CN107535481A

CN107535481A - 一种猪精液冷冻保护剂

Info

Publication number: CN107535481A
Application number: CN201710907049.9A
Authority: CN
Inventors: 赵国启
Original assignee: Jieshou City Of Kai Family Farm
Current assignee: Jieshou City Of Kai Family Farm
Priority date: 2017-09-29
Filing date: 2017-09-29
Publication date: 2018-01-05

Abstract

本发明公开了一种猪精液冷冻保护剂，由下列物质组成：冷冻基础液、新鲜鸡蛋黄、甘油、虾青素、熟地提取物。本发明对猪精液冷冻保护剂进行了特殊的选配处理，在各成分的共同作用下，最终制得的冷冻保护剂明显提升了对猪精液的冷冻保存效果，提高了猪精子活率、顶体完整率和质膜完整率，最大限度的保证了猪精子的受精活力和使用效果。

Description

一种猪精液冷冻保护剂

技术领域

本发明属于猪养殖技术领域，具体涉及一种猪精液冷冻保护剂。

背景技术

精液冷冻保存技术是随着人工授精技术发展起来的，是人工授精技术的重大革新。精液冷冻保存技术的原理是利用液氮（-196℃）、干冰（-79℃）或其它冷源，将精子经过适当的处理，使精子代谢完全停止。使用时在解冻进行人工授精和体外授精。精液冷冻可以大大提高种公畜的利用率，减少公畜的饲养量，节约成本且不受地域、时间的限制。有利于家畜品种的杂交改良，是家畜育种和珍惜濒危物种保护的有效技术手段。总之，精液的冷冻保存对研究人类生殖医学、促进家畜遗传育种、推广人工授精和保护濒危野生动物方面具有重要意义。

目前，我国养猪业已经从传统的副业型转变为效益型、专业化的工厂化生产。猪精液冷冻技术在养猪生产和猪育种等方面具有重大意义，使人工授精技术不再受时间、地域限制；提高了优良种猪的利用率，延长的种公猪的使用年限；通过引进优秀种公猪精液代替以往引进活体公猪，有效的减少了育种成本；使地方品种资源得到了有效的保护。但是，由于猪精子细胞结构、成份的特异性，对温度变化较敏感，大量精子在冷冻过程中受到损伤，冻精活率、顶体完整率和质膜完整率明显低于鲜精，精子 DNA 和线粒体等的损伤也明显高于鲜精，导致在商品化养猪生产中，母猪的妊娠率、产仔率普遍降低，因此利用冷冻精液进行人工授精在养猪业实际生产中很难推广应用。尽管国内外研究学者已经对猪精子的冷冻保存进行了大量的研究，但是猪精子冷冻解冻后的品质仍然不能够满足实际生产需要。

发明内容

本发明的目的是针对现有的问题，提供了一种猪精液冷冻保护剂。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种猪精液冷冻保护剂，由如下重量份的物质组成：

90~100份冷冻基础液、18~22份新鲜鸡蛋黄、2~5份甘油、0.5~1.5份虾青素、3~6份熟地提取物。

优选的，由如下重量份的物质组成：

95份冷冻基础液、20份新鲜鸡蛋黄、4份甘油、1份虾青素、5份熟地提取物。

进一步的，所述冷冻基础液中各成分及其对应重量份为：1~1.5份葡萄糖、1.5~1.8份柠檬酸、2~2.5份透明质酸、0.8~1.2份海藻糖、0.04~0.06份青霉素钠、0.1~0.15份硫酸链霉素、95~100份双蒸水。

进一步的，所述熟地提取物的制备方法为：

（1）先将熟地放入到沸水中水焯处理3~5min后取出，然后晾干备用；

（2）将步骤（1）处理后的熟地放入到盛有麦麸的砂锅内，加热保持砂锅温度为90~95℃，不断翻炒处理30~35min后取出，滤去麦麸后得炒制熟地备用；

（3）将步骤（2）所得的炒制熟地粉碎后过200目备用；

（4）将步骤（3）粉碎后的熟地放入到体积分数为85%的乙醇溶液中不断回流浸提24~28h后，将浸提液取出，最后将浸提液浓缩至原体积的一半后即得熟地提取物。熟地中的有效成分可提升精子保存环境的安全性，并可为精子复苏加能，增强其活性，但同样其内会含有一些刺激精子的有害物质，首先需要进行炒制来消除，否则会起到相反的使用效果。

相关研究表明，精液在冷冻平衡过程中，不可避免的通过呼吸代谢产生大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS），其所携带的氧自由基（O₂-、H₂O₂和-OH）能使精子细胞膜的不饱和脂肪酸发生氧化，造成精子细胞膜损伤，最终导致猪精子受精能力急剧下降。现有的精液冷冻保护剂中常添加维生素等成分来消除上述氧自由基等成分的危害作用，但起到的效果有限，同时冷冻处理时低温、水结晶等问题同样对精子产生较大的损害，为了提升精液的使用效果，亟需对上述问题不断改善。对此本申请人对猪精液的冷冻处理做了大量的实验，对精液冷冻保护剂的成分进行了合理的选择搭配，有效提升了对精液的保护效果，其中添加的虾青素具有很强的抗氧化特性，能很好的去除氧自由基等对于精子的伤害，添加的熟地提取物是由熟地中提取而得，有效成分为环烯醚萜类、单萜类、糖类、酮类、胶质类等成分，不仅能提升精子生存的环境安全，又能降低冷冻时小冰晶对于精子细胞膜的破坏程度，与虾青素协同增强了对精液的保护效果。

本发明相比现有技术具有以下优点：

本发明对猪精液冷冻保护剂进行了特殊的选配处理，在各成分的共同作用下，最终制得的冷冻保护剂明显提升了对猪精液的冷冻保存效果，提高了猪精子活率、顶体完整率和质膜完整率，最大限度的保证了猪精子的受精活力和使用效果。

具体实施方式

实施例1

一种猪精液冷冻保护剂，由如下重量份的物质组成：

90份冷冻基础液、18份新鲜鸡蛋黄、2份甘油、0.5份虾青素、3份熟地提取物。

进一步的，所述冷冻基础液中各成分及其对应重量份为：1份葡萄糖、1.5份柠檬酸、2份透明质酸、0.8份海藻糖、0.04份青霉素钠、0.1份硫酸链霉素、95份双蒸水。

进一步的，所述熟地提取物的制备方法为：

（1）先将熟地放入到沸水中水焯处理3min后取出，然后晾干备用；

（2）将步骤（1）处理后的熟地放入到盛有麦麸的砂锅内，加热保持砂锅温度为90℃，不断翻炒处理30min后取出，滤去麦麸后得炒制熟地备用；

（3）将步骤（2）所得的炒制熟地粉碎后过200目备用；

（4）将步骤（3）粉碎后的熟地放入到体积分数为85%的乙醇溶液中不断回流浸提24h后，将浸提液取出，最后将浸提液浓缩至原体积的一半后即得熟地提取物。

实施例2

一种猪精液冷冻保护剂，由如下重量份的物质组成：

进一步的，所述冷冻基础液中各成分及其对应重量份为：1.2份葡萄糖、1.7份柠檬酸、2.2份透明质酸、1份海藻糖、0.05份青霉素钠、0.13份硫酸链霉素、98份双蒸水。

进一步的，所述熟地提取物的制备方法为：

（1）先将熟地放入到沸水中水焯处理4min后取出，然后晾干备用；

（2）将步骤（1）处理后的熟地放入到盛有麦麸的砂锅内，加热保持砂锅温度为93℃，不断翻炒处理32min后取出，滤去麦麸后得炒制熟地备用；

（3）将步骤（2）所得的炒制熟地粉碎后过200目备用；

（4）将步骤（3）粉碎后的熟地放入到体积分数为85%的乙醇溶液中不断回流浸提26h后，将浸提液取出，最后将浸提液浓缩至原体积的一半后即得熟地提取物。

实施例3

一种猪精液冷冻保护剂，由如下重量份的物质组成：

100份冷冻基础液、22份新鲜鸡蛋黄、5份甘油、1.5份虾青素、6份熟地提取物。

进一步的，所述冷冻基础液中各成分及其对应重量份为：1.5份葡萄糖、1.8份柠檬酸、2.5份透明质酸、1.2份海藻糖、0.06份青霉素钠、0.15份硫酸链霉素、100份双蒸水。

进一步的，所述熟地提取物的制备方法为：

（1）先将熟地放入到沸水中水焯处理5min后取出，然后晾干备用；

（2）将步骤（1）处理后的熟地放入到盛有麦麸的砂锅内，加热保持砂锅温度为95℃，不断翻炒处理35min后取出，滤去麦麸后得炒制熟地备用；

（3）将步骤（2）所得的炒制熟地粉碎后过200目备用；

（4）将步骤（3）粉碎后的熟地放入到体积分数为85%的乙醇溶液中不断回流浸提28h后，将浸提液取出，最后将浸提液浓缩至原体积的一半后即得熟地提取物。

对比实施例1

本对比实施例1与实施例2相比，省去虾青素成分，除此外的方法步骤均相同。

对比实施例2

本对比实施例2与实施例2相比，省去熟地提取物成分，除此外的方法步骤均相同。

对比实施例3

本对比实施例3与实施例2相比，用等质量份的维生素E取代虾青素成分，除此外的方法步骤均相同。

对比实施例4

本对比实施例4与实施例2相比，在制备熟地提取物时，不对熟地进行步骤（2）的炒制处理，除此外的方法步骤均相同。

对照组

现有的猪精液冷冻保护剂。

为了对比本发明效果，对上述实施例2、对比实施例1、对比实施例2、对比实施例3、对比实施例4、对照组所述的冷冻保护剂进行实验测试，实验具体包括：

（一）精液采集：用手握法采猪精液，选择中段浓厚部分精液，经 4 层消毒纱布过滤除去胶状物，以商用抗冻剂1：1 稀释后，用显微镜在 37℃下进行常规品质检查，选择无异味、色泽为乳白色、精子形态正常、活率在0.8 以上、密度为“密”的精液用于试验；

（二）精液处理与冷冻：将采集的新鲜精液离心（800×g，10min），弃上清，加入等量预温的冷冻稀释液（Betsville Thawing Solution，BTS），经12～15层纱布包裹后，在17℃恒温箱中平衡1-3h；将平衡处理过的精液在 17℃温度下离心（1600×g，5min），弃上清，加入等温等体积的 I 液（实施例2、对比实施例1、对比实施例2、对比实施例3、对比实施例4、对照组），用 12～15 层纱布包裹后置于4℃冰箱中平衡 1-3h，然后再加入2 倍体积等温的 II液（实施例2、对比实施例1、对比实施例2、对比实施例3、对比实施例4、对照组），调整精子密度为 1.0×10⁹个／mL，用专用注射器将精液吸入 0.25ml 细管内（法国进口），快速封管，置于程序冷冻仪中以 1℃ /min 的速率从 4℃缓慢降至 –5℃，迅速移至液氮上方 2-3cm 熏蒸 5min～10min，将细管投入液氮中保存；

（三）细管冻精的解冻和精子质量评定：

1、精子活率：将细管冻精从液氮中取出后迅速放入 37℃的水浴中解冻 45s，收集于小试管内，然后用等温的冷冻稀释液（Betsville Thawing Solution，BTS）与解冻的精液按1:1（v/ v）稀释，孵育5min，取10μL 精液于载玻片上，盖上盖玻片，在400倍倒置显微镜下评价精子活率（直线运动精子百分率）。每次至少检查 200个精子，重复10 次；

2、精子顶体完整率：利用 FITC-PNA 染液染色后，荧光显微镜观察精子顶体形态，细管解冻后，将精液加到 2ml 的浓度为的3%PVP 液面上，800×g，3min 离心洗 2 次，弃上清；用 PBS（37℃）重悬调整密度至 1～2×10⁶个精子/mL；吸取30μL 精子悬液，涂片，空气干燥，用纯甲醇固定 10min；再加入30μL的FITC-PNA染液，37℃黑暗潮湿环境孵育30min；PBS冲洗，空气干燥，滴少量甘油和 PBS（甘油：PBS=9：1），盖片，用无色指甲油封片，尽快在400倍荧光显微镜下观察，每次至少检查 200个精子，重复10次；

3、精子质膜完整率：采用果糖-柠檬酸钠低渗液进行低渗肿胀检测（HOST），将解冻后的精液用常规稀释液稀释，调整精子密度为 1×10⁶个／ml，37℃孵育 30min，取 20μl 精液于悬液滴于血细胞计数板上，400倍显微镜下观察，计算弯尾精子百分率，每次至少检查200个精子，重复10 次。

上述实验最终处理的对比数据如下表1所示：

表1

	精子活率（%）	顶体完整率（%）	质膜完整率（%）
				实施例2	67.0	72.4	71.8
对比实施例1	57.4	61.1	61.9
				对比实施例2	58.0	62.7	63.5
对比实施例3	61.5	67.4	66.8
				对比实施例4	53.2	57.8	55.2
对照组	55.1	60.5	58.6

由上表1可以看出，本发明方法制得的冷冻保护剂能明显的提升对精液的保护效果，增强了其使用活力，使用价值较高。

Claims

1.一种猪精液冷冻保护剂，其特征在于，由如下重量份的物质组成：

2.根据权利要求1所述的一种猪精液冷冻保护剂，其特征在于，由如下重量份的物质组成：

3.根据权利要求1或2所述的一种猪精液冷冻保护剂，其特征在于，所述冷冻基础液中各成分及其对应重量份为：1~1.5份葡萄糖、1.5~1.8份柠檬酸、2~2.5份透明质酸、0.8~1.2份海藻糖、0.04~0.06份青霉素钠、0.1~0.15份硫酸链霉素、95~100份双蒸水。

4.根据权利要求1或2所述的一种猪精液冷冻保护剂，其特征在于，所述熟地提取物的制备方法为：

（3）将步骤（2）所得的炒制熟地粉碎后过200目备用；

（4）将步骤（3）粉碎后的熟地放入到体积分数为85%的乙醇溶液中不断回流浸提24~28h后，将浸提液取出，最后将浸提液浓缩至原体积的一半后即得熟地提取物。