CN115521377A - 人表皮生长因子受体结合分子及其应用 - Google Patents

人表皮生长因子受体结合分子及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN115521377A
CN115521377A CN202110705939.8A CN202110705939A CN115521377A CN 115521377 A CN115521377 A CN 115521377A CN 202110705939 A CN202110705939 A CN 202110705939A CN 115521377 A CN115521377 A CN 115521377A
Authority
CN
China
Prior art keywords
ser
gly
val
ala
thr
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202110705939.8A
Other languages
English (en)
Inventor
李加国
刘祥箴
朱伟民
孙艳
丁娜
钱其军
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang Nano Antibody Technology Center Co ltd
Original Assignee
Zhejiang Nano Antibody Technology Center Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang Nano Antibody Technology Center Co ltd filed Critical Zhejiang Nano Antibody Technology Center Co ltd
Priority to CN202110705939.8A priority Critical patent/CN115521377A/zh
Priority to PCT/CN2022/100888 priority patent/WO2022268178A1/zh
Publication of CN115521377A publication Critical patent/CN115521377A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/22—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from camelids, e.g. camel, llama or dromedary
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/71—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/82—Translation products from oncogenes

Abstract

本发明提供一种人表皮生长因子受体结合分子及其应用。本发明的人表皮生长因子受体结合分子包含抗人表皮生长因子受体单域抗体，所述单域抗体的互补决定区CDR包括SEQ ID NO:1所示的CDR1、SEQ ID NO:2所示的CDR2、和SEQ ID NO:3所示的CDR3。本发明还提供编码所述结合分子的多核苷酸、含有所述多核苷酸的核酸构建物，以及相应的噬菌体、宿主细胞、药物组合物、生产方法、非诊断性方法和用途。

Description

人表皮生长因子受体结合分子及其应用
技术领域
本发明涉及生物医学或生物制药技术领域，更具体地涉及一种人表皮生长因子受体(EGFR)结合分子及其应用。
背景技术
人表皮生长因子受体(EGFR，epidermal growth factor receptor，简称为EGFR、ErbB-1或HER1)是表皮生长因子受体(HER)家族成员之一。该家族包括HER1(erbB1，EGFR)、HER2(erbB2，NEU)、HER3(erbB3)及HER4(erbB4)。EGFR表达于正常上皮细胞表面，在许多实体肿瘤细胞中存在EGFR的高表达或异常表达，包括头颈癌、乳腺癌、膀胱癌、卵巢癌、肾癌、结肠癌以及非小细胞肺癌等，尤其是肺癌，亚裔肺癌人群中EGFR突变率可达到50％(Seshacharyulu P等,Expert Opin Ther Targets,2012；16:15–31)。EGFR是肿瘤靶向治疗的热门靶点。
EGFR位于细胞膜表面，通过与配体结合来激活，其配体包括EGF和TGFα。激活后，EGFR由单体转化为二聚体，尽管也有证据表明，激活前也存在二聚体。EGFR还可能和ErbB受体家族的其他成员聚合来激活。EGFR二聚后可以激活它位于细胞内的激酶通路，包括Y992、Y1045、Y1068、Y1148和Y1173等激活位点，自磷酸化可以引导下游的磷酸化，包括MAPK、Akt和JNK通路。EGFR与肿瘤细胞的增殖、血管生成、肿瘤侵袭、转移及细胞凋亡的抑制有关。EGFR下游的信号转导通路主要有两条：一条是Ras/Raf/MEK/ERK-MAPK通路，而另一条是PI3K/Akt/mTOR通路(R Roskoski Jr.Pharmacological research,2014:79:34–74.)。
目前，全球范围内批准上市的EGFR单抗共4个，即西妥昔单抗、帕尼单抗、耐昔妥珠单抗和尼妥珠单抗。主要用于治疗直肠癌、头颈癌。有研究表明，EGFR胞外段非常容易发生突变，容易产生耐药性。而纳米抗体结合表位要比scFv抗体结合表位小许多，受突变的影响较小，能够一定程度上提高EGFR有效抗肿瘤活性。且纳米抗体具有稳定性高、穿透力强、结合表位广的天然优势(Muyldermans S.Annu Rev Biochem.2013；82:775-97.)，针对EGFR近膜端的纳米抗体还鲜有研究。开发一种新型抗人表皮生长因子受体纳米抗体，使其具有较好的特异性、阻断活性、临床药效，并且生产简便、成本低、减轻用药负担，已经成为亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型抗人表皮生长因子受体结合分子及其应用。
本发明第一方面提供一种人表皮生长因子受体结合分子，包含抗人表皮生长因子受体单域抗体，所述单域抗体的互补决定区CDR包含CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR1包括SEQID NO:1所示的序列、CDR2包括SEQ ID NO:2所示的序列、和CDR3包括SEQ ID NO:3所示的序列。
在一个或多个实施方案中，SEQ ID NO:1是X1X2X3X4X5X6X7X8，其中，X1为G，X2为S、F、G、L或R，X3为G、T、V、P、A、S或I，X4为F、L或D，X5为T、S、E、D、L或I，X6为I、D、S或T，X7为Q、Y、H或F，X8为A或T。
在一个或多个实施方案中，SEQ ID NO:1是X1X2X3X4X5X6X7X8，其中，X1为G，X2为F或L，X3为T、P或A，X4为F或L，X5为S、E、D、L或I，X6为D或T，X7为Y，X8为A或T。
在一个或多个实施方案中，CDR1包含SEQ ID NO:4-12中任一所示的序列。优选地，CDR1包含SEQ ID NO:5、7、8、9、11中任一所示的序列。
在一个或多个实施方案中，SEQ ID NO:2是X1X2X3X4X5X6X7X8，其中，X1为I、L、V，X2为H、T、F、A或S，X3为Q、G、S、P、T、I或N，X4为G、T、D、A、S或Y，X5为G、H、E或N，X6为S、E、K、D、G或A，X7为T、H、I、K、S或无，X8为S、T、I、P或无。
在一个或多个实施方案中，SEQ ID NO:2是X1X2X3X4X5X6X7X8，其中，X1为I或L，X2为T、F、A或S，X3为G、S、P、T或I，X4为T、D、A或S，X5为G或E，X6为E、K、D或G，X7为T、H、I、K、S或无，X8为S、T、I或P。
在一个或多个实施方案中，CDR2包含SEQ ID NO:13-21中任一所示的序列。优选地，CDR2包含SEQ ID NO:14、16、17、18、20中任一所示的序列。
在一个或多个实施方案中，SEQ ID NO:3是X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X1 6X17X18X19X20X21X22X23X24X25，其中，X1为N、S、A、K或H，X2为V、I、R、K、A或L，X3为V、Y、S、D、L、T或N，X4为P、H、L、V、S、K或Y，X5为P、Y、S、R、T或A，X6为L、P、T、F、A、S或D，X7为R、P、F、S、A、I或D，X8为V、D、G、A或Y，X9为Y、N、T、R、F或无，X10为P、A、W、E或无，X11为S、H、L、Y或无，X12为F、D、N、L或无，X13为Y、V或无，X14为I、G或无，X15为G或无，X16为Y、A或无，X17为G或无，X18为G或无，X19为G或无，X20为E或无，X21为V或无，X22为R或无，X23为Y或无，X24为E或无，X25为Y或无。
在一个或多个实施方案中，SEQ ID NO:3是X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X1 6X17X18X19X20X21X22X23X24X25，其中，X1为N、S、A或K，X2为I、K或A，X3为Y、D、L或T，X4为H、L、V、S或K，X5为P、S、R或T，X6为P、F、A、S或D，X7为R、P、F、S或I，X8为V、D、G或A，X9为Y、N、T、R或F，X10为P、A、W或无，X11为S、H、L或无，X12为F、D、N、L或无，X13为Y、V或无，X14为I、G或无，X15为G或无，X16为Y、A或无，X17为G或无，X18为G或无，X19为G或无，X20为E或无，X21为V或无，X22为R或无，X23为Y或无，X24为E或无，X25为Y或无。
在一个或多个实施方案中，CDR3包含SEQ ID NO:22-30中任一所示的序列。优选地，CDR3包含SEQ ID NO:23、25、26、27、29中任一所示的序列。
在一个或多个实施方案中，所述抗人表皮生长因子受体单域抗体是人表皮生长因子受体近膜端III区或IV区的特异性单域抗体。
在一个或多个实施方案中，所述单域抗体的CDR1包含SEQ ID NO:4-12中任一所示的序列，CDR2包含SEQ ID NO:13-21中任一所示的序列，和CDR3包含SEQ ID NO:22-30中任一所示的序列。
在一个或多个实施方案中，所述单域抗体含有以下组a1到组a9中任一组的SEQ IDNO所示的CDR1、CDR2和CDR3：
组 CDR1 CDR2 CDR3
a1 4 13 22
a2 5 14 23
a3 6 15 24
a4 7 16 25
a5 8 17 26
a6 9 18 27
a7 10 19 28
a8 11 20 29
a9 12 21 30
在一个或多个实施方案中，所述单域抗体VHH的FR1可选自SEQ ID NO:31-82的任一VHH的FR1，VHH的FR2可选自SEQ ID NO:31-82的任一VHH的FR2，VHH的FR3可选自SEQ IDNO:31-82的任一VHH的FR3，VHH的FR4可选自SEQ ID NO:31-82的任一VHH的FR4。
在一个或多个实施方案中，所述单域抗体的FR区为选自SEQ ID NO:31-82的任一VHH的FR区。
在一个或多个实施方案中，所述单域抗体VHH如SEQ ID NO:31-82中任一所示。优选地，所述单域抗体如SEQ ID NO:40-82中任一所示。
在一个或多个实施方案中，所述人表皮生长因子受体结合分子是包含一条、两条或多条本文所述的抗人表皮生长因子受体单域抗体的单价或多价单域抗体、多特异性单域抗体、重链抗体或其抗原结合片段、抗体或其抗原结合片段。
在一个或多个实施方案中，所述多价单域抗体或多特异性单域抗体通过连接子连接多个单域抗体。所述连接子由选自G和S的1-15个氨基酸组成。
在一个或多个实施方案中，所述重链抗体的抗原结合片段是单链重链抗体。
在一个或多个实施方案中，所述重链抗体是骆驼重链抗体或软骨鱼重链抗体。
在一个或多个实施方案中，所述重链抗体还包含重链恒定区。
在一个或多个实施方案中，所述重链恒定区是骆驼重链抗体的恒定区，包含CH2和CH3。在一个或多个实施方案中，所述CH2和CH3是人IgG Fc的CH2和CH3，例如IgG1或IgG4的CH2和CH3。优选地，所述重链恒定区为IgG4的CH2和CH3，其氨基酸序列如SEQ ID NO:83所示。
在一个或多个实施方案中，所述重链恒定区是软骨鱼重链抗体的恒定区，包含CH1、CH2、CH3、CH4和CH5。
在一个或多个实施方案中，所述抗体是包含所述抗人表皮生长因子受体单域抗体作为重链可变结构域的抗体。
在一个或多个实施方案中，所述抗体还包含轻链可变结构域、重链恒定域和轻链恒定域。
在一个或多个实施方案中，抗体的抗原结合片段选自Fab、F(ab’)2、Fv、scFv。
在一个或多个实施方案中，本发明任一实施方案所述的结合分子为嵌合抗体或完全人抗体；优选为完全人抗体。
本发明还提供多核苷酸，选自：
(1)本文任一实施方案所述单域抗体或本文所述抗体或其抗原结合片段的编码序列；
(2)(1)的互补序列；
(3)(1)或(2)中任一序列的5-50bp的片段。
在一个或多个实施方案中，所述片段是引物。
本发明还提供一种核酸构建物，包含本文所述的多核苷酸。
在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物是重组载体或表达载体。
本发明还提供包含本文任一实施方案所述人表皮生长因子受体结合分子的噬菌体。
在一个或多个实施方案中，所述人表皮生长因子受体结合分子展示于所述噬菌体表面。
本发明还提供一种宿主细胞，选自：
(1)表达本文任一实施方案所述人表皮生长因子受体结合分子；
(2)包含本文所述的多核苷酸；和/或
(3)包含本文所述的核酸构建物。
本发明还提供一种产生人表皮生长因子受体结合分子的方法，包括：在适合产生人表皮生长因子受体结合分子(例如单价或多价单域抗体、多特异性单域抗体、重链抗体、抗体或其抗原结合片段)的条件下培养本文所述的宿主细胞，和任选的从培养物中纯化所述人表皮生长因子受体结合分子。
本发明还提供一种药物组合物，包含本文任一实施方案所述人表皮生长因子受体结合分子、多核苷酸、核酸构建物、噬菌体或宿主细胞，和药学上可接受的辅料。
在一个或多个实施方案中，所述药物组合物用于治疗癌症。
在一个或多个实施方案中，所述癌症是人表皮生长因子受体相关癌症。优选地，所述癌症选自：头颈癌、乳腺癌、膀胱癌、卵巢癌、肾癌、结肠癌、非小细胞肺癌等。
本发明还提供本文任一实施方案所述人表皮生长因子受体结合分子在制备用于预防或治疗癌症的药物中的用途。
在一个或多个实施方案中，所述癌症是人表皮生长因子受体相关癌症。优选地，所述癌症选自：头颈癌、乳腺癌、膀胱癌、卵巢癌、肾癌、结肠癌、非小细胞肺癌等。
本发明还提供一种治疗或预防癌症的方法，所述方法包括给予需要的患者治疗有效量的本发明任一实施方案所述的人表皮生长因子受体结合分子，或含有本发明任一实施方案所述的人表皮生长因子受体结合分子的药物组合物。
在一个或多个实施方案中，所述癌症是人表皮生长因子受体相关癌症。优选地，所述癌症选自：头颈癌、乳腺癌、膀胱癌、卵巢癌、肾癌、结肠癌、非小细胞肺癌等。
本发明还提供一种检测人表皮生长因子受体的试剂盒，用于评估药物治疗效果或诊断癌症，所述的试剂盒包含本文任一实施方案所述人表皮生长因子受体结合分子、多核苷酸、核酸构建物、噬菌体、宿主细胞。
在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还包括用于检测人表皮生长因子受体与单域抗体、抗体或其抗原结合片段的结合的试剂。例如通过酶联免疫反应法检测所述结合的试剂。
在一个或多个实施方案中，所述检测结合试剂是能与人表皮生长因子受体结合分子连接的可检测标记物，例如生物素。所述的可检测标记物被连接于所述人表皮生长因子受体结合分子或分离地存在于试剂盒中。
本发明还提供一种检测样品中人表皮生长因子受体存在情况的非诊断性方法，所述方法包括：以本文任一实施方案所述人表皮生长因子受体结合分子与样品孵育，和检测人表皮生长因子受体与单域抗体、抗体或其抗原结合片段的结合，从而确定样品中人表皮生长因子受体存在情况。所述检测是酶联免疫反应法检测。
本发明还提供本文任一实施方案所述人表皮生长因子受体结合分子在制备用于检测样品中人表皮生长因子受体、评估药物治疗效果或诊断癌症的试剂盒中的用途。
附图说明
图1中A、B分别为针对EGFR his蛋白、EGFR-III区蛋白的羊驼抗血清效价检测图。
图2中A-D分别显示VHH-IgG4抗体与EGFR胞外段全长蛋白、I+II区蛋白、III区蛋白、IV区蛋白的结合情况。除E009抗体结合I+II区外，其余抗体均结合在EGFR胞外段III区、IV区。
图3为VHH-IgG4抗体与EGF竞争结合EGFR抗原的ELISA检测结果。
图4为VHH-IgG4抗体与过表达EGFRⅢ区蛋白的293T稳转细胞株的结合检测结果。
图5为VHH-IgG4抗体与SKOV3肿瘤细胞株的结合检测结果。
图6为VHH-IgG4抗体与Aspc-1肿瘤细胞株的结合检测结果。
图7为A-C分别为抗体E002、E005、E008的膜蛋白阵列筛选(MPA)结果图。
图中，IC50、EC50的单位为nM。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入地研究，经过大量的筛选，发现一类包含抗人表皮生长因子受体单域抗体的人表皮生长因子受体结合分子。本发明的人表皮生长因子受体结合分子能够高特异性地结合EGFR抗原近膜端III区或IV区，具有较高的亲和力和生物活性，以及低的免疫原性，结构稳定，成药性良好。本发明单域抗体生成简便。
抗体
本文中，“人表皮生长因子受体结合分子”或“EGFR结合分子”是特异性结合人表皮生长因子受体的蛋白质，包括但不仅限于，抗体、抗体的抗原结合片段、重链抗体、纳米抗体、微型抗体、亲和体、受体的靶结合区、细胞粘附分子、配体、酶、细胞因子、和趋化因子。
“人表皮生长因子受体近膜端III区”(简称EGFRШ区)是指人表皮生长因子受体第311-480位氨基酸的区域(uniprot，P00533-1，C311-L480)。
“人表皮生长因子受体近膜端IV区”(EGFR IV区)是指人表皮生长因子受体第481-645位氨基酸的区域(uniprot，P00533-1，F481-S645)。
本文中，术语“抗体”包括单克隆抗体(包括全长抗体，其具有免疫球蛋白Fc区)，具有多表位特异性的抗体组合物，多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，双抗体和单链分子，以及抗体片段，尤其是抗原结合片段，例如，Fab，F(ab’)2和Fv)。本文中，术语“免疫球蛋白”(Ig)和“抗体”可互换地使用。
基本的4链抗体单元是由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)构成的异四聚体糖蛋白。IgM抗体由5个基本的异四聚体单元及称作J链的另外多肽组成，包含10个抗原结合位点；而IgA抗体包含2-5个基本的4链单元，其可与J链组合聚合形成多价装配物。在IgG的情况中，4链单元通常约150,000道尔顿。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而两条重链通过一个或多个二硫键彼此相连，二硫键的数目取决于重链的同种型。每条重链和轻链还具有间隔规律的链内二硫桥。每条重链在N-末端具有可变结构域(VH)，接着是三个(对于每种α和γ链，CH1、CH2和CH3)和四个(对于μ和ε同种型，CH1、CH2、CH3和CH4)恒定结构域(CH)以及位于CH1结构域与CH2结构域之间的绞链区(Hinge)。每条轻链在N-末端具有可变结构域(VL)，接着是其另一端的恒定结构域(CL)。VL与VH排列在一起，而CL与重链的第一恒定结构域(CH1)排列在一起。特定的氨基酸残基被认为在轻链和重链可变结构域之间形成界面。成对的VH和VL一起形成一个抗原结合位点。关于不同类别抗体的结构和性质，参见如Basic and Clinical Immunology，第八版，Daniel P.Sties，Abba I.Terr和TristramG.Parsolw编辑，Appleton&Lange，Norwalk，CT，1994，第71页和第6章。来自任何脊椎动物物种的轻链，根据其恒定结构域氨基酸序列，可归入两种称作κ和λ的截然不同型中的一种。根据其重链恒定结构域(CH)氨基酸序列，免疫球蛋白可归入不同的类或同种型。有五类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，分别具有称作α、δ、ε、γ和μ的重链。根据CH序列和功能的相对较小差异，γ和α类可进一步分为亚类，例如人表达下列亚类：IgG1、IgG2A、IgG2B、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
本文所述“重链抗体”是源自骆驼科生物或软骨鱼科生物的抗体。相比上述4链抗体，重链抗体缺失轻链和重链恒定区1(CH1)，仅包含2条由可变区(VHH)和其他恒定区组成的重链，可变区通过类似铰链区结构与恒定区相连。骆驼科重链抗体的每条重链包含1个可变区(VHH)和2个恒定区(CH2和CH3)，软骨鱼科重链抗体的每条重链含有1个可变区和5个恒定区(CH1-CH5)。重链抗体的抗原结合片段包括VHH和单链重链抗体。通过与人IgG Fc的恒定区融合，重链抗体可以具有人IgG Fc的CH2和CH3。
如本文所用，术语“单域抗体”、“抗人表皮生长因子受体单域抗体”、“重链抗体的重链可变区结构域”、“VHH”、“纳米抗体”可互换使用，均指特异性识别和结合于人表皮生长因子受体的单域抗体。单域抗体是重链抗体的可变区。通常，单域抗体含有三个CDR和四个FR。优选地，本发明的单域抗体具有SEQ ID NO:1所示的CDR1、SEQ ID NO:2所示的CDR2、和SEQ ID NO:3所示的CDR3。单域抗体是最小的功能性抗原结合片段。通常先获得天然缺失轻链和重链恒定区1(CH1)的抗体后，再克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体。
包含两条或多条单域抗体的结合分子是多价单域抗体；包含两条或多条不同特异性单域抗体的结合分子是多特异性单域抗体。多价单域抗体或多特异性单域抗体通过连接子连接多个单域抗体。所述连接子通常由选自G和S的1-15个氨基酸组成。
本文中，重链抗体和抗体旨在区分抗体的不同组合方式。由于二者的结构具有相似性，下述针对抗体的结构描述除涉及轻链外也均适用于重链抗体。
抗体的“可变区”或“可变结构域”是指抗体的重链或轻链的氨基末端结构域。重链和轻链的可变结构域可分别称为“VH”和“VL”。这些结构域通常是抗体的最可变的部分(相对于相同类型的其它抗体)并含有抗原结合位点。
术语“可变的”指可变结构域中的某些区段在抗体序列中差异广泛的情况。可变结构域介导抗原结合并限定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，变异性并非均匀分布于可变结构域跨越的全部氨基酸。相反，其集中在三个称为高变区(HVR)的区段(在轻链和重链可变结构域中均有)，即分别为重链可变区的HCDR1、HCDR2、HCDR3(重链抗体中可简称为CDR1、CDR2、CDR3)以及轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3。可变结构域中更为高度保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR区(FR1、FR2、FR3和FR4)，它们大多采取β-折叠构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成β-折叠结构一部分的三个HVR连接。每条链中的HVR通过FR区非常接近的保持在一起，并与另一条链的HVR一起促成抗体的抗原结合位点的形成。通常，轻链可变区的结构为FR1-LCDR1-FR2-LCDR2-FR3-LCDR3-FR4，重链可变区的结构为FR1-HCDR1-FR2-HCDR2-FR3-HCDR3-FR4。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应子功能，如在抗体依赖性细胞介导的细胞毒性中抗体的参与。
“Fc区”(可结晶片段区域)或“Fc结构域”或“Fc”是指抗体重链的C-末端区域，其介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括与位于免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)上的Fc受体的结合，或者与经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。在IgG，IgA和IgD抗体同种型中，Fc区由来自抗体两条重链的CH2结构域和CH3结构域的两个相同的蛋白片段构成；IgM和IgE的Fc区在每个多肽链中包含三个重链恒定结构域(CH结构域2-4)。虽然免疫球蛋白重链的Fc区的边界可以变化，但是人IgG重链Fc区通常定义为从重链位置C226或P230的氨基酸残基到羧基端的序列段，其中该编号是根据EU索引，如在Kabat中一样。如本文所使用的，Fc区可以是天然序列Fc或变体Fc。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合区和/或可变区。抗体片段优选为抗体的抗原结合片段。抗体片段的例子包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；scFv-Fc片段；由抗体片段形成的多特异性抗体；以及通过化学修饰或通过掺入脂质体中应能够增加半衰期的任何片段。用木瓜蛋白酶消化抗体产生称作“Fab”片段的两个相同的抗原结合片段，和一个残余“Fc”片段，其具有易于结晶的能力。Fab片段由完整轻链及重链可变结构域(VH)和一条重链第一恒定结构域(CH1)组成。每个Fab片段在抗原结合方面是单价的，即其具有单个抗原结合位点。胃蛋白酶处理抗体产生一个较大F(ab’)2片段，它粗略相当于两个通过二硫键相连的Fab片段，具有不同抗原结合活性且仍能够交联抗原。Fab’片段因在CH1结构域的羧基末端增加了一些另外的残基(包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸)而与Fab片段有所不同。F(ab’)2抗体片段最初是作为成对Fab’片段生成的，在Fab’片段之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。Fc片段包含通过二硫键保持在一起的两条重链的羧基末端部分。抗体的效应子功能是由Fc区中的序列决定的，该区还是由在某些类型细胞上发现的Fc受体(FcR)所识别的区。
“Fv”是含有完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该片段由紧密、非共价结合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体组成。从这两个结构域的折叠中突出了六个高变环(重链和轻链各3个环)，贡献出抗原结合的氨基酸残基并赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变结构域(或只包含对抗原特异的三个HVR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，尽管亲合力低于完整结合位点。“单链Fv”也可缩写为“sFv”或“scFv”，是包含抗体VH和VL结构域的连接成一条多肽链的抗体片段。优选的是，sFv多肽在VH和VL结构域之间还包含多肽接头，使得sFv形成期望的抗原结合结构。
本文中，术语“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体中获得的抗体，即除了可能以少量存在的可能的天然出现的突变和/或翻译后修饰(例如异构化、酰胺化)之外，构成群体的各个抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点。与多克隆抗体制剂(其典型地包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体)相比，每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除它们的特异性外，单克隆抗体的优势在于它们通过杂交瘤培养合成，未受到其它免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生产抗体。例如，将根据本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来生成，包括例如杂交瘤法、噬菌体展示法、重组DNA法、及用于从具有部分或整个人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物生成人或人样抗体的技术、单细胞测序法。
单克隆抗体在本文中也包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性。
非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。因此，“人源化抗体”通常指可变结构域构架区与在人抗体中发现的序列交换的非人抗体。通常在人源化抗体中，整个抗体(除CDR以外)由人来源的多核苷酸编码或与这种抗体相同(除CDR以外)。CDR(其中一些或全部由源自非人生物体的核酸编码)被移植到人抗体可变区的β-折叠骨架中以产生抗体，其特异性由被移植的CDR来决定。这类抗体的产生方法本领域周知，例如使用具有基因工程免疫系统的小鼠而产生。本发明中，抗体、单域抗体、重链抗体等均包括各所述抗体的经人源化的变体。
“人抗体”指这样的抗体，其具有与由人生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列和/或使用本文所公开的用于生成人抗体的任何技术产生。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。人抗体可使用本领域已知的多种技术来生成，包括噬菌体展示文库。
在一些实施方案中，本发明还提供与本发明的任何抗人表皮生长因子受体单域抗体结合人表皮生长因子受体相同表位(例如人表皮生长因子受体近膜端III区、IV区)的单域抗体、重链抗体、抗体或其抗原结合片段，即能够与本发明的任何单域抗体交叉竞争与人表皮生长因子受体的结合的单域抗体、重链抗体、抗体或其抗原结合片段。
本发明中，单域抗体的CDR1包括SEQ ID NO:1所示的序列，SEQ ID NO:1是X1X2X3X4X5X6X7X8，其中，X1为G，X2为S、F、G、L或R，X3为G、T、V、P、A、S或I，X4为F、L或D，X5为T、S、E、D、L或I，X6为I、D、S或T，X7为Q、Y、H或F，X8为A或T。优选地，X1为G，X2为F或L，X3为T、P或A，X4为F或L，X5为S、E、D、L或I，X6为D或T，X7为Y，X8为A或T。在一个或多个实施方案中，CDR1包含SEQ ID NO:4-12中任一所示的序列。
本发明中，单域抗体的CDR2包括SEQ ID NO:2所示的序列，SEQ ID NO:2是X1X2X3X4X5X6X7X8，其中，X1为I、L或V，X2为H、T、F、A或S，X3为Q、G、S、P、T、I或N，X4为G、T、D、A、S或Y，X5为G、H、E或N，X6为S、E、K、D、G或A，X7为T、H、I、K、S或无，X8为S、T、I、P或无。优选地，X1为I或L，X2为T、F、A或S，X3为G、S、P、T或I，X4为T、D、A或S，X5为G或E，X6为E、K、D或G，X7为T、H、I、K、S或无，X8为S、T、I或P。在一个或多个实施方案中，CDR2包含SEQ ID NO:13-21中任一所示的序列。
本发明中，单域抗体的CDR3包括SEQ ID NO:3所示的序列，SEQ ID NO:3是X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21X22X23X24X25，其中，X1为N、S、A、K或H，X2为V、I、R、K、A或L，X3为V、Y、S、D、L、T或N，X4为P、H、L、V、S、K或Y，X5为P、Y、S、R、T或A，X6为L、P、T、F、A、S或D，X7为R、P、F、S、A、I或D，X8为V、D、G、A或Y，X9为Y、N、T、R、F或无，X10为P、A、W、E或无，X11为S、H、L、Y或无，X12为F、D、N、L或无，X13为Y、V或无，X14为I、G或无，X15为G或无，X16为Y、A或无，X17为G或无，X18为G或无，X19为G或无，X20为E或无，X21为V或无，X22为R或无，X23为Y或无，X24为E或无，X25为Y或无。优选地，X1为N、S、A或K，X2为I、K或A，X3为Y、D、L或T，X4为H、L、V、S或K，X5为P、S、R或T，X6为P、F、A、S或D，X7为R、P、F、S或I，X8为V、D、G或A，X9为Y、N、T、R或F，X10为P、A、W或无，X11为S、H、L或无，X12为F、D、N、L或无，X13为Y、V或无，X14为I、G或无，X15为G或无，X16为Y、A或无，X17为G或无，X18为G或无，X19为G或无，X20为E或无，X21为V或无，X22为R或无，X23为Y或无，X24为E或无，X25为Y或无。在一个或多个实施方案中，CDR3包含SEQ ID NO:22-30中任一所示的序列。
在一个或多个实施方案中，所述单域抗体的CDR1含有如SEQ ID NO:5、7、8、9、11中任一所示的序列，CDR2含有SEQ ID NO:14、16、17、18、20中任一所示的序列，CDR3包含SEQID NO:23、25、26、27、29中任一所示的序列。
在一个或多个实施方案中，所述单域抗体含有表1中组a1到组a9中任一组SEQ IDNO所示的CDR1、CDR2和CDR3：
表1
组 CDR1 CDR2 CDR3
a1 4 13 22
a2 5 14 23
a3 6 15 24
a4 7 16 25
a5 8 17 26
a6 9 18 27
a7 10 19 28
a8 11 20 29
a9 12 21 30
优选含有选自以下的任一组所示的CDR1、CDR2和CDR3：a2、a4、a5、a6、a8。
在一个或多个实施方案中，所述单域抗体VHH的FR1可选自SEQ ID NO:31-82的任一VHH的FR1，VHH的FR2可选自SEQ ID NO:31-82的任一VHH的FR2，VHH的FR3可选自SEQ IDNO:31-82的任一VHH的FR3，VHH的FR4可选自SEQ ID NO:31-82的任一VHH的FR4。
在优选的实施方案中，本发明单域抗体VHH的FR区为选自SEQ ID NO:31-82的任一VHH的FR区。进一步优选地，这类抗体的CDR选自前述组a1到组a9中的任一组。在一个或多个实施方案中，所述单域抗体VHH如SEQ ID NO:31-82中任一所示。优选地，所述单域抗体如SEQ ID NO:31-38、40-46、57-82中任一所示。
本文所述人表皮生长因子受体结合分子可以是包含一条、两条或多条本文所述的抗人表皮生长因子受体单域抗体的单价或多价单域抗体、多特异性单域抗体、重链抗体或其抗原结合片段、抗体或其抗原结合片段。所述重链抗体还包含重链恒定区，例如骆驼重链抗体或软骨鱼重链抗体的恒定区。优选地，所述重链恒定区如SEQ ID NO:83所示。
本发明还包括所述抗体衍生物和类似物。“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的衍生物或类似物可以是(i)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(ii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iii)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与6His标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在不实质性影响抗体活性的前提下，本领域技术人员可以对本发明的序列改变一个或更多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个)氨基酸，以获得所述抗体或其功能性片段序列的变体。这些变体包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行保守性取代时，通常不会改变蛋白质的功能。如在可变区的FR和/或CDR区中将具有类似性质的氨基酸进行取代。可进行保守性取代的氨基酸残基为本领域所周知。这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。它们都被视为包括在本发明保护的范围内。
本文所述抗体的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。
在一些实施方案中，本发明所述变体的序列可以与其来源序列有至少有95％、96％、97％、98％或99％的一致性。本发明所述的序列一致性可以使用序列分析软件测量。例如使用缺省参数的计算机程序BLAST，尤其是BLASTP或TBLASTN。本发明还包括那些具有带CDR的抗体重链可变区的分子，只要其CDR与此处鉴定的CDR具有90％以上(较佳地95％以上，最佳地98％以上)的同源性。
可采用本领域常规的方法制备本发明的抗体，如本领域熟知的杂交瘤技术。可采用本领域常规的方法制备本发明的重链抗体，如本领域熟知的噬菌体展示技术。或者，本发明的抗体或重链抗体可在其他细胞系中表达。可用编码本发明抗体的序列转化合适的哺乳动物宿主细胞。转化可采用任何已知的方法进行，例如包括将多核苷酸包装在病毒(或病毒载体中)并用病毒(或载体)转导宿主细胞。所用的转化程序取决于将转化的宿主。用于将异源多核苷酸引入哺乳动物细胞中的方法为本领域所熟知，包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、将多核苷酸囊封在脂质体中和将DNA直接微注射至核中等。可用作用于表达的宿主的哺乳动物细胞系为本领域所熟知，包括但不限于可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的多种永生化细胞系，包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如，HepG2)等。尤其优选的细胞系通过确定哪些细胞系具有高表达水平并产生具有基本人表皮生长因子受体结合特性的抗体来进行选择。
核酸
本发明还提供了编码上述抗体或其片段的多核苷酸。本文提供编码重链可变区、轻链可变区、重链、轻链以及各CDR的多核苷酸。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
如本领域技术人员将了解，由于遗传密码的简并性，可制得极大量的核酸，它们全部编码本发明的抗体或其抗原结合片段。因此，在已鉴定特定氨基酸序列的情况下，本领域技术人员可通过以不改变编码蛋白质的氨基酸序列的方式简单地修饰一个或多个密码子的序列来制得任何数量的不同的核酸。所以，本发明还涉及与上述多核苷酸序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严谨条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严谨条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)杂交时加有变性剂,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将重链的编码序列和表达标签(如6His)融合在一起，形成融合蛋白。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
所以，本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的核酸构建物，例如表达载体和重组载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。载体通常含有用于质粒维系和用于克隆与表达外源性核苷酸序列的序列。所述序列(在某些实施方案中总称为“侧翼序列”)通常包括一个或多个以下核苷酸序列：启动子、一个或多个增强子序列、复制起点、转录终止序列、含有供体和受体剪接位点的完全内含子序列、编码用于多肽分泌的前导序列的序列、核糖体结合位点、聚腺苷酸化序列、用于插入编码将要表达的抗体的核酸的多连接子区和可选标记元件。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS7、293细胞的动物细胞等。
在某些实施方案中，宿主细胞可以是本领域周知的各种功能细胞，例如各种杀伤性细胞，包括但不限于细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)、树突状细胞刺激的细胞因子诱导的杀伤细胞(DC-CIK)、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、γδT细胞、自然杀伤细胞(NK)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、淋巴因子激活杀伤细胞(LAK)、CD3AK细胞(抗CD3单抗的杀伤细胞)和CAR-T/TCR-T细胞。在某些实施方案中，所述杀伤性细胞为T细胞或NK细胞。示例性的NK细胞包括但不限于原代NK细胞、NK细胞株(如NK92)和NKT细胞。在某些实施方案中，所述NK细胞为原代NK细胞。示例性的T细胞包括但不限于外周血T淋巴细胞、细胞毒杀伤T细胞(CTL)、辅助T细胞、抑制/调节性T细胞、γδT细胞以及细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)等混合细胞群体的T细胞。在某些实施方案中，所述T细胞选自外周血T淋巴细胞与源自TIL的T细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔，脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
治疗用途和药物组合物
通过构建纳米抗体文库，发明人发现并表达纯化多个可以结合EGFR蛋白的纳米抗体。通过蛋白水平亲和力检测、蛋白结合表位分析、配体竞争试验、种属交叉试验、细胞水平亲和力检测、肿瘤细胞EGFR结合检测、Membrane Proteome Array筛选和组织交叉反应等验证了这些抗体的对抗原和细胞的结合能力和药物安全性。
因此，本文所述的抗体的所有方面都可用于制备用以预防或治疗本文所述各种病况和疾病的药物，所述病况和疾病尤其病况与表达人表皮生长因子受体的细胞相关的疾病或病况。在一些实施方案中，所述病况和疾病是癌症，包括但不限于：头颈癌、乳腺癌、膀胱癌、卵巢癌、肾癌、结肠癌以及非小细胞肺癌等。
本文的药物组合物含有本文所述结合分子，以及药学上可接受的辅料，包括但不限于稀释剂、载剂、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂。辅料优选地在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒。这类辅料包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。在某些实施方案中，药物组合物可含有用于改善、维持或保留例如组合物的pH、渗透性、粘度、澄清度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸收或渗透的物质。这些物质为现有技术已知。可视预期的施用途径、递送方式和所需的剂量来确定最佳的药物组合物。
用于体内施用的药物组合物通常以无菌制剂的形式提供。通过经无菌过滤膜过滤来实现灭菌。在组合物冻干时，可在冻干和复水之前或之后使用此方法进行灭菌。可选择本发明的药物组合物用于肠胃外递送。用于肠胃外施用的组合物可以冻干形式或在溶液中储存。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。肠胃外组合物通常放在具有无菌进入孔的容器中，例如具有皮下注射针可刺穿的塞子的静脉内溶液带或小瓶。或者，可选择组合物用于吸入或通过消化道(诸如经口)递送。所述药学上可接受的组合物的制备在本领域的技术内。其它药物组合物将为本领域技术人员显而易见，包括在持续或控制释放递送配制物中包含抗体的配制物。用于配制多种其它持续或可控传递方式的技术(诸如脂质体载剂、生物易蚀微粒或多孔珠粒和积存注射)也为本领域技术人员所知。
药物组合物一经配制，就以溶液、悬浮液、凝胶、乳液、固体、晶体或以脱水或冻干粉末的形式储存在无菌小瓶中。所述配制物可储存成即用形式或在施用前复水的形式(例如，冻干)。本发明还提供用于产生单剂量施用单位的试剂盒。本发明的试剂盒可各自含有具有干燥蛋白的第一容器和具有含水配制物的第二容器。在本发明的某些实施方案中，提供含有单腔和多腔预填充注射器(例如，液体注射器和冻干注射器)的试剂盒。
本发明也提供通过施用本发明任一实施方案所述的结合分子或其药物组合物来治疗患者(尤其是患者的人表皮生长因子受体相关疾病)的方法。本文中，术语“患者”、“受试者”、“个体”、“对象”在本文中可互换使用，包括任何生物体，优选动物，更优选哺乳动物(例如大鼠、小鼠、狗、猫、兔等)，且最优选的是人。“治疗”指向受试者采用本文所述治疗方案以达到至少一种阳性治疗效果(比如，癌症细胞数目减少、肿瘤体积减小、癌细胞浸润至周边器官的速率降低或肿瘤转移或肿瘤生长的速率降低)。有效治疗患者的治疗方案可根据多种因素(比如患者的疾病状态、年龄、体重及疗法激发受试者的抗癌反应的能力)而变。
将采用的含有本发明结合分子的药物组合物的治疗有效量将取决于例如治疗程度和目标。本领域技术人员将了解，用于治疗的适当剂量水平将部分取决于所递送的分子、适应症、施用途径和患者的大小(体重、体表或器官大小)和/或状况(年龄和一般健康状况)而变化。在某些实施方案中，临床医生可滴定剂量并改变施用途径来获得最佳的治疗效果。例如每天约10微克/千克体重-约50毫克/千克体重。
给药频率将取决于所用配制物中结合分子的药物动力学参数。临床医生典型地施用组合物直到达到实现所需效果的剂量。组合物因此可作为单次剂量施用，或随时间以作为两次或多次剂量(可含有或不含有相同量的所需分子)施用，或通过植入装置或导管以连续输液的方式施用。
药物组合物的施用途径是根据已知方法，例如经口、通过静脉内、腹膜内、脑内(脑实质内)、脑室内、肌肉内、眼内、动脉内、门静脉或病灶内途径注射；通过持续释放系统或通过植入装置。
诊断、检测和试剂盒
本发明的结合分子因其与人表皮生长因子受体的高亲合力可用于测定，例如结合测定来检测和/或定量在组织或细胞中表达的人表皮生长因子受体。结合分子例如单域抗体可用在进一步研究人表皮生长因子受体在疾病中的作用的研究中。检测人表皮生长因子受体的方法大致如下：获得细胞和/或组织样本；检测样本中人表皮生长因子受体的水平。
本发明的人表皮生长因子受体结合分子可用于诊断目的，用来检测、诊断或监控与人表皮生长因子受体相关的疾病和/或病况。本发明提供使用本领域技术人员已知的经典免疫组织学方法检测样本中人表皮生长因子受体的存在。可以体内或体外进行人表皮生长因子受体的检测。适用于检测人表皮生长因子受体的存在的方法实例包括ELISA、FACS、RIA等。
对于诊断应用来说，通常用可检测的标记基团来标记结合分子例如单域抗体。合适的标记基团包括(但不限于)以下：放射性同位素或放射性核素(例如，3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、荧光基团(例如，FITC、罗丹明、镧系元素磷光体)、酶促基团(例如，辣根过氧化物酶、β根半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光基团、生物素基基团或由二级报导体识别的预定多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、用于二级抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂。用于标记蛋白质的各种方法在本领域中已知且可用来进行本发明。
本发明的另一方面提供检测与本发明的抗体竞争结合人表皮生长因子受体的测试分子的存在的方法。一种所述测定的实例将涉及在存在或不存在测试分子的情形下检测含有一定量人表皮生长因子受体的溶液中的游离抗体的量。游离抗体(即，未结合人表皮生长因子受体的抗体)的量增加将表示测试分子能与该抗体竞争结合人表皮生长因子受体。在一个实施方案中，用标记基团标记抗体。或者，标记测试分子并在存在或不存在抗体的情形下监控游离测试分子的量。
本发明还提供了用于检测人表皮生长因子受体水平的检测试剂盒，该试剂盒包括识别人表皮生长因子受体蛋白的抗体，用于溶解样本的裂解介质，检测所需的通用试剂和缓冲液，如各种缓冲液、检测标记、检测底物等。该检测试剂盒可以是体外诊断装置。
下文将以具体实施例的方式阐述本发明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并非意图限制本发明的范围。实施例中所用到的方法和材料，除非另有说明，否则均为本领域常规的材料和方法。
实施例
实施例1：羊驼免疫
1.1免疫原制备：
根据uniprot上查询人表皮生长因子受体蛋白序列(L25-S645,P00533-1)，与人IgG Fc片段序列进行融合，委托南京金斯瑞公司进行合成构建pCDNA3.4(Thermo)质粒的真核表达载体，将合成后的质粒利用ExpiCHOTM(Thermo Fisher)表达系统表达，表达后用5mL的Protein A预装柱(GE)进行一步亲和纯化，将纯化后样品置换入PBS缓冲液中，经SDS-PAGE电泳凝胶与HPLC鉴定纯度，ELISA鉴定活性后，分装冻存于-80℃冰箱用于后续免疫。
1.2羊驼免疫：
首次免疫抗原量为400μg，与佐剂(GERBU FAMA)混匀，选取羊驼背部皮下四点注射免疫，每点免疫量为1mL。第二至六次免疫：免疫抗原量为200μg，选取羊驼背部皮下四点注射免疫，每点免疫量为1mL。每次免疫间隔时间为一周。
1.3免疫血清效价检测：
1.3.1蛋白水平效价检测
4℃过夜包被EGFR.His抗原(Acro，Cat#EGR-H522a)、EGFR-V3-his tag抗原(Acro，Cat#EGI-H52H4)，封闭洗涤后，将梯度稀释的血清加入ELISA板进行孵育后，再使用anti-llama IgG HRP(Abcam)抗体进行孵育，洗涤后加入TMB显色液显色，用2M HCl终止反应，然后用酶标仪检测OD450纳米处吸光值。实验结果如图1所示，经过6次免疫后羊驼效价达到较高水平(>512000)。图1中的A、B分别展示了羊驼免疫前后血清在EGFR.His、EGFR-V3-histag抗原的结合效价。
实施例2：针对于EGFR的纳米抗体免疫文库的构建及筛选
(1)6次免疫结束后，提取骆驼外周血淋巴细胞100mL并提取总RNA。RNA的提取参照TAKARA公司RNAiso试剂说明书进行。
(2)以RNA为模板，oligo dT为引物，参照TAKARA公司反转录酶说明书合成cDNA第一链。
(3)采用PrimeSTAR高保真DNA聚合酶，经巢式PCR获得重链抗体的可变区编码基因。用巢式PCR扩增重链抗体的可变区片段：
第一轮PCR：
上游引物：GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGGC(SEQ ID NO:84)
下游引物：GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC(SEQ ID NO:85)
扩增重链抗体引导肽和抗体CH2之间的片段，55℃退火，30个循环；回收约600bp的DNA片段，作为第二轮PCR的模板。
第二轮PCR：
上游引物：GATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGRGGAGG(SEQ ID NO:86)
下游引物：GGACTAGTGCGGCCGCTGGAGACGGTGACCTGGGT(SEQ ID NO:87)
扩增重链抗体FR1区和长、短铰链区之间的片段(长片段和短片段)，55℃退火，30个循环，回收目的片段，结果显示该片段的大小约为500bp，即纳米抗体基因电泳带约为500bp。
(4)将噬菌粒pME207和PCR扩增产物分别用Sfi I和Not I双酶切(NEB)，回收、定量后，以1∶3摩尔比，用T4 DNA连接酶(TaKaRa)连接两个片段，在16℃，过夜连接。
(5)连接产物经乙醇沉淀后，溶于100μL无菌水，分十次进行电穿孔转化大肠杆菌TG1。取100μL电击、培养后的菌液倍比稀释，涂布氨苄青霉素LB培养板，计算库容，其余部分全部涂布于氨苄青霉素2×YT培养板，37℃，倒置培养13～16h。用10mL，2×YT培养基将培养板上的菌苔刮洗后，加入终浓度25％甘油，分装，-80℃保存备用。库容的大小为4.3×109。为检测文库的插入率，随机选取48个克隆做菌落PCR，结果显示插入率已达到90％以上。
(6)根据计算的库容量结果，接种10倍库容量的活细胞于200mL的2×YT(含2％葡萄糖，100μg/mL氨苄青霉素)，37℃，200r/min培养至OD600达0.5，按感染复数20∶1加入辅助噬菌体，37℃静置30min后，37℃，200r/min，30min。将培养物离心，用200mL的2×YT(含100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL卡那霉素)重悬沉淀，37℃，250r/min过夜培养后，8000rpm离心取上清，加入5×PEG/NaCl溶液，冰上放置60min，8000rpm离心30min，重悬沉淀于5mL的PBS中，即得到抗EGFR的单域抗体(VHH)免疫文库，取10μL测定滴度，其余分装于-80℃保存备用。
(7)使用EGFR.His蛋白进行噬菌体库淘选；将蛋白按2μg/mL，100μL每孔包被在酶标板上，4℃放置过夜。第二天五个孔中分别加入200μL，3％BSA，室温封闭2小时。2小时后用PBST(PBS中含有0.05％吐温20)洗3遍。洗板后先在每个负筛孔加入100μL用5％脱脂牛奶预封闭的噬菌体(2～3×1011tfu免疫骆驼纳米抗体噬菌展示基因库)，在室温下作用1.5小时，再将负筛后上清转移至目的抗原包被孔中，室温下作用1.5小时。用PBST(PBS中含有0.05％吐温20)洗12遍，以洗掉不结合的噬菌体。用Glycine(SIGMA)将与EGFR特异性结合的噬菌体解离下，洗脱的噬菌体经Tris(Invitrogen，1M，PH 8.0)中和后感染处于对数期的TG1，经繁殖扩增，进行下一轮“吸附-洗脱”。最后洗脱下的噬菌体浸染TG1，利用IPTG(Thermo)诱导TG1表达纳米抗体，用EGFR蛋白和EGFR-DIII-AlpFc蛋白包被ELISA板，取上清做ELISA检测，选取OD450>0.5的克隆做测序。
(8)通过序列分析后，总计得到182个可以结合EGFR蛋白的克隆。
实施例3：候选抗体表达纯化
选取9个和EGFR结合活性高的纳米抗体VHH序列(其编号及其CDR1、CDR2、CDR3和VHH序列参见表6、7)构建到pCDNA3.4-IgG4载体上，构建成VHH-IgG4形式，然后经ExpiCHOTM(Thermo Fisher)表达系统表达，表达一周后收取上清进行Protein A(GE)纯化。然后使用Nanodrop检测蛋白质量浓度，HPLC检测蛋白纯度。所得蛋白纯度及产量满足后续试验需要。
实施例4：抗体表征
(1)蛋白水平亲和力检测：使用表面等离子共振技术(SPR)测定候选抗体对人EGFR.His抗原的结合动力学和亲和力。将纯化的抗体流经预先固定protein A的传感器芯片，抗体被protein A捕获，然后将5个不同浓度的EGFR.His蛋白作为流动相，结合时间和解离时间分别为30min和60min。使用Biacore Evaluation Software 2.0(GE)分析结合速率(kon)、解离速率(koff)和平衡常数(KD)。选择结合人EGFR III区的抗体EC225为阳性对照(序列来源https://go.drugbank.com/drugs/DB00002)。SPR检测结果如下表1所示。
表1：蛋白亲和力检测结果汇总
抗体 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
E001 5.79E+04 1.20E-05 2.06E-10
E002 4.85E+04 1.21E-04 2.49E-09
E003 2.84E+04 1.33E-04 4.68E-09
E004 1.50E+05 7.76E-04 5.17E-09
E005 1.64E+04 4.67E-05 2.86E-09
E006 3.74E+04 2.55E-04 6.82E-09
E007 3.71E+04 1.08E-05 2.92E-10
E008 1.53E+06 1.48E-02 9.62E-09
EC255 1.54E+06 4.58E-04 2.97E-10
(2)蛋白结合表位分析：使用ELISA测定VHH-IgG4抗体与EGFR胞外各区段蛋白的结合情况。简而言之，将EGFR his tag蛋白、EGFR-V3-his tag抗原蛋白分别稀释到1μg/mL，将EGFR-D1D2(L25-A310,P00533-1(uniprot))、EGFR-D4(F481-S645,P00533-1(uniprot))histag抗原分别稀释至0.5μg/mL；各稀释好的抗原以100μL每孔包被于ELISA板上4℃下过夜。第二天，用PBST(添加0.5％TWEEN-20)洗涤板两次，然后用3％BSA在37℃下封闭板1.5h。然后用PBST洗涤板两次，然后将待测抗体稀释到50nM、5nM、0.5nM、0.05nM，按照100μL/孔加入分别包被有EGFR his tag蛋白、EGFR-V3-his tag抗原的板孔中；将抗体稀释到2000nM、200nM、20nM、2nM，按照100μL/孔加入分别包被有EGFR his tag蛋白、EGFR-V3-his tag抗原的板孔中；将ELISA板于37℃下孵育1h。然后用PBST洗涤板3次，然后每孔加入100μL HRP标记的山羊抗人IgG FC抗体(1:10000，Bethyl)，并在37℃下再孵育40min。然后用PBST洗涤板4次，按照100μL/孔加入TMB显色液，反应3～5min；按照100μL/孔加入3N的盐酸终止反应。终止反应后，在Tecan酶标仪上选择OD450/650进行检测。结果如图2和表2所示，图2中的A-D分别展示了各抗体与EGFR his tag蛋白、EGFR-D1D2蛋白、EGFR-V3-his tag、EGFR-D4蛋白的结合情况，除E009抗体结合I+II区外，其余抗体均结合在EGFR胞外段III区、IV区。
表2
抗体编号 结合区域
E001 Ⅳ
E002 Ⅲ
E003 Ⅲ&Ⅳ
E004 Ⅳ
E005 Ⅳ
E006 Ⅳ
E007 Ⅳ
E008 Ⅲ
EC255 Ⅲ
E009 Ⅰ+Ⅱ
(3)配体竞争试验：使用ELISA鉴定VHH-IgG4抗体是否与配体EGF竞争结合EGFR胞外蛋白。简而言之，将EGFR his tag蛋白用PBS稀释到2μg/mL，在酶标板中每孔加入100μL抗原于4℃包被过夜；第二天，用PBST(添加0.5％TWEEN-20)洗涤板两次，然后用3％BSA在37℃下封闭板1.5h，然后用PBST洗涤板两次。将Human EGF Protein,Mouse IgG2a Fc Tag(Acro,Cat#EGF-H525b，100μg)蛋白稀释至10μg/mL；将VHH-IgG4抗体稀释至2000nM，再4倍比连续稀释8个梯度；每个孔加入50μL EGF蛋白和50μL稀释抗体，将酶标板置于37℃孵育1h；洗涤3遍后，每孔加入按照1:3000稀释好的HRP山羊抗鼠IgG(Goat anti-Mouse IgG)(H+L)抗体(Abcam，cat#ab205719)，37℃孵育40min；然后用PBST洗涤板3次，按照100μL/孔加入TMB显色液，反应3～5min；按照100μL/孔加入3N的盐酸终止反应。终止反应后，在Tecan酶标仪上选择OD450/650进行检测。并用Graphprism 8.0软件制作剂量-效应曲线，计算IC50。同型对照2为阴性对照，其氨基酸序列如CN106046152A中的SEQ ID NO:2所示。结果如图3所示。
(4)种属交叉试验：使用ELISA鉴定VHH-IgG4抗体与小鼠EGFR、猴EGFR、人EGFR蛋白胞外段的结合情况。检测步骤如下：用磷酸缓冲液分别稀释Mouse EGF R Protein,His Tag蛋白(Acro，Cat#EGR-M5224)、Rhesus macaque EGF R Protein,His Tag(Acro，Cat#EGR-C52H1)至1μg/mL，然后按照100μL每孔加入到96孔酶标板中于4℃包被过夜；第二天，用PBST(添加0.5％TWEEN-20)洗涤板两次，然后用3％BSA在37℃下封闭板1.5h，然后用PBST洗涤板两次。将VHH-IgG4抗体稀释至50nM，每孔加入100μL，37℃孵育1h；然后用PBST洗涤板3次，然后每孔加入100μL HRP标记的山羊抗人IgG FC抗体(1:10000，Bethyl)，并在37℃下再孵育40min。然后用PBST洗涤板4次，按照100μL/孔加入TMB显色液，反应3～5min；按照100μL/孔加入3N的盐酸终止反应。终止反应后，在Tecan酶标仪上选择OD450/650进行检测。结果如下表3所示，结合III区的蛋白都与小鼠EGFR蛋白有结合。
表3：种属交叉试验数据汇总(OD450)
抗体编号 小鼠EGFR 猴EGFR
E001 0.76 3.30
E002 2.73 3.06
E003 2.80 3.15
E004 3.37 3.64
E005 3.33 3.19
E006 3.13 3.30
E007 3.21 3.35
E008 0.72 3.68
E009 0.08 3.36
EC255 0.11 3.56
(5)细胞水平亲和力检测：将表达EGFRШ区HEK293T细胞(即HEK293T EGFR-Ш细胞)铺于96孔板中，每孔3×105细胞，再将梯度稀释的VHH-IgG4抗体孵育HEK293T EGFR-Ш细胞，孵育半小时后，加入检测二抗anti-human IgG PE(Jackson Immuno Research，Code：109-117-008，Lot:145501)孵育，然后使用CytoFLEX流式细胞仪检测。通过Graphprism8.0软件进行曲线拟合，计算抗体的EC50。结果如图4所示。图中的同型对照1为阴性对照，其氨基酸序列如CN 106146653A中的SEQ ID NO.:2所示。
(6)针对肿瘤细胞EGFR结合检测：将表达EGFR的SKOV3和Aspc-1两种肿瘤细胞分别铺于96孔板中，每孔3×105细胞，再将梯度稀释的VHH-IgG4抗体孵育肿瘤细胞，冰上孵育半小时后，加入检测二抗anti-human IgG PE(Jackson Immuno Research，Code：109-117-008，Lot:145501)孵育，然后使用CytoFLEX流式细胞仪检测。通过拟合曲线计算抗体的EC50。结果分别如图5和图6所示。
实施例6：Membrane Proteome Array筛选(膜蛋白阵列筛选)
Membrane Proteome Array(MPA)是由美国Integral molecular公司开发的膜蛋白阵列筛选平台，他们将人的5300种不同膜蛋白通过转染HEK293细胞展示在细胞表面，通过FACS检测抗体在这些蛋白上的结合信号，以此评价待检测抗体的特异性。MPA筛选结果显示(图7)，E002、E005、E008都特异性较好(分别如图7的A、B、C所示)，只与靶蛋白EGFR有特异性结合。
实施例7：组织交叉反应
本试验主要由上海细胞治疗集团下属临床试验检测中心完成。研究目的是应用链霉菌抗生物素蛋白与生物素结合的免疫组织化学染色方法评价几个优选抗体是否与12种或34种正常人体冰冻组织(每种组织均来源于3个不同个体)存在交叉反应。流程如下：选取12种或34种组织做冰冻切片，常温晾干后使用丙酮固定。使用内源性生物素阻断试剂盒(生工，E674001)的试剂A和试剂B进行封闭。将生物素标记的抗体样品孵育30min，洗涤后加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(Abcam，ab7403)孵育15min。使用DAB显色和苏木素复染，中性塑胶封片，自然风干后待镜检。阳性对照为Anti-EGFR抗体(Biotin)(Abcam)，阴性对照为生物素标记的IgG同型对照。
表4展示了9个靶向EGFR的VHH-IgG4抗体与12种正常人体组织的组织交叉反应结果。9个EGFR纳米抗体与购买的商品化EGFR抗体在扁桃体、子宫颈鳞状上皮、皮肤、胎盘上有明显的定位典型的阳性反应。E008抗体的组织交叉反应范围相对最小和弱；其余抗体除与扁桃体、子宫颈鳞状上皮、皮肤、胎盘组织有交叉反应外，还与肝、肾、胆囊等组织有不同程度的交叉反应，其中E007抗体的组织交叉反应相对范围最广和最强。
表5展示了3个靶向EGFR的VHH-IgG4抗体与32种正常人体组织的组织交叉反应结果。3支抗体组织交叉反应的结果几乎接近，没有太大的差别。在阳性对照抗体反应的内皮细胞或鳞状上皮细胞均有定位明确的阳性反应。E008相对其它2支抗体的组织交叉反应更少。
表4：9个EGFR抗体与12种正常人体组织的组织交叉反应
Figure BDA0003132035270000261
Figure BDA0003132035270000271
表5：3个EGFR抗体与32种正常人体组织的组织交叉反应
Figure BDA0003132035270000272
Figure BDA0003132035270000281
实施例8：VHH抗体序列汇总
9个VHH抗体的CDR序列如表6所示，9个VHH抗体及EC255对照抗体的氨基酸序列如表7所示。
表6：VHH抗体CDR序列汇总表
Figure BDA0003132035270000282
表7：VHH抗体氨基酸序列汇总表
Figure BDA0003132035270000283
Figure BDA0003132035270000291
实施例9：VHH抗体人源化改造及亲和力检测
参考对纳米抗体做人源化的方法(J.Biol.Chem.2009；284:3273-3284)，使用CDR区移植的方法对4个结合EGFR抗原的VHH抗体E002、E003、E005、E006、E008进行人源化改造。在IgBLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)数据库筛选与E002、E003、E005、E006、E008同源性较高的种系(germline)为模板。各抗体的改型抗体序列如下表8所示。通过表面等离子共振技术(SPR)测定了改造后VHH抗体对人EGFR.His抗原的结合动力学和亲和力。结果如表9所示，改造后抗体亲和力较好。
表8：人源化改造后抗体氨基酸序列汇总表
Figure BDA0003132035270000292
Figure BDA0003132035270000301
Figure BDA0003132035270000311
Figure BDA0003132035270000321
表9：蛋白亲和力检测结果汇总表
抗体编号 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
E002.1 7.8E+04 3.9E-04 5.0E-09
E002.2 1.3E+05 6.8E-04 5.1E-09
E002.4 4.3E+04 4.5E-04 1.1E-08
E002.5 4.3E+04 5.5E-04 1.3E-08
E002.6 4.0E+04 3.8E-04 9.4E-09
E002.7 4.0E+04 4.6E-04 1.1E-08
E005.1 1.1E+04 3.5E-05 3.3E-09
E005.2 1.8E+04 2.1E-05 1.2E-09
E005.3 6.1E+03 1.7E-05 2.7E-09
E005.4 2.0E+03 9.6E-06 4.8E-09
E005.5 1.5E+04 1.1E-05 7.4E-10
E005.6 1.6E+04 4.1E-05 2.5E-09
E005.7 3.5E+03 2.5E-06 7.1E-10
E005.8 1.3E+04 2.7E-05 2.1E-09
E006.1 2.0E+04 7.9E-04 3.9E-08
E006.2 1.7E+04 7.2E-04 4.1E-08
E006.3 2.2E+04 4.0E-04 1.8E-08
E006.4 2.5E+04 3.2E-04 1.3E-08
E006.5 2.4E+04 3.1E-04 1.3E-08
E006.6 2.9E+04 3.2E-04 1.1E-08
E006.7 2.4E+04 3.3E-04 1.4E-08
E006.8 2.7E+04 4.0E-04 1.5E-08
E008.1 4.8E+05 8.7E-03 1.8E-08
E008.2 5.4E+05 2.1E-02 4.0E-08
E008.3 4.9E+06 2.8E-02 5.8E-09
E008.4 4.5E+05 9.3E-03 2.1E-08
E008.5 5.1E+05 1.2E-02 2.4E-08
E008.6 4.3E+05 1.3E-02 3.2E-08
E008.9 4.9E+05 1.2E-02 2.5E-08
E008.10 3.6E+05 2.9E-02 8.2E-08
序列表
<110> 浙江纳米抗体技术中心有限公司
<120> 人表皮生长因子受体结合分子及其应用
<130> 215047
<160> 87
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (1)..(1)
<223> Xaa为G
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (2)..(2)
<223> Xaa为S、F、G、L或R
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (3)..(3)
<223> Xaa为G、T、V、P、A、S或I
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (4)..(4)
<223> Xaa为F、L或D
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (5)..(5)
<223> Xaa为T、S、E、D、L或I
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (6)..(6)
<223> Xaa为I、D、S或T
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (7)..(7)
<223> Xaa为Q、Y、H或F
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (8)..(8)
<223> Xaa为A或T
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(1)
<223> The 'Xaa' at location 1 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (2)..(2)
<223> The 'Xaa' at location 2 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (3)..(3)
<223> The 'Xaa' at location 3 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (4)..(4)
<223> The 'Xaa' at location 4 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (5)..(5)
<223> The 'Xaa' at location 5 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (6)..(6)
<223> The 'Xaa' at location 6 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (7)..(7)
<223> The 'Xaa' at location 7 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (8)..(8)
<223> The 'Xaa' at location 8 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<400> 1
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是I、L或V
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是H、T、F、A或S
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是Q、G、S、P、T、I或N
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是G、T、D、A、S或Y
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是G、H、E或N
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是S、E、K、D、G或A
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (7)..(7)
<223> Xaa是T、H、I、K、S或无
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是S、T、I、P或无
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(1)
<223> The 'Xaa' at location 1 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (2)..(2)
<223> The 'Xaa' at location 2 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (3)..(3)
<223> The 'Xaa' at location 3 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (4)..(4)
<223> The 'Xaa' at location 4 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (5)..(5)
<223> The 'Xaa' at location 5 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (6)..(6)
<223> The 'Xaa' at location 6 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (7)..(7)
<223> The 'Xaa' at location 7 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (8)..(8)
<223> The 'Xaa' at location 8 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<400> 2
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 3
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是N、S、A、K或H
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是V、I、R、K、A或L
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是V、Y、S、D、L、T或N
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是P、H、L、V、S、K或Y
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是P、Y、S、R、T或A
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是L、P、T、F、A、S或D
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (7)..(7)
<223> Xaa是R、P、F、S、A、I或D
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是V、D、G、A或Y
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (9)..(9)
<223> Xaa是Y、N、T、R、F或无
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (10)..(10)
<223> Xaa是P、A、W、E或无
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (11)..(11)
<223> Xaa是S、H、L、Y或无
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (12)..(12)
<223> Xaa是F、D、N、L或无
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (13)..(13)
<223> Xaa是Y、V或无
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (14)..(14)
<223> Xaa是I、G或无
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (15)..(15)
<223> Xaa是G或无
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (16)..(16)
<223> Xaa是Y、A或无
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (17)..(17)
<223> Xaa是G或无
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (18)..(18)
<223> Xaa是G或无
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (19)..(19)
<223> Xaa是G或无
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (20)..(20)
<223> Xaa是E或无
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (21)..(21)
<223> Xaa是V或无
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (22)..(22)
<223> Xaa是R或无
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (23)..(23)
<223> Xaa是Y或无
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (24)..(24)
<223> Xaa是E或无
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (25)..(25)
<223> Xaa是Y或无
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(1)
<223> The 'Xaa' at location 1 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (2)..(2)
<223> The 'Xaa' at location 2 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (3)..(3)
<223> The 'Xaa' at location 3 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (4)..(4)
<223> The 'Xaa' at location 4 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (5)..(5)
<223> The 'Xaa' at location 5 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (6)..(6)
<223> The 'Xaa' at location 6 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (7)..(7)
<223> The 'Xaa' at location 7 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (8)..(8)
<223> The 'Xaa' at location 8 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (9)..(9)
<223> The 'Xaa' at location 9 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (10)..(10)
<223> The 'Xaa' at location 10 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (11)..(11)
<223> The 'Xaa' at location 11 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (12)..(12)
<223> The 'Xaa' at location 12 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (13)..(13)
<223> The 'Xaa' at location 13 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (14)..(14)
<223> The 'Xaa' at location 14 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (15)..(15)
<223> The 'Xaa' at location 15 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (16)..(16)
<223> The 'Xaa' at location 16 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (17)..(17)
<223> The 'Xaa' at location 17 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (18)..(18)
<223> The 'Xaa' at location 18 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (19)..(19)
<223> The 'Xaa' at location 19 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (20)..(20)
<223> The 'Xaa' at location 20 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (21)..(21)
<223> The 'Xaa' at location 21 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (22)..(22)
<223> The 'Xaa' at location 22 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (23)..(23)
<223> The 'Xaa' at location 23 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (24)..(24)
<223> The 'Xaa' at location 24 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (25)..(25)
<223> The 'Xaa' at location 25 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<400> 3
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Gly Ser Gly Phe Thr Ile Gln Ala
1 5
<210> 5
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Ala
1 5
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Ala
1 5
<210> 7
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Gly Phe Pro Phe Glu Thr Tyr Ala
1 5
<210> 8
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Gly Phe Ala Phe Ser Asp Tyr Thr
1 5
<210> 9
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Gly Phe Thr Phe Asp Thr Tyr Thr
1 5
<210> 10
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Gly Phe Ser Phe Ser Asp His Thr
1 5
<210> 11
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Gly Leu Pro Leu Leu Asp Tyr Ala
1 5
<210> 12
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Gly Arg Ile Asp Ile Ile Phe Thr
1 5
<210> 13
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Ile His Gln Gly Gly Ser Thr
1 5
<210> 14
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Ile Thr Gly Thr Gly Glu Thr Ser
1 5
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Ile Thr Ser Gly His Ser Thr
1 5
<210> 16
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Ile Phe Pro Asp Gly Lys His Thr
1 5
<210> 17
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Ile Thr Ser Ala Gly Asp Ile Ile
1 5
<210> 18
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Leu Ala Thr Thr Gly Gly Lys Pro
1 5
<210> 19
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Ile Thr Pro Ala Gly Asp Ile Ile
1 5
<210> 20
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Ile Ser Ile Ser Glu Gly Ser Thr
1 5
<210> 21
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Val Thr Asn Tyr Asn Ala
1 5
<210> 22
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
Asn Val Val Pro Pro Leu Arg Val
1 5
<210> 23
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
Ser Ile Tyr His Pro Pro Arg Asp Tyr
1 5
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
Asn Arg Ser Pro Tyr Thr Pro Gly Asn
1 5
<210> 25
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
Ala Lys Asp Leu Pro Phe Phe Ala Thr Pro Ser Phe Tyr Ile Gly Tyr
1 5 10 15
<210> 26
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
Asn Ala Leu Val Ser Ala Ser Val Arg Ala Ser Asp Tyr
1 5 10
<210> 27
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
Lys Ala Thr Ser Arg Ser Pro Val Asn Pro His Asn Tyr
1 5 10
<210> 28
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
Asn Ala Leu Val Ser Ala Ala Val Arg Ala Ser Asp Tyr
1 5 10
<210> 29
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
Ala Ala Asp Lys Thr Asp Ile Gly Phe Trp Leu Leu Val Gly Gly Ala
1 5 10 15
Gly Gly Gly Glu Val Arg Tyr Glu Tyr
20 25
<210> 30
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
His Leu Asn Tyr Ala Ser Asp Tyr Thr Glu Tyr Asp Tyr
1 5 10
<210> 31
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Pro Ser Gly Ser Gly Phe Thr Ile Gln
20 25 30
Ala Met Thr Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ile Ile His Gln Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ser Asp Ser Val Arg
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Ala Trp Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Val Val Pro Pro Leu Arg Val Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 32
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Ala Val Ser Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Arg Ile Thr Gly Thr Gly Glu Thr Ser Arg Tyr Glu Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Val Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Ile Tyr His Pro Pro Arg Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 33
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Gly Val Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Val Pro Gly Lys Leu Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Thr Ile Thr Ser Gly His Ser Thr Thr Tyr Ala Asp Ile Val Arg
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Arg Leu Glu Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Arg Ser Pro Tyr Thr Pro Gly Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 34
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ala Gln Ser Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ala Cys Glu Ala Ser Gly Phe Pro Phe Glu Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Ala Arg Gln Thr Pro Gly Asn Glu Pro Glu Trp Val
35 40 45
Ala Gly Ile Phe Pro Asp Gly Lys His Thr Ala Tyr Ala His Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Val Asn Ala Asn Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Leu Pro Phe Phe Ala Thr Pro Ser Phe Tyr Ile Gly Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 35
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Thr Met Arg Trp His Arg Gln Ala Ala Gly Lys Glu Leu Glu Leu Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Thr Ser Ala Gly Asp Ile Ile Lys Tyr Ala Asn Ser Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Arg Cys
85 90 95
Asn Ala Leu Val Ser Ala Ser Val Arg Ala Ser Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 36
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Thr Tyr
20 25 30
Thr Thr Ser Trp Glu Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Met Val
35 40 45
Ala Val Leu Ala Thr Thr Gly Gly Lys Pro Tyr Tyr Val Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ala Ser Glu Thr Ala Val Thr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Lys Ala Thr Ser Arg Ser Pro Val Asn Pro His Asn Tyr Ser Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 37
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asp His
20 25 30
Thr Met Arg Trp His Arg Gln Ala Ala Gly Lys Asn Leu Glu Leu Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Thr Pro Ala Gly Asp Ile Ile Lys Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Met Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Arg Cys
85 90 95
Asn Ala Leu Val Ser Ala Ala Val Arg Ala Ser Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 38
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
Glu Val Gln Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ser Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Thr Ser Ser Gly Leu Pro Leu Leu Asp Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Ala Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Ile Ser Glu Gly Ser Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Asn Lys Asn Lys Val Tyr
65 70 75 80
Leu Arg Met Asp Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Lys Thr Asp Ile Gly Phe Trp Leu Leu Val Gly Gly Ala
100 105 110
Gly Gly Gly Glu Val Arg Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val
115 120 125
Thr Val Ser Ser
130
<210> 39
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Arg Ile Asp Ile Ile Phe
20 25 30
Thr Met Gly Trp Tyr Arg Gln Thr Pro Gly Asn Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ser Val Thr Asn Tyr Asn Ala Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Thr Glu Asn Thr Ala Tyr Leu Gln
65 70 75 80
Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Val Cys His Leu
85 90 95
Asn Tyr Ala Ser Asp Tyr Thr Glu Tyr Asp Tyr Tyr Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 40
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Ala Val Ser Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ser Arg Ile Thr Gly Thr Gly Glu Thr Ser Arg Tyr Glu Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Ile Tyr His Pro Pro Arg Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 41
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Ala Val Ser Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ser Arg Ile Thr Gly Thr Gly Glu Thr Ser Arg Tyr Glu Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Val Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Ile Tyr His Pro Pro Arg Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 42
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Ala Val Ser Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ser Arg Ile Thr Gly Thr Gly Glu Thr Ser Arg Tyr Glu Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Val Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Ile Tyr His Pro Pro Arg Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 43
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Ala Val Ser Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Arg Ile Thr Gly Thr Gly Glu Thr Ser Arg Tyr Glu Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Ile Tyr His Pro Pro Arg Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 44
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Ala Val Ser Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Arg Ile Thr Gly Thr Gly Glu Thr Ser Arg Tyr Glu Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Val Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Ile Tyr His Pro Pro Arg Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 45
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Ala Val Ser Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Arg Ile Thr Gly Thr Gly Glu Thr Ser Arg Tyr Glu Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Ile Tyr His Pro Pro Arg Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 46
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Ala Val Ser Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Arg Ile Thr Gly Thr Gly Glu Thr Ser Arg Tyr Glu Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Val Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Ile Tyr His Pro Pro Arg Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 47
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Gly Val Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Val Pro Gly Lys Leu Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Thr Ile Thr Ser Gly His Ser Thr Thr Tyr Ala Asp Ile Val Arg
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Arg Ser Pro Tyr Thr Pro Gly Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 48
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Gly Val Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Val Pro Gly Lys Leu Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ser Thr Ile Thr Ser Gly His Ser Thr Thr Tyr Ala Asp Ile Val Arg
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Arg Ser Pro Tyr Thr Pro Gly Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 49
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Gly Val Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Val Pro Gly Lys Leu Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ser Thr Ile Thr Ser Gly His Ser Thr Thr Tyr Ala Asp Ile Val Arg
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Arg Ser Pro Tyr Thr Pro Gly Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 50
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Gly Val Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Val Pro Gly Lys Leu Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Thr Ile Thr Ser Gly His Ser Thr Thr Tyr Ala Asp Ile Val Arg
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Arg Ser Pro Tyr Thr Pro Gly Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 51
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Gly Val Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Val Pro Gly Lys Leu Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Thr Ile Thr Ser Gly His Ser Thr Thr Tyr Ala Asp Ile Val Arg
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Arg Ser Pro Tyr Thr Pro Gly Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 52
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Gly Val Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Val Pro Gly Lys Leu Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Thr Ile Thr Ser Gly His Ser Thr Thr Tyr Ala Asp Ile Val Arg
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Arg Ser Pro Tyr Thr Pro Gly Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 53
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Gly Val Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Val Pro Gly Lys Leu Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ser Thr Ile Thr Ser Gly His Ser Thr Thr Tyr Ala Asp Ile Val Arg
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Arg Ser Pro Tyr Thr Pro Gly Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 54
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Gly Val Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Val Pro Gly Lys Leu Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Thr Ile Thr Ser Gly His Ser Thr Thr Tyr Ala Asp Ile Val Arg
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Arg Ser Pro Tyr Thr Pro Gly Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 55
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Gly Val Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Val Pro Gly Lys Leu Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Thr Ile Thr Ser Gly His Ser Thr Thr Tyr Ala Asp Ile Val Arg
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Arg Leu Glu Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Arg Ser Pro Tyr Thr Pro Gly Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 56
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Gly Val Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Val Pro Gly Lys Leu Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ser Thr Ile Thr Ser Gly His Ser Thr Thr Tyr Ala Asp Ile Val Arg
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Arg Leu Glu Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Arg Ser Pro Tyr Thr Pro Gly Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 57
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Thr Met Arg Trp His Arg Gln Ala Ala Gly Lys Glu Leu Glu Leu Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Thr Ser Ala Gly Asp Ile Ile Lys Tyr Ala Asn Ser Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Arg Cys
85 90 95
Asn Ala Leu Val Ser Ala Ser Val Arg Ala Ser Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 58
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Thr Met Arg Trp His Arg Gln Ala Ala Gly Lys Glu Leu Glu Leu Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Thr Ser Ala Gly Asp Ile Ile Lys Tyr Ala Asn Ser Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Arg Cys
85 90 95
Asn Ala Leu Val Ser Ala Ser Val Arg Ala Ser Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 59
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Thr Met Arg Trp His Arg Gln Ala Ala Gly Lys Glu Leu Glu Leu Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Thr Ser Ala Gly Asp Ile Ile Lys Tyr Ala Asn Ser Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Arg Cys
85 90 95
Asn Ala Leu Val Ser Ala Ser Val Arg Ala Ser Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 60
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Thr Met Arg Trp His Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Leu Glu Leu Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Thr Ser Ala Gly Asp Ile Ile Lys Tyr Ala Asn Ser Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Arg Cys
85 90 95
Asn Ala Leu Val Ser Ala Ser Val Arg Ala Ser Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 61
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Thr Met Arg Trp His Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Leu Glu Leu Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Thr Ser Ala Gly Asp Ile Ile Lys Tyr Ala Asn Ser Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Arg Cys
85 90 95
Asn Ala Leu Val Ser Ala Ser Val Arg Ala Ser Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 62
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Thr Met Arg Trp His Arg Gln Ala Ala Gly Lys Glu Leu Glu Leu Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Ser Ala Gly Asp Ile Ile Lys Tyr Ala Asn Ser Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Arg Cys
85 90 95
Asn Ala Leu Val Ser Ala Ser Val Arg Ala Ser Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 63
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Thr Met Arg Trp His Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Leu Glu Leu Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Thr Ser Ala Gly Asp Ile Ile Lys Tyr Ala Asn Ser Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Arg Cys
85 90 95
Asn Ala Leu Val Ser Ala Ser Val Arg Ala Ser Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 64
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Thr Met Arg Trp His Arg Gln Ala Ala Gly Lys Glu Leu Glu Leu Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Thr Ser Ala Gly Asp Ile Ile Lys Tyr Ala Asn Ser Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Arg Cys
85 90 95
Asn Ala Leu Val Ser Ala Ser Val Arg Ala Ser Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 65
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Thr Tyr
20 25 30
Thr Thr Ser Trp Glu Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Met Val
35 40 45
Ala Val Leu Ala Thr Thr Gly Gly Lys Pro Tyr Tyr Val Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Lys Ala Thr Ser Arg Ser Pro Val Asn Pro His Asn Tyr Ser Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 66
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Thr Tyr
20 25 30
Thr Thr Ser Trp Glu Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Met Val
35 40 45
Ala Val Leu Ala Thr Thr Gly Gly Lys Pro Tyr Tyr Val Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ala Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Lys Ala Thr Ser Arg Ser Pro Val Asn Pro His Asn Tyr Ser Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 67
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Thr Tyr
20 25 30
Thr Thr Ser Trp Glu Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Met Val
35 40 45
Ala Val Leu Ala Thr Thr Gly Gly Lys Pro Tyr Tyr Val Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ala Ser Glu Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Lys Ala Thr Ser Arg Ser Pro Val Asn Pro His Asn Tyr Ser Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 68
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Thr Tyr
20 25 30
Thr Thr Ser Trp Glu Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Met Val
35 40 45
Ala Val Leu Ala Thr Thr Gly Gly Lys Pro Tyr Tyr Val Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ala Ser Glu Asn Ala Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Lys Ala Thr Ser Arg Ser Pro Val Asn Pro His Asn Tyr Ser Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 69
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Thr Tyr
20 25 30
Thr Thr Ser Trp Glu Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Met Val
35 40 45
Ala Val Leu Ala Thr Thr Gly Gly Lys Pro Tyr Tyr Val Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ala Ser Glu Asn Ala Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Lys Ala Thr Ser Arg Ser Pro Val Asn Pro His Asn Tyr Ser Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 70
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Thr Tyr
20 25 30
Thr Thr Ser Trp Glu Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Met Val
35 40 45
Ala Val Leu Ala Thr Thr Gly Gly Lys Pro Tyr Tyr Val Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ala Ser Glu Asn Ala Val Thr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Lys Ala Thr Ser Arg Ser Pro Val Asn Pro His Asn Tyr Ser Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 71
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Thr Tyr
20 25 30
Thr Thr Ser Trp Glu Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Met Val
35 40 45
Ser Val Leu Ala Thr Thr Gly Gly Lys Pro Tyr Tyr Val Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ala Ser Glu Asn Ala Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Lys Ala Thr Ser Arg Ser Pro Val Asn Pro His Asn Tyr Ser Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 72
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Thr Tyr
20 25 30
Thr Thr Ser Trp Glu Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Met Val
35 40 45
Ser Val Leu Ala Thr Thr Gly Gly Lys Pro Tyr Tyr Val Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ala Ser Glu Asn Ala Val Thr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Lys Ala Thr Ser Arg Ser Pro Val Asn Pro His Asn Tyr Ser Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 73
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Pro Leu Leu Asp Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Ala Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Ile Ser Glu Gly Ser Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Lys Thr Asp Ile Gly Phe Trp Leu Leu Val Gly Gly Ala
100 105 110
Gly Gly Gly Glu Val Arg Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val
115 120 125
Thr Val Ser Ser
130
<210> 74
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Pro Leu Leu Asp Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Ala Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Ile Ser Glu Gly Ser Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Lys Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Lys Thr Asp Ile Gly Phe Trp Leu Leu Val Gly Gly Ala
100 105 110
Gly Gly Gly Glu Val Arg Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val
115 120 125
Thr Val Ser Ser
130
<210> 75
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Pro Leu Leu Asp Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Ala Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Ile Ser Glu Gly Ser Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Arg Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Lys Thr Asp Ile Gly Phe Trp Leu Leu Val Gly Gly Ala
100 105 110
Gly Gly Gly Glu Val Arg Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val
115 120 125
Thr Val Ser Ser
130
<210> 76
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Pro Leu Leu Asp Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Ala Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Ile Ser Glu Gly Ser Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Asn Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Lys Thr Asp Ile Gly Phe Trp Leu Leu Val Gly Gly Ala
100 105 110
Gly Gly Gly Glu Val Arg Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val
115 120 125
Thr Val Ser Ser
130
<210> 77
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 77
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Pro Leu Leu Asp Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Ala Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Ile Ser Glu Gly Ser Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Lys Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Lys Thr Asp Ile Gly Phe Trp Leu Leu Val Gly Gly Ala
100 105 110
Gly Gly Gly Glu Val Arg Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val
115 120 125
Thr Val Ser Ser
130
<210> 78
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 78
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Pro Leu Leu Asp Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Ala Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Ile Ser Glu Gly Ser Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Asn Lys Asn Lys Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Lys Thr Asp Ile Gly Phe Trp Leu Leu Val Gly Gly Ala
100 105 110
Gly Gly Gly Glu Val Arg Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val
115 120 125
Thr Val Ser Ser
130
<210> 79
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 79
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ser Ser Gly Leu Pro Leu Leu Asp Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Ala Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Ile Ser Glu Gly Ser Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Asn Lys Asn Lys Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Lys Thr Asp Ile Gly Phe Trp Leu Leu Val Gly Gly Ala
100 105 110
Gly Gly Gly Glu Val Arg Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val
115 120 125
Thr Val Ser Ser
130
<210> 80
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 80
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Leu Pro Leu Leu Asp Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Ala Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Ile Ser Glu Gly Ser Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Asn Lys Asn Lys Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Lys Thr Asp Ile Gly Phe Trp Leu Leu Val Gly Gly Ala
100 105 110
Gly Gly Gly Glu Val Arg Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val
115 120 125
Thr Val Ser Ser
130
<210> 81
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 81
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Pro Leu Leu Asp Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Leu Glu Ala Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Ile Ser Glu Gly Ser Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Asn Lys Asn Lys Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Lys Thr Asp Ile Gly Phe Trp Leu Leu Val Gly Gly Ala
100 105 110
Gly Gly Gly Glu Val Arg Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val
115 120 125
Thr Val Ser Ser
130
<210> 82
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 82
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ser Ser Gly Leu Pro Leu Leu Asp Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Ala Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Ile Ser Glu Gly Ser Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Lys Val Tyr
65 70 75 80
Leu Arg Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Lys Thr Asp Ile Gly Phe Trp Leu Leu Val Gly Gly Ala
100 105 110
Gly Gly Gly Glu Val Arg Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val
115 120 125
Thr Val Ser Ser
130
<210> 83
<211> 229
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 83
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
<210> 84
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 84
gtcctggctg ctcttctaca aggc 24
<210> 85
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 85
ggtacgtgct gttgaactgt tcc 23
<210> 86
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 86
gatgtgcagc tgcaggagtc tggrggagg 29
<210> 87
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 87
ggactagtgc ggccgctgga gacggtgacc tgggt 35

Claims (13)

1.一种人表皮生长因子受体结合分子，包含抗人表皮生长因子受体单域抗体，所述单域抗体的互补决定区CDR包含CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR1包括SEQ ID NO:1所示的序列、CDR2包括SEQ ID NO:2所示的序列、和CDR3包括SEQ ID NO:3所示的序列，其中，
SEQ ID NO:1是X1X2X3X4X5X6X7X8，其中，X1为G，X2为S、F、G、L或R，X3为G、T、V、P、A、S或I，X4为F、L或D，X5为T、S、E、D、L或I，X6为I、D、S或T，X7为Q、Y、H或F，X8为A或T；
SEQ ID NO:2是X1X2X3X4X5X6X7X8，其中，X1为I、L或V，X2为H、T、F、A或S，X3为Q、G、S、P、T、I或N，X4为G、T、D、A、S或Y，X5为G、H、E或N，X6为S、E、K、D、G或A，X7为T、H、I、K、S或无，X8为S、T、I、P或无；
SEQ ID NO:3是X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21X22X23X24X25，其中，X1为N、S、A、K或H，X2为V、I、R、K、A或L，X3为V、Y、S、D、L、T或N，X4为P、H、L、V、S、K或Y，X5为P、Y、S、R、T或A，X6为L、P、T、F、A、S或D，X7为R、P、F、S、A、I或D，X8为V、D、G、A或Y，X9为Y、N、T、R、F或无，X10为P、A、W、E或无，X11为S、H、L、Y或无，X12为F、D、N、L或无，X13为Y、V或无，X14为I、G或无，X15为G或无，X16为Y、A或无，X17为G或无，X18为G或无，X19为G或无，X20为E或无，X21为V或无，X22为R或无，X23为Y或无，X24为E或无，X25为Y或无。
2.如权利要求1所述的人表皮生长因子受体结合分子，其特征在于，所述单域抗体的CDR1包含SEQ ID NO:4-12中任一所示的序列，CDR2包含SEQ ID NO:13-21中任一所示的序列，和CDR3包含SEQ ID NO:22-30中任一所示的序列，
优选地，所述单域抗体含有以下组a1到组a9中任一组的SEQ ID NO所示的CDR1、CDR2和CDR3：
Figure FDA0003132035260000011
Figure FDA0003132035260000021
3.如权利要求1或2所述的人表皮生长因子受体结合分子，其特征在于，
所述单域抗体的FR区包含选自SEQ ID NO:31-82的任一VHH的FR区，和/或
所述单域抗体VHH如SEQ ID NO:31-82中任一所示，或与如SEQ ID NO:31-82中任一的氨基酸序列具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，和/或
所述人表皮生长因子受体结合分子是包含一条、两条或多条所述单域抗体的单价或多价单域抗体、多特异性单域抗体、重链抗体或其抗原结合片段、抗体或其抗原结合片段。
4.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸选自：
(1)权利要求1-3中任一项所述的人表皮生长因子受体结合分子的编码序列；
(2)(1)的互补序列；
(3)(1)或(2)中任一序列的5-50bp的片段。
5.一种核酸构建物，其特征在于，所述核酸构建物包含权利要求4所述的多核苷酸；优选地，所述核酸构建物是重组载体或表达载体。
6.包含权利要求1-3中任一项所述的人表皮生长因子受体结合分子的噬菌体；优选地，所述人表皮生长因子受体结合分子展示于所述噬菌体表面。
7.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞：
(1)表达权利要求1-3中任一项所述的人表皮生长因子受体结合分子；和/或
(2)包含权利要求4所述的多核苷酸；和/或
(3)包含权利要求5所述的核酸构建物。
8.一种产生人表皮生长因子受体结合分子的方法，包括：在适合产生人表皮生长因子受体结合分子的条件下培养权利要求7所述的宿主细胞，和任选的从培养物中纯化所述人表皮生长因子受体结合分子。
9.一种药物组合物，包含权利要求1-3中任一项所述的人表皮生长因子受体结合分子、权利要求4所述的多核苷酸、权利要求5所述的核酸构建物、权利要求6所述的噬菌体或权利要求7所述的宿主细胞，和药学上可接受的辅料；优选地，所述药物组合物用于治疗癌症。
10.权利要求1-3中任一项所述的人表皮生长因子受体结合分子在制备用于预防或治疗癌症的药物中的用途。
11.一种检测人表皮生长因子受体的试剂盒，用于评估药物治疗效果或诊断癌症，所述的试剂盒包含权利要求1-3中任一项所述的人表皮生长因子受体结合分子、权利要求4所述的多核苷酸、权利要求5所述的核酸构建物、权利要求6所述的噬菌体或权利要求7所述的宿主细胞；
优选地，所述试剂盒还包括用于检测人表皮生长因子受体与单域抗体、抗体或其抗原结合片段的结合的试剂；
更优选地，所述试剂是通过酶联免疫反应法检测所述结合的试剂。
12.一种检测样品中人表皮生长因子受体存在情况的非诊断性方法，所述方法包括：以权利要求1-3中任一项所述的人表皮生长因子受体结合分子与样品孵育，和检测人表皮生长因子受体与单域抗体、抗体或其抗原结合片段的结合，从而确定样品中人表皮生长因子受体存在情况。
13.权利要求1-3中任一项所述的人表皮生长因子受体结合分子在制备用于检测样品中人表皮生长因子受体、评估药物治疗效果或诊断癌症的试剂盒中的用途。
CN202110705939.8A 2021-06-24 2021-06-24 人表皮生长因子受体结合分子及其应用 Pending CN115521377A (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110705939.8A CN115521377A (zh) 2021-06-24 2021-06-24 人表皮生长因子受体结合分子及其应用
PCT/CN2022/100888 WO2022268178A1 (zh) 2021-06-24 2022-06-23 人表皮生长因子受体结合分子及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110705939.8A CN115521377A (zh) 2021-06-24 2021-06-24 人表皮生长因子受体结合分子及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115521377A true CN115521377A (zh) 2022-12-27

Family

ID=84544126

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110705939.8A Pending CN115521377A (zh) 2021-06-24 2021-06-24 人表皮生长因子受体结合分子及其应用

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN115521377A (zh)
WO (1) WO2022268178A1 (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060228355A1 (en) * 2003-11-07 2006-10-12 Toon Laeremans Camelidae single domain antibodies vhh directed against epidermal growth factor receptor and uses therefor
CN110964110A (zh) * 2019-12-24 2020-04-07 北京纽安博生物技术有限公司 抗EGFR人源化的单域抗体、Fc融合蛋白、重链Fab蛋白及其应用
CN112552402A (zh) * 2018-09-27 2021-03-26 暨南大学 一种抗人egfr的纳米抗体与应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090269343A1 (en) * 2008-04-11 2009-10-29 Duke University Dual Specific Immunotoxin for Brain Tumor Therapy

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060228355A1 (en) * 2003-11-07 2006-10-12 Toon Laeremans Camelidae single domain antibodies vhh directed against epidermal growth factor receptor and uses therefor
CN112552402A (zh) * 2018-09-27 2021-03-26 暨南大学 一种抗人egfr的纳米抗体与应用
CN110964110A (zh) * 2019-12-24 2020-04-07 北京纽安博生物技术有限公司 抗EGFR人源化的单域抗体、Fc融合蛋白、重链Fab蛋白及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
WO2022268178A1 (zh) 2022-12-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11555077B2 (en) 4-1BB antibody and preparation method and use thereof
CN112830969B (zh) 一种特异性结合人Claudin18.2的单克隆抗体及包含其的药物和试剂盒
WO2019141268A1 (zh) 抗4-1bb抗体、其抗原结合片段及其医药用途
CN112243443B (zh) 抗trop-2抗体、其抗原结合片段及其医药用途
WO2021170082A1 (zh) 抗cd47/抗pd-l1抗体及其应用
WO2023036281A1 (zh) 抗cd47抗体及其用途
WO2022143550A1 (zh) 间皮素结合分子及其应用
JP2024504124A (ja) 新規の抗グレムリン１抗体
WO2021197401A1 (zh) 结合cd47的抗原结合多肽及用途
CN115298216A (zh) 抗体或其抗原结合片段、其制备方法及医药用途
CN114685666B (zh) 抗间皮素纳米抗体及其应用
CN114685667B (zh) 间皮素结合分子及其应用
WO2022199590A1 (zh) 一种靶向bcma的纳米抗体及其应用
WO2022268178A1 (zh) 人表皮生长因子受体结合分子及其应用
CN114685655B (zh) Pd-1结合分子及其应用
WO2023142297A1 (zh) Muc1结合分子及其应用
WO2023051618A1 (zh) Ctla-4结合分子及其应用
WO2023083327A1 (zh) 抗cldn18.2单克隆抗体及其应用
US20230086530A1 (en) Human cd47-targeting single-domain antibody and use thereof
WO2024088386A1 (en) Antibody, antigen-binding fragment thereof, and pharmaceutical use thereof
WO2023041065A1 (zh) 一种靶向人ceacam5/6的抗体、制备方法和应用
WO2022267926A1 (zh) 一种抗tnfr2抗体及其制备方法和应用
WO2024012434A1 (en) Antibody, antigen-binding fragment thereof, and pharmaceutical use thereof
CN117843793A (zh) 抗间皮素抗体、抗原结合片段及其用途
CN115010810A (zh) 抗ctla-4抗体及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination