CN102202692A

CN102202692A - 用于诊断表达her2受体或其截短形式的癌症的方法

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Publication number: CN102202692A
Application number: CN2009801266601A
Authority: CN
Inventors: 祖亚昆·阿瑞巴斯·洛佩兹; 吉姆·佩德森; 皮尔·戴维·安吉丽妮; 约瑟夫·路易斯·帕拉·帕劳; 梭尔·劳斯; 约瑟·巴塞尔加·托雷斯
Original assignee: FUNDACIO PRIVADA INST D INVEST; FUNDACIO PRIVADA INSTITUCIO CA; FUNDACIO PRIVADA INST DE RECER
Current assignee: FUNDACIO PRIVADA INST D INVEST; FUNDACIO PRIVADA INSTITUCIO CA; FUNDACIO PRIVADA INST DE RECER
Priority date: 2008-06-02
Filing date: 2009-06-05
Publication date: 2011-09-28
Anticipated expiration: 2029-06-05
Also published as: IL209769A; KR20110031187A; CN102202692B; AU2009265921B2; EP2293819B1; BRPI0914969A2; ES2342646B1; HK1157658A1; HRP20141158T1; KR20160140974A; ES2342646A1; ZA201009010B; US20090311262A1; EA025218B1; JP2011525175A; PT2293819E; JP2015214546A; WO2010000565A1; AU2009265921A1; US8389227B2

Abstract

本发明涉及表达HER2受体癌症的诊断和治疗方法。本发明提供识别HER2受体截短形式抗原表位的抗体或其片段，所述抗原表位的序列如SEQ ID NO：2所示。本发明还提供癌症的诊断方法，其包括检测患者样本中由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的HER2受体截短形式的存在。

Description

用于诊断表达HER2受体或其截短形式的癌症的方法

本发明涉及从分离的样本中诊断表达HER2受体癌症的方法。本发明还提供用于癌症的早期诊断和鉴定以及治疗的化合物。

背景技术

HER2(又称c-erbB2、ErbB2或Neu)为I型跨膜蛋白，属于表皮生长因子受体或EGFR家族，也称为HER1或ErbB1。该家族还包括其它两个成员HER3和HER4。当HER1、HER3或HER4与EGF-型配体结合时，其胞外功能域(domain)呈现“开放式”的构型，形成同源二聚体和异源二聚体。由于它的胞外功能域为“开放式”构型，即使它不与任何配体结合，HER2也会与其它与配体相连的HER受体发生相互作用。

由胞外功能域引起的二聚体的形成导致了胞内HER受体激酶发生相互作用，随后一些酪氨酸残基发生转磷酸作用。这些磷酸酪氨酸，作为一组胞内磷酸酪氨酸-结合蛋白耦合器(couplers)。细胞质膜中发生的相互作用通过不同的信号转导途径传至细胞核中，例如由分裂素活化蛋白激酶(MAPK)激活的蛋白激酶途径，由应力、磷脂酶C-γ激活的蛋白激酶途径(JNK)等。所有这些信号回路控制着基因表达，以协调的方式进行修饰，发挥作用以决定细胞的状态，例如细胞增殖、迁移、存活和粘附。因此，根据细胞背景，HER受体的激活导致明显的细胞应答，使细胞转化为介于癌细胞至早衰细胞之间的细胞。

除了经典的信号转导模式，HER受体或其片段可以形成细胞内含物并被转运至细胞核，在细胞核中它们可直接调控特定基因的表达。已观测到HER2的这一特殊情形(Wang等.，“Binding at and transactivation of the COX-2promoter by nuclear tyrosine kinase receptor ErbB-2”，Cancer Cell-2004，Vol.6，pp.251-26)，以及C端片段(CTF)的该情形，其由HER4受体截短形式组成，包括整个细胞质部分(Linggi等.，“ErbB-4 s80 intracellular domain abrogates ETO2-dependent transcriptional repression”，J.Biological Chemistry-2006，Vol.281，pp.25373-25380)。

在人乳腺癌中，已发现了一系列C端片段或CTFs，推测其含有HER2的跨膜域和细胞质域。(Molina等，“NH(2)-terminal truncatedHER2 protein but not full-length receptor is associated with nodal metastasis in human breast cancer”，Clinical Cancer Research-2002，Vol.8，pp.347-353)。还已知患有表达HER2CTFs乳腺癌的病人或患有表达相同截短形式(其不含HER2(HER2CTFs)的N-末端)乳腺癌的病人，比那些患有主要表达HER2完整形式的乳腺癌病人发展为癌症转移的可能性更大(Molina等2002-supra)且预后更差(Saez等，“p95HER2 predicts worse outcome in patients with HER2-positive breast cancer”，Clinical Cancer Research-2006，Vol.12，pp.424-431)。

因此，及时检测肿瘤中HER2的存在是十分重要的，更重要的是检测它为完整形式还是截短(CTF)形式。

当今，常规临床试验的层面上，使用抗体检测HER2完整形式的存在，以便确定有问题的乳腺肿瘤的类型。如果要检测HER2存的在，推荐的疗法是施用治疗性单克隆抗体，如Genentech公司的曲妥单抗(trastuzumab)。该单克隆抗体用于治疗癌症的用途描述于WO8906692中，Genentech公司所有。WO8906692中描述了单克隆或多克隆抗体定向作用于HER2的胞外区，该胞外区与蛋白完整的外部区域相匹配，为它的N-末端。如前面所述，WO8906692中提及的被抗体识别的抗原表位是HER2完整形式的胞外功能域的抗原部位，不包含截短形式或HER2的C端片段。因此，WO8906692中描述的抗体和诊断方法不能检测到截短的HER2的存在。此外，在所述HER2的CTFs表达的乳腺肿瘤中，抗体如曲妥单抗不是治疗性的，因为它们不识别任何抗原表位。这一事实解释了用曲妥单抗治疗表达HER2截短形式(CTFs)的患者具有耐药性。

为防止出现Saez等2006(supra)观察到的较差的预后数量，应该采用选择性疗法治疗表达HER2截短形式或CTFs的患者。为尽快检测(诊断)和治疗表达HER2截短形式肿瘤的患者，区分HER2的表达形式是非常有意义的。以便后续治疗。

Anido等“Biosynthesis of tumorigenic HER2C-terminal fragments by alternative initiation of translation”，European Molecular Biology Organization(EMBO)Journal-2006，Vol.25，pp.3234-3244，文献中描述了除了由α-分泌酶作用于HER2产生的片段之外，其产生截短形式(CTF)的P95，P95含有受体的跨膜片段和细胞质片段，通过选择性地从位于上游和下游的两个甲硫氨酸起始翻译的机制，还分别产生两种HER2跨膜功能域的截短形式(CTF)。具体地，美国国立生物技术信息中心(NCBI)的UniGene数据库中登录号为M11730.1的氨基酸序列，是选择性地从611位和687位上的甲硫氨酸起始翻译得到的。该文献中还指出这些HER2受体(CTFs)的可选择形式存在于乳腺肿瘤中。特别地，它指出大量存在的形式为CTF687，或者换言之，从687位上的甲硫氨酸起始翻译获得的蛋白。Anido等，提出将HER2的酪氨酸激酶活性抑制剂，例如拉帕替尼(lapatinib)用于治疗以使表达这些HER2截短形式肿瘤的生长降至最低。酪氨酸激酶抑制剂通过与HER2受体的C-末端相互作用而发挥功效，所述HER2受体是以受体的完整形式和由其衍生的或通过选择性起始翻译产生的CTFs形式存在的。

Scaltriti等的文献“Expression of p95HER2，a truncated form of the HER2 Receptor，and response to anti-HER2 therapies in breast cancer”，Journal of National Cancer Institute-2007，Vol.99，pp.628-368”中描述了用于检测HER2受体截短形式中的一种存在的选择性方法学研究实例，并列出一些用曲妥单抗(赫赛汀，Herceptin)治疗产生耐药性的可能原因。特别地，它强调不具有曲妥单抗识别的胞外功能域的p95HER2片段(HER2经α-分泌酶蛋白水解后的产物)和其它该受体截短形式的沉积。Scaltriti提出了一种检测p95HER2片段(经α-分泌酶蛋白水解后的产物)的免疫荧光法。该新的检测方法可在包埋于石蜡中的组织切片上进行，并按照临床操作用福尔马林固定。该新的方法学源自观测到p95HER2截短形式，而非受体的完整形式，位于细胞的细胞质膜和细胞质中。这种方法提出通过用结合受体的细胞质功能域的抗-HER2抗体对待测细胞质进行染色，比较是否有p95HER2表达；并用抗-细胞角蛋白抗体检测结果验证这些结果，该蛋白分布广泛被用作诊断肿瘤的工具。然而，尚不清楚这种方法是否能够有效地将那些表达HER2完整形式的肿瘤和表达截短形式的肿瘤区分开来。

有必要寻找新的和有效的用于诊断和治疗靶标，与问题癌症的类型准确相关，以便能够及时采取有效的治疗方法治疗那些预后最差的肿瘤，摒弃那些从一开始就没有效果的疗法。

本发明提供解决上述问题的方法以及对癌症，特别是乳腺癌进行早期分类的新方法。

发明概述

已经确定，一种由选择性起始翻译产生的HER2截短形式(CTF)的存在，与治疗的癌症类型的预测非常相关，这使医师在治疗过程中开处方变得容易。这种HER2截短形式(CTF-611)已被测定具有SEQID NO：1的序列。

该序列已被用于开发多种工具，以检测组织样本中HER2截短形式的存在，从而提供一种新的、可靠的诊断装置，也可用于临床诊断。

本发明还提供识别HER2截短形式或CTF(其不能被曲妥单抗识别)的新抗体或其片段。这些抗体识别由SEQ ID NO：2包含的序列限定的抗原表位。本发明还提供适合用于产生这种抗体的杂交瘤细胞系。目前可获得的抗-HER2抗体识别CTFs和HER2或仅HER2，这使得难以将表达HER2和CTFs的患者与仅表达HER2的患者区分开来。与可获得的抗-HER2抗体相比，本发明抗体优先结合CTF-611，从而能鉴定出表达这种CTF的患者。

本发明还涉及患者样本的癌症诊断方法，其包括检测所述患者样本中由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的HER2受体截短形式的存在。

本发明还提供所述抗体或其片段在分离的样本中诊断和预后检测表达HER2受体的样本中的应用。

本发明进一步提供用于从分离的样本中诊断和预后检测表达HER2受体和/或C-端片段的癌症的试剂，其包括至少一种上述抗体或其片段。

本发明还提供用于从分离的样本中诊断和预后检测表达HER2受体的癌症的试剂盒，其包括用于检测所述样本中由SEQ ID NO：1组成的HER2受体截短形式存在的装置。

本发明还提供上述抗体或其片段在治疗或制药中的应用。特别地，该药物用于治疗或预防至少由SEQ ID NO：1组成的表达HER2受体截短形式的癌症。

根据本发明的另一方面，所述的抗体或其片段用于制备治疗或预防哺乳动物，包括人乳腺癌的药物。

本发明的另一目的是提供用于治疗至少表达由SEQ ID NO：1组成的HER2受体截短形式的癌症的药物组合物，其含有上述抗体或其片段和至少一种药用赋形剂和/或载体。

附图说明

图1：截短形式CTF-611的蛋白序列，与完整的HER2受体序列及截短形式p95(648-CTF/p95)的序列对照图，其为α-分泌酶蛋白水解的产物。跨膜功能域表示螺旋线。其余分子以灰框显示。用于产生单抗或多抗的多肽序列以下划线表示。分子内二硫键的位置以半胱氨酸之间的连接标示。

图2：乳腺癌样本的电泳及蛋白质印迹(转移到膜上)。(S)表示可溶部分，(M)为膜部分。为检测完整的HER2和CTF-611形式，使用直接作用于该蛋白细胞质功能域的抗体。DHL：乳酸脱氢酶(用作对照)。

图3：表达CTF-611截短形式(图3A)肿瘤的转基因小鼠数量与表达完整HER2受体的转基因小鼠相比较的测定结果；以及检测到的肿瘤体积结果。(图3B)。在Y轴上，N和V分别代表肿瘤数量和肿瘤体积。在X轴上，T代表时间(周)。

图4：图4A为识别HER2受体细胞质功能域(在所有完整和截短形式中的功能域)的抗体(CB11)或抗SEQ ID NO：3(α-611-A和α-611-B)的多肽产生的多克隆抗体的电泳和蛋白质印迹(转移到膜上)结果。表达HER2受体完整形式、CTF-611J截短形式及p95截短形式的NCF7细胞裂解提取物痕迹。图4B为抗体α-611-A、α-611-B及CB11作用于含有完整的HER2受体以及截短形式CTF-611和p95的样本的免疫沉淀试验结果。

图5：(A)裂解表达HER2，611-CTF或648-CTF的MCF7细胞并用作用于HER2细胞质功能域的抗体CB11或作用于多肽MPIWKFPDEEGASQPSPINSTHSSVDLDDKGC(见图1)产生的两个单独的单克隆抗-611-CTF抗体进行蛋白质印迹分析。(B)表达HER2，611-CTF或648-CTF的MCF7细胞裂解物以1∶1∶1混合，并用指出的单克隆抗体进行免疫沉淀。将洗涤后的沉淀物与CB11抗体进行Western杂交分析。作为阴性对照，不加抗体(-)进行免疫沉淀。(C)在共聚焦显微镜中分析表达HER2，611-CTF或648-CTF的MCF7细胞与表明的抗体之间的间接免疫荧光反应。

图6(A)和(B)：采用流式细胞术检测到的一种单克隆抗体特征。

图7：采用免疫组织化学检测到的单克隆抗体特征。

图8：抗原表位的特征。图8(A)：图表显示了611-CTF近膜区的一级序列及不同组成的序列用于抗原表位作图。图8(B)蛋白质印迹。

图9：乳腺癌样本分析。图9(A)分析结果表格。图9(B)免疫细胞化学染色。

发明详述

CTF-611

如前所述，发明人惊奇地发现所述SEQ ID NO：1的HER2截短形式的差别检测结果与预后差的一般类型的乳腺组织癌症具有较好的相关性。因此，图3显示了表达截短形式CTF-611(SEQ ID NO：1)肿瘤的转基因小鼠数量的测定结果。

为了获得图3的结果，cDNA构建体在小鼠的上皮组织中表达，所述cDNA构建体编码人SEQ ID NO：1(CTF-611)，图中为M611-CTF。该cDNA构建体包括在鼠乳腺瘤病毒(MMTV)启动子的控制下的SEQID NO：1。作为对照，使用表达HER2完整形式的小鼠细胞FVB/N-Tg(MMTVneu)202J，其也是在MMTV启动子的控制下。从图3A中可知，小鼠中表达以CTF-611形式(SEQ ID NO：1)cDNA构建体的肿瘤数量远高于FVB/N-Tg(MMTVneu)202J细胞中的一个，图中为HER2/neu。检测17周龄的表达CTF-611的转基因动物的肿瘤，其代表首次即拿出FVB/N-Tg(MMTVneu)202J小鼠前3个月。这一事实表明表达HER2片段的肿瘤比那些表达完整形式的肿瘤侵袭力更强。图3B还表明表达具有SEQ ID NO：1的HER2的CTF截短形式的动物肿瘤体积比那些表达HER2/neu完整受体的动物肿瘤体积大得多。第二个事实还表明这种类型的肿瘤侵袭力更强。发明人还确定了那些表达序列SEQ ID NO：1截短形式的肿瘤比那些观察到的表达HER2/neu的肿瘤具有更高的肺部转移指数。下面实施例9中提供的实验进一步证明了临床相关性。

所有这些转基因动物数据揭示了具有SEQ ID NO：1的HER2受体截短形式与该受体的完整形式之间的差别检测是非常必要的。

显然，所述SEQ ID NO：1包括所有来自个体间的等位基因的突变体，其包括一些氨基酸数量和类型上的变化，例如大概2个或3个氨基酸，或一个氨基酸被另一个氨基酸替换，其不改变受体的整体结构。

这些HER2截短形式可包含新抗原表位，换言之，新的抗原决定簇不存在于完整受体中，表明它们与分子的相互作用方式与完整受体(抗体、药物等)不同。

CTF-611抗体

发明人能够制备CTF-611的多克隆抗体及单克隆抗体。这些抗体识别由SEQ ID NO：2中包含的序列限定的抗原表位，优选SEQ ID NO：3或其包含的序列定义的抗原表位。更优选识别MPIWKFPDEEGAS(SEQ.ID NO：5)或其包含的序列定义的抗原表位的抗体。

在本发明中，抗原表位被理解为肽类高分子(或抗原)的一部分，其序列和/或空间构型能被免疫系统识别(抗体、T细胞、B细胞)。

优选本发明抗体能够将SEQ ID NO：1的蛋白和HER2受体区分开来。而且，优选本发明抗体能够将SEQ ID NO：1的蛋白和HER2受体截短形式648-CTF/p95区别开来。可通过免疫荧光、流式细胞术、培养细胞的免疫组织化学及患者样本的免疫组织化学中的一种或多种将所述区别可视化。特别优选用流式细胞术和免疫沉淀进行定量区分。

根据本发明，在免疫沉淀实验中，优选本发明的抗体结合611-CTF比它们结合HER2高出至少300倍，更优选至少1000倍，最优选1000-2000倍，详述于实施例3中(用5微克32H2及5微克20F4)。

如上所述，抗体可以是多克隆的或单克隆的。

在本发明中，“多克隆抗体”应被理解为是指由不同的B细胞(B淋巴细胞)产生的一组抗体。多克隆抗体是针对某一抗原(高分子)由免疫球蛋白分泌的混合物，由于是由不同的B细胞产生，这些免疫球蛋白中的任何一种都能够识别不同的抗原表位。因此，在包含于多克隆抗体的不同免疫球蛋白群体中，有一类免疫球蛋白，它识别特定抗原表位或特定抗原的目标表位。

例如，多克隆抗体可以通过将SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQID NO：4或SEQ ID NO：5的多肽与免疫原如镇眼帽贝血蓝蛋白(Keyhole-limpet hemocyanin)共轭连接制备得到，并用该共轭物免疫大白兔。单克隆抗体可使用相同或相似的免疫原制备得到。杂交瘤细胞系的制备采用本领域技术人员已知的方法。然后，将杂交瘤细胞系培养于适合的培养基中，回收产生的单克隆抗体。

在优选的实施方式中，它们是由根据布达佩斯条约，在2008年4月9日保藏于“德国微生物菌种保藏中心-DSMZ”的保藏号(accessnumber)为DSM ACC2904的杂交瘤细胞系或由根据布达佩斯条约，在2008年11月6日保藏于“德国微生物菌种保藏中心-DSMZ”的保藏号为DSMACC2980的杂交瘤细胞系制备得到的。

特别优选用这些杂交瘤细胞系制备得到的单克隆抗体以及至少具有同等功能的单克隆抗体。至少具有同等功能是指那些能够同样地或更好地区分CTF-611和HER2的抗体。

适用的抗体还包括人源化(humanized)抗体和人源抗体(human antibodies)。

因此，本发明还提供分离得到的SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的多肽。

根据本发明可以使用抗体片段，而非完整抗体。所述抗体片段选自由F(ab)、F(ab’)和Fv组成的组。在本发明中，抗体片段指抗体的一部分，其具有足够的长度和适合的结构以结合存在于HER2受体截短形式中的抗原表位，从而实施样品检测。

实施例2和3给出了具体的抗体。显然，本发明还包括其它直接作用于SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3限定的CTF-611截短形式抗原表位的多克隆或单克隆抗体，因此，根据本发明的教导，它们可由本领域技术人员直接得出。同样地，本发明包括所述抗体的片段，例如F(ab)、F(ab’)、Fv等，或任何能够产生可直接作用于SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3的多肽的单克隆抗体的杂交瘤细胞系。

诊断方法

根据本发明的诊断方法，检测HER2受体截短形式的存在可分别采用下述方法进行：相对于所述HER2受体的完整形式而言，通过由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的HER2受体截短形式的在流动相-固定相系统中的差速迁移进行检测；以及通过与含有SEQ ID NO：1的HER2受体截短形式的特异性抗体结合进行检测。

在本发明中，通过差速迁移检测应理解为在特定的流动相-固定相系统中基于不同待测化合物的流动性而进行分离的任何分析技术，例如电泳。这种不同的流动性可能由化合物所带不同电荷、不同分子量或对其它化合物不同的亲和力而导致。

这种差别检测可通过本领域已知的分析技术，例如电泳、分子排阻层析、抗体亲和试验、免疫荧光、免疫细胞化学、免疫组织化学、流式细胞术等来实施。特别优选免疫组织化学。可将将一种或多种方法结合以增强可靠性。

由SEQ ID NO：1组成的HER2受体截短形式，在本发明中也称为CTF-611的差别检测，就整体或完整HER2受体而言，能够使图1中的两种不同分子量和不同序列的蛋白可视化。SEQ ID NO：1所示的截短形式由从HER2受体全序列的611位甲硫氨酸选择性起始翻译得到的蛋白组成。因此这种形式或CTF含有新的胞外功能域、跨膜片段及胞质功能域。跨膜片段和胞质功能域与HER2受体的完整形式相同。根据图1的另一个截短形式为p95或CTF-648。该形式为α-分泌酶作用于完整HER2受体的产物，其将胞外功能域的大部分分割开来。

根据本发明的另一个实施方案，检测样本中由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的HER2受体截短形式存在的步骤包括使用至少一种上述抗体进行检测。在一个具体的实施方案中，根据本发明的诊断方法包括检测SEQ ID NO：3限定的抗原表位。

在本发明的一个实施方案中，本发明的抗体或其片段被用作诊断及预后检测的试剂，或者直接用它们各自的多肽序列标记(例如用放射性同位素)或间接地(例如通过添加或结合荧光试剂或在选择反应培养基中通过反应能够产生荧光的试剂)，上述目的均是为了产生可视信号，如有可能，进行定量，以检测样本中由SEQ ID NO：1组成的HER2受体截短形式的存在。

以相同的方式，设计含有至少通过直接或间接与间隔臂相连的方法与固体支持物结合的抗体的诊断试剂，这种类型的试剂能够俘获样本的SEQ ID NO：1序列的形式，随后用其它非特异性抗体(例如CB11)检测它的存在。

本发明的诊断及预后检测试剂还可用于免疫组织化学操作。为此目的，单克隆或多克隆抗体(一级或二级)需适当地标记以产生可视信号，在定量的最佳情况下，一旦它们与测试组织相接触，它们就能够与待测靶蛋白，也就是SEQ ID NO：1序列的HER2的CTF片段发生作用。

为了便于医师的分析、诊断及预后检测，将诊断试剂设计成试剂盒形式，除抗体外，其包括反应试剂(例如用于免疫组织化学染色的试剂)、缓冲液及适合于检测样本中SEQ ID NO：1的截短形式存在的检测溶液，反映CTF-611不同表达水平的对照载片以及详细的说明，协助医师诊断评价。这种试剂盒还包括用于半定量免疫组织化学测定HER2的方法(例如Herceptest^TM)。

因此，本发明提供用于诊断及预后检测的试剂盒，除了本领域熟知的反应试剂及适合于抗体和抗原表位发生反应的缓冲液之外，其至少包括一种抗体或其片段，所述抗体或片段能识别由SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5定义的抗原表位。

本发明的诊断方法及试剂盒能够预测淋巴结转移、预后差及抗Herceptest^TM。

相对于HER2受体的完整形式而言，本发明的另一种类型试剂盒包括通过由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的HER2受体截短形式的差速迁移进行检测的所有必要的装置。

在表达HER2受体或其截短形式的癌症组中，乳腺癌最为突出。其它癌症也表达这些蛋白，包括肺癌、胰腺癌、大肠癌、胃癌、前列腺癌、头颈部癌、皮肤癌、肾癌、睾丸癌、甲状腺癌、膀胱癌、子宫癌、阴道癌、子宫内膜癌、卵巢癌、食道癌、口腔癌、唾液腺癌、喉癌、腹膜癌、鼻癌和喉癌、输卵管癌、肾母细胞癌、淋巴癌，以及秋千肉瘤、滑膜肉瘤、髓母细胞瘤、滋养层细胞瘤、胶质瘤、成胶质细胞瘤、胆管癌、胆脂瘤、软骨肉瘤、室管膜瘤、神经鞘瘤、神经瘤、横纹肌肉瘤。因此，本发明的诊断方法尤其适用于诊断这些癌症中的任何一种。除体外检测CTFS，还可将抗体用于体内成像。

治疗方法

本发明的抗体或其片段还可用于治疗，特别是癌症治疗，特别是那些表达HER2受体或其截短形式的癌症。优选人源化和人源抗体及其片段。

本发明抗体还可用于治疗至少表达由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的HER2受体截短形式癌症的药物组合物。该组合物含有药用载体或赋形剂及至少一种识别由SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3序列定义的抗原表位。该药物组合物还包括抗体混合物，除本发明抗体外，含有其它作用于HER2或其片段的抗体，例如Herceptest^TM。

基于本发明附图及示例性说明但不限于实施例，以下描述了诊断及预后检测表达HER2受体和/或其C端片段(截短形式)癌症的方法；新的多肽及作用于所述多肽的特异性抗体；新的细胞株；检测用诊断试剂及试剂盒，所有这些均为本发明目的。

尽管没有具体说明，本发明中使用的技术和科学术语为本领域熟知。相似或等同的方法及材料可用于本发明的实施。说明书及权利要求中“包括(comprise)”及该词的变化形式，例如“包括(comprising)”不能排除其它技术特征、添加剂、组分或步骤。基于说明书或实施本发明，本发明的其它目的、好处及特征对本领域技术人员而言是显而易见的，以下例举的实施例及附图不用来限制本发明范围。

此外，应理解本发明包括所有上述优选的及特殊组的组合。

实施例

以下实施例描述了从分离的表达HER2受体和/或其截短形式的癌症样本中，检测序列SEQ ID NO：1的截短形式存在的不同方法。

试验步骤

细胞：将MCF7Tet-Off细胞(BD生物科学)置于含有10％FBS(Gibco)、4mM L-谷酰胺(PAA Laboratories)、0.2mg/ml G418(Gibco)和1μg/ml强力霉素(Sigma)的DMEM/F-12(1∶1)(Gibco)中，在37℃，5％CO2的条件下保存。使用FuGENE6(Roche)，以各种表达质粒转染细胞。用0.1mg/ml的潮霉素B(Invitrogen)筛选含有基于整合质粒pUHD10-3h的单一稳定克隆。通过去除强力霉素诱导编码HER2和CTFs的cDNAs的pUHD10-3h表达。首先用0.5％胰蛋白酶-EDTA(GIBCO)分离细胞，通过离心洗3次，在培养皿中接种细胞10h后更换培养基。以作用于HER2细胞质功能域的抗体通过免疫荧光共聚焦显微镜检测同源的各细胞株。挑选出两株稳定的细胞株用于试验。

蛋白质印迹：在改变的RIIPA缓冲液(20mM NaH₂PO₄/NaOHpH7.4，150mM NaCl，1％Triton X-100，5mM EDTA，100mM PMSF，25mM NaF，16μg/ml抑肽酶，10μg/ml亮肽素和1.3mM Na₃VO₄)中将表达不同HER2亚型的细胞进行裂解，用DC蛋白检测试剂(BIO-RAD)测定蛋白浓度。将样本与含有5％β-巯基乙醇的加样缓冲液(终浓度：62mM Tris pH6.8，12％甘油，2.5％SDS)混合，在99℃培养5min，然后进行SDS-PAGE，分离出15μg蛋白。蛋白质印迹中的特殊信号用软件ImageJ 1.38(NIH)进行定量。

免疫沉淀：将细胞裂解物与不同的抗体在4℃培养1h。然后，用蛋白A纯化免疫复合物。用裂解缓冲液洗涤免疫沉淀物3次，与加样缓冲液混合并进行蛋白质印迹分析。

将接种于盖玻片的用于免疫荧光显微观察的细胞用PBS洗涤，用4％多聚甲醛固定20min并用0.2％Triton X-100通透化处理10min。用含有1％BSA、0.1％皂甙和0.02％NaN₃的PBS进行封闭(blocking)和抗体结合，用带DAPI的Vectashield(Vector laboratories)封片。

流式细胞术：在4℃用PBS洗涤表达HER2、611-CTF或648-的MCF7细胞并在含5mM EDTA的PBS中分离。将分离的细胞与10μg/ml抗-32H2单克隆抗体在含5％BSA的PBS中培养30min，于4℃洗涤并于4℃用FITC-共轭的抗鼠IgG(Becton-Dickinson)在含5％BSA的PBS中染色30min，在FACscan上进行流式细胞术，使用FACscan研究软件(Becton Dickinson Immunocytometry Sys.，Mountain View，CA)。

免疫组织化学：.在4℃用PBS洗涤表达HER2、611-CTF或648-的MCF7细胞并在含5mM EDTA的PBS中分离。然后，离心，在10％中性福尔马林中固定细胞沉淀物，脱水并包埋于石蜡中。将来自细胞沉淀物的切片或来自4μm厚的人体组织切片置于多聚赖氨酸包被的载玻片上。通过以下操作及进行免疫组织化学分析：

1.脱石蜡和再水化切片

1.1于60℃培养载玻片30min。

1.2给载玻片脱石蜡3次，每次5min。与洁净的二甲苯混合培养，接着用乙醇分析纯洗涤2次，每次3min。

1.3逐渐置于蒸馏水中：乙醇95℃3min，乙醇70℃3min，乙醇50℃3min，蒸馏水。

2.抗原回收

在低pH(6)进行PT连接(Link)，ENVISION FLEX TARGETRETRIEVAL SOLUTION高pH 10x.DM 812。20min，95℃。

用Envision Flex洗涤缓冲液洗涤x10DM 811，15min。

3.免疫组织化学染色

AUTOSTAINER加Link DAKO

试剂盒：ENVISION FLEX+MOUSE，高pH(Link)：

Envision Flex过氧化物酶封闭SM801。

Envision Flex/HRP SM 802。

Envision Flex DAB+色原体DM 807。

Envision Flex底物缓冲液SM 803。

Envision Flex洗涤缓冲液10x DM 811。

Envision Flex目标回收溶液高pH 10x DM 812。

Envision Flex+鼠(linker)SM 84。

加入过氧化物酶5min并用洗涤缓冲液洗涤。

蛋白质组件5％15-20min。

用洗涤缓冲液洗涤。

■32H2洗脱1∶1000-1∶3000(1mg/ml母液)或20F4洗脱1∶20-1∶50(1mg/ml母液)2小时。

■用洗涤缓冲液洗涤。

■二级(Flex HRP，Flex+鼠/兔)20min。

■用洗涤缓冲液洗涤。

■DAB 5min。

■用洗涤缓冲液洗涤。

■苏木精。

■用蒸馏水洗涤。

3.脱水并用封固剂固定

3.1用浓度递增的乙醇进行梯度洗涤(50％，70％，95％，每次洗涤2min)。

3.2依次置于蒸馏水中(乙醇95％，70％，50％，蒸馏水，每次洗涤3min)。

3.3用二甲苯/桉油精洗涤(洗涤3次，每次2min)。

3.4用DPX封固。

转基因小鼠

TG 611和TG 687小鼠通过基因工程方法，将编码687-CTF和611-CTF的序列克隆至pMB载体(Dr.Marcos Malumbres惠赠，CNIO，Madrid)的劳氏肉瘤病毒增强的小鼠乳腺瘤病毒长末端重复区下游的多克隆位点II。基础系(Founder lines)是通过向受精的卵母细胞中显微注射线性质粒DNA而得到的，所述卵母细胞来自动物生物技术和基因治疗中心(Centre de Biotecnologia Animal i Teràpia Gènica，Universitat Autònoma de Barcelona)提供的超排FVB小鼠。通过Southern杂交分析基础小鼠(founder mice)的基因型。基础动物鉴定后，常规菌群通过PCR基因分型。雄性和雌性FVB/N-Tg(MMTVneu)202J小鼠来自Jackson实验室(Bar Harbor，ME)。

全组织封片(Whole Mounts)及组织学

将哺乳动物腺体包埋于载玻片上，在4％多聚甲醛中固定过夜并转移至70％乙醇中。将载玻片用水冲洗5min并置于0.2％过滤的品红溶液中染色24h。然后腺体用浓度递减的乙醇连续脱水，然后脱脂并贮存于水杨酸甲酯中。将固定的腺体封闭(blocked)于石蜡中，切片并用苏木精和伊红染色用于组织学分析。

实施例1：通过差速迁移检测SEQ ID NO：1片段。

图2显示了凝胶电泳和Western-型转移(蛋白质印迹)的结果，将不同的乳腺癌样本(108、114、101、103、131、134和145)加样于泳道上。分析来自各样本细胞裂解物的可溶部分(S)和膜部分(M)，使HER2分子的类型可视化并确定其组成。大体上，预计完整受体和SEQ ID NO：1形式都存在于细胞膜中，为了检测完整的HER2及CTF-611形式，使用抗体(CB11)直接作用于所述蛋白的细胞质功能域，其是两种蛋白形式共有的功能域。作为分析对照，检测乳酸脱氢酶的存在(DHL)。在大部分样本中，出现完整HER2受体对应的条带以及在细胞膜部分中，出现SEQ ID NO：1的CTF-611形式对应的条带。

因此，图2表明可通过蛋白电泳分析检测HER2受体截短形式的类型。此外，序列SEQ ID NO：1的HER2片段的存在表示特定的癌症类型，至于实施例，在表达HER2的癌症中，乳腺癌应被当作个案来评价和处理。

实施例2：用针对新的SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3限定的抗原表位的多克隆抗体检测SEQ ID NO：1的HER2片段的存在。

为了能够检测序列为SEQ ID NO：1的HER2截短形式的存在，采用其它装置替代电泳中的差速迁移装置，合成具有SEQ ID NO：4序列的多肽并用所述多肽免疫4只兔子。该多肽对应于CTF-611形式或SEQID NO：1的N-末端的32个氨基酸，其中大部分半胱氨酸被丝氨酸取代，使多肽能够与免疫原琥珀酰化钥孔傶血兰蛋白(Keyhole-limpethemocyanin，KLH)共轭结合。

因此，与SEQ ID NO：3相同，改造SEQ ID NO：4对应的多肽以实施免疫技术。本领域技术人员应理解，直接作用于SEQ ID NO：4合成的多肽的抗体还可识别HER2受体截短形式(SEQ ID NO：1或CTF-611)中由SEQ ID NO：3定义的抗原表位。相似地，本领域技术人员应理解，如果合成的免疫多肽由SEQ ID NO：2组成，其包括所有位于胞外区的CTF-611受体的氨基酸，出于相同目的，得到等同的直接作用于其它多肽的抗体。

对表达HER2受体完整形式、CTF-611截短形式和p95截短形式的MCF7细胞裂解提取物进行SDS电泳及后续的Western转移。SEQ IDNO：1的截短形式实际表现为相似分子量的两个片段。如用糖苷酶-F进行的实验可得出，一种酶能够减少蛋白上的N-多糖(未显示)，CTF-611片段为翻译后修饰底物。具体地，合成约110kDa的片段并随后进入分泌途径进行N-糖基化。

两只免疫兔子的血清能识别完整HER2受体和CTF-611。从图4A中可以看出，检测到完整HER2受体和SEQ ID NO：1或CTF-611对应的条带。图4A表明，蛋白质印迹结果得到识别HER2受体细胞质功能域(为完整形式和截短形式共有的功能域)的抗体(CB11)；或得到存在于兔血清中的由SEQ ID NO：4所述的多肽产生的多克隆抗体(α-611-A和α-611-B)。由于抗体α-611-A和α-611-B对应于完整HER2和CTF-611的信号，推知它们能够识别存在于两种受体形式中的线性抗原表位。作为SDS电泳和蛋白质印迹的阴性对照，使用表达p95受体形式的MCF7细胞裂解物，其不具有作用于所设计的抗体的抗原表位。

比较这些结果，当用抗体α-611-A和α-611-B及抗体CB11进行免疫沉淀时，检测到直接作用于SEQ ID NO：4多肽的抗体比作用于受体截短形式(CTF-611)的抗体优选沉淀。易于形成沉淀的混合物中含有比例为1∶1∶1的表达HER2受体不同形式的细胞裂解物。图4B中清楚地体现了这些结果。图中，显示出SDS电泳和蛋白质印迹转移得到的条带，这些条带是加样抗体α-611-A、α-611-B和CB11进行免疫沉淀试验得到的结果。对照条带(input)是用易于和不同抗体形成免疫沉淀的三种类型的细胞裂解物1∶1∶1的混合物加样。用CB11进行蛋白质印迹。约106个表达全长HER2、611-CTF或648-CTF的细胞在500μl裂解缓冲液中裂解(50mM Tris HCL pH7.4，137mM NaCl，2mM EDTA，10％甘油，1％NP40)。裂解物通过14000g离心30min而澄清。Input：5μl裂解混合物(全长HER2∶CTF611∶CTF648，1∶1∶1)。IP：50μl裂解混合物+5μl来自兔或CB11的抗611CTF血清。

用抗体α-611-A和α-611-B免疫沉淀得到的相应条带，比CTF-611的糖基化和非糖基化形式得到的蛋白分子量条带明显更深，从而可清楚地区分开来。即，所述直接作用于SEQ ID NO：4多肽的抗体不能与HER2受体的完整形式发生免疫沉淀，这表明它们精确地识别未发生变化的完整HER2受体的抗原表位。因此，可知抗体α-611-A和α-611-B对CTF-611具有特异性。

这种特异性通过间接免疫沉淀试验(未显示)得以验证，其中亲和纯化多克隆抗体α-611-A和α-611-B仅能使表达CTF-611截短片段的样本染色。这一事实的好处是，使用它们检测表达于分离的肿瘤组织样本中的HER2受体的不同形式成为可能。多克隆抗体的亲和纯化操作如下：

(i)用HiTrap蛋白A HP柱(GE Healthcare)纯化总IgG。将兔血清抗体固定于用结合缓冲液(Na₂HPO₄)平衡的柱上，用10倍柱体积的结合缓冲液洗涤并用10倍柱体积的柠檬酸(pH2.7)洗脱。用pH8的Tris-HCL中和洗脱液。

(ii)用固定于HiTrap NHS柱的多肽进行纯化。将用于免疫兔子的同样的多肽固定于HiTrap NHS柱上。将上述步骤中纯化的IgGs加样到用结合缓冲液(Na₂HPO₄)平衡过的柱上，用10倍柱体积的结合缓冲液洗涤并用10倍柱体积的柠檬酸(pH2.7)洗脱。用pH8的Tris-HCL中和洗脱液。

(iii)最后将纯化的抗体用PBS 0.02％NaN₃透析。

完整的HER2受体包括，靠近细胞膜含有6个二硫桥的区域，图1中以半胱氨酸之间的连接线表示。CTF-611或SEQ ID NO：1序列的截短形式仅含5个半胱氨酸，以证实它们之间形成的二硫桥用以稳固该截短形式的同型二聚体(homodimers)。整体上从图4中可知，靠近SEQID NO：1截短形式的细胞膜区域与完整的HER2受体中抗原区域不同。据此，根据前述内容可知可进行差别检测。

输入(input)中不同HER2亚型的定量，根据标准化的HER2量免疫沉淀CB11及抗-611-B列于下表：

	Input	CB11	Anti-611-B
				HER2	1	1	1
611-CTF	1.47	1.27	23.20

648-CTF

1.53

2.76

2.4

用ImageJ 1.38进行定量。

实施例3：用直接作用于由SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3定义的新的抗原表位的单克隆抗体检测序列SEQ ID NO：1的HER2片段的存在。

用实施例2中SEQ ID NO：4的相同多肽，得到单克隆抗体。在所有的这些单克隆抗体中，20F4由登录号为DSM ACC2904的杂交瘤细胞系制备，单克隆抗体32H2由登录号为DSM ACC2980的杂交瘤细胞系制备。用所述抗体得到的结果显示于图5中。

以实施例2中相似的方法，用表达HER2受体完整形式或CTF-611截短形式或p95截短形式的MCF7细胞裂解提取物(之前用图1的结构转化)的1∶1∶1混合物进行SDS电泳和Western转移，在图5A中，Western膜表明CB11或单克隆抗体20F4及32H2的结果，后者特异性识别对应于SEQ ID NO：1的CTF-611受体的HER2截短形式，，而不能检测与所述受体完整形式的交叉反应，这表明它精确识别包含CTF-611受体形式N-末端上的一级氨基的新的抗原表位(neo-epitope)。

以相似的方法，与用抗体CB11(其识别受体的细胞质功能域)相比，当用单克隆抗体20F4及32H2进行免疫沉淀试验时，检测到单克隆抗体直接作用于SEQ ID NO：3的多肽，专一沉淀受体的截短形式(CTF-611)。这些结果在图5B中清楚地显示。图中，显示了以抗体20F4、32H2及CB11进行免疫沉淀试验得到的结果加样，进行SDS电泳及Western转移的结果。

对应于抗体20F4及32H2的免疫沉淀条带，仅能区分CTF-611截短形式的糖基化及非糖基化形式的条带。即，抗体20F4及32H2不免疫沉淀HER2受体的完整形式。因此，可知抗体20F4及32H2对CTF-611具有高度特异性，不识别HER2受体完整形式，表明它可用于区分和高度选择性地检测表达于分离的肿瘤组织样本中的HER2受体的具体形式。

直接作用于611-CTF序列N-端32个氨基酸长度的单克隆抗体的特征表明抗原表位的存在，其在全长HER2中隐藏(masked)，但在611-CTF中暴露。这些抗原表位隐藏在可溶分子及完整细胞中。CB11、32H2及20F4中不同HER2亚型的定量，根据标准化的HER2量通过免疫沉淀列于下表：

	CB11	32H2	20F4
				HER2	1	1	1
611-CTF	1.01	343.50	1302.19
				648-CTF	0.79	nd	nd

实施例4：通过流式细胞术分析作用于611-CTF N-端的单克隆抗体的特征

(A)用不同浓度的作用于多肽MPIWKFPDEEGASQPSPINSTHSSVDLDDKGC(见图1)的单克隆抗体32H2，通过流式细胞术分析表达HER2、611-CTF或648-CTF的MCF7细胞。见图6(A)。

(B)对(A)中两个单独试验的结果进行定量并显示平均值。见图6(B)。

(C)用标明的抗体通过间接免疫荧光反应，在共聚焦显微镜分析表达HER2、611-CTF或648-CTF的MCF7细胞。使用Invitrogen(A110011)的Alexa Fluor 488羊抗鼠IgG作为荧光基团偶联的二级抗体。在无32H2血清但存在二级抗体(“2ary”)的条件下进行FACS以检测非特异结合，作为阴性对照。

结论：抗体32H2识别的抗原表位暴露于表达611-CTF的肺细胞中，但隐藏于表达HER2的肺细胞中。

实施例5：通过免疫组织化学分析作用于611-CTF N-端的单克隆抗体的特征

用作用于HER2细胞质功能域的CB11或两个独立的由多肽MPIWKFPDEEGASQPSPINSTHSSVDLDDKGC产生的抗-611-CTF抗体对表达HER2、611-CTF或648-CTF的MCF7细胞进行免疫细胞化学染色(见图1)。结果显示于图7中。

结论：通过免疫组织化学分析，抗体20F4和32H2识别的抗原表位暴露于表达611-CTF的细胞中。相比之下，采用相同技术判定这些抗原表位隐藏于全长HER2分子中。该结果表明免疫组织化学是临床中最常规选择的检测技术。

实施例6：作用于611-CTF N-端的单克隆抗体识别的抗原表位特征

(A)图示表明611-CTF近膜区的一级序列。图中表示出该分子的N-端和C-端。跨膜区及激酶功能域分别用虚线及灰色的盒子标明。图示表明不同的缺失结构序列。见图8(A)。

(B)裂解用从图示氨基酸开始编码的cDNA缺失结构瞬时转染MCF-7细胞。细胞裂解物用作用于HER2细胞质功能域的CB11或两个独立的由多肽MPIWKFPDEEGASQPSPINSTHSSVDLDDKGC产生的单克隆抗-611-CTF抗体进行蛋白质印迹分析。见图8(B)。

结论：由抗体32H2和20F4识别的抗原表位含有或至少覆盖序列MPIWKFPDEEC.。

实施例7：用作用于611-CTF N-端的单克隆抗体或Herceptest^TM分析人乳腺癌样本

(A)用Herceptest^TM进行荧光原位杂交或蛋白质印迹，分析样本中HER2的表达。图中所示为蛋白质印迹判定的样本中表达的可检测水平的HER2C端片段(p95)(见(Scaltriti，M.，Rojo，F.，Ocana，A.，Anido，J.，Guzman，M.，Cortes，J.，Di Cosimo，S.，Matias-Guiu，X.，Ramon yCajal，S.，Arribas，J.，and Baselga，J.(2007)J Natl Cancer Inst 99(8)，628-638))。见图9(A)。

(B)用由多肽MPIWKFPDEEGASQPSPINSTHSSVDLDDKGC产生的单克隆抗-611-CTF抗体，32H2或用能使HER2细胞质功能域染色的Herceptest^TM对(A)中相同的乳腺癌样本进行免疫细胞化学染色。见图9(B)。

结论：通过免疫组织化学分析之前由蛋白质印迹判定的以抗体32H2染色人乳腺癌样本表达的可检测水平的CTFs。

实施例8：建立动物模型对体内CTF表达的效果进行表征

用仪器检测小鼠模型以确定潜在的致癌性急HER2在肿瘤发展中的相关性。为了进一步确定它的潜在致癌性，我们建立在鼠乳瘤病毒长末端重复序列(其在乳腺中表现活跃)控制下表达611-CTF的转基因(TG)小鼠。尽管该细胞模型表明可溶性胞内CTFs是无活性的，为了进一步研究这些片段表达的结果，我们还建立了表达687-CTF的TG动物。作为对照，我们使用经典的及特征清楚的模型表达野生型HER2(即鼠神经，rat neu)。

在7周龄，表达于TG 611杂合系F3和F2的611-CTF水平分别与内源HER2的水平相等以及为内源HER2的水平的三分之一，然而F1的水平低于检测阈值。建立的纯合系中687-CTF的水平范围是，分别为TG687系F2和F1中HER2水平的两倍至一半。

7周龄TG动物的乳腺没有观察到肉眼可见的异常。然而，全封片的品红染色形态学检测表明TG 611小鼠的树状乳管中增生异常。尽管不明显，TG 611小鼠的全部三个系中出现相似的异常。相比之下，TG687小鼠的腺体与那些野生型小鼠相比不明显。

实施例9：611-CTF的表达导致恶性乳腺瘤的发展

尽管TG HER2小鼠中增生更明显，TG 611动物的三个系在每只动物的肿瘤数量、肿瘤生长及肿瘤发生方面，具有更多的侵袭性肿瘤。

乳腺

(通过每周触诊监测乳腺肿瘤的外观。)

即使一年后，也没在TG 687动物中观察到肿瘤或异常。

肿瘤组织学分析表明HER2同样诱导TG 611小鼠中典型的侵袭性固体结节状癌(invasive solid nodular carcinomas)。由HER2和611-CTF引发的肿瘤的组织学之间的不同仅在于，TG 611小鼠中有丝分裂成像的数量更高。

如前所述，TG HER2小鼠引发肺部转移。在检测到肿瘤3～6周后，约四分之一的TG HER2动物肺部可检测到肿瘤结节：

(触诊检测到肿瘤后3～6周后处死小白鼠，通过免疫组织化学监测转移的情况。)

肺部转移的组织学分析证实了HER2的表达，且用细胞角蛋白18染色证实了细胞来自初级肿瘤。检测到的表达611-CTF肿瘤转移的动物数量比表达TG HER2的两倍还多。这表明由CTF引发的肿瘤更倾向于侵入肺部。

序列表

SEQ ID NO：1

Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln Pro Cys

1 5 10 15

Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys Gly Cys

20 25 30

Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr Ser Ile Val Ser Ala Val

35 40 45

Val Gly Ile Leu Leu Val Val Val Leu Gly Val Val Phe Gly Ile Leu

50 55 60

Ile Lys Arg Arg Gln Gln Lys Ile Arg Lys Tyr Thr Met Arg Arg Leu

65 70 75 80

Leu Gln Glu Thr Glu Leu Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly Ala Met

85 90 95

Pro Asn Gln Ala Gln Met Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Leu Arg Lys

100 105 110

Val Lys Val Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys Gly Ile

115 120 125

Trp Ile Pro Asp Gly Glu Asn Val Lys Ile Pro Val Ala Ile Lys Val

130 135 140

Leu Arg Glu Asn Thr Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu Asp Glu

145 150 155 160

Ala Tyr Val Met Ala Gly Val Gly Ser Pro Tyr Val Ser Arg Leu Leu

165 170 175

Gly Ile Cys Leu Thr Ser Thr Val Gln Leu Val Thr Gln Leu Met Pro

180 185 190

Tyr Gly Cys Leu Leu Asp His Val Arg Glu Asn Arg Gly Arg Leu Gly

195 200 205

Ser Gln Asp Leu Leu Asn Trp Cys Met Gln Ile Ala Lys Gly Met Ser

210 215 220

Tyr Leu Glu Asp Val Arg Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn

225 230 235 240

Val Leu Val Lys Ser Pro Asn His Val Lys Ile Thr Asp Phe Gly Leu

245 250 255

Ala Arg Leu Leu Asp Ile Asp Glu Thr Glu Tyr His Ala Asp Gly Gly

260 265 270

Lys Val Pro Ile Lys Trp Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu Arg Arg Arg

275 280 285

Phe Thr His Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val Trp Glu

290 295 300

Leu Met Thr Phe Gly Ala Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala Arg Glu

305 310 315 320

Ile Pro Asp Leu Leu Glu Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro Pro Ile

325 330 335

Cys Thr Ile Asp Val Tyr Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met Ile Asp

340 345 350

Ser Glu Cys Arg Pro Arg Phe Arg Glu Leu Val Ser Glu Phe Ser Arg

355 360 365

Met Ala Arg Asp Pro Gln Arg Phe Val Val Ile Gln Asn Glu Asp Leu

370 375 380

Gly Pro Ala Ser Pro Leu Asp Ser Thr Phe Tyr Arg Ser Leu Leu Glu

385 390 395 400

Asp Asp Asp Met Gly Asp Leu Val Asp Ala Glu Glu Tyr Leu Val Pro

405 410 415

Gln Gln Gly Phe Phe Cys Pro Asp Pro Ala Pro Gly Ala Gly Gly Met

420 425 430

Val His His Arg His Arg Ser Ser Ser Thr Arg Ser Gly Gly Gly Asp

435 440 445

Leu Thr Leu Gly Leu Glu Pro Ser Glu Glu Glu Ala Pro Arg Ser Pro

450 455 460

Leu Ala Pro Ser Glu Gly Ala Gly Ser Asp Val Phe Asp Gly Asp Leu

465 470 475 480

Gly Met Gly Ala Ala Lys Gly Leu Gln Ser Leu Pro Thr His Asp Pro

485 490 495

Ser Pro Leu Gln Arg Tyr Ser Glu Asp Pro Thr Val Pro Leu Pro Ser

500 505 510

Glu Thr Asp Gly Tyr Val Ala Pro Leu Thr Cys Ser Pro Gln Pro Glu

515 520 525

Tyr Val Asn Gln Pro Asp Val Arg Pro Gln Pro Pro Ser Pro Arg Glu

530 535 540

Gly Pro Leu Pro Ala Ala Arg Pro Ala Gly Ala Thr Leu Glu Arg Ala

545 550 555 560

Lys Thr Leu Ser Pro Gly Lys Asn Gly Val Val Lys Asp Val Phe Ala

565 570 575

Phe Gly Gly Ala Val Glu Asn Pro Glu Tyr Leu Thr Pro Gln Gly Gly

580 585 590

Ala Ala Pro Gln Pro His Pro Pro Pro Ala Phe Ser Pro Ala Phe Asp

595 600 605

Asn Leu Tyr Tyr Trp Asp Gln Asp Pro Pro Glu Arg Gly Ala Pro Pro

610 615 620

Ser Thr Phe Lys Gly Thr Pro Thr Ala Glu Asn Pro Glu Tyr Leu Gly

625 630 635 640

Leu Asp Val Pro Val

645

SEQ ID NO：2

Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln Pro Cys

1 5 10 15

Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys Gly Cys

20 25 30

Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr

35 40

SEQ ID NO：3

Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln Pro Cys

1 5 10 15

Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys Gly Cys

20 25 30

SEQ ID NO：4

Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Ser Gln Pro Ser

1 5 10 15

Pro Ile Asn Ser Thr His Ser Ser Val Asp Leu Asp Asp Lys Gly Cys

20 25 30

SEQ ID NO：5

Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Ser

1 5 10

序列说明

SEQ ID NO：1人HER2蛋白的截短形式或C端片段(CTF)

SEQ ID NO：2人HER2蛋白截短形式的抗原表位

SEQ ID NO：3人HER2蛋白截短形式的抗原表位

SEQ ID NO：4由人HER2蛋白截短形式抗原表位合成的多肽

SEQ ID NO：5由人HER2蛋白截短形式抗原表位合成的多肽

Claims

1.识别HER2受体截短形式抗原表位的抗体或其片段，所述抗原表位由SEQ ID NO：2包含的序列限定。

2.根据权利要求1所述的抗体或其片段，其中所述抗原表位由SEQ ID NO：3包含的序列限定。

3.根据权利要求1或2所述的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段适于将SEQ ID NO：1所示的蛋白与HER2受体区别开来。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段适于将SEQ ID NO：1所示的蛋白与HER2受体截短形式648-CTF/p95上区别开来。

5.根据权利要求3或4所述的抗体或其片段，其中可以通过免疫荧光、流式细胞术、培养细胞中的免疫组织化学和患者样本中的免疫组织化学中的一种或多种将所述区别可视化。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的抗体或其片段，其为多克隆抗体。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的抗体或其片段，其为单克隆抗体或其片段。

8.根据权利要求7所述的抗体或其片段，其是由保藏于DSMZ(德国微生物菌种保藏中心)的保藏号为DSM ACC2904的杂交瘤细胞系或保藏号为DSMACC2980的杂交瘤细胞系制备得到的。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的抗体或其片段，其中所述片段选自由F(ab)、F(ab’)和Fv组成的组。

10.制备权利要求7或8所述单克隆抗体的杂交瘤细胞。

11.制备权利要求1-9中任一项所述抗体的方法，包括用SEQ IDNO：3或SEQ ID NO：4所示序列的肽进行免疫接种，其任选地与免疫原结合。

12.根据权利要求11所述的用于获得单克隆抗体的方法，其中权利要求10所述的杂交瘤细胞系在适当的培养基中生长，且单克隆抗体可从该培养基中回收得到。

13.由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5组成的分离肽。

14.一种癌症诊断的方法，其包括检测患者样本中由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的HER2受体截短形式的存在。

15.根据权利要求14所述的方法，其中采用独立选自下组的方法进行检测：

(i)通过由SEQ ID NO：1组成的HER2受体截短形式相对于所述HER2受体的完整形式的差速迁移进行检测；以及

(ii)通过与权利要求1-12中任一项所述的一个或多个抗体相结合进行检测。

16.根据权利要求14或15所述的方法，其为预测肿瘤生长和/或转移发展的方法。

17.权利要求1-9任一项所述抗体或其片段的应用，其用于从分离的样本中诊断和预后检测表达HER2受体的癌症。

18.用于从分离的样本中诊断和预后检测表达HER2受体或其截短形式类型癌症的试剂，其至少含有一种权利要求1-9任一项所述的抗体或其片段。

19.根据权利要求18所述的用于诊断的试剂，其中抗体或其片段设置在固体支持物上。

20.用于从分离的样本中诊断和预后检测表达HER2受体或其截短形式类型癌症的试剂盒，其包括用于检测样本中由SEQ ID NO：1组成的HER2受体截短形式存在的装置。

21.根据权利要求20所述的用于诊断和预后检测的试剂盒，其中所述检测装置至少含有一种权利要求19或20所述的试剂。

22.根据权利要求20所述的用于诊断和预后检测的试剂盒，其中所述检测装置通过如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的HER2受体截短形式相对于所述HER2受体的完整形式的差速迁移进行检测。

23.用于治疗的权利要求1-9中任一项所述的抗体或其片段。

24.根据权利要求23所述的抗体或其片段，其用于治疗或预防至少表达由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的HER2受体截短形式的癌症。

25.根据权利要求23或24所述的抗体或其片段，其用于治疗或预防哺乳动物，包括人的乳腺癌。

26.根据权利要求23-25中任一项所述的抗体或其片段，其用于治疗或预防选自下组的癌症：肺癌、胰腺癌、大肠癌、胃癌、前列腺癌、头颈部癌、皮肤癌、肾癌、睾丸癌、甲状腺癌、膀胱癌、子宫癌、阴道癌、子宫内膜癌、卵巢癌、食道癌、口腔癌、唾液腺癌、喉癌、腹膜癌、鼻癌和喉癌、输卵管癌、肾母细胞癌、淋巴癌，以及秋千肉瘤、滑膜肉瘤、髓母细胞瘤、滋养层细胞瘤、胶质瘤、成胶质细胞瘤、胆管癌、胆脂瘤、软骨肉瘤、室管膜瘤、神经鞘瘤、神经瘤、横纹肌肉瘤。

27.权利要求1-9中任一项所述的抗体或其片段在生产用于治疗癌症的药物中的应用。

28.用于治疗至少表达由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的HER2受体截短形式的癌症的药物组合物，其特征在于，所述组合物含有权利要求1-9任一项所述的抗体或其片段和至少一种药用赋形剂和/或载体。