CN106135294A - 一种新型球孢白僵菌颗粒剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种球孢白僵菌颗粒剂，其通过如下方法制备得到：将球孢白僵菌或球孢白僵菌孢子接种于发酵培养基中；在25℃、绝对湿度为100％的环境中发酵7天；其中，所述发酵培养基的配置方法为：每升PD培养基中添加4g的葡萄糖、0.4g的磷酸二氢钾、0.2g的硫酸镁、0.1g的硫酸锌、8mg的维生素B1、1000g的玉米秸秆颗粒和1.2升的水。本发明的球孢白僵菌颗粒剂具有能够适应田间低湿高温环境，高效感染玉米螟，具有高效的抗虫效果。特别是，本发明的球孢白僵菌颗粒剂对解滞育的玉米螟幼虫具有很好的感染效果，因而对于玉米产区长期的抗虫具有重要意义。同时本发明属于生物制剂，具有环保安全的特点。
Description
技术领域
本发明涉及农业害虫防治领域，更具体地涉及一种防治亚洲玉米螟的生物制剂法。
背景技术
亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis属鳞翅目、草螟科，广泛分布于亚洲和大洋洲的大部分国家，在我国亚洲玉米螟的分布较为广泛，从东北一直到海南都有其分布。是我国玉米生产上主要的害虫是严重影响玉米产量和质量。
为了保证玉米的质量和产量，通过农药防治亚洲玉米螟是常用的手段，常规的农药包括化学农药和生物农药。生物农药是指利用生物活体(真菌，细菌，昆虫病毒，转基因生物，天敌等)或其代谢产物(信息素，生长素，萘乙酸钠，2，4-D等)针对农业有害生物进行杀灭或抑制的制剂，又称天然农药。相对于化学农药，生物农药更加环保，且对人的危害小。
球孢白僵菌Beauveria bassiana是研究和应用较多的一种重要昆虫病原真菌，寄主范围广，可寄生于15个目的700余种昆虫中。其不但能够寄生昆虫，而且当生态系统中缺乏昆虫寄主时，能够在不同的环境中营腐生活。球孢白僵菌因其具有物理防治害虫、易于培养、对环境不产生污染等特点，还具有对人畜安全、能够循环再侵染害虫的优点，已成为生物防治研究的热点之一。从目前国内外对球孢白僵菌应用范围的研究看，它不仅可以替代传统化学农药杀害昆虫，也可用于医药等行业。球孢白僵菌是生物防治亚洲玉米螟中应用最广泛的虫生真菌，不同剂型的球孢白僵菌产品在玉米主产区已广泛应用。
在我国东北选用该球孢白僵菌防治亚洲玉米螟的主要方法有喷雾法、喷粉法、颗粒剂法，防治时期为春季封垛期和玉米心叶期。
球孢白僵菌到现在为止生产上面临一些问题，其中一个最重要的问题就是真菌杀虫剂用于害虫大规模防治效果迟缓而不稳定，导致工业化、标准化及对剂型加工等方面均存在困难，影响了生物制剂的推广。另外，在田间应用时，田间环境多为低湿高温环境，不利于孢子萌发及长出菌丝侵染虫体， 温度、湿度和光照时间等因素，都会使白僵菌在田间应用及其效果发挥受到较大限制。而且，随着我国秸秆还田的推广，农村玉米垛的减少，使利用白僵菌封垛的引用面积减少。因此，需要提供一种球孢白僵菌生物制剂，该制剂的球孢白僵菌能够适应田间环境，具有良好的孢子萌发及长出菌丝的效果。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题在于提供一种球孢白僵菌颗粒剂，该制剂的球孢白僵菌能够适应田间环境，具有良好的孢子萌发及长出菌丝的效果。
为解决上述技术问题，本发明采用下述技术方案：
一种球孢白僵菌颗粒剂，其通过如下方法制备得到：
将球孢白僵菌或球孢白僵菌孢子接种于发酵培养基中；在25℃、绝对湿度为100％的环境中发酵7天；其中，
所述发酵培养基的配置方法为：每升PD培养基中添加4g的葡萄糖、0.4g的磷酸二氢钾、0.2g的硫酸镁、0.1g的硫酸锌、8mg的维生素B1、1000g的玉米秸秆颗粒和1.2升的水。
所述球孢白僵菌为MAT1-2基因标记的球孢白僵菌(Beauveria bassiana)，菌名为GZ01，分类名为：球孢白僵菌Beauveria bassiana，已于2016年5月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，其保藏编号为CGMCC No.12471。
本申请将所获得的球孢白僵菌颗粒剂命名为球孢白僵菌GZ01颗粒剂。
玉米秸秆颗粒为玉米秸秆粉碎获得的颗粒，颗粒过60目筛网。
本发明的有益效果如下：
本发明的球孢白僵菌颗粒剂具有能够适应田间低湿高温环境，高效感染玉米螟，具有高效的抗虫效果。本发明的球孢白僵菌颗粒剂对于对田间玉米植株均对2代亚洲玉米螟种群具有控制作用，也就是说球孢白僵菌对亚洲玉米螟生长发育的治病影响是一个缓慢的过程，对于存活下来的幼虫在这个越冬过称中有着持续控制的潜力。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1示出田间采集植株根茎叶MAT1-2型基因片段电泳检测。
图2示出田间采集亚洲玉米螟僵虫MAT1-2型基因片段电泳检测。
图3示出田间采集幼虫解滞育后僵虫MAT1-2型基因片段电泳检测。
图4示出田间采集植株根茎叶球孢白僵菌宿存量。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
实施例1：配制球孢白僵菌颗粒剂
1)配制PD液体培养基：马铃薯去皮切碎，称取1000g，加4000m去离子水，煮沸30min，过滤除渣，取过滤液加入75g葡萄糖，高压下蒸气灭菌20min。
2)配置PDA平板培养基：马铃薯去皮切碎，称取1000g加4000m去离子水，煮沸30min，过滤除渣，在过滤液中加入75g葡萄糖，加入100g琼脂粉，高压下蒸气灭菌20min，冷却到50℃，在无菌操作台中将培养基导入无菌培养皿中。
3)在PDA平板培养基上接种球孢白僵菌，并于25℃培养7天。
4)配制发酵培养基：在5L液体PD培养基中加入20g葡萄糖、2g磷酸二氢钾、1g硫酸镁、0.5g硫酸锌、40mg维生素B1、5000g玉米秸秆颗粒和6L无菌水，混合均匀。
5)将PDA平板培养基培养产生的球孢白僵菌分生孢子接种到发酵培养基中，混合均匀；
6)将接种的球孢白僵菌分生孢子于25℃、绝对湿度(RH)为100％的条件下发酵7天，即获得球孢白僵菌颗粒剂。
所述球孢白僵菌为含有MAT1-2基因标记的球孢白僵菌，本申请将菌种命名为球孢白僵菌GZ01，所制得的颗粒剂为球孢白僵菌GZ01颗粒剂。
实施例2：球孢白僵菌颗粒剂的效果实验
1.植物施菌
在伊通靠山镇伊通植保站试验地进行，玉米栽培品种为先玉335，采用大垄双行种植，一垄为一个试验组，试验组内随机选取40株玉米植株，在玉米植株三叶期时在植株近根部挖10-15cm深坑，在坑内放置约125g球孢白僵菌 GZ01颗粒剂，使所述颗粒剂与玉米植株的根部接触，然后在坑上轻轻覆盖一层土。
2.植物接虫
人工饲养的亚洲玉米螟成虫产卵后，将带卵块的蜡纸剪下，放入保湿的1.5mL透气离心管中，每个离心管放入一个标准卵块(约60粒卵)，于恒温培养箱培养(26±1℃)，待卵块黑头后，接入田间处理玉米植株的新叶上。在随机选取的对照组玉米植株和试验组标记的玉米植株，在玉米七叶期或抽雄时接亚洲玉米螟黑头卵块。
3.根茎叶内生菌的检测(PDA法)
玉米植株长成(玉米成熟期时)后，分别采集试验组玉米植株和对照组玉米植株的根茎叶。选取试验组植株的叶片，每组随机采集的4个样品进行内生菌检测，每个样品重复检测3次，将每片玉米植株叶片剪成1cm×1cm 4小片，用镊子将小片浸于0.5％的NaCl溶液中2min，再浸入70％乙醇中2min，无菌镊子取出小叶片，将其平贴于PDA平板培养基上，将每4个小片置于同一平板，用封口膜封口后室温下放置3天后，连续观察长菌的小叶片数量和菌落的形态，将获得的菌落提取其DNA，并进行PCR鉴定。
选取试验组和对照组玉米植株茎部，每组随机采集的4个样品进行内生菌检测，每个样品重复检测3次，将每株玉米的茎剪成2cm，4个小段，处理及培养方法同植株叶片。
选取试验组和对照组玉米植株须根，每组随机采集的4个样品进行内生菌检测，每个样品重复检测3次，将每株玉米的须根剪成2cm，4个小段，处理及培养方法同植株叶片。
球孢白僵菌菌株的DNA提取具体方法如下：
1)平板球孢白僵菌菌粉100mg液氮研磨成粉末；
2)置于预先加入600μl提取液的2.0mL离心管中静置2min，其中所述提取液的组成包括如下成分：1％SDS，0.5M NaCl，0.2M Tris-HCl，0.01M EDTA，pH8.0；
3)加入100μl的10％SDS，充分混匀后加入300μl氯化卞，剧烈震荡混匀；
4)在50℃中水浴1h，水浴中不用颠倒；
5)加入100μl的3M NaAC溶液，冰浴15min，然后在12000rpm条件下离心10min；
6)吸取上清液转入新的离心管，加入等体积Tris-饱和酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)抽提，12000rpm离心10min；
7)取上清，在上清中加入10μl的RnaseA(100ng/μl)，并在65℃水浴30min；
8)加入等体积Tris-饱和酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)抽提，12000rpm条件下离心10min；
9)加入2倍体积的冰预冷无水乙醇，温和的翻转，室温下沉淀30min，12000rpm离心10min；
10)弃上清保留沉淀，以70％乙醇洗沉淀物，在12000rpm的条件下离心3min，洗涤1-2次；
11)干燥后加TE溶解DNA，作为模板，保存于-20℃备用；
12)进行PCR鉴定。
PCR反应体系如下：
PCR反应程序设置为：94℃预变性5min，每次循环94℃1min，48℃1min，72℃1min，最后72℃延伸10min，共30次循环，保存于4℃。扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测
电泳结果见图1。图1中泳道M为分子量标记物，泳道Y1和Y2为田间采集植株叶片的DNA电泳检测，J1和J2为田间采集植株茎部DNA电泳检测，G1和G2为田间采集根部DNA电泳检测，J11为叶片对照组，G12为茎部对照组，以上检测样品均证明为试验组的玉米植株的根茎叶中具有球孢白僵菌GZ01，表明球孢白僵菌GZ01内生于实验组玉米植株的根茎叶中。图4表明球孢白僵菌的宿存量分别为根的宿存量为95％，茎的宿存量为75％，叶的宿存量为55％。
根的宿存量＝产生白僵菌菌落的根的数量/被检测的根的总量；
茎的宿存量＝产生白僵菌菌落的茎的数量/被检测的茎的总量；
叶的宿存量＝产生白僵菌菌落的茎的数量/被检测的叶的总量。
4.田间采集亚洲玉米螟僵虫及亚洲玉米螟幼虫解滞育后僵虫电泳检测
玉米植株(玉米成熟期时)长成后，剥茎收集试验样地试验组玉米植株 和对照组玉米植株上亚洲玉米螟幼虫和亚洲玉米螟僵虫，将所有亚洲玉米螟幼虫和亚洲玉米螟僵虫带回实验室。
通过PCR的方法检测亚洲玉米螟僵虫体内的球孢白僵菌是否含有MAT1-2基因(检测方法同上)，结果如图2所示，泳道1、2和3为采集试验组亚洲玉米螟僵虫DNA电泳检测结果，4、5和6为采集对照组亚洲玉米螟僵虫DNA电泳检测结果。试验组的亚洲玉米螟僵虫作为PCR模板时都出现阳性结果，而对照组则结果为阴性，表明试验组亚洲玉米螟僵虫感染球孢白僵菌GZ01，对照组感染的不是球孢白僵菌GZ01。
将实验组的亚洲玉米螟幼虫培养于实验室，此时亚洲玉米螟处于滞育阶段，当亚洲玉米螟处于滞育阶段时，亚洲玉米螟体内感染的球孢白僵菌也将停止繁殖。将滞育的玉米螟在实验室解滞育。亚洲玉米螟解滞育也会激活球孢白僵菌繁殖，使亚洲玉米螟幼虫死亡，成为亚洲玉米螟僵虫。通过PCR的方法检测亚洲玉米螟僵虫体内是否感染了球孢白僵菌GZ01，检测的基因为MAT1-2基因。结果见图3，泳道1-8为采集亚洲玉米螟幼虫解滞育后所得僵虫DNA电泳检测，证明球孢白僵菌GZ01导致亚洲玉米螟幼虫死亡。说明此试验方法已经能够实现对亚洲玉米螟的防治。
5.对亚洲玉米螟生存状态检测
玉米植株长成后，剥茎，收集试验组玉米植株和对照组玉米植株上存活的玉米5龄螟幼虫、蛹和亚洲玉米螟僵虫，记录亚洲玉米螟的平均成活率、平均化蛹率和白僵菌僵虫数量。采用DPS数据处理系统和Microsoft Excel软件分析，用one-way ANOVA进行方差分析。结果见表1.
表1显示了试验玉米植株上亚洲玉米螟的存在状况。
注：表中比率指该虫体数占各组整个虫体的百分率。
结果表明，试验组和对照组的亚洲玉米螟幼虫平均成活率分别为96.06％和97.84％，化蛹率分别为3.15％和0.72。
在雌穗成熟的末期，试验组和对照组亚洲玉米植株球孢白僵菌感染率分 别为0.79％、1.44％。虽然使用试验组玉米植株感染球孢白僵菌的百分比低于对照组，但随着时间的推移，经过滞育-解滞育的过程后，试验组的亚洲玉米螟幼虫被感染率会明显地增高为18.90％，而对照组没有明显变化。这表明球孢白僵菌GZ01在整个内生阶段中没有起到明显地治病作用，但对于对田间玉米植株均对2代亚洲玉米螟种群具有控制作用，也就是说球孢白僵菌对亚洲玉米螟生长发育的治病影响是一个缓慢的过程，对于存活下来的幼虫在这个越冬过称中有着持续控制的潜力。
6.球孢白僵菌GZ01颗粒剂对亚洲玉米螟幼虫生长发育影响检测
玉米植株长成后，剥茎，收集试验组和对照组玉米植株上存活的亚洲玉米螟幼虫，称量每头虫子体重。结果见表2。
表2施用球孢白僵菌GZ01颗粒剂对亚洲玉米螟幼虫生长发育影响
蛀孔在不同试验组玉米植株上分布的比较
表2结果显示：施用球孢白僵菌GZ01颗粒剂的试验组亚洲玉米螟幼虫的平均体重为0.0162±0.0008g，而未施用的对照组幼虫的平均体重为0.2530±0.0015g(表2)。施用球孢白僵菌GZ01颗粒剂极显著地抑制亚洲玉米螟的生长发育(t＝5.4205，p<0.01)。
7.玉米植株蛀孔分布情况分析
玉米植株长成后，剥茎收集对照组和试验组地玉米植株上存活的亚洲玉米螟幼虫，记录被害植株蛀孔数、蛀孔位置；然后统计计算出试验组和对照组玉米样地被害植株在各茎节的分布情况、平均蛀孔量。采用SPSS16.0数据处理系统分析，用one-way ANOVA进行方差分析。结果见表3.
表3显示了玉米植株蛀孔分布情况。结果表明，试验组玉米植株幼虫危害的蛀孔数相对来说略少，亚洲玉米螟幼虫危害的蛀孔在玉米雄穗柄至雌穗下第7节均有分布，其中以雌穗着生节(含穗柄)及其上、下1-3节上蛀孔最多。在此范围内，试验组和对照组组玉米植株上平均分布比率为7.84％、9.98％，试验组比对照组平均分布比率低2.14％。蛀孔在雌穗以上茎节上的分布比率为4.41％、4.81％；蛀孔在雌穗以下茎节上的分布比率为6.89％、6.56％， 分别高出雌穗以上茎节上的分布比率为2.48％、1.75％。其中试验组雌穗以上茎节与对照组雌穗以上茎节蛀孔的平均分布比率相比较，前者为3.61％，后者为4.81％.综合以上数据分析得出，试验组植株蛀孔总量少于对照组，试验组比对照组危害较低。
表3亚洲玉米螟幼虫危害蛀孔在不同试验组玉米上的分布
注：表中比率指该部位蛀孔数占整株株孔的百分率；上1-上6和下1-下7分布指雌穗着生节以上和以下的1-7茎节。
8.玉米植株上蛀孔长度的比较
玉米植株长成后，剥茎收集试验组玉米植株上存活的亚洲玉米螟幼虫，记录被害植玉米株平均蛀孔总隧道和平均隧道长度。采用DPS数据处理系统和Microsoft Excel软件分析，用one-way ANOVA进行方差分析。
表4不同玉米组织亚洲玉米螟幼虫蛀孔长度的比较
注：表内数据为平均值±SD，同列相同字母的不同处理间在0.05水平上差异不显著，Duncan，s新复极差检验。
表4显示了玉米植株上蛀孔长度的比较状况。结果表明，试验组和对照组玉米植株蛀孔平均长度分别为3.21cm和3.75cm，差异显著(p<0.05)。由此可见，试验组植株受害平均蛀孔长度小于对照组，也就是说，试验组玉米植株上蛀孔数量较多，但是平均蛀孔长度较短；而对照组玉米植株上蛀孔位置数量较少，但是平均蛀孔长度较长。
在试验组玉米植株中不同部分受害程度也是不同的。在雌穗和雌穗下茎两部分，试验组的蛀孔长度均比对照组分别高出79.5cm和53.1cm，试验组受害植株平均蛀孔长度与对照组相比差异不显著(p>0.05)。与之相反，在雌穗上茎、雌穗节和雌穗柄三个部分，对照组蛀孔长度均比试验组分别高出126.4cm、4.3cm和11.8cm，雌穗上茎接种组受害植株平均蛀孔长度与对照组差异显著(p<0.05)，雌穗节和雌穗柄接种组受害植株平均蛀孔长度与对照组差异不显著(p>0.05)。综合以上数据分析得出，因为植株下茎水分较多，所以雌穗节下茎蛀孔长度明显大于雌穗节上茎；试验组在雌穗上茎、雌穗节和雌穗柄三个部分防效效果相对好于对照组，而试验组植株的雌穗和雌穗下茎的防效效果相对对照组较差。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
Claims (2)
1.一种球孢白僵菌颗粒剂，其特征在于，通过如下方法制备得到：
将球孢白僵菌或球孢白僵菌孢子接种于发酵培养基中；在25℃、绝对湿度为100％的环境中发酵7天；其中，
所述发酵培养基的配置方法为：每升PD培养基中添加4g的葡萄糖、0.4g的磷酸二氢钾、0.2g的硫酸镁、0.1g的硫酸锌、8mg的维生素B1、1000g的玉米秸秆颗粒和1.2升的水。
2.如权利要求1所述的球孢白僵菌颗粒剂，其特征在于，所述球孢白僵菌为含有MAT1-2基因标记的球孢白僵菌，保藏编号为12471。
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