CN103329889B

CN103329889B - β-胡萝卜素用于制备猪精液冷冻保护剂的应用

Info

Publication number: CN103329889B
Application number: CN201310216063.6A
Authority: CN
Inventors: 李青旺; 胡晓辰; 江中良; 胡靓华
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2013-06-03
Filing date: 2013-06-03
Publication date: 2014-10-22
Anticipated expiration: 2033-06-03
Also published as: CN103329889A

Abstract

本发明公开了β-胡萝卜素用于制备猪精液冷冻保护剂的应用，所制备的猪精液冷冻保护剂由冷冻基础液、β-胡萝卜素、新鲜鸡蛋黄和甘油组成，其中，β-胡萝卜素在每100mL冷冻基础液中的添加量为1mg～2mg，新鲜鸡蛋黄在每100mL冷冻基础液中的添加量为20ml，然后取添加β-胡萝卜素和新鲜鸡蛋黄的冷冻基础液97ml，加入甘油3ml，即制成100mL猪精液冷冻保护剂。每100mL的冷冻基础液中含有下列物质：葡萄糖：1.1g，柠檬酸：1.48g，Tris：2.42g，青霉素钠：0.06g，硫酸链霉素：0.1g，余量为双蒸水。本发明首次将β-胡萝卜素用于猪精液的冷冻保存中，解冻后猪精子活率、顶体完整率、质膜完整率分别为51%、53%、52%。

Description

β-胡萝卜素用于制备猪精液冷冻保护剂的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及动物精液的抗冻剂，特别是β-胡萝卜素用于制备猪精液冷冻保护剂的应用。

背景技术

精液冷冻保存技术是随着人工授精技术发展起来的，是人工授精技术的重大革新。精液冷冻保存技术的原理是利用液氮（-196℃）、干冰（-79℃）或其它冷源，将精子经过适当的处理，使精子代谢完全停止。使用时在解冻进行人工授精和体外授精。精液冷冻可以大大提高种公畜的利用率，减少公畜的饲养量，节约成本且不受地域、时间的限制。有利于家畜品种的杂交改良，是家畜育种和珍惜濒危物种保护的有效技术手段。总之，精液的冷冻保存对研究人类生殖医学、促进家畜遗传育种、推广人工授精和保护濒危野生动物方面具有重要意义。

目前，我国养猪业已经从传统的副业型转变为效益型、专业化的工厂化生产。猪精液冷冻技术在养猪生产和猪育种等方面具有重大意义，使人工授精技术不再受时间、地域限制；提高了优良种猪的利用率，延长的种公猪的使用年限；通过引进优秀种公猪精液代替以往引进活体公猪，有效的减少了育种成本；使地方品种资源得到了有效的保护。但是，由于猪精子细胞结构、成份的特异性，对温度变化较敏感，大量精子在冷冻过程中受到损伤，冻精活率、顶体完整率和质膜完整率明显低于鲜精，精子DNA和线粒体等的损伤也明显高于鲜精，导致在商品化养猪生产中，母猪的妊娠率、产仔率普遍降低，因此利用冷冻精液进行人工授精在养猪业实际生产中很难推广应用。尽管国内外研究学者已经对猪精子的冷冻保存进行了大量的研究，但是猪精子冷冻解冻后的品质仍然不能够满足实际生产需要。

在精液冷冻过程中，应用最广泛的抗冻保护介质就是甘油，甘油可以渗透进入细胞内部，缓解细胞内由于脱水而造成的渗透压变化。甘油作为一种渗透性保护剂，目前已经广泛应用到牛的冷冻精液商品化生产当中，并且取得了良好的抗冻效果。但是研究表明渗透性冷冻保护剂对精子均匀一定的毒害作用，尤其是猪精子对甘油浓度极为敏感，过高浓度的甘油会对猪精子造成严重的损伤。因此，对新型抗冻保护剂的研究就显得十分迫切。

相关研究表明，精液在冷冻平衡过程中，不可避免的通过呼吸代谢产生大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS），其所携带的氧自由基（O^2-、H₂O₂和-OH）能使精子细胞膜的不饱和脂肪酸发生氧化，造成精子细胞膜损伤，最终导致猪精子受精能力急剧下降。

因此，在精液冷冻过程中，在稀释液中添加抗氧化成份可以起到一定的保护作用。

发明内容

针对目前猪精液冷冻的不足之处，申请人在深入研究中发现，β-胡萝卜素作为一种抗氧化物质，可以减少自由基对细胞膜和细胞遗传物质的损伤，采用β-胡萝卜素制备猪精液冷冻保护剂，经实验证明，能有效提高猪精液冷冻-解冻后的精子活率、顶体完整率、质膜完整率。

本发明制备的猪精液冷冻保护剂由冷冻基础液、β-胡萝卜素、新鲜鸡蛋黄和甘油组成，其中，β-胡萝卜素在每100mL冷冻基础液中的添加量为1mg～2mg，新鲜鸡蛋黄在每100mL冷冻基础液中的添加量为20ml，然后取添加β-胡萝卜素和新鲜鸡蛋黄的冷冻基础液97ml，加入甘油3ml，即制成100mL猪精液冷冻保护剂。

所述每100mL的冷冻基础液中含有下列物质：

葡萄糖：1.1g，柠檬酸：1.48g，Tris：2.42g，青霉素钠：0.06g，硫酸链霉素：0.1g，余量为双蒸水。

上述猪精液冷冻保护剂的制备包括下列步骤：

1）取配方量的葡萄糖、柠檬酸、Tris、青霉素钠、硫酸链霉素、溶于100ml双蒸水中，调节pH至6.21，渗透压286mosm/L，配制成冷冻基础液；

2）将步骤1）得到的冷冻基础液与20ml新鲜鸡蛋黄混匀，加入β-胡萝卜素1mg～2mg配制成Ⅰ液；

3）取步骤2）所配制的Ⅰ液97ml，加入甘油3ml，配制成100ml的Ⅱ液；

4）调节Ⅱ液pH值至6.0～7.5，渗透压286mosm/L，过滤灭菌，冷却至室温，得到猪精液冷冻保护剂，放入4℃冰箱中保存。

上述猪精液冷冻保护剂用于猪精液的冷冻保存方法，其特征在于，按下列步骤操作：

1）将新鲜精液离心，弃上清，加入等体积预温的冷冻稀释液，经纱布包裹后，在17℃恒温箱中平衡1-2h；

2）将步骤1）平衡处理后的精液在17℃离心，弃上清，加入等温等体积I液，用纱布包裹后置于4℃冰箱中平衡1h～2h；

3）向步骤2）平衡处理后的精液中加入2倍体积等温Ⅱ液，调整精子密度为1.0×10⁹个/mL，4℃冰箱平衡1h～2h；

4）将步骤3）平衡处理后的精液吸入0.25ml细管内，封管，置于程序冷冻仪中，以1℃/min的速率从4℃缓慢降至-5℃，迅速移至液氮上方2～3cm熏蒸5min～10min，将细管投入液氮中保存。

本发明首次将β-胡萝卜素作为冷冻保护剂用于猪精液冷冻保存，效果可靠，易于推广，适用于猪细管冷冻精液人工授精及精液超低温冷冻后的长期保存和长途运输后输精，可显著提高冷冻-解冻后猪精子活率、顶体完整率和质膜完整率，保持精子的受精活力。

据申请人所进行的资料检索，到目前为止，国内外尚未见有关β-胡萝卜素作为冷冻保护剂用于猪的精液冷冻保存的相关文献报道。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施。

在以下的实施例中，原料葡萄糖、柠檬酸、Tris、青霉素钠、硫酸链霉素选择市售产品。所涉及的冷冻稀释液（Betsville Thawing Solution，BTS）、购于Sigma公司（St.Louis，MO，USA）。FITC-PNA染液、磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffered Saline，PBS）选择市售产品；新鲜鸡蛋黄均取自于溶液配制当天生产的鸡蛋，小心敲破蛋壳并去除蛋清，随后用超纯水冲洗完整的鸡蛋黄3～5次并用脱脂滤纸吸干卵黄周围的水分，用10mL注射器小心刺破卵黄膜并吸取蛋黄。将称量好的药品和蛋黄溶于超纯水并混匀，于7000r/min，4℃离心1h，取上清弃沉淀,并用盐酸或NaOH调上清液pH值至7.0～7.2。

以下是发明人给出的实施例。需要说明的是，这些实施例仅是较佳的例子，本发明不限于所举实施例，本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均应属于本发明的保护范围。

实施例1：

准确量取葡萄糖：1.1g，柠檬酸：1.48g，Tris：2.42g，青霉素钠：0.06g，硫酸链霉素：0.1g溶于100ml双蒸水中，调节pH至6.21，渗透压286mosm/L，配制成冷冻基础液；

准确量取常规冷冻基础液80ml，加入新鲜鸡蛋黄20ml和β-胡萝卜素1mg～1.5mg，混匀配制成Ⅰ液；

取97ml的Ⅰ液添加3ml甘油配制成100ml的Ⅱ液，调节Ⅱ液的pH值为6.0～7.5，渗透压286mosm/L，过滤灭菌，冷却至室温，放入4℃冰箱中备用。

实施例2：

准确量取冷冻基础液80ml，加入新鲜鸡蛋黄20ml和β-胡萝卜素1.5mg～2.0mg,混匀配制成Ⅰ液；

对照例：

准确量取葡萄糖：1.1g，柠檬酸：1.48g，Tris：2.42g，青霉素钠：0.06g，硫酸链霉素：0.1g溶于100ml蒸馏水中，配制成常规冷冻基础液；

准确量取冷冻基础液80ml，加入新鲜鸡蛋黄20ml，混匀配制成Ⅰ液；

取97ml的Ⅰ液添加3ml甘油配制成100ml的Ⅱ液，调节Ⅱ液pH值为6.0～7.5，过滤灭菌，冷却至室温，放入4℃冰箱中备用。

试验例：

下面对猪精液冷冻保护液及精子质量评定进行说明：

（一）精液采集

用手握法采猪精液，选择中段浓厚部分精液，经4层消毒纱布过滤除去胶状物，以商用抗冻剂1：1稀释后，用显微镜在37℃下进行常规品质检查。选择无异味、色泽为乳白色、精子形态正常、活率在0.8以上、密度为“密”的精液用于试验。

（二）精液处理与冷冻

将采集的新鲜精液离心（800×g，10min），弃上清，加入等量预温的冷冻稀释液（Betsville Thawing Solution，BTS），经12～15层纱布包裹后，在17℃恒温箱中平衡1-3h。

将平衡处理过的精液在17℃温度下离心（1600×g，5min），弃上清，加入等温等体积的I液（实施例1、2、对照例），用12～15层纱布包裹后置于4℃冰箱中平衡1-3h。然后再加入2倍体积等温的II液（实施例1、2、对照例），调整精子密度为1.0×10⁹个／mL。用专用注射器将精液吸入0.25ml细管内（法国进口），快速封管，置于程序冷冻仪中以1℃/min的速率从4℃缓慢降至–5℃，迅速移至液氮上方2-3cm熏蒸5min～10min，将细管投入液氮中保存。

（三）细管冻精的解冻和精子质量评定

1、精子活率

将细管冻精从液氮中取出后迅速放入37℃的水浴中解冻45s，收集于小试管内，然后用等温的冷冻稀释液（Betsville Thawing Solution，BTS）与解冻的精液按1:1（v/v）稀释，孵育5min，取10μL精液于载玻片上，盖上盖玻片，在400倍倒置显微镜下评价精子活率（直线运动精子百分率）。每次至少检查200个精子，重复10次。

2、精子顶体完整率

利用FITC-PNA染液染色后，荧光显微镜观察精子顶体形态，细管解冻后，将精液加到2ml的浓度为的3%PVP液面上，800×g，3min离心洗2次，弃上清；用PBS（37℃）重悬调整密度至1～2×10⁶个精子/mL；吸取30μL精子悬液，涂片，空气干燥，用纯甲醇固定10min；再加入30μL的FITC-PNA染液，37℃黑暗潮湿环境孵育30min；PBS冲洗，空气干燥，滴少量甘油和PBS（甘油：PBS=9：1），盖片，用无色指甲油封片，尽快在400倍荧光显微镜下观察。每次至少检查200个精子，重复10次。

3、精子质膜完整率

采用果糖-柠檬酸钠低渗液进行低渗肿胀检测（HOST）。将解冻后的精液用常规稀释液稀释，调整精子密度为1×10⁶个／ml，37℃孵育30min，取20μl精液于悬液滴于血细胞计数板上，400倍显微镜下观察，计算弯尾精子百分率，每次至少检查200个精子，重复10次。

（四）精子质量评定结果

应用上述实施例制备的猪精液冷冻保护剂以及精液冷冻保存方法，评定结果如下：

当β-胡萝卜素添加量为1mg～1.5mg，冷冻-解冻后精子活率达55%，顶体完整率达60%，质膜完整率达62%；

当β-胡萝卜素添加量为1.5mg～2mg，冷冻-解冻后精子活率达58%，顶体完整率达62%，质膜完整率达63%。

结果如下表1所示：

表1：不同浓度β-胡萝卜素对猪精子冷冻保存效果的影响

处理	精子活率	顶体完整率	质膜完整率
				对照组	33%	45%	48%
实施例1	55%	60%	62%
				实施例2	58%	62%	63%

Claims

1. 一种猪精液冷冻保护剂，其特征在于，由冷冻基础液、β-胡萝卜素、新鲜鸡蛋黄和甘油组成，其中，β-胡萝卜素在每100mL冷冻基础液中的添加量为1mg～2mg，新鲜鸡蛋黄在每100mL冷冻基础液中的添加量为20ml，然后取添加β-胡萝卜素和新鲜鸡蛋黄的冷冻基础液97ml，加入甘油3 ml，即制成100mL猪精液冷冻保护剂；

所述每100mL的冷冻基础液中含有下列物质：

2.权利要求1所述的猪精液冷冻保护剂的制备方法，其特征在于包括下列步骤：

1）取配方量的葡萄糖、柠檬酸、Tris、青霉素钠、硫酸链霉素、溶于100ml双蒸水中，调节pH至6.21，渗透压286 mosm/L，配制成冷冻基础液；

2）将步骤1）得到的冷冻基础液与20ml新鲜鸡蛋黄混匀，加入β-胡萝卜素1mg~2mg配制成Ⅰ液；

3）取步骤2）所配制的Ⅰ液97ml，加入甘油3ml，配制成100 ml的Ⅱ液；

4）调节Ⅱ液pH值至6.0～7.5，渗透压286 mosm/L，过滤灭菌，冷却至室温，得到猪精液冷冻保护剂，放入4℃冰箱中保存。

3.一种如权利要求1所述的猪精液冷冻保护剂用于猪精液的冷冻保存方法，其特征在于，按下列步骤操作：

1）将新鲜精液离心，弃上清，加入等体积预温的冷冻稀释液，经纱布包裹后，在17℃恒温箱中平衡1h~2h；

2）将步骤1）平衡处理后的精液在17℃离心，弃上清，加入等温等体积I液，用纱布包裹后置于4℃冰箱中平衡1h~2 h；

所述的I液是在100mL的冷冻基础液中加入20ml新鲜鸡蛋黄混匀后，加入β-胡萝卜素1mg~2mg配制而成；

3）向步骤2）平衡处理后的精液中加入2倍体积等温Ⅱ液，调整精子密度为1.0×10⁹个/mL，4℃冰箱平衡1h~2h；

所述Ⅱ液是在97ml的Ⅰ液中加入甘油3ml，配制而成；

4）将步骤3）平衡处理后的精液吸入0.25ml细管内，封管，置于程序冷冻仪中，以1℃/min的速率从4℃缓慢降至-5℃，迅速移至液氮上方2cm~3cm熏蒸5min~10min，将细管投入液氮中保存。