CN102578075B

CN102578075B - 一种尼罗罗非鱼精子超低温保存的方法

Info

Publication number: CN102578075B
Application number: CN 201210007382
Authority: CN
Inventors: 柳凌; 邹桂伟; 张涛; 梁宏伟; 张洁明; 李忠; 郭峰
Original assignee: Yangtze River Fisheries Research Institute CAFS
Current assignee: Yangtze River Fisheries Research Institute CAFS
Priority date: 2012-01-11
Filing date: 2012-01-11
Publication date: 2013-05-22
Anticipated expiration: 2032-01-11
Also published as: CN102578075A

Abstract

本发明公开了一种尼罗罗非鱼精子超低温保存的方法，其步骤是：(1)尼罗罗非鱼精子的采集：选择性腺发育成熟的尼罗罗非鱼雄鱼，将精液挤入干燥的容器中，混匀；(2)精子活力检测：在显微镜下进行镜检，将镜检合格的精子放入冰箱保存备用；(3)精子的稀释：精确量取需要被冷冻的尼罗罗非鱼精液，加入精子稀释液，精液与稀释液混匀；(4)精液的冻前平衡：将稀释后的精液放入冰箱，进行冻前平衡；(5)加抗冻剂及分装；(6)程序降温；(7)进入液氮：降温完成后，直接将装有精液的麦管从程序降温仪中取出，放入液氮罐中，保存。方法易行，操作简便，对尼罗罗非鱼精子进行超低温保存，从而为罗非鱼的选育种提供必须的材料和手段。

Description

一种尼罗罗非鱼精子超低温保存的方法

技术领域

本发明涉及罗非鱼种质资源保存和精子低温生物学技术领域，更具体涉及一种尼罗罗非鱼精子超低温保存的方法，特别是针对尼罗罗非鱼精子进行超低温保存。

背景技术

罗非鱼(Tilapia)为一种中小形鱼，被誉为未来动物性蛋白质的主要来源之一。原产于非洲，上世纪70年代被引进到我国，目前已成为我国一个重要的水产养殖品种。随着我国对罗非鱼品种的选育和改良，除最初引进的尼罗罗非鱼(O.niloticus)和奥尼亚罗非鱼(O.aureus)外，又培育了许多新的品种。如：尼罗罗非鱼和奥尼亚罗非鱼的杂交后代奥尼罗非鱼；通过3系杂交选育的后代尼罗超雄鱼；以及由8个品系的尼罗罗非鱼经杂交混合选育的吉富罗非鱼等。

为了能进一步开展罗非鱼的新品种选育，以及罗非鱼的人工繁殖，为市场提供更优质的罗非鱼新品种和苗种，需要进行罗非鱼精子超低温保存。然而，不同鱼类的精子其外形、大小、密度、渗透压、激活后的寿命以及其它生物学特性都不一样。因此，不同鱼类的精子要求有不同的冷冻方法。尼罗罗非鱼精子超低温冷冻保存方法除了有一般鱼类精子冷冻保存所必须的步骤外，还有几个关键步骤。这些关键步骤的参数都是由尼罗罗非鱼精子的生物学特性决定的。

1.精子的渗透压不同决定了精子的稀释液配方就不同。渗透压过高的稀释液会使精子在稀释过程中严重脱水，精子内部渗透压迅速升高，造成精子破裂。渗透压过低的稀释液，又会使精子在冷冻过程中不断被激活，从而导致大量精子死亡。尼罗罗非鱼精子的渗透压在280～285mOsM之间，这就要求尼罗罗非鱼的精子稀释液渗透压也在这个值的区间，从而确保精子在被稀释后，即不被激活也不破裂。

2.不同鱼类的精子密度不同，决定了在冷冻过程中精子的稀释比也不尽相同。尼罗罗非鱼精液中所含精子的密度一般为1.4～1.8×10⁹个/ml。当对罗非鱼精子进行超低温保存时，含高密度精子的精原液是不能直接进行超低温冷冻保存的。这是因为在冷冻过程中，当温度降到0℃～-20℃区间时，被保存的精液中会形成冰晶，冰晶像锋利的刀一样刺向四周的精子，将精子刺破。这种在冷冻过程中冰晶对精子的物理损伤将直接导致精子超低温冷冻保存的失败。因此，冷冻前必须要对精子进行稀释。如果稀释比较低，稀释不够，则精子密度仍然过高，精子被刺破的概率也仍然很高。稀释比过高，则影响了精子保存的总量，精子保存的效率很低，而且还会影响到后期的冻精授精。

3.不同鱼类的精子膜通透性也不尽相同。精子膜的通透性决定了精子冷冻前在稀释液中的最小平衡时间。通透性好的精子平衡时间较短，通透性差的精子平衡时间较长。因此，每一种鱼的精子都有一个相对恒定的最小平衡时间。精子在达到最小平衡时间后可以维持一段时间精子活力不衰减。不同的鱼类这段时间是不完全相同的，它与精子被激活后的寿命有关。一般来讲，当激活液选择正确时，寿命越长，则这段时间也越长。尼罗罗非鱼精子的这段时间在4℃冰箱中可维持1小时40分钟。超过这段时间，精子就开始呈几何级数衰减。

4.由于不同鱼类精子的大小、形状不同，导致温度在精子中的传导速度和时间也不相同。因此，每种鱼精子超低温保存的降温程序也不尽相同。尼罗罗非鱼精子的降温程序是经过反复试验后摸索出来的。

上述因素的综合效应决定了尼罗罗非鱼精子的超低温冷冻保存必须要有其特定的方法。本发明中的方法是根据尼罗罗非鱼精子的生物学特性所设计的，目前已成功的应用到尼罗罗非鱼精子的超低温保存中。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种尼罗罗非鱼精子超低温保存的方法，方法易行，操作简便，应用该方法保存尼罗罗非鱼精子，可最大限度的提高精子复苏后的存活率，减少冷冻过程对精子的各种损伤。对尼罗罗非鱼精子进行超低温保存，从而为罗非鱼的选育种提供必须的材料和手段。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

一种尼罗罗非鱼精子超低温保存的方法，其步骤是：

(1)尼罗罗非鱼精子的采集：选择性腺发育成熟的尼罗罗非鱼雄鱼，用干毛巾擦干生殖孔周围及腹部的水。用手轻轻挤压雄鱼腹部，待能挤出精液后，前面几滴(3-6)精液不要，然后将精液挤入干燥的容器中，混匀。

(2)精子活力检测：在10×20倍的显微镜下进行镜检，计算机辅助检测鲜精平均活率达到85％以上，平均曲线运动速度(VCL)达到35微米/秒以上，平均直线运动速度达到20微米/秒以上，该精子便可用于超低温冷冻保存。将镜检合格的精子放入4℃冰箱保存备用。

(3)精子的稀释：精确量取需要被冷冻的尼罗罗非鱼精液，加入精液约3倍体积(为了分装方便，稀释液的量可适当增减一点，增减的量一般不超过总量的10％)的精子稀释液，使精液与稀释液的稀释比达到约1∶3。精液与稀释液混匀，备用。

所述的精子稀释液：所用稀释液为罗非鱼通用稀释液，其配方为：127.5mmol/L氯化钠(NaCl)，7.5mmol/L氯化钾(KCl)，2.5mmol/L碳酸氢钠(NaHCO₃)，2.0mmol/L氯化钙(CaCl₂)。该稀释液渗透压为283.5mOsM，pH为8.5。作用是尽可能减少冷冻过程中冰晶对精子的损伤。放置在4℃冰箱保存，备用

(4)精液的冻前平衡：将稀释后的精液放入4℃冰箱，进行冻前平衡。尼罗罗非鱼精液的冻前平衡时间为20-120分钟。20分钟为最少平衡时间，如果平衡时间不到20分钟，则冷冻效果会下降。120分钟为最长平衡时间，20分钟到120分钟以内，冷冻效果没有差异，超过120分钟，则冷冻效果随着时间的延长逐渐降低。

(5)加抗冻剂及分装：在平衡好的尼罗罗非鱼精液中直接加入抗冻剂二甲亚砜(DMSO)，加入的量为稀释后精液总量的8～9％，使抗冻剂在精液中的终浓度达到8％左右。抗冻剂加入后，立即混匀，分装。目前分装有2种容器，一种是0.5ml麦管，6支麦管装入1个麦管套中，1个冷冻架上可放2个麦管套。一般冷冻精液稀释后的总量低于18ml时，就采用这种方式分装。这种分装方式的优点是冷冻保存的成功率高，解冻速度快。缺点是分装较慢。另一种是2ml冷冻管，1个冷冻架上可放5支冷冻管。一般冷冻精液总量大于20ml时，就采用这种方式分装。这种分装方式的特点是分装速度较快，适合大批量精子的超低温保存，缺点是冷冻效果比麦管差，解冻速度也较慢。无论是麦管分装，还是冷冻管分装均需注意：首先，所有的管内必须被精液装满，不能留有气泡。其次，所有的分装过程必须在冰面完成，分装完成的管子在没有进入程序降温仪前，应全部埋在冰里，确保管内的精液不会升温。

所述的抗冻剂：所用抗冻剂为二甲亚砜(DMSO)，无需配制，直接用原液。抗冻剂是利用其吸水作用，使精子中的部分水脱出，细胞质浓度升高，从而达到降低精子冰点的目的，防止精子在冷冻过程中精子内部形成冰晶。放置在4℃冰箱保存，备用

(6)程序降温：降温是在程序降温仪(kryo.550-16，英国)中进行，程序降温仪由计算机控制，当计算机被输入自行设计的降温程序后，程序降温仪会按照设计好的程序开始降温。将分装好的精液以最快的速度放入程序降温仪的冷冻室中。尼罗罗非鱼的降温程序从0℃开始，以5℃/分钟的速度降至-15℃，在-15℃停留5分钟，然后再以25℃/分钟速度从-15℃降至-85℃，最后在-85℃处平衡10分钟。

所述的降温程序为：从0℃开始，以5℃/分钟的速度降至-15℃，在-15℃停留5分钟，然后再以25℃/分钟速度从-15℃降至-85℃，最后在-85℃处平衡10分钟。

(7)进入液氮：降温完成后，直接将装有精液的麦管或冷冻管连同冷冻支架一起从程序降温仪中取出，立即放入液氮罐中，在-196℃温度中保存。

与其他鱼类精子超低温冷冻保存方法的比较：

下表为尼罗罗非鱼精子与其他几种鱼类超低温保存方法的比较

尼罗罗非鱼精子超低温冷冻保存方法与其它鱼类精子超低温保存方法比较，具有以下优点和效果：

1.罗非鱼精子稀释液与中华鲟精子稀释液相比差异很大，不仅渗透压差异很大，而且类型也完全不同。而与鲤鱼精子稀释液比，虽然同属离子型精子稀释液，但成分和渗透压也有很大差异。特别是渗透压，哪怕只有0.5mOsM的差异，也可能导致精子超低温保存的失败。因此，罗非鱼精子稀释液只能是罗非鱼专用的。

2.尼罗罗非鱼精液的稀释比是1∶3，这与鲤鱼和中华鲟的稀释比也完全不同。

3.尼罗罗非鱼的冻前平衡时间也与其它2种鱼的冻前平衡时间存在较大差异。尼罗罗非鱼的最少平衡时间为20分钟，而鲤鱼和中华鲟的最少平衡时间分别为15分钟和40分钟。最长平衡时间尼罗罗非鱼与中华鲟相同，都是2小时，而鲤鱼只有40分钟。

4.目前，鱼类精子超低温保存所用抗冻剂只有3种，即：二甲亚砜(DMSO)、甲醛和甘油。尼罗罗非鱼精子超低温保存中选用的抗冻剂为8％左右的二甲亚砜，这是由尼罗罗非鱼精子的生物学特性决定的，它与其它鱼类的抗冻剂也存在着一定的差异。

5.尼罗罗非鱼的降温程序与其它鱼类相比也存在着一定的差异，这个降温程序是通过反复试验摸索出来的，是尼罗罗非鱼精子超低温保存所特有的。

附图说明

图1为方框示意图。

具体实施方式

实施例1：

以下以超低温保存4ml尼罗罗非鱼精液为例，说明采用尼罗罗非鱼精子超低温(-196℃)保存方法保存精子的过程。下面结合附图对本发明作进一步详细描述：

一种尼罗罗非鱼精子超低温保存的方法，其步骤是：

1.精子稀释液母液的配制：

(1)配制1000ml浓度为1M的NaCl母液：精确称取58.4g分析纯的NaCl，蒸馏水定容至1000ml。

(2)配制500ml浓度为1M的KCl母液：精确称取37.3g分析纯的KCl，蒸馏水定容至500ml。

(3)配制500ml浓度为0.5M的CaCl₂母液：精确称取55.5g分析纯的CaCl₂，蒸馏水定容至500ml。

(4)配制500ml浓度为0.5M的NaHCO₃母液：精确称取42.0g分析纯的NaHCO₃，蒸馏水定容至500ml。

(5)上述母液均放置4℃冰箱保存，备用。

2.100ml精子稀释液的配制：

(1)分别精确量取12.75ml 1M的NaCl母液；75μl 1M的KCl母液；40μl 0.5M的CaCl₂母液；50μl NaHCO₃ 0.5M的母液于100ml容量瓶中。

(2)将上述溶液混匀后，加蒸馏水定容至100ml。

(3)将上述配制好的100ml罗非鱼精子稀释液放置4℃冰箱保存，备用。

3.尼罗罗非鱼精子的超低温保存：

(1)罗非鱼精子的采集：选择性腺发育成熟的尼罗罗非鱼雄鱼1～2尾，用干毛巾擦干生殖孔周围及腹部的水。用手轻轻挤压雄鱼腹部，待挤出精液后，前面几滴精液不要，然后将精液挤入干燥的容器中。将挤出的精液混匀后，准备镜检。

(2)精子活力检测：在10×20倍的显微镜下进行镜检，计算机辅助检测鲜精平均活率达到85％以上，平均曲线运动速度(VCL)达到35微米/秒以上，平均直线运动速度达到20微米/秒以上，该精子便可用于超低温(-196℃)冷冻保存。放入4℃冰箱保存，备用。

(3)精液的稀释与平衡：取4ml镜检后符合冷冻标准的精液，加入13ml预先配制好的罗非鱼精子稀释液，稀释比约1∶3。精液与稀释液混匀后，放置4℃冰箱，冻前平衡20～40分钟。

注：4ml精液，稀释比为1∶3时，精确加入稀释液应该为12ml。但这样加的结果精液、稀释液、抗冻剂混合后的总量只有17.3ml。用麦管分装，只能分装34支。而麦管套每支必须装6支麦管，34不是6的整倍数。如果麦管套中的麦管少于6支，当放入液氮后，麦管会从麦管套中脱出。因此，实际操作时，往往通过多加或少加一点稀释液，以便分装时获得整数。

(4)添加抗冻剂与分装：将上述稀释平衡20分钟后的精液加入1.4ml二甲亚砜(DMSO)，使其终浓度达到8％左右，混匀后立即分装。用1ml微量进样器将上述混合液吸入0.5ml麦管中，用封口粉封闭麦管。共分装36支麦管，将分装好的麦管放入麦管套中，共装6支麦管套。然后将麦管套放在冷冻架上，每2支麦管套放1个冷冻架，共3个冷冻架。分装前应准备1个约30cm×30cm×20cm的泡沫箱，箱内放入碎冰，上述操作全部在冰面完成。分装完成后，立即将冷冻架放入程序降温仪的冷冻仓中，准备降温。

(5)程序降温：降温程序从0℃开始，以5℃/分钟的速度降至-15℃，在-15℃停留5分钟，然后再以25℃/分钟速度从-15℃降至-85℃，最后在-85℃处平衡10分钟。降温完成后，直接将装有麦管的冷冻架从程序降温仪中取出，立即放入液氮罐中，在-196℃温度中保存。

实施例2：

以下以超低温保存50ml尼罗罗非鱼精液为例，说明采用尼罗罗非鱼精子超低温(-196℃)保存方法保存精子的过程。

一种尼罗罗非鱼精子超低温保存的方法，其步骤是：

A、精子稀释液母液的配制：

精子稀释液母液配制方法与实施例1完全相同。

B、500ml精子稀释液的配制：

(1)分别精确量取63.75ml 1M的NaCl母液；375μl 1M的KCl母液；200μl 0.5M的CaCl₂母液；250μl NaHCO₃ 0.5M的母液于500ml容量瓶中。

(2)将上述溶液混匀后，加蒸馏水定容至500ml。

(3)将上述配制好的500ml罗非鱼精子稀释液放置4℃冰箱保存，备用。

C、尼罗罗非鱼精子的超低温保存：

(1)罗非鱼精子的采集：选择性腺发育成熟的尼罗罗非鱼雄鱼10～15尾，用干毛巾擦干生殖孔周围及腹部的水。用手轻轻挤压雄鱼腹部，待挤出精液后，前面几滴精液不要，然后将精液挤入干燥的容器中。将挤出的精液混匀后，准备镜检。

(2)精子活力检测：在10×20倍的显微镜下进行镜检，计算机辅助检测鲜精平均活率达到85％以上，平均曲线运动速度(VCL)达到35微米/秒以上，平均直线运动速度达到20微米/秒以上，该精子便可用于超低温冷冻保存。放入4℃冰箱保存，备用。

(3)精液的稀释与平衡：取50ml镜检后符合冷冻标准的精液，加入150ml预先配制好的罗非鱼精子稀释液，稀释比为1∶3。精液与稀释液混匀后，放置4℃冰箱，冻前平衡20分钟～2小时。

(4)添加抗冻剂与分装：将上述稀释平衡20分钟后的精液加入17.3ml二甲亚砜(DMSO)，使其终浓度达到8％左右，混匀后立即分装。用2ml微量进样器将上述混合液吸入2.0ml冷冻管中。共分装105支冷冻管，然后将冷冻管放在冷冻架上，每5支冷冻管放1个冷冻架，共21个冷冻架。分装前应准备1个约30cm×30cm×20cm的泡沫箱，箱内放入碎冰，上述操作全部在冰面完成，且时间不能超过1小时40分钟。分装完成后，立即将冷冻架放入程序降温仪的冷冻仓中，准备降温。

Claims

1.一种尼罗罗非鱼精子超低温保存的方法，其步骤是：

(1)尼罗罗非鱼精子的采集：选择性腺发育成熟的尼罗罗非鱼雄鱼，用干毛巾擦干生殖孔周围及腹部的水，用手轻轻挤压雄鱼腹部，待能挤出精液后，前面3-6滴精液不要，然后将精液挤入干燥的容器中，混匀；

(2)精子活力检测：在10×20倍的显微镜下进行镜检，计算机辅助检测鲜精平均活率达到85%，平均曲线运动速度达到35微米/秒，平均直线运动速度达到20微米/秒，该精子适合用于超低温冷冻保存，将镜检合格的精子放入4℃冰箱保存备用；

(3)精子的稀释：精确量取需要被冷冻的尼罗罗非鱼精液，加入精液3倍体积的精子稀释液，使精液与稀释液的稀释比达到1:3，精液与稀释液混匀，备用；

所述稀释液为罗非鱼通用稀释液，其配方为：127.5mmol/L氯化钠，7.5mmol/L氯化钾，2.5mmol/L碳酸氢钠，2.0mmol/L氯化钙；该稀释液渗透压为283.5mOsM，pH为8.5，放置在4℃冰箱保存；

(4)精液的冻前平衡：将稀释后的精液放入4℃冰箱，进行冻前平衡，尼罗罗非鱼精液的冻前平衡时间为20-120分钟，20分钟为最少平衡时间，120分钟为最长平衡时间；

(5)加抗冻剂及分装：在平衡好的尼罗罗非鱼精液中直接加入抗冻剂二甲亚砜，加入的量为稀释后精液总量的8～9%，使抗冻剂在精液中的终浓度达到8%，抗冻剂加入后，混匀，分装；

(6)程序降温：程序降温是在程序降温仪中进行，程序降温仪由计算机控制，计算机被输入降温程序后，程序降温仪按照程序开始降温，将分装好的精液放入程序降温仪的冷冻室中，尼罗罗非鱼的降温程序从0℃开始，以5℃/分钟的速度降至-15℃，在-15℃停留5分钟，然后再以25℃/分钟速度从-15℃降至-85℃，最后在-85℃处平衡10分钟；

(7)进入液氮：降温完成后，直接将装有精液的麦管或冷冻管连同冷冻支架一起从程序降温仪中取出，放入液氮罐中，在-196℃温度中保存。