CN1742688A - 中华鲟人工授精方法及所用稀释液 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种中华鲟人工授精方法及所用稀释液。所述的方法，是采用稀释液A液和B液作授精介质，用二次湿法操作，第一次用A液淘洗卵子去除卵巢液，第二次用B液激活卵子和精子并使精子分散均匀授精；所述的稀释液，为A液和B液，A液由NaCl、KCl、CaCl₂·2H₂O、MgCl·6H₂O、NaHCO₃、Na₂CO₃、NaOH、柠檬酸、青霉素、链霉素、蒸镏水配制而成，B液由A液以25倍体积的蒸镏水稀释而成。本发明解决的问题是，避免不利自然因素对人工授精的卵、精的损坏，提高卵、精激活率、受精率、降低致畸率、节省精液用量，从而使中华鲟人工授精对野生雄鲟捕捞数量的依赖降低。

Description

中华鲟人工授精方法及所用稀释液

所属技术领域：

本发明涉及鱼类人工授精技术。

背景技术：

中华鲟属江海洄游的大型鱼类。由于长江水利工程建设、水质污染的加剧以及捕捞强度增大等因素，中华鲟种群锐减，现已成为国家一级保护动物。提高中华鲟人工繁殖及人工增殖放流技术以帮助该种群的恢复，成为水产科学研究的重要课题。

进行中华鲟人工繁殖，需要中华鲟亲鱼，由于政府特许的捕捞减少，能获得的中华鲟亲鱼极少，而其中的雄性亲鱼更加稀少。因此，提高授精率，是人工繁殖摆脱资源条件制约的关键。

目前，鱼类人工授精的方法共有三种：干法、半干法、湿法。干法是发现雌鱼即将产卵时，一人用手按住雌鱼生殖孔，将鱼提出水面，擦去鱼体水份，另一人将卵挤入干盆中，用同样的方法立即向盆内挤入雄鱼精液，用手或羽毛轻轻搅拌，约1～2分钟，使精卵充分混合，然后，加入清水激活，再轻轻搅拌1～2分钟，静置约1分钟，倒去污液，人工授精即告完成。半干法的区别是，将挤出或用吸管吸出的精液用0.3～0.5％生理盐水稀释，然后倒在卵上，再搅拌。湿法的区别是将精、卵同时挤在盛有清水的盆中，不断搅匀授精。

中华鲟的人工授精，始于70年代。多年来所采用的方法是：分别将雌鱼的卵子和雄鱼的精子挤出，按每3～4万粒卵加约15毫升的精液，轻轻搅拌，充分混合均匀，然后加水300～500毫升，再轻轻搅拌1～2分种，静置约1分钟，倒去污液。所加入的水为长江水或者井水、自来水等淡水，是激活精、卵的授精介质。用这种方法所获得的受精率一般为51.9％。这种人工授精方法的受精率之所以不高，其原因主要为：

1.直接使用长江水或者其它淡水作中华鲟人工授精的授精介质，由于工业活动的加剧，有各种生产废液废渣排到水中和地下，使不同水源的成分各异且复杂，不同水质影响精卵激活率的因素差异较大，尤其是PH值不尽相宜，导致精子某些酶的活性被抑制，致使精子丧失授精能力。

2.作为授精介质的淡水一旦受到污染(如重金属、有机磷等)，对卵子、精子有毒害作用，使其丧失活力，直接影响受精率，而且增加胚胎的畸变。

3.人工授精，挤卵带出许多卵巢液，而中华鲟的卵巢液十分粘稠，与卵子裹在一起，采用干法授精，当精液加入后，许多精子被卵巢液粘住，加淡水激活后，也不能快速运动穿透卵子受精孔，使一些卵子得不到授精。

4.操作中，用作授精介质的淡水成分、渗透压、PH值不确定，其用量、各环节的时间控制不准确，存在随机随意性。

现有的中华鲟人工授精方法，除了受精率低的问题外，还存在精液用量大的问题。这是因为，中华鲟卵粒大且量大，附带的卵巢液粘稠又粘住许多精液，为了让精、卵充分混合，所以，必须使用大量的精液。这使中华鲟人工受精的资源成本加大，使本来就宝贵的雄亲鱼显得更加紧缺。

水生动物受精多以水为介质(淡水、海水)，淡水的低渗透压能激活淡水鱼类精子快速运动，海水中的K⁺离子或不同盐度的海水能激活海水鱼类精子快速运动。而研究鱼类尤其是江海洄游鱼人工授精稀释液鲜有报导。大黄鱼稀释液由NaCl、KCl、NaHCO₃、葡萄糖等组成，盐度为10‰时，大黄鱼精子不被激活，在盐度为20～30‰时，90％精子被激活(林丹军等，2002年)；大银鱼在下列配制的稀释液中精子寿命最长：

NaCl 7.47g、KCl 0.29g、CaCl 20.22g以1升蒸馏水稀释(李勃等，1997)。

发明内容：

本发明的目的，是为中华鲟人工授精提供一种方法，以提高受精率、降低致畸率、节省精液用量，从而减小对野生雄性亲鱼捕捞数量的依赖。

本发明的另一目的，是为实施该方法提供一种稀释液，以保证该方法实现要达到的目的。

本发明的技术方案是：分别取得和收集卵子、精子，按卵子数∶精液量＝1万粒∶1.33ml分量卵、精；按卵子数∶A液∶B液＝1万粒∶166.7毫升∶66.7毫升分量A液、B液；将A液倒入卵子中，用手单旋向轻搅20秒，迅速将手停在中央10秒，在30秒内将上层粘液倒掉，加入精液，轻搅20秒，加入B液，轻搅2分钟；

所述的A液，是按在每1000毫升的蒸馏水中，以下列物质及其含量所配制的人工授精稀释液：

NaCl 6.78g、KCl 1.56g、CaCl₂·2H₂O 0.20g、MgCl·6H₂O 0.22g、NaHCO₃ 0.30g、Na₂CO₃ 0.14g、NaOH 0.18g、柠檬酸0.10g、青霉素80万单位、链霉素80万单位；

所述的B液，是由A液以25倍体积蒸馏水稀释得到，

操作在气温和所述稀释液的温度为15～26℃下进行。

本发明，授精介质采用稀释液A液和B液，操作采用二次湿法。第一次是用A液淘洗卵子，湿法下，卵巢液分子间的结合力被稀释液破坏或减弱，从而降低其粘稠度，使卵巢液溶入稀释液随之排出；第二次是用B液激活卵子和精子，并将精子密度降低，让其均匀分散在卵子之中，实现授精。

作为本发明授精介质的稀释液，是参考中华鲟血液成分而配制，NaCl、KCl、CaCl₂·2H₂O、MgCl·6H₂O、NaHCO₃、Na₂CO₃在溶液中，各离子之间协同作用，使之成为平衡液；通过蒸馏水稀释，分成A液和B液，柠檬酸和NaOH使溶液在用于不同环节时具备所需的PH值，各组分的含量使溶液在用于不同环节时具备所需要的渗透压，A液中渗透压为289mosmol/kg、PH值为7.4，卵子用A液淘洗时，其环境条件与卵巢液的相仿，A液经25倍稀释成B液后，渗透压为265mosmol/kg、PH值为7.1，正适宜卵子打开受精孔和精子快速运动，卵子、精子在稀释液中就象在中华鲟体内一样；青霉素和链霉素使稀释液具备抗菌功能。

与中华鲟人工授精的现有技术相比，本发明所具的有优点是：

1.授精介质采用配制的稀释液，成分、渗透压、PH值稳定，避免污染，消除了不利自然因素对受精率的影响。

2.采用A液和B液二次湿法操作，适合中华鲟特有的生理现象，分步解决了轻松快捷除去粘稠量大的卵巢液和高比率激活精、卵的问题。

3.稀释液近似中华鲟体液，是一种等渗溶液，卵子在A液中能得到保护，保持原本的体征，B液能为精子补充能量，延长其存活时间，B液中恰当的渗透压和PH值能抑制精子的代谢进程，减少精子本身的营养消耗，增强精子抗外界环境变化的能力，而且特别适宜卵子受精孔的打开和精子的快速运动。

4.B液的使用还使精液量增加，使精子的密度降低，分布分散，提高其利用率。

5.操作规范，效果稳定。

上述特点的综合效果是使精、卵的激活率、受精率大为提高，畸变率降低，而精液的用量得到节省。这些均有利于减少对雄鲟的捕捞，利于中华鲟自然种群的保护。

应用本发明和现有技术分5次对中华鲟人工授精进行了对比试验，试验中，本发明授精介质为稀释液A液和B液，操作采用二次湿法；现有技术授精介质为长江水，操作采用干法，同在气温23℃、水温20℃条件下进行。结果是：

现有技术：5次的受精率分别是25.7％、45.1％、52.3％、62.4％、74％，平均受精率为51.9％，5次的致畸率分别是15.7％、23.1％、20.5％、21.2％、9.5％，平均致畸率为18.0％，精液用量：3万粒卵时用精液量＞10ml。

本发明：5次的受精率分别是65.2％、67.4％、71.3％、75.3％、98.3％，平均受精率为75.5％，5次的致畸率分别是2.3％、2.1％、0.8％、0.5％、0.3％，平均致畸率为1.2％，精液用量：3万粒卵时用精液量为4ml。

对比试验表明：本发明平均受精率高于现有技术23.6％，平均致畸率低于现有技术16.8％，精液用量节省60％。

具体实施方式：

下面以3万粒卵为例说明本发明的实施：

配制和量取稀释液：

按每1000ml蒸馏水中加入NaCl 6.78g、KCl 1.56g、CaCl₂·2H₂O 0.20g、MgCl·6H₂O 0.22g、NaHCO₃ 0.30g、Na₂CO₃ 0.14g、NaOH 0.18g、柠檬酸0.10g、青霉素80万单位、链霉素80万单位，按常规方法配制出A液，以A液25倍体积蒸馏水稀释A液得到B液，

按卵子数∶A液∶B液＝1万粒∶166.7ml∶66.7ml＝3万粒∶3×166.7ml∶3×66.7ml，取整数得A液为500ml、B液为200ml；

采卵、精并分量：

分别挤出和收集卵子、精子，取卵子3万粒，按卵子数∶精液量＝1万粒∶1.33ml＝3万粒∶3×1.33ml，取整数，得精液量为4ml；

授精操作：

人工授精在气温和稀释液温度为15～26℃下进行。

将500ml的A液倒入3万粒卵子中，用手(戴乳胶手套)顺时针轻轻搅拌20s，迅速将手停在液体中间10s使旋转的混合物静止，之后用30s的时间将上层粘液倒掉至少95％，将4ml精液倒入经淘洗的卵子中，轻搅20s初步混合，再将200ml的B液倒入，不断搅拌持续2min。人工授精即告完成。

Claims (2)

1.中华鲟人工授精方法，其特征在于，分别取得和收集卵子、精子，按卵子数∶精液量＝1万粒∶1.33ml分量卵、精；按卵子数∶A液∶B液＝1万粒∶166.7毫升∶66.7毫升分量A液、B液；将A液倒入卵子中，用手单旋向轻搅20秒，迅速将手停在中央10秒，在30秒内将上层粘液倒掉，加入精液，轻搅20秒，加入B液，轻搅2分钟；

所述的A液，是按每1000毫升的蒸馏水中，以下列物质及其含量所配制的人工授精稀释液：

NaCl 6.78g、KCl 1.56g、CaCl₂·2H₂O 0.20g、MgCl·6H₂O 0.22g、NaHCO₃ 0.30g、Na₂CO₃ 0.14g、NaOH 0.18g、柠檬酸0.10g、青霉素80万单位、链霉素80万单位；

所述的B液，是由A液以25倍体积蒸馏水稀释得到，

操作在气温和所述稀释液的温度为15～26℃下进行。

2.用于权利要求1所述方法中的稀释液，其特征在于，具有A液和B液，所述的A液是在每1000毫升的蒸馏水中，加入下列物质及其含量相配制而得到：NaCl 6.78g、KCl 1.56g、CaCl·2H₂O 0.20g、MgCl·6H₂O 0.22g、NaHCO₃ 0.30g、Na₂CO₃ 0.14g、NaOH 0.18g、柠檬酸0.10g、青霉素80万单位、链霉素80万单位；

所述的B液，是由A液以25倍体积的蒸馏水稀释得到。