MX2010013419A - Procedimiento de diagnostico de canceres que expresan el receptor her2 o sus variantes truncadas. - Google Patents

Abstract

La presente invención hace referencia a un método de diagnóstico y terapia de cánceres que expresan el receptor HER2. La invención proporciona anticuerpos o fragmentos del mismo que reconocen un epítope de una forma truncada del receptor HER2, dicho epítope es definido por una secuencia incluida en SEQ ID NO: 2. La invención también proporciona un método de diagnóstico de cáncer, que comprende la detección de la presencia de una forma truncada del receptor HER2 que consiste de una secuencia de aminoácidos SEQ JD NO: 1 en una muestra de paciente.

Description

PROCEDIMIENTO DE DIAGNÓSTICO DE CÁNCERES QUE EXPRESAN EL RECEPTOR HER2 O SUS VARIANTES TRUNCADAS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un procedimiento de diagnóstico en muestras aisladas de cánceres que se expresa el receptor HER2. La invención también propone compuestos de aplicación en el diagnóstico y la identificación precoz del cáncer así como de aplicación en terapia.

ESTADO DE LA TÉCNICA HER2 (también conocida como c-erbB2, ErbB2 o Neu) es una proteína transmembrana del tipo I que pertenece a la familia del receptor del factor de crecimiento epidérmico o EGFR (del inglés Epidermal Growth Factor Receptor), también conocido como HER1 o ErbB1. Dos miembros adicionales, HER3 y HER4 completan esta familia. Cuando HER1 , 3 o 4 se unen a un ligando tipo EGFr su dominio extracelular adopta la conformación denominada "abierta", la cual permite la formación de homodímeros y heterodímeros. Por el contrario, HER2 aunque no se una a ningún ligando, también interacciona con otros receptores HER unidos a ligando, debido a que su dominio extracelular está de manera constitutiva en conformación "abierta".

La dimerización dirigida por el dominio extracelular conduce a la interacción de las quinasas intracelulares de los receptores HER y a la subsiguiente transfosforilación de algunos residuos de tirosina. Estas fosfotirosinas, actúan como acopladores de un grupo de proteínas intracelulares de unión a fosfotirosinas. Las interacciones establecidas en la membrana plasmática son transducidas al núcleo celular por medio de distintas vías de señalización, tales como la vía de la proteína quinasa activada por mitógeno activada por proteína qüinasa (MAPK), la vía de la proteína quinasa activada por estrés, la fosfolipasa C gamma, etc. Todos estos circuitos de señalización controlan la expresión de genes que actúan de manera coordinada para modificar aspectos determinantes del estado celular, tales como la proliferación celular, la migración, la supervivencia y la adhesión. Así, dependiendo del contexto celular, la activación de los receptores HER resulta en una respuesta celular dramática que puede ir desde la transformación a célula maligna a una senescencia prematura.

Además del modo de señalización canónico, los receptores HER o fragmentos de los mismos pueden ser endocitados y transportados al núcleo, donde directamente pueden regular la expresión de ciertos genes. Este hecho se ha observado para el caso concreto de HER2 (Wang et al., "Binding at and transactivation of the COX-2 promoter by nuclear tyrosine kinase receptor ErbB-2", Cáncer Cell-2004, Vol. 6, pp. 251-261), así como para un fragmento carboxiterminal (CTF, del inglés Carboxy Terminal Fragments), que consiste en una forma truncada del receptor HER4, que incluye el dominio citoplasmático entero (Linggi et al., "ErbB-4 s80 intracellular domain abrogates ET02-dependent transcriptional repression", J. Bioloqical Chemistry-2006. Vol. 281, pp. 25373-25380).

En tumores mamarios humanos se han encontrado frecuentemente una serie de fragmentos carboxiterminales o CTFs (del inglés Carboxy Terminal Fragments), que se asume que incluyen los dominios transmembrana y citoplasmático de HER2. (Molina et al, "NH(2)-terminal truncated HER2 protein but not full-length receptor is associated with nodal metástasis in human breast cáncer", Clinical Cáncer Research-2002, Vol. 8, pp. 347-353). Se conoce además que las pacientes con cáncer de mama que expresan los CTFs de HER2 ,o, lo que es lo mismo, formas truncadas que no incluyen el extremo N-terminal de HER2 (HER2 CTFs), tienen mayor probabilidad de desarrollar metástasis (Molina et al. 2002 - supra) y un pronóstico peor que aquellas pacientes que expresan predominantemente la forma completa de HER2 (Sáez et al., "p95HER2 predicts worse outcome in patients with HER2-positive breast cáncer", Clinical Cáncer Research-2006, Vol. 12, pp. 424-431).

Por ello, resulta muy importante poder detectar a tiempo la presencia de HER2 en tumores y más aún poder determinar si está en forma completa o truncada (CTF).

Hoy en día, a nivel de clínica rutinaria se usan anticuerpos para detectar la presencia de la forma completa de HER2, a fin de determinar ante qué tipo de tumor mamario nos encontramos. En el caso de detectarse la presencia de HER2, la terapia recomendada consiste en la administración de anticuerpos monoclonales terapéuticos, tal cómo el trastuzumab de Genentech. El uso de este anticuerpo monoclonal para el tratamiento del cáncer, aparece descrito en el documento de solicitud de patente WO 8906692 de Genentech. En WO 8906692 se describen anticuerpos monoclonales o policlonales dirigidos contra la región extracelular de HER2, coincidiendo esta región extracelular con el dominio externo completo de la proteína, que es su extremo N-terminal. Según se ha indicado anteriormente, los epítopos reconocidos por los anticuerpos citados en WO 8906692 son regiones antigénicas del dominio extracelular de la forma completa de HER2 y no incluyen formas truncadas o fragmentos carboxiterminales de HER2. Por ello, con los anticuerpos y el procedimiento de diagnóstico descritos en WO 8906692 no se podrá detectar la presencia de HER2 truncados (CTFs). Además, en tumores mamarios donde dichos CTFs de HER2 se expresan, los anticuerpos como el trastuzumab no resultan terapéuticos, puesto que no reconocen a ningún epítopo. Este hecho explica la resistencia al tratamiento con trastuzumab que se observa en los pacientes que expresan formas truncadas (CTFs) de HER2.

Los pacientes que expresan formas truncadas o CTFs de HER2 deberían ser tratados con terapias alternativas para evitar las cifras de pronóstico pobre observadas por Sáez et al 2006 (supra). Con la finalidad de detectar (diagnosticar) y tratar cuanto antes a las personas que tengan tumores en los que se expresan formas truncadas de HER2, resulta muy interesante poder diferenciar qué tipo de forma de HER2 se expresa para luego actuar en consecuencia.

En el documento de Anido et al., "Biosynthesis of tumorigenic HER2 C-terminal fagments by alternative initiation of translation", European Molecular Biology Organization (EMBO) Journal - 2006, Vol. 25, pp. 3234-3244, se describe que, además del fragmento generado por la acción de las alfa-secretasas sobre HER2, que da lugar a una forma truncada (CTF) conocida como P95, que incluye el fragmento transmembrana y citoplasmático del receptor, también se generan dos formas truncadas (CTF), mediante un mecanismo de iniciación alternativa de la traducción a partir de dos metioninas situadas aguas arriba y aguas abajo, respectivamente, del dominio transmembrana de HER2. Concretamente, las metioninas para iniciación alternativa de la traducción corresponden a la metionina 611 y a la metionina 687 de la secuencia de aminoácidos con el número de acceso M11730.1 de la base de datos UniGene del National Center for Biotechnology Information (NCBI). Este documento también demuestra que estas formas alternativas del receptor HER2 (CTFs) están presentes en tumores mamarios. Concretamente, se indica que la más abundante corresponde a la forma denominada CTF687, o lo que es lo mismo, a la proteína obtenida por la iniciación alternativa de la traducción a partir de la metionina en posición 687. Anido et al. propone como terapia el uso de inhibidores de la actividad tirosinquinasa de HER2, tal como lapatinib, para minimizar el crecimiento de los tumores que expresan estas formas truncadas de HER2. Los inhibidores de la tirosinquinasa actúan interaccionando con el extremo C-termmal del receptor HER2 que está presente de forma íntegra tanto en el receptor completo como en los CTFs derivados del mismo o producidos por iniciación alternativa de la traducción.

El documento de Scaltriti et al, "Expression of p95HER2, a truncated form of the HER2 Receptor, and response to anti-HER2 therapies in breast cáncer", Journal of National Cáncer lnstitute-2007, Vol. 99, pp. 628-368, representa un ejemplo de estudio de metodología alternativa para detectar la presencia de una de las formas truncadas del receptor HER2 y detalla algunas de las posibles causas de la resistencia al tratamiento con trastuzumab (Herceptin). Concretamente, se hace hincapié en la acumulación del fragmento p95HER2 (producto de proteólisis de HER2 por alfa-secretasas) y otras formas truncadas del receptor, las cuales no poseen el dominio extracelular reconocido por el Trastuzumab. Scaltriti propone un procedimiento de inmunofluorescencia para detectar el fragmento p95HER2 (producto de proteólisis por alfa-secretasas). Este nuevo procedimiento de detección puede realizarse en secciones de tejido embebidas en parafina y fijadas con formalina según los protocolos de rutina clínicos. La nueva metodología deriva de observar que la forma truncada p95HER2, y no la forma entera del receptor, se localiza tanto en la membrana plasmática como en el citoplasma de la célula. Este procedimiento propone comparar si existe expresión de p95HER2 mediante tinción del citoplasma detectada con un anticuerpo anti-HER2 que se une al dominio citoplasmático del receptor; y en confirmar estos resultados con los de una detección con un anticuerpo anti-citoqueratina, una proteína cuya distribución ha sido ampliamente usada como herramienta para el diagnóstico de tumores. Sin embargo ho está claro que este procedimiento distinga eficientemente aquellos tumores que expresan la forma completa de HER2 de aquellos que expresen las formas truncadas.

Existe la necesidad de localizar nuevas y eficientes dianas diagnósticas y terapéuticas, que correlacionen bien con el tipo de cáncer y permitan tratar a tiempo con terapias eficientes aquellos tumores de peor pronóstico, descartando de entrada aquellas terapias que se ha visto que no resultan eficaces.

La presente invención aporta ventajas a los problemas citados anteriormente y supone una solución novedosa en la clasificación precoz del cáncer, especialmente el cáncer de mama.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Se ha determinado que la presencia de una de las formas truncadas (CTF) de HER2, generada por iniciación alternativa de la traducción, correlaciona muy bien con la predicción del tipo de cáncer que debe ser tratado, facilitando la tarea del facultativo a la hora de prescribir una pauta de tratamiento. Esta forma truncada (CTF-61 1) de HER2 ha sido identificada y se encontró que tenía la secuencia SEQ ID NO:1.

Esta secuencia se ha usado para el desarrollo de múltiples herramientas para poder detectar su presencia en muestras de tejidos aportándose, de esta forma, un conjunto diagnóstico nuevo y sólido, que además es aplicable a la rutina clínica.

La presente invención propone también nuevos anticuerpos, o fragmentos de los mismos, que reconocen esta forma truncada o CTF de HER2, que no es reconocida por trastuzumab. Estos anticuerpos reconocen un epítopo que se define mediante una secuencia incluida en la SEQ ID NO: 2. La invención también propone líneas celulares hibridoma apropiadas para producir tales anticuerpos. Los anticuerpos anti-HER2 actualmente disponibles reconocen CTF y HER2 o sólo HER2, haciendo muy difícil discriminar pacientes que expresan HER2 y CTF. En contraste con los anticuerpos anti-HER2 disponibles, los anticuerpos descritos en el presente documento se unen preferentemente a CTF-611 , permitiendo identificar pacientes que expresan este CTF.

La presente invención se refiere también a un procedimiento de diagnóstico de cáncer en muestras de pacientes que comprende la detección de la presencia en la citada muestra de la forma truncada del receptor HER2 que consiste en la SEQ ID NO: 1.

La presente invención propone también el uso del anticuerpo o del fragmento del mismo de la presente invención para el diagnóstico y la determinación de pronóstico en muestras aisladas de cánceres en los que se expresa el receptor HER2.

La presente invención propone además un agente de diagnóstico y determinación de pronóstico en muestras aisladas de cánceres en los que se expresa el receptor HER2 y/o fragmentos C-terminales, que comprende al menos un anticuerpo o un fragmento del mismo según se ha descrito anteriormente.

La presente invención propone también un kit de diagnóstico y de determinación de pronóstico en muestras aisladas de cánceres en los que se expresa el receptor HER2 que comprende medios de detección de la presencia, en la citada muestra, de la forma truncada del receptor HER2 que consiste en la SEQ ID NO: 1.

La invención propone también un anticuerpo o un fragmento del mismo según se ha detallado anteriormente para el uso en terapia en la preparación de un medicamento. Concretamente, el medicamento es para el tratamiento o la prevención de cánceres en los se expresa al menos la forma truncada del receptor HER2 que consiste en la SEQ ID NO: 1.

Según otra característica de la invención, el uso de los anticuerpos o fragmentos es para la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de cánceres de mama en mamíferos, incluyendo humanos.

Otro objeto de la presente invención es una composición farmacéutica destinada al tratamiento de cánceres en los que se expresa al menos la forma truncada del receptor HER2 que consiste en la SEQ ID NO: 1 , que comprende un anticuerpo o un fragmento del mismo según se ha descrito anteriormente y al menos un excipiente y/o vehículo farmacéuticamente aceptables.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS FIGURA 1 : Esquema de la secuencia proteica de la forma truncada CTF-61 1 , comparada con la secuencia del receptor HER2 completo y con la forma truncada conocida como p95 (648-CTF/p95), producto de la proteólisis por alfa-secretasas. El dominio transmembrana está representado como una línea helicoidal. El resto de la molécula está indicado con una caja gris. La secuencia del péptido usada para generar anticuerpos mono y policlonales aparece subrayada. Las posiciones con puentes disulfuro intramoleculares también se indican con conexiones entre las cisternas.

FIGURA 2: Electroforesis y Western-blot (transferencia a membrana) de muestras de cáncer de mama. (S) significa fracción soluble y (M) fracción membrana. Para la detección de HER2 completo y de la forma CTF-61 1 se usaron anticuerpos dirigidos al dominio citoplasmático de las proteínas. LDH: Lactato deshidrogenada (usado como control).

FIGURAS 3A y 3B: Resultados de la evaluación del número de tumores desarrollados en ratones transgénicos que expresan la forma truncada CTF-611 (FIG. 3A) en comparación con ratones transgénicos que expresan el receptor HER2 completo; y los resultados del volumen de los tumores detectados (FIG. 3B). En el eje de la Y, N y V significan, respectivamente, Número de tumores y Volumen de los mismos. En el eje de las X, T, significa tiempo en semanas.

La FIGURA 4A muestra una electroforesis y Western-Blot (transferencia a membrana) revelado con un anticuerpo (CB11) que reconoce el dominio citoplasmático del receptor HER2 (dominio común en todas las formas completas y truncadas) o bien con anticuerpos policlonales generados contra el péptido de SEQ ID NO: 3 (a-611-? y a-611-?). Los barriles corresponden a extractos de lisados celulares de células MCF7 (previamente transformadas con las construcciones de la FIG. 1) que expresan la forma completa del receptor HER2, la forma truncada CTF-611 y la forma truncada p95.

La FIGURA 4B muestra el resultado de un ensayo de inmunoprecipitación con los anticuerpos a-611-A, a-611-B y CB11 practicada en muestras que contenían tanto el receptor HER2 completo, como las formas truncadas CTF-611 y p95.

La FIGURA 5A Se lisaron células MCF7 que expresan HER2, 611-CTF o 648-CTF y se analizaron mediante Western-Blot con CB11 , un anticuerpo contra el dominio citoplasmático de HER2 o con dos anticuerpos anti-611-CTF monoclonales independientes generados contra el péptido MPIWKFPDEEGASQPSPINSTHSSVDLDDKGC (véase Fig. 1).

La FIGURA 5B Se mezclaron en proporción 1 :1 :1 los lisados de células MCF7 que expresan HER2, 611-CTF o 648-CTF y se sometieron a inmunoprecipitación con los anticuerpos monoclonales indicados. Como control negativo se realizó una inmunoprecipitación de prueba sin anticuerpos (-).

La FIGURA 5C Se analizaron células MCF7 que expresan HER2, 611-CTF o 648-CTF en un microscopio confocal mediante inmunofluorescencia indirecta con los anticuerpos indicados. Las FIGURAS 6A y 6B: Caracterización de anticuerpo monoclonal mediante citometría de flujo.

La FIGURA 7: Caracterización de anticuerpos monoclonales mediante inmunohistoquímica. Las FIGURAS 8A y 8B: Caracterización de epítopos. Fig. 8A: Gráfico que muestra la secuencia primaria de la región yuxtamembrana de 611-CTF y la secuencia de las diferentes construcciones usadas para mapear los epítopos. Fig. 8B Western blot.

Las FIGURAS 9A y 9B: Análisis de muestras de cáncer de mama. Fig. 9A Tabla con resultados analíticos. Fig. 9B tinción inmunocitoquímica.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN CTF-611 Según se ha mencionado anteriormente, los inventores localizaron que, sorprendentemente, la detección diferencial de dicha forma truncada de HER2 con SEQ ID NO; 1 , correlaciona muy bien con la manifestación de un tipo de cáncer común en tejido mamario y de pronóstico pobre. Así, la FIG. 3 muestra los resultados de la evaluación del número de tumores desarrollados en ratones transgénicos que expresan la forma truncada CTF-611 (SEQ ID NO: 1).

Para obtenerse los resultados de esta FIG. 3, se expresaron en epitelio mamario de ratones construcciones de cDNA que codificaban por la SEQ ID NO: 1 humana (CTF-611), identificados en la figura según M611-CTF. La construcción comprende la SEQ ID NO: 1 bajo control del promotor del virus de tumor mamario de ratón (MMTV) (Mouse Mammary Tumor Virus). Como control se usó la línea de ratón FVB/N-Tg(MMTVneu)202J que expresa la forma completa de HER2, también bajo el control del promotor del MMTV. Según se desprende de la FIG. 3A, el número de tumores en los ratones que expresan la construcción de cDNA con la forma CTF-611 (SEQ ID NO: 1) es mucho mayor que el de la línea FVB/N-Tg(MMTVneu)202J, identificados en esta figura con la designación HER2/neu. Los tumores en los animales transgénicos se detectaron a las 17 semanas de edad de los animales transgénicos que expresan CTF-611 , que representa tres meses antes de la primera detección en ratones FVB/N-Tg(MMTVneu)202J. Este hecho explicaría la mayor agresividad de tumores expresores de fragmentos de HER2 respecto de aquellos tumores expresores de la forma completa. En la FIG. 3B puede verse además, que el volumen de los tumores es mucho mayor en los animales que expresaban la forma truncada CTF dé HER2 con la SEQ ID NO: 1 , respecto de aquellos animales que expresan de forma constitutiva el receptor entero, también denominado HER2/neu. Este segundo hecho explica también la mayor agresividad de este tipo de tumores. Los inventores determinaron también que aquellos tumores que expresaban la forma truncada de secuencia SEQ ID NO: 1 presentaban unos índices de metástasis pulmonar superiores a los observados en los tumores que expresan HER2/neu. Se proponen experimentos adicionales que prueban la relevancia clínica en el ejemplo 9 a continuación.

Todos estos datos con animales transgénicos ponen de manifiesto que resulta muy necesaria la detección diferencial de la forma truncada del receptor HER2 de SEQ ID NO: 1 respecto de la forma completa del receptor.

Evidentemente, dicha SEQ ID NO: 1 incluye todas aquellas variantes procedentes de variaciones alélicas entre individuos, las cuales suponen variaciones en número y tipo, de algunos aminoácidos, tal como dos o tres aminoácidos de más o de menos, o la sustitución de un aminoácido por otro que no modifica la estructura global del receptor.

Estas formas truncadas de HER2 pueden contener neo-epítopos, esto es, huevos determinantes antigénicos no presentes en la molécula del receptor entero, con lo cuál, no interaccionan de la misma manera con las moléculas que si lo hacen con el receptor entero (anticuerpos, fármacos, etc.).

Anticuerpos para CTF-611 Los inventores pudieron producir un anticuerpos para CTF-611 tanto policlonales como monoclonales. Estos anticuerpos reconocen un epítopo que se define por una secuencia incluida en la SEQ. ID NO: 2, preferiblemente mediante una secuencia incluida en o definida mediante la SEQ. ID NO: 3. Los más preferidos son anticuerpos que reconocen un epítopo que está incluido en o definido por MPIWKFPDEEGAS (SEQ. ID NO: 5).

Por epítopo se entiende en el contexto de la presente invención aquella parte de una macromolécula (o de un antígeno) de naturaleza peptídica, cuya secuencia y/o configuración espacial es reconocida por el sistema inmune (anticuerpos, células T, células B).

Los anticuerpos de la presente invención pueden distinguir preferiblemente la proteína de SEQ. ID NO:1 del receptor HER2. Además, los anticuerpos de la presente invención pueden distinguir preferiblemente la proteína de SEQ. ID NO:1 de la forma truncada 648-CTF/p95 del receptor HER2. Puede visualizarse esta distinción mediante una o más de inmunofluorescencia, citometría de flujo, inmunohistoquímica en células cultivadas, e inmunohistoquímica en muestras de pacientes. Es particularmente preferido que pueda cuantificarse la distinción tanto en citometría de flujo como en inmunoprecipitación.

Según la presente invención, la unión de los anticuerpos de la presente invención a 611-CTF es preferiblemente al menos 300 veces, más preferiblemente al menos 1000 veces, más preferiblemente de 1000 a 2000 veces más fuerte que su unión a HER2 en un experimento de inmunoprecipitación, tal como se describe con más detalle en el ejemplo 3 (usando 5 microgramos de 32H2 y 5 microgramos de 20F4).

Tal como se ha citado anteriormente, el anticuerpo puede ser policlonal o monoclonal.

En el sentido de la presente invención debe entenderse por "anticuerpo policlonal" al conjunto de anticuerpos producidos por distintas líneas de células B (linfocitos B). Los anticuerpos policlonales son mezclas de inmunoglobulinas secretadas contra un antígeno (macromolécula), cada una de estas inmunoglobulinas capaz de reconocer un epítopo diferente, por proceder de una célula B diferente. Así, dentro de las distintas poblaciones de inmunoglobulinas contenidas en un anticuerpo policlonal existe un tipo de inmunoglobulina que reconoce el epítopo o epítopos de interés de un determinado antígeno.

Pueden producirse anticuerpos policlonales por ejemplo conjugando el péptido de SEQ. ID NO: 2, SEQ. ID NO: 3, SEQ. ID NO: 4 o SEQ. ID NO: 5 con un inmunogen tal como Keyhole-limpet hemocyanin (hemocianina de Megathura crenulata) e inmunizando conejos con este conjugado.

Pueden producirse anticuerpos monoclonales usando el mismo inmunogen o inmunogenes similares. Pueden producirse líneas celulares de hibridoma de una manera conocida para el experto en la técnica. La línea celular hibridoma puede hacerse crecer en un medio de cultivo apropiado del que se recupera el anticuerpo monoclonal.

En una realización preferida, se producen por la línea celular hibridoma depositada en la "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zeilkulturen GMBH (DSMZ)" con el número de acceso DSM ACC2904 de acuerdo con el Tratado de Budapest del 9 de Abril de 2008, o por la línea celular hibridoma depositada en la "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zeilkulturen GMBH (DSMZ)" con el número de acceso DSM ACC2980 de acuerdo con el Tratado de Budapest del 6 de noviembre de 2008.

Son particularmente preferidos los anticuerpos monoclonales producidos con estas líneas celulares hibridoma, así como los anticuerpos monoclonales que son al menos funcionalmente equivalentes. Al menos funcionalmente equivalentes son aquellos anticuerpos que pueden discriminar entre CTF-611 y HER2 igualmente bien o incluso mejor. Anticuerpos útiles incluyen también anticuerpos humanizados y humanos.

Por tanto, la presente invención propone también los péptidos aislados de secuencia SEQ. ID NO: 2, SEQ. ID NO: 3, SEQ. ID NO: 4 o SEQ. ID NO: 5.

En lugar del anticuerpo completo, puede usarse un fragmento del mismo según la presente invención. Los fragmentos del anticuerpo se seleccionan del grupo formado por F(ab), F(ab') y Fv. En el contexto de la presente invención, un fragmento de un anticuerpo significa una parte del anticuerpo, que es de un tamaño suficiente y conformación adecuada para unirse a un epítopo presente en la forma truncada del receptor HER2 y así permitir su detección en una muestra.

Los ejemplos 2 y 3 muestran anticuerpos concretos. Evidentemente, la invención se extiende a otros anticuerpos policlonales o monoclonales dirigidos contra el epítopo de la forma truncada CTF-611 que queda definido por las secuencias SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3, puesto que, a partir de las enseñanzas de esta invención se derivan de manera directa para un experto en la materia. Del mismo modo, la invención se extiende a fragmentos de dichos anticuerpos, tal como F(ab), F(ab'), Fv, etc., o cualquier línea celular hibridoma capaz de producir anticuerpos monoclonales dirigidos contra los péptidos de SEQ ID NO:2 y SEQ, ID NO: 3.

Procedimientos de diagnóstico En el procedimiento de diagnóstico según la invención la detección de la presencia de la forma truncada del receptor HER2 se lleva a cabo con medios seleccionados independientemente del grupo formado por: detección por migración diferencial en un sistema de fase móvil - fase estacionaria de la forma truncada del receptor HER2 que consiste en la SEQ ID NO: 1 respecto de la forma completa del citado receptor HER2; y detección por unión con anticuerpos específicos de la forma truncada del receptor HER2 que contiene la SEQ ID NO: 1.

Por detección por migración diferencial debe entenderse, en el contexto de la presente invención, toda técnica analítica que permita separar los compuestos a detectar en base a su distinta movilidad en un sistema fase móvil-fase estacionaría determinado, tal como una electroforesis. Dicha movilidad distinta puede venir originada por distinta carga eléctrica en el compuesto, distinto peso molecular o distinta afinidad por otros compuestos.

Esta detección diferencial puede llevarse a cabo mediante múltiples técnicas analíticas ampliamente conocidas por el experto en la materia como electroforesis de proteínas, cromatografías de exclusión molecular, ensayos de afinidad con anticuerpos, inmunofluorescencia, inmunocitoquímica, citometría de flujo, etc. La inmunohistoquímica es particularmente preferida. Pueden combinarse uno o más de estos procedimientos para potenciar la fiabilidad.

La detección diferencial de la forma truncada del receptor HER2 que consiste en la SEQ ID NO: 1, también denominada en esta invención CTF-611 , respecto del receptor HER2 entero 0 completo, implica poder visualizar dos proteínas con pesos moleculares distintos y secuencias diferentes según se desprende de la FIG. 1. La forma truncada con SEQ ID NO: 1 consiste en la proteína resultante de la iniciación alternativa de la traducción por la metionina 611 de la secuencia completa del receptor HER2, Esta forma o CTF comprende pues un nuevo dominio extracelular, un fragmento transmembrana y un dominio citosólico. El fragmento transmembrana y el dominio citosólico son iguales a los de la forma completa del receptor HER2. Otra forma truncada corresponde a la de la FIG, 1 referencíada como p95 o CTF-648. Esta última forma es el producto de la acción de las alfa-secretasas sobre el receptor HER2 completo, las cuales escinden gran parte del dominio extracelular.

Según otra realización de la invención, la etapa de detección de la presencia en la muestra de la forma truncada del receptor HER2 que consiste en la SEQ ID NO: 1 , comprende la detección, con al menos un anticuerpo, tal como se definió anteriormente. En una realización particular, el procedimiento de diagnóstico según la invención, comprende la detección del epítopo definido por la SEQ ID NO: 3.

En una realización de la invención, los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la presente invención se usan como agentes de diagnóstico y determinación de pronóstico, ya sea marcados de manera directa en su misma secuencia peptídica (por ejemplo con radioisótopos) o de manera indirecta (por ejemplo por adición o unión a un agente fluorescente o capaz de producir fluorescencia por reacción en un medio de reacción seleccionado), todo ello con la finalidad de generar una señal visible, y a ser posible cuantificable, con la que detectar en una muestra la presencia de la forma truncada del receptor HER2 que consiste en la secuencia SEQ ID NO: 1 en una muestra.

Del mismo modo, se prevé que el agente diagnóstico que contiene al menos los anticuerpos pueda estar adherido a un soporte sólido, directa o indirectamente mediante un brazo espaciador. Un agente de este tipo permite capturar la forma de secuencia SEQ ID NO: 1 de una muestra, para determinar luego su presencia con otros anticuerpos ya no específicos (tales como el CB11).

Los agentes diagnósticos y de determinación de pronóstico según la invención, pueden aplicarse también en protocolos de inmunohistoquímica. Para ello, los anticuerpos monoclonales o policlonales (primarios o secundarios) deben estar debidamente marcados para dar una señal visible, y en el mejor de los casos cuantificable, una vez han entrado en contacto con el tejido ensayado y se les ha permitido interaccionar con las proteínas que pretenden ser detectadas, esto es, con el fragmento CTF de HER2 de secuencia SEQ ID NO: 1.

Con la finalidad de facilitar al facultativo la tarea del análisis, diagnóstico y determinación de pronóstico, se prevé que se proporcione el agente diagnóstico en forma de un kit que incluye, además de los anticuerpos, los reactivos (por ejemplo reactivos necesarios para la tinción inmunohistoquímica), los tampones y las soluciones de detección adaptados para determinar en una muestra la presencia de la forma truncada de SEQ ID NO: 1 , posiblemente portaobjetos de control que representen diferentes niveles de expresión de CTF-611 y posiblemente instrucciones detalladas, que asistan al facultativo en la valoración del diagnóstico. El kit también puede comprender un medio para llevar a cabo un ensayo inmunohistoquímico cuantitativo para la determinación de HER2 (tal como Herceptast™).

Así, la invención proporciona un kit de diagnóstico y determinación de pronóstico que comprende al menos un anticuerpo o un fragmento del mismo, dicho anticuerpo o fragmento capaz de reconocer el epítopo definido por la SEQ ID NO:2 o la SEQ ID NO: 3 o la SEQ ID NO: 5, además de los medios de reacción y tampones apropiados para que se lleve a cabo la interacción del anticuerpo con el epítopo y que son ampliamente conocidos por los expertos en la materia.

El procedimiento de diagnóstico de la presente invención y el kit de la presente invención pueden permitir la predicción de metástasis nodal, pronóstico pobre y resistencia a Herceptin™.

Otro tipo de kit también objeto de la invención, comprende todos aquellos medios necesarios para llevar a cabo una detección por migración diferencial de la forma truncada del receptor HER2, que consiste en la secuencia SEQ ID NO: 1 , respecto de la forma completa del receptor HER2.

Dentro del conjunto de cánceres que expresan el receptor HER2 o sus variantes truncadas, destaca el cáncer de mama. Otros cánceres en los que también se expresan estas proteínas son el cáncer de pulmón, páncreas, colon, estómago, próstata, cabeza y cuello, piel, riñon, testículo, tiroides, vejiga urinaria, útero, vulva, endometrio, ovario, esófago, boca, glándula salivar, laringe, peritoneo, región nasofaríngea, trompas de Falopio, tumores de Wums, así como linfomas, sarcomas de Swing, sarcoma sinovial, meduloblastomas, tumores trofoblásticos, gliomas, glioblastomas, colangiocarcinomas, colesteatoma, condrosarcoma, ependimoma, neurilemomas, neuromas, rabdomiosarcomas. Así, el procedimiento de diagnóstico de la presente invención es particularmente adecuado para diagnosticar uno de estos cánceres. Además de la detección ex vivo de CTF, los anticuerpos pueden usarse para imagen in vivo.

Procedimientos terapéuticos Los anticuerpos de la presente invención, o fragmentos de los mismos, también son útiles en terapia, particularmente en terapia de cáncer, particularmente de aquellos cánceres que expresan el receptor HER2 o sus variantes truncadas. Son preferidos los anticuerpos humanizados o humanos y fragmentos de los mismos.

Los anticuerpos de esta invención son usados también dentro de composiciones farmacéuticas útiles para el tratamiento de cánceres en los que se expresa al menos la forma truncada del receptor HER2 que consiste en la SEQ ID NO: 1. La composición comprende aquellos vehículos o excipientes aceptables farmacéuticamente y al menos un anticuerpo que reconoce el epítopo definido por las secuencias SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3. La composición farmacéutica también puede comprender una mezcla de antibióticos que, además de un anticuerpo de la presente invención, contiene otros anticuerpos contra HER2 o fragmentos de los mismos, tales como Herceptin™.

En base a las figuras aquí aportadas y siempre a modo de ejemplos ilustrativos y no limitativos, se describen a continuación el procedimiento de diagnóstico y determinación de pronóstico de cánceres en los que se expresa el receptor HER2 y/o fragmentos carboxiterminales del mismo (variantes truncadas); nuevos péptidos y anticuerpos específicos contra tales péptidos; nuevas líneas celulares; agentes diagnósticos y kits para la detección, todos ellos objetos de la invención.

Aunque no se especifique, todos los términos científicos y técnicos usados en esta redacción tienen el significado que de ellos deriva un experto de la técnica a la que la invención pertenece. Procedimientos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos aquí, pueden ser usados en la práctica de la presente invención. A lo largo de la descripción y de las reivindicaciones el término "comprende" y sus variaciones no excluyen otras características, aditivos, componentes o etapas. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

Además, debe entenderse que la presente invención cubre todas las posibles combinaciones de grupos preferidos y particulares descritas más arriba.

EJEMPLOS En los siguientes ejemplos pueden verse distintas formas de detectar la presencia de la forma truncada de secuencia SEQ ID NO: 1 , en una muestra aislada de cáncer del tipo que expresa el receptor HER2 y/o sus variantes truncadas.

Procedimientos experimentales Células. Se mantuvieron células MCF7 de Tet-Off (BD Bioscience) a 37 °C y con C02 al 5 % en DMEM/F-12 (1 :1 ) (Gibco) que contenía FBS al 10 % (Gibco), 4 mM de L-glutamina (PAA Laboratories), 0,2 mg/ml de G418 (Gibco) y 1 µg/ml de doxiciclina (Sigma). Se transfretaron las células con los diversos plásmidos de expresión usando FuGENE6 (Roche). Se seleccionaron clones estables simples con plásmidos de base pUHD10-3h integrados con 0,1 mg/ml de higromicina B (Invitrogen). Se indujo expresión de cDNA que codificaban pUHD10-3h de HER2 y CTF eliminando doxiciclina. En primer lugar, se separaron las células con Tripsin-EDTA al 0,5 % (GIBCO), se lavaron tres veces mediante centrifugación y se cambió el medio 10 horas después de sembrar las placas de cultivo. Se comprobó la homogeneidad de los clones individuales mediante microscopía confocal de inmunofluorescencia con un anticuerpo contra el dominio citoplasmático de HER2. Se usaron en los experimentos dos clones estables, seleccionados independientemente.

Western blot. Se lisaron células que expresaban las diferentes isoformas de HER2 en tampón RIPA modificado (20 mM de NaH2P04/NaOH pH7,4, 150 mM de NaCI, Tritón X-100 al 1 %, 5 mM de EDTA, 10 mM de PMSF, 25 mM de NaF, 16 Mg/ml de Aprotinina, 10 g/ml de Leupeptina y 1 ,3 mM de Na3V04) y se determinaron las concentraciones de proteínas con reactivos de ensayo de proteínas DC (BIO-RAD). Se mezclaron las muestras con tampón de carga (concentraciones finales: 62 mM de Tris pH6,8, glicerol al 12 %, SDS al 2,5 %) con betamercaptoetanol al 5 % y se incubaron a 99 °C durante 5 min antes de la fraccionación de 15 pg de proteína mediante SDS-PAGE. Se cuantificaron las señales específicas en Western blot con el software ImageJ 1.38 (NIH).

Inmunoprecipitación . Se incubaron los lisados celulares con diferentes anticuerpos durante 1 hora a 4 °C. Luego, se purificaron los inmunocomplejos con proteína A. Se lavaron los inmunoprecipitados tres veces con tampón de lisis, se mezclaron con tampón de carga y se analizaron mediante Western blot.

Se lavaron con PBS células para microscopía de inmunofluorescencia sembradas sobre cubreobjetos de vidrio, se fijaron con paraformaldehído al 4 % durante 20 min y se permeabilizaron con Tritón X-100 al 0,2 % durante 10 min. Para el bloqueo y la unión a anticuerpo se usó PBS con BSA al 1 %, Saponina al 0,1 % y NaN3 al 0,02 % y para el montaje Vectashield con DAPI (Vector laboratories).

Citometría de flujo. Se lavaron células MCF7 que expresan HER2, 611-CTF o 648- a 4 °C con PBS y se separaron en PBS que contenía 5 mM de EDTA. Se incubaron las células separadas con 10 pg/ml de anticuerpo monoclonal anti-32H2 que contenía BSA al 5 % durante 30 min a 4 °C, se lavaron y se tiñeron durante 30 min a 4 °C con anti-lgG de ratón conjugada con FITC (Becton-Dickinson) en PBS que contenía BSA al 5 %. Se realizó la citometría de flujo en un FACscan usando software de investigación de FACscan (Becton-Dickinson Immunocytometry Sys., Mountain View, CA).

Inmunohistoquímica. Se lavaron células MCF7 que expresan HER2, 611-CTF o 648- a 4 °C con PBS y se separaron en PBS que contenía 5 mM de EDTA. Luego, se centrifugaron las células y se fijaron los sedimentos en formalina neutra al 10 %, se deshidrataron y se incrustaron en parafina. Se colocaron secciones de sedimentos celulares o de tejidos humanos de 4 pm de grosor en portaobjetos de vidrio recubiertos de polilisina. Se realizaron análisis de inmunohistoquímica usando el siguiente protocolo: 1. Desparafinar y rehidratar la sección 1.1 Incubar los portaobjetos 30 min a 60 °C. 1.2 Desparafinar los portaobjetos con tres incubaciones de 5 min de xileno limpio, seguido de dos lavados de 3 min con etanol absoluto. 1.3 Llevar gradualmente a agua destilada: etanol 95 °C 3 min, etanol 70 °C 3 min, etanol 50 °C 3 min, agua destilada. 2. Recuperación de antigen PT-Link a bajo pH (6), SOLUCIÓN DE RECUPERACIÓN DE DIANA DE ENVISION FLEX, ALTO Ph 10x. DM 812. 20 min a 95 °C.

Lavar con tampón de lavado de Envision Flex, x10 DM 811 15 min. 3. Tinción inmunohistoquímica AUTOSTAINER plus Link DAKO KIT: ENVISION FLEX + RATÓN, Alto Ph (Link): Bloqueo de peroxidasa de Envision Flex, SM801.

Envision Flex/ HRP SM 802.

Envision Flex DAB+CHROMOGEN DM 807.

Tampón de Sustrato de Envision Flex, SM 803.

Tampón de lavado de Envision Flex, 10x DM 811.

Solución de recuperación de diana de Envision Flex, Alto Ph 10x DM 812.

Envision Flex+ Ratón (linker) SM 84.

Peroxidasa 5 min y lavar con tampón de lavado.

Bloqueo de proteína al 5 % 15-20 min.

Lavar con tampón de lavado. ¦ 32H2 diluido 1 :1000-1 :3000 (1 mg/ml de solución madre) o 20F4 diluido 1 :20-1 :50 (1 mg/ml de solución madre) 2 horas.

¦ Lavar con tampón de lavado.

¦ Secundario (Flex HRP, Flex+Ratón/Conejo) 20 min.

¦ Lavar con tampón de lavado.

¦ DAB 5 min.

¦ Lavar con tampón de lavado.

¦ Hematoxilina.

¦ Lavar con agua destilada. 3. Deshidratación y estabilización con medio de montaje 3.1 Lavar gradualmente con concentraciones incrementadas de etanol (50 %, 70 %, 95 %, 2 min cada lavado). 3.2 Llevar gradualmente a agua destilada (etanol 95 %, 70 %, 50 %, agua destilada, 3 min cada lavado) 3.3 Lavar con Xileno/eucaliptol (3 lavados de 2 min cada uno). 3.4 Montar con DPX.

Ratones transgénicos Se diseñaron ratones TG 611 y TG 687 clonando las secuencias que codifican 687-CTF y 611-CTF en el sitio II de clonación múltiple aguas abajo de la repetición terminal larga del virus de tumor mamario de ratón potenciado con el virus del sarcoma de Rous del vector pMB (un amable regalo del Dr. Marcos Malumbres, CNIO, Madrid). Se generaron líneas fundadoras microinyectando DNA de plásmido linealizado en ovocitos fertilizados cosechados a partir de ratones HVB superovulados en el Centro de Biología Animal y Terapia Genética (Centre de Biotecnología Animal i Terapia Génica, Universitat Autónoma de Barcelona). Se genotiparon ratones fundadores mediante análisis de hibridación de Southern. Después de la identificación de los animales fundadores, se realizó el mantenimiento de colonias de rutina mediante genotipado por PCR. Se obtuvieron ratones FVB/N-Tg(MMTVneu)202J macho y hembra del Laboratorio Jackson (Bar Harbor, ME).

Montajes completos e histología Se montaron glándulas mamarias sobre portaobjetos de vidrio, se fijaron durante la noche en paraformaldehído al 4 % y se transfirieron a etanol al 70 %. Se aclararon en agua durante 5 min y se tiñeron con una solución filtrada de carmín al 0,2 % durante 24 horas. Luego se deshidrataron secuencialmente las glándulas con concentraciones decrecientes de etanol, luego se desgrasan y se almacenan en salicilato de metilo. Para el análisis histológico, se bloquearon glándulas fijadas en parafina, se seccionaron y se tiñeron con hematoxilina y eosina.

EJEMPLO 1 : Detección del fragmento de SEQ ID NO: 1 por migración diferencial.

En la FIG. 2, que corresponde a una imagen de un gel de electroforesis y posterior transferencia tipo Western (Western-blot), se cargaron en los carriles distintas muestras de cáncer de mama (108, 114, 101 , 103, 131 , 134 y 145). De cada muestra se analizó tanto la fracción soluble del lisado celular (S), como la fracción membrana (M) para visualizar qué tipo de molécula de HER2 estaba presente y en qué fracciones. En principio, se espera que tanto el receptor completo como la forma de la SEQ ID NO: 1 estén en la membrana celular. Para la detección de HER2 completo y de la forma CTF-611 se usaron anticuerpos (CB11) dirigidos al dominio citoplasmático de las proteínas, que es un dominio común en ambas formas proteicas. Como control del análisis se detectó la presencia de la enzima Lactato deshidrogenada (LDH). En la mayoría de muestras aparecen bandas correspondientes al receptor HER2 entero y en la fracción membrana, una banda correspondiente a la forma CTF-611 de SEQ ID NO: 1.

La FIG. 2 demuestra entonces que la detección del tipo de formas truncadas del receptor HER2 puede llevarse a cabo mediante análisis por electroforesis de proteínas. Además, la presencia de un fragmento de HER2 de secuencia SEQ ID NO: 1 es indicativo de un determinado tipo de cáncer, en el caso del ejemplo, cáncer de mama, que debe ser evaluado y tratado como un caso particular dentro de los cánceres que expresan HER2.

EJEMPLO 2. Detección de la presencia del fragmento de HER2 de secuencia SEQ ID NO: 1 con anticuerpos policlonales dirigidos a neo-epítopos definidos por la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3.

Con la finalidad de poder detectar la presencia de la forma truncada de HER2, cuya secuencia es la descrita en SEQ ID NO: 1 , con medios alternativos a los de la detección por migración diferencial en una electroforesis, se sintetizó un péptido con la SEQ ID NO: 4 y se inmunizaron cuatro conejos con dicho péptido. Este péptido corresponde a los 32 amino ácidos del extremo N-terminal de la forma CTF-611 o de SEQ ID NO:1 , en el que la mayoría de cisteínas han sido sustituidas por serrinas con la finalidad de conjugarlo con el inmunógeno conocido como Keyhole-limpet hemocyanin (KLH).

La SEQ ID NO: 4 corresponde pues a un péptido equivalente al de la SEQ ID NO: 3, aunque adaptado para llevar a cabo la técnica de inmunización. Un experto en la materia entenderá que los anticuerpos dirigidos contra el péptido de síntesis SEQ ID NO: 4 reconocerán también el epítopo definido por la SEQ ID NO: 3 presente en la forma truncada del receptor HER2 (SEQ ID NO: 1 o CTF-611). Del mismo modo, un experto en la materia puede deducir que si el péptido de síntesis usado para la inmunización consiste en la SEQ ID NO: 2, que comprende todos los aminoácidos del receptor CTF-611 situados en la zona extracelular, los resultados con anticuerpos dirigidos contra este otro péptido son equivalentes y por ello útiles para el mismo fin.

Se realizó una electroforesis-SDS y posterior transferencia Western de extractos de lisados de células MCF7 (previamente transformadas con las construcciones de la FIG. 1), que expresaban la forma completa del receptor HER2, la forma truncada CTF-61 y la forma truncada p95. La forma truncada de SEQ ID NO: 1 apareció en realidad como dos fragmentos de peso molecular similar. Según se desprende con ensayos practicados con glicosidasa-F, una enzima que elimina N-glicanos de las proteínas (no representados), el fragmento CTF-611 es un sustrato de modificaciones post-traduccionales. Concretamente, un fragmento con aproximadamente 110 kDa corresponde a la forma que se sintetiza y que posteriormente entra en la ruta secretoria, en la cuál pasa a ser N-glicosilado.

El suero de dos de los conejos inmunizados reconoció tanto el receptor HER2 completo, como el CTF-611. Ello se deriva de la FIG. 4A, donde se detectan las bandas correspondientes tanto al receptor completo de HER2, como a la forma de SEQ ID NO: 1 o CTF-611. Según se indica en la citada FIG. 4A, el Western blot se reveló con un anticuerpo (CB11) que reconoce el dominio citoplasmático del receptor HER2 (dominio común en todas las formas, completa y truncadas); o bien con los anticuerpos policlonales generados contra el citado péptido de SEQ ID NO: 4 (a-611-A y a-611-B) y que están presentes en los sueros de los conejos. Por ser comparable la señal de HER2 completo y CTF-611 , se deduce que los anticuerpos a-611-A y a-611-B reconocen un epítopo lineal que está presente en ambas formas del receptor. Como control negativo en la electroforesis-SDS y Western blot se usó un lisado de células MCF7 que expresaba la forma del receptor conocida como p95, la cuál no posee el epítopo contra el que se habían diseñado los anticuerpos.

En contraposición a dichos resultados, cuando se llevó a cabo un experimento de inmunoprecipitación con los anticuerpos a-611-A y a-611-B y el anticuerpo CB11 , se detectó que los anticuerpos dirigidos contra el péptido de SEQ ID NO: 4 precipitaban de manera preferente la forma truncada del receptor (CTF-611). La mezcla que se sometió a inmunoprecipitación contenía una proporción 1:1 :1 de los lisados celulares que exprésaban las formas distintas del receptor HER2. Estos resultados son visibles en la FIG. 4B. En esta figura, aparecen las bandas de una electroforesis-SDS y posterior transferencia Western, en cuyos carriles se cargaron los resultados de los experimentos de inmunoprecipitación con los anticuerpos a-611-A, a-611-B y CB11. Se cargó un carril control (input) con la mezcla 1 :1 :1 de los tres tipos de lisados celulares sometida a inmunoprecipitación con los distintos anticuerpos. El Western blot se reveló con CB11. (se lisaron aprox. 106 células que expresan HER2 de longitud completa, 611-CTF o 648-CTFen 500 µ? de tampón de lisado (50 m de Tris HCI, pH7,4, 137 mM de NaCI, 2 mM EDTA, glicerol al 10 %, NP40 al 1 %). Se clarificaron los lisados mediante centrifugación a 14000 g X 30 min. Input: 5 µ? de mezcla de lisado (HER2 de longitud completa:CTF611 :CTF648, 1:1 :1). IP: 50 µ? de mezcla de lisado + 5 µ? de suero anti-61 CTF de conejo o CB11 ).

En los carriles correspondientes a la inmunoprecipitación con los anticuerpos a-611-A y a-611-?, se distinguen claramente bandas más intensas que el resto en aquellos pesos moleculares correspondientes a la forma glicosilada y no glicosilada de CTF-611. Esto es, dichos anticuerpos dirigidos contra el péptido de SEQ ID NO: 4 no inmunoprecipitan la forma completa del receptor HER2, lo que significa que reconocen realmente un epítopo que está enmascarado cuando el receptor completo HER2 no está desnaturalizado. Por ello, puede concluirse que los anticuerpos a-611-A y a-611-B son específicos de CTF-611.

Dicha especificidad se corrobora con ensayos de inmunofluorescencia indirecta (no representados) en los que los anticuerpos policlonales a-611-A y a-611-B purificados por afinidad únicamente permiten la tinción en muestras que expresan el fragmento truncado CTF-611. Este hecho conlleva la ventaja de poder ser usados para detectar de manera diferencial qué forma del receptor HER2 se expresa en una muestra aislada de tejido tumoral. La purificación por afinidad de los anticuerpos policlonales se realizó como sigue: (i) Purificación de IgG total usando una columna HiTrap protein A HP (GE Healhcare). Se inmovilizaron anticuerpos de suero de conejo en la columna equilibrada con tampón de unión (Na2HP04), se lavó con 10 volúmenes de columna de tampón de unión y se eluyó en 20 volúmenes de ácido cítrico de pH(2,7). Se neutralizó la elución usando Tris-HCI pH 8. (ii) Purificación usando un péptido inmovilizado en una columna HiTrap NHS. Se inmovilizó el mismo péptido usado para inmunizar el conejo en una columna HiTrap NHS. Se cargaron IgG purificadas en la etapa previa en la columna equilibrada con tampón de unión (Na2HP04), se lavó con 10 volúmenes de columna de tampón de unión y se eluyó en 10 volúmenes de ácido cítrico de pH (2,7). Se neutralizó la elución usando Tris-HCI pH 8. (iii) Finalmente, se dializó el anticuerpo purificado contra PBS NaN3 al 0,02 %.

El receptor HER2 completo comprende, próxima a la membrana celular, una región estructurada mantenida por seis puentes disulfuro, señalizados en la FIG. 1 mediante líneas de conexión entre cisteínas. La forma truncada CTF-611 , o de secuencia SEQ ID NO: 1 , contiene únicamente cinco cisteínas entre las que se establecen dichos puentes disulfuro para estabilizar los homodímeros de esta forma truncada. Según se desprende de la FIG. 4 en su globalidad, debe deducirse que la zona próxima a la membrana celular de la forma truncada de SEQ ID NO: 1 es antigénicamente distinta de su equivalente en el receptor HER-2 completo. De ello, se desprende que puede ser detectada de manera diferencial según se ha indicado anteriormente.

La cuantificación de las diferentes isoformas de HER2 en los inmunoprecipitados del input, CB11 y anti-6 1-B normalizados a la cantidad de HER2 se muestran como sigue: La cuantificación se llevó a cabo usando ImageJ 1.38.

EJEMPLO 3: Detección de la presencia del fragmento de HER2 de secuencia SEQ ID NO: 1 con anticuerpos monoclonales dirigidos a neo-epítopos definidos por la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3.

Usándose el mismo péptido de SEQ ID NO: 4 del ejemplo 2, se obtuvieron anticuerpos monoclonales. De todos ellos, se seleccionaron el anticuerpo monoclonal 20F4 producido por la línea celular hibridoma con número de acceso DSM ACC2904 y el anticuerpo monoclonal 32H2 producido por la línea celular hibridoma con número de acceso DSM ACC2980. Los resultados obtenidos con este anticuerpo se detallan en la FIG. 5.

De igual forma que en el ejemplo 2, se realizó una electroforesis-SDS y posterior transferencia Western con una mezcla 1 :1:1 de extractos de lisados de células MCF7 (previamente transformadas con las construcciones de la FIG. 1), que expresaban la forma completa del receptor HER2 o la forma truncada CTF-611 o la forma truncada p95. En la FIG. 5A, que es una fotografía de la membrana del Western revelada con CB11 o con los anticuerpos monoclonales 20F4 y 32H2, puede verse que este último reconoce de manera específica la forma truncada de HER2 correspondiente al receptor CTF-611 de SEQ ID NO: i 1 y no presenta reactividad cruzada detectable icón la forma completa del citado receptor, lo i que significa que reconoce realmente un nuevo epítopo (neo-epítopo) que incluye e| grupo amino primario en el extremo N-terminal de la forma del receptor CTF-611.

De mismo modo, cuando se llevó a cabo un 'experimento de inmunoprecipitación con los anticuerpos monoclonales 20F4 y 32H2 en comparación con el anticuerpo CB11 (que reconoce el dominio citosólico de los receptareis), se detectó que el anticuerpo monoclonal dirigido contra el péptido de SEQ ID NO. 3 precipitaba de manera exclusiva la forma truncada del receptor (CTF-611 ). Estos resultados son visibles en la FIG. 5B. En esta figura, aparecen los resultados de una electroforesis-SDS y posterior transferencia Western, en cuyos carriles se cargaron los resultados de los experimentos de inmunoprecipitación con los anticuerpos 20F4, 32H2 y CB1 1. i En el carril correspondiente a la inmunoprecipitación con los anticuerpos 20F4 y 32H2, se distinguen únicamente las bandas de la forma glicosilada y no glicosilada de la forma truncada CTF-611. Esto es, los anticuerpos 20F4 y 32H2 no inmunoprecipitan la forma completa del receptor HER2, Por ello, puede concluirse que los anticuerpos 20F4 y 32H2 son altamente específicos de CTF-61 1 y no reconocen la forma completa de HER2, pudiendo ser usados para detectar de manera diferencial y altamente selectiva qué forma del receptor HER2 se expresa en una muestra aislada de tejido tumoral.

La caracterización de los anticuerpos monoclonales dirigidos contra un péptido correspondiente a una secuencia de 32 aminoácidos larga, N-terminal de 61 1-CTF, confirma la existencia de epítopo(s) enmascarado(s) en l lER2 de longitud completa pero expuesto(s) en 61 1-CTF. Estos epítopos están enmascarados tanto en la molécula solubilizada como en las células intactas. La cuantificación de las diferentes isoformas de HER2 en los inmunoprecipitados de CB1 1 , 32H2 y 20F4 normalizados a la cantidad de HER2 se muestran I como sigue: CB11 32H2 I 20F4 HER2 1 1 1 611-CTF 1 ,01 343,50 1302,19 ! I 648-CTF 0,79 sd sd ! EJEMPLO 4: Caracterización de un anticuerpo monoclonal contra el extremo N-terminal de 611-CTF mediante citometría de flujo.

(A) Se analizaron células MCF7 que expresan HER2, 611-CTF o 648-CTF mediante citometría de flujo usando concentraciones diferentes de 32H2, un anticuerpo monoclonal generado contra el péptido MPIWKFPDEEGASQPSPINSTHSSVDLDDKGC (véase Fig. 1). Véase la figura 6(A). ¡ (B) Se cuantificaron los resultados de dos experimentos diferentes realizados como en (A) y se muestra el promedio. Véase la figura 6(B). j (C) Se analizaron células MCF7 que expresan HER2, 611-CTF o 648-CTF en un microscopio confocal mediante inmunofluorescencia indirecta con los anticuerpos indicados. Como anticuerpo secundario acoplado a fluoroforo, se usó anti-lgG de ratón de cabra Alexa Fluor 488 de Invitrcgen (A110011). Para evaluar la unión no específica como control negativo, se i llevó a cabo FACS sin suero 32H2 pero en presencia de este anticuerpo secundario ("2ario"). Conclusión: El epítopo reconocido por el anticuerpo 32H2 está expuesto en células vivas que j expresan 611-CTF pero está enmascarado en células vivas que expresan HER2.

EJEMPLO 5: Caracterización de anticuerpos monoclonales contra el extremo N-terminal de 611-CTF mediante inmunohistoquímica. ' Se llevó a cabo la tinción ¡nmunohistoquímiqa de células MCF7 que expresan HER2, 611-CTF o 648-CTF con CB11 , un anticuerpo contra el dominio citoplasmático de HÉR2, o con dos anticuerpos anti-611-CTF monoclonales independientes contra el péptido MPIWKFPDEEGASQPSPINSTHSSVDLDDKGcj (véase Fig. 1). El resultado se muestra en la figura 7. ? Conclusiones. Los epítopos reconocidos por los anticuerpos 20F4 y 32H2 está expuesto en células que expresan 611-CTF analizadas mediante inmunohistoquímica. Por el contrario, tal como se determina por la misma técnica, estos epítopos están enmascarados en la molécula de HER2 de longitud completa. Este resultado es particularmente relevante dado que la inmunohistoquímica es la técnica a elegir para la mayoría de las pruebas de rutina en clínica.

EJEMPLO 6: Caracterización de los epítopos reconocidos por los anticuerpos monoclonales contra el extremo N-terminal de 61 1 -CTF (A) El esquema muestra la secuencia primaria de la región yuxtamembrana de 61 1-CTF. Se indican los extremos N- y C-terminal de la molécula. Se indican los dominios de transmembrana y de la quinasa mediante un discontinuo y una caja gris, respectivamente. Se indica la secuencia de diferentes construcciones de deleción. Véase la figura 8(A).

(B) Se lisaron células MCF7 transfectadas transitoriamente con construcciones de deleción i de cDNA comenzando en los aminoácidos indicados. Se analizaron mediante Western blot j los lisados celulares con CB1 1 , un anticuerpo contra el dominio citoplasmático de HER2, o con dos anticuerpos anti-611-CTF monoclonales generados contra el péptido MPIWKFPDEEGASQPSPINSTHSSVDLDDKGC. Véase la figura 8(B). i Conclusiones. Los epítopos reconocidos por loS anticuerpos 32H2 y 20F4 están contenidos o al menos solapados con la secuencia MPIWKFPDEEC.

EJEMPLO 7: Análisis de muestras de cáncer de mama humano con un anticuerpo monoclonal contra el extremo N-terminal de 61 1 {CTF o con Herceptest™ (A) Se analizó la expresión de HER2 en las muestras indicadas con Herceptest™, hibridación in situ con fluorescencia (Fluorescence In Situ Hybridization, FISH) o Western blot. Se indican estas muestras que expresan niveles detectables de fragmentos carboxilo terminales de HER2 (también conocido como P95) tal como se determina mediante Western blot (véase (Scaltriti, M., Rojo, F., Ocaña, A., Anido, J.J Guzmán, M., Cortes, J., Di Cosimo, S., Matías-Guiu, X., Ramón y Cajal, S., Arribas, J., and Baselga, J. (2007) J Nati Cáncer Inst 99(8), 628-638)). Véase la figura 9(A).

(B) Tinción inmunocitoquímica de las mismas muestras de cáncer de mama igual que en (A), con 32H2 un anticuerpo anti-61 1-CTF monoclonal generado contra el péptido MPIWKFPDEEGASQPSPINSTHSSVDLDDKGC (véase Fig. 1) o con Herceptest™, que tiñe el dominio citoplasmático de HER2. Véase la figura 9(B).

Conclusión. Mediante inmunohistoquímica, el anticuerpo 32H2 tiñe muestras de cáncer de mama humano conocido previamente por expresar niveles detectables de CTF, tal cómo se determinó mediante Western blot.

EJEMPLO 8: Generación de modelos animales para caracterizar el efecto de la expresión de CTF in vivo Los modelos de ratón han sido instrumentos a la hora de mostrar el potencial oncogénico y la relevancia de HER2 en la progresión tumoral. Para caracterizar su potencial oncogénico, se establecen ratones transgénicos (TG) que expresan 61 1-CTF bajo el control de la repetición terminal larga de virus del tumor mamario de ratón, que está preferencialmente activo en la glándula mamaria. Aunque los modelos celulares indicaron que los CTF intracelulares solubles son inactivos, para explorar adicionalmente las consecuencias de la expresión de estos fragmentos, también se generaron animales TG que expresan 687-CTF. Como control, se usa el modelo clásico y bien caracterizado que expresa HER2 de tipo salvaje (es decir, rat neu).

A la edad de 7 semanas, los niveles de 61 1-CTF expresados en las líneas de heterocigotos TG 611 F3 y F2 eran - iguales a y 1/3° de, respectivamente, los niveles de HER2 endógeno, mientras el nivel en F1 estaba por debajo del umbral de detección. Los niveles de 687-CTF en las líneas de homocigotos desarrolladas variaban desde ~ el doble hasta la mitad de los niveles de HER2 en las líneas TG 687 F2 y F1 , respectivamente.

Las glándulas mamarias de los animales TG no exhibieron anormalidades macroscópicas a las 7 semanas de edad. Sin embargo, el examen morfológico de los montajes completos teñidos con carmín revelaron anormalidades hiperplásticas en los árboles ductales de los ratones de HER2 TG. Estaban presentes anormalidades similares, aunque menos pronunciadas, en las tres líneas de ratones TG 611. Por el contrario, las glándulas de ratones TG 61 1 eran indistinguibles de aquellas de ratones de tipo salvaje.

EJEMPLO 9: La Expresión 61 1-CTF lleva al desarrollo de tumores mamarios agresivos A pesar de la hiperplasia más pronunciada en ratones TG HER2, las tres líneas de los animales TG 61 1 desarrollan tumores más agresivos en términos de número de tumores por animal, crecimiento de tumor y aparición de tumor: Glándulas mamarias Ratones Promedio (semanas) n HER2 (Neu) 30,3±7,5 22 611-F1 26,3±4,6 6 611-F2 22,2±4,8 12 611-F3 23,7±5,5 3 Se monitorizó la aparición de tumores mamarios mediante palpación semanalmente.

No se observaron tumores o anormalidades en animales TG 687 incluso después del seguimiento de más de un año.

El análisis histológico de los tumores mostró los mismos carcinomas nodulares sólidos invasivos típicos inducidos por HER2 en los ratones TG 61 . La única diferencia histológica entre los tumores iniciados por HER2 y 611-CTF fue un elevado número de imágenes mitóticas en los ratones TG 61 1.

Tal como se mostró previamente, los ratones TG HER2 desarrollaron metástasis de pulmón. De tres a seis semanas después de la detección de tumores, -1/4 de los animales TG HER2 mostraron nodulos detectables en los pulmones: Ratones Metástasis de pulmón n HER2 (Neu) 22 g 611-F1 , F2, F3 56 g Se sacrificaron los ratones 3-6 semanas después de la detección del tumor por palpación y se monitorizó la aparición de metástasis mediante inmunohistoquímica).EI análisis histológico de la metástasis de pulmón confirmó la expresión de HER2 y la tinción con citoqueratina 18 verificó que las células se originaron del tumor primario. En comparación con TG HER2, el número de animales que expresan 61 1 -CTF con metástasis detectable fue de más de la mitad. Esto muestra que los tumores iniciados por este CTF presentan una tendencia más pronunciada a invadir los pulmones.

Claims (28)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo o un fragmento del mismo que reconoce un epítopo de una forma truncada del receptor HER2, estando dicho epítopo caracterizado porque se define por una secuencia incluida en la SEQ ID NO: 2.

2. El anticuerpo o un fragmento del mismo según la reivindicación 1 , caracterizado porque dicho epítopo es uno incluido en la SEQ ID NO: 3.

3. El anticuerpo o fragmento según las reivindicaciones 1 ó 2, caractérizado porque el anticuerpo o fragmento del mismo es adecuado para distinguir la proteína de SEQ ID NO: 1 del receptor HER2.

4. El anticuerpo o fragmento según una o más de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento del mismo es adecuado para distinguir la proteína de SEQ ID NO:1 de la forma truncada del receptor HER2 648-CTF/p95.

5. El anticuerpo o fragmento según las reivindicaciones 3 ó 4, caracterizado porque la distinción puede visualizarse mediante una o más de entre ¡nmunofluorescencia, citometría de flujo, inmunohistoquímica en células cultivadas e inmunohistoquímica en muestras de pacientes.

6. El anticuerpo o fragmento del mismo según una o más de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque es un anticuerpo policlonal.

7. El anticuerpo o fragmento del mismo según una o más de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque es un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo.

8. El anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 7, caracterizado porque se produce por la línea celular hibridoma depositada en el "Deutschland Sammiung von Mikroorganismen und Zellen - DSMZ" con número de acceso DSM ACC2904 o la línea celular hibridoma depositada en el "Deutschland Sammiung von Mikroorganismen und Zellen - DSMZ" con número de acceso DSM ACC2980.

9. El anticuerpo o fragmento según una o mas de las reivindicación anteriores, caracterizado porque el fragmento es uno seleccionado del grupo formado por F(ab), F(ab') y Fv.

10. Un hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal de la reivindicación 7 ó 8. '

11. Un procedimiento para producir un anticuerpo tal como se reivindica en una o más de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque implica la inmunización con un péptido que consiste en la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO:4, que está conjugado opcionalmente con un inmunogen.

12. El procedimiento según la reivindicación 11 , para obtener un anticuerpo monoclonal, donde se cultiva la línea celular hibridoma según la reivindicación 10 en un medio de cultivo apropiado y se recupera el anticuerpo monoclonal de este medio.

13. Un péptido aislado que consiste en la SEQ ID NO:2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO: 5.

14. Un procedimiento de diagnóstico de cáncer, caracterizado porque comprende la detección de la presencia de la forma truncada del receptor HER2 que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 en una muestra de un paciente.

15. El procedimiento según la reivindicación 14, caracterizado porque la detección se lleva a cabo con medios seleccionados independientemente del grupo formado por: (i) detección por migración diferencial de la forma truncada del receptor HER2 que consiste en la SEQ ID NO: 1 , respecto de una forma completa del citado receptor HER2; y (ii) detección por unión con uno o más anticuerpos tal como se definió en una o más de las reivindicaciones 1 a 12.

16. El procedimiento según la reivindicación 14 o 15, caracterizado porque es un procedimiento de pronóstico que permite el pronóstico de la progresión de crecimiento de tumor y/o metástasis.

17. Uso de un anticuerpo o un fragmento del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para el diagnóstico y la determinación de pronóstico en muestras aisladas de cánceres en los que se expresa el receptor HER2.

. 18. Un agente de diagnóstico y determinación de pronóstico en muestras aisladas de cánceres del tipo que expresa el receptor HER2 o sus variantes truncadas, caracterizado porque comprende al menos un anticuerpo o un fragmento del mismo según una de las reivindicaciones 1 a 9.

19. El agente de diagnóstico según la reivindicación 18, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento del mismo está dispuesto en un soporte sólido.

20. Un kit de diagnóstico y determinación de pronóstico en muestras aisladas de cánceres del tipo que expresa el receptor HER2 o sus variantes truncadas, caracterizado porque comprende medios de detección de la presencia en la muestra de la forma truncada del receptor HER2 que consiste en la SEQ ID NO: 1.

21. El kit de diagnóstico y determinación de pronóstico según la reivindicación 20, caracterizado porque los medios de detección consisten en al menos un agente según las reivindicaciones 19 ó 20.

22. El kit de diagnóstico y determinación de pronóstico según la reivindicación 20, caracterizado porque los medios de detección consisten en la detección por migración diferencial de la forma truncada del receptor HER2 de SEQ ID NO: 1 , respecto de la forma completa del citado receptor HER2.

23. Un anticuerpo o un fragmento del mismo según una o más de las reivindicaciones 1 a 9, para uso terapéutico.

24. El anticuerpo o fragmento según la reivindicación 23, para su uso en el tratamiento o la prevención de cánceres en los se expresa al menos la forma truncada del receptor HER2 que consiste en la SEQ ID NO: 1.

25. El anticuerpo o fragmento según la reivindicación 23 ó 24, para su uso en el tratamiento o la prevención de cánceres de mama en mamíferos, incluyendo seres humanos.

26. El anticuerpo o fragmento según una o más de las reivindicaciones 23 a 25, para su uso en el tratamiento o la prevención de cánceres seleccionados del grupo que comprende cáncer de pulmón, páncreas, colon, estómago, próstata, cabeza y cuello, piel, riñon, testículo, tiroides, vejiga urinaria, útero, vulva, endometrio, ovario, esófago, boca, glándula salivar, laringe, peritoneo, región nasofaríngea, trompas de Falopio, tumores de Wilms, asi como linfomas, sarcomas de Swing, sarcoma sinovial, meduloblastomas, tumores trofoblásticos, gliomas, glioblastomas, colangiocarcinomas, colesteatoma, condrosarcoma, ependimoma, neurilemomas, neuromas, rabdomiosarcomas.

27. Un uso de un anticuerpo o fragmento del mismo tal como se define en una o más de las reivindicaciones 1 a 9 para la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer.

28. Composición farmacéutica destinada al tratamiento de cánceres en los que se expresa al menos la forma truncada del receptor HER2 que contiene la SEQ ID N : 1 , caracterizada porque comprende un anticuerpo o un fragmento del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y al menos un excipiente y/o vehículo farmacéuticamente aceptables.