CN100569071C - 中华鲟精子超低温冷冻保存的方法 - Google Patents
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Abstract
中华鲟精子超低温冷冻批量保存技术及工艺为：鲜精采集及检测、精子稀释、冻前平衡、加抗冻剂及分装、程序降温、最后进入温度为-196℃液氮罐中保存；每批可冷冻100毫升鲜精，当第1批精子进行到工艺中的程序降温5分分钟后，第2批精子可从工艺中的精子稀释开始操作，如此重复，直至全部精子在中华鲟精子的有效时间8-12小时前冷冻完毕。所述的稀释剂为20～30毫摩尔Tris-HCl，30～60摩尔蔗糖、2～10毫摩尔氯化钾，蒸馏水定溶至1000毫升，HCl调pH值8～8.5；所述的抗冻剂为甲醇。本发明能有效地实现对中华鲟精子超低温冷冻批量保存及长期超低温冷冻保存，为中华鲟人工繁殖提供足够量的精子资源。
Description
技术领域
本发明涉及到鱼类精子超低温冷冻保存方法，特别是对中华鲟精子超低温保存方法。
背景技术：
随着鱼类苗种人工繁育和遗传育种研究的发展，鱼类精子超低温冷冻保存技术已引起人们的关注，鱼类精子超低温冷冻保存首次成功是在1968年，用保存30天(-196℃)白鳝鱼精，获得了80-89％的受精率。近年来，鱼类精子超低温冷冻保存已逐步扩展到鲤科、鲈科、鲶科、鲡科以及鲑鱼鳟鱼类。
中华鲟是珍稀鱼种之一，属我国一级保护动物，它是我国特有的大型淡水鱼类，主要分布于长江水系和珠江水系。近来年，由于水质污染的加剧，以及捕捞强度增大，中华鲟种群锐减，提高中华鲟人工繁殖及人工放流技术，以帮助该种群恢复，已受到党和政府高度的重视，也是水产界重大的科研课题。
目前，中华鲟亲鱼的来源完全是葛洲坝下的自然群体，但是在进行人繁殖的过程中，由于是天然捕捞的亲鱼，个体较大，获得亲鱼的数量受到很大的限制，从而极易导致雌、雄亲鱼性腺成熟不同步。实际繁殖过程中，往往是雄鱼成熟了，雌鱼尚未排卵；或有了成熟的雌鱼，却没有雄鱼。两者之间时间相差短的为几小时，或者1～2天；长的时间甚至可达上十天。
另一方面，由于中华鲟为大型鱼类，授精一条雌鱼一般需几百，甚至上千毫升精液，使本来数量有限的亲本有效利用率进一步下降，成本增多。而且，中华鲟精子一旦被挤出体外后，允许进行超低温保存的操作时间为12小时，目前鱼类的冷冻保存技术每小时最多只能完成5～8毫升左右的精子保存，而1条中华鲟精液约为1000毫升。以目前的技术，最多只能有100毫升可用于低温保存，不能适应大型鱼类即中华鲟保存精子的需要。
发明内容：
本发明的目的是：实现对中华鲟精子超低温冷冻批量保存，解冻后的受精率达到70％以上。
本发明的另一目的是：实现我国特有的大型、珍稀、濒危鱼类中华鲟精子的长期超低温冷冻保存。
本发明的技术方案如下：
本发明的工艺为：鲜精采集及活力检测、精子稀释、抗冻剂及分装、程序降温、进入液氮。
1、鲜精的采集：挤压成熟雄中华鲟的腹部，即可收集到鲜精，在收集鲜精过程中，应绝对避免精子与水接触，收集到的鲜精放入密封的塑料袋中，在温度为4℃的冰箱或容器中保存；
2、鲜精镜检：在10×10倍的显微镜下进行镜检，计算机辅助检测鲜精平均活率达到85％，平均曲线运动速度达到160微米/秒以上，平均直线运动速度达到90微米/秒以上，即可冷冻；
3、中华鲟稀释液配制：鱼类精子被激活是依靠精子自身的渗透压与周围环境水中渗透压差来实现的，温水鱼类精子是由淡水环境的低渗所诱发，而海水鱼类精子运动则由海水的交渗所刺激。而渗稀释液的作用是：实现精子的长期保存，确保精子在保存过程中处于完全静止状态；
中华鲟稀释液的配制：20～30毫摩尔Tris-HCl，30～60毫摩尔蔗糖，2～10毫摩尔KCl，蒸馏水定溶1000毫升，HCl调pH值8～8.5，然后再放入温度为4℃的冰箱内存放；
4、精子稀释：将中华鲟精子与稀释液按1∶3比例在烧杯中混合并摇匀，然后放置于温度为4℃的冰箱内平衡20分钟；
5、程序降温度仪开机：连接好程序降温仪所有线路，液氮罐中加液氮30升以上，放好液氮泵，关好泵上气阀，打开电脑和程序、机后开关、液氮泵开关、使液氮压力升至0.2ibf/in2以上；打开降温仪开关，降温程序启动，使降温仓温度在15～20分钟内降至0℃，等待加样；
6、加抗冻剂及分装：将上述稀释平衡后的精子加入甲醇，使其甲醇终浓度达到9～10％，混匀后立即分装，用2毫升微量进样器进行分装，分装入2毫升冷冻管中，一次可装10支管，约需时间为10秒钟，于3～4分钟完成分装，将分装好的冷冻管放入冷冻架上，立即放入程序降温仪的冷冻仓中，
所述的抗冻剂，是利用其脱水作用，使精子中的部分水脱出，因为精子内含有大量的水分，当精子在降温冷冻过程中，在通过冰晶形成区(一般为-15℃～-60℃)时，其内部会形成冰晶，从而破坏细胞膜，导致精子死亡，加入脱水剂之后，可使精子中的水部分脱出，以达到降低精子冰点的目的，防止精子在冷冻过程中严重脱水和低温休克；
7、程序降温：降温程序为0℃开始，以3℃/分钟的速度从0℃降至-5℃，以5℃/分钟的速度从-5℃降至-15℃，以10℃/分钟速度从-15℃降至-25℃，再以20℃/分钟速度从-25℃降至-80℃，最后平衡5分钟，降温完成后，直接将精子从程序降温仪中取出，立即放入液氮罐中，在-196℃温度中保存，从0℃开始降温起一直到精子转入液氮罐中止，其操作时间约需要20分钟完成；
8、每批精子按第4～6步骤可冷冻100毫升鲜精，当第1批精子进行到第7步时，第2批精子可从第4步开始操作。
本发明的优点是：
1、能对中华鲟精子批量超低温冷冻保存，解冻后的受精率达到70％以上，为中华鲟人工繁殖提供足够的精子资源，特别是是当中华鲟雌、雄鱼性腺成熟不同步时，能提供足够量精子资源。
2、在鱼类种质资源保存中，为进一步研究中华鲟物质的长期保存。提供了参考依据和方法。
3、中华鲟精子冷冻保存采用的配制的稀释剂成分、渗透压、含量、pH值稳定。
4、中华鲟精子冷冻保存采用冷冻抗冻剂脱水保护稳定。避免了精子在冷冻过程中形成冰晶。
5、中华鲟精子与其他几种鱼类精子超低温冷冻保存相关参数比较。
通过上述表内比较结果可以说明：中华鲟精子个体较大，精液量多，本发明通过调整冻前平衡时间，操作方法分步降温等，实现了对中华鲟的精子批量冷冻保存。
具体实施方式：
实施例1：下面以冷冻500毫升中华鲟鲜精为例，说明具体操作过程：
1、挤压成熟雄中华鲟的腹部，收集500毫升以上的鲜精，收集过程中应绝对避免精子与水接触，收集到的鲜精按每袋100毫升的量放入冲氧后的密封的塑料袋中，共装5袋，然后放进温度为4℃的冰箱内保存；
2、在10×10倍的显微镜下进行镜检，计算机辅助检测鲜精平均活详细达到85％，平均曲线运动速度达到160微米/秒以上，平均直线运动速度达到90微米/秒以上，达到比标准即可冷冻；
3、中华鲟精子稀释液的配制：2000毫升稀释配制法：1摩尔Tris-HCl20毫升，1摩尔蔗糖30毫升，1摩尔氯化钾2毫升，蒸馏水定溶至1000毫升，HCl调pH值至8.5，配2次，共配制2000毫升，在温度为4℃冰箱中存放、备用。
4、每次从1袋中华鲟精液中用量筒取100毫升鲜精，取300毫升稀释液在500毫升烧杯中混合并摇匀，使其总体积为400毫升，再放入温度为4℃冰箱内平衡20分钟；
5、在液氮罐内加入30升以上的液氮，并打程序降温仪和液氮罐上的液氮泵开关，放液氮压力升至0.2ibf/in2以上，程序降温仪的降温仓温度在15～20分钟内降至0℃；
6、将上述平衡后的精子加入40毫升甲醇，并使其浓度达到9～10％，摇匀后用2毫升微量进样器进行分装到2毫升冷冻管中，一次可装10支管，约需10秒钟，分装完毕约为3～4分钟，分装好的冷冻罐放入冷冻架上，每个冷冻架上放10支管，共40个冷冻架，立即将其放入程序降温仪的冷冻仓中。
7、降温从0℃开始，以3℃/分钟的速度从0℃降至-5℃，以5℃/分钟的速度从-5℃降至-15℃，以10℃/分钟的速度从-15℃降至-25℃，最后以20℃/分钟的速度从-25℃降至-80℃，然后平衡5分钟，从程序降温仪中将精子取出立即放入-196℃的液氮中保存，整个操作时间约需20分钟；
8、当第7步进行了到5分钟时，可从第4步，开始第2个100毫升鲜精的冷冻过程作；
按上述冷冻过程操作计算，完成500毫升鲜精的冷冻时间为2.5～3小时，而中华鲟精子的有效冷冻时间为8～12小时，因此，该方法是以完成一条中华鲟的所有精子的冷冻保存。
实施例2：下面以冷冻1000毫升中华鲟鲜精为例，需4000毫升稀释液，其配置如下：
1摩尔Tris-HCl 20毫升，1摩尔蔗糖30毫升，1摩尔氯化钾2毫升，蒸馏水定溶至1000毫升，HCl调pH值8.5，配4次，共配制4000毫升，4℃冰箱存放、备用；
其他操作方法与上述实施例1相同。
Claims (1)
1、中华鲟精子超低温冷冻保存的方法，其特征是：
(1)、鲜精的采集：挤压成熟雄中华鲟的腹部，即可收集到鲜精，在收集鲜精过程中，应绝对避免精子与水接触，收集到的鲜精放入密封的塑料袋中，在温度为4℃的冰箱或容器中保存；
(2)、鲜精镜检：在10×10倍的显微镜下进行镜检，计算机辅助检测鲜精平均活率达到85％，平均曲线运动速度达到160微米/秒以上，平均直线运动速度达到90微米/秒以上，即可冷冻；
(3)、中华鲟稀释液配制：20～30毫摩尔Tris-HCl，30～60毫摩尔蔗糖，2～10毫摩尔KCl，蒸馏水定溶1000毫升，HCl调pH值8～8.5，然后再放入温度为4℃的冰箱内存放；
(4)、精子稀释：将中华鲟精子与稀释液按1∶3比例在烧杯中混合并摇匀，然后放置于温度为4℃的冰箱内平衡20分钟；
(5)、程序降温度仪开机：连接好程序降温仪所有线路，液氮罐中加液氮30升以上，放好液氮泵，关好泵上气阀，打开电脑和程序、机后开关、液氮泵开关、使液氮压力升至0.2以上；打开降温仪开关，降温程序启动，使降温仓温度在15～20分钟内降至0℃，等待加样；
(6)、加抗冻剂及分装：将上述稀释平衡后的精子加入甲醇，使其甲醇终浓度达到9～10％，混匀后立即分装，用2毫升微量进样器进行分装，分装入2毫升冷冻管中，一次可装10支管，需时间为10秒钟，于3～4分钟完成分装，将分装好的冷冻管放入冷冻架上，立即放入程序降温仪的冷冻仓中；
(7)、程序降温：降温程序为0℃开始，以3℃/分钟的速度从0℃降至-5℃，以5℃/分钟的速度从-5℃降至-15℃，以10℃/分钟速度从-15℃降至-25℃，再以20℃/分钟速度从-25℃降至-80℃，最后平衡5分钟，降温完成后，直接将精子从程序降温仪中取出，立即放入液氮罐中，在-196℃温度中保存，从0℃开始降温起一直到精子转入液氮罐中止，其操作时间需20分钟完成；
(8)、每批精子按第4～6步骤可冷冻100毫升鲜精，当第1批精子进行到第7步时，第2批精子可从第4步开始操作。
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