JPWO2020026987A1 - 抗ｒｏｒ１モノクローナル抗体およびその機能的断片、遺伝子、薬剤デリバリー組成物、並びに、医薬組成物 - Google Patents

抗ｒｏｒ１モノクローナル抗体およびその機能的断片、遺伝子、薬剤デリバリー組成物、並びに、医薬組成物 Download PDF

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Abstract

癌細胞のエンドサイトーシスの際に、ＲＯＲ１と共に癌細胞内に取り込まれる抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体を提供することを課題とする。ヒトＲＯＲ１タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００５００３．２）のアミノ酸配列位置１５６〜３００をエピトープとして認識する抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体により課題を解決できる。

Description

本明細書における開示は、抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体およびその機能的断片、遺伝子、薬剤デリバリー組成物、並びに、医薬組成物に関する。特に、癌細胞のエンドサイトーシスの際に、ＲＯＲ１と共に癌細胞内に取り込まれる抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体およびその機能的断片、抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体の可変領域をコードする遺伝子をオープンリーディングフレーム領域として有する遺伝子、抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体またはその機能的断片を含む薬剤デリバリー組成物、並びに、医薬組成物に関する。
肺癌は、経済的に良く発展した国々における癌による死亡の主たる原因であり、その中でも肺腺癌は最も頻度の高い組織学的サブタイプである。
肺腺癌は、肺における分岐形態形成及び生理学的機能に必要な系譜特異的転写因子（ｌｉｎｅａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）であるＴＴＦ−１（ｔｈｙｒｏｉｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ−１）の持続的な発現と密接に結びついていることが知られている(非特許文献１参照)。また、ＴＴＦ−１は系譜生存的癌遺伝子（ｌｉｎｅａｇｅ−ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｎｃｏｇｅｎｅ）であるということも知られている（非特許文献２〜４参照）。ＴＴＦ−１がサーファクタントタンパク質の産生、並びに正常な成人の肺における生理学的機能に欠かせないことから、ＴＴＦ−１の系譜特異的生存シグナルに関与する下流分子の同定は、新たな治療方法の開発に必要である。
ＴＴＦ−１により発現が誘導される下流分子としては、ＲＯＲ１（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ−ｌｉｋｅ ｏｒｐｈａｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １）遺伝子が知られている。そして、このＲＯＲ１遺伝子の発現を抑制することにより、特定の癌細胞の増殖が阻害できることも知られている（特許文献１参照）。
更に、ＲＯＲ１を標的とすると、癌細胞のアポトーシスの誘導のみならず、ＥＧＦＲやＭＥＴなどの受容体型チロシンキナーゼ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ、以下、受容体型チロシンキナーゼのことを「ＲＴＫ」と記載することがある。）が伝達する癌細胞の生存促進性シグナルの抑制が可能であること、そのため、ＲＯＲ１が、癌細胞の増殖抑制剤の開発の重要な標的となりうることも知られている（特許文献２参照、非特許文献５参照）。
ところで、上記特許文献２等に記載されているように、これまでの開発されてきた多くの分子標的薬は、キナーゼ活性の阻害剤である。前記キナーゼ活性の阻害剤とは、肺癌を始めとするヒトがんの増殖・生存に関わるＲＴＫの活性化を抑制する化合物のことである。しかしながら、キナーゼ活性の阻害剤を患者に投与すると、治療中にキナーゼ遺伝子に耐性を付与する変異が生じたり、癌細胞の生存シグナルを他のレセプターに依存するバイパス経路が生じることで、癌細胞が当該キナーゼ活性の阻害剤に対して耐性を獲得するという問題がある。
また、上記特許文献２に記載されているＥＧＦＲ、ＭＥＴ等、癌細胞の一つのレセプターを分子標的とした場合、他のレセプターからのシグナルが遮断できず十分な効果が得られないことがあり、各々のレセプターを標的とする阻害剤の併用が試みられている。しかしながら、複数の阻害剤を併用したとしても、更にバイパス経路が生じたり、複数の阻害剤投与による副作用が拡大する恐れがあるという問題がある。
以上のことから、正常細胞や癌細胞は様々な生存シグナルを駆使し自身が生き延びることを可能としているが、これらの生存シグナルは細胞膜に存在する多くのＲＴＫを介して伝わる。これまでの研究から、癌細胞では個々のＲＴＫをターゲットとした分子標的薬（ＥＧＦＲを対象としたイレッサなど）が開発され、上記のように複数のＲＴＫに対する阻害剤の併用が試みられているが、更に異なるＲＴＫを介したバイパス経路の出現やこれらのＲＴＫは正常細胞でも生存シグナルを伝える重要な役割を担っているため、副作用が非常に大きな問題となっている。そのため、癌細胞の個々のＲＴＫをターゲットとするのではなく、ＲＯＲ１とＣａｖｉｎ−１又はＲＯＲ１とＣａｖｅｏｌｉｎ１（以下、「ＣＡＶ１」と記載することがある。）の結合を抑制することで、各種増殖因子が結合し細胞内にシグナルを伝達するＲＴＫが集積しているカベオラの形成自体を抑制できること、そして、カベオラの形成を特異的に抑制することで、各種ＲＴＫの活性を一網打尽にできることも知られている（特許文献３、非特許文献６参照）。
国際公開第２０１０／００８０６９号 国際公開第２０１２／０９０９３９号 国際公開第２０１６／０６３６３７号
Ｔａｎａｋａ．Ｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２００７，Ｖｏｌ．６７， ｐ６００７〜６０１１ Ｋｅｎｄａｌｌ．Ｊ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２００７， Ｖｏｌ．１０４， ｐ１６６６３〜１６６６８ Ｗｅｉｒ，ＢＡ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ２００７， Ｖｏｌ．４５０， ｐ８９３〜８９８ Ｋｗｅｉ，ＫＡ ｅｔ ａｌ．， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００８， Ｖｏｌ．２７， ｐ３６３５〜３６４０ Ｙａｍａｇｕｃｈｉ．Ｔ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ，２０１２， Ｖｏｌ．２１， ｐ３４８〜３６１ Ｙａｍａｇｕｃｈｉ．Ｔ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎ，２０１６，Ｖｏｌ．７，１００６０（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１００６０）
上記のとおり、特許文献３に記載されている発明は、カベオラの形成を特異的に抑制することで、各種ＲＴＫの活性を一網打尽にできる化合物の探索に非常に有効である。ところで、細胞は様々な生存シグナルを駆使し自身が生き延びることを可能としている。そのため、有効な癌の治療薬の開発には、癌細胞の様々な分子機序に着目し、有効な方法を探索する必要がある。
本明細書における開示は、上記従来の問題を解決するためになされた発明であり、鋭意研究を行ったところ、（１）癌細胞に特有のタンパク質であるＲＯＲ１に着目し、ＲＯＲ１の細胞外領域の特定領域をエピトープとして認識する抗ＲＯＲ１抗体は、エンドサイトーシスの際に、ＲＯＲ１と共に癌細胞内に取り込まれること、（２）そのため、抗ＲＯＲ１抗体は薬剤を細胞内に取り込むデリバリーとして使用できること、を新たに見出した。
すなわち、本明細書における開示の目的は、癌細胞のエンドサイトーシスの際に、ＲＯＲ１と共に癌細胞内に取り込まれる抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体およびその機能的断片、抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体の可変領域をコードする遺伝子をオープンリーディングフレーム領域として有する遺伝子、抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体またはその機能的断片を含む薬剤デリバリー組成物、並びに、医薬組成物を提供することである。
本明細書における開示は、以下に示す、抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体およびその機能的断片、遺伝子、薬剤デリバリー組成物、並びに、医薬組成物に関する。
（１）ヒトＲＯＲ１タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００５００３．２）のアミノ酸配列位置１５６〜３００をエピトープとして認識する抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体。
（２）前記抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体が、ヒト癌細胞のＲＯＲ１と特異的に結合し、エンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれる
上記（１）に記載の抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体。
（３）重鎖可変領域が、
ＳＹＧＩＳ（配列番号１８）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１Ｈ領域と、
ＥＩＳＰＲＳＧＹＴＹＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号１９）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２Ｈ領域と、
ＰＨＹＧＤＹＶＧＹ（配列番号２０）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３Ｈ領域と、
からなる領域を含み、
軽鎖可変領域が、
ＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨ（配列番号２３）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１Ｌ領域と、
ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号２４）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２Ｌ領域と、
ＳＱＳＴＨＶＰＦＴ（配列番号２５）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３Ｌ領域と、
からなる領域を含む、
上記（１）または（２）に記載の抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体。
（４）Ｈ鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１７であり、
Ｌ鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号２２である
上記（１）〜（３）の何れか一つに記載の抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体。
（５）上記（１）〜（４）の何れか一つに記載の抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体の機能的断片。
（６）上記（３）に記載のＣＤＲ配列、または、請求項４記載の可変領域をコードする遺伝子をオープンリーディングフレーム領域として有する遺伝子。
（７）上記（１）〜（４）の何れか一つに記載の抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体、または、上記（５）に記載の抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体の機能的断片を含む薬剤デリバリー組成物。
（８）上記（１）〜（４）の何れか一つに記載の抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体、または、上記（５）に記載の抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体の機能的断片と、
リンカーと、
薬剤と
を含み、
前記リンカーの一端は、前記抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体、または、前記機能的断片に結合し、前記リンカーの他端は前記薬剤に結合する、
医薬組成物。
本明細書で開示する抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体は、癌細胞のエンドサイトーシスの際に、癌細胞に特有のタンパク質であるＲＯＲ１と共に癌細胞内に取り込まれる。そのため、本明細書で開示する抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体は、癌細胞内への薬剤デリバリーや医薬組成物として使用できる。
図１は、ＲＯＲ１分子の構造及び取得モノクローナル抗体の認識ドメインを示す図、および、マウスとヒトのＲＯＲ１のホモロジーを示す図、である。 図２Ａは、取得モノクローナル抗体（２ＡＭシリーズ及び２ＡＣシリーズ）のＲＯＲ１発現細胞に対する抗ヒトＲＯＲ１抗体の反応性を示す図である。図２Ｂは、取得モノクローナル抗体（２ＡＡシリーズ、２ＣＣシリーズ及び１ＡＡシリーズ）のＲＯＲ１発現細胞に対する抗ヒトＲＯＲ１抗体の反応性を示す図である。 図３Ｃは、取得モノクローナル抗体（２ＤＣシリーズ及び一部の１ＢＡシリーズ）のＲＯＲ１発現細胞に対する抗ヒトＲＯＲ１抗体の反応性を示す図である。図３Ｄは、取得モノクローナル抗体（１ＢＡシリーズ）のＲＯＲ１発現細胞に対する抗ヒトＲＯＲ１抗体の反応性を示す図である。 図４Ｅは、取得モノクローナル抗体（６ＡＭシリーズ）のＲＯＲ１発現細胞に対する抗ヒトＲＯＲ１抗体の反応性を示す図である。図４Ｆは、取得モノクローナル抗体（７０ＡＦシリーズ）のＲＯＲ１発現細胞に対する抗ヒトＲＯＲ１抗体の反応性を示す図である。 図５Ａは、キメラ化抗体の由来クローン名と認識ドメインを示す図である。図５Ｂは、キメラ化抗体の構造と認識ドメインを示す図である。 図６は、キメラ化抗体のＲＯＲ１高発現細胞と低発現細胞に対する反応性を示す図である。 図７は、キメラ化抗体のＲＯＲ１高発現細胞と低発現細胞に対する取り込みを示す図である。 図８Ａは、キメラ化抗体と非開裂型ＭＭＡＦによるＰＣ−９の細胞増殖阻害を示す図である。図８Ｂは、キメラ化抗体Ｍ２と開裂型ＭＭＡＦによるＰＣ−９の細胞増殖阻害を示す図である。図８Ｃは、キメラ化抗体Ｍ２と開裂型ＭＭＡＦによるＡ４２７の細胞増殖阻害を示す図である。
以下に、抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体（以下、単に「抗体」と記載することがある。）およびその機能的断片、遺伝子、薬剤デリバリー組成物、並びに、医薬組成物について詳しく説明する。
本明細書で開示する抗体は、ヒトＲＯＲ１の細胞外領域の内、アミノ酸配列位置１５６〜３００をエピトープとして認識して特異的に結合する抗体を意味し、元の抗体と実質的に同じ抗原特異性を示す当該抗体の断片（本明細書において、「機能的断片」と記載することがある。）または誘導体をも含むものとする。抗体の機能的断片または誘導体には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域断片（ｄｓＦｖ）、もしくはＣＤＲを含むペプチドのような抗体の機能的断片、またはヒト化抗体（例えば、ＣＤＲ移植完全ヒト型抗体）のような誘導体などが含まれる。誘導体は、遺伝子組み換え技術を用いて、公知の方法で作製することができる。
ヒトＲＯＲ１のアミノ酸配列、遺伝子情報、および、ｃＤＮＡ配列は公知であり、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００５００３．２に記載のアミノ酸配列、ＧｅｎＢａｎｋ Ｇｅｎｅ ＩＤ：４９１９の遺伝子情報、および、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００５０１２．１に記載のｃＤＮＡから配列等の情報を入手することができる。ヒトＲＯＲ１のアミノ酸配列の全長は９３７であり、アミノ酸位置１〜４０３が細胞外領域である。
また、本明細書において、「ヒトＲＯＲ１タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００５００３．２）のアミノ酸配列位置１５６〜３００」と記載した場合、前記アミノ酸配列位置１５６〜３００に加え、その誘導体を含む。ここで、「誘導体」とは、アミノ酸配列位置１５６〜３００において１または複数個（例えば、数個（例、６個））のアミノ酸残基の変異、置換、欠失および／または付加を含み、実質的にヒトＲＯＲ１のアミノ酸配列位置１５６〜３００と同じ抗原性を有するペプチドまたはポリペプチドを意味するものとする。ここで、「実質的に」とは、アミノ酸配列位置１５６〜３００をエピトープとして作製した抗体が、ＲＯＲ１に特異的に結合し、エンドサイトーシスの際に、ＲＯＲ１と共に癌細胞内に取り込まれる機能を有することを意味する。
「エピトープ」とは、抗体によって認識される抗原（本明細書の場合、ヒトＲＯＲ１の細胞外領域の内、アミノ酸配列位置１５６〜３００）の一部をいい、本明細書において開示される抗体可変領域を含む領域が結合する抗原上の部位を意味する。例えば、ＲＯＲ１のようなポリペプチドを抗原とする場合には、抗体は直線的なアミノ酸配列を認識する場合も、３次元的な立体構造を認識する場合もあるから、エプトープは、アミノ酸配列や抗原の構造によって定義することができる。なお、ヒトＲＯＲ１のアミノ酸配列の細胞外領域は、Ｉｇ（アミノ酸位置：６６−１４８）、ＣＲＤ（ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｒｉｃｈ ｄｏｍａｉｎ、アミノ酸位置：１６６−３０７）、Ｋｒｉｎｇｌｅ（アミノ酸位置：３１１−３９３）と呼ばれる３つの領域を含んでいる（図１参照）。したがって、本明細書で開示する抗体は、実質的にＣＲＤをエピトープとして認識する抗体と言える。
本明細書で開示する抗体は、後述する実施例に示す通り、ヒト癌細胞のＲＯＲ１と特異的に結合し、エンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれる。そのため、癌細胞に障害を与える薬剤等のデリバリー用抗体として用いることができる。したがって、本明細書で開示する抗体を溶媒等に分散した組成物を薬剤デリバリー組成物として提供できる。
また、本明細書で開示する抗体にリンカーの一端を結合し、リンカーの他端に薬剤を結合することで、本明細書で開示する抗体を利用した医薬組成物を提供できる。リンカーは、開裂型リンカー、非開裂型リンカーの何れを用いても良い。また、薬剤は、癌細胞を死滅あるいは増殖を抑制する等の癌治療するための薬剤であって、リンカーに結合が可能なものであれば特に制限はない。なお、抗体にリンカーを結合する際には、抗体のＲＯＲ１への結合を阻害しないようにするため、Ｈ鎖可変領域およびＬ鎖可変領域以外の部位にリンカーを結合することが好ましい。
癌細胞としては、ＲＯＲ１が発現しているものであれば特に制限はなく、例えば、肺癌（肺腺癌、肺小細胞癌、肺扁平上皮癌、肺大細胞癌を含む）、膵癌、悪性中皮腫、乳癌、胃癌、大腸癌、口腔癌、食道癌、子宮癌、腎臓癌、膀胱癌、卵巣癌、精巣癌などの癌の細胞が挙げられるが、これらに制限されない。癌細胞の由来する生物種としては、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギなどが挙げられるが、これらに制限されない。
以下に実施例を掲げ、実施形態を具体的に説明するが、本明細書で開示する発明の範囲を限定、あるいは制限することを表すものではない。
（１）ヒトＲＯＲ１の各種発現コンストラクトの構築
ヒトＲＯＲ１全長のｃＤＮＡ配列（ＮＭ＿００５０１２．１）をｐＣＭＶ６−ＫＬ６−ＲＯＲ１（ＯｒｉＧｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤｓ）から切り出してｐＣＭＶｐｕｒｏに導入し、ｐＣＭＶｐｕｒｏ−ＲＯＲ１を作成した。さらに、ＣＭＶプロモータで制御されヒトＲＯＲ１全長（アミノ酸位置１〜９３７）、或いは、ヒトＲＯＲ１細胞外領域全長（アミノ酸位置１〜４０３）を、ＩＲＥＳ配列下流のｐｕｒｏｍｙｃｉｎ−ＥＧＦＰ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎと同時に発現する動物細胞を以下の方法により得た。
＜ヒトＲＯＲ１全長＞
ＮｏｔＩサイトを含む５’Ｐｒｉｍｅｒ（配列番号１：５’−ＡＡＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＣＡＴＧＣＡＣＣＧＧＣＣＧＣＧＣＣ−３’：アンダーラインは、ＮｏｔＩサイトを示す。以下の配列では説明は省略するが、アンダーライン部分は制限酵素で切断するサイトを示す。）とＸｈｏＩサイトを含む３’Ｐｒｉｍｅｒ（配列番号２：５’−ＧＣＧＧＣＴＣＧＡＧＣＡＧＴＴＣＴＧＣＡＧＡＡＡＴＣＡＴＡＧＡＴＴＣＧ−３’）を用いて増幅したＰＣＲ産物を、制限酵素ＮｏｔＩとＸｈｏＩ消化することで断片を得た。得られた断片を、ｐＱＣＸＩＰＧのＮｏｔＩ−ＸｈｏＩサイトへ導入し、発現ベクターｐＱＣＸＩＰＧ−ｆｕｌｌを構築した。
＜ヒトＲＯＲ１細胞外領域全長＞
ＮｏｔＩサイトを含む５’Ｐｒｉｍｅｒ（配列番号１）とＢａｍＨＩサイトを含む３’Ｐｒｉｍｅｒ（配列番号３：５’−ＣＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＴＣＣＡＴＴＴＴＡＴＴＣＴＴＣＴＣＣＴＴＧＧ−３’）を用いて得たＰＣＲ産物を、ＮｏｔＩとＢａｍＨＩで消化することで断片を得た。得られた断片を、ｐＱＣＸＩＰＧのＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩサイトへ導入し、発現ベクターｐＱＣＸＩＰＧ−ＥＣを構築した。
一方、ヒトＣＤＲ領域とＫｒｉｎｇｌｅ領域を含むヒトＲＯＲ１部分長（アミノ酸位置１５６〜４０３）、及び、ヒトＣＤＲ領域を含むヒトＲＯＲ１部分長（アミノ酸位置１５６〜３００）を動物細胞に発現させるためのベクターは、上記ｐＱＣＸＩＰＧのマルチクローニングサイトの上流にＣｈｉｃｋｅｎ ｅｇｇ ｗｈｉｔｅ Ｌｙｓｏｚｙｍｅの分泌シグナル配列（アミノ酸配列：ＭＲＳＬＬＩＬＶＬＣＦＬＰＬＡＡＬＧ｜ＡＡＡ（配列番号４６）、遺伝子配列：ＡＴＧＡＧＧＴＣＴＴＴＧＣＴＡＡＴＣＴＴＧＧＴＧＣＴＴＴＧＣＴＴＣＣＴＧＣＣＣＣＴＧＧＣＴＧＣＴＣＴＧＧＧＧ｜ＧＣＧＧＣＣＧＣＣ（配列番号４７））を付加し、導入遺伝子の翻訳産物を細胞外に強制分泌させることを可能にするベクター（ｌｙｓｓｉｇ−ｐＱＣＸＩＰＧ）を用いた。
＜ヒトＣＤＲ領域とＫｒｉｎｇｌｅ領域を含むヒトＲＯＲ１部分長＞
ＮｏｔＩサイトを含む５’Ｐｒｉｍｅｒ（配列番号４：５’−ＡＡＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＧＴＣＣＡＧＧＡＴＡＣＴＣＡＧＡＴＧＡ−３’）とＢａｍＨＩサイトを含む３’Ｐｒｉｍｅｒ（配列番号３）を用いて増幅したＰＣＲ産物を、制限酵素ＮｏｔＩとＢａｍＨＩで消化することで断片を得た。得られた断片を、ｌｙｓｓｉｇ−ｐＱＣＸＩＰＧのＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩサイトへ導入し、発現ベクターｐＱＣＸＩＰＧ−ＣＫを構築した。なお、ｐＱＣＸＩＰＧ及びｌｙｓｓｉｇ−ｐＱＣＸＩＰＧは、ＢＤ Ｒｅｔｒｏ−ＸＴＭ Ｑ ＶｅｃｔｏｒｓのｐＱＣＸＩＰをベースとして改変したベクターである。
＜ヒトＣＤＲ領域を含むヒトＲＯＲ１部分長＞
５’Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＡＡＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＧＴＣＣＡＧＧＡＴＡＣＴＣＡＧＡＴＧＡ−３’（配列番号４）とＢａｍＨＩサイトを含む３’Ｐｒｉｍｅｒ（配列番号５：５’−ＡＧＣＡＧＧＡＴＣＣＡＡＴＣＣＧＧＡＴＡＣＡＧＴＴＣＧＣＡ−３’）を用いて増幅したＰＣＲ産物を、制限酵素ＮｏｔＩとＢａｍＨＩで消化することで断片を得た。得られた断片を、ｌｙｓｓｉｇ−ｐＱＣＸＩＰＧのＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩサイトへ導入し、発現ベクターｐＱＣＸＩＰＧ−ＣＤＲを構築した。
（２）ヒトＲＯＲ１を発現する細胞株の樹立
抗原発現細胞株の樹立には、Ｐａｎｔｒｏｐｉｃ Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；Ｋ１０６３−１）を用いた。Ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｃｏａｔｅｄ １００ｍｍ ｄｉｓｈに８０〜９０％コンフルエント状態のＧＰ２−２９３（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；Ｋ１０６３−１）を準備し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を用いて上記構築した発現ベクター（ｐＱＣＸＩＰＧ−ｆｕｌｌ、ｐＱＣＸＩＰＧ−ＥＣ、ｐＱＣＸＩＰＧ−ＣＫ、ｐＱＣＸＩＰＧ−ＣＤＲ）とｐＶＳＶ−Ｇ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；Ｋ１０６３−１）各１１．２μｇずつをｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎした。４８時間後、ウイルス粒子を含む上清を回収し、超遠心（１８，０００ｒｐｍ，１．５ｈ，４℃）によりウイルスを沈殿させた。その沈殿物を、３０μＬのＴＮＥ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．８］，１３０ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ）で懸濁し、レトロウイルスベクター濃縮液を調製した。
レトロウイルスベクター濃縮液５μＬを、８μｇ／ｍｌのＨｅｘａｄｉｍｅｔｈｒｉｎｅ ｂｒｏｍｉｄｅ（ＳＩＧＭＡ；Ｈ−９２６８）を含んだ１５０μＬのＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ；Ｄ５７９６）−１０％ＦＢＳで希釈し、ウイルス粒子入りの培地を調製した。９６穴のマイクロプレートに約４０％コンフルエントの状態になるように準備した２９３Ｔの培地を、調製したウイルス粒子入りの培地と交換することにより、ｐＱＣＸＩＰＧ−ｆｕｌｌ、ｐＱＣＸＩＰＧ−ＥＣ、ｐＱＣＸＩＰＧ−ＣＫ、ｐＱＣＸＩＰＧ−ＣＤＲを遺伝子導入した。遺伝子導入後、５μｇ／ｍｌのＰｕｒｏｍｙｃｉｎ（ＳＩＧＭＡ；Ｐ−８８３３）を含むＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ；Ｄ５７９６）−１０％ＦＢＳで拡大培養し、抗原発現細胞株（ｈＲＯＲ１−ｆｕｌｌ／２９３Ｔ、ｈＲＯＲ１−ＥＣ／２９３Ｔ、ｈＲＯＲ１−ＣＫ／２９３Ｔ、ｈＲＯＲ１−ＣＤＲ／２９３Ｔ）を樹立した。
（３）免疫用抗原の調製
樹立した上記発現細胞株（ｈＲＯＲ１−ＥＣ／２９３Ｔ、ｈＲＯＲ１−ＣＫ／２９３Ｔ、ｈＲＯＲ１−ＣＤＲ／２９３Ｔ）をＤＭＥＭ−１０％ＦＢＳ（５μｇ／ｍｌ ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）もしくはＣＤ２９３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養した上清を約１Ｌ回収し、そこからｍｙｃ−ｔａｇ抗体を化学修飾した担体を充填したアフニティカラム、もしくは、ＴＡＬＯＮ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；Ｋ１２５３−１）を用いて、ｍｙｃ−Ｈｉｓ Ｔａｇ付きのリコンビナント蛋白質を精製後、ＰＢＳで透析し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットにて精製蛋白質を確認した。プロテインアッセイキットＩＩ（ＢｉｏＲａｄ；５００−０００２ＪＡ）を用いて蛋白質濃度を決定し、免疫原用抗原とした。
（４）免疫
ヒトＲＯＲ１細胞外領域精製蛋白質（ｈＲＯＲ１−ＥＣ）、ヒトＲＯＲ１のＣＤＲ−Ｋｒｉｎｇｌｅ領域を含む部分長（ｈＲＯＲ１−ＣＫ）、もしくは、ヒトＲＯＲ１のＣＤＲ領域を含む部分長（ｈＲＯＲ１−ＣＤＲ）の精製蛋白質を同量のコンプリートアジュバント（ＳＩＧＭＡ；Ｆ５８８１）と混合してエマルジョンにし、ＢＡＬＢ／ｃマウス（メス）に５〜５０μｇ／ｈｅａｄで３〜７日おきに数回免疫した。またヒトＲＯＲ１全長を発現させた細胞ｈＲＯＲ１−ｆｕｌｌ／２９３Ｔを免疫する場合は、１×１０５個／ｈｅａｄで３〜７日おきに数回免疫した。最終免疫の３〜５日後にマウスからリンパ球細胞を摘出し、マウス骨髄腫細胞Ｐ３Ｕ１（Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８Ｕ１）との細胞融合を行った。
（５）細胞融合、及びモノクローナル抗体産生細胞の選択と取得
細胞融合は次に示す一般的な方法を基本として行った。全ての培地中のＦｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）は、５６℃で３０ｍｉｎ保温する処理により、非働化したものを使用した。Ｐ３Ｕ１は、ＲＰＭＩ１６４０−１０％ＦＢＳ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ 含有）で培養して準備した。摘出したマウスのリンパ球細胞とＰ３Ｕ１を１０：１〜２：１の割合で混合し、遠心した。沈殿した細胞に５０％ポリエチレングリコール４０００（Ｍｅｒｃｋ；１．０９７２７．０１００）を融合促進剤として徐々に加えながら穏やかに混合し、細胞融合を行った。さらにＲＰＭＩ１６４０を徐々に加えながら穏やかに混合後、遠心した。沈殿した融合細胞を、１５％ＦＢＳを含むＨＡＴ培地（ＲＰＭＩ１６４０、ＨＡＴ−ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；１１０６７−０３０）、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ 含有）で適宜希釈し、２００μＬ／ｗｅｌｌで９６穴のマイクロプレートに播種した。
融合細胞をＣＯ２インキュベータ（５％ＣＯ２、３７℃）中で培養し、コロニーが十分に形成されたところで、培養上清をサンプリングしてスクリーニングを行った。スクリーニングは、免疫に使用したＲＯＲ１抗原を感作した９６穴プレートに対するＥＬＩＳＡで陽性となったものの中から、全長ＲＯＲ１を強制発現させた２９３Ｔ（ｈＲＯＲ１−ｆｕｌｌ／２９３Ｔ）に対するフローサイトメトリーで反応性が確認されたハイブリドーマを選別した。１５％ＦＢＳを含むＨＴ培地（ＲＰＭＩ１６４０、ＨＴ−ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；２１０６０−０１７）、ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ 含有）でこれらを拡大培養後、限界希釈（ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）法により単クローン化した。このようにして、抗体（細胞外領域全長蛋白質（アミノ酸位置１〜４０３）を免疫原として１９クローン（図１：２ＡＭ、２ＡＣ、２ＣＣ、２ＡＡ、２ＤＣシリーズ）、全長を発現する細胞（ｈＲＯＲ１−ｆｕｌｌ／２９３Ｔ）を免疫原として１３クローン（図１：１ＡＡ、１ＢＡシリーズ）、ＣＤＲ−Ｋｒｉｎｇｌｅ領域を含んだ部分長蛋白質（アミノ酸位置１５６〜４０３）を免疫原として５クローン（図１：６ＡＭシリーズ）、ＣＤＲ−領域を含んだ部分長蛋白質（アミノ酸位置１５６〜３００）を免疫原として７クローン（図１：７０ＡＦシリーズ））を産生するハイブリドーマクローンを４５種類得た（図１）。これら４５種類の抗体を、ＥＬＩＳＡ法により、ｈＲＯＲ１−ＥＣ、ｈＲＯＲ１−ＣＫ、ｈＲＯＲ１−ＣＤＲに対する反応性を確認し、それぞれの抗体がどの領域を認識しているかを解析し、エピトープグルーピングを行ったところ、Ｉｇ領域を認識する抗体が２３種、ＣＤＲ領域を認識する抗体が１７種、Ｋｒｉｎｇｌｅ領域を認識する抗体が４種であった（図１）。また、図１にマウスとヒトのアミノ酸配列のホモロジーについても記載する。領域により相同性に差はあるものの、マウスとヒトのＲＯＲ１の細胞外領域は非常に高い相同性を示す。
（６）抗体のヒトＲＯＲ１発現細胞に対する反応性（ＦＡＣＳ）
以上のように得られた抗体の、内因性ヒトＲＯＲ１への反応性を検証するため、ＲＯＲ１高発現細胞ＮＣＩ−Ｈ３５８（ＡＴＣＣ寄託番号：ＣＲＬ−５８０７）株に対する反応性を次のように確認した。各ハイブリドーマクローンの培養上清からＰｒｏｔｅｉｎ Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いた一般的なアフィニティー精製法により抗体をそれぞれ精製した。得られた精製抗体を同条件下（同数のＮＣＩ−Ｈ３５８（１×１０５個）、同濃度の各精製抗体、同濃度の２次（検出）抗体）におけるフローサイトメトリーの平均蛍光強度の解析を行った。また、抗体濃度依存的な平均蛍光強度もデータを取得し、低濃度での検出限界を解析することで、相対的な親和性を評価した。その結果をグラフ化したものを図２〜４に示す。グラフの横軸は使用した抗体濃度（ｎｇ／ｍＬ）、縦軸はフローサイトメトリーにおける平均蛍光強度（ＭＦＩ）である。図２Ａは、取得モノクローナル抗体（２ＡＭシリーズ及び２ＡＣシリーズ）のＲＯＲ１発現細胞に対する抗ヒトＲＯＲ１抗体の反応性を示す図である。図２Ｂは、取得モノクローナル抗体（２ＡＡシリーズ、２ＣＣシリーズ及び１ＡＡシリーズ）のＲＯＲ１発現細胞に対する抗ヒトＲＯＲ１抗体の反応性を示す図である。図３Ｃは、取得モノクローナル抗体（２ＤＣシリーズ及び一部の１ＢＡシリーズ）のＲＯＲ１発現細胞に対する抗ヒトＲＯＲ１抗体の反応性を示す図である。図３Ｄは、取得モノクローナル抗体（１ＢＡシリーズ）のＲＯＲ１発現細胞に対する抗ヒトＲＯＲ１抗体の反応性を示す図である。図４Ｅは、取得モノクローナル抗体（６ＡＭシリーズ）のＲＯＲ１発現細胞に対する抗ヒトＲＯＲ１抗体の反応性を示す図である。図４Ｆは、取得モノクローナル抗体（７０ＡＦシリーズ）のＲＯＲ１発現細胞に対する抗ヒトＲＯＲ１抗体の反応性を示す図である。なお、図３Ｃおよび図３Ｄでは、グラフの間隔の関係で、一部の取得モノクローナル抗体の番号が省略されている。図２〜４に示すように、親和性に差はあるものの、得られた全ての抗体が、ヒトＲＯＲ１に結合することを確認した。
（７）抗体のＶＨ及びＶＬ遺伝子の単離、並びにＣＤＲの同定
次に、図１に示す、Ｉｇ領域を認識する抗体を産生するハイブリドーマから２種、ＣＤＲ領域を認識する抗体を産生するハイブリドーマから１種、Ｋｒｉｎｇｌｅ領域を認識する抗体を産生するハイブリドーマから１種、を選択した。なお、選択したハイブリドーマは、各領域を認識する抗体の中で、ＲＯＲ１に対する親和性が比較的高いものである。次に、選択した抗体を産生するハイブリドーマを培養し、一般的な方法によりｔｏｔａｌ ＲＮＡを取得した。次に、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ（登録商標）キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた５’−ＲＡＣＥ法により、ｃＤＮＡを取得した。得られたｃＤＮＡを鋳型とし、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ ５’Ｐｒｉｍｅｒ（配列番号４８：５’−ＣＧＡＣＴＧＧＡＧＣＡＣＧＡＧＧＡＣＡＣＴＧＡ−３’）とＣＨ１（ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１ ｃｏｎｓｔａｎｔ領域１）３’Ｐｒｉｍｅｒ（配列番号４９：５’−ＡＡＴＴＴＴＣＴＴＧＴＣＣＡＣＣＴＧＧ−３’）を用いてＰｌｕｔｉｎｕｍ Ｔａｑ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でＰＣＲ（サイクル［９４℃ ３０秒、５７℃ ３０秒、７２℃ ５０秒］を３５サイクル）を実施した。これによってＶＨ遺伝子（ｃＤＮＡ）を単離した。一方、ＶＬ遺伝子も同様にＧｅｎｅＲａｃｅｒ ５’Ｐｒｉｍｅｒと、Ｃｋ（κｃｏｎｓｔａｎｔ領域）３’Ｐｒｉｍｅｒ（配列番号５０：５’−ＣＴＡＡＣＡＣＴＣＡＴＴＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴＣＴ−３’）を用いてＰＣＲを実施し、ＶＬ遺伝子（ｃＤＮＡ）を単離した。
ＶＨ遺伝子及びＶＬ遺伝子をそれぞれｐＴ７Ｂｌｕｅベクターにサブクローニングした後、オートシークエンサー（アプライドバイオシステム社製）又は蛍光式オートシークエンサーを用いて配列を解析した。その結果得られたＶＨの塩基配列及びＶＬの塩基配列がコードするアミノ酸、及び各ＣＤＲの配列を決定した。
以下、同定された各配列を記す。アミノ酸配列の詳細は表１、塩基配列の詳細は表２及び表３に示す。
＜２ＤＣ＿５−２：Ｉｇ領域を認識＞
（アミノ酸配列）
ＶＨ ＣＤＲ１：配列番号：８に示すアミノ酸配列
ＶＨ ＣＤＲ２：配列番号：９に示すアミノ酸配列
ＶＨ ＣＤＲ３：配列番号：１０に示すアミノ酸配列
ＶＬ ＣＤＲ１：配列番号：１３に示すアミノ酸配列
ＶＬ ＣＤＲ２：配列番号：１４に示すアミノ酸配列
ＶＬ ＣＤＲ３：配列番号：１５に示すアミノ酸配列
ＶＨ：配列番号：７に示すアミノ酸配列
ＶＬ：配列番号：１２に示すアミノ酸配列
（塩基配列）
ＶＨ：配列番号：６の塩基配列
ＶＬ：配列番号：１１の塩基配列
＜６ＡＭ＿６９−２：ＣＤＲ領域を認識＞
（アミノ酸配列）
ＶＨ ＣＤＲ１：配列番号：１８に示すアミノ酸配列
ＶＨ ＣＤＲ２：配列番号：１９に示すアミノ酸配列
ＶＨ ＣＤＲ３：配列番号：２０に示すアミノ酸配列
ＶＬ ＣＤＲ１：配列番号：２３に示すアミノ酸配列
ＶＬ ＣＤＲ２：配列番号：２４に示すアミノ酸配列
ＶＬ ＣＤＲ３：配列番号：２５に示すアミノ酸配列
ＶＨ：配列番号：１７に示すアミノ酸配列
ＶＬ：配列番号：２２に示すアミノ酸配列
（塩基配列）
ＶＨ：配列番号：１６の塩基配列
ＶＬ：配列番号：２１の塩基配列
＜６ＡＭ＿１２０−２：Ｋｒｉｎｇｌｅ領域を認識＞
（アミノ酸配列）
ＶＨ ＣＤＲ１：配列番号：２８に示すアミノ酸配列
ＶＨ ＣＤＲ２：配列番号：２９に示すアミノ酸配列
ＶＨ ＣＤＲ３：配列番号：３０に示すアミノ酸配列
ＶＬ ＣＤＲ１：配列番号：３３に示すアミノ酸配列
ＶＬ ＣＤＲ２：配列番号：３４に示すアミノ酸配列
ＶＬ ＣＤＲ３：配列番号：３５に示すアミノ酸配列
ＶＨ：配列番号：２７に示すアミノ酸配列
ＶＬ：配列番号：３２に示すアミノ酸配列
（塩基配列）
ＶＨ：配列番号：２６の塩基配列
ＶＬ：配列番号：３１の塩基配列
＜２ＡＭ＿１Ｍ１７：Ｉｇ領域を認識＞
（アミノ酸配列）
ＶＨ ＣＤＲ１：配列番号：３８に示すアミノ酸配列
ＶＨ ＣＤＲ２：配列番号：３９に示すアミノ酸配列
ＶＨ ＣＤＲ３：配列番号：４０に示すアミノ酸配列
ＶＬ ＣＤＲ１：配列番号：４３に示すアミノ酸配列
ＶＬ ＣＤＲ２：配列番号：４４に示すアミノ酸配列
ＶＬ ＣＤＲ３：配列番号：４５に示すアミノ酸配列
ＶＨ：配列番号：３７に示すアミノ酸配列
ＶＬ：配列番号：４２に示すアミノ酸配列
（塩基配列）
ＶＨ：配列番号：３６の塩基配列
ＶＬ：配列番号：４１の塩基配列
Figure 2020026987
Figure 2020026987
Figure 2020026987
（８）キメラ化抗体の作製
同定した遺伝子配列をもとに、ＶＨ領域、ＶＬ領域をＰＣＲで増幅し、ＰＣＲ産物を常法によりヒトＩｇＧ１の定常領域を組み込んだ抗体産生用ベクターに導入した。制限酵素ＳｃａＩで消化したこれらの発現ベクター０．４μｇ／μｌを１００μｌと１Ｘ１０７個のＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣）をキュベット内で混和し、エレクトロポレーション法により形質転換を行なった。１０％ ＦＢＳを含むＨａｍ Ｆ−１２培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；１１７６５０５４）に懸濁し、９６穴のマイクロプレートに１００μｌずつ分注し、終濃度２０μｇ／ｍｌとなるようにｐｕｒｏｍｙｃｉｎを添加して、３７℃で１２日間培養した。単一コロニーを形成しているｗｅｌｌから上清を分取し、抗ヒトＩｇＧ抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法による活性が高いものを選別し、１０ｃｍ ｄｉｓｈへと拡大培養した後、４ｍＭ Ｌ−Ａｌａｎｙｌ−Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（ｗａｋｏ；０１６−２１８４１）を添加したＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標） ＣＤ−ＣＨＯ Ｆｕｓｉｏｎ培地（ＳＡＦＣ；１４３６５Ｃ）に馴化し、キメラ抗体産生細胞株を樹立した。得られた細胞株を、４ｍＭ Ｌ−Ａｌａｎｙｌ−Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅを添加したＥＸ−ＣＥＬＬ ＣＤ−ＣＨＯ Ｆｕｓｉｏｎ培地を用いて、３７℃、５％ ＣＯ２で１０日間大量培養し、その培養上清からＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ を用いてキメラ化抗体の精製抗体を得た。図５Ａに示すように、クローン２ＤＣ＿５−２、６ＡＭ＿６９−２、６ＡＭ＿１２０−２、および２ＡＭ＿１Ｍ１７から得られたキメラ化抗体について、以下それぞれＭ１、Ｍ２、Ｍ３、およびＭ４と呼称する。また、図５Ｂに、作製したキメラ化抗体の構造と認識ドメインを示す。
（９）キメラ抗体のヒトＲＯＲ１発現細胞に対する反応性の評価
以上のように得られた抗体の、内因性ヒトＲＯＲ１への反応性を検証するため、ＲＯＲ１高発現細胞株（ＮＣＩ−Ｈ１９７５、ＰＣ−９）およびＲＯＲ１低発現細胞株（Ａ４２７、ＮＣＩ−Ｈ４６０）に対する反応性を次のように確認した。なお、ＮＣＩ−Ｈ１９７５（ＡＴＣＣ寄託番号：ＣＲＬ−５９０８）、Ａ４２７（ＡＴＣＣ寄託番号：ＨＴＢ−５３）、および、ＮＣＩ−Ｈ４６０（ＡＴＣＣ寄託番号：ＨＴＢ−１７７）は、アメリカ培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から購入した。ＰＣ−９細胞株（ＲＣＢ４４５５）は、ＲＩＫＥＮのＣｅｌｌ Ｂａｎｋより入手した。各種細胞株を、２ｘ１０５個／ｗｅｌｌ となるように６ ｗｅｌｌ ｄｉｓｈに撒き、３７℃で２４時間培養し、ＰＢＳ洗浄後に回収し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ４８８ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ａ２０１８１）を用いて標識したキメラ化抗体を１μｇ／ｍｌに希釈し、氷上で１時間反応させた後、ＰＢＳにより洗浄し、反応強度をフローサイトメトリーにより解析した。対照として、哺乳類細胞に存在しない抗原に対するアイソタイプコントロールＩｇＧ１を用いた。図６は、ＲＯＲ１高発現細胞株および低発現細胞株に対する、キメラ化抗体の反応性を示すグラフである。図６に示すように、ＲＯＲ１高発現細胞株において、キメラ抗体Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、およびＭ４で反応が確認され、ＲＯＲ１低発現細胞株においては、非常に弱い反応であった。以上の結果より、キメラ抗体Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、およびＭ４は、何れも、内因性のヒトＲＯＲ１に対して反応性を示すことが明らかとなった。
（１０）キメラ抗体の細胞内取り込み評価
次に、ヒトＲＯＲ１と反応したキメラ抗体の細胞内への取り込み活性を調べるために、ｐＨｒｏｄｏ（登録商標） Ｒｅｄ Ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｐ３５３６３）を用いてキメラ抗体Ｍ１からＭ４を酸性ｐＨ感受性色素で認識した。ＲＯＲ１高発現細胞株ＰＣ−９およびＲＯＲ１低発現細胞株Ａ４２７について、１ｘ１０５個／ｗｅｌｌの細胞をカバーガラスを入れた６ ｗｅｌｌ ｄｉｓｈに撒き、５μｇ／ｍｌのｐＨｒｏｄｏ標識キメラ抗体を曝露し、３７℃で７２時間反応させ、ＰＢＳ洗浄後に回収し、フローサイトメトリーにて、蛍光強度を測定した。図７は、ＲＯＲ１高発現細胞と低発現細胞に対するキメラ化抗体の取り込みを示す図である。図７に示すように、ＲＯＲ１高発現細胞株において、キメラ抗体による取り込み活性が確認されたが、その中でもキメラ抗体Ｍ２を用いた際に、とくに強い取り込みが観察された。
（１１）キメラ抗体と細胞傷害性薬物が結合された二次抗体を用いた細胞増殖抑制効果の評価
（ａ）キメラ抗体の細胞内への取り込み活性を利用した細胞増殖抑制効果を調べるため、細胞傷害性薬物であるモノメチルオリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）が非開裂型リンカーによって結合された二次抗体を用いて、キメラ抗体との共処理による細胞増殖に対する抑制効果を評価した。ＰＣ−９肺腺癌細胞株１ｘ１０３個／ｗｅｌｌを９６ ｗｅｌｌ ｄｉｓｈに撒き、翌日に０．１μｇ／ｍｌまたは１．０μｇ／ｍｌのキメラ抗体Ｍ１からＭ４と、ＭＭＡＦが非開裂型リンカーで結合された二次抗体αＨＦｃ−ＮＣ−ＭＭＡＦ（Ｍｏｒａｄｅｃ社；ＡＨ−１０１ＡＦ）を添加して３７℃にて培養した。抗体添加処理開始から５日後に、ＭＴＴ ａｓｓａｙ法を用いて細胞増殖への影響について検討を加えた。図８Ａは、キメラ化抗体と非開裂型ＭＭＡＦによるＰＣ−９の細胞増殖阻害を示す図である。図８Ａに示すように、Ｉｇ領域を認識するキメラ抗体Ｍ１およびＭ４は、抗体濃度を濃くした場合に、細胞増殖が阻害されたが、ＣＤＲ領域を認識するキメラ抗体Ｍ２は、Ｍ１およびＭ４と比較して、より強く細胞増殖を阻害することが明らかとなった。また、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ４とも、抗体濃度依存的に細胞増殖が阻害されることが明らかとなった。一方、Ｋｒｉｎｇｌｅ領域を認識するキメラ抗体Ｍ３は、細胞増殖を全く阻害しなかった。
（ｂ）次に、上記（ａ）で細胞増殖を最も強く阻害したキメラ抗体Ｍ２の細胞増殖抑制効果をさらに調べるため、細胞傷害性薬物ＭＭＡＦが二次抗体に開裂型リンカーによって結合したαＨＦｃ−ＣＬ−ＭＭＡＦ（Ｍｏｒａｄｅｃ社；ＡＨ−１０２ＡＦ）を用い、キメラ抗体Ｍ２とＭＭＡＦ結合二次抗体で共処理を行い、その細胞増殖に対する影響を評価した。ＲＯＲ１高発現細胞株ＰＣ−９細胞株およびＲＯＲ１低発現細胞株Ａ４２７細胞株１ｘ１０３個／ｗｅｌｌを９６ ｗｅｌｌ ｄｉｓｈに撒き、翌日に０．１μｇ／ｍｌまたは１．０μｇ／ｍｌのキメラ抗体Ｍ２とαＨＦｃ−ＣＬ−ＭＭＡＦを共に添加し、５日間３７℃にて培養した後にＭＴＴ ａｓｓａｙ法により細胞増殖に対する抑制活性を測定した。図８Ｂは、キメラ化抗体Ｍ２と開裂型ＭＭＡＦによるＰＣ−９の細胞増殖阻害を示す図である。図８Ｃは、キメラ化抗体Ｍ２と開裂型ＭＭＡＦによるＡ４２７の細胞増殖阻害を示す図である。
図８Ｂに示すように、ＰＣ−９細胞株においては、キメラ抗体Ｍ２とＭＭＡＦ結合二次抗体を共処理した場合は細胞増殖が顕著に抑制されたが、コントロール（ＩｇＧ、Ｍ２のみ、ＩｇＧ−ＭＭＡＦ）では、細胞増殖の抑制は見られなかった。また、開裂型リンカーの方が、非開裂型リンカーより、細胞増殖を抑制できることが明らかとなった。一方、ＲＯＲ１低発現細胞株であるＡ４２７では、図８Ｃに示すように、キメラ抗体Ｍ２とＭＭＡＦ結合二次抗体を共処理した場合でも、細胞増殖の抑制は全く見られなかった。
以上の結果から、
（１）ヒトＲＯＲ１の細胞外領域を認識する抗体であれば、ヒトＲＯＲ１と特異的に結合すること、
（２）しかしながら、アミノ酸配列位置１５６〜３００をエピトープとして認識する抗体は、他の領域をエピトープとして認識する抗体と比較して、癌細胞内への取り込みが顕著であること、
（３）そのため、アミノ酸配列位置１５６〜３００をエピトープとして認識する抗体は、癌細胞内への薬剤デリバリー用の抗体、および、薬剤を結合することで医薬組成物として使用できること、
が明らかとなった。
アミノ酸配列位置１５６〜３００をエピトープとして認識する抗体は、細胞内に取り込まれることから、薬剤デリバリー抗体あるいは医薬組成物として使用できる。したがって、製薬産業に有用である。

Claims (8)

  1. ヒトＲＯＲ１タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００５００３．２）のアミノ酸配列位置１５６〜３００をエピトープとして認識する抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体。
  2. 前記抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体が、ヒト癌細胞のＲＯＲ１と特異的に結合し、エンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれる
    請求項１に記載の抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体。
  3. 重鎖可変領域が、
    ＳＹＧＩＳ（配列番号１８）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１Ｈ領域と、
    ＥＩＳＰＲＳＧＹＴＹＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号１９）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２Ｈ領域と、
    ＰＨＹＧＤＹＶＧＹ（配列番号２０）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３Ｈ領域と、
    からなる領域を含み、
    軽鎖可変領域が、
    ＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨ（配列番号２３）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１Ｌ領域と、
    ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号２４）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２Ｌ領域と、
    ＳＱＳＴＨＶＰＦＴ（配列番号２５）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３Ｌ領域と、
    からなる領域を含む、
    請求項１または２に記載の抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体。
  4. Ｈ鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１７であり、
    Ｌ鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号２２である
    請求項１〜３の何れか一項に記載の抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体。
  5. 請求項１〜４の何れか一項に記載の抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体の機能的断片。
  6. 請求項３記載のＣＤＲ配列、または、請求項４記載の可変領域をコードする遺伝子をオープンリーディングフレーム領域として有する遺伝子。
  7. 請求項１〜４の何れか一項に記載の抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体、または、請求項５に記載の抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体の機能的断片を含む薬剤デリバリー組成物。
  8. 請求項１〜４の何れか一項に記載の抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体、または、請求項５に記載の抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体の機能的断片と、
    リンカーと、
    薬剤と
    を含み、
    前記リンカーの一端は、前記抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体、または、前記機能的断片に結合し、前記リンカーの他端は前記薬剤に結合する、
    医薬組成物。
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