CN107298713A - 一种抗pd‑l1抗体及应用、制备方法、试剂盒和药物 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种抗PD‑L1抗体及应用、制备方法、试剂盒和药物，涉及生物检测和治疗技术领域。本发明提供的抗PD‑L1抗体，其含有重链可变区和轻链可变区，其中，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。该抗PD‑L1抗体可以特异性识别结合PD‑L1重组蛋白、以及表达PD‑L1分子的炎症组织细胞或肿瘤组织细胞，具有较高的特异性以及亲和力，可用于免疫印迹、酶联免疫吸附、免疫组织化学以及流式细胞术检测，也可以用于肿瘤、自身免疫性疾病和慢性感染性疾病等疾病的治疗。

Description

一种抗PD-L1抗体及应用、制备方法、试剂盒和药物

技术领域

本发明涉及生物检测和治疗技术领域，具体而言，涉及一种抗 PD-L1抗体及应用、制备方法、试剂盒和药物。

背景技术

程序性细胞死亡因子配体1(Programmed cell death 1ligand 1， PD-L1)是一个由290个氨基酸组成的跨膜糖蛋白。PD-L1属于B7家族，具有IgV和IgC样区、跨膜区及胞浆区尾部，PD-L1与其T细胞上的程序性细胞死亡因子1(Programmed cell death 1，PD-1)相互作用，在免疫应答的负性调控方面发挥着重要作用(Riley J L.PD-1 signaling inprimary T cells[J].Immunol Rev.2009，229(1):114-1125.)，广泛的低表达在正常免疫和非免疫细胞的表面，过表达于部分肿瘤细胞。

在正常免疫系统中，PD-L1在免疫耐受方面，起着极其重要的作用。研究表明PD-L1表达在牙周膜细胞表面，促进T细胞的凋亡并抑制炎症细胞对牙周膜细胞的损伤作用(张杰华.炎性诱导牙周膜细胞表面表达的PD-L1是对抗牙周炎的一种保护性机制.第九届全国免疫学学术大会论文集.2014)。

在肿瘤方面，在淋巴瘤、绒毛膜癌、黑色素瘤、食管癌等大多数肿瘤细胞系都检测到了PD-L1的表达，致使T细胞的凋亡，清除活化的T细胞(Dong H.Tumor-associated B7-H1promotes T-cell apoptosis:a potential mechanism of immune evasion[J].NatMed,2002, 8(8):793-800.)。PD-L1在乳腺癌(Muenst S.Expression of programmeddeath ligand 1(PD-L1)is associated with poor prognosis in human breast cancer[J].Breast Cancer Res Treat,2014,146(1):15-24.)、胃癌(Kim J W,Prognosticimplications of immnosuppressive protein expression in tumors as well asimmune cell infiltration within the tumor microenvironment in gastric cancer[J/OL].Gastric Cancer,2014.)、肾癌 (Choueiri TK.PD-L1Expression in non-clear-cell renal cell carcinoma[J].Ann oncol,2014,25(11):2178-2184)等多种肿瘤中表达上调，而在正常组织中低表达或不表达。

肿瘤细胞免疫逃逸是肿瘤躲避免疫系统清除的重要原因之一。表达于肿瘤细胞表面的PD-L1与PD-1结合抑制T细胞的激活，使其不能发现肿瘤。抗PD-L1单抗能有效结合癌细胞表面的PD-L1，阻断信号通路，激活T细胞，并杀死肿瘤细胞。阻断PD-L1/PD-1通路能提高T细胞的反应(Blank C.Blockade of PD-L1(B7-H1)augments human tumor-specific Tcell responses in vitro[J].Int J Cancer,2006, 119(2):317-327.)研究发现(刘志华.负性共刺激分子PD-L1在非肌层浸润性膀胱癌的表达及其对术后膀胱灌注治疗的影响.中山大学学报 (医学科学版).2015,36(2):221-225.))，PD-L1在非肌层浸润性膀胱癌细胞表达水平与肿瘤病理分期相关，根据PD-L1的表达选择药物，可以提高治疗效果。下调肺腺癌A549细胞PD-L1的mRNA表达，可以增强杀伤细胞对A549细胞的杀伤作用(蒋涛.CIK细胞对RNAi 沉默PD-L1基因的肺腺癌A549细胞的体外抑制作用.现代肿瘤医学.2015.23(12):1641-1643)PD-L1蛋白是非小细胞肺癌中预测肿瘤术后进展的重要指标(刘明东.PD-L1、Ki67预测非小细胞肺癌术后进展的研究.现代肿瘤医学.2017.885-889)。PD-L1的预后指标作用在其他肿瘤的研究中也有相关报道。

在慢性病毒感染性疾病方面，研究结果显示，在PD-L1基因敲除小鼠中，大量CD8+T细胞聚集在肝内，使活化T细胞的清除率下降，导致自身免疫性肝炎的发病率上升(DongH.B7-H1 determines accumulation and deletion of intrahepatic CD8+ Tlymphocytes[J]. Immunity,2004,20(3):327-336.)。研究发现，在活化的T细胞或者在病毒感染期，干扰素上调PD-L1在肝细胞上的表达，并与与表达在T 细胞上PD-1共同作用，诱导T细胞凋亡(Mühlbauer M.PD-L1is induced in hepatocytes by viral infection andby interferon-αand-γ and mediates T cell apoptosis[J].J Hepatol,2006,45(4):520-528.)研究慢性淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒感染小鼠(Daniel L Barber.Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection[J].Nature，2006，439(7077):682-687.)结果表明，对功能受损病毒特异性CD8+T细胞进行基因表达分析比较，发现PD-L1在感染的细胞上也高表达，对PD-1/PD-L1信号通路进行阻断，可以增强 T细胞的反应性，恢复CD8+T细胞部分功能。此机制有助于为慢性感染性疾病制定治疗策略。

抗体药物是以细胞工程技术和基因工程技术为主体的抗体工程技术制备的药物，具有特异性高，机制明确，疗效显著，毒副作用少等优点，在各种疾病治疗、特别是对肿瘤治疗有非常广阔的前景。目前美国FDA已经批准使用的抗PD-L1的单抗药物为罗氏 (Roche/Genentech)的Atezolizumab(Tecentriq)，在临床上用于治疗膀胱癌和非小细胞肺癌。

基于基因的检测方法只能在核酸水平上反映样品中基因含量，不能检测其是处于沉默还是表达，因此，其检测结果与蛋白的实际含量并无直接关联。加之，基因在加工过程中会因降解掉而难以检测，而核酸检测方法必须经过专门的核酸提取和纯化过程，增加了额外的工作量。基于蛋白的免疫学分析方法，采用高度特异性的抗原抗体反应，实现样本快速、准确、高效的检测，其技术关键是制备具有高度特异性的抗体。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗PD-L1抗体，其可特异性结合 PD-L1蛋白，具有较高的特异性，可用于免疫印迹(Western Blot)、酶联免疫吸附(ELISA)、免疫组织化学(IHC)以及流式细胞术(FACS) 检测，也可以用于肿瘤、自身免疫性疾病和慢性感染性疾病等疾病的治疗。

本发明的另一目的在于提供一种抗PD-L1的抗体片段，其具有与上述抗PD-L1抗体等同的效果，可特异性结合PD-L1蛋白，具有较高的特异性。

本发明的另一目的在于提供上述抗PD-L1抗体以及抗PD-L1的抗体片段的在检测和治疗中的应用。

本发明的另一目的在于提供上述抗PD-L1抗体的制备方法，所制得的抗PD-L1抗体效价高，特异性好。

本发明的另一目的在于提供一种检测PD-L1蛋白的试剂盒。

本发明的另一目的在于提供一种药物。

本发明是这样实现的：

一种抗PD-L1抗体，其含有重链可变区和轻链可变区，其中，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

一种抗PD-L1的抗体片段，所述抗体片段是由上述的抗PD-L1 抗体的抗体片段形成的Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、双抗体、线性抗体、单链抗体分子或多特异性抗体。

上述的抗PD-L1抗体或上述的抗PD-L1的抗体片段在检测生物样品中PD-L1蛋白中的应用。

上述的抗PD-L1抗体或上述的抗PD-L1的抗体片段在制备用于治疗肿瘤、自身免疫性疾病或慢性感染性疾病的药物中的应用。

上述的抗PD-L1抗体的制备方法，其包括：用氨基酸序列如SEQ ID No.2中的第29-290位所示的抗原肽免疫动物。

一种检测PD-L1蛋白的试剂盒，其含有上述的抗PD-L1抗体或上述的抗PD-L1的抗体片段。

一种药物，其含有上述的抗PD-L1抗体或上述的抗PD-L1的抗体片段。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供的抗PD-L1抗体，其含有重链可变区和轻链可变区，其中，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。该抗PD-L1抗体可以特异性识别结合PD-L1重组蛋白、以及表达PD-L1分子的炎症组织细胞或肿瘤组织细胞，具有较高的特异性以及亲和力，可用于免疫印迹 (Western Blot)、酶联免疫吸附(ELISA)、免疫组织化学(IHC)以及流式细胞术(FACS)检测，也可以用于肿瘤、自身免疫性疾病和慢性感染性疾病等疾病的治疗。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例1提供的PD-L1重组蛋白纯化结果；

图2为本发明实施例5提供的鼠单克隆抗体3A7对重组PD-L1 蛋白的免疫印迹检测结果；

图3为本发明实施例6提供的鼠单克隆抗体3A7对A549(人肺癌细胞)细胞的免疫印迹检测结果。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明实施例的一种抗PD-L1抗体及应用、制备方法、试剂盒和药物进行具体说明。

本发明应用生物信息学分析，来自于Genebank中(GI:20070268) 核酸序列，编码的UniProt中Q9NZQ7的蛋白序列，基因合成PD-L1 蛋白的29位到290位氨基酸对应的核苷酸，克隆至表达载体质粒 pET41a中，进行低温可溶表达，超声破碎后，Ni2⁺亲和纯化作为免疫原，免疫Balb/c小鼠。经细胞融合、重组PD-L1的ELISA筛选，并测定亚类为IgG1型单克隆抗体，阳性克隆细胞注射小鼠腹腔诱导产生腹水，经过protein A/G亲和纯化，获得高效分泌单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞系，免疫印记(Western Blot)实验显示该抗体能特异识别重组的PD-L1蛋白以及表达PD-L1分子的肿瘤细胞系。

基于上述结果，一方面，本发明提供了抗PD-L1抗体，其含有重链可变区和轻链可变区，其中，所述重链可变区的氨基酸序列如 SEQ ID NO.5所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.6 所示。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体由小鼠杂交瘤细胞系3A7分泌得到。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述小鼠杂交瘤细胞系 3A7由抗原肽免疫小鼠得到的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合得到，所述抗原肽的氨基酸序列如SEQ IDNo.2中的第29-290位所示。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述抗PD-L1抗体为小鼠IgG1亚型单克隆抗体。

本发明提供的抗PD-L1抗体可以特异性识别结合PD-L1重组蛋白、以及表达PD-L1分子的炎症组织细胞或肿瘤组织细胞，具有较高的特异性以及亲和力，可用于免疫印迹(Western Blot)、酶联免疫吸附(ELISA)、免疫组织化学(IHC)以及流式细胞术(FACS)检测，也可以用于肿瘤(例如淋巴瘤、绒毛膜癌、黑色素瘤、食管癌)、自身免疫性疾病和慢性感染性疾病等疾病的治疗。

另一方面，本发明提供了一种抗PD-L1的抗体片段，所述抗体片段是由上述的抗PD-L1抗体的抗体片段形成的Fab片段、Fab'片段、 F(ab')2片段、Fv片段、双抗体、线性抗体、单链抗体分子或多特异性抗体。

另一方面，本发明提供了上述抗PD-L1抗体或上述的抗PD-L1 的抗体片段在检测生物样品中PD-L1蛋白中的应用。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述生物样品为肿瘤组织或细胞；或者，所述生物样品为炎症组织或细胞。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，肿瘤组织或细胞选自淋巴瘤、绒毛膜癌、黑色素瘤、食管癌、乳腺癌、胃癌、肾癌等癌症组织或细胞。

另一方面，本发明提供了上述抗PD-L1抗体或上述的抗PD-L1 的抗体片段在制备用于治疗肿瘤、自身免疫性疾病或慢性感染性疾病的药物中的应用。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述肿瘤选自淋巴瘤、绒毛膜癌、黑色素瘤、食管癌、乳腺癌、胃癌、肾癌等癌症。

另一方面，本发明提供了上述抗PD-L1抗体的制备方法，其包括：用氨基酸序列如SEQ ID No.2中的第29-290位所示的抗原肽免疫动物。

本发明通过生物信息学分析显示PD-L1的29-290位抗原性好，含有B细胞表位，以PD-L1的29-290区为重组蛋白(抗原肽)免疫小鼠，制备鼠单克隆抗PD-L1抗体，得到的抗PD-L1抗体可以识别 PD-L1且具有较好的特异性。

当然，需要说明的是，也可以选用其他动物例如兔、大鼠、猪等哺乳动物进行免疫制备抗体。

进一步地，本发明的一些实施方案中，在免疫前，该制备方法还包括：将含有可编码上述抗原的经过密码子优化的核苷酸序列的表达载体转化大肠杆菌，经表达纯化得到免疫蛋白，将该免疫蛋白作为抗原肽免疫动物。

其中，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其编码得到的蛋白包括有PD-L1分子的第29-290位片段蛋白，该核苷酸序列易于大肠杆菌可溶表达。

进一步地，本发明的一些实施方案中，在免疫后，该制备方法还包括：取免疫后的动物例如小鼠的脾脏细胞，将其与小鼠骨髓瘤细胞融合，获得可分泌抗PD-L1抗体的小鼠杂交瘤细胞系3A7，培养该杂交瘤细胞系3A7，获得抗PD-L1抗体。

另一方面，本发明提供了一种检测PD-L1蛋白的试剂盒，其含有上述的抗PD-L1抗体或上述的抗PD-L1的抗体片段。

本发明提供的试剂盒可通过免疫印迹(Western Blot)、酶联免疫吸附(ELISA)、免疫组织化学(IHC)以及流式细胞术(FACS)检测样品中PD-L1蛋白情况，具有较好的特异性。

另一方面，本发明提供了药物，其上述的抗PD-L1抗体或上述的抗PD-L1的抗体片段，以及医药学上可接受的载体。

本发明提供的药物可以用于治疗PD-L1过表达的疾病例如淋巴瘤、绒毛膜癌、黑色素瘤、食管癌、乳腺癌、胃癌、肾癌等癌症或是慢性病毒感染性疾病。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

PD-L1重组蛋白表达质粒的构建

PD-L1单克隆按照Genebank中(GI:20070268)核酸序列，编码的Q9NZQ7的蛋白序列，采用基因合成的方式合成PD-L1蛋白(SEQ ID NO.2)第29位到290位氨基酸序列对应的DNA序列((SEQ ID NO.1)，引入酶切位点EcoR I和Xho I，克隆到表达载体pET41a (Novagen公司)上，进行测序分析，选取测序正确的克隆进行蛋白表达纯化。

实施例2

PD-L1重组蛋白表达和纯化

将含有PD-L1正确序列的质粒的大肠杆菌培养至OD₆₀₀为0.5，加入10μmol/L的IPTG，16℃过夜培养，收菌后超声破碎，进行Ni2⁺亲和纯化。并进行12％SDS-PAGE检测，考马斯亮蓝染色，结果如图1所示，重组PD-L1蛋白分子量约为57kDa，

图1结果(图中：marker为分子量标记)显示在55KD的位置附件有条带，说明本实施例得到PD-L1重组蛋白表达正确。

实施例3

1.动物免疫

取7周龄雌性Balb/c小鼠用实施例2中纯化的重组蛋白进行腹部皮下多位点免疫注射。初次免疫，使用弗氏完全佐剂，免疫剂量为 100μg/只。每3周加强免疫一次，连续加强3次，使用弗氏不完全佐剂，免疫剂量为100μg/只。第四次免疫日开始眼眶采血，每周一次，连续采血4次，分离血清，采用间接ELISA法进行血清效价检测。选取效价最高的小鼠进行肌肉注射冲击免疫，剂量为100μg/只。

2.细胞融合

在无菌条件下，取冲击免疫3天以后的小鼠脾脏，于平皿中用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数，细胞数为1×10⁸，同时制备腹腔悬液(巨噬细胞)作为饲养细胞备用。将以上脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0(购自ATCC)以10:1比例混合，离心1500rpm，5min，弃上清。在60s加入1ml的PEG1500(Sigma公司)，37℃静置60s后，加入10ml的DMEM(Hyclone公司)，离心1000rpm，5min，弃上清。加入10ml血清(Gibco公司)、5ml混合10×HAT(Gibco公司)的胸腺细胞和含有羧甲基纤维素(终浓度1.3％)的半固体培养基充分混匀，然后均匀的倒入细胞培养皿中。将细胞培养皿放入到湿盒中，放入37℃5％CO₂培养箱中培养。

3.单克隆细胞株鉴定

3.1ELISA筛选

融合后10天克隆细胞团清晰可见，将克隆团置于事先准备好含有15％血清培养基的96孔培养板中，于37℃、5％CO₂培养箱中培养。 3天后换液。2天后，取100μl上清，使用重组蛋白进行间接ELISA 检测抗原和抗体特异性反应能力，并将阳性克隆转入24孔板培养。3天后再次进行间接ELISA检测，然后转入6孔板进行扩大培养。

3.2亚类鉴定

根据亚类测定试剂(sigma公司)对间接ELISA筛选出的阳性鼠单克隆细胞株进行亚类测定。结果显示，本发明的单克隆抗体为IgG1 型鼠单克隆抗体，编号3A7，命名为小鼠杂交瘤细胞系3A7。使用冻存液(10％DMSO、20％血清、70％DMEM)进行冻存。

4单克隆抗体的获得

4.1细胞复苏和扩大培养

从液氮中取出3A7细胞冻存管，于37℃快速融解，1000rpm， 5min离心去除冻存液，于37℃、5％CO₂培养至对数生长期，期间注意观察细胞状态。

4.2腹水制备

小鼠腹腔诱生腹水法：注射降植烷致敏小鼠，使用0.01M PBS 洗涤并悬起对数生长期细胞，计数1×10⁶个细胞/ml，注射入腹腔。观察小鼠状态，8天后收集腹水。脊椎脱臼法处死腹部隆起的小鼠，用75％酒精浸泡消毒，用手术剪刀剪开腹部上皮，剪开腹膜，将注射器插入吸取腹水，3000rpm，10min离心，于-20℃保存。

4.3单克隆抗体的纯化

用Protein A/G(GE公司)亲和层析法按说明书从腹水中纯化抗体，得到鼠单克隆抗体3A7即抗PD-L1抗体。SDS-PAGE胶考马斯亮蓝染色鉴定纯度，BCA法测定浓度。

实施例4

单克隆抗体可变区序列测定

1.总RNA的获取

从液氮中取出3A7杂交瘤细胞细胞冻存管，于37℃快速融解， 1000rpm，5min离心去除冻存液，置于100mm孔板，培养至占培养板约80％，加入1ml Trizol试剂(Thermo公司)，并依据说明书提取杂交瘤细胞总RNA。

2.cDNA第一链的获取

取2.5μg上述总RNA，加入DECP水，使体积达到11μl，加入1.0μL oligo(dT)(10μM)，加入1μL dNTPs(10mM)，混合均匀， 65℃孵育5分钟后置冰上1分钟，然后加入4μL RTbuffer(5×)， 1.0μL DTT(100m M)，1μL Ribonuclease Inhibitor及1μL逆转录酶(takara公司)，50℃反应10min。80℃孵育10分钟以终止反应，获得的cDNA保存在-20℃。

3基因扩增

取上述2μLcDNA进行PCR扩增，5μL 10×PCR缓冲液，1μ L dNTPs(10mM)，2μL MgSO4(50mM)，1μL上游引物，1μL 下游引物，0.2μL Taq DNA聚合酶，DECP水定容至50μL。PCR 扩增程序为94℃，5min；30个循环(94℃，30s；55℃，40s；68℃， 40s)；72℃，10min。扩增出的片段进行测序。

其中，物序列的设计按照文献(Bodo Brocks. Species-Crossreactive scFvAgainst the Tumor Stroma Marker “Fibroblast Activation Protein”Selected byPhage Display From an Immunized FAP-/-Knock-Out Mouse)进行。用于扩增重链可变区的引物如表1所示，其中MHV.B1直至MHV.B12的12条引物为上游引物，可分别与重链下游引物MHC.F组合用于扩增重链可变区基因。用于扩增轻链可变区的引物如表1下，其中MKV.B1直至MKV.B10 的10条引物为上游引物，可分别与轻链下游引物组合用于扩增Kappa 轻链的可变区基因。

表1引物序列

引物名称	核苷酸序列
		MHV.B1	5’-GATGTGAAGCTTCAGGAGTC-3’
MHV.B2	5’-CAGGTGCAGCTGAAGGAGTC-3’
		MHV.B3	5’-CAGGTGCAGCTGAAGCAGTC-3’
MHV.B4	5’-CAGGTTACTCTGAAAGAGTC-3’
		MHV.B5	5’-GAGGTCCAGCTGCAACAATCT-3’
MHV.B6	5’-GAGGTCCAGCTGCAGCAGC-3’
		MHV.B7	5’-CAGGTCCAACTGCAGCAGCCT-3’
MHV.B8	5’-GAGGTGAAGCTGGTGGAGTC-3’
		MHV.B9	5’-GAGGTGAAGCTGGTGGAATC-3’
MHV.B10	5’-GATGTGAACTTGGAAGTGTC-3’
		MHV.B11	5’-GAGGTCCAGCTGCAACAGTC-3’
MHV.B12	5’-GAGGTGCAGCTGGAGGAGTC-3’
		MHC.F	5’-GCCAGTGGATAGTCAGATGGGGGTGTCGTTTTGGC-3’
MKV.B1	5’-GATGTTTTGATGACCCAAACT-3’
		MKV.B2	5’-GATATTGTGATGACGCAGGCT-3’
MKV.B3	5’-GATATTGTGATAACCCAG-3’
		MKV.B4	5’-GACATTGTGCTGACCCAATCT-3’
MKV.B5	5’-GACATTGTGATGACCCAGTCT-3’
		MKV.B6	5’-GATATTGTGCTAACTCAGTCT-3’
MKV.B7	5’-GATATCCAGATGACACAGACT-3’
		MKV.B8	5’-GACATCCAGCTGACTCAGTCT-3’
MKV.B9	5’-CAAATTGTTCTCACCCAGTCT-3’
		MKV.B10	5’-GACATTCTGATGACCCAGTCT-3’
MKC.F	5’-GGATACAGTTGGTGCAGCATC-3’

测序结果显示，鼠杂交瘤细胞株3A7分泌的单克隆抗体3A7的重链和轻链可变区的DNA序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4 所示，其对应的重链和轻链的可变区氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5 和SEQ ID NO.6所示。

实施例5

鼠单克隆抗体3A7对重组PD-L1蛋白特异性反应

选择PD-L1重组蛋白，用免疫印迹法检测本发明实施例3的单克隆抗体的识别特异性，蛋白上样5ng，进行10％聚丙烯酰胺凝胶电泳，使用电转移系统(湿转，Tanon公司)将凝胶蛋白带转移到0.45 μm的PVDF膜上(Millipore公司)。将膜置于封闭液(含1％BSA 的TBS-T)中4℃过夜。加入单克隆抗体3A7，室温孵育1h。用TBS-T 洗膜后，加入1：10000稀释的羊抗鼠二抗(HRP标记，北京全式金生物技术有限公司)，室温孵育0.5h。TBS-T洗膜，加入ECL显色液 (Thermo公司)，Western Blot凝胶成像分析系统(Tanon公司)采集图像数据。

结果如图2所示(图中：marker为分子量标记，3A7代表鼠单克隆抗体3A7)，鼠单克隆抗体3A7可特异性识别重组PD-L1蛋白，分子量大小约为57kD的条带，具有很高的特异性。

实施例6

鼠单克隆抗体3A7对表达PD-L1蛋白的A549细胞系特异性反应

选择A549细胞系，用免疫印迹法检测本发明的鼠单克隆抗体的识别特异性。蛋白上样100μg，进行12％聚丙烯酰胺凝胶电泳，使用电转移系统(湿转，Tanon公司)将凝胶蛋白带转移到0.22μm的 PVDF膜上(Millipore公司)。将膜置于封闭液(含1％BSA的TBS-T) 中4℃12h。加入单克隆抗体3A7，4℃孵育12h。用TBS-T洗膜后，加入1：10000稀释的羊抗鼠二抗(HRP标记，北京全式金生物技术有限公司)，室温孵育1h。TBS-T洗膜，加入ECL显色液(Thermo 公司)，Western Blot凝胶成像分析系统(Tanon公司)采集图像数据。

结果图3所示(图中：marker为分子量标记，3A7代表鼠单克隆抗体3A7)，鼠单克隆抗体3A7可特异性识别A549中分子量大小约为31kDa的条带，具有很高的特异性。

综上，本发明提供的抗PD-L1抗体(即上述的鼠单克隆抗体 3A7)，其含有重链可变区和轻链可变区，其中，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。该抗PD-L1抗体可以特异性识别结合PD-L1重组蛋白、以及表达PD-L1分子的炎症组织细胞或肿瘤组织细胞，具有较高的特异性以及亲和力，可用于免疫印迹(Western Blot)、酶联免疫吸附 (ELISA)、免疫组织化学(IHC)以及流式细胞术(FACS)检测，也可以用于肿瘤、自身免疫性疾病和慢性感染性疾病等疾病的治疗。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 联合益康（北京）生物科技有限公司

<120> 一种抗PD-L1抗体及应用、制备方法、试剂盒和药物

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 873

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgaggatat ttgctgtctt tatattcatg acctactggc atttgctgaa cgcatttact 60

gtcacggttc ccaaggacct atatgtggta gagtatggta gcaatatgac aattgaatgc 120

aaattcccag tagaaaaaca attagacctg gctgcactaa ttgtctattg ggaaatggag 180

gataagaaca ttattcaatt tgtgcatgga gaggaagacc tgaaggttca gcatagtagc 240

tacagacaga gggcccggct gttgaaggac cagctctccc tgggaaatgc tgcacttcag 300

atcacagatg tgaaattgca ggatgcaggg gtgtaccgct gcatgatcag ctatggtggt 360

gccgactaca agcgaattac tgtgaaagtc aatgccccat acaacaaaat caaccaaaga 420

attttggttg tggatccagt cacctctgaa catgaactga catgtcaggc tgagggctac 480

cccaaggccg aagtcatctg gacaagcagt gaccatcaag tcctgagtgg taagaccacc 540

accaccaatt ccaagagaga ggagaagctt ttcaatgtga ccagcacact gagaatcaac 600

acaacaacta atgagatttt ctactgcact tttaggagat tagatcctga ggaaaaccat 660

acagctgaat tggtcatccc agaactacct ctggcacatc ctccaaatga aaggactcac 720

ttggtaattc tgggagccat cttattatgc cttggtgtag cactgacatt catcttccgt 780

ttaagaaaag ggagaatgat ggatgtgaaa aaatgtggca tccaagatac aaactcaaag 840

aagcaaagtg atacacattt ggaggagacg taa 873

<210> 2

<211> 290

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Arg Ile Phe Ala Val Phe Ile Phe Met Thr Tyr Trp His Leu Leu

1 5 10 15

Asn Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr

20 25 30

Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu

35 40 45

Asp Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile

50 55 60

Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser

65 70 75 80

Tyr Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn

85 90 95

Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr

100 105 110

Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val

115 120 125

Lys Val Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val

130 135 140

Asp Pro Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr

145 150 155 160

Pro Lys Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser

165 170 175

Gly Lys Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn

180 185 190

Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr

195 200 205

Cys Thr Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu

210 215 220

Val Ile Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr His

225 230 235 240

Leu Val Ile Leu Gly Ala Ile Leu Leu Cys Leu Gly Val Ala Leu Thr

245 250 255

Phe Ile Phe Arg Leu Arg Lys Gly Arg Met Met Asp Val Lys Lys Cys

260 265 270

Gly Ile Gln Asp Thr Asn Ser Lys Lys Gln Ser Asp Thr His Leu Glu

275 280 285

Glu Thr

290

<210> 3

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ctgcagcagt ctggggctga gctggtgaag cctggggctt cagtgaagat ttcctgcaag 60

gcttctggct acaccttcac tagctattct atgcactgga tcaggcagtg gcctggaaag 120

aggctggaat ggatcggagc tattaaacca agctatagtg gttattcaat acatttagcg 180

gtttgtgtga aagggagggc caccatgaca agagacaaat ccaaaagtag tgtctacatg 240

caaatgaaca gtttgacatc tgaggattct gccgtctatt actgtgcaag gtcggactac 300

tggggccaag gcaccactct cacagtctcc tca 333

<210> 4

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gatatcgtgc tcactcaatc tccagctctc cctgctgtca gtcctggaga tcaagtcact 60

ttttcttgca ggtctagtca gagccttaac acctatttac attggtacct cgagaagcca 120

ggccagtctc ctaatctcct tatctacaaa gtttccaacc tgttttctgg aattccagac 180

aggttcagtg gcagtggatc tggtacagat ttcactctca agatcagtag agtggaggct 240

gaagatcttg gaatatatta ctgtctcaag ctacataatt atccttggac gttcggtgga 300

ggcaccaagc tggaaatcaa a 321

<210> 5

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Met Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys

1 5 10 15

Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Ser Met His

20 25 30

Trp Ile Arg Gln Trp Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile

35 40 45

Lys Pro Ser Tyr Ser Gly Tyr Ser Ile His Leu Ala Val Cys Val Lys

50 55 60

Gly Arg Ala Thr Met Thr Arg Asp Lys Ser Lys Ser Ser Val Tyr Met

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ser Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

100 105 110

<210> 6

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Pro Ala Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Asp Gln Val Thr Phe Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Asn Thr Tyr

20 25 30

Leu His Trp Tyr Leu Glu Lys Pro Gly Gln Ser Pro Asn Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Lys Val Ser Asn Leu Phe Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Lys Leu His Asn Tyr Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

Claims (10)

1.一种抗PD-L1抗体，其特征在于，其含有重链可变区和轻链可变区，其中，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

2.根据权利要求1所述的抗PD-L1抗体，其特征在于，所述抗PD-L1抗体由小鼠杂交瘤细胞系3A7分泌得到。

3.根据权利要求2所述的抗PD-L1抗体，其特征在于，所述小鼠杂交瘤细胞系3A7由抗原肽免疫小鼠得到的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合得到，所述抗原肽的氨基酸序列如SEQID NO.2中的第29-290位所示。

4.一种抗PD-L1的抗体片段，其特征在于，所述抗体片段是由权利要求1-3任一项所述的抗PD-L1抗体的抗体片段形成的Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、双抗体、线性抗体、单链抗体分子或多特异性抗体。

5.权利要求1-3任一项所述的抗PD-L1抗体或权利要求4所述的抗PD-L1的抗体片段在检测生物样品中PD-L1蛋白中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述生物样品为肿瘤组织或细胞；或者，所述生物样品为炎症组织或细胞。

7.权利要求1-3任一项所述的抗PD-L1抗体或权利要求4所述的抗PD-L1的抗体片段在制备用于治疗肿瘤、自身免疫性疾病或慢性感染性疾病的药物中的应用。

8.如权利要求1所述的抗PD-L1抗体的制备方法，其特征在于，其包括：用氨基酸序列如SEQ ID No.2中的第29-290位所示的抗原肽免疫动物。

9.一种检测PD-L1蛋白的试剂盒，其特征在于，其含有权利要求1-3任一项所述的抗PD-L1抗体或权利要求4所述的抗PD-L1的抗体片段。

10.一种药物，其特征在于，其含有权利要求1-3任一项所述的抗PD-L1抗体或权利要求4所述的抗PD-L1的抗体片段，以及医药学上可接受的载体。