CN101836615B - 中华鲟超低温冷冻精液人工授精方法 - Google Patents

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Abstract

一种中华鲟超低温冷冻精液人工授精方法，其包括如下步骤：(1)采集中华鲟雄鱼的精子，进行冷冻保存；(2)轻压中华鲟腹部能挤出卵或发现中华鲟产卵时开始解冻冷冻精子；(3)卵子产出后，立即与解冻精子进行冻精人工授精，冻精授精采用不同激活溶液进行分步激活授精，即将300ml卵子加入5ml解冻精子快速混合，随即加入激活溶液(10-20mM Tris，5-10mM NaCl，0.1-0.25mM KCl，pH 8.5)50ml激活，柔和搅拌20秒后，再次加入解冻精子5ml混合，20秒后加入10-20mM葡萄糖溶液混合搅拌，20秒后加入孵化用水搅拌，然后加入10％滑石粉脱粘，孵化用水冲洗后，将同批受精卵归并同一孵化筛中进行孵化。

Description

中华鲟超低温冷冻精液人工授精方法
技术领域
本发明涉及一种中华鲟超低温冷冻精液人工授精方法。
背景技术
中华鲟(Acipenser sinensis Gray)为典型的河海洄游鱼类，国家一级保护动物。目前，利用野生中华鲟亲鱼开展人工繁殖放流已成为该物种保护的重要措施之一，但由于酷渔滥捕、水域污染和水利工程建设等人为活动造成其自然资源不断衰退，中华鲟已处于濒危等级。在野生中华鲟人工繁殖过程中常常遇到雄鱼不足和雄鱼与雌鱼性腺发育不同步的问题，利用超低温冷冻保存技术把中华鲟精子长期有效的保存起来，待遇到成熟的雌性中华鲟亲鱼，即可对精液解冻，并与成熟鱼卵进行人工授精，以解决雌雄亲鱼性腺发育不同步的问题。
国外关于其它鱼类精液超低温冷冻保存研究的报道较多，相关技术也较为成熟，国内也有关于中华鲟精液超低温冷冻保存研究的报道，但有关利用中华鲟超低温冷冻精液人工授精操作方法尚未见报道。
现有技术的缺点：
(1)国内鲟鱼的人工繁殖研究保护工作起步较晚，采用冷冻精液进行人工授精作为人工繁殖的辅助措施，目前仅限于研究探索阶段，尚未应用到生产实践中。
(2)国内外尚未见有关中华鲟冷冻精液人工授精操作方法的报道。
发明内容
为了克服上述缺陷，本发明提供一种中华鲟超低温冷冻精液人工授精方法，掌握一种可应用于生产有效的中华鲟冻精人工授精操作方法。
本发明采用以下技术方案：
方案1：中华鲟超低温冷冻精液人工授精方法，步骤如下：
(1)采集中华鲟雄鱼的精子，进行冷冻保存；
(2)轻压中华鲟腹部能挤出卵或发现中华鲟产卵时开始对冷冻精子解冻；
(3)卵子产出后，立即与解冻精子进行人工授精：冻精授精采用不同激活溶液分步进行激活授精，即将300ml卵子加入5ml解冻精子快速混合，随即加入激活溶液(10-20mM Tris，5-10mM NaCl，0.1-0.25mM KCl，pH 8.5)50ml激活，柔和搅拌20秒后，再次加入解冻精子5ml混合，20秒后加入10-20mM葡萄糖溶液混合搅拌，20秒后加入孵化用水搅拌，然后加入10％滑石粉脱粘，孵化用水冲洗后，将同批受精卵归并同一孵化筛中进行孵化。
上述超低温冷冻精液是在-196℃的超低温保存的优质中华鲟冻精。
本发明具有如下优点：
1、冻精分步激活授精方法有助于提高冻精活力，提高受精率；
2、该方法已在野生中华鲟人工繁殖生产和子代中华鲟全人工繁殖生产中得到良好应用，可有效解决当前中华鲟人工繁过程中雄鱼不足、雌雄亲鱼不能同步成熟的问题，为通过人工增殖方式对中华鲟进行保护，提供有力的技术支撑；
3、本发明中所采用的激活溶液配方能够提高受精率和孵化率；
4、该方法也适用于其他鲟鱼类的冷冻精液人工授精。
具体实施例
本发明的技术方案具体实施例如下。
在中华鲟人工繁殖过程中常常会遇到雄鱼不足的问题，该专利通过利用超低温冷冻保存技术把中华鲟精子进行长期有的效保存，以解决雌雄亲鱼性腺发育不同步及充分利用有限资源，从长远来讲对中华鲟资源的恢复和保护具有十分重要的意义。该实验是通过利用超低温冷冻保存技术保存的子一代中华鲟精子进行了人工繁殖实验和效果分析，旨在完善中华鲟全人工繁殖技术体系，为更好地保护中华鲟种质资源提供技术支撑。
实施对象：
-196℃超低温保存的中华鲟优质冻精。
精卵来源：
用于全人工繁殖的中华鲟精液子与卵子，来自中华鲟研究所在纯淡水条件下驯养的性腺发育成熟的子一代中华鲟雄鱼和雌鱼各一尾，分别于2009年9月29日和2009年11月22日采用促黄体释放激素类似物(LRH-A2)对成熟的雄鱼和雌鱼进行注射催产，催产水温度为18.8-19℃，采取挤压法采集精子和卵子；精液在保鲜袋中充氧后于2-4℃冰箱内保存，经超低温冷冻投入液氮中保存，人工繁殖实验时冷冻精子再解冻与子一代中华鲟成熟鲟卵进行人工授精。
精子冷冻及解冻：
利用离心管和装有液氮的液氮罐，取活力大于90％的鲜精按体积比1∶3与2-4℃的抗冻稀释液混合，平衡10min，分装1.5ml离心管，采用二步降温法，即距液氮面上2-3cm处平衡10min后，沉入液氮罐底部保存。精液在液氮中保存53天后取出，于38-40℃水浴解冻1min。解冻后的精液于2-4℃的冰箱中保存，待镜检。
冻精活力镜检及激活剂筛选：
根据鲟鱼冻精的生理特性分别采用蒸馏水和以Tris、NaCl、CaCl 12、MgCl2、KCl及D-Glucose(葡萄糖)等各组分不同配比配制不同浓度的激活剂激活冻精，通过激活冻精活力镜检效果评价筛选冻精激活剂。
解冻精子人工授精：
雌鲟自催产达效应时间，轻压腹部能挤出卵或发现鲟鱼产卵时开始解冻冷冻精子，并同时采集卵子。将冻精从液氮中取出，于38-40℃水浴锅中1min解冻，取少量精液涂在载玻片上，滴加适量的蒸馏水混匀激活，立即在显微镜下观察精子的活力，选取激活率大于65％冻精与采集的卵子进行授精。
冻精激活授精采用激活溶液(10mM Tris，10mM NaCl，0.1mM KCl，pH 8.5)和20mM葡萄糖激活溶液分步激活授精，即300ml卵子加入5ml解冻精子快速混合，随即加入激活剂50ml激活，轻轻搅拌20秒后，加入解冻精子5ml混合，20秒后加入20mM葡萄糖溶液混合搅拌，20秒后加入孵化水搅拌，然后加入10％滑石粉脱粘，孵化用水冲洗后，将同批受精卵归并同一孵化筛中进行孵化，发育至原肠期后统计受精率和孵化率。
在本次子一代中华鲟冻精授精实验的应用中，成功的获得了冻精受精的鲟鱼苗，结果表明利用超低温冷冻保存技术将精子长期有效保存起来，解决中华鲟在人工繁殖过程中雌雄亲鱼性腺发育不同步问题，充分利用有限亲鱼资源进行繁殖的途径是可行的，为完善中华鲟全人工繁殖技术体系，更好地保护中华鲟种质资源提供有力的技术支持。

Claims (5)

1.一种中华鲟超低温冷冻精液人工授精方法，其包括如下步骤：
（1）采集中华鲟雄鱼的精子，经超低温冷冻投入液氮中保存；
（2）轻压中华鲟腹部能挤出卵或发现中华鲟产卵时开始对冷冻精子进行38-40℃水浴1min的解冻；
（3）卵子产出后，立即与解冻精子进行冻精人工授精，冻精授精采用不同激活溶液进行分步激活授精，即将300ml卵子加入5ml解冻精子快速混合，随即加入激活溶液50ml激活，柔和搅拌20秒后，加入解冻精子5ml混合，20秒后加入10-20mM葡萄糖溶液混合搅拌，20秒后加入孵化用水搅拌，然后加入10％滑石粉脱粘，孵化用水冲洗后，将同批受精卵归并同一孵化筛中进行孵化；所述激活溶液为10-20mM Tris，5-10mM NaCl，0.1-0.25mM KCl，pH 8.5。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，将采集的精子经超低温冷冻直接投入液氮中保存。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，卵子产出后立即与精子授精时的水温与催产水温相一致，为18.8-19℃。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，精子的冷冻采用离心管和装有液氮的液氮罐，取活力大于90％的鲜精按体积比1：3与2-4℃的抗冻稀释液混合，平衡10min，分装1.5ml离心管，采用二步降温法，即距液氮面上2-3cm处平衡10min后，直接投入液氮中冷冻保存；所述抗冻稀释液为20mM Tris，30-80mM Sucrose，1-2mM KCl，pH 8.5，8-9% MeOH。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，精子的解冻是将精液从液氮中取出， 38-40℃水浴1min即可解冻，解冻后的精液在2-4℃冰箱存放。
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