RO127804A0 - Produs seminal refrigerat de berbec şi ţap cu viabilitate de 5 zile - Google Patents

Abstract

Invenţia se referă la un procedeu de obţinere a unui produs seminal refrigerat, provenind de la berbec şi ţap, cu viabilitate de 5 zile, cu utilizare în zootehnie şi medicină veterinară. Procedeul conform invenţiei constă din aceea că, într-o perioadă de maximum 15 min, materialul seminal colectat se diluează într-un mediu de diluţie pe bază de citrat de sodiu, glucoză şi gălbenuş de ou, din care rezultă două fracţiuni, la 32°C şi la 20°C, cea de-a doua conţinând fracţiunea glicerinică, produsul rezultat fiind în final echilibrat, ambalat şi transportat la rece, obţinându-se un material seminal ce prezintă o fertilitate de 71% la 24 h după conservare, 68% după 48 h şi, respectiv, 64 sau 53% după 72, respectiv, 94 h.

Description

Produs seminal refrigerat de berbec și țap cu viabilitate de 5 zile

Invenția se refera la un produs seminal refrigerat de berbec si tap conservat prin refrigerare pana la 5 zile cu aplicabilitate în zootehnie și medicină veterinară, ca principal mijloc de difuzare a progresului genetic la rumegătoarele mici.

Obiectivul prezervării spermatozoizilor la temperaturi subambientale (21°C) este acela de a scădea metabolismul lor în scopul prelungirii viabilității. Sa constatat că o gamă largă de temperaturi din intervalul +2- +15°C asigură menținerea viabilității și fertilității celulelor. Sperma de berbec se diluează imediat după colectare in mediu salin, cu adaos de gălbenuș de ou iar la tap diluarea se face numai după îndepărtarea plasmei seminale prin spalare si centrifugare, după care concentratul de celule se diluează in același tip de mediu.

Metodele cunoscute de conservare pe durata scurta a spermei de berbec si tap constau din prezervarea la + 12°C - +15 °C timp de 10 ore si refrigerarea la +2 °C -+5°C timp de 24 de ore. Diluarea se face in mediul salin citrat de sodiu , glucoza si gălbenuș de ou la o rata de 1/15. Rezultatele fertilității după inseminare artificiala la femele sunt variabile , de la 40 % la 65 %.

Soluțiile cunoscute din stadiul tehnicii pentru conservarea materialului seminal ovin prezintă dezavantajul că nu asigură perioadă adecvată de viabilitate a celulelor spermatice.

Problema tehnică pe care o rezolvă invenția constă din elaborarea unor etape de procedeu pentu obținerea unui material semnal cu viabilitate îmbunătățită.

Produsul seminal refrigerat de berbec și țap, confom invenției, elimină dezavantajele menționate prin aceea că se obține din parcurgerea etapelor de selectare și pregătire a masculilor de la care se va colecta sperma, colectarea

C\-2 0 1 1 - 0 1 3 2 6 -0 6 -12- 2011 materialului seminal la o temperatură de (33 °C), determinarea volumului ejaculatului și densității in spermatozoizi, după care se efectuează prediluția materialului seminal în raport de 1/1 cu diluant la o temperatură de 32 °C pe bază citrat 2,9g%, glucoză 0,8 g% și gălbenuș de ou 20%, evaluarea motilității, viabilității și a concentrației prin tehnici în sine cunoscute, calculul diluției finale a spermei, în raport de concentrație, pentru a se asigura 5 x10⁹ celule / rril, diluția finală (20 °C) prin adaugarea a 2-4 volume de diluant salin conținând glicerina 1% ca agent crioprotector, echilibrarea spermei diluate timp de 2,5 ore prin plasarea recipientului ce conține sperma diluată pe baie de apă, la frigider, pentru răcire la o temperatură de +4...+5°C, ambalarea în paiete de plastic de 0,25 ml si transportul la rece a materialului seminal diluat, asfel încât, produsul rezultat testat prezintă o fertilitate de 71 % la 24 de ore după conservare, 68 % după 48 de ore, de 64% si respectiv 53% după 72 si 94 de ore.

Prin aplicarea invenției se obțin următoarele avantaje:

- colectarea si procesarea si difuzarea spermei din 5 in 5 zile,

- consecințele sunt de natura economica, deoarece sperma este transportata mai rar pe distante variate ;

- folosește rațional resusrele umane;

- -utilizează rațional materialul biologic valoros din punct de vedere genetic;

- după inseminarea artificiala a oilor si caprelor se obțin rezultate de fertilitate de 54%-71 % cu 9-15% mai mari, fata de sperma refrigerata fara glicerina si conservată prin refrigerare , doar 24 de ore;

- folosește dilutii in rate mai mici, de 5-7, care asigura o concentrație in spermatozoizi de cel puțin 5 x 10 ⁸ celule / ml de sperma la berbec si de 4 x 10 ⁸ celule / ml la sperma de tap.

Produsul refrigerat de berbec si tap, necesita mai multe faze de procesare si anume: colectare , diluare, controlul calitatii spermei , echilibrare, ambalare si difuzare zilnica la utilizatorii.

Produsul seminal refrigerat de berbec si tap cu viabilitate de 5 zile realizat după procedeul propus de autori , prelungește viabilitatea celulelor spermatice si perioada de utilizare cu inca 4 zile. Viabilitatea si motilitatea celulelor din ^- 2 0 1 1 - 0 1 3 2 6 -- η ;

O 6 -12- 2011 ' ^P momentul colectării ( mai mare de 80%) se menține timp de 24 de ore după care, scade treptat cu 5% in fiecare zi. Cea mai miva viabilitate acceptata este de 60%.Aceasta viabilitate se menține crescută pe toata durata conservării, datorita crioprotectiei fata de socul rece conferita de glicerina. Metoda de procesare a spermei de berbec si tap , mediile de diluare si timpii de realizare a fazelor de procesare sunt originali, stabiliți după o perioada lunga de experimentare “ in vitro’’ si” in vivo”. Perioada de manipulare a spermei in vitro, de la colectare si pana la începerea refrigerarii(echilibrare) este foarte scurtă, respectiv de 15 minute.

Se dă în continuare un exemplu de realizare a invenție:

Procedeul de obținerea a produsului seminal refrigerat de berbec si tap cu viabilitate de 5 zile, conform invenției, constă din următoarele etape:

• 1 .selectarea și pregătirea masculilor de la care se va colecta sperma;

• 2.colectarea materialului seminal (33 °C);

• 3. determinarea volumului ejaculatului si densității in spermatozoizi • 4.prediluția materialului seminal în raport de 1/1 cu diluant (32 °C) pe bază citrat( 2,9g%) , glucoza (0,8 g% )si de gălbenuș de ou (20%) • 5.evaluarea motilității, viabilității și a concentrației ;

• 6.calculul diluției finale a spermei, se face in raport de concentrație, pentru a asigura 5 x10⁹ celule / ml si • 7.diluția finala (20 °C) prin adaugarea a 2-4 volume de diluant salin ce conține glicerina 1%) și • 8.echilibrarea spermei diluate 2,5 ore prin plasarea recipientului ce conține sperma diluată pe baie de apă, la frigider, pentru răcire ( +4+5°C);

• 9.ambalarea în paiete de plastic de 0,25 ml si transportul la rece a materialului seminal diluat.

Conform invenției, produsul seminal, este obținut prin parcurgerea a 9 etape principale:

1. Selectarea și pregătirea masculilor de la care se va colecta sperma în funcție de criteriile de sanatate, de valoarea lui genetica si de dresaul masculilor ^-2011-0 1 3 2 6 -Ο 6 -12- 2011

pentru colectarea artificiala a spermei. După o perioada lunga de inactivitate sexuala, prin dresaj trebuie eliminate 15 ejaculate , favorizând spermatogeneza in noile condiții de exploatare si alimentație .

2. Colectarea materialului seminal se face cu vagina artificială individuala pentru fiecare individ, în pahare de colectare sterile, menținute in termostat la 37°C. De la fiecare animal se pot recolta 1-2 ejaculate, la interval de 5-10 minute..

3. Masurarea volumului ejaculatului se face prin citirea diviziunilor de pe paharul de colectare iar densitatea se apreciaza in funcție de consistenta( aspectul de smantana groasa corespunde unei densități mari , respectiv unei concentrații de 50 χ 10⁸ celule / ml, in timp ce ejaculatele cu aspect lăptos au sub 1x 10⁸ celule spermatice. Volumele ejaculatelor mai mici de 0,5 ml si aspect apos sunt aruncate

4. Prediluția sedimentului cu diluant ce conține gălbenuș de ou 20% (v/v), în raport de 1/1 (v/v), la 32 °C. Prediluția are rolul de a oferi supportul nutritiv si de protecție, menținând viabilitatea spermei la temperatura camerei cateva ore.Datorita concentrației mari de celule spermatice intr-un volum de plasmă foarte mic, spermatozoizii își consumă rapid rezervele nutritive în câteva minute, acumulându-se acid lactic care acidifiază mediul și produce moarte celulară. Supraviețuirea spermatozoizilor în plasma seminală este limitată la câteva yeci de minute, făcând necesară diluarea suspensiei de spermatozoizi într-o soluție capabilă să conserve capacitatea de fertilizare a spermatozoizilor pe timpul stocării “in vitro” la temperaturi joase. Pentru conservarea lichidă sperma trebuie diluată într-un mediu nutritiv care să susțină supraviețuirea în condiții de reducere a activității metabolice, când poate interveni atât o capacitare precoce, dar și moartea celulară. Stocarea prin refrigerare a materialului seminal la animalele de fermă are scopul de a reduce gradul fosforilării proteice endogene pentru a preveni capacitarea precoce

5. Evaluarea motilității, viabilității și a concentrației, precum și calculul diluției finale. Motilitatea, viabilitatea și concentrația probelor de spermă sunt analizate prin aceleași metode ca în cazul tehnologiei de conservare prin congelare.

C\-2 O 1 1 - o 1 3 2 ⁶ '

O 6 -12- 2011 fi

Motilitatea minim admisă pentru sperma ce va fi supusă diluării în vederea refrigerării este de 80%.

Concentrația (densitatea) este o caracteristică importantă de care depinde diluția ulterioară. Sperma acceptată pentru diluare-procesare trebuie să conțină minim 1,5 miliarde spermatice /ml.

6. Calculul diluției finale de spermatozoizi în doza ce va fi însămânțată:

-în general se însămânțează o doză de 0.25 ml spermă ce trebuie să conțină în jur de 300-400x10⁶ spz, adică o concentrație finală Cf de aproximativ 1 -1.6x10⁹ spz/ml.

-se notează V_o volumul inițial, C_o concentrația inițiala și N numărul de spermatozoizi inițial

-volumul final V_f va fi dat de raportul N/ C_f

Volumul de diluant ce urmează a fi adăugat va fi dat de relația V= V_f - V_o (volumul inițial)- V_o (adăugat la prediluție)

7. Diluția finală se face prin adăugarea restului de diluant ce conține glicerina 2 % .gălbenuș de ou, la temperatura de 20 °C.

8. Echilibrarea flacoanele cu spermă diluată sunt introduse la frigider, pe baie de apă, pentru a se asigura scăderea progresivă a temperaturii până la +5°C, temperatura de stocare. La această temperatură are loc scăderea metabolismului bazai al spermatozoizilor, asigurându-se menținerea viabilității pentru o perioadă mai mare de timp comparativ cu sperma menținută la temperaturi mai mari. Deoarece celula spermatică este foarte sensibilă la șocul rece, scăderea temperaturii trebuie să se facă încet și progresiv.

9. Ambalarea in paiete de plastic de 0.25 ml este preferabilă deoarece permite o bună identificare și ușurința în transport și manipulare în cazul inseminării artificiale. Ambalarea se face in camera frigorifica la temperatura de +2 °C în paiete sau flacoane de sticlă , individualizate iar transportul este obligatoriu sa se faca în termos cu gheață , suficienta care sa mențină temperatura de +4 °C 5 °C.

Calitatea spermei refrigerate este mai mare în condițiile realizării fazelor 1-7 , în 15 minute iar echilibrarea durează 2,5 . Sperma se inseminează la

Τ-2 011-01326-0 6 -12- 2011 femele în estru indus sau natural în doză de 0,25 ml și o concentrație de 12 x10⁷ celule /doză. Astfel motilitatea si viabilitatea celulelor se menține nemodificata de la colectare si după echilibrare, iar după păstrare prelungită sub forma refrigerată.

După 48 de ore motilitatea scade cu 5 % in a 3-a zi de păstrare la +4 °C, și cu 9% si 18% după 72 ore și respectiv 96 ore de conservare la rece.

Testarea in vivo a spermei refrigerate a asigurat o fertilitate de 71 % la 24 de ore după conservare , 68 % după 48 de ore , de 64% si respectiv 53% după 72 si 94 de ore.

(k-2 Ο 1 1 - Ο 1 32 θ - Ο 6 -12- 2011

Produs seminal refrigerat de berbec $i tap cu viabilitate de 5 zile

Claims (1)

1. Revendicări

   1. Produs seminal refrigerat de berbec si tap conservat prin refrigerare până la 5 zile cu utilizare în zootehnie și medicină veterinară caracterizat prin aceea că se obține din parcurgerea etapelor de selectare și pregătire a masculilor de la care se va colecta sperma, colectarea materialului seminal la o temperatură de (33 °C), determinarea volumului ejaculatului și densității in spermatozoizi, după care se efectuează prediluția materialului seminal în raport de 1/1 cu diluant la o temperatură de 32 °C pe bază cifrat 2,9g%, glucoză 0,8 g% și gălbenuș de ou 20%, evaluarea motilității, viabilității și a concentrației prin tehnici în sine cunoscute, calculul diluției finale a spermei, în raport de concentrație, pentru a se asigura 5 x10⁹ celule / ml, diluția finală (20 °C) prin adaugarea a 2-4 volume de diluant salin conținând glicerina 1% ca agent crioprotector, echilibrarea spermei diluate timp de 2,5 ore prin plasarea recipientului ce conține sperma diluată pe baie de apă, la frigider, pentru răcire la o temperatură de +4...+5°C, ambalarea în paiete de plastic de 0,25 ml si transportul la rece a materialului seminal diluat, asfel încât, produsul rezultat testat prezintă o fertilitate de 71 % la 24 de ore după conservare, 68 % după 48 de ore, de 64% si respectiv 53% după 72 si 94 de ore.