CN101088511B - 鱼类精子超低温冷冻保存简易方法 - Google Patents

Abstract

鱼类精子超低温冷冻保存简易方法，它是将鱼类精子取出后，将精子与稀释液按1∶1～5的比例稀释放入4℃冰箱内平衡20-30分钟，再加入一定浓度的抗冻剂，然后用0.5毫升麦细管分装后，放入泡沫箱内液氮面上厚2.5～3厘米，宽10厘米沫板上，20分钟后，将泡沫板上的麦细管滑入液氮中，5分钟后再将所有的麦细管转入温度为-196℃的液氮罐中内冷冻保存。本发明能在离实验室很远的野外条件下，以及没有程序降温仪或计算机控制程序降温仪的情况下，实现对鱼类精子快速、简便、超低温冷冻保存，其操作简便易行，冷冻效果好，成本低。

Description

鱼类精子超低温冷冻保存简易方法

技术领域：

本发明涉及到鱼类精子超低温冷冻保存方法

背景技术

当前，鱼类精子超低温冷冻保存采用有三种方法：一种是小丸颗粒冷冻法，另一种是安瓿瓶冷冻法，第三种是麦细管冷冻法。其小丸颗粒冷冻法是将鱼类精子直接滴入干冰内或用液氮蒸气冷冻成精子小颗粒，然后转入液氮罐中，用程序降温仪或计算机控制程序降温仪控制鱼类精子的冷冻速度，使鱼类精子冷冻温度达到-196℃进行保存。这种冷冻方法不足之处在于：每次保存的精子量很少，而且解冻需要合适的解冻液，因此很少有人采用。安瓿瓶冷冻法是将鱼类精子装入安瓿瓶中，然后再转入液氮罐内，用程序控制降温仪或计算机控制程序降温仪控制鱼类精子冷冻速度，使其鱼类精子冷冻温度达到-196℃进行保存。麦细管冷冻法是将鱼类精子装入麦细管中，然后再转入液氮罐内，用程序控制仪或计算机控制程序降温仪控制鱼类精子冷冻速度，使其鱼类精子冷冻温度达到-180℃进行保存。安瓿瓶冷冻法和麦细管冷冻法的优点是可以避免精子与冷冻剂的直接接触，但安瓿瓶冷冻法不足的是：安瓿瓶体积较大，降温难以均匀，而且操作比较复杂。以上三种方法均是在实验室中进行，其程序控制降温仪或计算机控制程序降温仪对降温过程的控制相当准确。在对鱼类精子进行冷冻保存时，特别是对珍稀和濒危鱼类精子的冷冻保存时，采集精子的地点往往是野外。而鱼类精子一旦被采集，其活力就处于一种随时间衰减的状态，这种衰减的状态直接影响冷冻后的精子复苏效果。珍稀鱼类精子的采集往往几年、甚至几十年才可能有一次采集精子的机会，一旦错过，很难再采集到。而野外离实验室太远，有时甚至需要1-2天才能回到实验室，这样，采集到的精子待回到实验室时均已死亡。而程序降温仪或计算机控制程序降温仪体积较大，很笨重，不便于搬到野外进行工作。

发明内容：

本发明的目的是在离实验室很远的野外条件下，不用程序降温仪或计算机控制程序降温仪实现对鱼类精子快速、简便、超低温冷冻保存。

本发明技术方案是以如下方式实现的：

1、取性腺发育成熟的亲鱼(雄性)，将亲鱼腹部用干毛巾擦干净，挤下腹部，用干净的注射器在生殖孔处吸取精子；

2、用预先配制好的稀释液，不同的鱼种，其稀释液的成分和浓度均不相同，其精子与稀释液之间按1∶1～5的比例稀释精子；

3、稀释后的精子放在温度为4℃的冰箱内平衡20～30分钟；

4、平衡后的精子用0.5毫升麦细管分装；

5、将液氮加入一个带盖的泡沫箱内，其内的中空泡沫板的中空宽度为10厘米，0.5毫升的麦细管正好横在上面，长度可依据泡沫箱的大小而定，越长，一次放的麦细管越多，泡沫板浮在液氮表面，盖上盖保持2分钟；

6、打开泡沫箱盖，将分装好的麦细管迅速横放在泡沫板上，每只麦细管之间要保持一定的距离，由于泡沫板的厚度为2.5～3cm，其麦细管正好位于液氮面2.5～3cm处，盖上泡沫箱盖，保持20分钟；

7、打开泡沫箱，将泡沫板一端往上提起，使细麦管迅速滚入泡沫箱内的液氮中；

8、5分钟后即可将麦细管转入液氮罐在温度为-196℃中永久保存。

本发明的优点是：

1、本发明与采用程序降温仪对10种鱼类精子的冷冻效果进行比较，其效果优于程序降温仪。下表为两种方法的比较：

鱼类	鲜精活率(％)	程序降温冻精活率(％)	本发明冻精活率(％)
				草鱼	91.23	70.04	68.74
白鲢	85.60	45.63	52.70
				鳙	93.33	73.11	72.19
建鲤	93.47	78.52	78.89
				团头鲂	95.16	73.65	69.26
大头鲇	89.69	68.82	65.34
				中华鲟	94.38	78.95	80.17
中华倒刺鲃	82.66	54.15	59.36
				匙吻鲟	91.78	80.97	79.15
胭脂鱼	77.49	42.61	38.56

2、能在野外不用程序降温仪或者计算机程序控制降温仪实现对鱼类精子快速、简便、超低冷冻保存。

3、操作简便易行，成本低。

附图说明：

图：泡沫箱结构图

具体实施方式：

实施例1

图中，泡沫箱2的上面有一个箱盖1，泡沫箱2内有液氮4，液氮4的上面有泡沫板3，泡沫板3为中空板，共厚度为25毫米，长为25厘米，宽为100毫米，泡沫板3上放有9支麦细管5。

实施例2：

下面以冷冻10毫升鲤鱼精子为例，说明简易冷冻方法的具体操作过程：

(1)鲜精采集10毫升鲤鱼精子后，放置于温度为4℃的冰箱内，每次取5毫升鲜精，加入20毫升稀释液于30毫升指管瓶中混匀，总体积为25毫升，在温度为4℃冰箱内平衡30分钟，其稀释液为8克NaCl，0.5克KCl，15克葡萄糖，蒸馏水定溶至1000毫升，pH6.0；

(2)平衡完成后，加入2.16毫升DMSO(二甲砜抗冻剂)，使其抗冻剂的浓度达到8％，混匀后，立即用0.5毫升麦细管分装，50支麦细管即可全部分装完成，分装时间越短越好，一般只需30-60秒；

(3)将分装好的麦细管横放在泡沫箱液氮面上的泡沫板上，泡沫板中空宽10厘米，长20厘米，厚2.5厘米时，可放50支以上的麦管；

(4)盖上泡沫箱盖，保持20分钟，同时重复1～3的过程，20分钟后，提起泡沫板一端，使麦管滚入下面液氮中，再放第二批分装好的麦细管，如此重复，直到全部精子冷冻完；

(5)5分钟后，将泡沫箱内液氮中的麦细管全部转入液氮罐中，在温度为-196℃中长期保存。

实施例3

以下用冷冻20毫升胭脂鱼精子，说明冷冻方法的具体操作过程：

(1)鲜精采集后，放置于4℃的冰箱中，每次取10毫升鲜精，加入30毫升稀释液于50毫升指管瓶中摇匀，总体积为40毫升，在4℃冰箱内平衡30分钟，其稀释液8克NaCl，0.5克KCl，15克葡萄糖，蒸馏水定溶至1000毫升，pH7.0；

(2)平衡完成后，加入3.26毫升DMSO(二甲砜抗冻剂)，使其抗冻剂的浓度达到8％，混匀后，立即用0.5毫升麦管分装，约80支麦管即可全部分装完成，分装时间越短越好，一般只需30-60秒；

(3)将分装好的麦管横放在泡沫箱液氮面上的泡沫板上，泡沫板中空宽10厘米，长30厘米，厚3厘米时，可放80支以上的麦细管；

(4)盖上泡沫箱盖，保持20分钟，同时重复1～3的过程，20分钟后，提起泡沫板一端，使麦细管滚入下面液氮中，再放第二批分装好的麦细管，如此重复，直到全部精子冷冻完；

(5)5分钟后，将泡沫箱内液氮中的麦管全部转入液氮罐中，在温度为-196℃中长期保存。

Claims (2)

1.鱼类精子超低温冷冻保存简易方法，其特征是：

(1)鲜精采集10毫升鲤鱼精子后，放置于温度为4℃的冰箱内，每次取5毫升鲜精，加入20毫升稀释液于30毫升指管瓶中混匀，总体积为25毫升，在温度为4℃冰箱内平衡30分钟，其稀释液为8克NaCl，0.5克KCl，15克葡萄糖，蒸馏水定溶至1000毫升，pH6.0；

(2)平衡完成后，加入2.16毫升‘DMSO’，使其抗冻剂的浓度达到8％，混匀后，立即用0.5毫升麦细管分装，50支麦细管即可全部分装完成，分装时间需30-60秒；

(3)将分装好的麦细管横放在泡沫箱液氮面上的泡沫板上，泡沫板中空宽10厘米，长20厘米，厚2.5厘米时，可放50支以上的麦管；

(4)盖上泡沫箱盖，保持20分钟，同时重复(1)～(3)的过程，20分钟后，提起泡沫板一端，使麦管滚入下面液氮中，再放第二批分装好的麦细管，如此重复，直到全部精子冷冻完；

(5)5分钟后，将泡沫箱内液氮中的麦细管全部转入液氮罐中，在温度为-196℃中长期保存。

2.鱼类精子超低温冷冻保存简易方法，其特征是：

(1)鲜精采集20毫升胭脂鱼精子后，放置于4℃的冰箱中，每次取10毫升鲜精，加入30毫升稀释液于50毫升指管瓶中摇匀，总体积为40毫升，在4℃冰箱内平衡30分钟，其稀释液8克NaCl，0.5克KCl，15克葡萄糖，蒸馏水定溶至1000毫升，pH7.0；

(2)平衡完成后，加入3.26毫升‘DMSO’，到8％，混匀后，立即用0.5毫升麦管分装，约80支麦管即可全部分装完成，分装时间需30-60秒；

(3)将分装好的麦管横放在泡沫箱液氮面上的泡沫板上，泡沫板中空宽10厘米，长30厘米，厚3厘米时，可放80支以上的麦细管；

(4)盖上泡沫箱盖，保持20分钟，同时重复(1)～(3)的过程，20分钟后，提起泡沫板一端，使麦细管滚入下面液氮中，再放第二批分装好的麦细管，如此重复，直到全部精子冷冻完；

(5)5分钟后，将泡沫箱内液氮中的麦管全部转入液氮罐中，在温度为-196℃中长期保存。

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