RO127804B1

RO127804B1 - Procedeu pentru obţinerea unui produs seminal refrigerat de berbec şi ţap şi produsul obţinut prin acest procedeu

Info

Publication number: RO127804B1
Application number: ROA201101326A
Authority: RO
Inventors: Stela Filofteia Zamfirescu; Nicolae Dobrin; Andreea Hortanse Anghel
Original assignee: Universitatea "Ovidius" Din Constanţa
Priority date: 2011-12-06
Filing date: 2011-12-06
Publication date: 2016-04-29
Also published as: RO127804A0

Description

Invenția se referă la un procedeu și la un produs seminal refrigerat, de berbec și țap, conservat prin refrigerare până la 5 zile, cu aplicabilitate în zootehnie și medicină veterinară, ca principal mijloc de difuzare a progresului genetic la rumegătoarele mici.

Obiectivul prezervării spermatozoizilor la temperaturi subambientale (2ΓΟ) este acela de a scădea metabolismul lor, în scopul prelungirii viabilității. S-a constatat că o gamă largă de temperaturi din intervalul +2...+15°C asigură menținerea viabilității și fertilității celulelor. Sperma de berbec se diluează imediat după colectare în mediu salin, cu adaos de gălbenuș de ou, iar la țap diluarea se face numai după îndepărtarea plasmei seminale prin spălare și centrifugare, după care concentratul de celule se diluează în același tip de mediu.

Metodele cunoscute de conservare pe durată scurtă a spermei de berbec și țap constau din prezervarea la+12...+ 15°C, timp de 10 h, și refrigerarea la+2...+5°C, timp de 24 h. Diluarea se face în mediul salin citrat de sodiu, glucoză și gălbenuș de ou, la o rată de 1/15. Rezultatele fertilității după inseminare artificială la femele sunt variabile, de la 40% la 65%.

Documentul Florin Varo Ghiuru, loan Ladosi, Iulian Roman, Andrea Hettig, Marius Zăhan, Vasile Miclea, “Antioxidant Medium forMangalita Boar Semen Cryopreservation”, Bulletin UASVM Animal Science and Biotechnologies, 67(1-2)/2010 se referă la stabilirea condițiilor tehnice ale crioconservării indispensabile a spermei de vier, pentru ameliorarea eficienței porcului nativ de Mangalița. Obiectivul acestui studiu a fost de a determina dacă acidul ascorbic este capabil să îmbunătățească semnificativ calitatea spermatozoizilor crioconservați, din porci de Mangalița. Ejaculatul de la porcul de Mangalița și PIC (ca comparație) spermă de porc congelată într-un extender suplimentat cu 200 μΜ acid ascorbic (vitamina C), 400 μΜ Trolox® (o vitamina E hidrosolubilă analog), 200 + 400 μΜ vit. C + vit. E, 200 + 200 μΜ vit. C + vit. E sau fără suplimentare a fost decongelat și apoi a fost evaluată motilitatea spermatozoizilor. Tratamentul cu 200 + 400 μΜ vit. C + vit. E are efectul cel mai benefic asupra motilității spermatozoizilor de Mangalița după congelate-decongelare printre concentrațiile testate (P < 0,05), iar documentul Marius Zăhan, Vasile Miclea, Florin Ghiuru, Iulian Roman, Alexandru Rusu, Ileana Miclea, Manuel Mihăilescu, “The Influence ofFreezing on Some Rare Breeds Boar Semen Cryopreservation”, Bulletin UASVM Animal Science and Biotechnologies, 67(1-2)/2010 se referă la cercetări în crioconservarea materialului seminal de vier, aplicarea de îngheț-dezgheț (FT) a materialului seminal în programe de inseminare artificială comercială (Al) este încă limitată. Principalele surse de material seminal utilizate în Al sunt păstrarea materialului seminal la temperatura camerei (RT) și, uneori, a materialului seminal proaspăt (F). Cu toate acestea, utilizarea germoplasmei de mascul din genebank pe unele rase rare este legată de capacitatea de a folosi material seminal congelat. Scopul acestui studiu a fost de a evalua efectul metodei de conservare a materialului seminal și, în special, influența congelării pe Mangalița Roșu și crioconservarea materialului seminal de vier de Bazna.

Soluțiile cunoscute din stadiul tehnicii, pentru conservarea materialului seminal ovin, prezintă dezavantajul că nu asigură perioadă adecvată de viabilitate a celulelor spermatice.

Problema tehnică pe care o rezolvă invenția constă din elaborarea unor etape de procedeu pentru obținerea unui material seminal cu viabilitate îmbunătățită.

Procedeul de obținere a produsului seminal refrigerat de berbec și țap, conform invenției, elimină dezavantajele menționate prin aceea că se obține prin parcurgerea etapelor de selectare și pregătire a masculilor de la care se va colecta sperma, colectarea materialului seminal la o temperatură de 33°C, determinarea volumului ejaculatului și a densității în spermatozoizi, după care se efectuează prediluția materialului seminal în raport de 1/1 cu diluant, la o temperatură de 32°C, pe bază citrat 2,9 g%, glucoză 0,8 g% și gălbenuș de ou 20%, evaluarea motilității, viabilității și a concentrației prin tehnici în sine cunoscute, calculul

RO 127804 Β1 diluției finale a spermei, în raport de concentrație, pentru a se asigura 5 x 10⁹ celule/ml, diluția 1 finală (20°C) prin adăugarea a 2...4 volume de diluant salin, conținând glicerină 1% ca agent crioprotector, echilibrarea spermei diluate timp de 2,5 h, prin plasarea recipientului ce conține 3 sperma diluată pe baie de apă, la frigider, pentru răcire la o temperatură de +4...+5°C, ambalarea în paiete de plastic de 0,25 ml și transportul la rece al materialului seminal diluat, 5 astfel încât produsul rezultat testat prezintă o fertilitate de 71% la 24 h după conservare, 68% după 48 h, de 64% și, respectiv, 53% după 72 și 94 h. 7

Prin aplicarea invenției se obțin următoarele avantaje:

- colectarea, procesarea și difuzarea spermei din 5 în 5 zile;9

- consecințele sunt de natură economică, deoarece sperma este transportată mai rar pe distanțe variate;11

- folosește rațional resursele umane;

- utilizează rațional materialul biologic valoros din punct de vedere genetic;13

- după inseminarea artificială a oilor și caprelor, se obțin rezultate de fertilitate de

54...71%, cu 9...15% mai mari, față de sperma refrigerată fără glicerină, și conservată prin 15 refrigerare, doar 24 h;

- folosește diluții în rate mai mici, de 5...7, care asigură o concentrație în spermatozoizi 17 de cel puțin 5 x 10⁸ celule/ml de spermă la berbec, și de 4 x 10⁸ celule/ml la spermă de țap.

Produsul refrigerat de berbec și țap necesită mai multe faze de procesare, și anume: 19 colectare, diluare, controlul calității spermei, echilibrare, ambalare și difuzare zilnică la utilizatori.

Produsul seminal refrigerat, de berbec și țap, cu viabilitate de 5 zile, realizat după 21 procedeul propus de autori, prelungește viabilitatea celulelor spermatice și perioada de utilizare cu încă 4 zile. Viabilitatea și motilitatea celulelor din momentul colectării (mai mare de 80%) se 23 menține timp de 24 h, după care scade treptat cu 5% în fiecare zi. Cea mai mică viabilitate acceptată este de 60%. Această viabilitate se menține crescută pe toată durata conservării, 25 datorită crioprotecției față de șocul rece, conferită de glicerină. Metoda de procesare a spermei de berbec și țap, mediile de diluare și timpii de realizare a fazelor de procesare sunt originali, 27 stabiliți după o perioadă lungă de experimentare in vitro și in vivo. Perioada de manipulare a spermei in vitro, de la colectare și până la începerea refrigerării (echilibrare), este foarte scurtă, 29 respectiv, de 15 min.

Se dă în continuare un exemplu de realizare a invenție.31

Exemplu

Procedeul de obținere a produsului seminal refrigerat, de berbec și țap, cu viabilitate de 33 5 zile, conform invenției, constă din următoarele etape:

- selectarea și pregătirea masculilor de la care se va colecta sperma;35

- colectarea materialului seminal (33°C);

- determinarea volumului ejaculatului și densității în spermatozoizi;37

- prediluția materialului seminal în raport de 1/1 cu diluant (32°C) pe bază citrat (2,9 g%), glucoză (0,8 g% ) și gălbenuș de ou (20%);39

- evaluarea motilității, viabilității și a concentrației;

- calculul diluției finale a spermei se face în raport de concentrație, pentru a asigura 41 5 x 10⁹ celule/ml;

- diluția finală (20°C) prin adăugarea a 2...4 volume de diluant salin ce conține glicerină 43 (1%);

- echilibrarea spermei diluate 2,5 h, prin plasarea recipientului ce conține sperma diluată 45 pe baie de apă, la frigider, pentru răcire (+4...+5°C);

- ambalarea în paiete de plastic de 0,25 ml, și transportul la rece al materialului seminal 47 diluat.

RO 127804 Β1

Conform invenției, produsul seminal este obținut prin parcurgerea a 9 etape principale:

1. selectarea și pregătirea masculilor de la care se va colecta sperma, în funcție de criteriile de sănătate, de valoarea lui genetică și de dresajul masculilor pentru colectarea artificială a spermei. După o perioadă lungă de inactivitate sexuală, prin dresaj trebuie eliminate 15 ejaculate, favorizând spermatogeneza în noile condiții de exploatare și alimentație;

2. colectarea materialului seminal se face cu vagina artificială individuală, pentru fiecare individ, în pahare de colectare sterile, menținute în termostat la 37°C. De la fiecare animal se pot recolta 1...2 ejaculate, la interval de 5...10 min;

3. măsurarea volumului ejaculatului se face prin citirea diviziunilor de pe paharul de colectare, iar densitatea se apreciază în funcție de consistență (aspectul de smântână groasă corespunde unei densități mari, respectiv, unei concentrații de 50 x 10⁸ celule/ml, în timp ce ejaculatele cu aspect lăptos au sub 1 x 10⁸ celule spermatice. Volumele ejaculatelor mai mici de 0,5 ml și aspect apos sunt aruncate;

4. prediluția sedimentului cu diluant ce conține gălbenuș de ou 20% (v/v), în raport de 1/1 (v/v), la 32°C. Prediluția are rolul de a oferi suportul nutritiv și de protecție, menținând viabilitatea spermei la temperatura camerei câteva ore. Datorită concentrației mari de celule spermatice într-un volum de plasmă foarte mic, spermatozoizii își consumă rapid rezervele nutritive, în câteva minute, acumulându-se acid lactic ce acidifiază mediul și produce moarte celulară. Supraviețuirea spermatozoizilor în plasma seminală este limitată la câteva zeci de minute, făcând necesară diluarea suspensiei de spermatozoizi într-o soluție capabilă să conserve capacitatea de fertilizare a spermatozoizilor pe timpul stocării in vitro la temperaturi joase. Pentru conservarea lichidă, sperma trebuie diluată într-un mediu nutritiv care să susțină supraviețuirea în condiții de reducere a activității metabolice, când poate interveni atât o capacitare precoce, cât și moartea celulară. Stocarea prin refrigerare a materialului seminal la animalele de fermă are scopul de a reduce gradul fosforilării proteice endogene, pentru a preveni capacitarea precoce;

5. evaluarea motilității, viabilității și concentrației, precum și calculul diluției finale. Motilitatea, viabilitatea și concentrația probelor de spermă sunt analizate prin aceleași metode ca în cazul tehnologiei de conservare prin congelare. Motilitatea minim admisă pentru sperma ce va fi supusă diluării în vederea refrigerării este de 80%. Concentrația (densitatea) este o caracteristică importantă, de care depinde diluția ulterioară. Sperma acceptată pentru diluareprocesare trebuie să conțină minimum 1,5 miliarde spermatice/ml;

6. calculul diluției finale de spermatozoizi în doza ce va fi însămânțată:

- în general se însămânțează o doză de 0,25 ml spermă, ce trebuie să conțină în jur de

300...400 x 10⁶ spz, adică o concentrație finală C_f de aproximativ 1...1,6 x 10⁹ spz/ml;

- se notează V_o volumul inițial, C_o concentrația inițială și N numărul de spermatozoizi inițial;

- volumul final V_f va fi dat de raportul N/C_f.

Volumul de diluant ce urmează a fi adăugat va fi dat de relația:

V = V_f - V_o (volumul inițial) - V_o (adăugat la prediluție);

7. diluția finală se face prin adăugarea restului de diluant ce conține glicerină 2%, gălbenuș de ou, la temperatura de 20°C;

8. echilibrarea, flacoanele cu spermă diluată sunt introduse la frigider, pe baie de apă, pentru a se asigura scăderea progresivă a temperaturii până la + 5°C, temperatura de stocare. La această temperatură are loc scăderea metabolismului bazai al spermatozoizilor, asigurânduse menținerea viabilității pentru o perioadă mai mare de timp, comparativ cu sperma menținută la temperaturi mai mari. Pentru că celula spermatică este foarte sensibilă la șocul rece, scăderea temperaturii trebuie să se facă încet și progresiv;

RO 127804 Β1

9. ambalarea în paiete de plastic de 0,25 ml este preferabilă deoarece permite o bună 1 identificare și ușurință în transport și manipulare, în cazul inseminării artificiale. Ambalarea se face în camera frigorifică la temperatura de + 2°C, în paiete sau flacoane de sticlă, individuali- 3 zate, iar transportul este obligatoriu să se facă în termos cu gheață suficientă, care să mențină temperatura de+4...+5°C. 5

Calitatea spermei refrigerate este mai mare în condițiile în realizării fazelor 1...7 în 15 min, iar echilibrarea durează 2,5 h. Sperma se inseminează la femele în estru indus sau 7 natural, în doză de 0,25 ml și o concentrație de 12 x 10⁷ celule/doză. Astfel motilitatea și viabilitatea celulelor se mențin nemodificate de la colectare și după echilibrare, și după păstrare 9 prelungită, sub formă refrigerată.

După 48 h motilitatea scade cu 5%, în a 3-a zi de păstrare la + 4°C, și cu 9% și 18% 11 după 72 h și, respectiv, 96 h de conservare la rece.

Testarea in vivo a spermei refrigerate a asigurat o fertilitate de 71% la 24 h după 13 conservare, 68% după 48 h, de 64% și, respectiv, 53% după 72 și 94 h.

Claims

1 Revendicări

3 1. Procedeu de obținere a unui produs seminal refrigerat, de berbec și țap, caracterizat prin aceea că se colectează materialul seminal la o temperatură de 33°C, pe o perioadă de 5 maximum 15 min, se diluează într-un raport de 1/1 la temperatura de 32°C, într-un mediu de diluție pe bază de citrat de sodiu 2,9% în greutate, glucoză 0,8% în greutate și gălbenuș de ou 7 20% în greutate, se evaluează motilitatea, viabilitatea și concentrația, se calculează diluția finală a spermei în raport de concentrație, pentru a se asigura 5 x 10⁹ celule/ml, se realizează diluția 9 finală la 20°C, prin adăugarea a 2...4 volume de diluant salin conținând glicerină 1%, ca agent crioprotector, se echilibrează sperma diluată timp de 2,5 h, prin plasarea recipientului ce conține 11 sperma diluată pe baie de apă la + 4...+ 5°C, se ambalează în paiete de plastic de 0,25 ml și se transportă la rece.

13 2. Produs seminal refrigerat, de berbec și țap, obținut prin procedeul definit în revendicarea 1, caracterizat prin aceea că prezintă o fertilitate de 71% la 24 h după conservare, 15 68% după 48 h și, respectiv, 64% sau 53% după 72, respectiv, 94 h.