CN104255704B - 一种猪冷冻精液保藏方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种猪冷冻精液保藏方法，属于动物生产繁殖学领域，该方法将采集精液稀释后降温到17℃，等温下加入冷却保护液稀释，进一步降温到4~5℃，再加入冷冻保护液进封装冷藏；根据冷冻曲线降温恒定到-120℃后，储藏在液氮罐中。本发明的方法，猪用冷冻精液需在无菌的环境下操作，每一步都需严格控制，严防出错，否则会影响最终结果。每一环节和参数都是经过大量试验进行校正和优化。本方法制作的冷冻精液合格率达100%，即冷冻精液解冻后精子活力在0.3以上。
Description
技术领域
本发明涉及动物生产和繁殖领域，具体地说涉及一种猪冷冻精液保藏方法。
背景技术
人工授精技术是动物繁殖中提高雄性动物繁殖力的一个关键技术。猪人工授精技术中的常用精液为常温保存的液态精液，其保存时间3-5天，最多不超过10天；如能应用冷冻技术，那公猪的利用力则能大幅度提高。目前，在牛上，特别是奶牛上，冷冻技术的研究和应用非常成熟和普遍，并有专门的国家标准，如《牛冷冻精液》(GB4143-2008)、《牛冷冻精液生产技术规程》(NY/T1234-2006)。猪和牛繁殖生理的不同，如精液量、精子密度、精液成分等，导致冷冻技术在两者上应用面的差异。目前，猪冷冻精液技术，缺乏统一的国家标准或行业标准，尚处于研究阶段，其制作工艺流程还处在摸索阶段，大多研究主要集中在稀释液成分、甘油浓度、稀释方法、剂量等方面。
发明内容
发明目的：本发明的目的是提供一种对猪新鲜精液进行稀释、抗冷处理、筛选并分装冷冻的保藏方法，以获得100％精液合格率，高精子活力的冻精产品。
技术方案：为了实现上述发明目的，本发明的一种猪冷冻精液保藏方法，包括如下步骤：对采集精液稀释后降温到17℃，测量精子密度，离心后测量上清液精子密度，等温下加入冷却保护液稀释，稀释液计算公式为式(I)所示：
稀释液总量＝(稀释后精子密度-上清液精子密度)×体积/7亿(I)，
进一步降温到4～5℃，再加入冷冻保护液进封装冷藏；根据冷冻曲线降温恒定到-120℃后，储藏在液氮罐中；所述冷冻曲线的过程是：从4～5℃以2℃/min的降温速度降温至-5℃，再以60℃/min降温速度降温至-140℃，然后回到-120℃维持10min。
采集精液的稀释步骤为：取1000ml无菌双蒸水水浴锅中加热至30～38℃，再加入原精稀释液粉
溶解获得原精稀释液，稳定1小时待用；采集精液、原精稀释液按1∶0.5的比例等温稀释，放入17℃冰箱中平衡40分钟。
稀释后精液降温到17℃后立即进行离心，17℃等温环境下，800g离心12.5min，并吸除上清液。
加冷却保护液稀释后的体积为最终体积的一半，加完稀释液后，于4℃环境下降温平衡，1h后水杯中加冰块或周围加冰袋促使其快速降温至4-5℃；0.5h后等量等温加入冷冻保护液，加入后平衡45分钟装管。
封装时利用细管容纳冷藏精液，水平放置，封口后将管内气泡晃动到管中央。
冷冻采用将容纳有冷冻精液的细管置于液氮上方的方式，通过控制与液氮液面的距离，在-80℃～-120℃之间调节，8min后投入液氮获得冻精。
有益效果：本发明所述方法中，猪用冷冻精液需在无菌的环境下操作，每一步都需严格控制，严防出错，否则会影响最终结果。本工艺中的每一环节和参数都是经过大量试验进行校正和优化。本工艺制作的冷冻精液合格率达100％，即冷冻精液解冻后精子活力在0.3以上。
具体实施方式
实施例1
(一)准备工作：
原精稀释液：取1000ml无菌双蒸水置30～38℃水浴锅中调至30～38℃，溶解原精稀释液粉47g，然后稳定1小时待用。原精稀释液粉来自Minitube公司下的产品AndrohepPROPlusExtender，产品批号13533/3009；
冷却保护液：用400ml30～38℃双蒸水溶解44g药品A；使用时，加入100g新鲜蛋黄，用磁力搅拌器搅拌30min；然后冷却到17℃备用。
冷冻保护液：用370ml32～38℃双蒸水溶解40.7g药品B。使用时，加入100g新鲜蛋黄，加入30ml甘油，用磁力搅拌器搅拌30min。然后冷却到5℃备用。或取冷却保护液185ml加入15ml甘油，用磁力搅拌器搅拌30min。然后冷却到5℃备用。
配制冷却保护液中药品A的和冷冻保护液中的药品B来自Minitube公司下产品AndrohepCryoGuardCooling&FreezingExtender，产品批号13533/2006。
(二)具体操作：
步骤1：精液采集和处理
精液采集：按规范操作。注意各个体间不要混杂。多个体使用同一集精杯时，用完后要先用蒸馏水冲洗再用38℃生理盐水冲洗干净。或在集精杯中套入一保鲜袋，每头猪换一个。
原精液稀释：采集精液、原精稀释液按1∶0.5的比例等温(一般30-35℃，根据不同季节采集到的原精温度而定)稀释。放入17℃冰箱中平衡40分钟。
测量精子密度：按计数板法或密度测定仪法测定稀释后的精子密度。
步骤2：离心处理
原精稀释后40分钟左右，温度降到17℃后立即进行离心。用50或100ml离心管在17℃环境下，800g离心12.5min，吸去上清液。并测量上清液精子密度。(注意：离心机要提前预冷至17℃。)
步骤3：加冷却保护液
用加冷却保护液等温稀释，稀释后的体积为最终体积的一半。加完稀释液后，用水杯盛适量的17℃水，把稀释管放入后送4℃低温柜内降温平衡，1h后水杯中加冰块或周围加冰袋促使其快速降温至4-5℃(0.5h后进行下一步)。
稀释液计算公式为式(I)所示：
稀释液总量＝(稀释后精子密度-上清液精子密度)×体积/7亿(I)，
步骤4：加冷却保护液II
等量等温加入冷冻保护液，加入后平衡45分钟装管。(注意：这时在水杯加大量的4-5℃水，以便防止在加冷却保护液II和下面的分装过程中温度变化。)
步骤5：装管和封口
在4-5℃的冷藏室或平衡柜中进行装管和封口，封口后将管内气泡晃动到管的中央。
步骤6：冷冻
利用Minitube全自动冷冻仪设置冷冻曲线：从4～5℃以2℃/min的降温速度降温至-5℃，再以60℃/min降温速度降温至-140℃，然后回到-120℃维持10min。程序冻精完成后将冻精管迅速取出并迅速投入到装有液氮的泡沫盒中。后装入纱布袋中快速放入液氮罐中。
利用大口径液氮罐冷冻，应符合GB/T5458的规定。冷冻采用将容纳有冷冻精液的细管置于液氮上方的方式，通过控制与液氮液面的距离，在-80℃～-120℃之间调节，8min后投入液氮获得冻精。
实施例2
将实施例1获得的冻精进行解冻，解冻采取湿解法解，即先将60ml解冻液加入试管，26℃水浴预热，然后1-2支冻精放入38℃水中，30秒钟后取出，用吸水纸或纱布擦干水珠，再用细管剪剪去封口端后注入试管中(26℃)，然后用26℃解冻液1∶1稀释，3～4秒后再缓慢加入更多的解冻液，边加变摇晃。获得解冻后精液。镜检精子活率，达0.3以上者包装。批量生产。随机抽查不合格，则全部弃之。
实施例3
本发明的方法就工艺参数进行优化，获得最优效果。
试验动物：国家级小梅山猪保种场的12头成年、体质健康、性欲旺盛、采精频率正常的公猪(大约克猪2头、巴克夏猪2头、梅山猪4头、枫泾猪4头)。
试验设计：依据预实验结果选择稀释比例在1∶0.5～1∶1.5下进行的实验，在此范围内进行分组稀释，研究冷冻后精子活力的大小。将采集来的精液测量其活力和密度然后将其分成5份每份精液6mL，并按照每份理论密度一次是2.4亿/mL、2亿/mL、1.6亿/mL、1.2亿/mL、0.8亿/mL的顺序稀释精液。并测量每份密度的活力和密度，然后进行猪精冷冻试验，冷冻后分别解冻，测量每份精液的密度和活力，并在室温下两小时后再次侧量它们的活力和密度并记录以上数据进行分析。
试验方法如本发明实施例1所述。
试验结果：随着稀释倍数的增大，解冻后精子的活力也有所增大的。解冻两小时后的精子活力也有所增大，当稀释密度处于0.8亿/mL～1.6亿/mL时显示的解冻后精子活力比较高。建议进行精液冷冻前将精液稀释至0.8亿/mL～1.6亿/mL，对解冻后精子的活力会比较高。
实施例4
本试验是针对2中稀释剂证明本发明采用的稀释剂应用于冷冻精液上可获得更高活力和质量的精子。
试验动物：枫泾种公猪五头。公猪3-5岁、体重100kg左右、体质健康，强壮，性欲旺盛。
试验设计：2种稀释液
表1：精液稀释液的制作
I号和II号稀释剂在平衡处理后活力均为0.84，差异不显著，解冻后活力II号稀释剂平均活力为0.32，I号稀释剂活力为0.28，经统计比较两种稀释剂差异极显著(p＜0.01)。II号稀释剂在解冻后活力优于I号稀释剂。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种猪冷冻精液保藏方法，其特征在于包括如下步骤：
采集精液原精稀释后降温到17℃，测量精子密度，离心后测量上清液精子密度，等温下加入冷却保护液进一步稀释，稀释液计算公式为式（I）所示：
稀释液总量=（稀释后精子密度－上清液精子密度）×体积/7亿（I），
进一步降温到4~5℃，再加入冷冻保护液进封装冷藏；根据冷冻曲线降温恒定到-120℃后，储藏在液氮罐中；
所述冷冻曲线的过程是：从4~5℃以2℃/min的降温速度降温至-5℃，再以60℃/min降温速度降温至-140℃，然后回到-120℃维持10min。
2.根据权利要求1所述的一种猪冷冻精液保藏方法，其特征在于：采集精液原精稀释的步骤为：
取1000ml无菌双蒸水水浴锅中加热至30~38℃，再加入原精稀释液粉溶解获得原精稀释液，稳定1小时待用；采集精液、原精稀释液按1：0.5的比例等温稀释，放入17℃冰箱中平衡40分钟。
3.根据权利要求1或2所述的一种猪冷冻精液保藏方法，其特征在于：将稀释后精液降温到17℃后立即进行离心，17℃等温环境下，800g离心12.5min，并吸除上清液。
4.根据权利要求1所述的一种猪冷冻精液保藏方法，其特征在于：加冷却保护液稀释后的体积为最终体积的一半，加完稀释液后，于4℃环境下降温平衡，1h后水杯中加冰块或周围加冰袋促使其快速降温至4-5℃；0.5h后等量等温加入冷冻保护液，加入后平衡45分钟装管。
5.根据权利要求1所述的一种猪冷冻精液保藏方法，其特征在于：封装时利用细管容纳冷藏精液，水平放置，封口后将管内气泡晃动到管中央。
6.根据权利要求1所述的一种猪冷冻精液保藏方法，其特征在于：冷冻采用将容纳有冷冻精液的细管置于液氮上方的方式，通过控制与液氮液面的距离，在-80℃~-120℃之间调节，8min后投入液氮获得冻精。
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