CN109593132B

CN109593132B - 用于治疗癌症的单克隆抗体及其应用

Info

Publication number: CN109593132B
Application number: CN201811614901.4A
Authority: CN
Inventors: 巫满香; 杨骏
Original assignee: Zhongsai Stem Cell Genetic Engineering Co ltd
Current assignee: Zhongsai stem cell genetic engineering Co.,Ltd.
Priority date: 2018-12-27
Filing date: 2018-12-27
Publication date: 2021-04-30
Anticipated expiration: 2038-12-27
Also published as: CN109593132A

Abstract

本发明公开了一系列能够与EF4具有高亲和力的单克隆抗体，同时这些抗体能够显著的抑制细胞中的EF4蛋白表达，从而达到治疗癌症的效果，有着广阔的医学应用前景。

Description

用于治疗癌症的单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及用于治疗癌症的单克隆抗体及其应用，属于医药生物技术领域。

背景技术

线粒体是位于细胞之内的一种细胞器，它是身体的能量加工厂，在氧的参与下，经过一系列的生化反应，线粒体把葡萄糖的分解产物丙酮酸转化为能量，这是一个有氧代谢的过程。但是，如果过多的线粒体遭到破坏(一个细胞内有数百到数千个线粒体)，身体就不能产生足够的能量来满足细胞的需求。缺乏能量细胞难以生存，为了能够生存下去，细胞必须通过其它的途径(不需要线粒体)来获得能量，这个途径就是无氧代谢(即糖发酵)。糖发酵的过程中会产生大量的乳酸，使体内环境变酸，正常细胞难以在这样的酸性环境下生存，但细胞经过癌变以后就没有问题了。所以，癌变是细胞求生存的一种方式。

因此，收到来自于线粒体的痛苦信号以后，DNA中的一组基因就被激活了，包括癌基因和产生肿瘤血管的基因，DNA根据线粒体的指令，把正常细胞转变成癌细胞，这样的转变就保证了能量的供应，有了足够的能量，就保证了细胞的继续生存。经过其中的一系列复杂过程，最后癌细胞变成了永生不死的发酵体。

线粒体是真核细胞物质和能量代谢的“超级工厂”，可全方位接收和处理应激信号，调整细胞内环境以应对外界环境的变化。近年来，诸多研究证实线粒体于细胞而言远远不止"细胞能量站"，其参与了各项细胞功能调控，与癌症等多种人类疾病存在着莫大的联系，但线粒体在癌细胞中的作用机制目前并未被完全阐明。线粒体在细胞的不同生命时相、生理过程和环境下，形态、数量和分布具有高度可变性，其往往集中于能量消耗更旺盛的区域，而这种动态变化与线粒体功能息息相关。研究发现，癌细胞中的线粒体大量集中于细胞边缘。由于癌症转移的一个重要途径—伪足的形成与线粒体有关。在伪足形成过程中，微管和微丝会发生动态变化，而这个过程需要消耗大量的ATP，所以，作为ATP主要供应商的线粒体自然要大量集中于此了。换句话说，通过控制和调节癌细胞中线粒体的数量和分布，就可以影响癌症的侵袭和转移。

EF4蛋白是所有已知的基因组中最保守的蛋白，在原核生物中，它可以与正在进行蛋白延伸过程中的核糖体结合引发tRNA的反向转位。同时，研究发现EF4还具有GTP水解酶活性和分子伴侣活性，降低了蛋白翻译的出错率。在酵母中的研究发现EF4在应激条件下能够影响线粒体的蛋白合成，但是在人源化细胞中对EF4功能的研究还未见报道。

由上可知，EF4蛋白在人类细胞中具有高度保守的同源物，其亚细胞定位应该在细胞的能量工厂一一线粒体中，对人类正常细胞和癌症细胞的代谢具有重要作用，为人类的癌症、代谢疾病的诊断和治疗提供了潜在的生物标记物和靶位点，并为相关药物的设计提供了线索。CN103877594A提供使人癌细胞中的EF4蛋白编码基因沉默的试剂在制备用于抑制所述癌细胞生长的药物中的用途，更具体地，本发明提供针对人EF4蛋白编码基因的siRNA干扰片段在制备用于抑制人癌细胞生长的药物中的用途。

基于EF4蛋白的研究目前还不多，本发明为了提供更多、更好的的抑制策略，提供了EF4的单克隆抗体，从而丰富现有技术的缺陷。

发明内容

本发明提供抗EF4抗体和使用所述抗体的方法。

本发明的目的在于提供特异性结合人EF4蛋白的人单克隆抗体，该抗体包含人源重链(V_H)和轻链(V_L)结构域。

本发明的另一目的在于提供用于治疗癌症的组合物，该组合物包含特异性结合EF4蛋白的人单克隆抗体。

本发明的再一目的在于提供通过给对象施用根据本发明的治疗组合物来治疗癌症的方法。

在另一个方面中，提供结合EF4的单克隆抗体，其中所述抗体包含与选自SEQ IDNO：1-6的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的重链可变结构域和与选自SEQ ID NO：7-12的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的轻链可变结构域。

在一个实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的重链可变结构域和与SEQ ID NO：7的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的轻链可变结构域。

在一个实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的重链可变结构域和与SEQ ID NO：8的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的轻链可变结构域。

在一个实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的重链可变结构域和与SEQ ID NO：9的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的轻链可变结构域。

在一个实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO：4的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的重链可变结构域和与SEQ ID NO：10的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的轻链可变结构域。

在一个实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的重链可变结构域和与SEQ ID NO：11的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的轻链可变结构域。

在一个实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO：6的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的重链可变结构域和与SEQ ID NO：12的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的轻链可变结构域。

具体的，一种抗体为

重链可变区的氨基酸序列：

EVQLVESRGGLVQPGGSLRLSCAASSQRIKDQYIHWVRQAPGKKLEWVARDYPTSSRRRYADSVKGRFTISADTSKNTGYLSMNSLRAEDTAVYYCYRWGSAGFYAMQSWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：1)；

轻链可变区的氨基酸序列：

DIQMTQSRSSLSASVGDRVTITCRASNTVQTGVAWYQGKPGKAPKLLIYGLYASFPGVPSRFSGSRSGTDFTKTISSLQPEDFATYYCGGHYQTSSAFGQGRKVEIK(SEQ ID NO：7)；

或者：

重链可变区的氨基酸序列：

EVQLVESRGGLVQPGGSLRLSCAASDYRIKDQGIHWVRQAPGKKLEWVARRRPTSSQRRYADSVKGRFTISADTSKNTGYLSMNSLRAEDTAVYYCYRWITAGFYAMQSWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：2)；

轻链可变区的氨基酸序列：

DIQMTQSRSSLSASVGDRVTITCRASNTEVTGVAWYQGKPGKAPKLLIYGLSVSFPGVPSRFSGSRSGTDFTKTISSLQPEDFATYYCGGEDQTSSAFGQGRKVEIK(SEQ ID NO：8)；

或者：

重链可变区的氨基酸序列：

EVQLVESRGGLVQPGGSLRLSCAASDYRISDQCIHWVRQAPGKKLEWVARRRPTSSQSRYADSVKGRFTISADTSKNTGYLSMNSLRAEDTAVYYCYRWYTAGFYAMQTWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：3)；

轻链可变区的氨基酸序列：

DIQMTQSRSSLSASVGDRVTITCRASDTEVAGVAWYQGKPGKAPKLLIYGISVSFAGVPSRFSGSRSGTDFTKTISSLQPEDFATYYCGCEDSTSGAFGQGRKVEIK(SEQ ID NO：9)；

或者：

重链可变区的氨基酸序列：

EVQLVESRGGLVQPGGSLRLSCAASSCCIKDQSIHWVRQAPGKKLEWVARDYPTGSNNRYADSVKGRFTISADTSKNTGYLSMNSLRAEDTAVYYCTAWGSAGFQAMQGWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：4)；

轻链可变区的氨基酸序列：

DIQMTQSRSSLSASVGDRVTITCRASETVQTKVAWYQGKPGKAPKLLIYGLYLSFTGVPSRFSGSRSGTDFTKTISSLQPEDFATYYCGGHYQTSSAFGQGRKVEIK(SEQ ID NO：10)；

或者：

重链可变区的氨基酸序列：

EVQLVESRGGLVQPGGSLRLSCAASSPPIKDSYIHWVRQAPGKKLEWVARDLLTSSCRRYADSVKGRFTISADTSKNTGYLSMNSLRAEDTAVYYCGGWGSAGFYAMDSWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：5)；

轻链可变区的氨基酸序列：

DIQMTQSRSSLSASVGDRVTITCRASDTVQTEVAWYQGKPGKAPKLLIYGLSSCFPGVPSRFSGSRSGTDFTKTISSLQPEDFATYYCSSHYQTDDTFGQGRKVEIK(SEQ ID NO：11)；

再或者：

重链可变区的氨基酸序列：

EVQLVESRGGLVQPGGSLRLSCAASCYCIKDQQIHWVRQAPGKKLEWVARDSRTSSRPRYADSVKGRFTISADTSKNTGYLSMNSLRAEDTAVYYCERWGVQGFYAMQWWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：6)；

轻链可变区的氨基酸序列：

DIQMTQSRSSLSASVGDRVTITCRASSRVQTKVAWYQGKPGKAPKLLIYPKYASFVGVPSRFSGSRSGTDFTKTISSLQPEDFATYYCTFHYQTQSAFGQGRKVEIK(SEQ ID NO：12)；

在另一个方面中，抗-EF4抗体是选自Fab，Fab’-SH，Fv，scFv，或(Fab’)₂片段的抗体片段。在另一个方面中，抗-EF4抗体是人源化的、嵌合的或人抗体。

上述实施方案的任一个可以是单独的或组合的。

在另一个实施方案中，抗体以≤10nM的Kd结合EF4。

在另一个方面中，提供抑制EF4活性的方法，所述方法包括使表达EF4的细胞暴露于上述实施方案中任一项的抗体。

如本文使用的“抗体”包括提到的与特定抗原免疫学反应的免疫球蛋白分子，并包括多克隆和单克隆抗体。该术语也包括基因工程形式如嵌合抗体(例如，人源化鼠科动物抗体)和异源结合抗体(heteroconjugate antibody)(例如，双特异性抗体)。

术语“抗体”也包括抗体的抗原结合形式，包括具有抗原结合能力的片段(例如，Fab′、F(ab′)2、Fab、Fv和rIgG)。该术语也指重组单链Fv片段(scFv)。该术语抗体也包括二价分子或双特异性分子、双抗体、三抗体和四抗体。二价分子和双特异性分子描述在这些文献中，例如，Kostelny等人(1992，J.Immunol.148：15467)、Pack和Pluckthun(1992，Biochemistry 31：1579)、Hollinger等人(1993，supra)、Gruber等人(1994，J.Immunol.：5368)、Zhu等人(1997，Protein Sci.6：781)、Hu等人(1996，Cancer Res.56：3055)、Adams等人(1993，Cancer Res.53：4026)和McCartney等人(1995，Protein Eng.8：301)。

而且，如本文使用的术语“单克隆抗体”是指从基本相同的抗体克隆获得的抗体分子，其对特定表位表现出单一结合特异性和亲和力。

通常，免疫球蛋白具有重链和轻链。每个重链和轻链均含有恒定区和可变区(该区域也称为“结构域”)。轻链和重链可变区含有被称为“互补决定区”或“CDR”的三个高变区和四个“框架”区。该CDR主要负责结合到抗原的表位上。每个链的CDR通常指从N-末端开始按顺序编号的CDR1、CDR2和CDR3，通常也通过特定CDR位于其中的链鉴定。

如本文使用的术语“人源化抗体”是源于人免疫球蛋白的分子，指构成抗体的所有氨基酸序列，包括互补决定区和框架区，都由人免疫球蛋白组成。人源化抗体用于人治疗一般至少具有三个潜在的优点。首先，它可以与人免疫系统更好地相互作用，例如，从而通过补体依赖性细胞毒性(CDC)或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)更有效地破坏靶细胞。其次，人免疫系统不会将该抗体识别为外来的(foreign)。第三，其在人体循环中的半衰期类似于天然存在的人抗体，从而允许较小的给药剂量和较不频繁的给药次数。

因此，根据本发明的人单克隆抗体对在人EF4表现出强亲和力，并有效地抑制癌症细胞。另外，因为它们的重链和轻链结构域都来源于人从而现出低免疫原性，所以根据本发明的人单克隆抗体可以用于治疗癌症。

在又一个方面，本发明涉及制备特异性结合到人EF4的人单克隆抗体的方法。

本发明的单克隆抗体容易由产生单克隆抗体的众所周知的方法产生。例如，制备单克隆抗体的方法可以通过利用从免疫动物中获取的B白细胞产生杂交瘤而进行(Koeherand Milstein，1976，Nature，256：495)，或利用噬菌体展示方法进行，但不局限于此。

利用噬菌体展示的抗体文库是这样的方法，其利用直接从B淋巴细胞获取的抗体基因在噬菌体表面上表达抗体，而不需要制备杂交瘤。噬菌体展示方法可以克服与通过B细胞永生化产生单克隆抗体关联的许多困难。常规噬菌体展示包含：1)将具有随机序列的寡核苷酸插入到与噬菌体外壳蛋白pIII(或pIV)的N-末端对应的区域中；2)表达天然外壳蛋白和所述具有随机序列的寡核苷酸编码的多肽的融合蛋白；3)处理可以结合到所述寡核苷酸编码的多肽的受体材料；4)利用低pH或具有结合竞争能力的分子洗脱结合在该受体上的肽-噬菌体颗粒；5)扩增通过淘选在宿主细胞中洗脱下来的噬菌体；6)重复所述步骤以便获得期望量的噬菌体；和7)通过对淘选选择的噬菌体克隆进行DNA测序来测定活性肽的序列。

在优选实施方式中，本发明单克隆抗体的制备方法可以通过噬菌体展示方法进行。本发明所属领域的技术人员参考，例如由Barbas等人(METHODS：A CompaniontoMethods in Enzymology 2：119，1991 and J.Virol.2001Jul；75(14)：6692-9)和Winter等人(Ann.Rev.Immunol.12：433，1994)公开的众所周知的噬菌体展示技术能够容易地进行上述步骤。可用于构建抗体文库的噬菌体可以是丝状噬菌体，例如，fd、M13、f1、If1、Ike、Zj/Z、Ff、Xf、Pf1或Pf3，但不局限于此。而且，可用于表达丝状噬菌体表面上的外源基因的载体可以是噬菌体载体如fUSE5、fAFF1、fd-CAT1或fdtetDOG，或噬菌粒载体如pHEN1、pComb3、pComb8或pSEX，但不局限于此。

进一步地，可用于提供重组噬菌体成功再感染所需的天然外壳蛋白的辅助噬菌体可以由M13K07或VSCM13示例，但不局限于此。

根据本发明的一个实施方式，检验通过重组技术获得的EF4的分子量和纯度，然后将其用于制备单克隆抗体。通过噬菌体展示技术获得的对人EF4具有特异性的人抗体是人源scFv(单链可变区片段)，并作为单噬菌体克隆被筛选，从而获得10类对人EF4具有特异性的单克隆噬菌体。

进一步地，根据本发明的一个实施方式，构建了含有多核苷酸的表达载体，该多核苷酸编码所选10类人抗体噬菌体的重链和轻链或其具有免疫活性的片段。在构建表达载体后，可以对表达调控元件，如启动子、终止子和增强子，以及用于靶向膜或分泌的序列加以适当地选择，并可为了某种目而将其结合使用，这取决于用于产生人抗体的轻链和重链或其片段的宿主细胞。

本发明的表达载体包括质粒载体、粘粒载体、细菌噬菌体载体、病毒载体或类似载体，但不局限于此。合适的表达载体包括用于靶向膜或分泌的信号序列或前导序列以及表达调控元件，如启动子、操纵子、起始密码子、终止密码子、多聚腺苷酸化信号和增强子，并可以根据其目的被构建成多种形式。

附图说明

图1 ELASA检测结果图，C为对照，1-5分别为9M5，7M13，11M20(4M27结果基本相同)，15M29，5M30单抗的检测结果。

图2抗体治疗效果图。

发明的有益效果

本发明通过EF4抗原作为免疫原，制备并筛选获得了针对EF4的单克隆抗体，其具有较好的结合活性，同时其能够显著的抑制细胞中的EF4蛋白表达，从而达到治疗癌症的效果。

具体实施方式

下文，将参考实施例更详细地描述本发明。然而，下列实施例仅为说明本发明的目的而提供，因此本发明不意欲局限于此。

实例1：人EF4抗原的制备

培养商业购买的Hela细胞，使用Trizol试剂分离Hela细胞总的RNA。以oligo(dT)15作为引物，将2μg总RNA在反转录酶的作用下反转录成单链cDNA。合成特异性的EF4引物(上海生工合成)：

EF4-F：5’-atgtggaccctcgtgggtcg-3’；SEQ ID NO：14

EF4-R：5’-aaaattctttgttttcccac-3’；SEQ ID NO：15

RT-PCR扩增条件:变性94度，35秒；退火56度，35s；延伸72度，30秒；循环次数：30次；最后延伸条件72度，10分钟。PCR样品进行琼脂糖胶电泳,2033bp即为目的基因，胶回收之后构建原核表达载体pET-28a-EF4，将其导入到DH5a菌，扩增鉴定后，提取质粒，在导入到表达细菌BL21感受态细胞细胞中。挑选PCR鉴定为SEQ ID NO：13所示的阳性的BL21菌株，将BL21菌株1％接种2L LB培养基中，37度培养至对数生长期(0D A600约0.6)，冷却到16度后加0.3mM异丙基硫代半乳糖苷，诱导22小时，4度离心收集。超声破菌后4度、15000rpm离心30分钟，上清过镍柱，10-20OmM咪唑梯度洗脱需要的蛋白(保存在20mM Tris-HCl pH7.5、500mM氯化钠中)，通过SDS-PAGE确定目的蛋白的管，随后采用GE公司的Hiloadl6/60Superdex75凝胶过滤柱和Hiprep16/10QFF阴离子交换柱纯化,得到了电泳纯的可溶性EF4蛋白。

实施例2、抗EF4蛋白单克隆抗体制备

将实施例1制备的EF4蛋白为免疫原，BALB/c小鼠为免疫动物，免疫方式选择背部多点注射和腹腔注射。共30只小鼠(M1-M30)分别进行三次免疫后，在进行取脾进行细胞融合之前尾部取血获得血清，用间接ELISA方法测定效价。用样品稀释液将阴性血清和待测血清按本领域常规的比例进行稀释，进行效价的检测。其中M5、M9、M13、M15、M20、M27、M29、M30加强免疫前效价均大于1:80000，而本领域常规的选择小鼠血清效价>1:1500时，进行细胞融合。血清效价越高，则说明小鼠免疫效果越显著，获得的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合后得到阳性克隆的可能性就越大。因此，本实验选择了M5、M9、M13、M15、M20、M27、M29、M30小鼠进行最后一次免疫，3天后进行第一次细胞融合。本研究总共进行了8次完整的细胞融合，其中4次用SP2/0细胞融合，3次用SP2/0细胞和NS-1细胞分别融合，1次用NS-1细胞融合。细胞融合后，观察长出的克隆，待细胞长到板底的十分之一时，分别取两次有细胞克隆孔的细胞上清，采用本领域常用的ELISA体系进行第一次和第二次检测。两次检测后阳性孔的中细胞进行亚克隆，同时留种冻存。亚克隆要进行三次，最后检测长出的克隆全为阳性时，可以确定该杂交瘤细胞为阳性杂交瘤细胞。经过三次亚克隆之后仍是阳性的克隆中，挑取其中显色最为明显的6个克隆进行后续试验(见图1)。其分别命名为9M5，7M13，11M20，4M27，15M29，5M30。通过抗体链测序，获得了相应的抗体的可变区序列分别如下：

9M5单克隆抗体：

重链可变区的氨基酸序列：

轻链可变区的氨基酸序列：

DIQMTQSRSSLSASVGDRVTITCRASNTVQTGVAWYQGKPGKAPKLLIYGLYASFPGVPSRFSGSRSGTDFTKTISSLQPEDFATYYCGGHYQTSSAFGQGRKVEIK(SEQ ID NO：7)。

7M13单克隆抗体：

重链可变区的氨基酸序列：

EVQLVESRGGLVQPGGSLRLSCAASDYRIKDQGIHWVRQAPGKKLEWVARRRPTSSQRRYADSVKGRFTISADTSKNTGYLSMNSLRAEDTAVYYCYRWITAGFYAMQSWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：2。

轻链可变区的氨基酸序列：

11M20单克隆抗体：

重链可变区的氨基酸序列：

轻链可变区的氨基酸序列：

DIQMTQSRSSLSASVGDRVTITCRASDTEVAGVAWYQGKPGKAPKLLIYGISVSFAGVPSRFSGSRSGTDFTKTISSLQPEDFATYYCGCEDSTSGAFGQGRKVEIK(SEQ ID NO：9)。

4M27单克隆抗体：

重链可变区的氨基酸序列：

轻链可变区的氨基酸序列：

DIQMTQSRSSLSASVGDRVTITCRASETVQTKVAWYQGKPGKAPKLLIYGLYLSFTGVPSRFSGSRSGTDFTKTISSLQPEDFATYYCGGHYQTSSAFGQGRKVEIK(SEQ ID NO：10)。

15M29单克隆抗体：

重链可变区的氨基酸序列：

轻链可变区的氨基酸序列：

5M30单克隆抗体：

重链可变区的氨基酸序列：

轻链可变区的氨基酸序列：

单抗亚型鉴定

用单抗亚型鉴定试剂盒鉴定所获单抗的亚型，经鉴定9M5，7M13，11M20，4M27，15M29，5M30单抗均为IgG。

实施例3抗体结合活性检测

利用Fortibio测定抗体结合及解离常数。利用OctetRED(Fortebio,USA)仪器，测定抗EF4抗体亲和力。PBS稀释抗体浓度为10μg/mL，包被AHC传感器；PBS为对照，稀释EF4浓度为0.1μg/mL、1μg/mL、3μg/mL、10μg/mL、测定抗EF4抗体与EF4相互作用的结合、解离曲线；利用GlobeFitting拟合曲线，计算两者相互作用的解离常数。结果见表1。

表1. 9M5，7M13，11M20，4M27，15M29，5M30与EF4相互作用亲和力分析

抗体名称	解离常数(nM)
		9M5	1.49
7M13	8.76
		11M20	4.20
4M27	6.53
		15M29	0.26
5M30	1.25

从结果看出，本发明获得6个单克隆抗体均具有较好的结合效果，其中最突出的是15M29，期解离常数达到了0.26nM。

实施例4小鼠实验

动物造模与实验

分组雌性裸鼠，6～8周龄，体质量18～22g，购自北京维通利华，无菌条件下饲养。动物研究均遵守国家动物保护和使用条例。使用脑立体定位仪建立神经胶质瘤原位模型。使用微量注射泵将5μl细胞悬液(约含2×105人U87神经胶质瘤细胞)注入至小鼠右侧纹状体(坐标：前囟后0.5mm，外侧2.5mm，深3.5mm)，整个过程在10min完成。将植入U87的裸体小鼠随机分成7组，每组6只，分别为对照组和抗体1-6组。造模成功后第7天，对照组尾静脉仅注射生理盐水，其余各组尾静脉注射相应实验药物。

生存分析

观察不同组别小鼠死亡情况，小鼠死亡计数从造模成功第1天开始直至实验结束，生存时间也记录到实验最后(小鼠全部死亡)。采用Kaplan-Meier法评估存活率和各种治疗的影响。

从图2的结果可以看出，转染本发明6种抗体的的裸鼠生存时间明显高于对照组(P＜0.001)，其中15M29和11M20抗体的效果最好，小鼠存活时间达到85天，同期对照小鼠最多只存活50天。4M27的数据与11M20的基本一致，也能够保持较好的治疗效果。

通过Western blot检测每种抗体治疗后小鼠体内的EF4蛋白的表达量，结果如下：

抗体治疗小鼠	EF4蛋白相对含量
		对照	1
9M5	0.13±0.02
		7M13	0.14±0.01
11M20	0.05±0.002
		4M27	0.09±0.01
15M29	0.04±0.004
		5M30	0.16±0.02

统计学分析采用SPSS18.0统计软件，计量资料以x±s表示，两组比较采用t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。通过检测发现，本发明的抗体能够较好的抑制EF4蛋白的表达。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

序列表

<110> 宜春莲泽生物科技发展有限公司

<120> 用于治疗癌症的单克隆抗体及其应用

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 120

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 1

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Arg Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Ser Gln Arg Ile Lys Asp Gln

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Lys Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Asp Tyr Pro Thr Ser Ser Arg Arg Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Gly Tyr

65 70 75 80

Leu Ser Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Tyr Arg Trp Gly Ser Ala Gly Phe Tyr Ala Met Gln Ser Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 2

<211> 120

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 2

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Arg Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Asp Tyr Arg Ile Lys Asp Gln

20 25 30

Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Lys Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Arg Arg Pro Thr Ser Ser Gln Arg Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Gly Tyr

65 70 75 80

Leu Ser Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Tyr Arg Trp Ile Thr Ala Gly Phe Tyr Ala Met Gln Ser Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 3

<211> 120

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 3

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Arg Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Asp Tyr Arg Ile Ser Asp Gln

20 25 30

Cys Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Lys Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Arg Arg Pro Thr Ser Ser Gln Ser Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Gly Tyr

65 70 75 80

Leu Ser Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Tyr Arg Trp Tyr Thr Ala Gly Phe Tyr Ala Met Gln Thr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 4

<211> 120

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 4

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Arg Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Ser Cys Cys Ile Lys Asp Gln

20 25 30

Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Lys Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Asp Tyr Pro Thr Gly Ser Asn Asn Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Gly Tyr

65 70 75 80

Leu Ser Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ala Trp Gly Ser Ala Gly Phe Gln Ala Met Gln Gly Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 5

<211> 120

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 5

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Arg Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Ser Pro Pro Ile Lys Asp Ser

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Lys Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Asp Leu Leu Thr Ser Ser Cys Arg Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Gly Tyr

65 70 75 80

Leu Ser Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Gly Gly Trp Gly Ser Ala Gly Phe Tyr Ala Met Asp Ser Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 6

<211> 120

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 6

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Arg Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Cys Tyr Cys Ile Lys Asp Gln

20 25 30

Gln Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Lys Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Asp Ser Arg Thr Ser Ser Arg Pro Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Gly Tyr

65 70 75 80

Leu Ser Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Glu Arg Trp Gly Val Gln Gly Phe Tyr Ala Met Gln Trp Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 7

<211> 107

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 7

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Arg Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Asn Thr Val Gln Thr Gly

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gly Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Leu Tyr Ala Ser Phe Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Lys Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gly His Tyr Gln Thr Ser Ser

85 90 95

Ala Phe Gly Gln Gly Arg Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 8

<211> 107

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 8

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Arg Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Asn Thr Glu Val Thr Gly

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gly Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Leu Ser Val Ser Phe Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Lys Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gly Glu Asp Gln Thr Ser Ser

85 90 95

Ala Phe Gly Gln Gly Arg Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 9

<211> 107

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 9

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Arg Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Asp Thr Glu Val Ala Gly

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gly Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ile Ser Val Ser Phe Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Lys Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Cys Glu Asp Ser Thr Ser Gly

85 90 95

Ala Phe Gly Gln Gly Arg Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 10

<211> 107

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 10

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Arg Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Thr Val Gln Thr Lys

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gly Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Leu Tyr Leu Ser Phe Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Lys Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gly His Tyr Gln Thr Ser Ser

85 90 95

Ala Phe Gly Gln Gly Arg Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 11

<211> 107

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 11

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Arg Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Asp Thr Val Gln Thr Glu

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gly Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Leu Ser Ser Cys Phe Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Lys Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ser Ser His Tyr Gln Thr Asp Asp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Arg Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 12

<211> 107

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 12

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Arg Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Arg Val Gln Thr Lys

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gly Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Pro Lys Tyr Ala Ser Phe Val Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Lys Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Thr Phe His Tyr Gln Thr Gln Ser

85 90 95

Ala Phe Gly Gln Gly Arg Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 13

<211> 2033

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 13

atgtggaccc tcgtgggtcg gggctggggg tgcgcacgcg ctctcgcgcc acgagccact 60

ggggccgcgc ttctggtggc cccggggccc cggtccgcgc cgacccttgg ggctgctcca 120

gagtcctggg ctaccgacag gctctacagc tccgcagaat tcaaggaaaa acttgacatg 180

tctaggtttc ctgttgaaaa tattagaaat ttcagtattg ttgcacacgt ggatcatggc 240

aaaagtactt tagctgacag gctcctagaa cttacaggga caattgataa aacaaagaat 300

aataagcagg ttcttgataa attgcaagtg gaacgagaaa gaggaatcac tgttaaagca 360

cagacagcat ctctctttta caattgtgaa ggaaagcagt accttttaaa tctcattgat 420

acaccgggcc atgttgattt tagttatgaa gtatccaggt cactttctgc ttgccagggt 480

gttttacttg tggttgatgc aaatgaggga attcaagccc aaactgtagc aaacttcttt 540

cttgccttcg aagcacagct atcggtaatt ccagttataa ataagataga tctgaagaat 600

gctgatcctg aaagggttga aaaccaaatt gagaaagtgt ttgatattcc aagtgatgaa 660

tgtattaaga tttctgctaa acttggaaca aatgttgaga gtgttcttca ggcaattatt 720

gaaagaatcc cccctcctaa agtgcatcgc aaaaatcctc tgagagcttt ggtatttgac 780

tccacctttg accagtatag aggtgtgata gccaatgtag cattatttga cggagtggtt 840

tccaaaggag ataaaattgt atctgcacat actcaaaaga catacgaagt taatgaagta 900

ggagtcttga atcctaatga gcagccaact cataaattat atgcaggaca ggtgggctat 960

ctgattgctg ggatgaaaga tgtcactgaa gcgcaaatag gagatacatt atgtttacat 1020

aagcaaccag tggagccctt gcctgggttt aaatcagcga aaccaatggt atttgcagga 1080

atgtatcctc tagaccaatc tgaatataac aatctgaaga gtgctataga aaaactgact 1140

ttaaatgatt ccagtgtgac cgttcatcgg gatagtagcc ttgctctggg tgctggctgg 1200

aggctaggat ttcttggact tttgcacatg gaagttttca accagcgact ggagcaagaa 1260

tataatgctt ctgttatttt aacaacccct actgttccat ataaagctgt actgtcatca 1320

tcaaaattga taaaggaaca tagagaaaaa gaaattacaa ttatcaatcc tgcacaattc 1380

cccgataaat caaaagtaac agaatatttg gagccagttg ttttgggcac tattatcaca 1440

ccagatgaat acactggaaa aataatgatg ctttgcgagg ctcgaagagc agttcagaag 1500

aatatgatat ttattgatca aaatagagtt atgcttaaat atctctttcc tttgaatgaa 1560

attgtggtag atttttatga ctctttgaaa tccctatctt ctggatatgc tagttttgat 1620

tacgaagatg caggctacca gactgcagaa cttgtaaaaa tggatattct actgaatgga 1680

aatactgtag aggagctagt aactgttgta cacaaagaca aagctcattc aattggcaaa 1740

gccatatgtg aacggctgaa ggattctctt cctaggcaac tgtttgagat agcaattcaa 1800

gctgctattg gaagtaaaat cattgcaaga gaaactgtga aagcctatag gaaaaacgtt 1860

ttggcaaaat gttatggtgg tgatattacc cgaaaaatga agcttttgaa gagacaagca 1920

gaagggaaaa aaaagctgag gaaaattggc aacgttgaag ttccaaaaga tgcttttata 1980

aaagttctga aaacacaatc ttctaaataa ttggtgggaa aacaaagaat ttt 2033

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 14

atgtggaccc tcgtgggtcg 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 15

aaaattcttt gttttcccac 20

Claims

1.一种单克隆抗体，其能够结合EF4蛋白并抑制EF4活性，并且所述抗体以≤10nM的Kd结合EF4，其中所述抗体的重链可变区和轻链可变区序列分别如（A）~（F）任一所示：

（A）重链可变区的氨基酸序列：SEQ ID NO：1；

轻链可变区的氨基酸序列：SEQ ID NO：7；

（B）重链可变区的氨基酸序列：SEQ ID NO：2；

轻链可变区的氨基酸序列：SEQ ID NO：8；

（C）重链可变区的氨基酸序列：SEQ ID NO：3；

轻链可变区的氨基酸序列：SEQ ID NO：9；

（D）重链可变区的氨基酸序列：SEQ ID NO：4；

轻链可变区的氨基酸序列：SEQ ID NO：10；

（E）重链可变区的氨基酸序列：SEQ ID NO：5；

轻链可变区的氨基酸序列：SEQ ID NO：11；

（F）重链可变区的氨基酸序列：SEQ ID NO：6；

轻链可变区的氨基酸序列：SEQ ID NO：12。

2.如权利要求1所述的抗体，其特征在于：所述抗体是选自Fab，Fab’-SH，Fv，scFv，或(Fab’)₂片段的抗体片段。

3.权利要求1-2中任一项的抗体用于制备治疗与EF4增加的表达或活性相关的疾病的药物中的应用。

4.权利要求1-2中任一项的抗体用于制备治疗恶性肿瘤的药物中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述恶性肿瘤为神经胶质瘤。