CN103710353A - 中华鲟boule基因序列及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种中华鲟boule的基因序列及其用途，该基因的cDNA序列全长2586bp，开放阅读框为1065bp，编码354个氨基酸，具有如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列和SEQIDNo.2所示的氨基酸序列。该基因序列可应用于中华鲟生殖细胞的鉴定、追踪和分离，为中华鲟生殖细胞移植和种质资源保存等方面的应用研究奠定基础。

Description

中华鲟boule基因序列及其用途

技术领域

本发明涉及到生物工程领域，特别涉及到一种中华鲟boule基因序列及其用途。

背景技术

中华鲟(Acipenser sinensis)是一种古老的大型溯河产卵洄游性鱼类, 具有在淡水中繁殖、海水中生长和发育的生活习性。由于筑坝、航运、污染和过度捕捞等人类活动的影响，中华鲟资源量急剧下降，1988年被列为国家一级重点保护动物。长江所自上世纪80年代即开始从事中华鲟人工繁殖工作，并实现了规模化人工繁殖，但此种方法需要对其亲本长期养殖，需要投入大量的人力、物力和财力，而且还存在亲鱼死亡等多种风险，因此，有必要寻求其他办法对该物种进行多途径的保护。近年来随着生物技术的快速发展，生殖细胞移植被认为是一种周期短而且有效的方法，在多种鱼类中有成功应用的报道。该种方法的实施需要首先鉴定出中华鲟生殖细胞的标记基因，在此基础上再鉴定并分离生殖细胞用于生殖细胞移植。

DAZ基因家族成员均为生殖细胞标记基因，包括3个成员：daz、dazl和boule，其编码的蛋白质都含有一个保守的RRM结构域和一个或多个DAZ结构域。目前的观点认为，boule是DAZ基因家族的祖先基因。在脊椎动物的进化过程中，boule经过复制在常染色体上产生dazl基因；dazl基因再经一次复制、转座及多次复制，在Y染色体上产生多个拷贝DNA基因。虽然有研究报道boule基因在线虫、青鳉和虹鳟的卵巢中有表达，但它主要还是在精巢中表达。果蝇中，boule基因的突变使雄性的生殖细胞停留在减数分裂期。另外，boule基因在人类睾丸组织(第一次减数分裂前中期的生殖细胞)中特异表达，是人类精子发生过程中减数分裂转换的主要调控因子。因此，对中华鲟boule基因研究，了解其在生殖细胞中的表达特征，并应用于生殖细胞的鉴定、追踪和分离，可为中华鲟生殖细胞移植和种质资源保存等方面的应用研究奠定基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种中华鲟boule基因序列及其用途。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

本发明所述的中华鲟boule基因全长cDNA为2586bp，开放阅读框为1065 bp，编码354个氨基酸，具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

所述基因编码的蛋白质具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

本发明利用荧光定量PCR技术检测中华鲟boule基因在不同组织（心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肠、精巢、卵巢、垂体、下丘脑、端脑、中脑、小脑和延脑）的转录水平，结果表明：boule基因只在精巢和卵巢中表达，且精巢的表达量是卵巢的18倍左右。

本发明利用原位杂交技术研究了中华鲟boule基因在精巢和卵巢中表达特征，结果表明：该基因在精巢中的精原细胞和初级精母细胞中有表达，在次级精母细胞中的表达量有所增加，而在精子细胞中几乎不表达；在卵巢中，中华鲟boule基因在卵原细胞和初级卵母细胞中大量表达。

本发明制备了中华鲟boule蛋白的特异性多克隆抗体。

本发明利用Western Blot技术检测中华鲟boule蛋白在不同组织（心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肠、精巢、卵巢、垂体、下丘脑、端脑、中脑、小脑和延脑）的表达特征，结果表明：boule蛋白只在精巢和卵巢中表达。 

本发明利用免疫组化技术研究中华鲟boule蛋白在精巢和卵巢中的表达特征，结果表明：在精巢中，boule蛋白在精原细胞、初级精母细胞和次级精母细胞中有表达，而在精子细胞中的表达量减弱，精子中几乎不见，卵巢中，boule蛋白在卵原细胞和初级卵母细胞中大量表达。

本发明的积极效果为：本发明提供了中华鲟boule基因的序列和不同组织中的其RNA和蛋白表达特征，鉴定了一种中华鲟生殖细胞标记基因。该基因可以应用于筛选和分离中华鲟生殖细胞，为中华鲟生殖细胞移植和种质资源保存等方面的应用研究奠定基础。

附图说明

图1为Real-time PCR检测boule基因在中华鲟不同组织中的表达特征；

图2为boule基因在中华鲟卵巢和精巢中的表达特征。A和B为卵巢，B为A中矩形区域的放大；C为精巢；og为卵原细胞，Ⅰ和Ⅱ为初级卵母细胞；SG为精原细胞，PSP为初级精母细胞，SSP为次级精母细胞，SPD为精子细胞；

图3为boule蛋白在中华鲟不同组织中的表达特征；

图4为boule蛋白在中华鲟卵巢和精巢中的表达特征。A、B和C为卵巢，D、E和F为精巢。A和D为中华鲟boule蛋白抗体的免疫荧光定位，B和E为细胞核的荧光定位，C和F为两种荧光的共定位。

具体实施方式

下面结合附图1至4进一步说明本发明的具体实施方式。

1．总RNA的提取

取人工养殖4龄中华鲟，麻醉放血，取出性腺，置于液氮中速冻，然后存放－80℃冰箱。取备用样品，按SV Total RNA Isolation System (Promega，USA) 试剂盒的说明提取总RNA。

2．SMART cDNA的合成

按SMARTer? RACE cDNA Amplification Kit操作手册的方法合成中华鲟性腺SMART cDNA第一链：（1）取2 μL总RNA与1 μL 3’-CDS Primer A /5’-CDS Primer A混匀，72℃ 孵育3 min，42℃ 温育2 min。（2） 5’RACE cDNA合成反应管中，加入1 μL SMARTⅡA Oligo，然后，混匀，离心。（3）向反应管中加入5×Buffer，DTT，RNase Inhibitor，dNTP， SMARTScribe? 反转录酶混匀， 42℃ 温育90 min，70℃ 温育10 min。（4） 用20μL的Tricine-EDTA Buffer稀释合成的cDNA第一链产物，置于-20℃保存备用。

3．引物设计依据和引物合成的方法

从GenBank数据库中下载已知物种boule的同源基因编码区序列，通过Clustal X2比对分析保守区，然后运用Primer Premier 5.0和Oligo 6.0软件设计简并引物，引物设计后提交生工生物工程（上海）有限公司进行合成。所合成的引物序列为：boule-degenerate_forward：5’- ATCCCYAAYCGSMTYTTTGT-3’， boule-degenerate_reverse：5’- AAGTARGCNACDCCRTTGTG-3’。

4．中华鲟boule基因cDNA全序列的克隆

以上述合成的SMART cDNA为模板，用兼并引物进行PCR扩增，扩增所得到的PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，在紫外灯下割胶回收目的片段，用DNA凝胶回收试剂盒（Omega）回收。然后将纯化的PCR产物连入PMD-18T载体中，转化DH5α感受态细胞，挑取单菌落，经PCR检测后，将阳性克隆送到生工生物工程（上海）有限公司用M13引物进行测序。

根据已得到的cDNA片段序列设计特异引物，利用cDNA末端快速扩增技术（Rapid Amplification of cDNA ends, RACE），对目的基因的3’和5’末端进行PCR扩增。

在3’RACE中，采用巢式PCR进行扩增。以上述合成的第一链cDNA作为模板，首先用Asboule-3’RACE forward（5’-GATTTGGGGCAGTGAAGGAAGT-3’）和接头引物UPM（5’- CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’和5’-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3’）进行PCR反应，以所得的PCR产物稀释100的倍作为模板，利用Asboule-3’RACE nested forward（5’-GGACCTACACAATGGATGAC-3’）和接头引物NUP（5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’）再进行PCR扩增。

在5’RACE中，根据3’RACE测序得到的序列信息设计5’RACE特异引物Asboule-5’RACE reverse（5’-GCTGCCTAACATTTTCCATCATT-3’）和Asboule-5’RACE nested reverse（5’-AAGGAGCAGTCATCCATTGTGTAG-3’）采用巢式PCR进行扩增。以上述合成的SMART cDNA作为模板，首先用Asboule-5’RACE reverse和UPM引物进行第一轮PCR，用所得PCR产物稀释100的倍作为模板，再利用5’RACE nested reverse和NUP引物进行第二轮PCR扩增。

扩增所得到的PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，在紫外灯下割胶回收目的片段，用DNA凝胶回收试剂盒（Omega）回收。然后将纯化的PCR产物连入PMD-18T载体中，转化DH5α感受态细胞，挑取单菌落，经PCR检测后，将阳性克隆送到生工生物工程（上海）有限公司用M13引物进行测序。测序所得5’RACE序列和3’RACE序列利用Chromas软件进行拼接，得到中华鲟boule基因的全长cDNA序列。

5．中华鲟boule基因序列的测定

所得到的PCR产物在1.5%的琼脂糖凝胶电泳上进行分离检测后，将PCR产物纯化，克隆到pMD-18T载体中，转化肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取单菌落，经PCR检测后，将阳性克隆送到生工生物工程（上海）有限公司用M13引物进行测序。测序结果用BLAST软件进行同源性测定，来确定为中华鲟boule基因的同源序列。用ORF Finder查找开放阅读框，并推导其相应的氨基酸序列。

6．中华鲟boule基因在不同组织中的荧光定量PCR分析

取中华鲟的心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肠、精巢、卵巢、垂体、下丘脑、端脑、中脑、小脑、延脑组织，提取总RNA。各取1μg的总RNA，用PrimeScript? RT reagent Kit With gDNA Eraser (TaKaRa)试剂盒合成cDNA，稀释5倍后作为模板。根据boule基因的cDNA序列设计特异的荧光定量PCR引物（boule-RT-F：GGGTGGTGAACGAGGTGAAGATA和boule-RT-R：CCACTTGCTGTTTGCGGATG），对boule的cDNA进行荧光定量PCR检测。以中华鲟β-actin作为内参基因（引物为actin-qF：CCTTCTTGGGTATGGAATCTTGC和actin-qR：CAGAGTATTTACGCTCAGGTGGG），所得数据通过2^?ΔΔCT 的方法计算目的基因的相对表达量。利用SYBR green real-time PCR master mix (BioRad)进行荧光定量PCR。PCR反应体系为20 μL，包含10 μL SYBR green real-time PCR master mix，上下游引物(10 mmol/L) 各0.5 μL、1μL稀释的cDNA 模板和8μL灭菌水。PCR反应在CFX 96 TM Real Time System (Bio-Rad) 上完成。PCR反应程序为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性10 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，读板温度77 ℃，读板时间5s；40次循环，做熔解曲线分析温度为65-95 ℃。所有实验样品均重复3 次。如图1所示，boule基因只在精巢和卵巢中表达，且精巢的表达量是卵巢的18倍左右。

7．中华鲟boule蛋白特异性抗体的制备

选用pET-32a载体表达目的基因。设计一对分别含有BamH I和Xho I酶切位点的引物Asboule-E-F(GGATCCATGTCTGTCAAAGAATCACAG)和Asboule-E-R(CTCGAGTCATAACAGGGTCAGCAGT)，其扩增产物编码230个氨基酸。经PCR扩增后，回收产物、连接pMD-18载体。然后，摇菌，提质粒，进行双酶切并回收产物。将pET-32a质粒用BamH I和Xho I酶切后回收。接着将目的基因与载体连接，转化到大肠杆菌BL21(DE3)，经菌落PCR筛选重组克隆，然后进行测序验证。

接种Asboule基因的重组表达菌株于含有LB液体培养基，在37℃ 250 rpm的条件下培养到对数期，然后加入终浓度为1 mM的IPTG，诱导表达4 h。收集宿主菌，重悬后超声波破碎细菌，离心，制备蛋白样品，经SDS-PAGE分离。切下两边缘胶条，经考马斯亮蓝染色、脱色后，找出目标蛋白表达位置，然后切胶回收。将含有该蛋白的胶反复冻融、磨碎，并浸泡于1ml的生理盐水中。取10μL的样品和等体积的2×Loading Buffer悬液于沸水浴10 min 后上样，经SDS-PAGE分析蛋白的纯度和浓度。

免疫日本大耳白兔(中国科学院武汉病毒研究所提供),具体方法为：在注射抗原之前的一周进行预免疫。一周后，将1 ml纯化蛋白（约500 μg）在兔的背部皮下多点注射，每点注射剂量约0.2 ml。第一次注射2周后加强免疫4次，每次剂量为第一次注射的一半，每次间隔2周，在第4次注射后10天自心脏抽取血液。将兔血放在37℃静置1 h后，沿管壁搅动一圈，利于血细胞沉降，再于4℃静置过夜，室温，取300 g离心10 min，吸取多抗血清，分装后保存于-80℃冰箱。结果得到了中华鲟boule蛋白的特异性抗体。

8．卵巢和精巢的冰冻切片

取甲醇中保存的卵巢和精巢样品，梯度过度到PBS中，再用30％的蔗糖4℃渗透过夜；取出样品，在底座上摆好方向，用OCT包埋；置－25℃约3－4小时，即可进行切片；切片厚度为7μm，将切片贴在多聚赖氨酸浸泡处理的玻片上，37℃烤片一个小时，之后置于-80℃以备原位杂交和免疫组化用。

9．中华鲟boule基因正义和反义探针的合成

根据得到的中华鲟boule基因的序列设计正义探针（boule-sense-T7-F：TAATACGACTCACTATAGGGTACCAGGCTCCTACCCAGTGTC和boule-sense-R：TCAAATGCTGCCACCTTGTCAG）和反义探针（boule-antisense-F：TACCAGGCTCCTACCCAGTGTC和boule-antisense-T7-R：TAATACGACTCACTATAGGGTCAAATGCTGCCACCTTGTCAG）引物，以逆转录的cDNA为模板分别扩增得到正义和反义探针的模板DNA，接着进行体外转录。                                               

.反应体系为：10×Buffer 1μL，10×DIG RNA Labeling Mix 1μL，RNA 聚合酶1μL，模板DNA 6.5μL和RNasin 0.5μL，总体积为10μL，在37℃下反应两小时。

. 向反应管中加2U的DNaseI，10ΜL DEPC水，37℃消化30min。

.向反应体系中加入2μL  0.2M的EDTA中止反应体系。④. 再加入2.5μL 4M LiCl和75μL预冷的100%乙醇，-20℃沉淀过夜。⑤. 4℃，12000rpm离心15min，沉淀用75%冷乙醇洗涤一次。

. 沉淀按1μg/μL的浓度重悬，并加入20U（0.5μL）RNain。

. 用分光光度计测浓度，并取0.2μL电泳检测，应为一条或两条带。. 1ml杂交液里应加1μg探针，使其终浓度为1ng/μL，按一管1μg分装，冻于-80℃备用。

10．中华鲟boule基因在卵巢和精巢中的表达特征分析

原位杂交第一天：①.将切片用PBS复水。②.用浓度为10μg/ml蛋白酶K 消化10 min。③.用4％PFA室温固定20min。④.PBST 漂洗4×5min。⑤.boule正义和反义探针70℃变性5min后，分别加入新鲜的杂交液至终浓度为1ng/μL；60℃反应过夜。

原位杂交第二天：探针漂洗在60℃杂交箱中进行。①.从HM（50% deionized formamide，5×SSC，0.1% Tween20 pH6.0）过渡到2×SSC，即75% HM、50% HM、25% HM和100% 2×SSC，每次10 min。②.0.2×SSCT，2×30min。③.从0.2×SSC过渡到PBST，即75% 0.2×SSC、50% 0.2×SSC、25% 0.2×SSC和1×PBST，每次10 min。④.加入封闭液(1×PBT, 2% sheep serum, 2 mg/ml BSA)，室温3h。⑤.加入抗地高辛的碱性磷酸酶标记抗体反应液（1:3000，封闭液稀释），4℃过夜。

原位杂交第三天：①.用PBST洗去多余抗体，6次，每次15min。②.用显色缓冲液（100 mM Tris HCl, pH9.5, 50 mM MgCl₂, 100mM NaCl and 0.1% Tween20）平衡，3次，每次5min。③. 用NBT/BCIP系统室温下显色，注意定时检测显色效果。④.用Stop solution（1×PBS, pH 5.5, 1 mM EDTA, 0.1% Tween-20）终止显色。⑤.最后用甲醇去浮色，放置40秒，用甘油封片，在显微镜下观察拍照。结果表明：如图2所示，中华鲟boule基因在精巢中的精原细胞和初级精母细胞中有表达，在次级精母细胞中的表达量有所增加，而在精子细胞中几乎不表达；在卵巢中，中华鲟boule基因在卵原细胞和初级细胞中大量表达。

11．中华鲟boule蛋白在不同组织中的表达特征

⑴.各种组织加入1ml EB匀浆缓冲液（100 mmol/L β-磷酸甘油，20 mmol/L HEPES，20 mmol/L EGTA，15 mmol/L MgCl₂，pH7.3，临用前加入1 mmol/L DTT，2 mmol/L PMSF，2.5 μg/ml leupetin，2.5 μg/ml aprotinin）进行冰浴匀浆，取10000 g离心10 min，取上清液。⑵.加入等体积的2×Loading Buffer，沸水浴10 min，冰上冷却。⑶.经12％SDS-PAGE胶（Bio-Rad Mini-Protein电泳系统）电泳分离。⑷.转膜：将电泳后的凝胶于转膜缓冲液（25 mM Tris pH 8.3，192 mM 甘氨酸，15%甲醇）中平衡10 min。同时，将PVDF膜在甲醇中浸泡5分钟，再浸泡于转膜缓冲液备用。所用的滤纸也浸泡于转膜缓冲液中。然后，按照Mini Trans-Blot 电泳转移系统（Bio-Rad）的说明装配转膜系统，80 V恒压转膜40 min，将蛋白转移至PVDF膜上。⑸.用丽春红染色1 min，在甲醇中脱色，用铅笔标出Marker。⑹.用TBS溶液（25 mM Tris pH 7.5，500 mM NaCl）洗膜3次，每次10 min。⑺.用 5%奶粉（溶于TBST中）室温封闭1h。⑻.加入4ml一抗孵育液（1:200稀释兔抗血清，1％奶粉，溶于TBST中），4℃孵育过夜。⑼.用TBST（TBS中加入0.1 %Tween-20）洗膜3次，每次10 min。⑽.加入4ml二抗孵育液（1:5000稀释AP-标记羊抗兔血清，1％奶粉，溶于TBST中）继续室温孵育1h。⑾.用TBST溶液室温下洗膜3次，每次10min。⑿.用NBT/BCIP显色。结果表明：如图3所示，中华鲟boule蛋白只在精巢和卵巢中表达。

12．中华鲟boule蛋白在精巢和卵巢中的表达特征

⑴.取出-80℃存放备用的切片，室温下在湿盒中放置5 min，新鲜的切片直接用于以下操作。⑵.用5％奶粉（溶于PBS）进行封闭室温1 h。⑶.用PBS冲洗玻片3次后，加入200μL一抗孵育液（1:150稀释兔血清抗体，1％奶粉，溶于PBS中，每个玻片加入约200 uL），4℃下于湿盒中孵育过夜。⑷.取出玻片，置于卧式染缸中，用PBST（PBS+0.1％Tween-20）在摇床上摇洗5次，每次10 min。⑸.再用PBS洗两次，每次10 min。⑹.加入200μL二抗孵育液（1:200稀释FITC-标记羊抗兔血清，2％正常羊血清，10 μg/ml DAPI，溶于PBS中）暗盒中室温孵育1h。⑺.取出玻片，置于卧式染缸中，用PBS清洗5次，每次10 min。⑻.用抗淬灭剂封片。⑼.用Zeiss激光共聚焦显微镜观察和拍照。每次实验取相邻的切片作为阴性对照（一抗孵育过程用对照的血清代替抗血清，其它的均相同）。结果表明：如图4所示，在精巢中，boule蛋白在精原细胞、初级精母细胞和次级精母细胞中有表达，而在精子细胞中的表达量减弱，精子中几乎不见，卵巢中，boule蛋白在卵原细胞和初级卵母细胞中大量表达。

以上所述仅是本发明的非限定实施方式，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思和不作出创造性劳动的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110>  中国水产科学研究院长江水产研究所

<120>  中华鲟boule基因序列及其用途

<160>  2     

<170>  PatentIn version 3.3

<210>  1

<211>  2586

<212>  DNA

<213>  中华鲟（Acipenser sinensis）

<400>  1

gagcgaaggg aggccattga agacagtgtt gtatcgaccc ggtacaggag aacttcagtt     60

cattatcact tattataata tttaaatata tatttttaca tattactact catagttagg    120

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caactttttc tatatattgt ggcagcaaga aataaaacag aacagcattt aactcttctt   2100

tttttcttta aaaagaaaaa gtgtattatg atcatggctg caacattata ataactgtgt   2160

gtgtagacta gtatgtttta tattgctaga tgtatccttt tattcttgac tggtgaagac   2220

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ttaaaagatt gtaacccaag tgtcgttctc ctccactgac aaggtggcag catttgaatg   2340

gccggttact tctattgtgg taagcaggtc agtcttcggt cctgcagtca ttagttgtag   2400

atgtaaaaca agtgtgtgct atttcaagta gcacgttgat gactggaaaa tgtaatttct   2460

ggatctaaat aaaaaattta gattcatgta caacactagg aaggttaaac tatgatactg   2520

gatctttaag agtacaataa aggttggtta aaatgttaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa   2580

aaaaaa                                                              2586

<210>  2

<211>  354

<212>  PRT

<213>  中华鲟（Acipenser sinensis）

<400>  2

Met Met Glu Asn Glu Ile Thr Gln Thr Ser Ser Gln Thr Gln Thr Gly 

1               5                   10                  15      

Ser Leu Ser Pro Pro Asn Gly Met Ala Pro Ser Pro Gly Asn His Gly 

            20                  25                  30          

Asn Pro Thr Ser Ala Pro Arg Tyr Gly Thr Val Ile Pro Asn Arg Ile 

        35                  40                  45              

Phe Val Gly Gly Ile Asp Phe Lys Thr Asn Glu Asn Asp Leu Arg Lys 

    50                  55                  60                  

Phe Phe Ser His Tyr Gly Val Val Asn Glu Val Lys Ile Val Asn Asp 

65                  70                  75                  80  

Arg Ala Gly Val Ser Lys Gly Tyr Gly Phe Val Thr Phe Glu Thr Gln 

                85                  90                  95      

Asp Asp Ala Gln Lys Ile Leu Gln Glu Ala Asp Lys Leu Phe Phe Arg 

            100                 105                 110         

Asp Lys Lys Leu Asn Val Gly Pro Ala Ile Arg Lys Gln Gln Val Gly 

        115                 120                 125             

Ile Pro Tyr Ala Gly Phe Pro Phe Ser Gly Ser Ser Pro Ser Val Thr 

    130                 135                 140                 

Pro Pro Ser Pro Ala Thr Met Tyr Phe Thr Thr Ser Thr Gly Tyr Pro 

145                 150                 155                 160 

Tyr Thr Tyr His Asn Gly Val Ala Tyr Phe His Ala Pro Glu Ile Thr 

                165                 170                 175     

Ser Val Pro Gln His Trp Pro Pro Cys Ser Ile Ser Ser Ser Pro Val 

            180                 185                 190         

Met Val Thr His Glu Ala His Pro Val Leu Gln Gln Pro Ala Cys His 

        195                 200                 205             

Tyr Gln Ala Pro Thr Gln Cys Leu Pro Gly Gln Trp Gln Trp Ser Leu 

    210                 215                 220                 

Pro Gln Ser Pro Ala Pro Ala Met Pro Leu Leu Tyr Met Gln Ala Ser 

225                 230                 235                 240 

Asp Ile Leu Tyr Gln Thr Gln Glu Leu Pro Gln Asp Gly Gly Cys Ala 

                245                 250                 255     

Pro Ser Thr Leu Pro Met Leu Glu Ala Thr Val Pro Glu Ala Phe Pro 

            260                 265                 270         

Glu His Gly Val Gln Pro Ala Tyr His Gln Val Phe Thr Gln Ser Pro 

        275                 280                 285             

Ala Cys Met Pro Gln Leu Pro Ile Leu Gln Gln Glu Pro Val Lys Asp 

    290                 295                 300                 

Gln Arg Leu His Ala Met His Arg Gly Phe Ser Gln Ser Pro Met Gly 

305                 310                 315                 320 

Leu Thr Pro Arg Tyr Thr Arg Ser Ser Leu Tyr His Ser Arg Lys Asp 

                325                 330                 335     

Tyr Arg Pro Glu Glu Ser Ile Leu Ala Pro Pro Ala Ser Thr Glu Ser 

            340                 345                 350         

Leu Asn

Claims (3)

1.一种中华鲟boule基因，其特征在于：所述中华鲟boule基因的cDNA核苷酸序列如表中SEQ ID No.1所述。

2.一种中华鲟boule基因，其特征在于：所述中华鲟boule基因的氨基酸序列如表中SEQ ID No.2所述。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的一种中华鲟boule基因的用途，其特征在于：用于中华鲟生殖细胞的鉴定、追踪和分离。

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