CN100355882C - 杂交瘤细胞株及其产生的抗人vegfr－3的单克隆抗体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了杂交瘤细胞株BDD073 CGMCC No.1537及其产生的抗人VEGFR-3的单克隆抗体。该单克隆抗体的重链可变区具有序列表中的SEQ ID №：1的氨基酸残基序列或将序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有抗人VEGFR-3中和活性的多肽；轻链可变区具有序列表中的SEQID №：2的氨基酸残基序列或将序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有抗人VEGFR-3中和活性的多肽。本发明不仅为进一步研究VEGFR-3的生物学功能及其作用机理奠定了基础，而且在制备抑制肿瘤淋巴转移和抗血管生成的治疗性药物中具有潜在的应用前景。

Description

杂交瘤细胞株及其产生的抗人VEGFR-3的单克隆抗体

技术领域

本发明涉及杂交瘤细胞株及其产生的抗人VEGFR-3的单克隆抗体。

背景技术

肿瘤转移通常是人类癌症致死的主要原因之一。目前认为肿瘤转移的通路主要通过以下三种方式：第一，肿瘤细胞浸润血管，直接进入血道形成转移灶；第二，通过侵入已存在的淋巴管进入淋巴循环系统，进而通过淋巴-血循环转移到新的组织中形成转移灶；第三，肿瘤细胞从实体瘤上脱落，直接种植到周边组织形成转移。其中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGFs)家族及其受体血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFRs)信号系统在肿瘤血管发生和增生以及淋巴管增生过程中发挥了重要作用。目前已经发现5种VEGFs：VEGF-A，B，C，D和胎盘生长因子(placenta growth factor，PIGF)，这些VEGFs能直接选择性的与膜上的三种受体(VEGFR-1(Flt1)，VEGFR-2(KDR)和VEGFR-3(Flt4))中的一种或两种作用，促进血管内皮细胞增殖或介导淋巴管的增生(Akagi K，Ikeda Y，Miyazaki M，et al.Vascular endothelial growth factor-C(VEGF-C)expression in human colorectal cancer tissues[J].Br J Cancer，2000，83：887-891.)。VEGF-A和VEGF-B能与VEGFR-1，VEGFR-2结合，刺激血管内皮增生并增加血管通透性，在血管发生(vasculogenesis)和血管生成(angiogenesis)过程中起重要作用(Niki T，Iba S，Tokunou M，et al.Expression of vascularendothelial growth factors A，B，C，and D and their relationships to lymphnode status in lung adenocarcinoma[J].Clin Cancer Res，2000，6：2431-2439.)；VEGF-C和VEGF-D是近年发现的与淋巴增生相关的因子，VEGF-C与VEGFR-2和VEGFR-3作用促进肿瘤淋巴发生和转移(Salven P，Lymboussaki A，Heikkila P，et al.Vascular endothelial growth factors VEGF-B and VEGF-C are expressed in humantumors[J].Am j Pathol，1998，153(1)：103-108.)；与VEGF-C不同，VEGF-D与VEGFR-3和VEGFR-2结合，不仅促进淋巴管的生成而且促进血管的增生(Kurahara H.，Takao S.，Maemura K.，et al.Impact of Vascular Endothelial Growth Factor-Cand-D Expression in human pancreatic cancer[J].Clinical Cancer Res，2004，10：8413-8420.)。

淋巴转移是肿瘤特别是癌的常见转移途径，循淋巴道转移的肿瘤以癌多见，尤其是胃、胰、肺、乳腺、结肠、鼻咽等部位的癌。淋巴结的肿瘤转移多形成由近到远的逐站发展，即“瀑布式”转移，可呈“跳跃式”或“逆行式”转移，危害性极大。近年来人们对VEGF-C/D在人肿瘤中的表达及其与肿瘤转移之间的关系进行了大量的研究。临床检测表明，原发性肿瘤中VEGF-C/D的表达上调与前列腺癌、结肠癌、胃癌、肺癌等许多肿瘤的淋巴结转移相关(Stearns M.E.，Wang M.，Hu Y.，et al.Expression of a Flt-4(VEGFR3)Splicing Variant in Primary Human ProstateTumors.VEGF D and Flt-4t(Delta773-1081)overexpression is Diagnostic forsentinel lymph node metastasis[J].Lab Invest，2004，84：785-795.)。Salven等在检测的35例人肿瘤标本中，19例检测出VEGF-C，其中淋巴瘤都有VEGF-C的表达，头颈鳞癌、恶性黑色素瘤、肉瘤、乳腺癌原发灶也有表达，转移灶3例标本中1例有VEGF-C的表达(Salven P，Lymboussaki A，Heikkila P，et al. Vascularendothelial growth factors VEGF-B and VEGF-C are expressed in human tumors[J].Am j Pathol，1998，153(1)：103-108.)。在对多种人肿瘤组织的研究中发现，VEGF-C表达与淋巴管转移呈正相关性(Kitadai Y，Amioka T，Haruma K，et al.Clinicopathological Significance of vascular endothelial growth factor(VEGF)-C in human esophageal squamous cel carcinomas[J].Int J Cancer，2001，93(5)：662-666.)。在人胰腺癌的肿瘤细胞表达VEGF-C和VEGF-D，并与淋巴转移和患者的预后密切相关(Kurahara H.，Takao S.，Maemura K.，et al.Impact ofVascular Endothelial Growth Factor-C and-D Expression in human pancreaticcancer[J].Clinical Cancer Res，2004，10：8413-8420.)。Stearns等检测了52例T2a-T2b/T3期肿瘤相对应的前哨淋巴结的基因表达情况，结果在有前哨淋巴结参与的原发性肿瘤中，VEGF-D和Flt-4tΔ_773-1081表达水平显著提高，表明针对VEGF-D或Flt-4tΔ_773-1081受体的抑制可能对阻断肿瘤淋巴结转移具有重要的作用(Stearns M.E.，Wang M.，Hu Y.，et al.Expression of a Flt-4(VEGFR3)Splicing Variant inPrimary Human Prostate Tumors.VEGF D and Flt-4t(Delta773-1081)overexpression is Diagnostic for sentinel lymph node metastasis[J].LabInvest，2004，84：785-795.)。

动物模型的研究则为肿瘤淋巴转移时淋巴管生成的重要性提供了有力的支持。Mandriota等利用Rip-VEGF-C(Rip为大鼠胰岛素启动子)转基因小鼠研究了VEGF-C对肿瘤淋巴管生成的影响(Mandriota SJ，Jussila L，Jeltsch M，et al.Vascularendothelial growth factor-c-mediated lymphangiogenesis promotes tumormetastasis[J].EMBOJ，2001，20(4)，672-682.)。处于Rip调控下的VEGF-C定向表达在内分泌胰腺的p-细胞中，结果在转基因小鼠的朗格汉斯结周围形成广泛的淋巴管网络(以LYVE-1为特异性标记)。而在同样的条件下，Ripl Tag2小鼠(带有胰腺癌基因的转基因小鼠)形成的胰腺β-细胞癌并无淋巴管生成，也不发生转移。当Rip-VEGF-C与RiplTag2小鼠杂交后繁殖的双转基因小鼠，则在肿瘤周围形成丰富的淋巴管，胰腺淋巴结转移的频率也随之增加。更重要的是，在同一模型中，VEGF-A的过量表达可以促进血管和肿瘤的形成，但并无淋巴管的生成，也没有发生淋巴结转移(Gannon G，Mandriota SJ，Cui L，et al.Overexpression of vascular endothelialgrowth factor-A165 enhances tumor angiogenesis but not metastasis duringbeta-cell carcinogenesis[J].Cancer Res，2002，62：603-608.)。Skobe等通过在小鼠体内接种VEGF-C过表达的MDA-MB-435肿瘤细胞来研究实体瘤内的血管生成与淋巴管生成，结果发现VEGF-C可以诱导肿瘤组织周围的淋巴管扩张和肿瘤内部形成新生淋巴管(Skobe M，Hawighorst T，Jackson D，et al.Velasco P，et al.Induction of tumour lymphangiogenesis by VEGF-C promotes breast cancermetastasis[J].Nat Med，200lb，7：192-198.)。Karpanen等将乳腺癌MCF-7细胞植入到SCID小鼠中，结果显示VEGF-C可以促进肿瘤相关淋巴管的生成(Karpanen T，Egeblad M，Marika I，et al.Vascular endothelial growth factor C promotes tumorlymphangiogenesis and intralymphatic tumor growth[J].Cancer Res，2001，61(5)：1786-1790.)。而使用可溶性VEGFR-3/Ig可以抑制淋巴管的新生，表明阻断VEGFR-3信号通路可能是抑制肿瘤淋巴转移的途径之一。Stacker等用293-EBNA异种移植模型也证实了VEGF-D在肿瘤的淋巴转移中起到了重要的作用(Stacker S，CaesarC，Baldwin M，et al.VEGF-D promotes the metastatic spread of tumour cellsvia the lymphatics[J].Nat Med，2001，7：186-191.)。与Gannon的研究相似，VEGF-A的过量表达促进了血管和肿瘤的形成，但对淋巴管的生成和淋巴结转移却无影响。

至今为止，国内外对抑制恶性肿瘤淋巴转移的研究主要集中在阻断VEGF-C/D与VEGFR-3的结合进而抑制其肿瘤的淋巴结转移。常用的阻断途径主要有两种：1.应用可溶性的VEGFR-3与其配体竞争性的结合来达到目的。应用过量表达VEGFR-3/Ig的LNM35(人肺癌细胞系，有高转移表现型和高水平的内源性VEGF-C表达)细胞，在免疫缺陷小鼠模型中能够抑制肿瘤的淋巴管生成和肿瘤淋巴结转移。在免疫功能健全的同基因系乳腺肿瘤小鼠模型中使用相同的方法，同样也获得了抑制淋巴结转移的作用(He Y，Kozaki K，Karpanen T，et al.Suppression of tumor lymphangiogenesisand lymph node metastasis by blocking vascular endothelial growth factorreceptor 3 signaling[J].J Natl Cancer Inst，2002，94：819-825.)。2.应用中和活性的抗体抑制VEGFR-3的信号通路。Shimizu等研究发现肿瘤细胞过量分泌VEGF-C/VEGF-D可诱导肿瘤组织内或边缘新生淋巴管的形成，应用VEGF-C/VEGF-D阻断性的抗体则可抑制肿瘤的淋巴转移(Shimizu，K.，Hajime Kubo，Koji Yamaguchi，et al.Suppression of VEGFR-3 signaling inhibits lymph node metastasis ingastric cancer[J].Cancer Sci，2004，95：328-333.)。Pytowski等应用抗小鼠VEGFR-3中和性抗体在过表达VEGF-C的乳腺癌中可阻断淋巴管的增生。同时长时间的阻断VEGFR-3信号通路对已形成的淋巴血管在形态上并无影响(Pytowski B，GoldmanJ，Persaud K，et al.Complete and specific inhibition of adult lymphaticregeneration by a novel VEGFR-3 neutralizing antibody[J].J Natl Cancer Inst，2005，97：14-21.)。这为以阻断VEGFR-3作用来作为一种抗肿瘤淋巴转移的方法提供了强有力的支持。

目前所做的研究均局限在应用抗小鼠VEGFR-3单克隆抗体抑制肿瘤淋巴转移的方面。未见有抗人VEGFR-3中和活性抗体的动物模型的报道。同时国内也未见有关抗人VEGFR-3抗体的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一株可产生抗人VEGFR-3单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

本发明所提供的可产生抗人VEGFR-3单克隆抗体的杂交瘤细胞株，名称为BDD073，该细胞株已于2005年11月25日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.1537。

由上述杂交瘤细胞株BDD073产生的抗人VEGFR-3的单克隆抗体，名称为ABDD073，来源于小鼠属小鼠(Mus musculus)，其重链可变区具有序列表中的SEQ ID №：1的氨基酸残基序列；轻链可变区具有序列表中的SEQ ID №：2的氨基酸残基序列。

序列表中的SEQ ID №：1由117个氨基酸残基组成，序列表中的SEQ ID №：2由132个氨基酸残基组成。

编码抗人VEGFR-3单克隆抗体ABDD073的基因(ABDD073)，其重链可变区编码基因具有序列表中SEQ ID №：3的DNA序列或编码序列表中SEQ ID №：1的DNA序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；轻链可变区编码基因具有序列表中SEQ ID №：4的DNA序列或编码序列表中SEQ ID №：2的DNA序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：4限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

序列表中的SEQ ID №：3由351个碱基组成，其编码序列为自5’端第1至351位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列的蛋白质。序列表中的SEQ ID №：4由396个碱基组成，其编码序列为自5’端第1至396位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列的蛋白质。

含有本发明基因ABDD073的表达载体、转基因细胞系和宿主菌均属于本发明的保护范围。

扩增ABDD073中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

本发明还提供了衍生于抗人VEGFR-3单克隆抗体ABDD073的单链抗体，Fab抗体和人鼠嵌合抗体，以及编码这些衍生抗体的多核苷酸序列。

本发明提供了一种抗人VEGFR-3的单克隆抗体ABDD073。VEGFR-3是淋巴管特异性标志物之一，因此本发明的单克隆抗抗体可应用于肿瘤淋巴转移的诊断中。此外，ABDD073可以抑制VEGF-D与VEGFR-3结合，抑制人红白血细胞HEL的增殖，以及抑制由人VEGF-D诱导的鸡胚尿囊膜血管的生成。ABDD073通过抑制肿瘤淋巴管新生达到抑制肿瘤转移的功效，与传统的治疗性单抗相比，抗VEGFR-3单抗的具有广谱、低毒或无毒、低耐药性的优点，其原因在于：1)肿瘤血管或淋巴管内皮细胞突变少，不易产生耐药性；2)虽然不同类型的肿瘤特异性靶蛋白不同，但是其血管和淋巴管结构却大致相同，因此具有广谱性；3)直接作用于血管或淋巴内皮，无须穿透到肿瘤内部，避免了肿瘤内部高压及药物分布的问题。基于上述优点，可以ABDD073为活性成分制备成抗肿瘤转移药物。该抗体制备方法简单，可由杂交瘤细胞株BDD073 CGMCC No1537直接分泌产生。本发明不仅为进一步研究VEGFR-3的生物学功能及其作用机理奠定了基础，而且在制备抑制肿瘤淋巴转移和抗血管生成的治疗性药物中具有潜在的应用前景。

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

附图说明

图1为重组GST-VEGF-D和VEGFR-3/Fc的结合活性分析结果

图2为不同剂量GST-VEGF-D对HEL细胞增殖影响的实验结果

图3为具有中和活性的抗VEGFR-3单克隆抗体的筛选结果

图4为抗VEGFR-3单克隆抗体ABDD073的免疫印迹(Western blot)鉴定结果

图5为用免疫组织化学技术分析VEGFR-3单克隆抗体ABDD073在胎心、胎肾、胎肺中的组织定位结果

图6为流式细胞术鉴定ABDD073与HEL细胞表面表达的VEGFR-3结合活性的结果

图7为ABDD073阻断VEGFR-3与VEGF-D相互作用的体外实验结果

图8为抗VEGFR-3的单克隆抗体ABDD073抑制HEL细胞增殖的验证实验结果

图9为检测不同剂量的可溶性的GST-VEGF-D蛋白对鸡胚尿囊膜血管生成影响的实验结果

图10为不同剂量的抗VEGFR-3的单克隆抗体ABDD073对由GST-VEGF-D诱导生成的鸡胚尿囊膜血管的抑制实验结果

图11为PCR扩增的ABDD073的轻、重链可变区编码基因的琼脂糖凝胶电泳检测结果

图12为PCR扩增的抗VEGFR-3单链抗体VL-linker-VH编码基因的琼脂糖凝胶电泳检测结果

图13为诱导表达的抗VEGFR-3单链抗体VL-linker-VH的SDS-PAGE检测结果

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物合成及测序工作均由上海博亚生物技术有限公司完成。

实施例1、抗VEGFR-3单克隆抗体的制备及其鉴定

应用杂交瘤技术制备抗VEGFR-3的单克隆抗体，具体方法包括以下步骤：

一、杂交瘤细胞株的制备及初筛

用VEGFR-3/Ig重组蛋白(R&D research system corp.)作为免疫原对BALB/C小鼠进行3次免疫接种。接种部位为腹膜内注射或皮下注射，每次注射剂量50μg/mL。在最后一次免疫接种三天后，取脾脏，剪碎，将细胞悬浮于RPMI1640培养基(GIBCO，USA)中，然后在50％聚乙二醇(PEG)存在下，将脾细胞和SP2/0小鼠骨髓瘤细胞进行融合，并用HAT选择性培养基(RPMI 1640 197.5mL，HAT浓缩液(100×)2.5mL，胎牛血清50mL)对杂交瘤细胞进行初步筛选。

二、VEGFR-3阳性而正常人血清阴性的单克隆抗体的筛选

单克隆抗体的获得方法：对六周龄BALB/C小鼠腹腔注射石蜡油0.5mL/只。10天后，将步骤一经初筛获得的杂交瘤细胞悬液接种于BALB/C小鼠腹腔，1×10⁷个细胞/只。约10天后，收集腹水，离心取上清。通过蛋白A亲和层析，从培养上清或腹水中纯化单克隆抗体。将纯化的单克隆抗体进行无菌过滤，冷藏或冷冻保存。用HBT公司的抗体亚类检测试剂盒鉴定抗体的亚型。

用夹心酶联免疫吸附法筛选VEGFR-3阳性而正常人血清阴性的单克隆抗体，具体方法为：

1)纯化的重组VEGFR-3/Ig、正常人血清、正常人IgG(北京中杉金桥有限公司)分别包被微滴定条孔(strip wells)，用包被液(0.1M碳酸盐缓冲液(pH9.6))稀释至0.5μg/mL，每个微滴定条孔加入100μl，4℃孵育12-24小时(或在室温下孵育2小时)。

2)用洗涤液(0.2M磷酸盐缓冲液，0.02％吐温)在拓普洗板机上将上述包被孔洗涤三次后加入10％小牛血清(200μl/孔)进行封闭，4℃孵育12-24小时(或在室温下孵育2小时)。在拓普洗板机上洗涤三次后拍干备用。

3)向封闭后的每个微滴定条孔中加入100μl经初筛获得的杂交瘤细胞的培养上清，以脾切除小鼠的血清作为阳性对照(1∶1000稀释)。37℃孵育30分钟后用洗涤液洗三次。正常人血清(1∶4000)和正常人IgG(0.5μg/mL)的作用是除去分泌与正常人Ig结合抗体的杂交瘤细胞。

4)将按1∶5000比例稀释的羊抗鼠Ig-HRP抗体(Jackson corp.)加入到微滴定条孔中，37℃孵育20分钟后按上述方法洗涤所述条孔。

5)加入HRP酶底物反应液A和B(各80μl/孔，HRP酶底物反应液A：醋酸钠13.6g，柠檬酸1.6g，30％H₂O₂，定容至500mL。HRP酶底物反应液B：EDTA-Na 0.2g，柠檬酸0.95g，甘油50mL，四甲基联苯胺(TMB)0.2g，定容至500mL。)，将平板在37℃孵育15分钟后用2M的硫酸中止反应。用Mutiskan MK3(Thermo)酶标仪检测。检测结果大于正常鼠血清OD值2.5倍的为VEGFR-3/Ig阳性而正常人血清阴性的单克隆抗体。将阳性克隆在24孔组织培养板(FALCON)中扩增培养，并用上述相同的方法进行检测。最终获得17株分泌抗VEGFR-3单克隆抗体的杂交瘤细胞，它们产生的单克隆抗体特异结合VEGFR-3抗原而不结合人IgG，筛选得到的与VEGFR-3特异反应的单克隆抗体及其基本信息如表1所示。

表1  17株杂交瘤细胞产生的抗VEGFR-3单克隆抗体

Mab克隆	亚类	免疫印迹	IH(石蜡切片)		IH(冰冻切片)
							胎肾	胎肺	胎心	胎肾
			BAB045	IgG1	P	N					N	P	P
BDD092	IgG1	N					N	N	N	N
			BDF016	IgG1	N	N					N	N	N
BBE022	IgG1	N					N	N	N	N

BCE024	IgG1	N	N	N	N	N
							BBG047	IgG1	N	N	N	N	N
BCD062	IgG1	N	P	P	P	P
							BGB118	IgG1	N	N	N	N	N
BDD024	IgG1	N	N	N	N	N
							BDA076	IgG1	P	P	P	P	P
BCH102	IgG1	P	N	N	N	N
							BCF013	IgG1	N	N	N	P	P
ABDD073	IgG2a	P	P	P	P	P
							BAD045	IgG1	P	N	N	N	N
ABA112	IgG1	P	N	N	N	N
							AAD016	IgG1	P	N	N	N	N
AEH081	IgG1	P	N	N	N	N

三、具有中和活性的抗VEGFR-3单克隆抗体的筛选

1、重组人GST-VEGF-D的表达和鉴定

根据VEGF-D的VHD片段的编码序列(GenBank号为：NM657920)，设计引物PCR扩增该片段，引物序列如下：

P1(正向引物)：5’-CCCAAGCTTATGTTTGCGGCAACTTTCTATGACATTG-3’；

P2(反向引物)：5’-CCGGAATTCTCTTCTGATAATTGAGTATGGATGG-3’

从人胎肺组织中提取总RNA，反转录合成其cDNA，并以此为模板，在引物P1和P2的引导下，PCR扩增目的片段。PCR反应条件：94℃ 30s，58℃ 30s，72℃1min，共进行30个循环。反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收并纯化348bp的DNA片段，将其克隆入载体pGEX-5X-1(Amersham公司)中。将重组产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性重组子，提质粒，用限制性内切酶NotI和EcoRI进行双酶切鉴定，结果经酶切获得了348bp的酶切片段，与预期结果相符，表明目的片段已正确连入载体中。再用测序的方法对阳性质粒做进一步鉴定，测序结果表明插入片段序列正确，获得了VEGF-D基因的重组表的质粒，命名为pGEX-5x-1/VEGF-D。

将上述构建的重组表达质粒pGEX-5x-1/VEGF-D转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，筛选阳性转化子进行原核表达，对表达产物进行10％SDS-PAGE检测，获得了38KD的重组蛋白，与VEGF-D蛋白的分子量大小相符，用GST亲和层析柱(Amersham公司)对目的蛋白进行纯化。分析经纯化后的重组GST-VEGF-D进行下述分析：

1)重组GST-VEGF-D和VEGFR-3/Fc的结合活性分析

将浓度为1、2μg/mL的VEGFR-3/Fc(R&D research system corp.)与20μg/mL的GST-VEGF-D混合，以VEGFR-3/Fc纯品为对照，通过检测450nm处的OD值分析GST-VEGF-D与VEGFR-3/Fc的结合活性，结果如图1所示，表明重组人GST-VEGF-D可与VEGFR-3/Ig相互作用。

2)GST-VEGF-D促进HEL细胞增殖

以GST(将pGEX-5x-1载体转入BL21(DE3)感受态细胞，0.2mM IPTG诱导表达3h，超生破碎细菌，12000g离心取上清后使用Amersham公司GST预装纯化柱纯化)为对照，分别用0.8、1.6、3.2、6.4、12.8μg/mL的GST-VEGF-D对人红白血病(HEL)细胞进行处理，通过测定492nm处的OD值检测GST-VEGF-D对表达有VEGFR-3的HEL细胞生长的影响，结果如图2所示(结果为三次测定结果的平均值，*表示P＜0.01)，随着GST-VEGF-D浓度的升高，HEL细胞量也随之增加，而随着GST浓度的升高，HEL细胞量并没有明显变化，表明GST-VEGF-D在一定浓度范围内可以刺激HEL细胞的生长。

2、具有中和活性的抗VEGFR-3单克隆抗体的筛选

挑选步骤二筛选得到的与VEGFR-3特异反应的单克隆抗体(和产生这些抗体的杂交瘤)，用ELISA方法从中筛选具有中和活性的抗VEGFR-3单克隆抗体。具体方法为：用步骤1获得的经纯化的8μg/mL GST-VEGF-D包被96孔板，封闭，将VEGFR-3/IgG和GST-VEGF-D混合孵育1h后加入96孔板中孵育一小时，洗板后加入抗VEGF-D抗体(R&D research system corp.)，最后加二抗羊抗鼠IgG-HRP抗体(Jackson公司)显色，测定OD450值。反之用VEGFR-3/IgG包板进行检测。结果如图3所示，应用此体系成功筛选到具有中和活性的抗VEGFR-3单克隆抗体ABDD073。产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，名称为BDD073，已于2005年11月25日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.1537。

实施例2、具有中和活性的抗VEGFR-3的单克隆抗体ABDD073的鉴定

一、免疫印迹(Western blot)鉴定

对实施例1筛选的具有中和活性的抗VEGFR-3的单克隆抗体ABDD073进行Western免疫印迹分析。具体方法为：将10⁷个HEL细胞在RAPI(1％NP-40，0.15M NaCl，1×PBS PH7.2，2nM EDTA，50mM氟化钠，0.2mM钒酸钠，蛋白酶抑制剂1∶50)中裂解。将细胞裂解物进行10％SDS-PAGE电泳并电转到硝酸纤维素膜上。将此膜与抗VEGFR-3的单克隆抗体ABDD073一起孵育，用偶联辣根过氧化物酶的羊抗鼠抗血清(北京中杉金桥有限公司)和ECL试剂(Amersham)使结合的抗体显色，显色结果如图4所示(NM IgG表示正常属IgG)，在175kDa和125kDa处出现两条明显条带，对应于VEGFR-3多肽。

二、组织定位

利用冷冻组织切片、石蜡组织切片和免疫组化技术对VEGFR-3阳性脉管进行鉴定。具体方法为：将胎心，胎肾、胎肺组织样品切片在磷酸盐缓冲液中进行再水化，并与羊血清在室温下温育30分钟。然后将所述切片与浓度为1.0μg/mL的实施例1获得的ABDD073单克隆抗体在潮湿的空气中4℃孵育12-24小时，以抗VEGFR-3的不同抗原决定簇的其它单克隆抗体BDA076，BCD062，BAB045，BCF013为对照。随后用PV-9000试剂盒(北京中杉金桥有限公司)的试剂温育50分钟。用3，3-二氨基苯联胺(DAB，北京中杉金桥有限公司)使过氧化酶显色1分钟。最后，用苏木精将切片染色5分钟。通过省略第一抗体或用正常小鼠IgG作为阴性对照。结果如图5所示，表明ABDD073可以识别胎心，胎肾、胎肺组织的血管内皮。其它单克隆抗体BDA076，BCD062，BAB045，BCF013也可以识别胎心，胎肾、胎肺组织的血管内皮。

三、流式细胞术鉴定

采用FACS流式细胞仪分析ABDD073与HEL细胞表面表达的VEGFR-3的结合活性。具体方法为：分别将1×10⁶个HEL细胞与ABDD073、对照抗体共孵育1小时，用PBS洗三遍，加入FITC-羊抗鼠IgG抗体(北京中杉金桥有限公司)，孵育1小时，洗三遍后将细胞重悬于500μl PBS中。在FACS上进行免疫荧光分析并测定平均荧光密度，以PBS为阴性对照，结果如图6所示，表明ABDD073可与HEL表达的VEGFR-3特异结合而对照抗体无明显反应。

上述实验结果证明实施例1获得的具有中和活性的单克隆抗体ABDD073可特异识别VEGFR-3。

实例3、ABDD073阻断VEGFR-3与VEGF-D相互作用的体外实验

用实施例1中步骤三筛选具有中和活性的抗VEGFR-3的单克隆抗体所用的ELISA相互作用体系，考察ABDD073对VEGFR-3与VEGF-D相互作用的抑制活性。将抗体ABDD073、BAB045(对照)分别与VEGFR-3/Ig在37℃孵育1小时后，混合液加入已包被GST-VEGF-D(8μg/mL)的96孔酶联板中继续孵育1小时，PBST洗板三次；向其中加入抗VEGF-D单克隆抗体，37℃孵育30分钟后用洗涤液洗三次。将1∶5000稀释的羊抗鼠Ig-HRP抗体加入到微滴定条孔中，37℃孵育20分钟后按上述方法洗涤所述条孔。加入HRP酶底物反应液A和B(各80μl/孔)，将平板在37℃孵育15分钟后用2M的硫酸中止反应，用Mutiskan MK3(Thermo)酶标仪进行检测，检测结果如图7所示，表明ABDD073可抑制VEGF-D与VEGFR-3的相互作用，且随着ABDD073剂量的升高，抑制VEGF-D与VEGFR-3相互作用的能力越强。

实施例4、抗VEGFR-3的单克隆抗体ABDD073抑制HEL细胞增殖的验证实验

将HEL细胞以10⁴个/孔的浓度接种于96孔板中，向其中分别加入64μg/mL的GST-VEGF-D和不同浓度(1、10、40、80、100、150、200、250、300nM)的ABDD073纯化抗体以及对照抗体正常鼠IgG，在37℃、5％CO₂孵箱培养72小时后，每孔加MTT溶液20μl，37℃孵育4小时后加入二甲基亚砜溶解沉淀，测OD_492nm值，用SAS8.0作统计学分析对HEL细胞增殖的抑制率，结果如图8所示，表明抗VEGFR-3的单克隆抗体ABDD073可显著抑制HEL细胞增殖，而对照抗体无明显作用。

实施例5、抗VEGFR-3的单克隆抗体ABDD073抑制由重组GST-VEGF-D诱导的鸡胚尿囊膜血管的生成的验证实验

鸡胚尿囊膜是鸡胚外的一层膜，主要功能是提供进行气体交换的表面，同时鸡胚尿囊膜功能的行使也依赖于致密的血管网的支撑。由于鸡胚发育过程中淋巴管伴随着大量尿囊膜血管的形成，因此鸡胚尿囊膜是研究血管发生和形成的很好的模型(Mandriota SJ，Jussila L，Jeltsch M，et al.Vascular endothelial growth factor-c-mediated lymphangiogenesis promotes tumor metastasis[J].EMBOJ，2001，20(4)，672-682.)。现用抗VEGFR-3的单克隆抗体ABDD073进行对由重组GST-VEGF-D诱导的鸡胚尿囊膜血管生成的抑制实验，具体方法为：将购自中国农业科学院畜牧研究所的受精卵鸡蛋39℃孵育3天，无菌条件下加入不同剂量(5、10、20μg/mL)的可溶性的GST-VEGF-D蛋白，以GST为对照，观察其对鸡胚尿囊膜血管的影响，结果如图9所示(A图为显微观察结果；B图为血管面密度分析结果(横坐标为样品组，纵坐标为血管面密度))，在对照中仅能明显看到鸡胚的主要血管(a，b箭头处)，而在加了GST-VEGF-D的实验组中可看到大量的毛细血管生成(c，d，e)，并且随着GST-VEGF-D剂量的升高，生成的毛细血管的数量也增多，上述结果表明重组GST-VEGF-D具有促进鸡胚血管生成的作用。再在20μg/mL GST-VEGF-D剂量组加入不同剂量(0、1.25、10μg/mL)的抗VEGFR-3单克隆抗体ABDD073，以GST为对照，检测其对由重组GST-VEGF-D诱导的鸡胚尿囊膜血管生成的抑制作用，用石蜡封口继续孵育3天后，观察鸡胚微血管生成情况，结果如图10所示(A图为显微观察结果；B图为血管面密度分析结果(横坐标为样品组，纵坐标为血管面密度))，当GST-VEGF-D加入到鸡胚尿囊膜边缘后，有大量的毛细血管生成，而加入ABDD073后，由GST-VEGF-D诱导生成的血管被ABDD073抗体所抑制。上述实验结果证明抗VEGFR-3的单克隆抗体ABDD073具有抑制血管生成的作用。

实施例6、抗VEGFR-3单克隆抗体ABDD073基因序列的克隆及序列测定

从产ABDD073的杂交瘤细胞BDD073 CGMCC No.1537中分离纯化mRNA，反转录合成第一链cDNA，设计合成其轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)的引物，引物序列如下：

轻链可变区引物：

PL1：5’-CTGCCATGGAGTCAGACACACTGCTG-3’

PL2：5’-TGGATGGTGGGAAGATGGA-3’；

重链可变区引物：

PH1：5’-CAGGTGCAGCTTCAGGAATCTGG-3’

PH2：5’-CCAGGGGCCAGTGGATAGACAAGCTTGGGTGTCGTTTT-3’

PH3：5’-CCAGGGGCCAGTGGATAGACGGGTGG-3’

以反转录杂交瘤BDD073 CGMCC No.1537总RNA获得的cDNA为模板，在引物PL1和PL2的引导下，用PCR方法扩增ABDD073轻链可变区基因，50μl PCR反应体系为：10×PCR缓冲液5μl，dNTP混合物(2.5mM)4μl，宝生物Ex Taq酶0.2μl，模板2μl，PL1，PL2各1μl，ddH₂O 36.8μl，反应条件为94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min，共30个循环；以反转录杂交瘤BDD073 CGMCC No.1537总RNA获得的cDNA为模板，在引物PH1、PH2和PH3的引导下，用巢式PCR方法扩增其重链可变区基因，50μl PCR反应体系为：10×PCR缓冲液5μl，dNTP混合物(2.5mM)4μl，宝生物Ex Taq酶0.2μl，模板2μl，PH1，PH2，PH3各1μl，ddH₂O 36.8μl，反应条件为：94℃变性30s，60℃退火45s，72℃延伸1min，共30个循环。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图11所示(泳道M为DNA Marker，泳道1为扩增的轻链可变区基因，泳道2为扩增的重链可变区基因)，回收并纯化396 bp和351bp的目的片段，将其分别克隆到载体pGEM-T(Promega公司)中，将重组产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，筛选阳性重组子，提质粒进行测序。测序结果表明ABDD073轻链可变区基因具有序列表中SEQ ID №：3的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID №：3由351个碱基组成，其编码序列为自5’端第1至351位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列的蛋白质；重链可变区基因具有序列表中SEQ ID №：4的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID №：4由396个碱基组成，其编码序列为自5’端第1至396位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列的蛋白质。

实施例7、抗VEGFR-3小分子单链抗体的制备

抗VEGFR-3小分子单链抗体是保留抗体特异性和生物学活性的最小分子。由于其分子量小，免疫原性低，有利于作为载体制备成治疗自身免疫性疾病、感染性疾病和肿瘤等疾病的免疫治疗性药物。抗VEGFR-3小分子单链抗体的制备方法如下：

设计扩增ABDD073轻、重链可变区基因的引物，其中轻链下游引物和重链上游引物有20个碱基相互匹配，以保证VL和VH片段相互融合并插入柔性连接子(Gly₄ser)₃，组成VL-linker-VH ScFv片段；此外，在轻链的上游引物还含有限制性内切酶EcoR I识别位点，重链下游引物含有限制性内切酶Not I识别位点，以便融合的ScFv片段克隆至表达载体，引物序列为：

轻链可变区引物：

PL3(上游引物)：5’-GC GAATTCATGGAGTCAGACACACTGCTG-3’(带下划线碱基为EcoRI识别位点)

PL4(下游引物)：5’-GAACCACCGCCGCCCGAACCGCCACCACCCCGTTTTATTTCCAGCTTG-3’；重链可变区引物：

PH4(上游引物)：5’-TCGGGCGGCGGTGGTTCCGGGGGTGGCGGCTCCCAGGTGCAGCTTCAGG-3’；

PH5(下游引物)：5’-ATAAGAAT GCGGCCGCAGAGACAGTGACCAGAGTCC-3’  (带下划线碱基为Not I识别位点)

分别以实施例6中扩增出的抗体ABDD073的轻、重链可变区基因为模板，分别在上述引物对(PL3&PL4，PH4&PH5)的引导下，用PCR方法扩增抗体ABDD073的轻、重链可变区基因。再取所扩增的ABDD073的轻、重链可变区基因各1μl，进行融合PCR反应，反应体系及反应条件为：取扩增的VH、VL基因片段各1μl，先94℃变性30s，70℃退火45s，72℃延伸3min，共3个循环；然后94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min，共27个循环。反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图12所示(泳道M为DNA Marker，分子量范围与图11相同；泳道1为扩增的重链可变区基因；泳道2为扩增的轻链可变区基因；泳道3为ABDD073的轻、重链融合蛋白VL-linker-VH基因片段)，回收并纯化792 bp的融合基因片段，将其克隆到载体PET32a(Novagen)中，得到ABDD073可溶性单链抗体的高效表达质粒，命名为PET32a/VL-linker-VH，将重组产物转化大肠杆菌BL21感受态细胞，用100mg/L的氨苄霉素筛选分泌抗体的阳性重组子。挑取阳性重组子，在30℃，0.2mM IPTG下诱导培养，以大肠杆菌BL21为对照，离心收集含有可溶性抗体功能片段的上清、沉淀，进行10％SDS-PAGE检测，检测结果如图13所示(BL21为对照，硫氧还蛋白(TRX)为空载体对照，Total Ivsisi为全菌体)，经表达获得了分子量大小为48KD的单链抗体融合蛋白。用亲和层析分离纯化单链抗体VL-linker-VH，再用与实施例1相同的ELISA体系鉴定表达的可溶性抗VEGFR-3单链抗体VL-linker-VH的特异性和生物活性，结果如表2所示，表明表达出的单链抗体具有与VEGFR-3相结合的活性。对PET32a/VL-linker-VH进行测序，测序结果表明所合成的单链抗VEGFR-3抗体基因具有序列表中SEQ ID №：6的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID №：6由792个碱基组成，其编码序列为自5’端第1至792位碱基，自5’端第397-441位碱基为编码柔性连接子(Gly4ser)3，编码具有序列表中SEQ ID №：5的氨基酸残基序列的蛋白质，序列表中的SEQ ID №：5由264个氨基酸残基组成。

表2  可溶性抗VEGFR-3单链抗体VL-linker-VH的特异性和生物活性的ELISA鉴定结果

	OD450
								ScFv6.5μg/mL	ScFv13μg/mL	ScFv65μg/mL	正常鼠血清(1∶1000)	Anti-His(1∶1000)	PBS	BDD073上清
	VEGFR-3/Fc(0.5μg/mL)正常人IgG(0.5μg/mL)	0.515±0.0220.0805±0.0035	0.7296±0.04950.0066±0.022	1.007±0.07990.066±0.008	0.05±0.0010.064±0.011	0.082±0.0500.054±0.013	0.081±0.0380.061±0.006								0.889±0.1090.074±0.018

序列表

<160>6

<210>1

<211>117

<212>PRT

<213>小鼠属小鼠(Mus musculus)

<400>1

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Pro Arg Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr

            20                  25                  30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

        35                  40                  45

Ala Arg Ile Arg Asn Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asn

    50                  55                  60

Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Gly Asp Ser Gln Ser Met

65                  70                  75                  80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr

                85                  90                  95

Tyr Cys Val Arg Asp Gly Tyr Ser Leu Val His Trp Gly His Gly Thr

            100                 105                 110

Leu Val Thr Val Ser

        115

<210>2

<211>132

<212>PRT

<213>小鼠属小鼠(Mus musculus)

<400>2

Met Glu Ser Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1               5                   10                  15

Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala

            20                  25                  30

Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser

        35                  40                  45

Val Ser Thr Phe Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

    50                  55                  60

Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser

65                  70                  75                  80

Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

                85                  90                  95

Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys

            100                 105                 110

Gln His Ser Arg Glu Leu Met Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu

        115                 120                 125

Glu Ile Lys Arg

    130

<210>3

<211>351

<212>DNA

<213>小鼠属小鼠(Mus musculus)

<400>3

caggtgcagc ttcaggaatc tggtggagga ttggtgcggc ctagagggtc attgaaactc     60

tcatgtgcag cctctggatt caccttcaat acctacgcca tgaactgggt ccgccaggct    120

ccaggaaagg gtttggaatg gattgctcgc ataagaaata aaagtaataa ttatgcaaca    180

tattatgcca attcagtgaa agacaggttc accatctcca gaggtgattc acaaagcatg    240

ctctatctac aaatgaacaa cttgaaaact gaggacacag ccatgtatta ctgtgtgaga    300

gatggttact cccttgttca ctggggccat gggactctgg tcactgtctc t             351

<210>4

<211>396

<212>DNA

<213>小鼠属小鼠(Mus musculus)

<400>4

atggagtcag acacactgct gttatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt     60

gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc    120

atctcatgca gggccagcaa aagtgtcagt acatttggct atagttatat gcactggtac    180

caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatc ttgcatccaa cctagaatct    240

ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat    300

cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc acagtaggga acttatgtac    360

acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaacgg                              396

<210>5

<211>264

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

Met Glu Ser Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1               5                   10                  15

Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala

            20                  25                  30

Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser

        35                  40                  45

Val Ser Thr Phe Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

    50                  55                  60

Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser

65                  70                  75                  80

Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

                85                  90                  95

Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys

            100                 105                 110

Gln His Ser Arg Glu Leu Met Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu

        115                 120                 125

Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

    130                 135                 140

Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg

145                 150                 155                 160

Pro Arg Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

                165                 170                 175

Asn Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

            180                 185                 190

Glu Trp Ile Ala Arg Ile Arg Asn Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr

        195                 200                 205

Tyr Ala Asn Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Gly Asp Ser

    210                 215                 220

Gln Ser Met Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr

225                 230                 235                 240

Ala Met Tyr Tyr Cys Val Arg Asp Gly Tyr Ser Leu Val His Trp Gly

                245                 250                 255

His Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

            260

<210>6

<211>792

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

atggagtcag acacactgct gttatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt     60

gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc    120

atctcatgca gggccagcaa aagtgtcagt acatttggct atagttatat gcactggtac    180

caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatc ttgcatccaa cctagaatct    240

ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat    300

cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc acagtaggga acttatgtac    360

acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaacggggtg gtggcggttc gggcggcggt    420

ggttccgggg gtggcggctc ccaggtgcag cttcaggaat ctggtggagg attggtgcgg    480

cctagagggt cattgaaact ctcatgtgca gcctctggat tcaccttcaa tacctacgcc    540

atgaactggg tccgccaggc tccaggaaag ggtttggaat ggattgctcg cataagaaat    600

aaaagtaata attatgcaac atattatgcc aattcagtga aagacaggtt caccatctcc    660

agaggtgatt cacaaagcat gctctatcta caaatgaaca acttgaaaac tgaggacaca    720

gccatgtatt actgtgtgag agatggttac tcccttgttc actggggcca tgggactctg    780

gtcactgtct ct                                                        792

Claims (9)

1、杂交瘤细胞株BDD073 CGMCC No.1537。

2、权利要求1所述的杂交瘤细胞株BDD073 CGMCC No.1537产生的抗人VEGFR-3的单克隆抗体。

3、根据权利要求2所述的抗人VEGFR-3的单克隆抗体，其特征在于：所述单克隆抗体的重链可变区具有序列表中的SEQ ID №：1的氨基酸残基序列；轻链可变区具有序列表中的SEQ ID №：2的氨基酸残基序列。

4、衍生于权利要求2所述抗人VEGFR-3单克隆抗体的单链抗体，Fab抗体或人鼠嵌合抗体。

5、编码权利要求2所述的抗人VEGFR-3单克隆抗体的基因，其重链可变区编码基因具有序列表中SEQ ID №：3的DNA序列或编码序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；轻链可变区编码基因具有序列表中SEQ ID №：4的DNA序列或编码序列表中SEQID №：2的DNA序列。

6、根据权利要求5所述的基因，其特征在于：所述重链可变区编码基因具有序列表中SEQ ID №：3的DNA序列；轻链可变区编码基因具有序列表中SEQ ID №：4的DNA序列。

7、含有权利要求5所述基因的表达载体、转基因细胞系或宿主菌。

8、编码权利要求4所述的衍生于抗人VEGFR-3单克隆抗体的单链抗体，Fab抗体或人鼠嵌合抗体的基因。

9、权利要求2所述的抗人VEGFR-3的单克隆抗体在制备抑制肿瘤淋巴转移和抗血管生成的治疗性药物中的应用。

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