JP2942822B2 - 生殖細胞の凍結保存方法 - Google Patents
生殖細胞の凍結保存方法Info
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、生殖細胞の凍結保
存剤および保存方法に関し、詳しくは鶏などの家禽精子
の凍結保存に効果的な、Ｎ−メチルアセトアミドを含む
生殖細胞の凍結保存剤および該凍結保存剤を用いた生殖
細胞の凍結保存方法に関する。
存剤および保存方法に関し、詳しくは鶏などの家禽精子
の凍結保存に効果的な、Ｎ−メチルアセトアミドを含む
生殖細胞の凍結保存剤および該凍結保存剤を用いた生殖
細胞の凍結保存方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】人工授精技術は、古くから家畜の改良お
よび増殖を図る手段として、技術的な研究が進められ、
畜産業への普及が進められてきた。この人工授精技術の
利用価値は、Polgi and Rowson（1952）によるウシ精子
の凍結保存技術が報告されたことを契機として飛躍的に
向上した。この報告以来、多くの研究者の努力により、
半永久的な利用が可能な精液の凍結保存技術へと発展し
た。さらに、簡易で個体識別が容易な急速ストロー法に
よる凍結保存技術の確立により、実用化が図られ、特に
ウシにおいては世界的な規模で実用化および普及が進ん
でいる。
よび増殖を図る手段として、技術的な研究が進められ、
畜産業への普及が進められてきた。この人工授精技術の
利用価値は、Polgi and Rowson（1952）によるウシ精子
の凍結保存技術が報告されたことを契機として飛躍的に
向上した。この報告以来、多くの研究者の努力により、
半永久的な利用が可能な精液の凍結保存技術へと発展し
た。さらに、簡易で個体識別が容易な急速ストロー法に
よる凍結保存技術の確立により、実用化が図られ、特に
ウシにおいては世界的な規模で実用化および普及が進ん
でいる。
【０００３】このような凍結精液による人工授精技術
を、鶏等の家禽においても利用しようと、近年研究が進
められている。凍結精液を半永久的に保存するために
は、凍結に対して精液を保護するための凍結保存剤が重
要である。家禽精液用の凍結保存剤としては、現在のと
ころ、以下のようなものが報告されている。
を、鶏等の家禽においても利用しようと、近年研究が進
められている。凍結精液を半永久的に保存するために
は、凍結に対して精液を保護するための凍結保存剤が重
要である。家禽精液用の凍結保存剤としては、現在のと
ころ、以下のようなものが報告されている。
【０００４】（１）グリセリンを凍結保存剤に用いる方
法 グリセリンは、人工授精用の精液の凍結保存剤として最
も一般的であり、鶏などの家禽精液用の凍結保存剤とし
ても汎用されているものである。グリセリンは、数種の
凍結方法に対応でき、終末濃度７〜７．５％となるよう
に用いた場合に、最も高い耐凍効果が期待できる。しか
しながら、この濃度で用いると、耐凍効果は向上するの
に対し、実際に授精に用いた場合に、受精卵は全く得ら
れないことがわかっている。
法 グリセリンは、人工授精用の精液の凍結保存剤として最
も一般的であり、鶏などの家禽精液用の凍結保存剤とし
ても汎用されているものである。グリセリンは、数種の
凍結方法に対応でき、終末濃度７〜７．５％となるよう
に用いた場合に、最も高い耐凍効果が期待できる。しか
しながら、この濃度で用いると、耐凍効果は向上するの
に対し、実際に授精に用いた場合に、受精卵は全く得ら
れないことがわかっている。
【０００５】そのため、高い耐凍効果および高い受精率
の両方を確保するためには、融解後に再希釈および遠心
分離からなるグリセリンの除去作業を行う必要がある。
さらに、この再希釈の際には、精子が希釈ショックを起
こさないように、段階希釈をしなければならない。この
ように、作業の煩雑さの故に、特別な研究目的を除いて
グリセリンによる鶏などの家禽の精液の凍結保存は活用
されていない。
の両方を確保するためには、融解後に再希釈および遠心
分離からなるグリセリンの除去作業を行う必要がある。
さらに、この再希釈の際には、精子が希釈ショックを起
こさないように、段階希釈をしなければならない。この
ように、作業の煩雑さの故に、特別な研究目的を除いて
グリセリンによる鶏などの家禽の精液の凍結保存は活用
されていない。
【０００６】（２）ＤＭＳＯを凍結保存剤に用いる方法 ＤＭＳＯを終末濃度４〜４．５％になるように調整し、
プログラムフリーザーを用いて凍結する方法である。こ
の方法では、プログラムフリーザーを用いる必要がある
が、このプログラムフリーザーは高価であり、しかも多
数の製造に対応できない。また、プログラムフリーザー
の種類によっては高い受精率が期待できないといった問
題もある。
プログラムフリーザーを用いて凍結する方法である。こ
の方法では、プログラムフリーザーを用いる必要がある
が、このプログラムフリーザーは高価であり、しかも多
数の製造に対応できない。また、プログラムフリーザー
の種類によっては高い受精率が期待できないといった問
題もある。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、家禽精子な
どの生殖細胞の凍結保存剤として、上記のグリセリンや
ＤＭＳＯのような問題点を有しない凍結保存剤を開発す
ることを目的とする。すなわち、凍結する生殖細胞の希
釈の際に、段階希釈の必要がなく、簡易で個体識別が容
易な急速ストロー法による凍結が可能であり、しかも人
工授精に際して凍結保存剤の除去が不要なダイレクト注
入ができることにより、高い受精率が期待できる凍結保
存剤並びに凍結保存方法を開発することを目的とする。
どの生殖細胞の凍結保存剤として、上記のグリセリンや
ＤＭＳＯのような問題点を有しない凍結保存剤を開発す
ることを目的とする。すなわち、凍結する生殖細胞の希
釈の際に、段階希釈の必要がなく、簡易で個体識別が容
易な急速ストロー法による凍結が可能であり、しかも人
工授精に際して凍結保存剤の除去が不要なダイレクト注
入ができることにより、高い受精率が期待できる凍結保
存剤並びに凍結保存方法を開発することを目的とする。
【０００８】このような優れた効果を十分に発揮する凍
結保存剤を開発することにより、鶏などの家禽の人工授
精の実用化を図ることができる。したがって、本発明の
目的とするところは、上記の課題を解決する凍結保存剤
を確立すると共に、耐凍効果を引き出す有効な希釈液組
成の提示、および具体的な作製方法を提供することであ
る。
結保存剤を開発することにより、鶏などの家禽の人工授
精の実用化を図ることができる。したがって、本発明の
目的とするところは、上記の課題を解決する凍結保存剤
を確立すると共に、耐凍効果を引き出す有効な希釈液組
成の提示、および具体的な作製方法を提供することであ
る。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記目的に
適う凍結保存剤を開発すべく鋭意検討を重ね、Ｎ−メチ
ルアセトアミド（ＣＨ3 ＣＯＮＨＣＨ3 、分子量７３．
１０）が耐凍効果を有しており、その効果がグリセリン
やＤＭＳＯよりも優れていることを見出した。そこで、
凍結保存剤にＮ−メチルアセトアミドを用い、それが有
効に作用する希釈液を開発し、さらに希釈方法と該希釈
液とを用いた生殖細胞の凍結保存方法を確立することに
より、本発明を完成するに至った。
適う凍結保存剤を開発すべく鋭意検討を重ね、Ｎ−メチ
ルアセトアミド（ＣＨ3 ＣＯＮＨＣＨ3 、分子量７３．
１０）が耐凍効果を有しており、その効果がグリセリン
やＤＭＳＯよりも優れていることを見出した。そこで、
凍結保存剤にＮ−メチルアセトアミドを用い、それが有
効に作用する希釈液を開発し、さらに希釈方法と該希釈
液とを用いた生殖細胞の凍結保存方法を確立することに
より、本発明を完成するに至った。
【００１０】請求項１記載の本発明は、Ｎ−メチルアセ
トアミドを含む生殖細胞の凍結保存剤である。請求項２
記載の本発明は、請求項１記載の凍結保存剤を用いるこ
とを特徴とする生殖細胞の凍結保存方法である。
トアミドを含む生殖細胞の凍結保存剤である。請求項２
記載の本発明は、請求項１記載の凍結保存剤を用いるこ
とを特徴とする生殖細胞の凍結保存方法である。
【００１１】
【発明の実施の形態】以下に本発明を詳細に説明する。
請求項１記載の本発明は、Ｎ−メチルアセトアミドを含
む生殖細胞の凍結保存剤である。
請求項１記載の本発明は、Ｎ−メチルアセトアミドを含
む生殖細胞の凍結保存剤である。
【００１２】生殖細胞として家禽から採取した精液を対
象とした場合の一般的な凍結保存法について述べると、
先ず精液を常法により希釈（１次希釈）し、得られた希
釈精液を２次希釈液によってさらに希釈し、これをスト
ロー等に充填し、凍結して保存することによって行われ
る。すなわち、雄鶏などの雄性家禽から、マッサージ法
等の常法によって精液を採取する。このとき、透明液を
できるだけ混入しないように留意するとともに、精液の
採取時間についても１５分程度以内に終了するように
し、低温（５℃）に冷却した１次希釈液によって２倍希
釈して低温（５℃）にて２０〜３０分間静置する。
象とした場合の一般的な凍結保存法について述べると、
先ず精液を常法により希釈（１次希釈）し、得られた希
釈精液を２次希釈液によってさらに希釈し、これをスト
ロー等に充填し、凍結して保存することによって行われ
る。すなわち、雄鶏などの雄性家禽から、マッサージ法
等の常法によって精液を採取する。このとき、透明液を
できるだけ混入しないように留意するとともに、精液の
採取時間についても１５分程度以内に終了するように
し、低温（５℃）に冷却した１次希釈液によって２倍希
釈して低温（５℃）にて２０〜３０分間静置する。
【００１３】ここで、１次希釈液としては、保存する家
禽の精液などを考慮して適宜決定すればよいが、鶏の精
液の場合、グルコース０．６ｇ、グルタミン酸ナトリウ
ム・１水和物１．９２ｇ、酢酸ナトリウム無水物０．５
１ｇ、クエン酸３カリウム・１水和物０．１２８ｇ、酢
酸マグネシウム４水和物０．０８ｇおよび硫酸ゲンタマ
イシン０．００１ｇを蒸留水で１００ｍｌにメスアップ
したものが好適に使用される。これは、鶏精液の液状保
存用希釈液であるＬａｋｅ液（1979, J. Reprod. Fert.
57, 149-155）のＢａｓｉｃ（Ａ）に抗生物質である硫
酸ゲンタマイシンを細菌感染防止のために添加したもの
に相当する。その他の組成の希釈液も使用することがで
きる。
禽の精液などを考慮して適宜決定すればよいが、鶏の精
液の場合、グルコース０．６ｇ、グルタミン酸ナトリウ
ム・１水和物１．９２ｇ、酢酸ナトリウム無水物０．５
１ｇ、クエン酸３カリウム・１水和物０．１２８ｇ、酢
酸マグネシウム４水和物０．０８ｇおよび硫酸ゲンタマ
イシン０．００１ｇを蒸留水で１００ｍｌにメスアップ
したものが好適に使用される。これは、鶏精液の液状保
存用希釈液であるＬａｋｅ液（1979, J. Reprod. Fert.
57, 149-155）のＢａｓｉｃ（Ａ）に抗生物質である硫
酸ゲンタマイシンを細菌感染防止のために添加したもの
に相当する。その他の組成の希釈液も使用することがで
きる。
【００１４】１次希釈液により希釈された精液につい
て、２次希釈液による希釈を行う。本発明の凍結保存剤
は、この２次希釈液に添加して使用することが好まし
い。すなわち、２次希釈液として、Ｎ−メチルアセトア
ミドを添加したものを用いることにより、本発明の凍結
保存剤としての優れた効果を得ることができる。この場
合、２次希釈液中の、Ｎ−メチルアセトアミド以外の成
分は、保存する家禽の精液などを考慮して適宜決定する
ことができるが、例えばトレハロース液にＮ−メチルア
セトアミドを添加したものを用いることができる。トレ
ハロース液の組成は、トレハロース２水和物１１．５
ｇ、牛血清アルブミン０．３ｇおよび硫酸ゲンタマイシ
ン０．００１ｇを蒸留水で１００ｍｌにメスアップした
ものである。なお、トレハロースの代わりにスクロース
やラクトース等の糖類を使用することもできる。Ｎ−メ
チルアセトアミドは、耐凍効果が十分に発揮される量を
含んでいればよく、通常は凍結保存剤中の濃度が１０〜
１６％、（終末濃度が５〜８％）となるように添加す
る。Ｎ−メチルアセトアミドの濃度が下限未満である
と、耐凍効果が十分に発揮されず、上限を超える量を添
加しても、相応する効果が得られない上に、受精率の低
下を招く等の問題が生じ、好ましくない。そのため、通
常はＮ−メチルアセトアミド１５ｍｌにトレハロース液
８５ｍｌを混合したものを２次希釈液として用いること
が好ましい。
て、２次希釈液による希釈を行う。本発明の凍結保存剤
は、この２次希釈液に添加して使用することが好まし
い。すなわち、２次希釈液として、Ｎ−メチルアセトア
ミドを添加したものを用いることにより、本発明の凍結
保存剤としての優れた効果を得ることができる。この場
合、２次希釈液中の、Ｎ−メチルアセトアミド以外の成
分は、保存する家禽の精液などを考慮して適宜決定する
ことができるが、例えばトレハロース液にＮ−メチルア
セトアミドを添加したものを用いることができる。トレ
ハロース液の組成は、トレハロース２水和物１１．５
ｇ、牛血清アルブミン０．３ｇおよび硫酸ゲンタマイシ
ン０．００１ｇを蒸留水で１００ｍｌにメスアップした
ものである。なお、トレハロースの代わりにスクロース
やラクトース等の糖類を使用することもできる。Ｎ−メ
チルアセトアミドは、耐凍効果が十分に発揮される量を
含んでいればよく、通常は凍結保存剤中の濃度が１０〜
１６％、（終末濃度が５〜８％）となるように添加す
る。Ｎ−メチルアセトアミドの濃度が下限未満である
と、耐凍効果が十分に発揮されず、上限を超える量を添
加しても、相応する効果が得られない上に、受精率の低
下を招く等の問題が生じ、好ましくない。そのため、通
常はＮ−メチルアセトアミド１５ｍｌにトレハロース液
８５ｍｌを混合したものを２次希釈液として用いること
が好ましい。
【００１５】なお、本発明の凍結保存剤は、家禽の生殖
細胞の他、他の動物の生殖細胞などに対しても適用でき
るが、耐凍性が低く、従来は長期保存が困難であった家
禽の生殖細胞に対して特に優れた効果を発揮することが
できる。ここで、家禽としては、鶏の他にシチメンチョ
ウ、アヒルなどを挙げることができるが、これらの中で
も、鶏は食用としての需要が最も高い家禽であり、本発
明の凍結保存剤の対象として最も好ましいものである。
また、本発明を適用することができる家禽以外の動物と
しては、ウシ、ウマ、ブタや野生動物などが挙げられ
る。
細胞の他、他の動物の生殖細胞などに対しても適用でき
るが、耐凍性が低く、従来は長期保存が困難であった家
禽の生殖細胞に対して特に優れた効果を発揮することが
できる。ここで、家禽としては、鶏の他にシチメンチョ
ウ、アヒルなどを挙げることができるが、これらの中で
も、鶏は食用としての需要が最も高い家禽であり、本発
明の凍結保存剤の対象として最も好ましいものである。
また、本発明を適用することができる家禽以外の動物と
しては、ウシ、ウマ、ブタや野生動物などが挙げられ
る。
【００１６】次に、請求項２記載の本発明について説明
する。請求項２記載の本発明は、請求項１記載の凍結保
存剤を用いることを特徴とする生殖細胞の凍結保存方法
である。
する。請求項２記載の本発明は、請求項１記載の凍結保
存剤を用いることを特徴とする生殖細胞の凍結保存方法
である。
【００１７】本発明の方法においては、請求項１記載の
凍結保存剤を用いる。したがって、対象となる生殖細胞
としては請求項１記載の本発明の場合と同様に動物の生
殖細胞等、特に鶏等の家禽の生殖細胞が好ましい。以下
に、雄鶏の精液について行う凍結保存方法の一例を示
す。前記した如く、マッサージ法等により雄鶏から採取
した精液を低温の１次希釈液によって希釈して２０〜３
０分静置する。このときの希釈倍率は、特に限定されな
いが、通常は２倍希釈する。次に、得られた１次希釈液
の２次希釈を行う。これは、請求項１記載の凍結保存剤
を添加したものを２次希釈液として用いて行う。２次希
釈の際の希釈倍率についても、特に限定されないが、１
次希釈液の希釈倍率が２倍であった場合は、通常、原精
液が４倍に希釈されるように、２倍希釈を行う。本発明
においては、２次希釈後に得られる希釈精液に含まれる
Ｎ−メチルアセトアミドの終末濃度が５〜８％となるよ
うにすることが好ましい。２次希釈された希釈精液は、
通常人工授精の際に用いられる１ｍｌまたは０．５ｍｌ
のストローに充填する。なお、１次希釈から２次希釈ま
での一連の作業は５℃で行い、希釈精液の温度があまり
上がらないように注意する。
凍結保存剤を用いる。したがって、対象となる生殖細胞
としては請求項１記載の本発明の場合と同様に動物の生
殖細胞等、特に鶏等の家禽の生殖細胞が好ましい。以下
に、雄鶏の精液について行う凍結保存方法の一例を示
す。前記した如く、マッサージ法等により雄鶏から採取
した精液を低温の１次希釈液によって希釈して２０〜３
０分静置する。このときの希釈倍率は、特に限定されな
いが、通常は２倍希釈する。次に、得られた１次希釈液
の２次希釈を行う。これは、請求項１記載の凍結保存剤
を添加したものを２次希釈液として用いて行う。２次希
釈の際の希釈倍率についても、特に限定されないが、１
次希釈液の希釈倍率が２倍であった場合は、通常、原精
液が４倍に希釈されるように、２倍希釈を行う。本発明
においては、２次希釈後に得られる希釈精液に含まれる
Ｎ−メチルアセトアミドの終末濃度が５〜８％となるよ
うにすることが好ましい。２次希釈された希釈精液は、
通常人工授精の際に用いられる１ｍｌまたは０．５ｍｌ
のストローに充填する。なお、１次希釈から２次希釈ま
での一連の作業は５℃で行い、希釈精液の温度があまり
上がらないように注意する。
【００１８】次に、精液を充填したストローの凍結を行
う。凍結は、急速ストロー法（液体窒素蒸気による凍結
法）により行うことができる。例えば、蓋のある発泡ス
チロール製の箱に、ストロー架台（金属製の試験管立て
等）と液体窒素を入れる。このとき、液体窒素の液面と
ストローとの距離が３．５〜４ｃｍ程度となるようにす
る。精液の入ったストローをストロー架台に並べ、蓋を
して所定時間、通常は３０分程静置する。凍結したスト
ローを液体窒素に投入して、液体窒素保管容器中で保存
する。
う。凍結は、急速ストロー法（液体窒素蒸気による凍結
法）により行うことができる。例えば、蓋のある発泡ス
チロール製の箱に、ストロー架台（金属製の試験管立て
等）と液体窒素を入れる。このとき、液体窒素の液面と
ストローとの距離が３．５〜４ｃｍ程度となるようにす
る。精液の入ったストローをストロー架台に並べ、蓋を
して所定時間、通常は３０分程静置する。凍結したスト
ローを液体窒素に投入して、液体窒素保管容器中で保存
する。
【００１９】このようにして保存された凍結精液は、半
永久的に保存することができ、これを融解して授精に用
いた場合、精子の受精率が下がることはないことが証明
されている。
永久的に保存することができ、これを融解して授精に用
いた場合、精子の受精率が下がることはないことが証明
されている。
【００２０】なお、上記の方法により保存された凍結精
液は、以下のようにして実際の授精に用いることができ
る。凍結精液のストローを、液体窒素に入れたまま鶏舎
に運び、５℃の水中で融解する。融解した精液を試験管
に移し、雌１羽あたり０．２〜０．５ｍｌをそのまま膣
部深部に注入する。なお、融解から注入完了までの操作
は、５分以内に行うべきである。このように、本発明の
方法により保存された凍結精液は、人工授精に用いるこ
とにより、高い受精率およびふ化率で効率よく鶏の繁殖
に供することが可能となる。
液は、以下のようにして実際の授精に用いることができ
る。凍結精液のストローを、液体窒素に入れたまま鶏舎
に運び、５℃の水中で融解する。融解した精液を試験管
に移し、雌１羽あたり０．２〜０．５ｍｌをそのまま膣
部深部に注入する。なお、融解から注入完了までの操作
は、５分以内に行うべきである。このように、本発明の
方法により保存された凍結精液は、人工授精に用いるこ
とにより、高い受精率およびふ化率で効率よく鶏の繁殖
に供することが可能となる。
【００２１】
【実施例】以下に本発明を実施例により詳しく説明す
る。 実施例１ （１）精液採取と１次希釈 横斑プリマスロックの雄鶏１２羽から、マッサージ法に
より精液を採取した。採取時間は、最初の精液を採取し
てから１５分程度で終了し、５℃に冷却した１次希釈液
によって２倍希釈して５℃で２０〜３０分静置した。１
次希釈液は、Ｌａｋｅ液（１９７９）のＢａｓｉｃ
（Ａ）に硫酸ゲンタマイシンを添加したものであり、具
体的な組成は以下の第１表に示す通りである。
る。 実施例１ （１）精液採取と１次希釈 横斑プリマスロックの雄鶏１２羽から、マッサージ法に
より精液を採取した。採取時間は、最初の精液を採取し
てから１５分程度で終了し、５℃に冷却した１次希釈液
によって２倍希釈して５℃で２０〜３０分静置した。１
次希釈液は、Ｌａｋｅ液（１９７９）のＢａｓｉｃ
（Ａ）に硫酸ゲンタマイシンを添加したものであり、具
体的な組成は以下の第１表に示す通りである。
【００２２】
【表１】 第１表〔１次希釈液の組成〕 ───────────────────────────── 成 分 分 量 ───────────────────────────── グルコース ０．６ｇ グルタミン酸ナトリウム１水和物 １．９２ｇ 酢酸ナトリウム無水物 ０．５１ｇ クエン酸３カリウム１水和物 ０．１２８ｇ 酢酸マグネシウム４水和物 ０．０８ｇ 硫酸ゲンタマイシン ０．００１ｇ 蒸留水 全量 １００ｍｌ ─────────────────────────────
【００２３】（２）２次希釈とストロー充填 １次希釈により得られた希釈液を、Ｎ−メチルアセトア
ミドを１５％含む２次希釈液を用いて、さらに２倍希釈
（原精液に対して４倍希釈で、Ｎ−メチルアセトアミド
の終末濃度が７．５％となるように行う）した。２次希
釈液は、第２表に示す組成のトレハロース液８５ｍｌを
Ｎ−メチルアセトアミド１５ｍｌと混合したものであ
る。
ミドを１５％含む２次希釈液を用いて、さらに２倍希釈
（原精液に対して４倍希釈で、Ｎ−メチルアセトアミド
の終末濃度が７．５％となるように行う）した。２次希
釈液は、第２表に示す組成のトレハロース液８５ｍｌを
Ｎ−メチルアセトアミド１５ｍｌと混合したものであ
る。
【００２４】
【表２】 第２表〔トレハロース液の組成〕 ─────────────────────────── 成 分 分 量 ─────────────────────────── トレハロース２水和物 １１．５ｇ 牛血清アルブミン ０．３ｇ 硫酸ゲンタマイシン ０．００１ｇ 蒸留水 全量 １００ｍｌ ───────────────────────────
【００２５】上記により２次希釈した希釈精液を、１ｍ
ｌのストローに充填した。なお、精液の１次希釈から２
次希釈までの作業は、すべて５℃で行い、希釈精液の温
度が上がらないように配慮した。
ｌのストローに充填した。なお、精液の１次希釈から２
次希釈までの作業は、すべて５℃で行い、希釈精液の温
度が上がらないように配慮した。
【００２６】（３）凍結 蓋のある発泡スチロール製の箱に、ストロー架台（金属
製の試験管立て等）と液体窒素を入れた。液体窒素の量
は、架台に並べたストローと液面との距離が３．５〜４
ｃｍ程度となるように入れた。精液の入ったストローを
ストロー架台に並べた後、蓋をして液体窒素蒸気中で３
０分静置した。続いて、凍結したストローをストロー架
台から箱内の液体窒素の中に投入して１０分程度おいた
後、箱から取り出し、液体窒素保管容器中に移して保存
した。
製の試験管立て等）と液体窒素を入れた。液体窒素の量
は、架台に並べたストローと液面との距離が３．５〜４
ｃｍ程度となるように入れた。精液の入ったストローを
ストロー架台に並べた後、蓋をして液体窒素蒸気中で３
０分静置した。続いて、凍結したストローをストロー架
台から箱内の液体窒素の中に投入して１０分程度おいた
後、箱から取り出し、液体窒素保管容器中に移して保存
した。
【００２７】（４）融解および注入 保存開始から数日経過後の凍結精液ストローを、液体窒
素に入れたまま鶏舎に運び、５℃の水中で融解した。融
解した精液を試験管に移し、ハイラインのコマーシャル
雌鶏２７羽の膣部深部に注入した。注入量は、１羽あた
り０．３ｍｌとした。なお、凍結精液の融解から注入完
了までの操作は５分以内に行うようにした。この人工授
精操作は、図１に示すように、合計３回行った。すなわ
ち、１回目の精液注入の翌日に２回目の注入を行い、さ
らに２回目の注入を行った日の３日後に３回目の精液注
入を行った。
素に入れたまま鶏舎に運び、５℃の水中で融解した。融
解した精液を試験管に移し、ハイラインのコマーシャル
雌鶏２７羽の膣部深部に注入した。注入量は、１羽あた
り０．３ｍｌとした。なお、凍結精液の融解から注入完
了までの操作は５分以内に行うようにした。この人工授
精操作は、図１に示すように、合計３回行った。すなわ
ち、１回目の精液注入の翌日に２回目の注入を行い、さ
らに２回目の注入を行った日の３日後に３回目の精液注
入を行った。
【００２８】（５）受精率およびふ化率の調査 １回目の精液注入の翌々日から８日間種卵採取を行い、
入卵を行った。種卵採取の期間は、図１に示した通りで
ある。検卵は、入卵から７日目にキャンドリングで行っ
た。受精卵は、発生までふ卵を続け、ふ化率を調査し
た。受精率およびふ化率の測定結果を第３表に示す。
入卵を行った。種卵採取の期間は、図１に示した通りで
ある。検卵は、入卵から７日目にキャンドリングで行っ
た。受精卵は、発生までふ卵を続け、ふ化率を調査し
た。受精率およびふ化率の測定結果を第３表に示す。
【００２９】実施例２ 実施例１と同様にして製造した凍結精液を０．５ｍｌの
ストローに充填したこと、並びにハイラインのコマーシ
ャル雌鶏を３０羽用いたこと以外は、実施例１と同様の
方法で人工授精試験を行った。受精率およびふ化率の測
定結果を第３表に示す。
ストローに充填したこと、並びにハイラインのコマーシ
ャル雌鶏を３０羽用いたこと以外は、実施例１と同様の
方法で人工授精試験を行った。受精率およびふ化率の測
定結果を第３表に示す。
【００３０】
【表３】 第３表〔受精率およびふ化率の測定結果〕 ───────────────────────────────── 実施例１ 実施例２ ───────────────────────────────── 受精個体 （羽） ２７ ３０ 入卵個数 （個） ２０６ ２２３ 受精卵 （個） １６７ １８８ 中止卵 （個） ３ ０ 死籠卵 （個） ５ ３ 発生ひな（羽） １５９ １８５ 受精率 （％） ８１．１ ８４．３ ふ化率 対入（％） ７７．２ ８３．０ 対受（％） ９５．２ ９８．４ ─────────────────────────────────
【００３１】第３表より、本発明の凍結保存剤を用いて
凍結保存された鶏精液は、融解後に人工授精に使用した
場合、８０％以上の高い受精率を示し、同様にふ化率
（対入）も８０％前後の高レベルを示すことがわかる。
凍結保存された鶏精液は、融解後に人工授精に使用した
場合、８０％以上の高い受精率を示し、同様にふ化率
（対入）も８０％前後の高レベルを示すことがわかる。
【００３２】
【発明の効果】本発明の凍結保存剤は、生殖細胞、特に
家禽等の耐凍性の低い精液の凍結保存に有効であり、生
殖能力をそのままで、半永久的な保存が可能である。し
かも、凍結前の希釈作業や融解後の操作が簡便である上
に、高い受精率が得られる。そのため、例えば鶏の場
合、本発明の方法により凍結保存した雄鶏の精液を人工
授精に供することによって、効率よく繁殖を行うことが
できるので、繋養施設を圧迫することなく、遺伝的に優
秀な雄鶏の後代検定が可能となり、系統の遺伝的改良を
早めることが期待される。また、累進交配や戻し交配が
容易になることから、学術的な利用も盛んになることが
予想できる。
家禽等の耐凍性の低い精液の凍結保存に有効であり、生
殖能力をそのままで、半永久的な保存が可能である。し
かも、凍結前の希釈作業や融解後の操作が簡便である上
に、高い受精率が得られる。そのため、例えば鶏の場
合、本発明の方法により凍結保存した雄鶏の精液を人工
授精に供することによって、効率よく繁殖を行うことが
できるので、繋養施設を圧迫することなく、遺伝的に優
秀な雄鶏の後代検定が可能となり、系統の遺伝的改良を
早めることが期待される。また、累進交配や戻し交配が
容易になることから、学術的な利用も盛んになることが
予想できる。
【００３３】従来、鶏の繁殖の際には成鶏を輸送する必
要があり、かなりの労力および時間を費やす必要はあっ
た。しかし、生体の代わりに、本発明により得た凍結精
液を輸送すれば、輸送費の低減を図ることができ、長距
離輸送の負担が全くない。同時に、輸送中の事故（へい
死）防止や鶏糞による悪臭問題等も解決できる。また、
本発明は、各種の研究手段としても利用することがで
き、例えば遺伝的に貴重な鶏などを精液として保存して
ジーンバンクとしたり、希少な形質転換鶏等の長期利用
も可能となる。
要があり、かなりの労力および時間を費やす必要はあっ
た。しかし、生体の代わりに、本発明により得た凍結精
液を輸送すれば、輸送費の低減を図ることができ、長距
離輸送の負担が全くない。同時に、輸送中の事故（へい
死）防止や鶏糞による悪臭問題等も解決できる。また、
本発明は、各種の研究手段としても利用することがで
き、例えば遺伝的に貴重な鶏などを精液として保存して
ジーンバンクとしたり、希少な形質転換鶏等の長期利用
も可能となる。
【図１】 実施例１および２における人工授精の時期お
よび種卵採取期間を示したものである。
よび種卵採取期間を示したものである。
ＡＩは、人工授精を行ったことを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) A01N 1/00 - 1/02 C12N 5/00 ＣＡ（ＳＴＮ)
Claims (2)
- 【請求項１】 Ｎ−メチルアセトアミドを含む生殖細胞
の凍結保存剤。 - 【請求項２】 請求項１記載の凍結保存剤を用いること
を特徴とする生殖細胞の凍結保存方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4098898A JP2942822B2 (ja) | 1998-02-09 | 1998-02-09 | 生殖細胞の凍結保存方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4098898A JP2942822B2 (ja) | 1998-02-09 | 1998-02-09 | 生殖細胞の凍結保存方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11228301A JPH11228301A (ja) | 1999-08-24 |
| JP2942822B2 true JP2942822B2 (ja) | 1999-08-30 |
Family
ID=12595819
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4098898A Expired - Lifetime JP2942822B2 (ja) | 1998-02-09 | 1998-02-09 | 生殖細胞の凍結保存方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2942822B2 (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5773347B2 (ja) * | 2009-11-27 | 2015-09-02 | 国立大学法人 千葉大学 | 血液細胞の凍結保存剤 |
| CN102487938B (zh) * | 2011-11-15 | 2014-04-02 | 青岛大学医学院附属医院 | 一种保护细胞连接的深低温保存方法 |
| CN113969274A (zh) * | 2012-03-16 | 2022-01-25 | 生育创新有限公司 | 精细胞的处理 |
| CN107913118A (zh) * | 2017-12-19 | 2018-04-17 | 佛山科学技术学院 | 一种骡鸭人工授精方法 |
| CN110946132A (zh) * | 2019-12-31 | 2020-04-03 | 赵章成 | 一种禽类精液营养剂、营养稀释液及其制备方法和应用 |
-
1998
- 1998-02-09 JP JP4098898A patent/JP2942822B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒｕｃｔｓ ｖｏｌ．１１４ 抄録番号２０２９９０ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH11228301A (ja) | 1999-08-24 |
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
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