CN107353341A

CN107353341A - 一种抗clu抗体及应用、制备方法和试剂盒

Info

Publication number: CN107353341A
Application number: CN201710721170.2A
Authority: CN
Inventors: 姚承志
Original assignee: United Yikang (beijing) Biological Science And Technology Co Ltd
Current assignee: United Yikang (beijing) Biological Science And Technology Co Ltd
Priority date: 2017-08-17
Filing date: 2017-08-17
Publication date: 2017-11-17
Anticipated expiration: 2037-08-17
Also published as: CN107353341B

Abstract

本发明公开一种抗CLU抗体及应用、制备方法和试剂盒，涉及生物检测和治疗技术领域。本发明提供的抗CLU抗体，其含有重链可变区和轻链可变区，其中，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。该抗CLU抗体可以特异性识别结合CLU重组蛋白、以及表达CLU分子的炎症组织细胞或肿瘤组织细胞，具有较高的特异性以及亲和力，可用于通过免疫印迹(Western Blot)、酶联免疫吸附(ELISA)、免疫组织化学(IHC)以及流式细胞术(FACS)等手段检测样品中的CLU蛋白，也可以用于CLU蛋白在肿瘤和炎症组织或细胞中的定性、定量和定位检测。

Description

一种抗CLU抗体及应用、制备方法和试剂盒

技术领域

本发明涉及生物检测和治疗技术领域，具体而言，涉及一种抗CLU抗体及应用、制备方法和试剂盒。

背景技术

簇集蛋白(Clusterin，CLU)是近年新发现的一种凋亡相关蛋白，分子量为50KD的糖蛋白，广泛存在于人类及动物的许多组织中，在多种病理、生理过程(包括组织重构、再生、脂质转运、补体调节和凋亡等)中发挥重要作用。CLU在正常的成熟组织中低表达，而选择性地在某些恶性肿瘤中高表达。CLU有2种主要亚型：分泌型CLU和核型CLU，功能分别为促凋亡和促生存。

在恶性肿瘤中，以CLU为靶点的研究已逐步展开。研究结果表明(臧家兰.Clusterin在乳腺浸润性导管癌中的表达与临床特征关系的研究.中国肿瘤临床，2007,34(15)：880-882)，CLU在正常乳腺组织中不表达，在乳腺浸润性导管癌中的表达上调，且与淋巴结转移情况正相关，与ER、PR负相关、与肿瘤的临床分期和分化程度正相关(TrougakosIP.Silencing expression of the clusterin/apolipoprotein j gene in humancancer cells using small interfering RNA induces spontaneous apoptosis,reduced growth ability,and cell sensitization to genotoxic and oxidativestress.Cancer Research.2004,64(5):1834-1842)。针对Clusterin反义寡核苷酸治疗可以提高乳腺癌细胞对部分化疗药物的治疗敏感性(迟绍云.脂质体介导Clusterin反义寡核苷酸抑制胰腺癌细胞侵袭力及增强5-FU化疗敏感性的实验研究.临床与实验病理学杂志.2012,28(2):173-176)，从而有望成为乳腺癌治疗的新靶点。而Clusterin和Herceptin的联合靶向治疗(Antisense clusterin oligodeoxynucleotides increase the responseof HER-2 gene amplified breast cancer cells to Trastuzumab.Journal ofCellular Physiology.2005,204(2):463–469)，有望成为乳腺癌治疗的方法。

另外，clusterin在膀胱癌(SR Sylvester.Localization of sulfatedglycoprotein-2(clusterin)on spermatozoa and in the reproductive tract of themale rat.Biology of Reproduction,1991,45(1):195)、非小细胞肺癌(左志通.簇集蛋白在非小细胞肺癌中的表达.江苏医药.2012,38(18):2146-2148)、宫颈癌(伊丽莎.Clusterin和Ki67在宫颈癌的表达及其临床意义.中山大学,2008)中均有表达，对其在肿瘤中的表达特性的研究，有助于为诊断、治疗及预后判断提供理论依据和应用前景。

在心脑血管疾病中，Clusterin具有多种生物学活性，包括保护细胞，调节补体系统，正常情况下表达量低，病理情况下表达量升高(J Sabatte.Semen clusterin is anovel DC-SIGN ligand.Journal of Immunology,2011,187(10):5299-309；AZoubeidi.Small heat shock proteins in cancer therapy andprognosis.International Journal of Biochemistry&Cell Biology.2012,44(10):1646)。研究表明CLU在脑梗死(徐艳.簇集蛋白在急性脑梗死中的表达及其临床意义.重庆医学.2016,45(21):2942-2945)，脑出血等多种神经系统疾病中呈现高表达，且证实在以上神经系统疾病中，主要发挥神经元保护作用。

基因在加工过程中会因降解掉而难以检测，而核酸检测方法必须经过专门的核酸提取和纯化过程，增加了额外的工作量。基于蛋白的免疫学分析方法，采用高度特异性的抗原抗体反应，实现样本快速、准确、高效的检测，其技术关键是制备具有高度特异性的抗体

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗CLU抗体，其可特异性结合CLU蛋白，具有较高的特异性，可用于通过免疫印迹(Western Blot)、酶联免疫吸附(ELISA)、免疫组织化学(IHC)以及流式细胞术(FACS)等手段检测样品中的CLU蛋白，也可以用于CLU蛋白在肿瘤和炎症组织或细胞中的定性、定量和定位检测。

本发明的另一目的在于提供一种抗CLU的抗体片段，其具有与上述抗CLU抗体等同的效果，可特异性结合CLU蛋白，具有较高的特异性。

本发明的另一目的在于提供上述抗CLU抗体以及抗CLU的抗体片段的在检测和治疗中的应用。

本发明的另一目的在于提供上述抗CLU抗体的制备方法，所制得的抗CLU抗体效价高，特异性好。

本发明的另一目的在于提供一种检测CLU蛋白的试剂盒。

本发明是这样实现的：

一种抗CLU抗体，其含有重链可变区和轻链可变区，其中，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

一种抗CLU的抗体片段，所述抗体片段是由上述的抗CLU抗体的抗体片段形成的Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、双抗体、线性抗体、单链抗体分子或多特异性抗体。

上述的抗CLU抗体或上述的抗CLU的抗体片段在检测生物样品中CLU蛋白中的应用。

上述的抗CLU抗体的制备方法，其包括：用氨基酸序列如SEQ ID NO.2中的第23-449位所示的抗原肽免疫动物。

一种检测CLU蛋白的试剂盒，其含有上述的抗CLU抗体或上述的抗CLU的抗体片段。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供的抗CLU抗体，其含有重链可变区和轻链可变区，其中，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。该抗CLU抗体可以特异性识别结合CLU重组蛋白、以及表达CLU分子的炎症组织细胞或肿瘤组织细胞，具有较高的特异性以及亲和力，可用于通过免疫印迹(Western Blot)、酶联免疫吸附(ELISA)、免疫组织化学(IHC)以及流式细胞术(FACS)等手段检测样品中的CLU蛋白，也可以用于CLU蛋白在肿瘤和炎症组织或细胞中的定性、定量和定位检测。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例1提供的CLU重组蛋白纯化结果；

图2为本发明实施例5提供的鼠单克隆抗体14B7对重组CLU蛋白的免疫印迹检测结果；

图3为本发明实施例6提供的鼠单克隆抗体14B7对A549(人肺癌细胞)细胞的免疫印迹检测结果。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明实施例的一种抗CLU抗体及应用、制备方法和试剂盒进行具体说明。

本发明应用生物信息学分析，来自于UniProt中P10909的蛋白序列，基因合成CLU蛋白的23位到449位氨基酸对应的核苷酸，优化为大肠杆菌表达密码子，克隆至表达载体质粒pET30a(Novagen公司)中，进行低温可溶表达，超声破碎后，Ni2+亲和纯化作为免疫原，免疫Balb/c小鼠。经细胞融合、重组CLU的ELISA筛选，并测定亚类为IgG2a型单克隆抗体，阳性克隆细胞注射小鼠腹腔诱导产生腹水，经过protein A/G亲和纯化，获得高效分泌单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞系，免疫印记(Western Blot)实验显示该抗体能特异识别重组的CLU蛋白以及表达CLU分子的肿瘤细胞系。

基于上述结果，一方面，本发明提供了抗CLU抗体，其含有重链可变区和轻链可变区，其中，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述抗CLU抗体由小鼠杂交瘤细胞系14B7分泌得到。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述小鼠杂交瘤细胞系14B7由抗原肽免疫小鼠得到的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合得到，所述抗原肽的氨基酸序列如SEQ IDNO.2中的第23-449位所示。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述抗CLU抗体为小鼠IgG2a亚型单克隆抗体。

本发明提供的抗CLU抗体可以特异性识别结合CLU重组蛋白、以及表达CLU分子的炎症组织细胞或肿瘤组织细胞，具有较高的特异性以及亲和力，可用于通过免疫印迹(Western Blot)、酶联免疫吸附(ELISA)、免疫组织化学(IHC)以及流式细胞术(FACS)等手段检测样品中的CLU蛋白，也可以用于CLU蛋白在肿瘤和炎症组织或细胞中的定性、定量和定位检测。

另一方面，本发明提供了一种抗CLU的抗体片段，所述抗体片段是由上述的抗CLU抗体的抗体片段形成的Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、双抗体、线性抗体、单链抗体分子或多特异性抗体。

另一方面，本发明提供了上述抗CLU抗体或上述的抗CLU的抗体片段在检测生物样品中CLU蛋白中的应用。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述生物样品为肿瘤组织或细胞；或者，所述生物样品为炎症组织或细胞。

另一方面，本发明提供了上述抗CLU抗体的制备方法，其包括：用氨基酸序列如SEQID NO.2中的第23-449位所示的抗原肽免疫动物。

本发明通过生物信息学分析显示CLU的23-449位抗原性好，含有B细胞表位，以CLU的29-290区为重组蛋白(抗原肽)免疫小鼠，制备鼠单克隆抗CLU抗体，得到的抗CLU抗体可以识别CLU且具有较强的特异性。

当然，需要说明的是，也可以选用其他动物例如兔、大鼠、猪等哺乳动物进行免疫制备抗体。

进一步地，本发明的一些实施方案中，在免疫前，该制备方法还包括：将含有可编码上述抗原的经过密码子优化的核苷酸序列的表达载体转化大肠杆菌，经表达纯化得到重组蛋白，将该重组蛋白作为抗原肽(或称免疫原)免疫动物。

其中，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码得到的蛋白包括有CLU分子的第23-449位片段蛋白，该核苷酸序列易于大肠杆菌可溶表达。

进一步地，本发明的一些实施方案中，在免疫后，该制备方法还包括：取免疫后的动物例如小鼠的脾脏细胞，将其与小鼠骨髓瘤细胞融合，获得可分泌抗CLU抗体的小鼠杂交瘤细胞系14B7，培养该杂交瘤细胞系14B7，获得抗CLU抗体。

另一方面，本发明提供了一种检测CLU蛋白的试剂盒，其含有上述的抗CLU抗体或上述的抗CLU的抗体片段。

本发明提供的试剂盒可通过免疫印迹(Western Blot)、酶联免疫吸附(ELISA)、免疫组织化学(IHC)以及流式细胞术(FACS)检测样品中CLU蛋白情况，具有较好的特异性。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

CLU重组蛋白表达质粒的构建

CLU单克隆按照编码的P10909的蛋白序列，基因合成的方式合成CLUD蛋白(SEQ IDNO.2)第23位到449位氨基酸序列对应的DNA序列，优化为大肠杆菌表达密码子(SEQ IDNO.1)，引入酶切位点EcoR I和Xho I，克隆到表达载体pET30a(Novagen公司)上，进行测序分析，选取测序正确的克隆进行蛋白表达纯化。

实施例2

CLU重组蛋白表达和纯化

将含有CLU正确序列的质粒的大肠杆菌培养至OD₆₀₀为0.5，加入10μmol/L的IPTG，16℃过夜培养，收菌后超声破碎，进行Ni2⁺亲和纯化。并进行12％SDS-PAGE检测，考马斯亮蓝染色，结果如图1所示，重组CLU蛋白分子量约为50kDa，

图1结果(图中：marker为分子量标记)显示在55KD的偏下的位置有条带，说明本实施例得到CLU重组蛋白表达正确。

实施例3

1.动物免疫

取7周龄雌性Balb/c小鼠用实施例2中纯化的重组蛋白进行腹部皮下多位点免疫注射。初次免疫，使用弗氏完全佐剂，免疫剂量为100μg/只。每3周加强免疫一次，连续加强3次，使用弗氏不完全佐剂，免疫剂量为100μg/只。第四次免疫日开始眼眶采血，每周一次，连续采血4次，分离血清，采用间接ELISA法进行血清效价检测。选取效价最高的小鼠进行肌肉注射冲击免疫，剂量为100μg/只。

2.细胞融合

在无菌条件下，取冲击免疫3天以后的小鼠脾脏，于平皿中用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数，细胞数为1×10⁸，同时制备腹腔悬液(巨噬细胞)作为饲养细胞备用。将以上脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0(购自ATCC)以10:1比例混合，离心1500rpm，5min，弃上清。在60s加入1ml的PEG1500(Sigma公司)，37℃静置60s后，加入10ml的DMEM(Hyclone公司)，离心1000rpm，5min，弃上清。加入10ml血清(Gibco公司)、5ml混合10×HAT(Gibco公司)的胸腺细胞和含有羧甲基纤维素(终浓度1.3％)的半固体培养基充分混匀，然后均匀的倒入细胞培养皿中。将细胞培养皿放入到湿盒中，放入37℃5％CO₂培养箱中培养。

3.单克隆细胞株鉴定

3.1ELISA筛选

融合后10天克隆细胞团清晰可见，将克隆团置于事先准备好含有15％血清培养基的96孔培养板中，于37℃、5％CO₂培养箱中培养。3天后换液。2天后，取100μl上清，使用重组蛋白进行间接ELISA检测抗原和抗体特异性反应能力，并将阳性克隆转入24孔板培养。3天后再次进行间接ELISA检测，然后转入6孔板进行扩大培养。

3.2亚类鉴定

根据亚类测定试剂(sigma公司)对间接ELISA筛选出的阳性鼠单克隆细胞株进行亚类测定。结果显示，本发明的单克隆抗体为IgG2a型鼠单克隆抗体，编号14B7，命名为小鼠杂交瘤细胞系14B7。使用冻存液(10％DMSO、20％血清、70％DMEM)进行冻存。

4单克隆抗体的获得

4.1细胞复苏和扩大培养

从液氮中取出14B7细胞冻存管，于37℃快速融解，1000rpm，5min离心去除冻存液，于37℃、5％CO₂培养至对数生长期，期间注意观察细胞状态。

4.2腹水制备

小鼠腹腔诱生腹水法：注射降植烷致敏小鼠，使用0.01M PBS洗涤并悬起对数生长期细胞，计数1×10⁶个细胞/ml，注射入腹腔。观察小鼠状态，8天后收集腹水。脊椎脱臼法处死腹部隆起的小鼠，用75％酒精浸泡消毒，用手术剪刀剪开腹部上皮，剪开腹膜，将注射器插入吸取腹水，3000rpm，10min离心，于-20℃保存。

4.3单克隆抗体的纯化

用Protein A/G(GE公司)亲和层析法按说明书从腹水中纯化抗体，得到鼠单克隆抗体14B7即抗CLU抗体。SDS-PAGE胶考马斯亮蓝染色鉴定纯度，BCA法测定浓度。

实施例4

单克隆抗体可变区序列测定

1.总RNA的获取

从液氮中取出14B7杂交瘤细胞细胞冻存管，于37℃快速融解，1000rpm，5min离心去除冻存液，置于100mm孔板，培养至占培养板约80％，加入1ml Trizol试剂(Thermo公司)，并依据说明书提取杂交瘤细胞总RNA。

2.cDNA第一链的获取

取2.5μg上述总RNA，加入DECP水，使体积达到11μl，加入1.0μL oligo(dT)(10μM)，加入1μL dNTPs(10mM)，混合均匀，65℃孵育5分钟后置冰上1分钟，然后加入4μL RT buffer(5×)，1.0μL DTT(100m M)，1μL Ribonuclease Inhibitor及1μL逆转录酶(takara公司)，50℃反应10min。80℃孵育10分钟以终止反应，获得的cDNA保存在-20℃。

3基因扩增

取上述2μLcDNA进行PCR扩增，5μL 10×PCR缓冲液，1μL dNTPs(10mM)，2μL MgSO4(50mM)，1μL上游引物，1μL下游引物，0.2μL Taq DNA聚合酶，DECP水定容至50μL。PCR扩增程序为94℃，5min；30个循环(94℃，30s；55℃，40s；68℃，40s)；72℃，10min。扩增出的片段进行测序。

其中，物序列的设计按照文献(Bodo Brocks.Species-Crossreactive scFvAgainst the Tumor Stroma Marker“Fibroblast Activation Protein”Selected byPhage Display From an Immunized FAP-/-Knock-Out Mouse)进行。用于扩增重链可变区的引物如表1所示，其中MHV.B1直至MHV.B12的12条引物为上游引物，可分别与重链下游引物MHC.F组合用于扩增重链可变区基因。用于扩增轻链可变区的引物如表1下，其中MKV.B1直至MKV.B10的10条引物为上游引物，可分别与轻链下游引物组合用于扩增Kappa轻链的可变区基因。

表1引物序列

测序结果显示，鼠杂交瘤细胞株14B7分泌的单克隆抗体14B7的重链和轻链可变区的DNA序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，其对应的重链和轻链的可变区氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

实施例5

鼠单克隆抗体14B7对重组CLU蛋白特异性反应

选择CLU重组蛋白，用免疫印迹法检测本发明实施例3的单克隆抗体的识别特异性，蛋白上样5ng，进行10％聚丙烯酰胺凝胶电泳，使用电转移系统(湿转，Tanon公司)将凝胶蛋白带转移到0.45μm的PVDF膜上(Millipore公司)。将膜置于封闭液(含1％BSA的TBS-T)中4℃过夜。加入单克隆抗体14B7，室温孵育1h。用TBS-T洗膜后，加入1：10000稀释的羊抗鼠二抗(HRP标记，北京全式金生物技术有限公司)，室温孵育0.5h。TBS-T洗膜，加入ECL显色液(Thermo公司)，Western Blot凝胶成像分析系统(Tanon公司)采集图像数据。

结果如图2所示(图中：marker为分子量标记，14B7代表鼠单克隆抗体14B7)，鼠单克隆抗体14B7可特异性识别重组CLU蛋白，分子量大小约为54kD的条带，具有很高的特异性。

实施例6

鼠单克隆抗体14B7对表达CLU蛋白的A549细胞系特异性反应

选择A549细胞系，用免疫印迹法检测本发明的鼠单克隆抗体的识别特异性。蛋白上样100μg，进行12％聚丙烯酰胺凝胶电泳，使用电转移系统(湿转，Tanon公司)将凝胶蛋白带转移到0.22μm的PVDF膜上(Millipore公司)。将膜置于封闭液(含1％BSA的TBS-T)中4℃12h。加入单克隆抗体14B7，4℃孵育12h。用TBS-T洗膜后，加入1：10000稀释的羊抗鼠二抗(HRP标记，北京全式金生物技术有限公司)，室温孵育1h。TBS-T洗膜，加入ECL显色液(Thermo公司)，Western Blot凝胶成像分析系统(Tanon公司)采集图像数据。

结果图3所示(图中：marker为分子量标记，14B7代表单克隆抗体14B7)，本发明提供的单克隆抗体14B7可特异性识别A549中分子量大小约为50kDa的条带，具有很高的特异性。

综上，本发明提供的抗CLU抗体(即上述的鼠单克隆抗体14B7)，其含有重链可变区和轻链可变区，其中，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。该抗CLU抗体可以特异性识别结合CLU重组蛋白、以及表达CLU分子的炎症组织细胞或肿瘤组织细胞，具有较高的特异性以及亲和力，可用于通过免疫印迹(Western Blot)、酶联免疫吸附(ELISA)、免疫组织化学(IHC)以及流式细胞术(FACS)等手段检测样品中的CLU蛋白，也可以用于CLU蛋白在肿瘤和炎症组织或细胞中的定性、定量和定位检测。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 联合益康（北京）生物科技有限公司

<120> 一种抗CLU抗体及应用、制备方法和试剂盒

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1350

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgatgaaga ctctgctgct gtttgtgggg ctgctgctga cctgggagag tgggcaggtc 60

ctgggggacc agacggtctc agacaatgag ctccaggaaa tgtccaatca gggaagtaag 120

tacgtcaata aggaaattca aaatgctgtc aacggggtga aacagataaa gactctcata 180

gaaaaaacaa acgaagagcg caagacactg ctcagcaacc tagaagaagc caagaagaag 240

aaagaggatg ccctaaatga gaccagggaa tcagagacaa agctgaagga gctcccagga 300

gtgtgcaatg agaccatgat ggccctctgg gaagagtgta agccctgcct gaaacagacc 360

tgcatgaagt tctacgcacg cgtctgcaga agtggctcag gcctggttgg ccgccagctt 420

gaggagttcc tgaaccagag ctcgcccttc tacttctgga tgaatggtga ccgcatcgac 480

tccctgctgg agaacgaccg gcagcagacg cacatgctgg atgtcatgca ggaccacttc 540

agccgcgcgt ccagcatcat agacgagctc ttccaggaca ggttcttcac ccgggagccc 600

caggatacct accactacct gcccttcagc ctgccccacc ggaggcctca cttcttcttt 660

cccaagtccc gcatcgtccg cagcttgatg cccttctctc cgtacgagcc cctgaacttc 720

cacgccatgt tccagccctt ccttgagatg atacacgagg ctcagcaggc catggacatc 780

cacttccaca gcccggcctt ccagcacccg ccaacagaat tcatacgaga aggcgacgat 840

gaccggactg tgtgccggga gatccgccac aactccacgg gctgcctgcg gatgaaggac 900

cagtgtgaca agtgccggga gatcttgtct gtggactgtt ccaccaacaa cccctcccag 960

gctaagctgc ggcgggagct cgacgaatcc ctccaggtcg ctgagaggtt gaccaggaaa 1020

tacaacgagc tgctaaagtc ctaccagtgg aagatgctca acacctcctc cttgctggag 1080

cagctgaacg agcagtttaa ctgggtgtcc cggctggcaa acctcacgca aggcgaagac 1140

cagtactatc tgcgggtcac cacggtggct tcccacactt ctgactcgga cgttccttcc 1200

ggtgtcactg aggtggtcgt gaagctcttt gactctgatc ccatcactgt gacggtccct 1260

gtagaagtct ccaggaagaa ccctaaattt atggagaccg tggcggagaa agcgctgcag 1320

gaataccgca aaaagcaccg ggaggagtga 1350

<210> 2

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Met Lys Thr Leu Leu Leu Phe Val Gly Leu Leu Leu Thr Trp Glu

1 5 10 15

Ser Gly Gln Val Leu Gly Asp Gln Thr Val Ser Asp Asn Glu Leu Gln

20 25 30

Glu Met Ser Asn Gln Gly Ser Lys Tyr Val Asn Lys Glu Ile Gln Asn

35 40 45

Ala Val Asn Gly Val Lys Gln Ile Lys Thr Leu Ile Glu Lys Thr Asn

50 55 60

Glu Glu Arg Lys Thr Leu Leu Ser Asn Leu Glu Glu Ala Lys Lys Lys

65 70 75 80

Lys Glu Asp Ala Leu Asn Glu Thr Arg Glu Ser Glu Thr Lys Leu Lys

85 90 95

Glu Leu Pro Gly Val Cys Asn Glu Thr Met Met Ala Leu Trp Glu Glu

100 105 110

Cys Lys Pro Cys Leu Lys Gln Thr Cys Met Lys Phe Tyr Ala Arg Val

115 120 125

Cys Arg Ser Gly Ser Gly Leu Val Gly Arg Gln Leu Glu Glu Phe Leu

130 135 140

Asn Gln Ser Ser Pro Phe Tyr Phe Trp Met Asn Gly Asp Arg Ile Asp

145 150 155 160

Ser Leu Leu Glu Asn Asp Arg Gln Gln Thr His Met Leu Asp Val Met

165 170 175

Gln Asp His Phe Ser Arg Ala Ser Ser Ile Ile Asp Glu Leu Phe Gln

180 185 190

Asp Arg Phe Phe Thr Arg Glu Pro Gln Asp Thr Tyr His Tyr Leu Pro

195 200 205

Phe Ser Leu Pro His Arg Arg Pro His Phe Phe Phe Pro Lys Ser Arg

210 215 220

Ile Val Arg Ser Leu Met Pro Phe Ser Pro Tyr Glu Pro Leu Asn Phe

225 230 235 240

His Ala Met Phe Gln Pro Phe Leu Glu Met Ile His Glu Ala Gln Gln

245 250 255

Ala Met Asp Ile His Phe His Ser Pro Ala Phe Gln His Pro Pro Thr

260 265 270

Glu Phe Ile Arg Glu Gly Asp Asp Asp Arg Thr Val Cys Arg Glu Ile

275 280 285

Arg His Asn Ser Thr Gly Cys Leu Arg Met Lys Asp Gln Cys Asp Lys

290 295 300

Cys Arg Glu Ile Leu Ser Val Asp Cys Ser Thr Asn Asn Pro Ser Gln

305 310 315 320

Ala Lys Leu Arg Arg Glu Leu Asp Glu Ser Leu Gln Val Ala Glu Arg

325 330 335

Leu Thr Arg Lys Tyr Asn Glu Leu Leu Lys Ser Tyr Gln Trp Lys Met

340 345 350

Leu Asn Thr Ser Ser Leu Leu Glu Gln Leu Asn Glu Gln Phe Asn Trp

355 360 365

Val Ser Arg Leu Ala Asn Leu Thr Gln Gly Glu Asp Gln Tyr Tyr Leu

370 375 380

Arg Val Thr Thr Val Ala Ser His Thr Ser Asp Ser Asp Val Pro Ser

385 390 395 400

Gly Val Thr Glu Val Val Val Lys Leu Phe Asp Ser Asp Pro Ile Thr

405 410 415

Val Thr Val Pro Val Glu Val Ser Arg Lys Asn Pro Lys Phe Met Glu

420 425 430

Thr Val Ala Glu Lys Ala Leu Gln Glu Tyr Arg Lys Lys His Arg Glu

435 440 445

Glu

<210> 3

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ctgcagcagt ctggacctga actggtgaag cctggggctt cagtgaagat gtcctgcaag 60

acttctggct acacattcac ctcatactcc ttatactgga tcaaactgag gcttggacaa 120

agcccggaat ggatcggatc gattaaacca aacaatagtg gttactcact acaattagag 180

gttcgtgtga agagcagggc cacactgact gtagacacat ccaaagcctg tgcctacatg 240

caattcagca gcctgacatc tgatgattct gcagtctatt actgtgcaat gtctgactac 300

tggggccagg gcaccactct cacagtctcc tca 333

<210> 4

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gatatcgtga tgacccaaga tccagctctc cctgctgtca gagtaggaga tcaagtcacc 60

atttcttgca aatctagtca gagtcttaag acctacttac attggtacct cgagaagcca 120

ggccagtctc ctaagatcct tatctacaga gtttccaatc tgtattctgg ggttccagat 180

aggttcacag gcagtggatc tggtacagat ttcactctca agatcagcag agtggaggct 240

gaagatctgg gaatctatta ctgtgtcaag gaacataatt atccttggac gttcggtgct 300

gggaccaagc tggacgtgaa a 321

<210> 5

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Met Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys

1 5 10 15

Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Ser Leu Tyr

20 25 30

Trp Ile Lys Leu Arg Leu Gly Gln Ser Pro Glu Trp Ile Gly Ser Ile

35 40 45

Lys Pro Asn Asn Ser Gly Tyr Ser Leu Gln Leu Glu Val Arg Val Lys

50 55 60

Ser Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Lys Ala Cys Ala Tyr Met

65 70 75 80

Gln Phe Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Met Ser Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

100 105 110

<210> 6

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Asp Ile Val Met Thr Gln Asp Pro Ala Leu Pro Ala Val Arg Val Gly

1 5 10 15

Asp Gln Val Thr Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Lys Thr Tyr

20 25 30

Leu His Trp Tyr Leu Glu Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ile Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Val Ser Asn Leu Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Val Lys Glu His Asn Tyr Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Asp Val Lys

100 105

Claims

1.一种抗CLU抗体，其特征在于，其含有重链可变区和轻链可变区，其中，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

2.根据权利要求1所述的抗CLU抗体，其特征在于，所述抗CLU抗体由小鼠杂交瘤细胞系14B7分泌得到。

3.根据权利要求2所述的抗CLU抗体，其特征在于，所述小鼠杂交瘤细胞系14B7由抗原肽免疫小鼠得到的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合得到，所述抗原肽的氨基酸序列如SEQID NO.2中的第23-449位所示。

4.根据权利要求3所述的抗CLU抗体，其特征在于，所述抗体为小鼠IgG2a亚型单克隆抗体。

5.一种抗CLU的抗体片段，其特征在于，所述抗体片段是由权利要求1-4任一项所述的抗CLU抗体的抗体片段形成的Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、双抗体、线性抗体、单链抗体分子或多特异性抗体。

6.权利要求1-4任一项所述的抗CLU抗体或权利要求5所述的抗CLU的抗体片段在检测生物样品中CLU蛋白中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述生物样品为肿瘤组织或细胞；或者，所述生物样品为炎症组织或细胞。

8.如权利要求1所述的抗CLU抗体的制备方法，其特征在于，其包括：用氨基酸序列如SEQ ID NO.2中的第23-449位所示的抗原肽免疫动物。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述动物为小鼠。

10.一种检测CLU蛋白的试剂盒，其特征在于，其含有权利要求1-4任一项所述的抗CLU抗体或权利要求5所述的抗CLU的抗体片段。