EA025218B1 - Способ диагностики злокачественных новообразований, экспрессирующих рецептор her2 или его укороченные варианты - Google Patents

Способ диагностики злокачественных новообразований, экспрессирующих рецептор her2 или его укороченные варианты Download PDF

Info

Publication number
EA025218B1
EA025218B1 EA201001874A EA201001874A EA025218B1 EA 025218 B1 EA025218 B1 EA 025218B1 EA 201001874 A EA201001874 A EA 201001874A EA 201001874 A EA201001874 A EA 201001874A EA 025218 B1 EA025218 B1 EA 025218B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
hek2
receptor
antibody
antibodies
sequence
Prior art date
Application number
EA201001874A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201001874A1 (ru
Inventor
Хоакин Аррибас Лопес
Ким Педерсен
Пьер-Давиде Анджеллини
Хосеп Льюйс Парра Палау
Сирле Лаос
Хосе Басельга Торрес
Original Assignee
Фундасио Привада Институт Де Ресерка Оспиталь Университари Валь Эброн
Фундасио Привада Институсио Каталана Де Ресерка И Эстудис Аванкатс
Фундасио Привада Институт Д'Инвестигасио Онкольохика Де Валь Эброн
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Фундасио Привада Институт Де Ресерка Оспиталь Университари Валь Эброн, Фундасио Привада Институсио Каталана Де Ресерка И Эстудис Аванкатс, Фундасио Привада Институт Д'Инвестигасио Онкольохика Де Валь Эброн filed Critical Фундасио Привада Институт Де Ресерка Оспиталь Университари Валь Эброн
Publication of EA201001874A1 publication Critical patent/EA201001874A1/ru
Publication of EA025218B1 publication Critical patent/EA025218B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3015—Breast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/71—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for growth factors; for growth regulators

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение относится к способу диагностики и терапии злокачественных новообразований, экспрессирующих рецептор HER2. Изобретение обеспечивает антитела или их фрагменты, которые распознают эпитоп укороченной формы рецептора HER2, где указанный эпитоп определяется последовательностью, включенной в SEQ ID NO: 2. Изобретение также обеспечивает способ диагностики злокачественных новообразований в образце пациента, который содержит обнаружение наличия укороченной формы рецептора HER2, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1.

Description

Настоящее изобретение относится к способу диагностики в выделенных образцах злокачественных новообразований, экспрессирующих рецептор НЕК2. Изобретение также обеспечивает соединения для применения при ранней диагностике и для выявления злокачественного новообразования, а также для применения в терапии.
Предшествующий уровень техники
НЕК2 (также известный как с-егЬВ2, ЕгЬВ2 или Ией) является трансмембранным белком I типа, принадлежащим к семейству рецептора эпидермального фактора роста или ЕСРК (ерШегта1 8го\\!Н Гас!ог гесер!ог), также известному как НЕК1 или ЕгВ-1. Два дополнительных члена, НЕК3 и НЕК4, завершают это семейство. При связывании НЕК 1, 3 или 4 с лигандом ЕОР-типа его внеклеточный домен принимает конформацию, которая называется открытой, что приводит к образованию гомодимеров и гетеродимеров. НЕК2 также взаимодействует с другими рецепторами НЕК, связанными с лигандом, даже если НЕК2 не связан с каким-либо лигандом, из-за того, что его внеклеточный домен конститутивно находится в открытой конформации.
Димеризация, регулируемая внеклеточным доменом, приводит к взаимодействию внутриклеточных киназ рецепторов НЕК и к последующему трансфосфорилированию некоторых остатков тирозина. Эти фосфотирозины действуют в качестве соединительного звена для группы внутриклеточных фосфотирозин-связывающих белков. Взаимодействия, адаптированные на плазматической мембране, трансдуцируются в ядро клетки посредством различных сигнальных путей, таких как протеинкиназный путь, активируемый митоген-активированной протеинкиназой (МАРК), стресс-активированный протеинкиназный путь (1ΝΚ), путь, путь, активируемый фосфолипазой С гамма, и т.д. Все эти сигнальные цепи контролируют экспрессию генов, которые согласованно действуют при модификации определенных аспектов состояния клетки, таких как клеточная пролиферация, миграция, выживание и адгезия. Таким образом, в зависимости от клеточного контекста, активация рецепторов НЕК приводит к драматическому клеточному ответу, который может колебаться в пределах от трансформации в злокачественную клетку до преждевременного старения.
В дополнение к каноническому сигнальному режиму, рецепторы НЕК или их фрагменты могут быть подвергнуты эндоцитозу и переносу в ядро, где они могут напрямую регулировать экспрессию некоторых генов. Данный факт наблюдался в специфическом случае для НЕК2 (\Уапд е! а1., Вшбшд а! апб !гап8асйуайоп оГ (Не СОХ-2 ргото!ег Ьу пис1еаг !уго8ше ките гесер!ог ЕгЬВ-2, Сапсег Се11-2004, Уо1. 6, рр. 251-261), а также для С-концевых фрагментов (СТР), состоящих из укороченной формы рецептора НЕК4, и включающих полную цитоплазматическую часть (Ыпдщ е( а1., ЕгЬВ-4 880 1п!гасе11и1аг боташ аЬгода(С8 ЕТ02-берепбеп! !гаи8спрйопа1 герге88юп, 1. Вю1ощса1 Сйет18!гу-2006. уо1. 281, рр. 2537325380).
В опухолях молочной железы человека часто находили серии С-концевых фрагментов или СТР, которые как предполагается, включают трансмембранные и цитоплазматические домены НЕК2. (Мойпа е( а1, ИН(2)-!егтша1 (гипса(еб НЕК2 рго!еш Ьи( по! ГиПчепфН гесер!ог 18 а88ос1а!еб \νί(1ι поба1 те!а8!а818 ш Нитап Ьгеа8! сапсег, Сйтса1 Сапсег Ке8еагсН-2002, Уо1. 8, рр. 347-353). Также известно, что пациенты, у которых при раке молочной железы экспрессируются НЕК2 СТР, или, что тоже самое, укороченные формы, не включающие Ν-концевой фрагмент НЕК2 (НЕК2 СТР), имеют большую вероятность развития метастазов (Мойпа е! а1., 2002 - выше) и более плохой прогноз, чем те пациенты, у которых экспрессируется главным образом полноразмерная форма НЕК2 (8ае/ е! а1., р95НЕК2 ргебю!8 \уог8е ои!соте ш райеп!8 νί!Η НЕК2-ро81Йуе Ьгеа8! сапсег, Сйтса1 Сапсег Ке8еагсй-2006, уо1. 12, рр. 424-431).
Следовательно, очень важно иметь своевременную возможность определения наличия НЕК2 в опухолях и даже больше, важно иметь возможность определения находится ли рецептор в полноразмерной или укороченной (СТР) форме.
В настоящее время, на уровне клинических тестов применяются антитела для определения наличия полноразмерной формы НЕК2, в целях определения типа обсуждаемого рака молочной железы, и в случае обнаружения наличия НЕК2, рекомендуемая терапия состоит из введения терапевтических моноклональных антител, таких как трастузумаб (4га8Ц.1/итаЬ) от Оепеп!есй. Применение моноклонального антитела для лечения злокачественного новообразования описывается в заявке \УО 8906692, принадлежащей Оепеп!есй. В \УО 8906692 описываются моноклональные или поликлональные антитела, направленные против внеклеточной области НЕК2, и этот внеклеточный домен совпадает с полной внешней частью белка, которая является его Ν-концевой частью. Как упоминалось выше, распознаваемые антителами эпитопы, цитируемые в \УО 8906692, являются антигенными областями внеклеточного домена полноразмерной формы НЕК2 и не включены в укороченные формы или С-концевые фрагменты НЕК2. Следовательно, с помощью антител и способа диагностики, описанных в \УО 8906692, будет невозможно обнаружить наличие укороченного НЕК2 (СТР). Также в новообразованиях молочной железы, экспрессирующих указанные СТР НЕК2, антитела, такие как трастузумаб, не являются терапевтическими, поскольку они не распознают какой-либо эпитоп. Этот факт объясняет устойчивость к лечению трастузумабом!, которая наблюдается у пациентов с экспрессией укороченных форм НЕК2 (СТР).
Пациенты, у которых экспрессируются укороченные формы НЕК2 или СТР, должны подвергаться
- 1 025218 лечению альтернативной терапией в целях предотвращения множества плохих прогнозов, наблюдавшихся 8ае/ с1 а1., 2006 (выше). В целях как можно более быстрого обнаружения (диагностирования) и лечения людей с новообразованиями, в которых экспрессируется укороченная форма НЕР2, особый интерес для дальнейших действий вызывает способность различать, какая форма НЕР2 экспрессируется.
В работе Άηίάο с1 а1., ВюууШЬеыз οί Енпопдешс НЕР2 С-1сгтта1 ГгадтеШз Ьу айетайуе ίηίΐίαΐίοη οί ΐΗΐηδΕιΙίοη, Еигореап Мо1еси1аг Вю1оду Огдаш/айон (ЕМВО) 1оита1 - 2006, Уо1. 25, рр. 3234-3244, дается описание того, что в дополнение к фрагменту, образуемому действием альфа-секретаз на НЕР2, в результате которого образуется укороченная форма (СТР), известная как Р95, которая включает трансмембранный и цитоплазматический фрагменты рецептора, также посредством механизма альтернативной инициации трансляции образуются две укороченные формы (СТР), начинающиеся с двух метионинов, расположенных выше и ниже, соответственно, трансмембранного домена НЕР2. В частности, метионины для альтернативной инициации трансляции соответствуют метионину 611 и метионину 687 аминокислотной последовательности с учетным номером М11730.1 в базе ишОепе Национального центра биотехнологической информации (ΝΟΒΙ). Данный документ также демонстрирует, что эти альтернативные формы рецептора НЕР2 (СТР) присутствуют в опухолях молочной железы, в частности, указывает на то, что наиболее распространенная форма соответствует форме известной как СТР687, или, другими словами, белку, полученному альтернативной инициацией трансляции, которая начинается с метионина в позиции 687. Άηίάο е1 а1., для терапии предлагают применение ингибиторов тирозинкиназной активности НЕР2, таких как лапатиниб, в целях минимизации роста новообразований, экспрессирующих эти укороченные формы НЕР2. Ингибиторы тирозинкиназ действуют путем взаимодействия с С-концевой частью рецептора НЕР2, которая присутствует интегральным образом, как полноразмерном рецепторе, так и в СТР полученных из него, или продуцируемых альтернативной инициацией трансляции.
Работа 8са11тШ е1 а1., Е.хргезыон οί р95НЕК2, а ΐ^иηсаΐеά Гогт οί 1Не НЕР2 РесерЮг, анб тезроще Ю ай1-НЕК2 1йетар1е8 ίη Ьтеаз! сансег, 1оита1 οί №Ьона1 С.’ансег 11-151111.1^-2007, νο1. 99, рр. 628-368 представляет собой пример исследования с использованием альтернативной методологии для обнаружения наличия одной из укороченных форм рецептора НЕР2 и перечисляет некоторые из возможных причин устойчивости к обработке трастузумабом (герцептином). В частности, подчеркивается, что накопление фрагмента р95НЕР2 (продукта протеолиза НЕР2 альфа-секретазами) и других укороченных форм рецептора, не имеющих внеклеточного домена, распознаваемого трастузумабом. Для обнаружения фрагмента р95НЕР2 (продукта протеолиза альфа-секретазами) ЗсаИгШ предлагает способ иммунофлюоресценции. Этот новый способ обнаружения может быть проведен на срезах ткани, залитой в парафин и фиксированной формалином с последующими клиническими протоколами. Новая методология возникает из наблюдения, заключающегося в том, как в плазматической мембране, так и в цитоплазме клетки расположена укороченная форма р95НЕК2, а не полноразмерная форма рецептора. Данный способ предлагает сравнить есть ли экспрессия р95НЕР2 посредством окрашивания детектируемой цитоплазмы с помощью анти-НЕК2, антитела, которое связывает цитоплазматический домен рецептора; и подтвердить эти результаты результатами детекции антителами против цитокератина, белка, чье распределение широко применяется как инструмент диагностики злокачественных новообразований. Однако не ясно эффективно ли данный способ отличает те злокачественные новообразования, которые экспрессируют полноразмерную форму НЕР2, от тех, что экспрессируют укороченные формы.
Существует необходимость в поиске новых и эффективных мишеней для диагностики и терапии, хорошо коррелирующих с типом обсуждаемого злокачественного новообразования, которые сделают возможным своевременное лечение с помощью эффективных терапий тех злокачественных новообразований, которые обладают наихудшим прогнозом, отбрасывая с самого начала те терапии, которые рассматривались как неэффективные.
Настоящее изобретение предлагает полезные результаты, связанные с приведенными выше проблемами, и представляет собой новое решение в области ранней классификации злокачественных новообразований, особенно рака молочной железы.
Сущность изобретения
Было установлено, что наличие одной из укороченных форм (СТР) НЕК2, образованных посредством альтернативной инициации трансляции, очень хорошо коррелирует с прогнозом типа подвергаемого лечению злокачественного образования, что упрощает задачу врачу на момент назначения курса лечения. Эта укороченная форма НЕР2 (СТР-611) была определена и ее последовательность, 8ЕО ГО N0:1, была установлена.
Данную последовательность применили для разработки нескольких инструментов для обнаружения ее наличия в образцах тканей, что, таким образом, обеспечило новый и надежный диагностический набор, который также является применимым в клинической практике.
Настоящее изобретение также обеспечивает новые антитела, или их фрагменты, которые распознают эту укороченную форму НЕР2 или СТР, которая не распознается трастузумабом. Эти антитела распознают эпитоп, который определяется последовательностью, включенной в 8Е0 ГО N0:2. Изобретение также обеспечивает гибридомные клеточные линии, подходящие для продуцирования антител. Доступ- 2 025218 ные в настоящее время анти-НЕР2 антитела распознают СТР и НЕР2 или только НЕР2, что делает очень трудным процесс различения пациентов с экспрессией только НЕР2, и пациентов с экспрессией НЕР2 и СТР. В отличие от доступных антител анти-НЕР2, антитела, описанные в данном документе, предпочтительно связывают СТР-611, что позволяет идентифицировать пациентов с экспрессией этого СТР.
Настоящее изобретение также относится к способу диагностики злокачественных новообразований в образцах пациентов, который включает обнаружение наличия в указанном образце укороченной формы рецептора НЕР2, состоящей из последовательности 8ЕЦ ГО N0: 1.
Настоящее изобретение также обеспечивает применение антитела или его фрагмента настоящего изобретения для диагностики и определения прогноза в выделенном образце злокачественного новообразования, в котором экспрессируется рецептор НЕР2.
Настоящее изобретение дополнительно обеспечивает средство диагностики и определения прогноза в выделенных образцах злокачественных новообразований, в которых экспрессируется рецептор НЕР2 и/или С-концевые фрагменты, которое содержит по меньшей мере одно антитело или его фрагмент, как описано выше.
Настоящее изобретение также обеспечивает набор для диагностики и определения прогноза в выделенных образцах злокачественных новообразований, экспрессирующих рецептор НЕР2, который содержит средства для обнаружения наличия в указанном образце укороченной формы рецептора НЕР2, состоящей из последовательности 8ЕЦ ГО N0: 1.
Изобретение также обеспечивает антитело или его фрагмент, описанные выше, для применения в терапии или при изготовлении лекарственного средства. В частности, лекарственное средство для лечения или для профилактики злокачественных новообразований, в которых экспрессируется, по меньшей мере, укороченная форма рецептора НЕР2, состоящая из последовательности 8ЕЦ ГО N0: 1.
В соответствии с другим аспектом изобретения рассматривается применение антител или фрагментов для изготовления лекарственного средства для лечения или для профилактики рака молочной железы у млекопитающих, включая людей.
Другой объект настоящего изобретения заключается в фармацевтической композиции для лечения злокачественных новообразований, в которых экспресеируется, по меньшей мере, укороченная форма рецептора НЕР2, состоящая из последовательности 8ЕЦ ГО N0: 1, которая содержит антитело или его фрагмент, описанные выше, и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый инертный наполнитель и/или носитель.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1: Схема белковой последовательности укороченной формы СТР-611, приведенная в сравнении с последовательностью полноразмерного рецептора НЕР2 и с укороченной формой, известной как р95 (648-СТР/р95), продуктом протеолиза альфа-секретазами. Трансмембранный домен представлен в виде спирали. Оставшаяся часть молекулы обозначена серым прямоугольником. Последовательность пептида, использованного для образования моно- и поликлональных антител подчеркнута. Позиции внутримолекулярных дисульфидных мостиков также обозначены связями между цистеинами.
Фиг. 2: Электрофорез и вестерн-блоттинг (перенос на мембрану) образцов рака молочной железы. (8) означает растворимую фракцию, а (М) означает мембранную фракцию. В целях выявления полноразмерного НЕР2 и формы СТР-611, были использованы антитела, направленные на цитоплазматический домен белков. ЛДГ: Лактатдегидрогеназа (использовалась в качестве контроля).
Фиг. 3: Результаты оценки количества злокачественных новообразований, развившихся у трансгенных мышей, экспрессирующих укороченную форму СТР-611 (фиг. 3А) в сравнении с трангенными мышами, которые экспрессировали полноразмерный рецептор НЕР2; и результаты измерения объемов обнаруженных опухолей (фиг. 3В). По оси Υ, N и V обозначают количество (№ппЬсг) опухолей и объем (Уо1ише) опухолей, соответственно. По оси X, Т означает время (Тше) в неделях.
Фиг. 4: На фиг. 4А показан электрофорез и вестерн-блоттинг (перенос на мембрану), которые выявили цитоплазматический домен рецептора НЕР2 (общий домен во всех полноразмерных и укороченных формах), распознаваемый антителом (СВ11), или пептид с последовательностью 8ЕЦ ГО N0: 3 (альфа-611-А и альфа-611-8) распознаваемый с помощью образованных против него поликлональных антител. Треки соответствуют экстрактам лизатов клеток МСР7 (ранее трансформированных конструкциями фиг. 1), которые экспрессируют полноразмерную форму рецептора НЕР2, укороченную форму СТР-611 и укороченную форму р95. На фиг. 4В представлены результаты анализа иммунопреципитации с антителами α-611-А, α-611-В и СВ11, проводившихся на образцах, содержащих как полноразмерный рецептор НЕР2 так и укороченные формы СТР-611 и р95.
Фиг. 5: (А) Клетки МСР7, экспрессирующие НЕР2, 611 -СТР или 648-СТР, лизировали и анализировали посредством вестерн-блоттинга с помощью антитела СВ11 против цитоплазматического домена НЕР2, или с двумя независимыми моноклональными антителами анти-611-СТР против пептида МР1^КРРПЕЕОА8рР8РГН8ТН88’^ЬППКОС (см. фиг. 1). (В) Лизаты клеток МСР7, экспрессирующих НЕР2, 611 -СТР или 648-СТР, смешивали 1:1:1 и подвергали иммунопреципитации с указанными моноклональными антителами. Отмытые иммунопреципитаты анализировали вестерн-блоттингом с помощью антитела СВ11. В качестве отрицательного контроля проводили ложную иммунопреципитацию без анти- 3 025218 тела (-). (С) Клетки МСР7, экспрессирующие НЕК2, 611-СТР или 648-СТР, анализировали с помощью конфокального микроскопа посредством непрямой иммунофлюоресценции с указанными антителами.
Фиг. 6 (А) и (В): Определение характеристик одного моноклонального антитела проточной цитометрией.
Фиг. 7: Определение характеристик моноклональных антител иммуноцитохимией.
Фиг. 8: Определение характеристик эпитопов.
Фиг. 8(А): Схема, демонстрирующая первичную последовательность примебранной области 611СТР и последовательности различных конструктов, использованных для картирования эпитопов.
Фиг. 8(В) Вестерн-блоты.
Фиг. 9: Анализ образцов рака молочной железы.
Фиг. 9(А): Таблица аналитических результатов.
Фиг. 9(В): Иммуноцитохимическое окрашивание.
Подробное описание
СТР-611.
Как упоминалось ранее, авторы неожиданно обнаружили, что дифференциальное обнаружение указанной укороченной формы НЕК.2 5>ЕО ГО N0: 1 очень хорошо коррелирует с обнаружением в ткани молочной железы распространенного типа злокачественного новообразования с плохим прогнозом. Таким образом, на фиг. 3 показаны результаты оценки числа опухолей, развившихся в трансгенных мышах, экспрессировавших укороченную форму СТР-611 (5>Е0 ГО N0: 1).
Для получения результатов для данной фиг. 3 в эпителии молочной железы мышей экспрессировали конструкты с кДНК, где указанные конструкты кодировали человеческую последовательность 5>Е0 ГО N0: 1 (СТР-611), обозначенную в фигуре как М611-СТР. Данный конструкт содержит последовательность 5>Е0 ГО N0: 1 под контролем промотора вируса опухоли молочной железы мышей(ММТУ). В качестве контроля была использована мышиная линия РУВ/'Н-Тд(ММТУпси)2()2Т которая экспрессирует полноразмерную копию НЕК2, также под контролем промотора ММТУ. Из фиг. ЗА можно сделать умозаключение о том, что количество опухолей в мышах, экспрессирующих конструкт кДНК с формой СТР611 (5>Е0 ГО N0: 1), гораздо выше, чем количество опухолей в линии РУВ^-Тд(ММТУпеи)202.Г, обозначенной на этой фигуре меткой НЕК2/пеи. Новообразования в трансгенных животных, экспрессирующих СТР-611, обнаружили в возрасте 17 недель, что на три месяца раньше, чем первое обнаружение в мышах РУВ/К-Т8(ММТУпеи)2021. Данный факт объясняется большей агрессивностью новообразования, экспрессирующего фрагменты НЕК2, по сравнению с тем новообразованиями, экспрессирующими полноразмерную форму. На фиг. ЗВ также показано, что объем новообразований намного больше у животных с экспрессией укороченной формы СТР НЕК2 5>Е0 ГО N0: 1, по сравнению с животными, конститутивно экспрессирующими полноразмерный рецептор, также известный как НЕК2/пеи. Этот второй факт также объясняет большую агрессивность данного типа новообразований. Авторы также определили, что новообразования, экспрессирующие укороченную форму 5>Е0 ГО N0: 1, демонстрируют более высокий уровень метастазов в легких, по сравнению с количеством метастазов у новообразований, экспрессирующих НЕК2/пеи. Удостоверяющие клиническую значимость дополнительные эксперименты предоставлены в примере 9 ниже.
Все эти данные с трансгенными животными говорят о том, что дифференциальное обнаружение укороченной формы рецептора НЕК2 с 5>Е0 ГО N0: 1 по сравнению с полной формой рецептора весьма востребовано.
Очевидно, что указанная последовательность 5>Е0 ГО N0: 1 включает все варианты, которые получены из аллельных вариантов индивидуумов, и охватывает изменения в количестве и типе некоторых аминокислот, например, больше или меньше, чем двух или трех аминокислот, или охватывает не модифицирующей всю структуру рецептора замены аминокислоты другой аминокислотой.
Три укороченные формы НЕК2 могут содержать неоэпитопы, другими словами, новые антигенные детерминанты, отсутствующие в молекуле целого рецептора, что означает, что они не взаимодействуют тем же самым путем с молекулами (антителами, лекарственными средствами и т.п.), как это происходит в целом рецепторе.
Антитела к СТР-611.
Авторы способны произвести как поликлональные, так и моноклональные антитела против СТР611. Эти антитела распознают эпитоп, который определяется последовательностью, включенной в 5>Е0 ГО N0:2, предпочтительно последовательностью, включенной в 5>Е0 ГО N0: 3 или определенной ею. Наиболее предпочтительными являются антитела, которые распознают эпитоп, включенный в последовательность МР1^КРРИЕЕСА§ (5>Е0 ГО N0: 5) или определенный ею.
В контексте настоящего изобретения эпитоп понимается как часть макромолекулы пептидного типа (или часть антигена), чья последовательность и/или пространственная конфигурация распознаются иммунной системой (антителами, Т-клетками, В-клетками).
Антитела настоящего изобретения предпочтительно могут отличать белок с последовательностью 5>Е0 ГО N0:1 от рецептора НЕК2. Антитела настоящего изобретения предпочтительно могут отличать белок с последовательностью 5>Е0 ГО N0:1 от укороченной формы рецептора НЕК2 648-СТР/р95. Это
- 4 025218 отличие может быть визуализировано одним или несколькими методами: иммунофлюоресценцией, проточной цитометрией, иммуногистохимией в культивируемых клетках и иммуногистохимией в образцах пациентов. Особенно предпочтительным является то, что отличие может оцениваться количественно как с помощью проточной цитометрии, так и с помощью иммунопреципитации.
В соответствии с настоящим изобретением связывание антител настоящего изобретения с 611-СТР в эксперименте иммунопреципитации предпочтительно по меньшей мере в 300 раз, более предпочтительно по меньшей мере в 1000 раз, наиболее предпочтительно от 1000 до 2000 раз сильнее, чем его связывание с НЕК2, что подробно описано в примере 3 (при использовании 5 мкг 32Н2 и 5 мкг 20Р4).
Как отмечалось выше, антитела могут быть поликлональными или моноклональными.
По смыслу настоящего изобретения поликлональное антитело должно обозначать группу антител, продуцируемых различными линиями В-клеток (В-лимфоцитов). Поликлональные антитела являются смесями иммуноглобулинов, секретируемых против антигена (макромолекулы), при этом каждый из этих иммуноглобулинов способен распознать отдельный эпитоп, поскольку происходит из отдельной Вклетки. Таким образом, в различных популяциях иммуноглобулинов, содержащихся в поликлональном антителе, существует тип иммуноглобулина, который распознает эпитоп или эпитопы интереса специфического антигена.
Поликлональные антитела могут быть получены, например, конъюгацией пептида δΕΟ ГО N0: 2, δΕΟ ГО N0: 3, δΕΟ ГО N0: 4 или δΕΟ ГО N0: 5 с иммуногеном, таким как гемоцианин лимфы улитки и иммунизацией кроликов этим конъюгатом.
Моноклональные антитела могут быть получены с помощью того же или похожего иммуногена. Гибридомные клеточные линии могут быть получены специалистом известным способом. Гибридомная клеточная линия затем может быть выращена в подходящей культуральной среде, из которой выделяется моноклональное антитело.
В предпочтительном воплощении антитела продуцируются гибридомной клеточной линией, депонированной в 'ГОеШзсЫапй §атш1ип§ νοη МЖгоогдатктеп ипй 2с11ки11игсп ОтЬН -ΏδΜΖ под номером ΌδΜ АСС2904 в соответствии с Будапештским договором от 9 апреля 2008 г. или гибридомной клеточной линией, депонированной в Осп15еЫапй §атт1ип§ νοη МПаоогдапктсп ипй ΖοΙίΚπΙΙπΓοη ОтЬН ΌδΜΖ под номером ΌδΜ АСС2980 в соответствии с Будапештским договором от 6 ноября 2008 г.
Моноклональные антитела, полученные с помощью этих гибридомных клеточных линий, а также моноклональные антитела, которые, по меньшей мере, эквивалентны им, являются особенно предпочтительными. Функционально, по меньшей мере, эквивалентом являются антитела, которые отличают СТР611 от НЕК2 одинаково хорошо или даже лучше.
Эффективные антитела также включают гуманизированные и человеческие антитела.
Настоящее изобретение также обеспечивает выделенные полипептиды с последовательностями δΕΟ ГО N0: 2, δΕΟ ГО N0: 3, δΕΟ ГО N0: 4 или δΕΟ ГО N0: 5.
В соответствии с настоящим изобретением вместо полноразмерного антитела может быть использован его фрагмент. Фрагменты антител выбраны из группы, состоящей из Р(аЬ), Р(аЬ') и Ρν. В контексте настоящего изобретения к фрагменту антитела относится часть антитела, которая имеет достаточный размер и соответствующую структуру для связывания эпитопа, присутствующего в укороченной форме рецептора НЕК.2 и которая, таким образом, позволяет детектировать его в образце.
Примеры 2 и 3 демонстрируют конкретные антитела. Очевидно, что изобретение распространяется на другие поликлональные или моноклональные антитела, направленные против эпитопа укороченной формы СТР-611, определенной последовательностью δΕΟ ГО N0: 2, поскольку, на основании описания этого изобретения они могут быть напрямую получены специалистом. В равной степени, изобретение распространяется на фрагменты указанных антител, такие как Р(аЬ), Р(аЬ'), Ρν и т.д., или на любую гибридомную клеточную линию, способную продуцировать моноклональные I антитела, направленные против пептидов с последовательностями δΕΟ ГО N0:2 и δΕΟ ГО N0: 3.
Диагностические способы
В способе диагностики по изобретению обнаружение наличия укороченной формы рецептора НΕΚ2 может быть проведено с помощью средств, независимо выбранных из группы, содержащей обнаружение в системе мобильная фаза-станционарная фаза дифференциальной миграции укороченной формы рецептора ΚΕΚ2, состоящей из последовательности δΕΟ ГО N0: 1 по сравнению с полноразмерной формой указанного рецептора НΕΚ2; обнаружение путем связывания со специфическими антителами укороченной формы рецептора ЖК2, содержащей последовательность δΕΟ ГО N0:1.
Под обнаружением посредством дифференциальной миграции в контексте настоящего изобретения должен пониматься любой аналитический метод, который позволяет разделение детектируемых соединений на основе их различной подвижности в специфической системе мобильной фазы-стационарной фазы, такой как электрофорез. Такая различная подвижность может быть вызвана отличающимся электрическим зарядом соединения, отличающейся молекулярной массой или отличающимся сродством к другим соединениям.
Дифференциальное обнаружение может быть проведено с помощью известных специалисту в данной области аналитических методов, таких как белковый электрофорез, гель-фильтрация, тесты сродства
- 5 025218 антител, иммунофлюоресценция, иммуноцитохимия, иммуногистохимия, проточная цитометрия и т.п. Особенно предпочтительной является иммуногистохимия. Один или несколько из этих методов могут быть объединены для повышения надежности.
Дифференциальное обнаружение укороченной формы рецептора НЕК2, состоящей из последовательности 8ЕО ГО N0: 1, также называемой в данном изобретении СТР-611, относительно целого или полноразмерного рецептора НЕК2, предполагает способность визуализировать два белка с различными молекулярными массами и различными последовательностями, как на фиг. 1. Укороченная форма с последовательностью 8Е0 ГО N0: 1 состоит из белка, полученного альтернативной инициацией трансляции через метионин 611 полной последовательности рецептора НЕК2. Эта форма или СТР также содержит новый внеклеточный домен, трансмембранный фрагмент и цитозольный домен.
Трансмембранный фрагмент и цитозольный домен являются теми же самыми, что и у полноразмерной формы рецептора НЕК2. Другая укороченная форма соответствует форме, обозначенной на фиг. 1 как р95 или СТР-648. Эта последняя форма является продуктом действия на полноразмерный рецептор НЕК2 альфа-секретаз, которые отделяют большую часть внеклеточного домена.
В соответствии с другим воплощением изобретения стадия обнаружения наличия в образце укороченной формы рецептора НЕК.2, состоящей из последовательности 8Е0 ГО N0: 1, содержит обнаружение с помощью по меньшей мере одного антитела, как это определено выше. В конкретном воплощении способ диагностики в соответствии с изобретением содержит обнаружение эпитопа, определенного последовательностью 8Е0 ГО N0:3.
В одном воплощении изобретения антитела настоящего изобретения или их фрагменты применяются как средства диагностики и определения прогноза и либо несут метку непосредственно в их собственной пептидной последовательности (например, метятся с помощью радиоизотопов), либо несут метку опосредованно (например, метятся добавлением или связыванием с флуоресцентным агентом или агентом, способным производить флюоресценцию реакцией в выбранной реакционной среде), либо метятся всем вышеперечисленным с целью образования видимого сигнала, а по возможности количественного, с помощью которого определяется наличие в образце укороченной формы рецептора НЕК2, состоящей из последовательности 8Е0 ГО N0: 1.
Таким же образом для диагностического средства, содержащего, по меньшей мере, антитела, предполагается прикрепление последних к твердой подложке, непосредственное или опосредованное спейсером. Средство этого типа позволяет захватывать в образце форму с последовательностью 8Е0 ГО N0: 1 в целях определения ее наличия впоследствии с помощью других, неспецифических антител (таких как СВ11).
Средства диагностики и определения прогноза по изобретению также могут применяться в иммуногистохимических протоколах. Для этого (первичное или вторичное) моноклональные или поликлональные антитела должны быть надлежащим образом промаркированы для того, чтобы дать видимый сигнал, в лучшем случае с количественной оценкой, после вступления в контакт с тестируемой тканью и при осуществлении взаимодействия с белками, предназначенными для обнаружения, другими словами, с фрагментом СТР НЕК2 с последовательностью 8Е0 ГО N0: 1.
С целью облегчения для врача задачи анализа, диагностики и определения прогноза, предполагается, что диагностическое средство обеспечивается в форме набора, который кроме антител включает реактивы (например, реактивы, необходимые для иммуногистохимического окрашивания), буферы и растворы для обнаружения, адаптированные для определения в образце наличия укороченной формы с последовательностью 8Е0 ГО N0: 1, возможно, включает контрольные срезы, представляющие различные уровни экспрессии СТР-611 и также, возможно, детальные инструкции, помогающие врачу при постановке диагноза. Набор также содержит средства для проведения полуколичественного иммуногистохимического теста для определения НЕК2 (такие как НегсерЮН™).
Таким образом, изобретение обеспечивает набор для диагностики и определения прогноза, который содержит по меньшей мере одно антитело или его фрагмент, при этом указанное антитело или фрагмент способны распознать эпитоп, определенный последовательностями 8Е0 ГО N0:2 или 8Е0 ГО N0: 3 или 8Е0 ГО N0:5, в дополнение к хорошо известным специалистам в данной области реактивным средствам и буферам, подходящим для проведения взаимодействия антитела с эпитопом.
Диагностический способ настоящего изобретения и набор настоящего изобретения могут позволить спрогнозировать нодальные метастазы, плохой прогноз и устойчивость к Нетсерйи™.
Другой тип набора, также являющийся задачей изобретения, содержит все необходимые средства для проведения обнаружения укороченной формы рецептора НЕК2, состоящей из последовательности 8Е0 ГО N0: 1, посредством дифференциальной миграции по сравнению с полноразмерной формой рецептора НЕК2.
В группе злокачественных новообразований, которые экспрессируют рецептор НЕК2 или его укороченные варианты, рак молочной железы занимает особое место. Другие типы злокачественных новообразований, в которых эти белки также экспрессируются, включают злокачественные новообразования легких, поджелудочной железы, толстой кишки, желудка, простаты, головы и шеи, кожи, почек, яичка,
- 6 025218 щитовидной железы, мочевого пузыря, матки, вульвы, эндометрия, яичников, пищевода, полости рта, слюнных железы, гортани, брюшины, области носоглотки, маточных труб, опухоли Вильмса, а также лимфомы, саркомы Юинга, синовиальную саркому, медуллобластомы, трофобластические опухоли, глиомы, глиобластомы, холангиокарциномы, холестеатомы, хондросаркому, эпендимому, неврилемоммы, невромы, рабдомиосаркомы. Диагностический способ настоящего изобретения, таким образом, особенно подходит для диагностики одного из этих типов злокачественных новообразований, в дополнение к ех-νίνο обнаружению СТР, антитела могут применяться для получения изображения ίη νίνο.
Терапевтические способы
Антитела настоящего изобретения или их фрагменты, также полезны в терапии, особенно в терапии злокачественных новообразований, особенно тех злокачественных новообразований, которые экспрессируют рецептор НЕК2 или его укороченные варианты. Гуманизированные или человеческие антитела и их фрагменты также являются предпочтительными.
Антитела данного изобретения также применяются в фармацевтических композициях, полезных при лечении злокачественных новообразований, в которых, по меньшей мере, экспрессируется укороченная форма рецептора НЕК2 с последовательностью 8ЕО ГО N0: 1. Композиция содержит фармацевтически приемлемые носители или наполнители и по меньшей мере одно антитело, которое распознает эпитоп, определенный последовательностями 8Е0 ГО N0: 2 или 8Е0 ГО N0: 3. Фармацевтическая композиция также может содержать смесь антител, котора, помимо антитела настоящего изобретения содержит другие антитела против НЕК.2 или их фрагментов, такие как Негсерйп™.
На основании предоставленных в данном документе фигур и примеров, при всех обстоятельствах иллюстративных, а не ограничивающих, ниже дано описание способа диагностики и определения прогноза злокачественных новообразований, экспрессирующих рецептор НЕК2 и/или его С-концевые фрагменты (укороченные варианты); новых пептидов и специфических антител против указанных пептидов; новых клеточных линий; диагностических средств и наборов для обнаружения, при этом всё это относится к задачам изобретения.
Хотя это и не указано, все технические и научные термины, использованные в описании изобретения, имеют значения, которые им будет присваивать специалист в области, к которой принадлежит изобретение. Подобные или эквивалентные описанным здесь материалы и методы могут быть практически применены в настоящем изобретении. На всем протяжении описания и формулы изобретения формулировка содержит и варианты формулировки, такие как содержащий, не предназначены для исключения других технических признаков, добавок, компонентов или стадий. Дополнительные задачи, преимущества и признаки изобретения станут очевидными специалистам в данной области в ходе изучения описания или могут быть изучены при практическом исполнении изобретения. Следующие примеры и чертежи предоставляются в качестве иллюстрации и не предназначены для ограничения настоящего изобретения.
Также следует понимать, что настоящее изобретение охватывает все возможные комбинации предпочтительных и конкретных групп описанных выше.
Примеры
Следующие примеры демонстрируют различные пути обнаружения наличия укороченной формы с последовательностью 8Е0 ГО N0: 1 в выделенном образце злокачественного новообразования такого типа, который экспрессирует рецептор НЕК2 и/или его укороченные варианты.
Экспериментальные процедуры
Клетки.
Клетки МСР7 Те1-0ГГ (ВБ ЬюЖепсе) поддерживали при 37°С и 5% С02 в среде ЭМЕМ/Р-12 (1:1) (СтЬсо), содержащей 10% РВ8 (СФсо). 4 мМ Ь-глутамин (РАА ЬаЬогаФпек), 0.2 мг/мл 0418 (0Фсо) и 1 пг/мл доксициклина (8щта). Клетки трансфецировали различными экспрессирующими плазмидами с помощью Ри0ЕМЕ§ (КосЬе). Одиночные стабильные клоны с интегрированными плазмидами на основе рЕНШ0-3П отбирали на 0,1 мг/мл гигромицине В ОпуПгсщеп). Экспрессию с риНБ10-3Ь, кодирующих кДНК НЕК2 и СТР индуцировали удалением доксициклина. Вначале клетки отделяли с помощью 0,5% трипсина/ЭДТА (01ВС0), отмывали три раза с центрифугированием, а среду после рассева в культуральных чашках заменяли каждые 10 ч. Гомогенность индивидуальных клонов проверяли иммунофлюоресцентным конфокальным микроскопом с помощью антител против цитоплазматического домена НЕК2. В экспериментах применяли два независимо отобранных стабильных клона.
Вестерн-блоттинг.
Клетки, экспрессирующие различные изоформы НЕК2, лизировали в модифицированном буфере К1РА (20 мМ NаН2Р04/Nа0Н рН 7,4, 150 мМ №С1, 1% Тритон Х-100, 5 мМ ЭДТА 100 мМ РМ8Р, 25 мМ NаΕ, 16 мкг/мл апротинин, 10 мкг/мл лейпептин и 1,3 мм №3У04) и определяли концентрацию белка с помощью реагента для анализа белка ПС (ВЮ-КАБ). Образцы смешивали с загрузочным буфером (конечные концентрации: 62 мМ Трис рН 6,8, 12% глицерин, 2,5% 8Б8) и с 5% бета-меркаптоэтанолом и инкубировали при 99°С в течение 5 мин до разделения 15 мкг белка посредством 8Б8-РА0Е. Конкретные сигналы в вестерн-блотах количественно определяли с помощью программного обеспечения 1таде1 1.38 (N10).
- 7 025218
Иммунопреципитация.
Клеточные лизаты инкубировали с различными антителами в течение 1 ч при 4°С. Затем иммунокомплексы очищали с помощью протеина А. Иммунопреципитаты отмывали три раза лизирующим буфером, смешивали с загрузочным буфером и анализировали вестерн-блоттингом.
Клетки для иммунофлюоресцентной микроскопии, рассеянные на покровные стекла, отмывали РВ§, фиксировали 4% парафармальдегидом в течение 20 мин и пермеабилизовали 0,2% Тритоном Х-100 в течение 10 мин. Для блокирования и связывания антител мы применяли РВ§ с 1% БСА, 0,1% сапонином и 0,02% Ν;·ιΝΛ а для заключения в среду - УееРМпеИ \νί11ι ΌΑΡΙ (УееЮг 1аЬогаЮпс5).
Проточная цитометрия.
Клетки МСР7, экспрессирующие НЕК2, 611-СТР или 648, отмывали РВ§ при 4°С и снимали в РВ§, содержащем 5 мМ ЭДТА. Открепленные клетки инкубировали с 10 пг/мл моноклонального антитела анти-32Н2 в РВ§, содержащем 5% БСА в течение 30 мин при 4°С, отмывали и окрашивали в течение 30 мин при 4°С с помощью Р1ТС-конъюгированных анти-мышиных 1дО (ВссЮп-Оюкиъоп) в РВ§, содержащем 5% БСА. Проточную цитометрию осуществляли на установке РАСТсап с помощью программного обеспечения РАСТеап Кекеагек 5оП\\агс (ВсеЮп ΩΚΙοηδοη 1ттипосу1отс1гу 8у8., Маунтин Вью, Калифорния).
Иммуногистохимия. Клетки МСР7, экспрессирующие НЕК2, 611-СТР или 648, отмывали при 4°С с помощью РВ§ и снимали РВ§, содержащем 5 мМ ЭДТА. Затем клетки центрифугировали, а клеточный осадок фиксировали в 10% нейтральном формалине, дегидрировали и заливали парафином. Срезы клеточных осадков или человеческих тканей толщиной 4 мкм размещали на покрытых полилизином покровных стеклах. Анализы иммуногистохимии осуществляли с помощью следующего протокола:
1. Депарафинизация и регидратация среза
1.1 Инкубация стекол в течение 30 мин при 60°С.
1.2 Депарафинизация стекол инкубациями в чистом ксилоле 3 раза по 5 мин, а затем 2 раза по 3 мин отмывки абсолютным этанолом.
1.3 Поэтапный перенос в дистиллированную воду: Этанол 95°С 3 мин, этанол 70°С 3 мин, этанол 50°С 3 мин, дистиллированная вода.
2. Восстановление антигена
РТ-модуль, интегрированный в платформу Ыик, при низком рН (6), раствор для восстановления антигена (10х) ΕΝνίδΙΟΝ РЬЕХ ТАКОЕТ КЕТМЕУАЬ δΟΡΡΊΊΟΝ НЮН РЬ, ИМ 812, 20 мин при 95°С
Отмывка с помощью отмывочного буфера Р1ех \ν;·ΐδ1ι Ъийег х10, ИМ 811, в течение 15 мин.
3. Иммуногистохимическое окрашивание АИТОБТАШЕК р1ик Ыик, фирмы ΌΑΚΟ
Набор: Система детекции ΕΝνίδΙΟΝ РЬЕХ, Мышиные, Высокий рН, для использования в автоматической платформе Ыик:
Реагент для блокирования пероксидазы Έηνίδίοη Р1ех РегохШазе В1оект§, 8М801.
Реактив Έηνίδίοη Р1ех/НКР, §М 802.
Реактив Έηνίδίοη Р1ех ИАВ+СНКОМООЕ№', ИМ 807.
Буфер Έηνίδίοη Р1ех 8иЪк1га1е Вийег, §М 803.
Буфер Έηνίδίοη Р1ех \УакЬ Вийег, 10х, ИМ 811.
раствор для восстановления антигена (10х) Έηνίδίοη Р1ех Тагде! Ре1пеуа1 δο1ηίίοη НщЬ РЬ 10х, ИМ812.
Линкер Έηνίδίοη Р1ех+ Мοиδе (1ткег). δМ 84.
Пероксидаза 5 мин и промывка отмывочным буфером.
5% белковая блокировка, 15-20 мин
Промывка отмывочным буфером.
• 32Н2, разведение 1:1000-1:3000 (1 мг/мл сток) или 20Р4, разведение 1:20-1:50 (1 мг/мл сток), 2 ч.
• Промывка отмывочным буфером.
• Вторичное антитело (Р1ех НКР, Р1ех +Мοиδе/КаЪЪ^ΐ), 20 мин.
• Промывка отмывочным буфером.
• ИАВ, 5 мин.
• Промывка отмывочным буфером.
• Г ематоксилин • Промывка дистиллированной водой.
3. Дегидратация и стабилизация со средой для заливки
3.1 Постепенная отмывка с увеличением концентрации этанола (50, 70, 95%, 2 мин каждая отмывка).
3.2 Постепенный перенос в дистиллированную воду (этанол 95, 70, 50%, дистиллированная вода, 3 мин каждая отмывка).
3.3 Отмывка ксиленом/эвкалиптолом (3 отмывки по 2 мин каждая).
3.4 Заливка смолой ИРХ. Трансгенные мыши.
Мыши ТО 611 и ТО 687 были созданы путем клонирования последовательностей 687-СТР и
- 8 025218
611-СТР в сайт множественного клонирования II вектора рМВ (любезный подарок д-ра Магсок Ма1итЬгек, С№0, Мадрид) ниже длинного концевого повтора вируса опухоли молочной железы мышей, усиленного длинным концевым повтором вируса саркомы Рауса. Линии-основатели получали микроинъекцией линеаризованной плазмидной ДНК в фертильные ооциты, отобранные у суперовулирующих мышей РУВ в Центре биотехнологии животных и генной терапии (СеШге бе Вю1еспо1офа Ашта1 ί Тетар1а Сетса, Итуегкйа! Аиопота бе Вагсе1опа). Мышей-основателей генотипировали анализом гибризации по Саузерну. После идентификации животных-основателей, осуществляли рутинное поддержание колоний посредством генотипирования РСК. Самцы и самки мышей РУ3/Ы-Т§(ММТУпеи)2021 были получены из 1асккоп ЬаЬога1оту (Бар Харбор, Мэн).
Тотальные препараты и гистология
Молочные железы закрепляли на покровных стеклах, фиксировали в течение ночи в 4% парафармальдегиде и переносили в 70% этанол. Срезы отмывали в воде в течение 5 мин и окрашивали в фильтрованном растворе 0,2% кармина в течение 24 ч. Затем железы последовательно дегидратировали с помощью уменьшающихся концентраций этанола, затем переносили и хранили в метилсалицилате. Для гистологического анализа фиксированные железы блокировали в парафине, разрезали и окрашивали гематоксилином и эозином.
Пример 1. Обнаружение фрагмента с последовательностью 8ЕС ГО N0: 1 посредством дифференциальной миграции.
На фиг. 2, которая соответствует изображению электрофорезного геля и последующего вестернпереноса (вестерн-блоттинг), в треки которого наносили различные образцы рака молочной железы (108, 114, 101, 103, 131, 134 и 145). Для каждого образца анализировали как растворимую фракцию (8), так и мембранную фракцию (М) клеточного лизата в целях визуализации типа молекулы НЕК2 и фракции, в которой он находится. В принципе, ожидается, что как полноразмерный рецептор, так и форма с последовательностью 8ЕС ГО N0: 1 находятся в клеточной мембране. Для обнаружения полноразмерного НЕК2 и его формы СТР-611 использовали антитела (СВ11), нацеленные на цитоплазматический домен белков, который является общим доменом в обеих белковых формах. В качестве аналитического контроля детектировали наличие фермента лактатдегидрогеназы (ЭНЬ). В большинстве образцов появлялись полосы, соответствующие полноразмерному рецептору НЕК2, а в мембранной фракции, появлялась полоса, соответствующая форме СТР-611 с последовательностью 8ЕС ГО N0: 1.
Фиг. 2, следовательно, демонстрирует, что обнаружение типа укороченной формы рецептора может быть осуществлено посредством электрофоретического анализа белков. Более того, наличие фрагмента НЕК2 с последовательностью 8ЕС ГО N0: 1 указывает на определенный тип злокачественного новообразования, в случае, например, рака молочной железы, для которого необходима оценка и лечение на индивидуальном уровне в пределах злокачественных новообразований, экспрессирующих НЕК2.
Пример 2. Обнаружение наличия фрагмента НЕК2 с последовательностью 8ЕС ГО N0: 1 с помощью моноклональных антител, направленных на неоэпитопы, определенные последовательностью 8ЕС ГО N0: 2 или 8ЕС ГО N0: 3.
Для того, чтобы быть в состоянии обнаружить наличие укороченной формы НЕК2, чья последовательность является последовательностью, описанной в 8ЕС ГО N0: 1, при использовании альтернативных средств для обнаружения посредством дифференциальной миграции в электрофорезе, пептид, имеющий последовательность 8ЕС ГО N0: 4, синтезировали и иммунизировали указанным пептидом четырех кроликов. Этот пептид соответствует 32 аминокислотам Оконца формы СТР-611 или последовательности 8ЕС ГО N0:1, в которой большая часть цистеинов замещается серинами для конъюгации с иммуногеном, известным как гемоцианин лимфы улитки (КЬН).
Следовательно, последовательность 8ЕС ГО N0: 4 соответствует пептиду, эквивалентному 8ЕС ГО N0: 3, хотя и адаптированному для проведения метода иммунизации. Специалист в данной области поймет, что антитела, нацеленные на синтезированный пептид 8ЕС ГО N0: 4, будут также распознавать эпитоп, определенный последовательностью 8ЕС ГО N0: 3, присутствующей в укороченной форме рецептора НЕК2 (8ЕС ГО N0: 1 или СТР-611). Подобным образом специалист в данной области может следовать этому, если синтезированный пептид, использованный для иммунизации, состоит из последовательности 8ЕС ГО N0: 2, которая содержит все аминокислоты рецептора СТР-611, расположенные во внеклеточной зоне, при этом результаты с антителами, нацеленными на этот другой пептид, являются эквивалентными и, следовательно, антитела являются полезными для тех же целей.
Были проведены 8Ό8 электрофорез и последующий вестерн-перенос экстрактов лизатов клеток МСР7 (ранее трансформированных конструктами фиг. 1), экспрессирующих полноразмерную форму рецептора НЕК2, укороченную форму СТР-611 и укороченную форму р95. Укороченная форма 8ЕС ГО N0: 1 фактически представляет собой два фрагмента со схожей молекулярной массой. С помощью тестов, осуществленных с Гликозидазой-Р, ферментом, удаляющим ^гликаны с белков (не показаны), можно выяснить, что фрагмент СТР-611 является субстратом посттрансляционных модификаций. В частности, фрагмент размером приблизительно 110 кДа соответствует форме, которая синтезируется и затем поступает в секреторный путь, где она становиться ^гликозилированной.
Сыворотки из двух иммунизированных кроликов распознают как полноразмерный рецептор НЕК2,
- 9 025218 так и СТР-611. Это видно на фиг. 4А, на которой обнаруживаются полосы, соответствующие как полноразмерному рецептору НЕК2, так и форме с последовательностью 8ЕЦ ГО N0: 1 или СТР-611. На упомянутой фиг. 4А на вестерн-блоте выявляется цитоплазматический домен рецептора НЕК2 (общий домен во всех формах, полноразмерной и укороченной), распознаваемый антителом (СВ11); или выявляется указанный пептид с последовательностью 8Е0 ГО N0: 4, распознаваемый поликлональными антителами (α-611-Α и α-611-В), образованными против него и присутствующими в сыворотках кроликов. Из-за сопоставимого сигнала полноразмерного НЕК2 и СТР-611 делается вывод, что антитела α-611-А и α-611-В распознают линейный эпитоп, который присутствует в обеих формах рецептора.
В качестве отрицательного контроля при 8Ό8 электрофорезе и вестерн-блоте использовали клеточный лизат МСР7, экспрессирующий рецепторную форму, известную как р95, которая не имеет эпитоп, против которого разрабатывались антитела.
В противоположность этим результатам, при проведении анализа иммунопреципитации с антителами α-611-А и α-611-В и антителом СВ11, было обнаружено, что антитела против пептида с последовательностью 8Е0 ГО N0: 4 преципитируют предпочтительно укороченную форму рецептора (СТР-611). Смесь, которую подвергали иммунопреципитации, содержала пропорцию 1:1:1 клеточных лизатов, экспрессирующих различные формы рецептора НЕК2. Эти результаты наглядно представлены на фиг. 4В. На этой фигуре показаны полосы 8Ό8 электрофореза с последующим вестерн-переносом, в треки которого вносили результаты анализов иммунопреципитации с антителами α-611-А, α-611-В и СВ11. Контрольный трек (ввод) загружали смесью 1:1:1 трех типов клеточных лизатов, подвергнутых иммунопреципитации с различными антителами. Вестерн-блот проявляли с помощью СВ11. (Примерно по 106 клеток, экспрессирующих полноразмерный НЕК2, 611-СТР или 648-СТР лизировали в 500 мкл лизирующего буфера (50 мМ Трис НС1 рН 7,4, 137 мМ №С1, 2 мМ ЕИТА, 10% глицерин, 1% ΝΡ40). Лизаты осветляли центрифугированием при 14000 д /30 мин. Загрузка: 5 мкл смеси лизатов (полноразмерный НЕК2:СТР611:СТР648, 1:1:1) ИП: 50 мкл смеси лизатов + 5 мкл кроличьей сыворотки анти-611СТР или СВП.
В треках, соответствующих иммунопреципитации с антителами α-611-А и α-611-В, можно различить полосы, которые явно более интенсивны, чем другие полосы, чьи молекулярные массы соответствуют гликозилированной и негликозилированной формам СТР-611. То есть, указанные антитела, направленные против пептида 8Е0 ГО N0: 4, не приципитируют полноразмерную форму рецептора НЕК2, что означает, что они действительно распознают эпитоп, который скрыт, в неденатурированном полноразмерном рецепторе НЕК2. Следовательно, можно сделать вывод, что антитела α-611-А и α-611-В являются специфичными к СТР-611.
Эта специфичность подтверждается анализом непрямой иммунофлюоресценции (не показано) в котором аффинность очищенных поликлональных антител α-611-А и α-611-В делает возможным окрашивание только в образцах, экспрессирующих укороченный фрагмент СТР-611. Этот факт предусматривает преимущество, которое позволяет использовать антитела для дифференциального определения конкретной формы рецептора НЕК2, экспрессирующейся в выделенном образце ткани злокачественного новообразования. Аффинную очистку поликлональных антител осуществляли следующим образом:
(ί) Общая очистка 1дО с помощью колонки НПгар Рто1еш А НР (ОЕ НеаНйеате). Антитела из сыворотки кролика иммобилизовали в колонке, уравновешенной буфером связывания (№тНР04). промывали 10 объемами колонки буфером для связывания и элюировали в 10 объемах лимонной кислоты рН (2,7). Элюцию нейтрализовали с помощью ТГ18-НС1 рН 8.
(ίί) Очистка с помощью пептида, иммобилизованного на колонке НПгар N48. Такой же пептид что и использованный при иммунизации кроликов, иммобилизовали на колонке НПгар N48. 1дО, очищенные на предыдущей стадии, наносили на колонку, уравновешенную буфером связывания (№2НР04), промывали 10 объемами колонки буфером для связывания и элюировали в 10 объемах лимонной кислоты рН (2,7). Элюцию нейтрализовали с помощью Тпв-НС1 рН 8.
(ίίί) В конце очищенное антитело диализовали против 0.02% в РВ8.
Рядом с клеточной мембраной полноразмерный рецептор НЕК2 содержит структурированную область, поддерживаемую шестью дисульфидными мостиками, указанными на фиг. 1 соединительными линиями между цистеинами. Укороченная форма СТР-611, или последовательность с 8Е0 ГО N0: 1, содержит только пять цистеинов, посредством которых указанные дисульфидные мостики образуются для стабилизации гомодимеров этой укороченной формы. Исходя из представленного на фиг. 4 в целом, можно сделать вывод о том, что примембранная зона укороченной формы 8Е0 ГО N0: 1 является антигенно отличной от ее эквивалента в полноразмерном рецепторе НЕК2. Из этого вытекает, что она может быть обнаружена дифференциально в соответствии с тем, что было указано выше.
Количественная оценка различных изоформ НЕК2 в загрузке иммунопреципитатов, полученных с помощью СВ11 и анти-611-В и нормализованных по количеству НЕК2, демонстрирует следующее:
- 10 025218
Загрузка СВ11 Анти-611-В
НЕК2 1 1 1
611-СТР 1,47 1,27 23,20
648-СТР 1,53 2,76 2,4
Количественную оценку проводили с помощью 1таде1 1.38.
Пример 3. Обнаружение наличия фрагмента НЕК2 с последовательностью 8ЕО ГО N0: 1 с помощью моноклональных антител, направленных на неоэпитопы, определенные последовательностью 8Е0 ГО N0: 2 или 8ЕО ГО N0:3.
Моноклональные антитела получали с тем же самым пептидом с 8Е0 ГО N0: 4 из примера 2. Из всех антител отобрали моноклональное антитело 20Р4, продуцируемое гибридомной клеточной линией с учетным номером Ό8Μ АСС2904 и моноклональное антитело 32Н2, продуцируемое гибридомной клеточной линией с учетным номером Ό8Μ АСС2980. Результаты, полученные с данными антителами, представлены на фиг. 5.
Также как и в примере 2 проводили 8Ό8 электрофорез и последующий вестерн-перенос со смесью 1:1:1 экстрактов лизатов клеток МСР7 (ранее трансформированных конструктами фиг. 1), экспрессирующих полноразмерную форму рецептора НЕК2, укороченную форму СТР-611 или укороченную форму р95. На фиг. 5А которая является фотографией мембраны вестерн-блота, проявленного с помощью СВ11 или моноклональных антител 20Р4 и 32Н2, можно видеть, что последнее специфически распознает укороченную форму НЕК.2, соответствующую рецептору СТР-611 с последовательностью 8Е0 ГО N0: 1 и не дает любой детектируемой кросс-реактивности с полноразмерной формой указанного рецептора, что означает что оно действительно распознает новый эпитоп (нео-эпитоп), который включает первичную аминогруппу Шконца формы рецептора СТР-611.
Аналогичным образом, при проведении анализа иммунопреципитации с моноклональными антителами 20Р4 и 32Н2 в сравнении с антителом СВ11 (которое распознает цитозольный домен рецепторов) было обнаружено, что моноклональное антитело, направленное против пептида с 8Е0 ГО N0: 3, преципитирует исключительно укороченную форму рецептора (СТР-611). Эти результаты наглядно представлены на фиг. 5В. На этой фигуре представлены полосы 8Ό8 электрофореза и последующего вестернпереноса, в треки которого были загружены результаты анализов иммунопреципитации с антителами 20Р4, 32Н2 и СВ11.
В треке, соответствующем иммунопреципитации с антителами 20Р4 и 32Н2, могут быть различимы только полосы гликозилированной и негликозилированной укороченной формы СТР-611. То есть, антитела 20Р4 и 32Н2 не иммунопреципитируют полноразмерную форму рецептора НЕК2. Таким образом, можно сделать вывод о том, что антитела 20Р4 и 32Н2 являются высокоспецифичными к СТР-611 и не распознают полноразмерную форму НЕК2, что означает, что они могут быть применены для дифференциального и высокочувствительного избирательного обнаружения этой формы рецептора НЕК2, экспрессируемой в выделенном образце ткани злокачественного новообразования.
Определение характеристик моноклональных антител направленных против пептида, соответствующего Шконцу последовательности 611-СТР, длиной 32 аминокислоты, подтверждает существование эпитопа(ов) скрытых в полноразмерном НЕК2, но экспонированных в 611-СТР. Эти эпитопы замаскированы как в солюбилизированной молекуле, так и в интактных клетках. Количественная оценка различных изоформ НЕК2 в иммунпреципитатах СВ11, 32Н2 и 20Р4, нормализованных по количеству НЕК2, демонстрирует следующее:
СВ11 32Н2 20Р4
НЕК2 1 1 1
611-СТР 1,01 343,50 1302,19
648-СТР 0,79 Н.О. Н.О.
Пример 4. Определение характеристик моноклональных антител против Шконца 611-СТР с помощью проточной цитометрии.
(A) Клетки МСР7, экспрессирующие НЕК2, 611-СТР или 648-СТР, анализировали с помощью различных концентраций 32Н2, моноклонального антитела, созданного против пептида МРВУКЕРОЕЕ0А8рР8РЕН8ТН88У0РППК0С (см. фиг. 1). См. фиг. 6(А).
(B) Результаты двух независимых экспериментов осуществленных, как и в (А), оценивали количественно и представляли средние значения. См. фиг. 6(В).
(C) Клетки МСР7, экспрессирующие НЕК2, 611-СТР или 648-СТР, анализировали с помощью конфокального микроскопа посредством непрямой иммунофлюоресценции с указанными антителами.
В качестве связанного с флюорофором вторичного антитела, использовали А1еха Р1иог 488 антимышиный козий 1§0 от ’Тпуйгодеп (А110011). Для оценки неспецифического связывания в качестве отрицательного контроля проводили РАС8 без сыворотки 32Н2 в присутствии этого вторичного антитела (2-ое).
Заключение: Эпитоп, распознаваемый антителом 32Н2, экспонируется в живых клетках, экспрессирующих 611-СТР, но скрыт в живых клетках, экспрессирующих НЕК2.
- 11 025218
Пример 5. Определение характеристик моноклональных антител против Ν-конца 611-СТР с помощью иммуногистохимии.
Проводили иммуноцитохимическое окрашивание клеток МСР7, экспрессирующих НЕК2, 611-СТР или 648-СТР, с помощью антитела СВ11 против цитоплазматического домена НЕК2, или с помощью двух независимых моноклональных антител анти-611-СТР, созданных против пептида ΜΡΙ^ΚΡΡΌΕΕСАЗОРЗРШЗТНЗЗУОРПЭКСС (см. фиг. 1). Результат представлен на фиг. 7.
Заключение. По иммуногистохимическому анализу эпитопы, распознаваемые антителами 20Р4 и 32Н2, экспонированы в клетках, экспрессирующих 611-СТР. В противоположном случае, при оценке тем же методом, в полноразмерной молекуле НЕК2 эти эпитопы замаскированы. Этот результат является особенно значимым из-за того, что иммуногистохимия является излюбленным методом при проведении большинства рутинных тестов в клинике.
Пример 6. Определение характеристик эпитопов, распознаваемых моноклональными антителами против Ν-конца 611-СТР (A) Схема, демонстрирующая первичную последовательность примембранной области 611-СТР. Указаны Ν- и С-концы молекулы. Трансмембранный и киназный домены обозначены заштрихованным и серым прямоугольниками, соответственно. Указаны последовательности различных делеционных конструктов. См. фиг. 8(А).
(B) Лизировали клетки МСР-7, транзиентно трансфецированные делеционными конструктами кДНК, которые начинаются с указанных аминокислот. Клеточные лизаты анализировали вестернблоттингом с СВ11, антителом против цитоплазматического домена НЕК2, или двумя независимыми моноклональными антителами анти-611-СТР, созданными против пептида МР1\УКРРЭЕЕСА5ОР8РШ8ТН88УИТИИКСС. См. фиг. 8 (В).
Заключение. Эпитопы распознаваемые антителами 32Н2 и 20Р4, содержат или, по меньшей мере, перекрывают последовательность МР1^КРРИЕЕС.
Пример 7. Анализ образцов рака молочной железы человека с помощью моноклональных антител против Ν-конца 611-СТР или с Нетсер1с51™.
(A) Анализ экспрессии НЕК2 в указанных образцах проводили с помощью Негсер1ек1™, флуоресцентной гибридизации ίη κίίτι (Р18Н) или с помощью вестерн-блоттинга. Указаны те образцы, которые экспрессируют детектируемые уровни С-концевых фрагментов НЕК2 (также известных как Р95) по оценке вестерн-блоттингом (см. (8са1бтй М., Ко]о Р., Осапа А., Αηίάο 1., Сн/тап М., Сойек 1., Όί Сок1то, 8., Майак-Сши X., Катоп у Са.)а1, 8., АтЪак 1., апб Вакеща 1. (2007) 1 Ν;·ι11 Сапсег !пк1 99(8), 628-638)). См. фиг. 9(А).
(B) Иммуногистохимическое окрашивание тех же самых, что и в А образцов рака молочной железы с помощью 32Н2, моноклонального антитела анти-611-СТР, созданного против пептида МР1^КРРИЕЕСА8рР8РРН8ТН88УИТИИКСС (см. фиг. 1) или с помощью Негсер1ек1'™. который окрашивает цитоплазматический домен НЕК2. См. фиг. 9(В).
Заключение. В иммуногистохимии антитело 32Н2 окрашивает образцы рака молочной железы человека, о которых ранее было известно, что они экспрессируют детектируемые уровни СТР, по оценке вестерн-блоттингом.
Пример 8. Создание модели на животных для определения характеристик влияния экспрессии СТР щ νίνο
Мышиные модели играют важную роль в демонстрации онкогенного потенциала и значимости НЕК2 в прогрессии злокачественных новообразований. Для определения характеристик онкогенного потенциала, мы создали трансгенных (ТС) мышей, экспрессирующих 611-СТР под контролем длинного концевого повтора вируса рака молочной железы мышей, который преимущественно активен в молочной железе. Хотя клеточные модели указывают на то, что растворимые внутриклеточные СТР являются неактивными, для дальнейшего изучения последствий экспрессии этих фрагментов, мы также получили трансгенных животных, экспрессирующих 687-СТР. В качестве контроля мы использовали классическую и хорошо охарактеризованную модель, экспрессирующую НЕК2 дикого типа (т.е. крысиный пей).
В возрасте 7 недель, уровни 611-СТР, экспрессируемые в гетерозиготных линиях ТС 611 Р3 и Р2 были ~ равны 1/3, соответственно, от уровня эндогенного НЕК2, в то время как в Р1 уровень был ниже порога обнаружения. Уровни 687-СТР в полученных гомозиготных линиях варьировали от ~ удвоенного до половинного уровня НЕК2 в ТС 687 линиях Р2 и Р1 соответственно.
Молочные железы трансгенных животных не демонстрировали макроскопических аномалий в 7недельном возрасте. Однако морфологическая проверка окрашенных кармином тотальных препаратов выявила гиперпластические аномалии в древовидной системе дуктальных протоков молочной железы мышей ТС НЕК2. Аналогичные аномалии, хотя и менее выраженные, присутствовали во всех трех линиях мышей ТС 611, в отличие от мышей ТС 687, у которых железы были неотличимы от желез мышей дикого типа.
- 12 025218
Пример 9. Экспрессия 611-СТР ведет к развитию агрессивных злокачественных новообразований молочной железы
Несмотря на более выраженную гиперплазию у мышей ТО НΕΚ2, в трех линиях животных ТО 611 развились более агрессивные злокачественные опухоли с точки зрения количества злокачественных опухолей на животное, скорости роста злокачественных опухолей и момента возникновения опухолей.
Молочные железы.
Мыши Среднее значение (недели) п
НЕК2 (Леи) 30,3 + 7,5 22
611-Р1 26,3 ±4,6 6
611-Р2 22,2±4,8 12
611-РЗ 23,7 + 5,5 3
(Появление злокачественных новообразований молочной железы выявляли ежедневной пальпацией).
В животных ТО 687 не наблюдали никаких злокачественных новообразований или аномалий даже в ходе последующего наблюдения в течение более чем одного года.
Гистологический анализ злокачественных опухолей в мышах ТО 611 продемонстрировал те же самые, типичные для индуцируемых НΕΚ2, инвазивные твердые узловые карциномы. Единственным гистологическим различием между новообразованиями, инициированными НΕΚ2 и 611-СТР, было большее количество митозов на снимках, полученных на образцах мышей ТО 611.
Ранее было показано, что в мышах ТО НΕΚ2 развились метастазы в легких. От трех до шести недель после обнаружения злокачественных новообразований потребовалось для образования у ~1/4 части животных ТО НΕΚ2 детектируемых узелков в легких.
Мыши Легочные метастазы η
НЕК2 Щей) 22 9
611-Р1,Р2,РЗ 56 9
(Мышей умерщвляли через 3-6 недель после обнаружения пальпацией злокачественных новообразований, а появление метастазов контролировали с помощью иммуногистохимии).
Гистологический анализ легочных метастазов подтвердил экспрессию НΕΚ2, а окрашивание цитокератином 18 подтвердило происхождение клеток из первичного злокачественного новообразования. По сравнению с ТО НΕΚ2, количество животных с обнаруживаемыми метастазами, экспрессирующих 611СТР, превышало в два раза. Это говорит о том, что злокачественные новообразования, инициируемые СТР, имеют более выраженную тенденцию к инвазии в легкие.
- 13 025218
5Ε0υΕΝ€Ε 1Ι5ΤΙΝ0 <110> РитЗасту Ргтмайа 1п5бтбиб άβ Кесегса Нозртба1 игл νβτ&Ί бап Уа!1 неЬгоп/ Рип<3асту Рп'уаСа 1п$бтбиб сРХпуезбтдасту ОпсоТудтса бе уа1! неЬгоп (унго)/ Рипдасту Ргтуада 1п5бтбисту сабатапа с!е кесегса ί Ε56υάΐ5 Ауапзабз <120> мебНой Тог сКадпозтпд сапсегз ехргеззтпд бНе НЕР2 гесербог ог тбз бгипсабес) уап’апбз <13 0> 134353 <150> Р200801652 <151> 2008-06-08 <160> 5 <170> РабепбТп уегзтол 3.4 <210> 1 <211> 645 <212> РКТ <213> Ното зартепэ <220>
<223> тгипсабеЬ ίο пл ог сагЬоху тегяИпа! Ргадшепб (СТР) οί бНе Нитап ргобетп НЕК2
<400> 1
Меб Рго 11е Тгр 1_У5 РНе РГО АЗр 01 и о! и с!у а! а Суз с1п РГО суз
1 5 10 15
РГО 11е А5П СУ5 тКг НТ 5 зег СУ5 уа! АЗр ьеи А5р АЗр ЬУ5 о! у суз
20 25 30
Рго а! а 01 и С! η Агд А! а Зег Рго Ьеи ТНг 5ег Пе Уа1 5ег а! а Уа!
35 40 45
Уа! о!у Пе Ьеи ьеи Уа! Уа! Уа! Ьеи С1у Уа! Уа! РНе ΟΊ у Пе Ьеи
50 55 60
11е Ьуз Агд Агд С1п οίη Ьу5 Пе Агд Ьуз Туг ТНг Меб Агд Агд Ьеи
65 70 75 80
ьеи Οίη е!и ТНг С1и Ьеи Уа! О! и Рго ьеи ТНг РГО 5ег С1у а! а меб
85 90 95
Рго АЗЛ С1п А! а С1п Меб Агд Пе Ьеи Ьуз о!и ТНг О1и Ьеи Агд Ьуз
100 105 по
Уа! ьуз Уа! Ьеи С1у 5ег с! у а! а рКе 01у ТНг уа! Туг Ьуз о!у Не
115 120 125
тгр Не Рго А5р 6(у с!и А5П Уа! ьуз Пе РГО уа! а! а Пе ьуз уа!
130 135 140
Ьеи Агд с!и АЗП ТКг 5ег РГО ьуз А1а АЗП ЬУ5 О! и Пе ьеи Азр о! и
145 150 155 160
а! а туг Уа! Мег Геи 180 А1а 165 ТЬг Ну Уа! с! у уа! Бег Рго 170 туг уа! Уа1 тЬг Бег Агд Геи 175 МеГ Геи Рго
Ну Пе Суз зег ТЬг Нп 185 геи Пп Геи 190
туг Пу Суз Геи Геи А5р ΗΊ 3 уа! Агд С! и АЗП Агд Ну Агд Геи Н у
195 200 205
Бег Пп Азр Геи Геи А5П тгр суз мег Нп Пе л!а ГУ5 Пу МеГ Бег
210 215 220
Туг Ьеи Ии Азр уа! Агд геи Уа! НТ 5 Агд Азр Геи А! а А! а Агд А5П
225 230 235 240
Уа1 [.ей Уа! ГУ5 Бег Рго Азп Нт 5 Уа1 Гуз Пе ТЬг Азр РЬе Ну Геи
245 250 255
А! а Агд Геи Геи 260 Азр 11е АЗр Ии ТЬг 265 Ни Туг НТ 5 А1а Азр 270 Ну с!у
ьу$ Уа1 РГО Не гуз Тгр мег л1а Геи Ни Бег Пе геи Агд Агд Агд
275 280 285
РЬе ТЬг НТ 5 Пп Бег А5р Уа! Тгр Бег Туг Пу Уа! ТЬг Уа! Тгр Ни
290 295 300
Теи МеГ ТЬг РЬе с! у А1а Гуз Рго Туг Азр с! у Пе РГО А1а Агд Ни
305 310 315 320
Пе Рго Азр Геи геи Ии гуз Ну Ии Агд геи Рго с1п Рго Рго Пе
325 330 335
Су5 тЬг Пе Азр 340 уа! туг мег Пе мег 345 уа! гуз Суз Тгр МеГ 350 Пе АЗр
Бег Ни Суз 355 Агд РГО Агд РЬе Агд 360 с! и Геи Уа1 Бег о! и 365 РЬе Бег Агд
Мег А! а 370 Агд Азр РГО Ип Агд 375 РЬе уа1 уа! Пе Пп 380 Азп с! и А5р Геи
С1у Рго А1а 5ег Рго геи АЗр Бег тЬг РЬе туг Агд Бег геи геи Ни
385 390 395 400
АЗр АЗр А5Р мег Ну 405 Азр Геи Уа! А5р А1а 410 Пи Ни туг геи Уа! 415 Рго
Нп Нп С1у РЬе РЬе суз Рго АЗр РГО А1а РГО Ну а! а Ну О! у мет
420 425 430
- 15 025218
Уа1 НТ 5 ΗΊ5 435 Агд НТ 5 Агд Бег Бег Бег тНг Агд Бег 51у о!у 51у А5Р
440 445
ьеи ТНг ьеи с!у ьеи 51и РГО Бег 51 и с1и 51и А1а Рго Агд зег РГО
450 455 460
ьеи А1а РГО Бег С1и б!у А1а 01 у Бег Азр уа! рЬе АЗР 51 у А5Р ьеи
465 470 475 480
51 у мег С1у А1а А1а ьуз с1у ьеи 51 η Бег ьеи РГО тНг НТ 5 А5Р РГО
485 490 495
Бег Рго ьеи С1п Агд Туг Зег с1и Азр Рго тНг Уа1 Рго Ьеи Рго Зег
500 505 510
С1и тНг Азр с1у туг Уа1 А1а РГО ьеи ТНг суз зег рго 51 П РГО 51и
515 520 525
Туг Уа! А5П 51 η рго Азр Уа1 Агд Рго 51 η Рго Рго Бег Рго Агд 51и
530 535 540
51у РГО ьеи РГО А1а А1а Агд РГО А1а 51у А1а тЬг Ьеи 51 и Агд А1а
545 550 555 560
ЬуЗ ТНг ьеи Бег Рго С1у ЬУ5 АЗП б1у Уа1 Уа! ьуз Азр Уа1 РЬе Д1а
565 570 575
РНе С1у С|у А1а уа1 51 и АЗП Рго 51 и туг Ьеи ТЬг Рго б!п 51у б!у
580 585 590
А1а а! а РГО 51 п РГО НТ 5 РГО РГО РГО А1а РНе Зег Рго А1а РНе Азр
595 600 605
АЗП Ьеи Туг Туг тгр Азр б!п А5р Рго РГО 51 и дгд 51 у л1а рго Рго
610 615 620
Бег ТНг РНе ьуз 51У ТНг рго ТНг д!а 51 и А5П Рго 51 и туг Ьеи 51 у
625 630 635 640
ьеи Азр ΐ Уа! Рго уа! 645
<210? 2
<211> 42
<212? РКТ
<213? Ното зарт епз
<220?
<223? ЕртЬоре оТ а ЬгипсаХес! Тогт οΐ хЬе Ьитап НЕЯ2 ргогетп
<400? 2
МеГ Рго 11е Тгр ьуз РНе Рго Азр с1и с1и С1у А1а суз С1п РГО 1
1 5 10 15
- 16 025218
Рго 11е Αδη суз тНг 20 НТ 5 зег суз уа! 25 Азр беи Азр дзр буз С1у суз 30
Рго А1а <51 и Οίη Агд А1а зег рго беи тНг
35 40
<210> 3
<211> 32
<212> РКТ
<213> Ното зарлепз
<220>
<223> Ерлборе оТ а тгипсатес! тогт оТ бНе Нитап НЕК2 ргобелп
<400> 3
Меб Рго 11е тгр буз р(ле Рго Азр С1и С1и б!у А!а Суз <з1п Рго Суз 15 10 15
Рго IIе Азп Суз тЬг Нлз Бег суз Уа! Азр беи Азр Азр буз С1у Су5 20 25 30 <210> 4 <211> 32 <212> РКТ <213> АгблГл'сл'а!
<220>
<223> БупбНеблс рерблде Неглуей Тгот ап ерлборе об а бгипсабед Тогт оТ бпе Нитап НЕК2 ргобелп <400> 4 меб Рго 11е Тгр буз РНе Рго Азр е!и С1и С!у А1а Бег С1п Рго Бег 15 10 15
Рго Пе Азп Бег ТНг нлз Бег Бег уа! А5р беи Азр Азр буз 01у Суз 20 25 30 <210> 5 <211> 13 <212> РКТ <213> АгблТлсла1 <220>
<223> БупбНеблс рерблйе деглуес! ίΓοιη ап ерлборе оТ а бгипсабей Тогт оТ бпе Нитап НЕК2 ргобелп <400> 5
Меб Рго 11е Тгр бу5 РНе рго дзр с!и с1и с1у А1а Бег
5 10

Claims (17)

1. Изолированное моноклональное антитело или его функциональный фрагмент, которое распознает эпитоп укороченной формы рецептора НЕК2, продуцируемое гибридомной клеточной линией И8М АСС2904.
2. Изолированное моноклональное антитело или его функциональный фрагмент, которое распознает эпитоп укороченной формы рецептора НЕК2, продуцируемое гибридомной клеточной линией И8М АСС2980.
3. Фрагмент по п. 1 или 2, который выбран из группы, образованной Е(аЬ), Е(аЬ') и Εν.
4. Гибридомная клеточная линия И8М АСС2904, продуцирующая моноклональное антитело по п.1.
5. Гибридомная клеточная линия И8М АСС2980, продуцирующая моноклональное антитело по п.2.
6. Способ получения изолированного антитела по п.1 или 2, распознающего эпитоп укороченной формы рецептора НЕК2, включающий иммунизацию кроликов пептидом, который состоит из последовательности 8ЕЦ ГО N0: 3 или 8ЕЦ ГО N0: 4, который конъюгирован с иммуногеном;
получение гибридомной клеточной линии;
выращивание гибридомной клеточной линии в подходящей культуральной среде и выделение моноклональных антител из этой культуральной среды.
7. Способ получения моноклонального антитела по п.1 или 2, включающий выращивание гибридомной клеточной линии по п.4 или 5 в подходящей культуральной среде и выделение моноклонального антитела из этой среды.
8. Способ диагностики злокачественных новообразований у пациента, который включает обнаружение в образце из пациента наличия укороченной формы рецептора НЕК2, состоящей из аминокислотной последовательности 8ЕЦ ГО N0: 1, причем указанное обнаружение осуществляют с помощью антитела или его функционального фрагмента по любому из пп.1-3.
9. Способ по п.8, в котором обнаружение проводят путем дифференциальной миграции укороченной формы рецептора НЕК2, состоящей из последовательности 8ЕЦ ГО N0: 1, при сравнении с полной формой указанного рецептора НЕК2 с одним или более антителом или его функциональным фрагмен- 17 025218 том, как определено в одном или более пп.1-3.
10. Применение способа по п.8 или 9 для определения прогноза развития злокачественного новообразования и/или метастазов.
11. Применение антитела или его функционального фрагмента по любому из пп. 1 -3 для диагностики злокачественных новообразований, экспрессирующих рецептор НЕК2.
12. Применение антитела или его функционального фрагмента по любому из пп.1-3 для определения прогноза развития злокачественных новообразований, экспрессирующих рецептор НЕК2.
13. Средство для диагностики злокачественных новообразований и/или определения прогноза их развития у пациента, которые экспрессируют рецептор НЕК2 или его укороченные формы, причем это средство содержит по меньшей мере одно антитело или его функциональный фрагмент по пп.1-3.
14. Средство по п.12, в котором антитело или его функциональный фрагмент располагается на твердой подложке.
15. Набор для диагностики злокачественных новообразований и/или определения прогноза их развития, которые экспрессируют рецептор НЕК2 или его укороченные варианты, который содержит антитело или его функциональный фрагмент по п. 1 или 3 и по меньшей мере один реагент, буфер и/или детектирующий раствор, адаптированный для определения присутствия укороченной формы НЕК2 с последовательностью 8ЕО ГО N0: 1 в указанном образце.
16. Применение антитела или его функционального фрагмента по любому из пп.1-3 для изготовления лекарственного средства для лечения злокачественного новообразования, экспрессирующего рецептор НЕК.
17. Фармацевтическая композиция для лечения злокачественных новообразований, в которых экспрессируется, по меньшей мере, укороченная форма рецептора НЕК2, содержащая последовательность 8Е0 ГО N0: 1, отличающаяся тем, что она содержит антитело или его функциональный фрагмент по любому из пп.1-3 и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый наполнитель и/или носитель.
EA201001874A 2008-06-02 2009-06-05 Способ диагностики злокачественных новообразований, экспрессирующих рецептор her2 или его укороченные варианты EA025218B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ES200801652A ES2342646B1 (es) 2008-06-02 2008-06-02 Metodo de diagnostico de canceres que expresan el receptor her-2 o sus variantes truncadas.
PCT/EP2009/056976 WO2010000565A1 (en) 2008-06-02 2009-06-05 Method for diagnosing cancers expressing the her2 receptor or its truncated variants

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201001874A1 EA201001874A1 (ru) 2011-08-30
EA025218B1 true EA025218B1 (ru) 2016-12-30

Family

ID=40911029

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201001874A EA025218B1 (ru) 2008-06-02 2009-06-05 Способ диагностики злокачественных новообразований, экспрессирующих рецептор her2 или его укороченные варианты

Country Status (21)

Country Link
US (1) US8389227B2 (ru)
EP (1) EP2293819B1 (ru)
JP (2) JP5753079B2 (ru)
KR (2) KR101785117B1 (ru)
CN (1) CN102202692B (ru)
AU (2) AU2009265921B2 (ru)
BR (1) BRPI0914969A2 (ru)
CA (1) CA2727365A1 (ru)
CY (1) CY1115798T1 (ru)
DK (1) DK2293819T3 (ru)
EA (1) EA025218B1 (ru)
ES (2) ES2342646B1 (ru)
HK (1) HK1157658A1 (ru)
HR (1) HRP20141158T1 (ru)
IL (1) IL209769A (ru)
MX (1) MX2010013419A (ru)
PL (1) PL2293819T3 (ru)
PT (1) PT2293819E (ru)
SI (1) SI2293819T1 (ru)
WO (1) WO2010000565A1 (ru)
ZA (1) ZA201009010B (ru)

Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2002257132A1 (en) * 2001-04-06 2002-10-21 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Erbb interface peptidomimetics and methods of use thereof
CA2711843C (en) 2007-12-20 2018-11-13 Laboratory Corporation Of America Holdings Her-2 diagnostic methods
ES2342646B1 (es) * 2008-06-02 2011-04-26 Institut De Recerca Hospital Universitari Vall Hebron Metodo de diagnostico de canceres que expresan el receptor her-2 o sus variantes truncadas.
SG177252A1 (en) 2008-12-01 2012-03-29 Lab Corp America Holdings METHODS AND ASSAYS FOR MEASURING p95 AND/OR p95 IN A SAMPLE AND ANTIBODIES SPECIFIC FOR p95
CA2749846C (en) 2009-01-15 2018-08-07 Laboratory Corporation Of America Holdings Methods of determining patient response by measurement of her-3
AU2010248884B2 (en) * 2009-05-14 2015-04-02 Nestec S.A. Biomarkers for determining sensitivity of breast cancer cells to HER2-targeted therapy
PT2330131E (pt) 2009-12-07 2015-01-14 Fundació Privada Institució Catalana De Recerca I Estudis Avancats Anticorpos contra a variante truncada de her-2 ctf-611
CN103102414B (zh) * 2013-02-04 2014-08-27 无锡傲锐东源生物科技有限公司 抗her2蛋白单克隆抗体及其用途
CA2908391A1 (en) 2013-05-01 2014-11-06 Five Prime Therapeutics, Inc. Methods of treating cancer
EP3825327A1 (en) 2014-03-11 2021-05-26 Molecular Templates, Inc. Proteins comprising binding regions, shiga toxin a subunit effector regions, and carboxy-terminal, endoplasmic reticulum localization signal motifs
EP3604333B1 (en) 2014-03-11 2021-05-05 Molecular Templates, Inc. Proteins comprising amino-terminal proximal shiga toxin a subunit effector regions and cell-targeting immunoglobulin-type binding regions capable of specifically binding cd38
AU2016271124C1 (en) 2015-05-30 2020-05-14 Molecular Templates, Inc. De-immunized, Shiga toxin a subunit scaffolds and cell-targeting molecules comprising the same
AU2016297920A1 (en) 2015-07-26 2018-01-18 Molecular Templates, Inc. Cell-targeting molecules comprising shiga toxin A subunit effectors and CD8+ T-cell epitopes
WO2017196263A1 (en) * 2016-05-12 2017-11-16 Agency For Science, Technology And Research Anti-erbb-2 antibodies and uses thereof
WO2018060301A1 (en) 2016-09-30 2018-04-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antibodies against cd3
ES2971981T3 (es) 2017-01-25 2024-06-10 Molecular Templates Inc Moléculas de reconocimiento de células que comprenden efectores de la subunidad A de la toxina Shiga desinmunizados y epítopos de células T CD8+
CA3097178A1 (en) 2018-04-17 2019-10-24 Molecular Templates, Inc. Her2-targeting molecules comprising de-immunized, shiga toxin a subunit scaffolds
CN110172448B (zh) * 2019-05-30 2020-07-28 中南大学湘雅二医院 一种滑膜肉瘤细胞系hSS-005R及其子代细胞系
AU2020318781A1 (en) 2019-07-23 2022-02-10 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Immune cells defective for SUV39H1
CN110865184B (zh) * 2019-12-04 2023-04-07 广州医科大学附属第三医院（广州重症孕产妇救治中心、广州柔济医院） Srsp蛋白和srsp抗原表位肽的应用及诊断和治疗肿瘤的产品
EP3915576A1 (en) 2020-05-28 2021-12-01 Fundació Privada Institut d'Investigació Oncològica de Vall-Hebron Chimeric antigen receptors specific for p95her2 and uses thereof
WO2023126458A1 (en) 2021-12-28 2023-07-06 Mnemo Therapeutics Immune cells with inactivated suv39h1 and modified tcr
EP4253418A1 (en) 2022-03-29 2023-10-04 Fundació Privada Institut d'Investigació Oncològica de Vall-Hebron Immune cells expressing chimeric antigen receptors and bispecific antibodies and uses thereof
EP4279085A1 (en) 2022-05-20 2023-11-22 Mnemo Therapeutics Compositions and methods for treating a refractory or relapsed cancer or a chronic infectious disease
WO2024062138A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 Mnemo Therapeutics Immune cells comprising a modified suv39h1 gene

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998006863A1 (en) * 1996-08-14 1998-02-19 The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services A vector for polynucleotide vaccines
WO1999031140A1 (en) * 1997-12-12 1999-06-24 Genentech, Inc. TREATMENT WITH ANTI-ErbB2 ANTIBODIES
WO2000069460A1 (en) * 1999-05-14 2000-11-23 Genentech, Inc. TREATMENT WITH ANTI-ErbB2 ANTIBODIES
WO2001015730A1 (en) * 1999-08-27 2001-03-08 Genentech, Inc. DOSAGES FOR TREATMENT WITH ANTI-ErbB2 ANTIBODIES
US7371376B1 (en) * 1996-10-18 2008-05-13 Genentech, Inc. Anti-ErbB2 antibodies

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1989006692A1 (en) 1988-01-12 1989-07-27 Genentech, Inc. Method of treating tumor cells by inhibiting growth factor receptor function
EP0778848B1 (en) 1994-08-30 2007-12-26 University of Dundee Agents for inducing apoptosis and applications of said agents in therapy
WO2005011607A2 (en) * 2003-08-01 2005-02-10 Smithkline Beecham Corporation Treatment of cancers expressing p95 erbb2
JP2006316040A (ja) * 2005-05-13 2006-11-24 Genentech Inc Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）補助療法
ES2342646B1 (es) * 2008-06-02 2011-04-26 Institut De Recerca Hospital Universitari Vall Hebron Metodo de diagnostico de canceres que expresan el receptor her-2 o sus variantes truncadas.
SG177252A1 (en) * 2008-12-01 2012-03-29 Lab Corp America Holdings METHODS AND ASSAYS FOR MEASURING p95 AND/OR p95 IN A SAMPLE AND ANTIBODIES SPECIFIC FOR p95

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998006863A1 (en) * 1996-08-14 1998-02-19 The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services A vector for polynucleotide vaccines
US7371376B1 (en) * 1996-10-18 2008-05-13 Genentech, Inc. Anti-ErbB2 antibodies
WO1999031140A1 (en) * 1997-12-12 1999-06-24 Genentech, Inc. TREATMENT WITH ANTI-ErbB2 ANTIBODIES
WO2000069460A1 (en) * 1999-05-14 2000-11-23 Genentech, Inc. TREATMENT WITH ANTI-ErbB2 ANTIBODIES
WO2001015730A1 (en) * 1999-08-27 2001-03-08 Genentech, Inc. DOSAGES FOR TREATMENT WITH ANTI-ErbB2 ANTIBODIES

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANIDO JUDIT ET AL: "Biosynthesis of tumorigenic HER2 C-terminal fragments by alternative initiation of translation.", EMBO JOURNAL., OXFORD UNIVERSITY PRESS, SURREY., GB, vol. 25, no. 13, 12 July 2006 (2006-07-12), GB, pages 3234 - 3244, XP002540505, ISSN: 0261-4189, DOI: 10.1038/SJ.EMBOJ.7601191 *
SÁEZ ROSANA ET AL: "p95HER-2 predicts worse outcome in patients with HER-2-positive breast cancer.", CLINICAL CANCER RESEARCH, THE AMERICAN ASSOCIATION FOR CANCER RESEARCH., US, vol. 12, no. 2, 15 January 2006 (2006-01-15), US, pages 424 - 431, XP002540504, ISSN: 1078-0432, DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-05-1807 *
SCALTRITI MAURIZIO ET AL: "Expression of p95HER2, a truncated form of the HER2 receptor, and response to anti-HER2 therapies in breast cancer.", NATIONAL CANCER INSTITUTE. JOURNAL (ONLINE), OXFORD UNIVERSITY PRESS, GB, vol. 99, no. 8, 18 April 2007 (2007-04-18), GB, pages 628 - 638, XP002540506, ISSN: 1460-2105, DOI: 10.1093/JNCI/DJK134 *

Also Published As

Publication number Publication date
AU2009265921A1 (en) 2010-01-07
DK2293819T3 (en) 2014-12-08
CY1115798T1 (el) 2017-01-25
CN102202692B (zh) 2014-03-12
WO2010000565A1 (en) 2010-01-07
HK1157658A1 (en) 2012-07-06
KR20110031187A (ko) 2011-03-24
EP2293819A1 (en) 2011-03-16
IL209769A0 (en) 2011-02-28
US8389227B2 (en) 2013-03-05
MX2010013419A (es) 2011-08-15
KR20160140974A (ko) 2016-12-07
KR101785117B1 (ko) 2017-11-07
AU2015202854A1 (en) 2015-06-18
IL209769A (en) 2016-04-21
BRPI0914969A2 (pt) 2015-10-20
JP2015214546A (ja) 2015-12-03
EP2293819B1 (en) 2014-09-03
US20090311262A1 (en) 2009-12-17
PL2293819T3 (pl) 2015-04-30
ZA201009010B (en) 2012-03-28
ES2342646A1 (es) 2010-07-09
CN102202692A (zh) 2011-09-28
JP2011525175A (ja) 2011-09-15
HRP20141158T1 (hr) 2015-02-13
ES2528132T3 (es) 2015-02-04
AU2009265921B2 (en) 2015-04-02
ES2342646B1 (es) 2011-04-26
PT2293819E (pt) 2014-12-09
JP5753079B2 (ja) 2015-07-22
SI2293819T1 (sl) 2015-01-30
EA201001874A1 (ru) 2011-08-30
CA2727365A1 (en) 2010-01-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA025218B1 (ru) Способ диагностики злокачественных новообразований, экспрессирующих рецептор her2 или его укороченные варианты
JP5852306B2 (ja) Ｈｅｒ２末端切断型変異体ｃｔｆ−６１１に対する抗体
Leeming et al. Enzyme‐linked immunosorbent serum assay specific for the 7S domain of collagen type IV (P4NP 7S): a marker related to the extracellular matrix remodeling during liver fibrogenesis
RU2651513C2 (ru) Новое антитело для диагностики и (или) прогнозирования рака
KR20080106157A (ko) Ｆａｓ 결합 항체
TWI782000B (zh) 抗ｇｐｒ２０抗體、其製造方法及其應用
US20160151405A1 (en) Pappalysin Regulator
JP2018525400A (ja) Ｖｉｉｉ型コラーゲン配列のイムノアッセイ
WO2006091326A1 (en) Anti-prl-3 antibodies and methods of use thereof
JP2015184195A (ja) Ｎｌｒｒ１細胞外ドメインタンパク質を検出する方法
WO2023190820A1 (ja) 抗ＣＫ２α抗体又はその断片
JP6729917B2 (ja) ＥｐｈＡ２ Ｎ末端フラグメント抗体
US7160989B2 (en) Antibodies that recognize and bind phosphorylated human androgen receptor and methods of using same
JP4319700B1 (ja) 酸化修飾タンパク質またはポリペプチドに対する高特異性モノクローナル抗体

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): RU