CN102666585A - 抗簇蛋白抗体和抗原结合片段及其减小肿瘤体积的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明开了与簇蛋白特异性结合的新颖抗体和抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体阻滞簇蛋白的生物学活性并且可用于针对某些癌症，更具体地用于针对诸如子宫内膜癌、乳腺癌、肝细胞癌、前列腺癌、肾细胞癌、卵巢癌、胰腺癌和结直肠癌的癌症的组合物中。本发明还涉及表达人源化抗体或杂合抗体的细胞。此外，还公开了利用抗体和片段检测和治疗癌症的方法。

Description

抗簇蛋白抗体和抗原结合片段及其减小肿瘤体积的用途
【技术领域】
本发明涉及抗簇蛋白抗体和其减小肿瘤体积的用途。本发明更具体地涉及与簇蛋白结合的人源化抗体、杂合抗体和抗原结合片段及其减小肿瘤体积以抑制肿瘤生长和转移的用途。
【发明背景】
癌是最常见的人类恶性肿瘤，其起源于上皮细胞。上皮癌的进程起始于细胞间接触的破坏以及迁移（间充质样）表型的获得。该现象称作上皮-间充质转化（EMT），其被认为是晚期肿瘤进程和转移中的关键事件。
分泌蛋白TGF-β抑制肿瘤生长最初较大程度地由于其对上皮来源的肿瘤细胞的生长抑制作用所导致，然后在较晚期促进肿瘤细胞进程和转移。TGF-β可借以促进肿瘤进程的一种机制是通过EMT的诱导。
由于TGF-β在致癌作用中的双重作用，TGF-β的直接抑制剂可能是有风险的，因为虽然其可有利于晚期肿瘤，但其也可能加速瘤前病变。较好的治疗物可以是一种抑制TGF-β的原癌促EMT作用，同时使TGF-β的肿瘤抑制基因生长抑制作用不受影响。为开发这样的抑制剂，需要鉴定TGF-β信号转导途径的分叉点，使得途径的一个分支中的介体参与EMT应答，而不参与对TGF-β的生长抑制应答。抑制仅位于TGF-β信号转导途径的促EMT分支中的治疗剂将减少转移并且对瘤前病变的加速影响甚小或无影响。
整体上还未鉴定出促进或介导TGF-β的促EMT作用并且也不参与TGF-β的生长抑制作用的TGF-β信号途径特异性组分。
相比之下，已鉴定的内源性蛋白（YY1核因子）能够干扰（与促进相反）TGF-β的促肿瘤生长的EMT作用，并保留完整的肿瘤抑制作用（生长抑制）（Kurisaki等,2004）。
靶向TGF-β配体、受体和Smad信号传导蛋白的抑制剂是已知的。尤其是，可溶性受体外功能区、抗体和其它结合蛋白能够通过与TGF-β配体相互作用并阻止其远离细胞表面受体而作为拮抗剂。抑制I型TGF-β受体的激酶活性的小分子是可获得的，且Smad信号传导蛋白的内源性抑制剂也是已知的。因为所有这些信号转导途径组分参与TGF-β的前致癌作用和抗致癌作用，靶向它们的这些抑制剂可有益于晚期肿瘤，然而，它们也可加速瘤前病变。
2006年9月13日提交的国际专利申请第PCT/CA2006/001505号和2007年3月22日公布的WO2007/030930描述了抗簇蛋白抗体和抗原结合片段，其针对簇蛋白的特异性表位并且能够抑制癌细胞的上皮-间充质转化。该专利申请更具体地显示了抗簇蛋白抗体在前列腺癌和乳腺癌中抑制EMT的能力。
【发明概述】
本发明在其一方面涉及一种抗体，所述抗体能够与簇蛋白特异性结合且其包括人源化轻链可变区和/或人源化重链可变区。
更具体地，本发明提供了能够与簇蛋白特异性结合的非人亲本抗体的人源化抗体以及杂合抗体和其抗原结合片段。
本发明的人源化抗体或杂合抗体包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区和重链可变区可包含天然人抗体的非人互补性决定区氨基酸残基和人框架区氨基酸残基。
本发明还涉及抗原结合片段，所述抗原结合片段包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区和重链可变区包含非人互补性决定区氨基酸残基和人框架区氨基酸残基。
本发明的抗体和抗原结合片段可用于抑制由簇蛋白诱导的上皮-间充质转化。
在另一方面，本发明涉及用于减小肿瘤体积的抗簇蛋白抗体（多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、分离的人抗体、杂合抗体或其片段）和用于进行如此减小的方法。
本发明还包括的是编码本文所描述的人源化抗体、杂合抗体或抗原结合片段或本文所描述的分离的抗体的轻链可变区和/或重链可变区的分离的核酸。
本文还包括的是载体或构建体，所述载体或构建体包括本文所描述的核酸。根据本发明，载体可为例如但不限于哺乳动物表达载体、细菌表达载体等。
本发明还涉及包含或表达本发明的抗体或抗原结合片段或包括本发明的核酸或载体的细胞。
在又一另外的方面，本发明提供了包括一个或多个小瓶的试剂盒，所述小瓶可包括例如本文所描述的人源化抗体、本文所描述的杂合抗体、本文所描述的抗原结合片段、本文所描述的分离的抗体、本文所描述的分离的核酸或本文所描述的载体。
在另一方面，本发明涉及药物组合物，所述药物组合物可包括例如本文所描述的人源化抗体、本文所描述的杂合抗体、本文所描述的抗原结合片段、本文所描述的分离的抗体和药学上可接受的载体。
本发明的又一另外的方面涉及组合疗法，所述组合疗法包括本文所描述的药物组合物和化学治疗剂。
本文还包括产生人源化或杂合抗簇蛋白抗体或抗原结合片段的方法以及利用人源化或杂合的抗簇蛋白抗体或抗原结合片段治疗与簇蛋白表达或分泌相关的疾病的方法。
本发明的进一步的范围、适用性和优点将通过下文的非限制性详细描述而变得明显。然而应理解，该参照附图、同时示出本发明示例性实施方案的详细描述仅通过举例的方式给出。
【附图简述】
图1.小鼠16B5抗簇蛋白抗体的可变区的同源3D模型。CDR被标记（轻链中为L1、L2、L3，且重链中为H1、H2和H3）。由人框架残基所替代的小鼠框架残基显示为球模型。
图2.小鼠16B5、人源化16B5和选择的人框架的序列比对（提供了NCBI数据库）。顶端显示了Kabat编号。CDR被突出显示。根据对于CDR的逼近（以内）、表面暴露（B：隐藏）和与配对可变域的接触在序列比对下突出显示了回复突变的候选残基。
图3.16B5鼠类和人源化抗簇蛋白抗体的动力学分析。
图4.h16B5阻滞癌细胞系的迁移。在针对小鼠乳腺癌细胞的刮伤测定中，h16B5至少具有与小鼠16B6一样的活性。图显示了呈各种构型的的抗体在体外阻滞细胞迁移的能力。
图5.h16B5的抑制降低了人前列腺癌细胞的侵袭力。用200μL减生长因子基质胶（Becton Dickinson）覆盖12孔平板的底部。将细胞（2.5×104）重悬于200μL基质胶中，层放于其上部，并最后将500μL的细胞特异性生长培养基添加到基质胶的上部。将h16B5以8μg/mL的浓度添加到每层基质胶和培养基。将平板在37℃下孵育长达3周，在该过程中每周补充生长培养基（+/-h16B5）。箭头表示上皮样细胞的区域。
图6.用h16B5处理前列腺癌肿瘤降低了肿瘤的生长并增高了其对于化疗的应答。将DU145前列腺癌细胞（2×106）皮下移植到SCID小鼠中并使其生长直至肿瘤大小为近100mm3。用数字卡尺每两周测量肿瘤并按照L×W×H计算肿瘤体积。每组含8只动物，其在开始结束处理前随机分组。结果表示为mm3±SEM。利用斯氏T检验计算P值。
图7.小鼠21B12抗簇蛋白抗体的可变区的同源3D模型。CDR被标记（轻链中为L1、L2、L3，且重链中为H1、H2和H3）。由人框架残基所替代的小鼠框架残基显示为球模型。
图8.小鼠16B5、人源化21B12和选择的人框架的序列比对（提供了NCBI数据库）。顶端显示了Kabat编号。CDR被突出显示。根据对于CDR的近似（
Figure BDA00001676566400042
以内）、表面暴露（B：隐藏）和与配对可变域的接触在序列比对下突出显示了回复突变的候选残基。
图9.21B12鼠类和人源化抗簇蛋白抗体的动力学分析。
图10.h16B5抑制PC-3前列腺肿瘤的生长。将PC-3前列腺癌细胞（2×106）皮下移植到SCID小鼠中并使其生长直至肿瘤大小为近100mm3。用数字卡尺每两周测量肿瘤并按照L×W×H计算肿瘤体积。每组含8只动物，其在开始结束处理前随机分组。结果表示为mm3±SEM。
图11.簇蛋白在人前列腺肿瘤中表达。使来源于前列腺癌细胞系的肿瘤（如所示）生长于SCID小鼠中，将其收获，固定于福尔马林中，制成切片并利用h16B5的免疫组织化学进行检查。利用HRP缀合的二级抗体通过标准方法观察阳性染色。利用同种型对照抗体在相同的条件下进行阴性对照。
图12.H16B5抑制前列腺癌细胞系的迁移。将PANC-1细胞接种于含基质胶阻碍物的24孔Transwell平板的上部室中。下部的孔用作为化学诱导剂的含10%FBS的培养基填充。在TGFβ和/或h16B5存在或不存在（如所示）下孵育24小时之后，对基质胶层的细胞进行染色并计数细胞的数目。
图13.分泌型簇蛋白被内化到癌细胞中。在293-6E细胞中表达重组人簇蛋白，将其纯化并利用商业标记试剂盒（Invitrogen）用AlexaFluor 488进行标记。将BRI-JM01小鼠乳腺癌细胞接种到盖玻片上并用250ng/ml的标记的分泌型簇蛋白进行处理。在指定的时间，用冰冷的PBS洗涤细胞并将细胞固定于2%的多聚甲醛中。用AntifadeGold封片并用荧光显微镜生成图像。
图14.H16B5抑制分泌型簇蛋白在癌细胞中的内化。如关于图13所描述的进行实验。以10μg/ml添加H16B5。
图15.显示了人簇蛋白（NP_001822）和鼠类簇蛋白（NP_038520）之间的同源区域。
图16.显示了h16B5（在图中标记为AB-16B5）与在由4T1小鼠乳腺肿瘤生成的固定的冰冻切片中表达的鼠类簇蛋白的结合。利用免疫组织化学进行实验并利用HRP缀合的二级抗体完成检测。
【发明详述】
本发明在其一方面涉及抗体，所述抗体能够与簇蛋白特异性结合且其包括人源化轻链可变区和/或人源化重链可变区。
人簇蛋白的序列可见于RefSeq检索号；NM_001831.2（蛋白编号=NP_001822），而鼠类簇蛋白的序列可见于RefSeq检索号；NM_013492.2（蛋白编号=NP_038520）。
本发明的抗体或抗原结合片段可能够与簇蛋白的鼠类形式和/或人形式结合。本发明的抗体或抗原结合片段还能够结合天然存在的变体以及与人或鼠类簇蛋白具有至少75%（例如，80%、85%、90%、95%、99%）氨基酸同一性的合成簇蛋白变体。
本发明因此提供了非人亲本抗体的人源化抗体，其能够与簇蛋白或其抗原结合片段以及杂合抗体和其抗原结合片段特异性结合。
根据本发明的一个实施方案，人源化抗体或杂合抗体可抑制（降低）表达或分泌簇蛋白的肿瘤细胞的生长。
根据本发明的另一个实施方案，人源化抗体或杂合抗体可减小包含表达或分泌簇蛋白的肿瘤的体积。
根据本发明的一个实施方案，人源化抗体或杂合抗体可抑制（降低）表达或分泌簇蛋白的肿瘤细胞的迁移或侵袭。
因此，根据本发明的又一个另外的实施方案，人源化抗体或杂合抗体可抑制（降低）表达或分泌簇蛋白的肿瘤细胞的转移发生。
在另一方面，本发明涉及减小包含簇蛋白表达细胞的肿瘤的体积的方法，所述方法包括向有需要的哺乳动物施用抗簇蛋白抗体（多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、分离的人抗体、杂合抗体或其片段）。该方法更具体地考虑了施用嵌合抗体、人源化抗体或杂合抗体。
在一个实施方案中，杂合抗体或其片段可包括例如非人抗体的轻链可变区和人源化抗体的重链可变区。
在另一个实施方案中，杂合抗体或其片段可包括例如非人抗体的轻链可变区和人源化抗体的重链可变区。
术语“抗体”是指完整的抗体，单克隆抗体、（完全或部分）人源化抗体、杂合抗体、嵌合抗体或多克隆抗体以及分离的人抗体。术语“抗体”还包括多特异性抗体诸如双特异性抗体。人抗体通常由两个轻链和两个重链组成，每个链包括可变区和恒定区。轻链可变区包含3个CDR，本文称作CDRL1、CDRL2和CDRL3，两侧为框架区。重链可变区包含3个CDR，本文称作CDRH1、CDRH2和CDRH3，两侧为框架区。
术语“人源化抗体”指包括1至6个CDR的抗体，所述CDR包含非人CDR氨基酸残基和其来自人抗体谱的重链和/或轻链框架区的置换部分。在一些情况下，人源化抗体的重链和/或轻链框架区的总数可与由人抗体谱（天然人抗体）所编码的（可编码的）那些相同。在其它情况下，人源化抗体的重链和/或轻链框架区可包括1至30个来自待人源化非人抗体的氨基酸且剩余的部分来自天然人抗体。在其它情况下，人源化抗体可包括1至6个完全非人CDR且通常该6个CDR是完全非人的。在其它情况下，“人源化抗体”可包括人或其它来源（来自哺乳动物）的恒定区。
术语“杂合抗体”指包括其重链或轻链可变区（其重链或轻链）的一个为（对簇蛋白具有亲和力的）人源化抗体或来自天然人抗体而重链或轻链可变区（重链或轻链）的另一个为非人的抗体。
术语“嵌合抗体”指具有非人可变区和人恒定区的抗体。
术语“天然人抗体”指由人抗体谱，即，种系序列所编码的（可编码的）抗体。
如本文所用，如果利用人免疫球蛋白序列，例如通过使携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠免疫或通过筛选人免疫球蛋白基因文库从系统获得抗体，则分离的人抗体“来源于”特定的种系序列。由此通过将人抗体的氨基酸序列与人种系免疫球蛋白的氨基酸序列相比较可鉴定“来源于”人种系免疫球蛋白序列的分离的人抗体。选择的人抗体通常在氨基酸序列中与由人种系免疫球蛋白基因所编码的氨基酸序列至少90%同一，并含有当与其它物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列（例如，鼠类种系序列）相比较时将人抗体鉴定为人的氨基酸残基。在某些情况中，人抗体在氨基酸序列中可与由种系免疫球蛋白基因所编码的氨基酸序列至少95%，或甚至至少96%、97%、98%或99%同一。通常，来源于特定的人种系序列的人抗体将表现出与由人种系免疫球蛋白基因所编码的氨基酸序列不同的不超过10个氨基酸差异。在某些情况中，人抗体可表现出表现出与由人种系免疫球蛋白基因所编码的氨基酸序列不同的不超过5个，或甚至不超过4个、3个、2个或1个氨基酸差异。
如本文所用，术语“抗原结合片段”指保留与抗原结合的能力的抗体的一个或多个片段。已显示抗体的抗原结合功能可由完整的抗体的片段来执行。包括在术语抗体的“抗原结合片段”中的结合片段的实例包括（i）Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；（ii）F(ab′)2片段，包括在铰链区通过二硫桥连接的两个Fab片段；（iii）Fd片段，由VH和CH1结构域组成；（iv）Fv片段，由抗体的单臂的VL和VH结构域组成，（v）dAb片段（Ward等,(1989)Nature341:544-546），其由VH结构域组成；和（vi）分离的互补性决定区（CDR），例如，VH CDR3。并且，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由独立的基因所编码，可利用重组方法通过能使它们作为单一多肽链的合成的连接物将它们融合，所述单一多肽链其中VL和VH区配对以形成单价分子（称为单链Fv（scFv）；参见，例如，Bird等(1988)Science 242:423-426；和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883）。所述单链抗体也将包括在术语抗体的“抗原结合片段”之中。并且，抗原结合片段包括结合结构域免疫球蛋白融合蛋白，其包括（i）结合结构域多肽（诸如重链可变区，轻链可变区，或通过连接物肽与轻链可变区融合的重链可变区），其与免疫球蛋白铰链区多肽融合，（ii）与CH2恒定区融合的免疫球蛋白重链CH3恒定区，和（iii）与CH2恒定区融合的免疫球蛋白重链CH3恒定区。可通过将一个或多个半胱氨酸残基用丝氨酸残基来取代以防止二聚化来修饰铰链区。US 2003/0118592和US 2003/0133939中也公开了所述结合结构域免疫球蛋白融合蛋白。利用本领域中的技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，并筛选所述片段的与完整的抗体同样的效用。
典型的抗原结合位点包括由免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链的配对形成的可变区。抗体可变区的结构是非常一致的并表现出非常相似的结构。这些可变区通常包括相对同源的框架区（FR），以称作互补性决定区（CDR）的3个高变区间隔。抗原结合片段的总体结合活性通常受CDR序列的支配。然而，FR通常在用于最优抗原结合的CDR的适当定位和三维排列中起作用。
本发明的人源化抗体或杂合抗体可包括重链可变区，所述重链可变区可包括非人互补性决定区氨基酸残基和天然人抗体的人框架区氨基酸残基或互补的轻链。
本发明的人源化抗体或杂合抗体可包括轻链可变区，所述轻链可变区可包括非人互补性决定区氨基酸残基和天然人抗体的人框架区氨基酸残基和互补的重链。
本发明的人源化抗体或杂合抗体可抑制转移、肿瘤细胞迁移或侵袭或可抑制簇蛋白表达细胞的生长，所述簇蛋白表达细胞包括例如癌细胞。事实上，申请人意外的发现：包含本发明的人源化抗体或杂合抗体的抗簇蛋白抗体在体内减小肿瘤体积。可选地，本发明的人源化抗体或杂合抗体可用于检测表达簇蛋白的细胞。
选择用于非人亲本抗体的人源化天然人抗体可包括可变区，所述可变区具有与非人亲本抗体的（模型的）可变区相似的（可重叠的）三维结构。因此，人源化抗体或杂合抗体具有包含与非人亲本抗体的三维结构相似的三维结构的较大机会。
本发明的人源化抗体具有对于簇蛋白的高亲和力。事实上，本文已显示人源化抗体以4.49×10-9M±8.5×10-10或更佳的亲和力与重组单体簇蛋白结合。
根据本发明，人源化抗体或杂合抗体轻链的人框架区氨基酸残基来自天然人抗体轻链框架区。选择用于人源化目的的天然人抗体的轻链框架区可具有，例如，与非人亲本抗体的轻链框架区的至少70%同一性。优选地，选择用于人源化目的的天然人抗体在其轻链互补性决定区中可具有与非人亲本抗体的轻链互补性决定区相同或基本上相同数目的氨基酸。
在本发明的另外的实施方案中，人源化抗体或杂合抗体轻链的人框架区氨基酸残基来自与非人亲本抗体的轻链框架区具有至少75%、80%、83%（或更高）同一性的天然人抗体轻链框架区。
还根据本发明，人源化抗体或杂合抗体重链的人框架区氨基酸残基来自与非人亲本抗体的重链框架区具有至少70%同一性的天然人抗体重链框架区。优选地，选择用于人源化目的的天然人抗体在其重链互补性决定区中可具有与非人亲本抗体的重链互补性决定区相同或基本上相同数目的氨基酸。
在本发明的另外的实施方案中，人源化抗体或杂合抗体重链的人框架区氨基酸残基来自与非人亲本抗体的重链框架区具有至少75%、80%、83%同一性的天然人抗体重链框架区。
在本发明的一个实施方案中，人源化抗体或杂合抗体的重链可变区可因此包括至少一个非人互补性决定区。
可选地，在本发明的另外的实施方案中，人源化抗体或杂合抗体的重链可变区可包括至少两个非人互补性决定区或甚至3个非人互补性决定区。
在本发明的另外的实施方案中，轻链可变区可包括至少一个非人互补性决定区。
可选地，在又一些另外的实施方案中，轻链可变区包含至少2个非人互补性决定区或甚至3个非人互补性决定区。
人源化抗体可因此有利地包括非人抗体的全部6个CDR。就二价人源化抗体而言，全部12个CDR可来自非人抗体。
可通过人源化抗体或杂合抗体检测的簇蛋白表达细胞包括癌细胞。人源化抗体或杂合抗体还可用于抑制表达簇蛋白的癌细胞且尤其是人癌细胞的生长。
已显示若干类型的人癌细胞表达或分泌簇蛋白，其中有，子宫内膜癌的细胞、乳腺癌的细胞、肝细胞癌的细胞、前列腺癌的细胞、肾细胞癌的细胞、卵巢癌的细胞、结直肠癌的细胞、胰腺癌的细胞等。
本发明的一个示例性实施方案包括例如人源化抗体或杂合抗体，所述人源化抗体或杂合抗体包括如本文所描述的天然人抗体重链的人框架区氨基酸残基，和选自由以下组成的组的重链CDR：具有SEQ IDNO：1的氨基酸序列的CDRH1、具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的CDRH2和具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的CDRH3及其组合，或选自由以下组成的组的重链CDR：具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列的CDRH1、具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列的CDRH2和具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的CDRH3及其组合。
在另一个示例性实施方案中，人源化抗体或杂合抗体可包括如本文所描述的天然人抗体重链的人框架区氨基酸残基，和选自由以下组成的组的至少2个重链CDR：具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的CDRH1、具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的CDRH2和具有SEQ IDNO：3的氨基酸序列的CDRH3，或选自由以下组成的组的至少两个重链CDR：具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列的CDRH1、具有SEQID NO：12的氨基酸序列的CDRH2和具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的CDRH3及其组合。
可选地，在另一个示例性实施方案中，本发明的人源化抗体或杂合抗体可包括如本文所描述的天然人抗体重链的人框架区氨基酸残基，和具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的CDRH1、具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的CDRH2和具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的CDRH3，或具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列的CDRH1、具有SEQID NO：12的氨基酸序列的CDRH2和具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的CDRH3。
在本发明的一个更特定的实施方案中，人源化抗体或杂合抗体（或来源于其的任何抗原结合片段）可包括包含SEQ ID NO：26的轻链可变区（h16B5VL共有序列1）：
DIVMXQSPXSLAVSXGEXXTXXCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQXPKLLIYWASTRESGVPDRFXGSGSGTDFTLTISSXQAEDXAVYYCKQSYNLWTFGXGTKLEXK；其中由X表示的氨基酸中的至少一个是与SEQ ID NO：25（鼠类16B5VL）中所列的多肽中的对应氨基酸相比较的氨基酸置换。氨基酸置换可以是例如保守性的或非保守性的。根据本发明，氨基酸置换可以是保守性的。
人源化抗体或杂合抗体（或来源于其的任何抗原结合片段）可包括包含SEQ ID NO：27的轻链可变区（16B5VL共有序列2）：
DIVMXa1QSPXa2SLAVSXa3GEXa4Xa5TXa6Xa7CKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQXa8PKLLIYWASTRESGVPDRFXa9GSGSGTDFTLTISSXa10QAEDXa11AVYYCKQSYNLWTFGXa12GTKLEXa13K；
其中Xa1可以是中性亲水性氨基酸，例如T或S；
其中Xa2可以是例如D或S；
其中Xa3可以是疏水性氨基酸，例如L或A；
其中Xa4可以是碱性氨基酸，例如R或K；
其中Xa5可以是疏水性氨基酸，例如A或V；
其中Xa6可以是疏水性氨基酸，例如I或M；
其中Xa7可以是例如N或S；
其中Xa8可以是例如P或S；
其中Xa9可以是中性亲水性氨基酸，例如S或T；
其中Xa10可以是疏水性氨基酸，例如L或V；
其中Xa11可以是疏水性氨基酸，例如V或L；
其中Xa12可以是例如Q或G；
其中Xa13可以是例如I或F；且
其中轻链可变区可包括与SEQ ID NO：25相比较的以上氨基酸置换中的至少一个。
人源化抗体或杂合抗体（或来源于其的任何抗原结合片段）可包括包含SEQ ID NO：28的轻链可变区（16B5VL共有序列3）：
DIVMXa1QSPXa2SLAVSXa3GEXa4Xa5TXa6Xa7CKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQXa8PKLLIYWASTRESGVPDRFXa9GSGSGTDFTLTISSXa10QAEDXa11AVYYCKQSYNLWTFGXa12GTKLEXa13K；
其中Xa1可以是例如T或S；
其中Xa2可以是例如D或S；
其中Xa3可以是例如L或A；
其中Xa4可以是例如R或K；
其中Xa5可以是例如A或V；
其中Xa6可以是例如I或M；
其中Xa7可以是例如N或S；
其中Xa8可以是例如P或S；
其中Xa9可以是例如S或T；
其中Xa10可以是例如L或V；
其中Xa11可以是例如V或L；
其中Xa12可以是例如Q或G；
其中Xa13可以是例如I或F；且
其中轻链可变区可包括与SEQ ID NO：25相比较的以上氨基酸置换中的至少一个。
在本发明的另一个更特定的实施方案中，人源化抗体或杂合抗体（或来源于其的任何抗原结合片段）可包括包含SEQ ID NO：30的重链可变区（16B5VH共有序列1）；
XVQLXQSGAEXXKPGAXVXXSCXXSGFNIKDIYMHWVXQXPXXGLEWXGRIDPAYGNTKYDPKFQGXXTITADTSXXTAYXXLSSLXSEDTAVYYCArRYDTAMDYwgqgtXvtvsS；
其中由X表示的氨基酸中的至少一个是与SEQ ID NO：29（鼠类16B5VH）中所列的多肽中的对应的氨基酸相比较的氨基酸置换。氨基酸置换可以是例如保守性的或非保守性的。根据本发明，氨基酸置换可以是保守性的。
人源化抗体或杂合抗体（或来源于其的任何抗原结合片段）可包括包含SEQ ID NO：31的重链可变区（16B5VH共有序列2）：
Xb1VQLXb2QSGAEXb3Xb4KPGAXb5VXb6Xb7SCXb8Xb9SGFNIKDIYMHWVXb10QXb11PXb12Xb13GLEWXb14GRIDPAYGNTKYDPKFQGXb15Xb16TITADTSXb17Xb18TAYXb19Xb20LSSLXb21SEDTAVYYCArRYDTAMDYwgqgtXb22vtvsS；
其中Xb1可以是例如Q或E；
其中Xb2可以是例如V或Q；
其中Xb3可以是疏水性氨基酸，例如V或L；
其中Xb4可以是例如K或V；
其中Xb5可以是中性亲水性氨基酸，例如T或S；
其中Xb6可以是碱性氨基酸，例如K或R；
其中Xb7可以是疏水性氨基酸，例如I或L；
其中Xb8可以是例如K或T；
其中Xb9可以是例如V或T；
其中Xb10可以是碱性氨基酸，例如Q或K；
其中Xb11可以是例如A或R；
其中Xb12可以是例如G或E；
其中Xb13可以是碱性氨基酸，例如K或Q；
其中Xb14可以是疏水性氨基酸，例如M或I；
其中Xb15可以是碱性氨基酸，例如R或K；
其中Xb16可以是疏水性氨基酸，例如V或A；
其中Xb17可以是中性亲水性氨基酸，例如T或S；
其中Xb18可以是例如D或N；
其中Xb19可以是疏水性氨基酸，例如M或L；
其中Xb20可以是例如E或Q；
其中Xb21可以是例如R或T；
其中Xb22可以是例如L或S；且
其中重链可变区可包括与SEQ ID NO：29相比较的以上氨基酸置换中的至少一个。
人源化抗体或杂合抗体（或来源于其的任何抗原结合片段）可包括包含SEQ ID NO：32的重链可变区（16B5VH共有序列3）：
Xb1VQLXb2QSGAEXb3Xb4KPGAXb5VXb6Xb7SCXb8Xb9SGFNIKDIYMHWVXb10QXb11PXb12Xb13GLEWXb14GRIDPAYGNTKYDPKFQGXb15Xb16TITADTSXb17Xb18TAYXb19Xb20LSSLXb21SEDTAVYYCArRYDTAMDYwgqgtXb22vtvsS；
其中Xb1可以是例如Q或E；
其中Xb2可以是例如V或Q；
其中Xb3可以是例如V或L；
其中Xb4可以是例如K或V；
其中Xb5可以是例如T或S；
其中Xb6可以是例如K或R；
其中Xb7可以是例如I或L；
其中Xb8可以是例如K或T；
其中Xb9可以是例如V或T；
其中Xb10可以是例如Q或K；
其中Xb11可以是例如A或R；
其中Xb12可以是例如G或E；
其中Xb13可以是例如K或Q；
其中Xb14可以是例如M或I；
其中Xb15可以是例如R或K；
其中Xb16可以是例如V或A；
其中Xb17可以是例如T或S；
其中Xb18可以是例如D或N；
其中Xb19可以是例如M或L；
其中Xb20可以是例如E或Q；
其中Xb21可以是例如R或T；
其中Xb22可以是例如L或S；且
其中重链可变区可包括与SEQ ID NO：29相比较的以上氨基酸置换中的至少一个。
在本发明的另一特定的实施方案中，人源化抗体或杂合抗体（或来源于其的任何抗原结合片段）可包括包含SEQ ID NO：34的轻链可变区（21B12VL共有序列1）；
DIVMXcQSPXSLAVSXGEXXTXXCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQXPGQXPKLLIYWASTRESGVPDRFXGSGSGTDFTLTISSXXAEDXAVYYCQQYYIYPRTFGXGTKLEIK；
其中由X表示的氨基酸中的至少一个是与SEQ ID NO：33（鼠类21B12VL）中所列的多肽中的对应的氨基酸相比较的氨基酸置换。氨基酸置换可以是例如保守性的或非保守性的。根据本发明，氨基酸置换可以是保守性的。
人源化抗体或杂合抗体（或来源于其的任何抗原结合片段）可包括包含SEQ ID NO：35的轻链可变区（21B12VL共有序列2）：
DIVMXc1QSPXc2SLAVSXc3GEXc4Xc5TXc6Xc7CKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQXc8PGQXc9PKLLIYWASTRESGVPDRFXc10GSGSGTDFTLTISSXc11Xc12AEDXc13AVYYCQQYYIYPRTFGXc14GTKLEIK；
其中Xc1可以是中性亲水性氨基酸，例如T或S；
其中Xc2可以是例如D或S；
其中Xc3可以是疏水性氨基酸，例如L或V；
其中Xc4可以是碱性氨基酸，例如R或K；
其中Xc5可以是疏水性氨基酸，例如A或V；
其中Xc6可以是疏水性氨基酸，例如I或M；
其中Xc7可以是例如N或S；
其中Xc8可以是例如碱性氨基酸K或R；
其中Xc9可以是例如P或S；
其中Xc10可以是中性亲水性氨基酸，例如S或T；
其中Xc11可以是疏水性氨基酸，例如L或V；
其中Xc12可以是碱性氨基酸，例如Q或K；
其中Xc13可以是疏水性氨基酸，例如V或L；
其中Xc14可以是例如Q或G；且
其中轻链可变区可包括与SEQ ID NO：33相比较的以上氨基酸置换中的至少一个。
人源化抗体或杂合抗体（或来源于其的任何抗原结合片段）可包括包含SEQ ID NO：36的轻链可变区（21B12VL共有序列3）：
DIVMXc1QSPXc2SLAVSXc3GEXc4Xc5TXc6Xc7CKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQXc8PGQXc9PKLLIYWASTRESGVPDRFXc10GSGSGTDFTLTISSXc11Xc12AEDXc13AVYYCQQYYIYPRTFGXc14GTKLEIK；
其中Xc1可以是T或S；
其中Xc2可以是例如D或S；
其中Xc3可以是L或V；
其中Xc4可以是R或K；
其中Xc5可以是例如A或V；
其中Xc6可以是例如I或M；
其中Xc7可以是例如N或S；
其中Xc8可以是例如K或R；
其中Xc9可以是例如P或S；
其中Xc10可以是例如S或T；
其中Xc11可以是例如L或V；
其中Xc12可以是例如Q或K；
其中Xc13可以是例如V或L；
其中Xc14可以是例如Q或G；且
其中轻链可变区可包括与SEQ ID NO：33相比较的以上氨基酸置换中的至少一个。
在本发明的另一个示例性实施方案中，人源化抗体或杂合抗体（或来源于其的任何抗原结合片段）可包括包含SEQ ID NO：38的重链可变区（21B12VH共有序列1）：
QXQLVQSGXELKKPGXXVKXSCKASGYTFTNYGMHWVXQAPGXGLXWMGWINTYTGEPTYADDFKGRFXFSLXTSXSTAYLQIXXLKXEDTAXYXCARdGFLYFFDYwgqgtXXtvss；
其中由X表示的氨基酸中的至少一个是与SEQ ID NO：37（鼠类21B12VH）中所列的多肽中的对应的氨基酸相比较的氨基酸置换。氨基酸置换可以是例如保守性的或非保守性的。根据本发明，氨基酸置换可以是保守性的。
人源化抗体或杂合抗体（或来源于其的任何抗原结合片段）可包括包含SEQ ID NO：39的重链可变区（21B12VH共有序列2）：
QXd1QLVQSGXd2ELKKPGXd3Xd4VKXd5SCKASGYTFTNYGMHWVXd6QAPGXd7GLXd8WMGWINTYTGEPTYADDFKGRFXd9FSLXd10TSXd11STAYLQIXd12Xd13LKXd14EDTAXd15YXd16CARdGFLYFFDYwgqgtXd17Xd18tvss；
其中Xd1可以是疏水性氨基酸，例如V或I；
其中Xd2可以是例如S或P；
其中Xd3可以是例如A或E；
其中Xd4可以是中性亲水性氨基酸，例如S或T；
其中Xd5可以是疏水性氨基酸，例如V或I；
其中Xd6可以是碱性氨基酸，例如R或K；
其中Xd7可以是碱性氨基酸，例如Q或K；
其中Xd8可以是例如E或K；
其中Xd9可以是疏水性氨基酸，例如V或A；
其中Xd10可以是酸性氨基酸，例如D或E；
其中Xd11可以是疏水性氨基酸，例如V或A；
其中Xd12可以是例如S或N；
其中Xd13可以是例如S或N；
其中Xd14可以是例如A或N；
其中Xd15可以是例如V或T；
其中Xd16可以是芳香族氨基酸，例如Y或F；
其中Xd17可以是例如L或T；
其中Xd18可以是疏水性氨基酸，例如V或L；且
其中重链可变区可包括与SEQ ID NO：37相比较的以上氨基酸置换中的至少一个。
人源化抗体或杂合抗体（或来源于其的任何抗原结合片段）可包括包含SEQ ID NO：40的重链可变区（21B12VH共有序列3）：
QXd1QLVQSGXd2ELKKPGXd3Xd4VKXd5SCKASGYTFTNYGMHWVXd6QAPGXd7GLXd8WMGWINTYTGEPTYADDFKGRFXd9FSLXd10TSXd11STAYLQIXd12Xd13LKXd14EDTAXd15YXd16CARdGFLYFFDYwgqgtXd17Xd18tvss；
其中Xd1可以是例如V或I；
其中Xd2可以是例如S或P；
其中Xd3可以是例如A或E；
其中Xd4可以是例如S或T；
其中Xd5可以是例如V或I；
其中Xd6可以是例如R或K；
其中Xd7可以是例如Q或K；
其中Xd8可以是例如E或K；
其中Xd9可以是例如V或A；
其中Xd10可以是例如D或E；
其中Xd11可以是例如V或A；
其中Xd12可以是例如S或N；
其中Xd13可以是例如S或N；
其中Xd14可以是例如A或N；
其中Xd15可以是例如V或T；
其中Xd16可以是例如Y或F；
其中Xd17可以是例如L或T；
其中Xd18可以是例如V或L；且
其中重链可变区可包括与SEQ ID NO：37相比较的以上氨基酸置换中的至少一个。
在一个更特定的实施方案中，人源化抗体或杂合抗体可包括具有SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：17的氨基酸序列的重链可变区。
本发明的又一个更特定的实施方案包括人源化抗体或杂合抗体，所述人源化抗体或杂合抗体可包括具有SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：19的氨基酸序列的重链。
本发明的人源化抗体或杂合抗体可具有如本文所示的重链或重链可变区和互补轻链或轻链可变区。
另一方面，本发明的人源化抗体或杂合抗体可具有如本文所示的轻链或轻链可变区和互补重链或重链可变区。
本发明的人源化抗体或杂合抗体可因此包括如本文所描述的天然人抗体轻链的人框架区氨基酸残基和选自由例如以下组成的组的轻链CDR：具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的CDRL1、具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的CDRL2和具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的CDRL3或选自由以下组成的组的重链CDR：具有SEQ ID NO：14的氨基酸序列的CDRL1、具有SEQ ID NO：15的氨基酸序列的CDRL2和具有SEQ ID NO：16的氨基酸序列的CDRL3及其组合。
在另一个实施方案中，人源化抗体或杂合抗体可包括如本文所描述的天然人抗体轻链的人框架区氨基酸残基和选自由以下组成的组的至少2个轻链CDR：具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的CDRL1、具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的CDRL2和具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的CDRL3或选自由以下组成的组的至少2个重链CDR：具有SEQ ID NO：14的氨基酸序列的CDRL1、具有SEQ ID NO：15的氨基酸序列的CDRL2和具有SEQ ID NO：16的氨基酸序列的CDRL3及其组合。
在又一个另外的实施方案中，人源化抗体或杂合抗体可包括如本文所描述的天然人抗体轻链的人框架区氨基酸残基和具有SEQ IDNO：4的氨基酸序列的CDRL1、具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的CDRL2和具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的CDRL3或具有SEQID NO：14的氨基酸序列的CDRL1、具有SEQ ID NO：15的氨基酸序列的CDRL2和具有SEQ ID NO：16的氨基酸序列的CDRL3及其组合。
在一个更具体的实施方案中，人源化抗体或杂合抗体可包括具有SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：18的氨基酸序列的轻链可变区。
在一个甚至更具体的实施方案中，本发明的人源化抗体或杂合抗体可包括具有SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：20的氨基酸序列的轻链。
本发明的另外的特定的实施方案包括人源化抗体，所述人源化抗体具有包含SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：17的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：18的氨基酸序列的轻链可变区。
本发明的一个另外的特定的实施方案包括人源化抗体，所述人源化抗体具有包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的重链和具有SEQ IDNO：10的氨基酸序列的轻链。
另外，本发明的一个另外的特定的实施方案包括人源化抗体，所述人源化抗体具有包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO：20的氨基酸序列的轻链。
本发明在另一方面涉及抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段可能够与簇蛋白特异性结合且可选自由以下组成的组：
抗体或其抗原结合片段，其可具有与SEQ ID NO：25至少80%同一（例如，85%、90%、95%、99%）的轻链可变区和/或与SEQ IDNO：29至少80%同一（例如，85%、90%、95%、99%）的重链可变区，其中所述抗体或其抗原结合片段可包括例如与SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：29相比较的至少一个氨基酸置换并且其中所述氨基酸置换可以在例如互补性决定区之外；和
抗体或其抗原结合片段，其可具有与SEQ ID NO：33至少80%同一（例如，85%、90%、95%、99%）的轻链可变区和/或与SEQ IDNO：37至少80%同一（例如，85%、90%、95%、99%）的重链可变区，其中所述抗体或其抗原结合片段可包括与SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：37相比较的至少一个氨基酸置换并且其中所述氨基酸置换可以在例如互补性决定区之外。
根据本发明，至少一个氨基酸置换可以是例如在轻链可变区中。
根据本发明，至少一个氨基酸置换可以是例如在重链可变区中。
氨基酸置换可以是保守的或非保守的。在更特定的实施方案中，氨基酸置换可以是保守的。
根据本发明的一个实施方案，本发明的抗体和抗原结合片段结合人簇蛋白。根据本发明的另一个实施方案，本发明的抗体和抗原结合片段结合鼠类簇蛋白。本发明的抗体和抗原结合片段还可结合天然存在的人簇蛋白或人簇蛋白的鼠类的合成变体。所述变体可以例如与人簇蛋白或与鼠类簇蛋白具有至少75%氨基酸序列同一性。
利用Kabat和Chothia定义鉴定了SEQ ID NO：29的CDR（与SEQ ID NO.30、31、32和7的那些同一）。本文所鉴定的对应的CDR序列如下；重链可变区的CDR1对应于SEQ ID NO：1，重链可变区的CDR2对应于SEQ ID NO：2和重链可变区的CDR3对应于SEQ IDNO：3。
在2006年9月13日提交的（即，1505申请）并以第WO2007/030930号公布的国际申请第PCT/CA2006/001505号中展示了SEQ ID NO：1、2和3的较短形式。在该专利申请中，利用执行IMGT定义的IMGT/V搜索软件鉴定了SEQ ID NO：29的CDR（对应于‘1505申请中的SEQID NO：23）。本文中鉴定的对应序列如下；重链可变区的CDR1对应于SEQ ID NO：44，重链可变区的CDR2对应于SEQ ID NO：45和重链可变区的CDR3对应于SEQ ID NO：46。
如本文所用，关于SEQ ID NO：29的术语“氨基酸置换…在互补性决定区（CDR）之外”一般指SEQ ID NO：1、2和3（外的）周围的氨基酸。在一些实施方案中，该术语可可选地指SEQ ID NO：44、45和46（外的）周围的氨基酸。
利用Kabat和Chothia定义鉴定了SEQ ID NO：25的CDR（与SEQ ID NO.26、27、28和8的那些同一）。本文所鉴定的对应的CDR序列如下；轻链可变区的CDR1对应于SEQ ID NO：4，轻链可变区的CDR2对应于SEQ ID NO：5和轻链可变区的CDR3对应于SEQ IDNO：6。
在2006年9月13日提交的（即，1505申请）并以第WO2007/030930号公布的国际申请第PCT/CA2006/001505号中展示了SEQ ID NO：4、5和6的较短形式。在该专利申请中，利用执行IMGT定义的IMGT/V搜索软件鉴定了SEQ ID NO：25的CDR（对应于‘1505申请中的SEQID NO：12）。本文中鉴定的对应序列如下；轻链可变区的CDR1对应于SEQ ID NO：47，轻链可变区的CDR2对应于氨基酸序列“WAS”和轻链可变区的CDR3对应于SEQ ID NO：49。
如本文所用，关于SEQ ID NO：25的术语“氨基酸置换…在互补性决定区（CDR）之外”一般指SEQ ID NO：4、5和6（外的）周围的氨基酸。在一些实施方案中，该术语可可选地指SEQ ID NO：47、轻链可变区的CDR2和49（外的）周围的氨基酸。
利用Kabat和Chothia定义鉴定了SEQ ID NO：37的CDR（与SEQ ID NO.38、39、40和17的那些同一）。本文所鉴定的对应的CDR序列如下；重链可变区的CDR1对应于SEQ ID NO：11，重链可变区的CDR2对应于SEQ ID NO：12和重链可变区的CDR3对应于SEQ ID NO：13。
在2006年9月13日提交的（即，1505申请）并以第WO2007/030930号公布的国际申请第PCT/CA2006/001505号中展示了SEQ ID NO：11、12和13的较短形式。在该专利申请中，利用执行IMGT定义的IMGT/V搜索软件鉴定了SEQ ID NO：37的CDR（对应于‘1505申请中的SEQ ID NO：22）。本文中鉴定的对应序列如下；重链可变区的CDR1对应于SEQ ID NO：50，重链可变区的CDR2对应于SEQ IDNO：51和重链可变区的CDR3对应于SEQ ID NO：52。
如本文所用，关于SEQ ID NO：37的术语“氨基酸置换…在互补性决定区（CDR）之外”一般指SEQ ID NO：11、12和13（外的）周围的氨基酸。在一些实施方案中，该术语可可选地指SEQ ID NO：50、51和52（外的）周围的氨基酸。
利用Kabat和Chothia定义鉴定了SEQ ID NO：33的CDR（与SEQ ID NO.34、35、36和18的那些同一）。本文所鉴定的对应的CDR序列如下；轻链可变区的CDR1对应于SEQ ID NO：14，轻链可变区的CDR2对应于SEQ ID NO：15和轻链可变区的CDR3对应于SEQ ID NO：16。
在2006年9月13日提交的（即，1505申请）并以第WO2007/030930号公布的国际申请第PCT/CA2006/001505号中展示了SEQ ID NO：14、15和16的较短形式。在该专利申请中，利用执行IMGT定义的IMGT/V搜索软件鉴定了SEQ ID NO：33的CDR（对应于‘1505申请中的SEQ ID NO：11）。本文中鉴定的对应序列如下；轻链可变区的CDR1对应于SEQ ID NO：53，轻链可变区的CDR2对应于氨基酸序列“WAS”和重链可变区的CDR3对应于SEQ ID NO：55。
如本文所用，关于SEQ ID NO：33的术语“氨基酸置换…在互补性决定区（CDR）之外”一般指SEQ ID NO：14、15和16（外的）周围的氨基酸。在一些实施方案中，该术语可可选地指SEQ ID NO：53、轻链可变区的CDR2和55（外的）周围的氨基酸。
本发明的人源化抗体（或来源于其的任何抗原结合片段）可包括选自由SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：27组成的组的轻链可变区和选自由SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：29或SEQ IDNO：30组成的组的重链可变区。
本发明的杂合抗体（或来源于其的任何抗原结合片段）可包括选自由SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：27组成的组的轻链可变区和包含SEQ ID NO：28的重链可变区。
可选地，本发明的杂合抗体（或来源于其的任何抗原结合片段）可包括包含SEQ ID NO：25的轻链可变区和选自由SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：30的重链可变区。
本发明的人源化抗体（或来源于其的任何抗原结合片段）可包括选自由SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：33组成的组的轻链可变区和选自由SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：35或SEQ IDNO：36组成的组的重链可变区。
本发明的杂合抗体（或来源于其的任何抗原结合片段）可包括选自由SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：33组成的组的轻链可变区和包含SEQ ID NO：34的重链可变区。
可选地，本发明的杂合抗体（或来源于其的任何抗原结合片段）可包括包含SEQ ID NO：31的轻链可变区和选自由SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：36组成的组的重链可变区。
本发明的人源化抗体或抗原结合片段的另一个示例性实施方案包括例如，具有轻链可变区的抗体或抗原结合片段，所述轻链可变区可包含SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28或SEQ IDNO：8的任何一个的至少90个连续氨基酸。
如本文所用，术语“SEQ ID NO：26的至少90个连续氨基酸”还包括术语“至少91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111或至少112个连续氨基酸”。术语“SEQ ID NO：26的至少90个连续氨基酸”包括存在于SEQ ID NO：26的至少90个连续氨基酸的任何可能的序列且特别是包含SEQ ID NO：26的3个CDR的那些序列，例如包含SEQ IDNO：26的第6位到第108位氨基酸、第5位到第109位氨基酸、第13位到第103位氨基酸、第9位到第111位氨基酸等的序列。
如本文所用，术语“SEQ ID NO：27的至少90个连续氨基酸”还包括术语“至少91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111或至少112个连续氨基酸”。术语“SEQ ID NO：27的至少90个连续氨基酸”包括存在于SEQ ID NO：27的至少90个连续氨基酸的任何可能的序列且特别是包含SEQ ID NO：27的3个CDR的那些序列，例如包含SEQ IDNO：27的第7位到第109位氨基酸、第12位到第104位氨基酸、第22位到第113位氨基酸、第18位到第112位氨基酸等的序列。
术语“SEQ ID NO：28的至少90个连续氨基酸”或“SEQ ID NO：8的至少90个连续氨基酸”具有相似的含义。
根据本发明，本发明的抗体或抗原结合片段可具有，例如，如SEQID NO：8中所列的轻链可变区。
还根据本发明，本发明的抗体或抗原结合片段可具有，例如，如SEQ ID NO：10中所列的轻链。
本发明的人源化抗体或抗原结合片段包括（或还包括），例如，可包含SEQ ID NO：30、31、32或7的任何一个的至少90个连续氨基酸的重链可变区。
如本文所用，术语“SEQ ID NO：30的至少90个连续氨基酸”还包括术语“至少91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116或至少117个连续氨基酸”。术语“SEQ ID NO：30的至少90个连续氨基酸”包括存在于SEQ ID NO：30的至少90个连续氨基酸的任何可能的序列且特别是包含SEQ ID NO：30的3个CDR的那些序列，例如包含SEQ ID NO：30的第1位到第108位氨基酸、第2位到第112位氨基酸、第11位到第113位氨基酸、第7位到第109位氨基酸等的序列。
如本文所用，术语“SEQ ID NO：31的至少90个连续氨基酸”还包括术语“至少91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116或至少117个连续氨基酸”。术语“SEQ ID NO：31的至少90个连续氨基酸”包括存在于SEQ ID NO：31的至少90个连续氨基酸的任何可能的序列且特别是包含SEQ ID NO：31的3个CDR的那些序列，例如包含SEQ ID NO：31的第6位到第109位氨基酸、第8位到第113位氨基酸、第1位到第108位氨基酸、第2位到第115位氨基酸等的序列。
术语“SEQ ID NO：32的至少90个连续氨基酸”或“SEQ ID NO：7的至少90个连续氨基酸”具有相似的含义。
根据本发明，本发明的抗体或抗原结合片段可具有，例如，如SEQID NO：7中所列的重链可变区。
还根据本发明，本发明的抗体或抗原结合片段可具有，例如，如SEQ ID NO：9中所列的重链。
根据本发明，抗体或抗原结合片段可包括例如
a）可包含SEQ ID NO：26的至少90个连续氨基酸的轻链可变区和可包含SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：7的任何一个的至少90个连续氨基酸的重链可变区；
b）可包含SEQ ID NO：27的至少90个连续氨基酸的轻链可变区和可包含SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：7的任何一个的至少90个连续氨基酸的重链可变区；
c）可包含SEQ ID NO：28的至少90个连续氨基酸的轻链可变区和可包含SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32或SEQID NO：7的任何一个的至少90个连续氨基酸的重链可变区；或
d）可包含SEQ ID NO：8的至少90个连续氨基酸的轻链可变区和可包含SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32或SEQID NO：7的任何一个的至少90个连续氨基酸的重链可变区。
根据本发明的更特定的实施方案，轻链可变区可包含SEQ IDNO：8的至少90个连续氨基酸且重链可变区可包含SEQ ID NO：7的至少90个连续氨基酸。
根据本发明的甚至更特定的实施方案，轻链可变区可以是如SEQID NO：8中所列的且重链可变区可以是如SEQ ID NO：7中所列的。
本发明的人源化抗体或抗原结合片段的其它示例性实施方案是可包括轻链可变区的那些，所述轻链可变区可包含SEQ ID No.34、35、36或18的任何一个的至少90个连续氨基酸。
如本文所用，术语“SEQ ID NO：34的至少90个连续氨基酸”还包括术语“至少91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112或至少113个连续氨基酸”。术语“SEQ ID NO：34的至少90个连续氨基酸”包括存在于SEQ ID NO：34的至少90个连续氨基酸的任何可能的序列且特别是包含SEQ ID NO：34的3个CDR的那些序列，例如包含SEQ ID NO：34的第6位到第103位氨基酸、第11位到第106位氨基酸、第1位到第106位氨基酸、第3位到第110位氨基酸、第5位至第107位氨基酸等的序列。
如本文所用，术语“SEQ ID NO：35的至少90个连续氨基酸”还包括术语“至少91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112或至少113个连续氨基酸”。术语“SEQ ID NO：35的至少90个连续氨基酸”包括存在于SEQ ID NO：35的至少90个连续氨基酸的任何可能的序列且特别是包含SEQ ID NO：35的3个CDR的那些序列，例如包含SEQ ID NO：35的第9位到第106位氨基酸、第10位到第113位氨基酸、第1位到第109位氨基酸、第20位到第110位氨基酸、第7位至第107位氨基酸等的序列。
术语“SEQ ID NO：36的至少90个连续氨基酸”或“SEQ ID NO：18的至少90个连续氨基酸”具有相似的含义。
根据本发明，本发明的抗体或抗原结合片段可具有，例如，如SEQID NO：18中所列的轻链可变区。
还根据本发明，本发明的抗体或抗原结合片段可具有，例如，如SEQ ID NO：20中所列的重链。
本发明的人源化抗体或抗原结合片段包括（或还包括），例如，可包含SEQ ID NO：38、39、40或17的任何一个的至少90个连续氨基酸的重链可变区。
如本文所用，术语“SEQ ID NO：38的至少90个连续氨基酸”还包括术语“至少91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117或至少118个连续氨基酸”。术语“SEQ ID NO：38的至少90个连续氨基酸”包括存在于SEQ ID NO：38的至少90个连续氨基酸的任何可能的序列且特别是包含SEQ ID NO：38的3个CDR的那些序列，例如包含SEQ ID NO：38的第6位到第111位氨基酸、第1位到第114位氨基酸、第12位到第109位氨基酸、第5位到第113位氨基酸、第10位到第107位氨基酸等的序列。
如本文所用，术语“SEQ ID NO：39的至少90个连续氨基酸”还包括术语“至少91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117或至少118个连续氨基酸”。术语“SEQ ID NO：39的至少90个连续氨基酸”包括存在于SEQ ID NO：39的至少90个连续氨基酸的任何可能的序列且特别是包含SEQ ID NO：39的3个CDR的那些序列，例如包含SEQ ID NO：39的第3位到第109位氨基酸、第1位到第115位氨基酸、第1位到第110位氨基酸、第22位到第116位氨基酸、第20位到第115位氨基酸等的序列。
术语“SEQ ID NO：40的至少90个连续氨基酸”或“SEQ ID NO：17的至少90个连续氨基酸”具有相似的含义。
根据本发明，本发明的抗体或抗原结合片段可具有，例如，如SEQID NO：17中所列的重链可变区。
还根据本发明，本发明的抗体或抗原结合片段可具有，例如，如SEQ ID NO：19中所列的重链。根据本发明，抗体或抗原结合片段可包括例如
a）可包含SEQ ID NO：34的至少90个连续氨基酸的轻链可变区和可包含SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40或SEQ ID NO：17的任何一个的至少90个连续氨基酸的重链可变区；
b）可包含SEQ ID NO：35的至少90个连续氨基酸的轻链可变区和可包含SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40或SEQ ID NO：17的任何一个的至少90个连续氨基酸的重链可变区；
c）可包含SEQ ID NO：36的至少90个连续氨基酸的轻链可变区和可包含SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40或SEQID NO：17的任何一个的至少90个连续氨基酸的重链可变区；或
d）可包含SEQ ID NO：18的至少90个连续氨基酸的轻链可变区和可包含SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40或SEQ ID NO：17的任何一个的至少90个连续氨基酸的重链可变区。
根据本发明的更特定的实施方案，轻链可变区可具有SEQ IDNO：18的至少90个连续氨基酸且重链可变区可具有SEQ ID NO：17的至少90个连续氨基酸。
根据本发明的甚至更特定的实施方案，轻链可变区可以是如SEQID NO：18中所列的且重链可变区可以是如SEQ ID NO：17中所列的。
当然，本文所描述的轻链或重链或它们的可变区还可包含信号肽。所述信号太可来自原始序列或可被设计以优化多肽的特别的细胞定位。当然，需要的信号肽是可允许多肽的分泌的那些（例如，可裂解的）。
本发明的人源化抗体或杂合抗体可具有恒定区，优选地是人恒定区。虽然可选择其它亚型，人源化抗体或杂合抗体可包括IgG1、IgG2或IgG3亚型的免疫球蛋白的恒定区的氨基酸残基。
本发明在另一方面还涉及包括轻链可变区（或其片段）和重链可变区（或其片段）的抗原结合片段，其可包含非人互补性决定区氨基酸残基和人框架区氨基酸残基。
本发明的抗原结合片段可与簇蛋白结合且可有利地具有比非人亲本抗体的抗原结合片段更佳的亲和力。
事实上，本文已显示抗原结合片段以1.7×10-8M±2.97×10-9或更佳的亲和力与重组单体簇蛋白结合。
在一个示例性实施方案中，抗原结合片段可包括如本文所描述的天然人抗体重链的人框架区氨基酸残基和选自由以下组成的组的重链CDR：具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的CDRH1、具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的CDRH2和具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的CDRH3，或选自由以下组成的组的重链CDR：具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列的CDRH1、具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列的CDRH2和具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的CDRH3。
在另一个示例性实施方案中，抗原结合片段可包括如本文所描述的天然人抗体重链的人框架区氨基酸残基和选自由以下组成的组的至少两个重链CDR：具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的CDRH1、具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的CDRH2和具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的CDRH3，或选自由以下组成的组的至少两个重链CDR：具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列的CDRH1、具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列的CDRH2和具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的CDRH3。
在另一个示例性实施方案中，抗原结合片段可包括如本文所描述的天然人抗体重链的人框架区氨基酸残基和具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的CDRH1、具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的CDRH2和具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的CDRH3，或具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列的CDRH1、具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列的CDRH2和具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的CDRH3。
在一个更具体的实施方案中，抗原结合片段可包括具有SEQ IDNO:7或SEQ ID NO：17的氨基酸序列的重链可变区（或其片段）。
在另一个示例性实施方案中，抗原结合片段可包括如本文所描述的天然人抗体轻链的人框架区氨基酸残基和选自由以下组成的组的轻链CDR：具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的CDRL1、具有SEQ IDNO：5的氨基酸序列的CDRL2和具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的CDRL3，或选自由以下组成的组的轻链CDR：具有SEQ ID NO：14的氨基酸序列的CDRL1、具有SEQ ID NO：15的氨基酸序列的CDRL2和具有SEQ ID NO：16的氨基酸序列的CDRL3。
在另一个示例性实施方案中，抗原结合片段可包括如本文所描述的天然人抗体轻链链的人框架区氨基酸残基和选自由以下组成的组的至少两个轻链CDR：具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的CDRL1、具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的CDRL2和具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的CDRL3，或选自由以下组成的组的至少两个轻链CDR：具有SEQ ID NO：14的氨基酸序列的CDRL1、具有SEQ ID NO：15的氨基酸序列的CDRL2和具有SEQ ID NO：16的氨基酸序列的CDRL3。
在又一个示例性实施方案中，抗原结合片段可包括如本文所描述的天然人抗体轻链链的人框架区氨基酸残基和具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的CDRL1、具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的CDRL2和具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的CDRL3，或具有SEQ ID NO：14的氨基酸序列的CDRL1、具有SEQ ID NO：15的氨基酸序列的CDRL2和具有SEQ ID NO：16的氨基酸序列的CDRL3。
在一个更特定的实施方案中，抗原结合片段可包括具有SEQ IDNO：8或SEQ ID NO：18的氨基酸序列的轻链可变区或其片段。
根据本发明，抗原结合片段可以是例如Fab片段、F(ab’)2片段、Fd片段、Fv片段或dAb片段。
优选地，抗原结合片段可以是例如Fab片段或F(ab’)2片段。
本发明还包括包含本文所描述的抗原结合片段的氨基酸序列的分离的抗体。分离的抗体还可包括恒定区。
【变体抗体和抗原结合片段】
虽然，用于人框架中的人CDR的来自啮齿类抗体的置换CDR有时足以转移高抗原结合亲和力（Jones,P.T.等,Nature 321:522-525(1986)；Verhoeyen,M.等,Science 239:1534-1536(1988)），在另外的情况中需要另外地替换一个（Riechmann,L.等,Nature 332:323-327(1988)）或多个（Queen,C.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:10029-10033(1989)）框架区残基。在抗体人源化领域中存在着相当的不可预知性。例如，在美国专利第7,537,931号中，试图将鼠类抗体转移到人抗体中导致了与抗原的结合的丧失。
如果人源化过程不导致具有需要的特性（即，特异性、亲和力等）的人源化抗体或杂合抗体，则可用非人氨基酸框架残基置换人氨基酸框架残基。
因此本发明包括本文所描述的人源化抗体或杂合抗体或抗原结合片段的变体。所包括的变体抗体或抗原结合片段是在本文所描述的人源化抗体或杂合抗体或抗原结合片段的氨基酸序列中具有变异的那些。例如，本发明包括的变体抗体或抗原结合片段是具有可包括非人互补性决定区氨基酸残基和天然人抗体的人框架区氨基酸残基且还包括至少一个氨基酸变异（优选地在框架区中）的轻链可变区和重链可变区的那些。
本发明所包括的变体抗体或抗原结合片段是具有以下的那些，例如，与人源化抗体或杂合抗体或抗原结合片段相比较相似的或提高的特性但与本文所描述的人源化抗体或杂合抗体相比较携带至少一个氨基酸变异。
本发明包括的变体抗体或抗原结合片段是可包括插入、缺失或氨基酸置换（保守的或非保守的）的那些。因此一些变体可在其氨基酸序列移除中具有至少一个氨基酸残基并在该位置具有不同的插入的残基。
置换诱变的目标位点可包括高变区（CDR）、框架区或甚至恒定区。保守置换可通过将来自以下所列的组（组1到6）中之一的氨基酸与相同的组的另一氨基酸交换来生成。
在表1A中的“优选的置换”标题下显示了保守置换的其它示例性实施方案。如果所述置换导致了不期望的性质，则可将表1A中命名为“示例性置换”或以下根据氨基酸种类的进一步描述的更大量的改变引入并筛查产物。
表1A中显示了名称为“保守置换”的置换的实例。如果此类置换导致了不需要的改变，则可将表1A中命名为“示例性置换”或以下根据氨基酸种类的进一步描述的其它类型的置换引入并筛查产物。
通过选择其在维持以下的作用上显著不同的置换可实现功能或免疫识别中的大量修改：（a）置换的区域中的多肽骨架的结构，例如，片层或螺旋构象。（b）靶位点处的分子的电荷或疏水性，或（c）侧链的堆积。基于共同的侧链性质将天然存在的残基分为以下的组：
（组1）疏水性：正亮氨酸、蛋氨酸（Met）、丙氨酸（Ala）、缬氨酸（Val）、亮氨酸（Leu）、异亮氨酸（Ile）
（组2）中性亲水性：半胱氨酸（Cys）、丝氨酸（Ser）、苏氨酸（Thr）
（组3）酸性：天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）
（组4）碱性：天冬酰胺（Asn）、谷氨酰胺（Gln）、组氨酸（His）、赖氨酸（Lys）、精氨酸（Arg）
（组5）影响链取向的残基：甘氨酸（Gly）、脯氨酸（Pro）；和
（组6）芳香族：色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）
非保守置换将使这些种类之一中的一员替代另一个。
表1A氨基酸置换
  原始残基   示例性置换   保守置换
  Ala（A）   Val、Leu、Ile   Val
  Arg（R）   Lys、Gln、Asn   Lys
  Asn（N）   Gln、His、Lys、Arg、Asp   Gln
  Asp（D）   Glu、Asn   Glu
  Cys（C）   Ser、Ala   Ser
  Gln（Q）   Asn;Glu   Asn
  Glu（E）   Asp、Gln   Asp
  Gly（G）   Ala   Ala
  His（H）   Asn、Gln、Lys、Arg、   Arg
  Ile（I）   Leu、Val、Met、Ala、Phe、正亮氨酸   Leu
  Leu（L）   正亮氨酸、Ile、Val、Met、Ala、Phe   Ile
  Lys（K）   Arg、Gln、Asn   Arg
  Met（M）   Leu、Phe、Ile   Leu
  Phe（F）   Leu、Val、Ile、Ala、Tyr   Tyr
  Pro（P）   Ala   Ala
  Ser（S）   Thr   Thr
  Thr（T）   Ser   Ser
  Trp（W）   Tyr、Phe   Tyr
  Tyr（Y）   Trp、Phe、Thr、Ser   Phe
  Val（V）   Ile、Leu、Met、Phe、Ala、正亮氨酸   Leu
变体抗体或抗原结合片段的氨基酸序列中的变异可包括氨基酸增加、缺失、插入、置换等、一个或多个氨基酸的骨架或侧链中的一个或多个修改、或基团或另一分子添加到一个或多个氨基酸（侧链或骨架）。
变体抗体或抗原结合片段与原始抗体或抗原结合片段氨基酸序列相比较在其氨基酸序列中可具有大量的序列相似性和/或序列同一性。两个序列之间的相似性的程度基于同一性（相同的氨基酸）的百分比和保守置换的百分比。
当确定框架区与另一框架区相比较的同一性百分比时，优先地应该不考虑CDR氨基酸序列。框架区与另一框架区相比较的同一性百分比优选地跨越整个框架区而不是逐个框架来确定。
一般，利用Blast2序列程序（Tatiana A.Tatusova,Thomas L.Madden(1999),"Blast 2sequences-a new tool for comparing proteinand nucleotide sequences",FEMS Microbiol Lett.174:247-250）利用缺省设置，即，blastp程序，BLOSUM62矩阵（开放空位11和延伸空位罚值1；gapx下降50，期望10.0，字长3）和激活的过滤器本文已确定了可变链之间的相似性和同一性的程度。
因此同一性百分比将代表与原始肽相比较相同的且其可占据相同或相似的位置的氨基酸。
相似性百分比将代表与原始肽相比较相同的和在相同或相似的位置处以保守氨基酸置换来替换的那些氨基酸。
因此本发明的变体包括与原始序列或原始序列的部分可具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的那些。
变体的示例性实施方案是与本文所描述的序列具有至少81%序列同一性和与原始序列或原始序列的部分具有至少81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列相似性的那些。
变体的其它示例性实施方案是与本文所描述的序列具有至少82%序列同一性和与原始序列或原始序列的部分具有至少82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列相似性的那些。
变体的另外的示例性实施方案是与本文所描述的序列具有至少85%序列同一性和与原始序列或原始序列的部分具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列相似性的那些。
变体的其它示例性实施方案是与本文所描述的序列具有至少90%序列同一性和与原始序列或原始序列的部分具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列相似性的那些。
变体的示例性实施方案是与本文所描述的序列具有至少95%序列同一性和与原始序列或原始序列的部分具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%序列相似性的那些。
变体的又一些另外的示例性实施方案是与本文所描述的序列具有至少97%序列同一性和与原始序列或原始序列的部分具有至少97%、98%、99%或100%序列相似性的那些。
为简洁的目的，申请人在本文提供了表1B，其示出了本发明包括的单独的变体的示例性实施方案，并包括详细的序列同一性%和序列相似性%。每个“X”被认为定义了给定的变体。
Figure BDA00001676566400361
本发明因此包括人源化抗体或杂合抗体，其中再导入了非人氨基酸框架残基或其中进行了其它类型的氨基酸修饰。特别被选择以优化抗体的特性的氨基酸包括参与抗原结合的那些。图2中提供了这样的氨基酸的实例。
在一个示例性实施方案中，本发明的人源化抗体或杂合抗体可因此在重链可变区包含1到21个非人框架区氨基酸残基（回复突变）。
在另一个示例性实施方案中，人源化抗体或杂合抗体可在轻链可变区中包括1到12个非人框架区氨基酸残基（回复突变）。
如本文所用，术语“1到20”包括每个单独的数值和范围例如，1、2、3和直到20；1到20；1到19；1到18；1到17；1到16；1到15等等；2到20；2到19；2到18；2到17等等；3到20；3到19；3到18等等；4到20；4到19；4到18；4到17；4到16等等；5到20；5到19；5到18；5到17等等。
同样，术语“1到12”包括每个单独的数值和范围，例如1、2、3和直到12；1到12；1到11；1到10等等；2到12；2到11、2到10；2到9；2到8等等；3到12；3到11；3到10；3到9等等；4到12；4到11等等；5到12；5到11；5到10；5到9；5到8；5到7；等等。
相似的术语以相似的方式来解释。
本发明包括或使用与另一氨基酸序列具有需要的%同一性的氨基酸序列，例如，“与非人亲本抗体的轻链框架区具有至少70%同一性的天然人抗体轻链框架区”或“与非人亲本抗体的重链框架区具有至少70%同一性的天然人抗体重链框架区”。
术语“与非人亲本抗体的轻链框架区具有至少70%同一性的天然人抗体轻链框架区”包括与非人亲本抗体的轻链框架区具有70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的天然人抗体轻链框架区。同一性%优选地跨越整个框架区来确定（即，排除CDR）。
如上关于变体所述，术语“与非人亲本抗体的轻链框架区具有至少70%同一性的轻链框架区”包括与非人亲本抗体的轻链框架区具有70%同一性的轻链框架区且其与非人亲本抗体的轻链框架区也可具有71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列相似性。
术语“与非人亲本抗体的重链框架区具有至少70%同一性的天然人抗体重链框架区”包括与非人亲本抗体的重链框架区具有70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的天然人抗体重链框架区。
如上关于变体所述的，术语“与非人亲本抗体的重链框架区具有至少70%同一性的重链框架区”包括与非人亲本抗体的重链框架区具有70%同一性的重链框架区且其还可与非人亲本抗体的重链框架区具有71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列相似性。
【在细胞中产生抗体】
本文中所公开的抗体可通过本领域中的技术人员熟悉的多种方法来生成（重组DNA方法、化学合成等）。
为表达抗体，可将编码本文所描述的免疫球蛋白轻链和重链中的任何一个的核苷酸序列导入到表达载体中，例如，含有用于特定的宿主中的插入的编码序列的转录和翻译控制的元件的载体。这些元件可包括调控序列，例如增强子、组成型和诱导型启动子，和5’和3’非翻译区。本领域中的技术人员熟知的方法可用于构建所述表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。
可使用本领域中的技术人员已知的多种表达载体/宿主细胞系统来表达来源于能够编码本文所描述的免疫球蛋白轻链和重链的任何一个的核苷酸序列的多肽或RNA。这些包括但不限于微生物诸如利用重组噬菌体、质粒或粘粒DNA表达载体转化的细菌；利用酵母表达载体转化的酵母；利用杆状病毒载体感染的昆虫细胞系统；利用病毒或细菌表达载体转化的植物细胞系统；或动物细胞系统。对于哺乳动物系统中的重组蛋白的长期生产，细胞系中的稳定表达可以是有效的。例如，可利用表达载体将能够编码本文所描述的免疫球蛋白轻链和重链中的任何一个的核苷酸序列导入到细胞系中，所述表达载体可含有病毒复制起始点和/或内源性表达元件和在相同的载体上或在不同的载体上含有可选择的或可见的标志基因。本发明不局限所用的载体或宿主细胞。在本发明的某些实施方案中，可将能够编码本文所描述的免疫球蛋白轻链和重链中的任何一个的核苷酸序列连接到不同的表达载体中并独立地表达每个链。在另一个实施方案中，可将能够编码本文所描述的免疫球蛋白轻链和重链中的任何一个的轻链和重链连接到单一的表达载体中并同时表达。
可选地，可利用体外转录系统或联合的体外转录/翻译系统从包括能够编码本文所描述的免疫球蛋白轻链和重链中的任何一个的核苷酸序列的载体中表达RNA和/或多肽。
一般，可通过本领域中的技术人员已知的多种方法来鉴定包含能够编码本文所描述的免疫球蛋白轻链和重链中的任何一个的核苷酸序列和/或表达由能够编码本文所描述的免疫球蛋白轻链和重链中的任何一个的核苷酸序列编码的多肽或其部分的宿主细胞。这些方法包括但不限于DNA/DNA或DNA/RNA杂交、PCR扩增和蛋白生物测定或免疫测定技术包括，基于膜、溶液或芯片的技术以用于检测和/或定量核酸或氨基酸序列。利用特定的多克隆或单克隆抗体检测和测量多肽的表达的免疫学方法是本领域中已知的。所述技术的实例包括酶联免疫吸附测定（ELISA）、放射性免疫测定（RIA）和荧光激活细胞分选（FACS）。本领域中技术人员可容易地使这些方法适于本发明。
因此，可在用于对应的RNA的转录和/或从细胞培养中表达多肽的条件下培养包括能够编码本文所描述的免疫球蛋白轻链和重链中的任何一个的核苷酸序列的宿主细胞。根据所用的序列和/或载体，由细胞产生的多肽可被分泌或可在胞内保留。在一个示例性实施方案中，可设计含有能够编码本文所描述的免疫球蛋白轻链和重链中的任何一个的核苷酸序列的表达载体以含有指导多肽通过原核或真核细胞膜而分泌的信号序列。
SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22中提供了编码重链可变区的核酸的一个示例性实施方案。
SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24中提供了编码轻链可变区的核酸的一个示例性实施方案。
由于遗传密码的固有的简并性，可产生编码相同的、基本上相同的或功能上等价的氨基酸序列的其它DNA序列并将其用于，例如，表达由能够编码本文所描述的免疫球蛋白轻链和重链中的任何一个的核苷酸序列编码的多肽。可利用本领域中一般已知的方法对本发明的核苷酸序列进行工程化以改变核苷酸序列以用于多种目的，所述方法包括但不限于基因产物的克隆、加工和/或表达的修饰。通过随机断裂和基因片段和合成的寡核苷酸的PCR重新组装的DNA改组可用于工程化核苷酸序列。例如，寡核苷酸介导的定点诱变可用来导入创建新型限制位点的突变、改变糖基化类型、改变密码子偏好、产生剪接变体等等。
此外，可关于调节插入的序列的表达或已需要的方式加工表达的多肽的能力选择宿主细胞系。所述多肽的修改包括但不限于乙酰化、羧化、糖基化、磷酸化、脂质化和酰化。在一个示例性实施方案中，含有特定的糖基化结构或类型的抗体可能是需要的。翻译后加工，其裂解多肽“前原”形式，可用来指定蛋白靶点、折叠和/或活性。具有用于翻译后活性的特定细胞机器和特性机制的不同的宿主细胞（例如，CHO、HeLa、MDCD、HEK293和W138）是从商业上可获得的且可从美国典型培养物保藏中心（ATCC）可获得的，且可选择其以确保表达的多肽的正确的修饰和加工。
本领域中的技术人员将容易地理解，可在前述宿主细胞中的任何一种中将天然的、修改的或重组的核酸序列连接到异源序列，导致含有异源多肽部分的融合多肽的翻译。利用商业上可获得的亲和基质所述异源多肽部分可协助融合多肽的纯化。所述部分包括但不限于谷胱甘肽S-转移酶（GST）、麦芽糖结合蛋白、硫氧还蛋白、钙调蛋白结合肽、6-His（His）、FLAG、c-myc、血凝素（HA）和抗体表位诸如单克隆抗体表位。
在另一方面中，本发明涉及多肽，所述多肽可包括编码融合蛋白的核苷酸序列。融合蛋白可包括与本文所描述的多肽（例如，完整轻链、完整重链、可变区、CDR等）融合的融合伴侣（例如，HA、Fc等）。
本领域中的技术人员还将容易地认识到，核酸和多肽序列可以是利用本领域中熟知的化学或酶促方法全部或部分合成的。例如，可利用不同的固相技术进行肽合成，且可使用机器诸如ABI 431A肽合成仪（PE Biosystems）来使合成自动化。如果需要的话，可在合成的过程中改变氨基酸序列和/或将其与来自其它蛋白的序列组合以产生变体蛋白。
当仅轻链可变域或重链可变域之一是可获得的，可利用本领域中已知的方法通过筛查互补可变域的文库来重新构建抗体或抗原结合片段（Portolano等The Journal of Immunology(1993)150:880-887,Clarkson等,Nature(1991)352:624-628）。这样，仅知道可变区氨基酸序列之一（重链可变区或轻链可变区）通常足以重新构建具有需要的抗原结合特异性的完整的抗体。因此，编码抗体的轻链可变区或重链可变区的核酸可用于互补链，当所述互补链互相组装时形成具有足够的抗原结合特异性的抗原结合片段或抗体。与编码抗体的轻链可变区或重链可变区的核酸具有高水平的序列同一性的单恋核酸（例如，寡核酸）或其互补物可用于检测编码抗体的轻链可变区或重链可变区的核酸或用于检测共有高水平序列同一性的任何其它核酸序列。
因此，在另一方面，本发明还提供了编码本文所描述的人源化抗体或杂合抗体的轻链可变区和/或重链可变区的、编码本文所描述的抗原结合片段或本文所描述的分离的抗体的分离的核酸。
在又一方面，本发明提供了载体或构建体，所述载体或构建体包括本文所描述的（分离的）核酸。根据本发明，载体可以是例如哺乳动物表达载体，细菌表达载体等。
本发明还包括包含本文所描述的分离的核酸或本文所描述的载体的分离的细胞。本文还包括表达本发明的抗体或抗原结合片段的分离的细胞。适宜的细胞包括例如哺乳动物细胞、细菌细胞等。
本发明的又一另外的方面涉及用于生成人源化或杂合抗簇蛋白抗体的方法，所述方法包括将能够与簇蛋白特异性结合的非人抗体的非人重链CDR氨基酸残基导入到天然人抗体重链可变区的框架区中。
本发明的又一另外的方面涉及用于生成人源化或杂合抗簇蛋白抗体的方法，所述方法可包括利用编码重链可变区（或完整重链）的核酸转化细胞，所述重链可变区包含能够与簇蛋白特异性结合的非人抗体的非人重链CDR氨基酸残基和天然人抗体重链可变区的框架区氨基酸。所述方法还可包括利用编码互补轻链可变区（或完整轻链）的核酸转化细胞。
在另一方面，本发明涉及用于生成人源化或杂合抗簇蛋白抗体的方法，所述方法可包括表达包含能够与簇蛋白特异性结合的非人抗体的非人重链CDR氨基酸残基和天然人抗体重链可变区的框架区氨基酸的重链可变区（或完整重链）。所述方法还可包括表达互补轻链可变区（或完整轻链）。
可被选择用于人源化目的的天然人抗体重链可变区可具有以下的特性：a）与非人抗体的三维结构相似或相同（重合）的三维结构，b）具有与非人抗体的重链框架区至少70%同一的氨基酸序列的框架区，和/或；c）重链CDR（例如，全部3个CDR）中与非人重链CDR氨基酸残基的相同或基本上相同的（大量）氨基酸残基。
因此该方法可包括例如导入非人抗体的至少2个CDR的非人重链CDR氨基酸残基。因此生成人源化抗体或杂合抗体的方法中所用的核酸可编码非人抗体的至少2个CDR。因此在生成人源化抗体或杂合抗体的方法中所表达的重链可变区可包括非人抗体的至少2个CDR。
该方法可优选地包括导入全部3个CDR的非人重链CDR氨基酸残基。因此生成人源化抗体或杂合抗体的方法中所用的核酸可编码非人抗体的3个CDR。因此在生成人源化抗体或杂合抗体的方法中表达的重链可变区可包括非人抗体的3个CDR。
因此该方法包括导入包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQID NO：3的氨基酸序列的非人CDR。因此生成人源化抗体或杂合抗体的方法中所用的核酸可编码SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQID NO：3。因此生成人源化抗体或杂合抗体的方法中所表达的重链可变区可包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3。
因此该方法还包括导入包含SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13的氨基酸序列的非人CDR。因此生成人源化抗体或杂合抗体的方法中所用的核酸可编码SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13。因此生成人源化抗体或杂合抗体的方法中所表达的重链可变区可包含SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ IDNO：13。
可选地，可将以上所述的CDR的较短形式导入到天然人抗体重链可变区的框架区中。
本发明的方法还可包括将能够与簇蛋白特异性结合的非人抗体的非人轻链CDR氨基酸残基导入到天然人抗体轻链可变区的框架区中。
本发明的方法可包括允许编码包括能够与簇蛋白特异性结合的非人抗体的非人轻链CDR氨基酸残基和天然人抗体轻链可变区的框架区氨基酸的轻链可变区（或完整轻链）的核酸的表达。所述方法还可包括利用编码互补重链可变区（或完整重链）的核酸转化细胞。
在另一方面，本发明设计用于生成人源化或杂合抗簇蛋白抗体的方法，所述方法可包括表达包含能够与簇蛋白特异性结合的非人抗体的非人轻链CDR氨基酸残基和天然人抗体轻链可变区的框架区氨基酸的轻链可变区（或完整轻链）。该方法还可包括表达互补重链可变区（或完整重链）。
可被选择用于人源化目的的天然人抗体轻链可变区可具有以下的特性：a）与非人抗体的轻链的三维结构相似或相同（重合）的三维结构，b）具有与非人抗体的轻链框架区至少70%同一的氨基酸序列的框架区，和/或；c）轻链CDR（例如，全部3个CDR）中与非人轻链CDR氨基酸残基的相同或基本上相同的（大量）氨基酸残基。
因此，该方法可包括例如导入非人抗体的至少2个CDR的非人轻链CDR氨基酸残基。因此生成人源化抗体或杂合抗体的方法中所用的核酸可编码非人抗体的至少2个CDR。因此在生成人源化抗体或杂合抗体的方法中所表达的轻链可变区可包括非人抗体的至少2个CDR。
该方法可优选地包括导入全部3个CDR的非人轻链CDR氨基酸残基。因此生成人源化抗体或杂合抗体的方法中所用的核酸可编码非人抗体的3个CDR。因此在生成人源化抗体或杂合抗体的方法中表达的轻链可变区可包括非人抗体的3个CDR。
因此该方法包括导入包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQID NO：6的氨基酸序列的非人CDR。因此生成人源化抗体或杂合抗体的方法中所用的核酸可编码SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQID NO：6。因此生成人源化抗体或杂合抗体的方法中所表达的轻链可变区可包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。
因此，该方法还包括导入包含SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16的氨基酸序列的非人CDR。因此生成人源化抗体或杂合抗体的方法中所用的核酸可编码SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16。因此生成人源化抗体或杂合抗体的方法中所表达的轻链可变区可包含SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ IDNO：16。
可选地，可将以上所述的CDR的较短形式导入到天然人抗体轻链可变区的框架区中。
本发明的另一方面关于用于生成人源化抗簇蛋白抗体的方法，所述方法可包括将能够与簇蛋白特异性结合的非人抗体的非人重链CDR氨基酸残基导入到天然人抗体重链可变区的框架区中并将能够与簇蛋白特异性结合的非人抗体的非人轻链CDR氨基酸残基导入到天然人抗体轻链可变区的框架区中。
另外，本发明的另一方面关于用于生成人源化抗簇蛋白抗体的方法，所述方法包括允许能够编码与簇蛋白特异性结合的非人抗体的非人重链CDR氨基酸残基和天然人抗体重链可变区的框架区的核酸的表达并允许编码能够与簇蛋白特异性结合的非人抗体的非人轻链CDR氨基酸残基和天然人抗体轻链可变区的框架区的核酸的表达。
可被选择用于人源化目的的天然人抗体重链可变区可具有以下的特性：a）包括具有与非人抗体的重链框架区至少70%同一的氨基酸序列的框架区，和；b）在重链CDR（例如，全部3个CDR）中具有与非人重链CDR氨基酸残基相同或基本上相同的（大量）氨基酸残基，同时可被选择用于人源化目的的天然人抗体轻链可变区可具有以下的特性：a）包括与非人抗体的轻链框架区至少70%同一的氨基酸序列的框架区，和；b）在轻链CDR（例如，全部3个CDR）中具有与非人轻链CDR氨基酸残基相同或基本上相同的（大量）氨基酸残基。天然人抗体可变区优选地具有与非人抗体可变区相似或相同（重合）的三维结构。
根据本发明，该方法可包括导入非人抗体的至少两个CDR的非人重链CDR氨基酸残基。因此生成人源化抗体或杂合抗体的方法中所用的核酸可编码非人抗体的至少2个CDR。因此生成人源化抗体或杂合抗体的方法中所表达的重链可变区可包括非人抗体的至少2个CDR。
可选地，方法可包括导入全部3个CDR的非人重链CDR氨基酸残基。因此生成人源化抗体或杂合抗体的方法中所用的核酸可编码非人抗体的全部3个CDR。因此生成人源化抗体或杂合抗体的方法中表达的重链可变区可包括非人抗体的3个CDR。
还根据本发明，所述方法可包括导入非人抗体的至少2个CDR的非人轻链CDR氨基酸残基。因此生成人源化抗体或杂合抗体的方法中所用的核酸可编码非人抗体的至少2个CDR。因此生成人源化抗体或杂合抗体的方法中所表达的轻链可变区可包括非人抗体的至少2个CDR。
可选地，所述方法可包括导入全部3个CDR的非人轻链CDR氨基酸残基。因此生成人源化抗体或杂合抗体的方法中所用的核酸可编码非人抗体的3个CDR。因此生成人源化抗体或杂合抗体的方法中所表达的轻链可变区可包括非人抗体的3个CDR。
利用本文所描述的方法，可有利地将包含SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2和SEQ ID NO：3的氨基酸序列的CDR输入到天然人重链可变区中。因此生成人源化抗体或杂合抗体的方法中所用的核酸可编码SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3。因此生成人源化抗体或杂合抗体的方法中所表达的轻链可变区可包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3。
利用本文所描述的方法，可有利地将包含SEQ ID NO：11、SEQID NO：12和SEQ ID NO：13的氨基酸序列的CDR输入到天然人重链可变区中。因此生成人源化抗体或杂合抗体的方法中所用的核酸可编码SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13。因此生成人源化抗体或杂合抗体的方法中所表达的轻链可变区可包含SEQID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13。
利用本文所描述的方法，可有利地将包含SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：5和SEQ ID NO：6的氨基酸序列的CDR输入到天然人轻链可变区中。因此生成人源化抗体或杂合抗体的方法中所用的核酸可编码SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。因此生成人源化抗体或杂合抗体的方法中所表达的轻链可变区可包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。
利用本文所描述的方法，可有利地将包含SEQ ID NO：14、SEQID NO：15和SEQ ID NO：16的氨基酸序列的CDR输入到天然人轻链可变区中。因此生成人源化抗体或杂合抗体的方法中所用的核酸可编码SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16。因此生成人源化抗体或杂合抗体的方法中所表达的轻链可变区可包含SEQID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16。
在另一方面，本发明关于用于生成人源化或杂合抗簇蛋白抗体的方法，所述方法可包括利用编码本文所描述的重链可变区的核酸转化宿主细胞。
适宜的重链可变区的示例性实施方案是非人抗体的那些，所述非人抗体可包括具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的氨基酸序列的3个CDR和具有与非人抗体的重链框架区至少70%同一的氨基酸序列的天然人抗体重链框架区。优选地，天然人抗体可包括与非人重链的CDR（例如，全部3个CDR）相同或基本上相同的（大量）重链CDR氨基酸残基。
适宜的重链可变区的示例性实施方案是非人抗体的那些，所述非人抗体可包括具有SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13的氨基酸序列的3个CDR和具有与非人抗体的重链框架区至少70%同一的氨基酸序列的天然人抗体重链框架区。优选地，天然人抗体可包括与非人重链的CDR（例如，全部3个CDR）相同或基本上相同的（大量）重链CDR氨基酸残基。
本发明的方法还可包括利用编码互补轻链的核酸转化宿主细胞。
如果需要的话，互补轻链可由与编码重链的相同的核酸来编码。
所述互补轻链可包括非人抗体的轻链可变区，其可包括具有SEQID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的氨基酸序列的3个CDR和具有与非人抗体的轻链框架区至少70%同一的氨基酸序列的天然人抗体轻链框架区。优选地，天然人抗体可包括与非人轻链的CDR（例如，全部3个CDR）相同或基本上相同的（大量）轻链CDR氨基酸残基。
所述互补轻链可包括非人抗体的轻链可变区，其可包括具有SEQID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16的氨基酸序列的3个CDR和具有与非人抗体的轻链框架区至少70%同一的氨基酸序列的天然人抗体轻链框架区。优选地，天然人抗体可包括与非人轻链的CDR（例如，全部3个CDR）相同或基本上相同的（大量）轻链CDR氨基酸残基。
在又一另外的方面，本发明涉及用于生成人源化或杂合抗簇蛋白抗体的方法，所述方法可包括利用编码轻链可变区的核酸转化宿主细胞。
适宜的轻链可变区的示例性实施方案是非人抗体的那些，所述非人抗体可包括具有SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的氨基酸序列的3个CDR和具有与非人抗体的轻链框架区至少70%同一的氨基酸序列的天然人抗体轻链框架区。优选地，天然人抗体可包括与非人轻链的CDR（例如，全部3个CDR）相同或基本上相同的（大量）轻链CDR氨基酸残基。
适宜的轻链可变区的示例性实施方案是非人抗体的那些，所述非人抗体可包括具有SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16的氨基酸序列的3个CDR和具有与非人抗体的轻链框架区至少70%同一的氨基酸序列的天然人抗体轻链框架区。优选地，天然人抗体可包括与非人轻链的CDR（例如，全部3个CDR）相同或基本上相同的（大量）轻链CDR氨基酸残基。
本发明的方法还可包括利用编码互补重链的核酸转化宿主细胞。
如果需要的话，互补重链可由与编码轻链相同的核酸来编码。
【抗体的药物组合物及其使用】
在另一方面，本发明涉及药物组合物，所述药物组合物可包括例如本文所描述的人源化抗体或杂合抗体，本文所描述的抗原结合片段或本文所描述的分离的抗体和药学上可接受的载体。
本发明的又一些方面涉及本文所描述的分离的抗体或抗原结合片段在疾病的治疗或诊断中的用途。
本发明的另外的方面涉及组合疗法，所述组合疗法包括本文所描述的药物组合物和化学治疗剂。
根据本发明，药物组合物可与化学治疗剂同时施用（可施用的）。
还根据本发明，药物组合物和化疗剂可以不同的时间间隔来施用（可施用的）。
又根据本发明，化疗剂可与抗体或抗原结合片段相缀合。
除活性成分外，药物组合物还可包含药学上可接受的载体，所述药学上可接受的载体包括水、PBS、盐溶液、明胶、油、醇类和可在药学上使用的有助于将活性化合物加工到制剂中的其它赋形剂和辅剂。在其它情况下，所述制剂可以是无菌的。
如本文所用，“药物组合物”意为治疗有效量的剂连同药学上可接受的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂和/或载体。如本文所用的“治疗有效量”指对于既定的病症和施用方案提供治疗作用的量。所述组合物是液体或冻干的或其它的干燥的剂型，且包括不同缓冲液内容物（例如，Tris-HCl、醋酸盐、磷酸盐）、pH和离子强度的稀释物，添加剂诸如白蛋白或明胶以防止表面的吸收，去垢剂（例如，吐温20、吐温80、Pluronic F68、胆汁酸盐）。增溶剂（例如，甘油、聚乙二醇），抗氧化剂（例如，抗坏血酸、偏亚硫酸氢钠），防腐剂（例如，硫柳汞、苯甲醇、对羟苯甲酸酯）、膨化物质或张力改良剂（例如，乳糖、甘露醇），聚合物诸如聚乙二醇与蛋白的共价结合，与金属离子的复合或材料掺入到聚合化合物诸如聚乳酸、聚羟基乙酸、水凝胶等的颗粒制剂其中或其上，或掺入到脂质体、微乳剂、微团、单层或多层囊泡、红细胞血影或原生质球上。所述组合物将影响物理状态、溶解度、稳定性、体内释放的速率和体内清除的速率。受控释放的或持续释放的组合物包括亲油性贮存药剂（例如，脂肪酸、蜡、油）。本发明还包括用聚合物（例如，泊洛沙姆）覆盖的颗粒组合物。本发明的组合物的另外的实施方案包括颗粒形式保护性包衣（coating）、蛋白酶抑制剂或渗透增强剂以用于多种施用途径，包括胃肠外途径、肺途径、鼻途径、口服途径、阴道途径、直肠途径。在一个实施方案中，药物组合物是胃肠外、癌旁、透粘膜、透皮、肌内、静脉内、皮肤内、皮下、腹腔内、心室内、颅内和瘤内施用的。
另外，如本文所用，“药学上可接受的载体”或“药学载体”是本领域中已知的，并包括但不限于0.01-0.1M或0.05M磷酸缓冲液或0.8%盐溶液。另外地，所述药学上可接受的载体可以是水成溶液或非水成溶液、悬浮液和乳液。非水成溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油诸如橄榄油和可注射有机酯类诸如油酸乙酯。水成载体包括水、醇/水成溶液、乳液或悬浮液，包括盐溶液和缓冲介质。胃肠外囊泡包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖（Ringer’s dextrose）、葡萄糖和氯化钠、乳酸盐林格氏溶液（lactated Ringer’s）或不挥发性油。静脉内载体包括流体和营养物补充物、电解质补充物诸如基于林格氏葡萄糖的那些，和类似的载体。还可存在防腐剂和其它添加剂，例如，抗菌剂、抗氧化剂、整理剂、惰性气体和类似物。
本发明中使用的药物组合物可通过任何数量的途径来施用，所述途径包括但不限于口服方式、静脉内方式、肌内方式、动脉内方式、髓内方式、鞘内方式、心室内方式、透皮方式、皮下方式、腹膜内方式、鼻内方式、肠内方式、局部方式、舌下方式或直肠方式。
用于本公开内容的目的的术语“治疗”指治疗性治疗和预防性或防护性措施，其中目的是为了防止或减慢（减少）目标病理性病症或疾患。需要治疗的那些个体包括已患有疾患的那些个体和易于患有疾患的那些个体或其中的疾患待防止的那些个体。
抗体或抗原结合片段可在多种疾病的治疗中具有治疗性应用。在某些实例中，抗体或抗原结合片段可与表达目标抗原相互作用并通过介导ADCC诱导免疫反应。在其它实例中，抗体和片段可阻滞抗原与其蛋白伴侣的相互作用。在又一些另外的实例中，抗体或片段可封闭抗原。
“化学治疗剂”是用于治疗癌症的化合物。化学治疗剂的实例包括烷化剂诸如塞替派（thiotepa）和环磷酰胺；烷基磺酸盐诸如白消安、英丙舒凡（improsulfan）和哌泊舒凡（piposulfan）；氮丙啶类诸如苯佐替派（benzodopa）、卡波醌、美妥替哌（meturedopa）和乌瑞替派（uredopa）；乙撑亚胺和甲基戊胺（methylamelamine），包括六甲蜜胺、三乙撑蜜胺、三乙撑磷酰胺、三乙撑硫代磷酰胺和三羟甲基三聚氰胺（trimethylolomelamine）；氮芥，诸如苯丁酸氮芥、萘氮芥、环磷鱿胺、雌莫司汀、异环磷既胺、双氯乙基甲胺、盐酸氧化双氯乙基甲胺、美法仑、novembiehin、苯芥胆固醇、泼尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲，如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀；杭生素，如阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素、偶氮丝氛酸、博来霉素、放线菌素C、加利车霉素、卡柔比星、洋红霉素、嗜癌素、久莫霉素、放线菌素D、柔红霉素、地托比星、6-二嗪-5-氧-L-正亮氮酸、阿霉素、表阿霉素、依索比星、idambicin、麻西罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、绛色霉素、链脲霉素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢物，如氨甲喋呤和5-氟尿嘧啶（5-FU）；叶酸类似物，如二甲叶酸、氨甲喋吟、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，如环胞苷、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷、5-FU；雄激素，诸如卡鲁睾酮、丙酸屈他雄酮、表硫雄醇、美雄氨、睾内酯；杭肾上腺素，诸如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，诸如如亚叶酸（frolinic acid）；醋葡醛内醋；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶；bestrabucil；比生群；依达曲沙；defofamine；地美可辛；地吖醌；依氟鸟氨酸；醋酸羟吡咔唑；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；胺硝吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；鬼臼酸；2-乙基酰肼；甲基苄肼；PSK7；丙亚胺；西佐喃；锗螺胺；细格孢氮杂酸；三亚胺醌；2,2’,2’-三氯三乙胺；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；呱泊溴烷；gacytosine；阿拉伯糖苷（“Ara-C”）；环磷酰胺；硫替哌；紫杉烷，例如紫杉醇和紫杉萜;苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；氨甲喋呤；铂类似物，如顺铂和卡铂；长春碱；铂；表鬼臼毒吡喃葡糖苷（VP-16）；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞宾；异长春花碱（navelhine）；三羟基蒽醌；表鬼臼毒噻吩糖苷；柔红霉素；氨基蝶呤；希罗达（xeloda）；伊拜膦酸盐；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸（DMFO）；视黄酸；埃斯波霉素；卡培他滨（capecitabine）；和上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。该定义还包括用来调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，如抗雌激素，包括如他莫昔芬、雷洛昔芬、芳香酶抑制4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、雷洛昔芬（keoxifene）、LY117018、奥那司酮（onapristone）和托瑞米芬（Fareston）；和抗雄激素，诸如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺（bicalutamide）、亮丙立德和戈舍瑞林；和上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
【抗体缀合物】
可将本发明的抗体或抗原结合片段与可检测部分（即，用于检测或诊断目的）或与（用于治疗目的的，例如化学治疗剂）治疗性部分缀合。
“可检测部分”是通过分光镜法、光化学方法、生物化学方法、免疫化学方法、化学方法和/或其它物理方法可检测的部分。利用本领域中熟知的方法可将可检测部分与本发明的抗体和抗原结合片段直接地和/或间接地结合（例如通过连接，例如但不限于DOTA或NHS连接）。可使用多种可检测部分，选择依赖于所需要的敏感度、缀合的容易、稳定性条件和可获得的仪器装置。适宜的可检测部分包括但不限于荧光标记、放射性标记（例如，不限于125I、In111、Tc99、I131和包括用于PET扫描器等的正电子发射同位素）、核磁共振活性标记、发光标记、化学发光标记、生色团标记、酶标记（例如且不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等）、量子点和纳米颗粒。可检测部分可导致和/或产生可检测信号，从而允许检测到来自可检测部分的信号。
在本发明的另一个示例性实施方案中，治疗性部分（例如，药物、细胞毒性部分）可结合（修饰）抗体或其抗原结合片段。
在一个示例性实施方案中，抗体和抗原结合片段可包括化学治疗剂或细胞毒性剂。例如，可将抗体和抗原结合片段与化学治疗剂或细胞毒性剂缀合。除在本申请中其它地方所列的那些之外，所述化学治疗剂或细胞毒性剂包括但不限于钇-90、钪-47、铼-186、碘-131、碘-125和由本领域中的技术人员所认识的许多其它的（例如，镥（例如，Lu177）、铋（例如，Bi213）、铜（例如，Cu67））。在其它的实例中，化学治疗剂或细胞毒性剂除本领域中的技术人员已知的其它之外可包括，5-氟尿嘧啶、阿霉素、依立替康（irinotecan）、紫杉烷类、假单胞菌内毒素、蓖麻毒素和其它毒素。
可选地，为进行本发明和本领域中已知的方法，本发明的抗体或抗原结合片段可用于与能够特异性地结合本发明的抗体或抗原结合片段且能够携带需要的可检测部分、诊断性部分或治疗性部分的第二分子（例如，二级抗体等）相组合。
【治疗的方法】
本发明的另一方面涉及降低表达簇蛋白的癌细胞的生长或减小包含簇蛋白表达细胞的肿瘤的体积的方法。所述方法可包括例如向有需要的哺乳动物施用抗簇蛋白抗体诸如多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、分离的人抗体、杂合抗体和其片段。
该方法还可包括施用化学治疗剂。
本发明在其另一方面还涉及治疗与增高的簇蛋白表达或分泌相关的疾病的方法。该方法可包括向有需要的哺乳动物施用本文所描述的人源化抗体或杂合抗体、本文所描述的抗原结合片段或本文所描述的分离的抗体。
可受益于所述治疗的方法的有需要的哺乳动物可包括例如患有癌症的哺乳动物、具有升高的簇蛋白水平的哺乳动物、具有增高的血浆或血液簇蛋白的水平的哺乳动物、携带或易于携带能够上皮-间充质转化的细胞的哺乳动物、患有与增高的簇蛋白（前簇蛋白或分泌的簇蛋白）的水平或簇蛋白表达或分泌（包括血液或血浆簇蛋白）相关的疾病的哺乳动物等。
本发明的另一方面涉及本文所描述的人源化抗体或杂合抗体、本文所描述的抗原结合片段或本文所描述的分离的抗体在生产用于治疗与簇蛋白表达或分泌相关的疾病的的药物中的用途。
【试剂盒和测定】
在又一另外的方面，本发明提供了包括一个或多个小瓶的试剂盒，所述小瓶可包括例如本文所描述的人源化抗体或杂合抗体、本文所描述的抗原结合片段或所描述的分离的抗体。所述试剂盒可用于检测目的或用于治疗目的。
在另一个示例性实施方案中，所述试剂盒可包括本文所描述的分离的核酸或本文所描述的载体。所述试剂盒可在检测互补核酸、表达其编码的蛋白或其它中具有用途。
因此本发明还涉及通过将含有或怀疑含有簇蛋白的样品与本文所描述的人源化或人抗体、本文所描述的抗原结合片段或所描述的分离的抗体相接触来检测簇蛋白（前簇蛋白和分泌的簇蛋白）的方法。检测利用具有可检测抗原与抗体的结合的适当的探测器的装置来进行（例如，BIAcoreTM、酶标仪、分光光度计，等）。所述装置可装配有计算机系统。
如本文所用，术语，关于可变区的“与其相似或重合的三维结构”意为利用计算机化的模型后，特定的可变区具有以另一可变区相似的方式允许抗原结合位点暴露的构象。当可变区氨基酸的计算机化的代表在空间上占据与另一可变区的对应的氨基酸相似的位置时，认为可变区是可重合的。
如本文所用，术语“做模型的可变区”意为获自密切相关的抗体可变区的已知三维立体结构的可变区的计算机化的代表。
如本文所用，术语，“非人”非限制性地包括啮齿类（例如，小鼠、大鼠等）、兔或非人灵长类等。
如本文所用，术语“非人互补性决定区氨基酸残基”因此意为来源于非人，通常是啮齿动物诸如小鼠的互补性决定区的氨基酸残基。
如本文所用，术语“非人亲本抗体”因此包括获自非人的抗体，其用作人源化过程的起始物质。
术语“转化宿主细胞”包括本领域中已知的用于将需要的核酸转移或导入到宿主细胞中的一些技术。所述技术包括但不限于转染、感染、脂质转染、注射、转导、细胞核转染、电穿孔、声穿孔、热休克、磁转染等。
关于非人重链或轻链CDR氨基酸残基的术语“输入”包括物理方法或计算机化的方法，例如，克隆技术、核酸或蛋白的化学合成、计算机生成的人源化抗体等。如本文所用的关于氨基酸的数量的术语“基本上相同”，意为+/-3个氨基酸的差异或优选地+/-2个氨基酸或甚至更优选地+/-1个氨基酸的差异可以是容许的。
【实施例1-通过设计抗簇蛋白小鼠单克隆抗体进行人源化】
【小鼠16B5单克隆抗体的可变区的3D建模】
该工作可易于通过以下来实现：将2个不同的小鼠抗体（分别为蛋白数据库（Protein Data Bank）（PDB）编码1Q9Q和1TY7）的可获得的晶体结构中的3个轻链残基和7个重链残基突变，然后通过重合模板结构进行轻链和重链的组装。CDR-H3环的部分以另一抗体结构（PDB编码1UJ3，人源化抗体）为基础，其也对16B5的重链具有高度序列相似性，但不同于小鼠模板结构，表现出对CDR-H3环的相同的长度。所得的结构利用AMBER力场通过能量最低化来精化，且然后用于随后的分析。在小鼠16B5序列对可获得的结构模板的高度同源性的条件下，所得同源性模型的优良品质是在此期望的。虽然如此，在平行对照同源性建模实验中获得了相当的结构，其中我们通过使用普通3D同源性建模程序如Modeller或Composer、或如WAM软件中实现的抗体专用的3D同源性建模构建了小鼠16B5可变区模型。图1中给出了小鼠16B5抗体的用作模型的可变区的代表。
【16B5源供体（小鼠）氨基酸序列的表征和作为模型的结构】
进行该步骤以评估人化指数，以描绘CDR、规范的残基、链内包装（VH/VL界面残基）、可变区/恒定区包装（VH/CH和VL/CL界面残基）、罕见框架残基、潜在的N-和O-糖基化位点隐蔽残基、Vernier区残基和与CDR的接近。使用网络上可获得的资源和本地软件评价这些性质。
【用于小鼠CDR的最佳人轻链和重链框架的选择】
通过针对人种系数据库（VBASE）的本地拷贝、针对其它序列文库（Genbank和SwissProt）乙基人框架共有序列的组的标准序列同源性比较来进行最佳人轻链和重链框架的选择。进行BLAST搜索以检索仅在框架区中（因此排除CDR）具有最高同源性并匹配CDR环的长度的心序列匹配。使与从PDB鉴定的16B5可变序列最相似的人或人源化可变序列的结构在用于结构比较的16B5可变区的用作模型的结构上重合。最初保留了一些最相似的人框架序列以评价用于突变的候选位置处的氨基酸可变性，以及在人源化后亲和力丧失的事件中提供作为备份的混合的适宜的框架区序列。将最密切的人框架区序列与图2中的鼠类16B5序列进行比对。
【鉴定能够影响构象和抗原结合的小鼠框架残基】
鉴定能够影响构象和抗原结合的小鼠框架残基是重要的步骤，该步骤以特别的注意标记了应当被突变为对应的人序列的氨基酸残基。在亲和力丧失的情况下这些残基代表回复突变为小鼠序列的主要候选物。这是通过设计进行人源化最困难的和不可预测的步骤，尤其是在缺少抗体-抗原复合物的实验结构情况下。该步骤依赖于以下种类的一个或多个中的残基的鉴定：规范（canonical）的残基、CDR-H3残基、Vernier区残基、罕见的残基、CDR-接近的（
Figure BDA00001676566400561
内）残基、链内包装残基和糖基化位点残基。这些残基可能直接地或间接地影响抗原结合位点和亲和力。16B5抗簇蛋白mAb的最终人源化序列需要相对于鼠类序列的轻链中的13个框架突变和重链中的22个框架突变，而不改变CDR区。惊人的是，严密的结构和比较序列分析表明了导入全部这些突变而保留高抗原结合亲和力从而以通过CDR移植技术实现所允许的人源化最高程度为目标的高度可能性（即，100%，排除CDR）。所设计的人源化抗体的3D建模支持了该预测。虽然如此，我们已鉴定了用于回复突变的候选残基，包括CDR-接近残基（来自CDR的
Figure BDA00001676566400562
内的轻链中的3个和重链中的9个），与重链接触的一个轻链残基，以及可转化其回复到小鼠序列的一些隐蔽残基（且因此可能为非免疫原性的）（轻链中的4个和重链中的6个）。用于回复突变的突变残基和候选残基示于图1和图2中。
【另外的结构分析】
在提交用于重组表达的人源化序列之前，另外的结构分析包括信号肽的选择、同种型的选择和可变区/恒定区连接处的结构相容性的分析。此外，小鼠抗体和人源化抗体之间的链内包装和可变区/恒定区包装的比较性分析表明在16B5人源化情况中，生成将人源化和嵌合的（小鼠可变区）链组合的杂合抗体是可行的，即，作为轻链/重链配对的小鼠/小鼠（M/M）、小鼠/人源化（M/H）、人源化/小鼠（H/M）和人源化/人源化（H/H）。选择用于抗簇蛋白抗体的同种型是人IgG2。人IgG2不具有有效的效应器作用，其是阻滞抗体的标志，如本文所公开的那些。此外，人IgG2对蛋白水解性裂解较不敏感，其使在体内提供该同种型的抗体更加稳定。
【小鼠21B12单克隆抗体的可变区的3D建模】
根据上述关于16B5的教导进行21B12小鼠抗簇蛋白抗体的建模。所得的人源化21B12是100人源化，且需要重链中的18个突变和轻链中的14个突变。突变的残基和用于回复突变的候选残基示于图7和图8中。
【实施例2.抗簇蛋白抗体的动力学分析】
这些研究的目的是确定抗簇蛋白抗体的动力学参数。尤其是，为确定16B5和21B12抗簇蛋白单克隆抗体的人源化是否影响其与人簇蛋白的结合的动力学参数，为此目的，利用BIAcore 3000开发了动力学分析方法。将人簇蛋白固定在探测芯片上。注射全长的抗体或Fab片段并允许其与固定的簇蛋白相互作用。该实施例描述了示例性抗体16B5，但21B12示例性抗体以相似的方式制备和检验。
【簇蛋白的固定】
将HBST（10mM Hepes pH 7.4，135mM NaCl，3.4mM EDTA，0.005%吐温20）用作用于所有BIAcore实验的电泳缓冲液。利用常规胺偶联方法以5μl/分钟的流速将重组单聚簇蛋白固定在CM3芯片上。用35μl的50mM NHS/0.2M EDC的混合物活化表面。注射含簇蛋白的10mM醋酸钠pH 4.5直到捕捉需要的量（60RU以下）。利用35μl的1M乙醇胺盐酸盐-NaOH pH8.5使未反应的酯失活。通过以相同的方式注射NHS/EDC和乙醇胺制备对照表面。
【人源化抗簇蛋白IgG2抗体的制备】
利用本领域中的技术人员熟悉的瞬时转染方法在293细胞中表达含有编码轻链和重链免疫球蛋白的cDNA的表达载体。根据在两个免疫球蛋白链的氨基末端掺入的信号肽，从细胞的无血清培养基中收获成熟的IgG2。转染后继续使细胞生长5天，然后收获培养基以纯化IgG2嵌合单克隆抗体。按照生产商的说明（Sigma-Aldrich CanadaLtd.,Oakville,ON）利用蛋白-A琼脂糖纯化蛋白。
【小鼠16B5和HH 16B5Fab的制备】
在室温下用木瓜蛋白酶以1:100的摩尔比率处理小鼠16B5IgG4小时。通过添加4:1比率的木瓜蛋白酶抑制剂E64停止消化。通过在1ml HiTrap蛋白G柱上进行层析将Fab片段与Fc片段分离。用0.1M甘氨酸pH 2.7从柱上洗脱Fab片段。立即通过将1ml级分收集到含有100μl的2M Tris，pH9的管中中和pH。混合含有Fab的级分并以30kDa分子量截断在Amicon Ultra 4离心浓缩器上浓缩。使样品在20mM HEPES，pH 7.5、200mM NaCl中通过Superose 12体积排阻柱（10×300mm）以分离Fab级分和F(ab’)2级分。混合含有Fab的级分并以30kDa分子量截断在Amicon Ultra 4离心浓缩器上浓缩。
对于制备HH 16B5Fab，方案与小鼠Fab的非常相似，不同的是消化时间是室温下20小时，和Fab和Fc片段在HiTrap蛋白A柱上分离而非HiTrap蛋白G柱。根据来自小规模检验的结果提高消化时间以消除F(ab’)2的存在。体积排阻谱显示较长的消化降低了F(ab’)2片段的存在，但没有完全将其消除。进行蛋白A而非蛋白G的转换避免了将Fab片段暴露于从蛋白G洗脱Fab片段所需的低pH。Fab片段流经蛋白A柱且Fc片段由蛋白A保留。在PBS而非HEPES缓冲液中进行体积排阻分离。使用相同的方法来制备21B12Fab片段。
【小鼠16B5和HH16B5和Fab的动力学分析】
以50μl/分钟进行动力学分析。全长抗体（小鼠或人源化）或Fab稀释于HBST中。全长抗体的浓度范围为1.953-31.25nM和Fab为15.625-250nM。在簇蛋白和对照表面上注射每个浓度，持续5分钟，然后进行5分钟解离洗涤。用50μl的20mM HCl在每个抗体注射之间重新生成簇蛋白表面。
【抗原与簇蛋白的结合的动力学分析】
图3总结了获自16B5全长抗体和Fab抗簇蛋白抗体的动力学参数的确定的结果。
全长人源化16B5（HH16B5）的动力学参数与全长小鼠抗体（16B5）的动力学非常相似，表明人源化没有影响抗体与簇蛋白的结合。然而，人源化16B5Fab（HH16B5）的动力学参数比Fab小鼠抗体（16B5Fab）的动力学稍微较好，再次表明人源化没有影响抗体与簇蛋白的结合。固定的人簇蛋白和小鼠16B5或人源化16B5之间的相互作用的KD在低的nM范围中。所开发的方法可用于在抗簇蛋白抗体的人源化过程中比较动力学参数。
图9总结了获自21B12全长抗体和Fab抗簇蛋白抗体的动力学参数的确定的结果。如关于16B5所描述，21B12的人源化（HH21B12）导致了与亲代小鼠21B12抗体相似的结合参数。固定的人簇蛋白和小鼠21B12或人源化21B12之间相互作用的KD在低的nM范围内。所开发的方法可用于在抗簇蛋白抗体的人源化过程中比较动力学参数。
【实施例3.基于细胞的测定中的h16B5的生物学活性】
进行这些研究以比较h16B5与小鼠16B5的生物学活性。为检验h16B5，使用了两种测定，所述两种测定先前已显示用单克隆抗体阻滞簇蛋白可能降低癌细胞系的迁移和侵袭。
为检验抗簇蛋白抗体针对癌细胞迁移的活性，使用了标准创伤愈合或划痕测定。在该测定中，将小鼠乳腺癌细胞系，EMT6细胞，以高密度接种并通过在细胞层创建划痕使其经受创伤。在时间0，宽的裸露区域是明显的，其在37℃下赋予细胞15小时后迅速填满（参见图4中的左上图）。在商业的抗簇蛋白多克隆（C-18,Santa CruzBiotech,Santa Cruz,CA）或从原始杂交瘤中纯化的小鼠16B5存在下赋予细胞导致了裸露的区域中的降低的细胞数量（参见图4中的右上图，标记为商业和杂交瘤16B5）。将创伤的EMT6细胞与嵌合的16B5（参见图4下图MM）、含嵌合轻链和人源化重链的杂合抗体（参见图4下图MH）、含有嵌合重链和人源化轻链的杂合抗体（参见图4下图HM）或完整的人源化16B5（参见图4下图HH）一起孵育也奥旨了对细胞迁移到裸露的区域中的阻滞。事实上，人源化16B5表现为最有效的抑制剂。此外，嵌合的和小鼠-人杂合抗体抑制迁移的能力显示了与簇蛋白的相互作用是相同的，而与16B5抗体中含有哪个免疫球蛋白链无关。
然后我们确定了其它细胞系诸如人前列腺PC3和DU145细胞系，其分泌不同水平的内源性的簇蛋白，可通过h16B5在其侵袭行为中受到影响和生长。当接种于基质胶中时（图5，左上图），PC3肿瘤细胞系表现出放射状形态，且突出生长到基质胶中，该特征与增高的侵袭潜力有关（Thompson等,1992）。用h16B5处理（图5，右上图）显著降低了放射状形态，有力地表明了簇蛋白分泌有助于PC3细胞的侵袭表型。DU145细胞没有表现出在PC3细胞中观察到的放射状形态，而是在基质胶中形成球样结构（图5，左下图），其似乎在h16B5存在下更小和数量上更少（图5，右下图）。这些结果显示h16B5降低癌细胞系的侵袭潜力的能力与原始小鼠16B5相当，并显示人源化过程未改变抗体与分泌的簇蛋白相互作用并阻滞其活性的能力。
获得了来自4个不同的人胰腺癌细胞系的肿瘤，将其在福尔马林中固定、在石蜡中包埋并在玻璃载玻片上切片。用h16B5抗体进行免疫组织化学以确定来源于该癌症适应症的肿瘤表达簇蛋白。肿瘤来源于Aspc-1、BxPC-3、PANC-1和MiaPaCa-2，其全部来源于胰腺癌患者（ATCC,Manassas,VA）。将石蜡包埋的上皮胰腺肿瘤样品置于玻璃载玻片上并在50℃下固定15分钟。脱蜡通过用二甲苯处理2次来进行，然后脱水在100%、80%和70%乙醇中进行连续的5分钟洗涤。在PBS中洗涤载玻片2次5分钟并用抗原修复溶液（柠檬酸盐-EDTA）处理以暴露抗原。通过用含H2O2的甲醇孵育载玻片而去除内源性过氧化物反应性物质，并通过在室温下用无血清的封闭溶液（Dakocytomation）孵育载玻片20分钟进行封闭。添加5μg/ml的一级mAb（对照IgG或h16B5），在室温下持续1小时。通过用生物素缀合的人抗κ孵育，然后用链酶亲和素-HRP三级抗体孵育来检测H16B5反应性簇蛋白。通过用DAB-过氧化氢底物处理载玻片，持续少于5分钟并随后用苏木素复染色来显示阳性染色。如图11中所示，全部4个肿瘤对于簇蛋白表达被染色为阳性（参见图11中的右图）。有趣地是，已知对化疗具有抗性的肿瘤（PANC-1和MisPaCa-2）含有最高水平的分泌的簇蛋白。如关于前列腺癌细胞系所描述的（参见上文）在基质胶中培养PANC-1细胞系并使其生长。用TGFβ刺激细胞，并将上皮-间充质转化的诱导物和导致细胞迁移穿过膜的生长因子加入到基质胶中（参见图12，右上图）。当用h16B5处理受刺激的细胞时，严重抑制了迁移（图12，右下图）。该结果表明h16B5可阻滞胰腺癌细胞的迁移，并显示抗体在该癌症适应症中可能具有治疗性活性。
【实施例4.癌症的动物模型中的h16B5的生物学活性】
进行这些研究以测量h16B5在人癌症模型中的体内效力。已报道在前列腺癌异种移植物中靶向簇蛋白的反义寡核苷酸和小干扰RNA在体外诱导凋亡和化学敏感性[1-4]。所用的模型系统包括DU145人前列腺癌细胞系，其为雄激素不敏感的并代表该疾病的最良好表征的模型之一。因而，将2×106个细胞皮下移植到SCID小鼠的侧腹中，并允许肿瘤生长至约100mm3。在第1天起始，以5mg/kg的剂量腹膜内（i.p.）注射h16B5，并自第4天，以10mg/kg的剂量腹膜内注射泰索帝（TxT）。h16B5注射每周持续两次，而TxT每周施用。如图6中所描绘的，与对照相比在接受h16B5治疗的动物中（原发性）肿瘤的生长显著减小了。该作用发生于单一治疗组（将对照与h16B5相比较，P=0.0104）和与TxT的组合中（将TxT与h16B5+TxT相比较，P=0.0395）。该结果显示用h16B5阻滞簇蛋白导致肿瘤生长减小并增高了肿瘤对TxT的化学敏感性。
在不同的肿瘤模型中通过移植PC-3前列腺癌细胞进行了第二个前列腺癌模型研究。PC-3细胞也是激素不敏感的但据报道比DU145细胞稍微更具有侵袭性。如上所述，将细胞皮下移植到SCID小鼠中并当肿瘤生长至约100mm3的体积时开始处理（命名为第1天）。在第1天以5mg/kg腹膜内施用h16B5注射并每周继续两次，此后在第5天以10mg/kg腹膜内施用单独的TxT注射。进行该TxT方案的修改，因为发现PC-3细胞与DU145肿瘤相比较对该化学治疗药物显著更敏感。
图10中描绘了该研究的结果。如前，观察到单独接受h16B5的动物中的肿瘤与未处理的动物相比较对抗体具有几乎立即的应答。在第43天发现h16B5处理组中的平均肿瘤体积的显著下降导致与对照组相比较37%下降。还监测了存活，并观察到在对照组中无留下的动物时（第43天），在AB016B5处理组中60%以上的小鼠为存活的。该整体存活的增加转化为接受h16B5的动物中的47%的增加。
观察到了TxT针对前列腺癌细胞的细胞毒性作用，但注射后约18天肿瘤表现出从该处理中的恢复。TxT组中的肿瘤的生长甚至超过了接受AB-16B5的组中的肿瘤（参见第50天，图10）。然而，h16B5与TxT的组合显著减慢了肿瘤的生长，导致与单独的TxT组相比较肿瘤小了41%。而且，h16B5的存在延长了动物的存活，总之，来自这些体内研究的结果表明抑制分泌的簇蛋白的功能的h16B5人源化抗体能够显著地减慢实体瘤的生长。
【实施例5.H16B5在癌细胞中能够抑制分泌的簇蛋白的内化】
以上公开的结果表明上皮-间充质转化的诱导导致癌细胞分泌簇蛋白。另外，我们的数据还显示了这些癌细胞分泌的簇蛋白是有效的EMT诱导物。这些发现暗示了分泌的簇蛋白在间接地通过与胞外基质中的其它肿瘤相关因子相互作用或直接地通过与癌细胞的细胞表面上的受体相互作用来接到该作用。虽然已知正常血清中存在的分泌的簇蛋白与许多不同的蛋白结合，诸如完整级联反应的成员、瘦素、各种载脂蛋白，但癌细胞中或肿瘤微环境中分泌簇蛋白的蛋白伴侣的存在仍相对未经探索。一些实例包括由Jo和同事公开的报道（Jo等,2008），其显示了通过血清撤除在压力条件下肿瘤分泌簇蛋白与IGF-1结合。并且，发现前列腺癌细胞系中所含的簇蛋白与称作COMMD1的蛋白相互作用（Zoubeidi等,2010）。该相互作用导致了NF-κB-相关途径的增高的激活，其进而促进前列腺癌细胞存活。这些发现开始在某些程度上揭示分泌的簇蛋白可能有助于肿瘤发生但其促进EMT的分子机制是未知的。
为开始解决该问题，进行了基于细胞的实验以确定分泌的簇蛋白是否与直接地或精油细胞培养基中的其它分泌因子与癌细胞相互作用。为了对此进行测量，将分泌的簇蛋白进行荧光标记并与BRI-JM01小鼠乳腺癌细胞一起孵育。发现在处理约24小时之后，细胞内部含有荧光信号。在较短的时间点对这些细胞的分析显示荧光标记的分泌的簇蛋白被细胞内化（参见图13）。如所示，内化以受体介导的胞吞途径相一致的方式随时间增加。而且，在在沿着胞内体途径被内化的蛋白中常观察到24小时之后的斑点和核周类型的染色（参见图13的白色箭头）。在DU145人前列腺癌细胞中观察到了相似的结果。
通过检验是否h16B5可阻滞该活性来进一步检查该分泌的簇蛋白内化。在h16B5或同种型对照IgG存在下用分泌的簇蛋白-Alexa480处理细胞。如所示，在图14中，分泌的簇蛋白内化到JM01细胞中通过添加h16B5来阻滞。在用对照IgG处理的细胞中人观察到了分泌的簇蛋白的内部核周染色（参见图14中的白色箭头）。
综合而言，这些结果显示了分泌的簇蛋白的内化可通过添加h16B5来抑制，表明这可能是抗体阻止分泌的簇蛋白在癌细胞中介导EMT的机制之一。
可进行本文所描述的实验以确定抗体的氨基酸序列（例如，可变区、恒定区、框架区中或CDR中）的特定的突变是如何影响抗体的生物学活性的。例如，可将一个或多个突变导入到h16B5（或在鼠类16B5中）的可变轻链或可变重链的框架区中并如本文所描述的评估肿瘤生长。
不同的抗体和抗原结合片段与人或鼠类簇蛋白的结合可通过本领域中已知的一些方法来检验，例如，例如，ELISA、蛋白质印迹、质子表面共振等。
【实施例6.抗簇蛋白抗体可与簇蛋白变体结合】
本发明的抗体和抗原结合片段与簇蛋白的人和鼠类形式两者结合。这两种蛋白共有77%氨基酸序列同一性和89%相似性（参见图15）。通过比较鼠类和人形式的氨基酸序列，可理解抗体可能结合存在于两种蛋白中的线性的或构象的表位。期望地是，抗体和抗原结合片段可与同人或鼠类簇蛋白具有至少75%（包括80%、85%、90%、95%、99%、100%）氨基酸同一性其它天然存在的变体以及合成的变体（包括重组蛋白）结合。例如，抗体和抗原结合片段可结合具有包含SEQ ID NO：56（其中+代表氨基酸置换、例如例如保守氨基酸置换）或SEQ ID NO：57的氨基酸序列的簇蛋白变体。
本发明显示了抗簇蛋白抗体靶向表达于人肿瘤中的簇蛋白。为证实抗簇蛋白抗体诸如h16B5与鼠类肿瘤簇蛋白的相互作用，用h16B5孵育从4T1小鼠乳腺肿瘤中制备的冷冻切片。简言之，用冰冻的丙酮固定冷冻切片10分钟并用商业上可获得的试剂盒（Dako Canada,Inc.,Burlington,ON）中提供的试剂封闭非特异性结合。在5μg/ml的浓度下将H16B5与小鼠肿瘤切片孵育1小时。洗涤之后，通过用HRP-缀合的抗人IgG孵育来显示特异性染色。以与人同种型对照IgG相同的方式处理对照样品。如图16中所示，如通过从辣根过氧化物染料中得到的棕色染色所证明的，h16B5在4T1肿瘤中检测到鼠类簇蛋白（参见右图，标记为4T1-AB-16B5）。对照抗体并未显示出任何抗原（参见左图，标记为4T1-ctl）。如通过h16B5所显示的，该结果表明抗簇蛋白抗体与表达于小鼠肿瘤中的鼠类簇蛋白相互作用。并且，利用免疫荧光的其它研究显示了h16B5检测到表达于另一小鼠乳腺癌细胞系BRI-JM01细胞中的鼠类簇蛋白。
本发明的抗体和抗原结合片段与天然存在的变体或合成的簇蛋白的变体的结合还可通过本领域中已知的方法来检验，包括例如以上所述的方法。
CLU基因在人、黑猩猩、狗、牛、小鼠、大鼠、鸡和斑马鱼中是保守的。本发明包括在这些模型中检验抗体和抗原结合片段。
【序列表】
【SEQ ID NO：1】
16B5CDRH1:GFNIKDIYMH
【SEQ ID NO：2】
16B5CDRH2:RIDPAYGNTKYDPKFQG
【SEQ ID NO：3】
16B5CDRH3:RYDTAMDY
【SEQ ID NO：4】
16B5CDRL1:KSSQSLLNSRTRKNYLA
【SEQ ID NO：5】
16B5CDRL2:WASTRES
【SEQ ID NO：6】
16B5CDRL3:KQSYNLWT
【SEQ ID NO：7】
16B5人源化重链可变区
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【SEQ ID NO：8】
16B5人源化轻链可变区
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【SEQ ID NO：9】
h16B5的完整的重链免疫球蛋白序列
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【SEQ ID NO：10】
h16B5的完整的轻链免疫球蛋白序列
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【SEQ ID NO：11】
21B12CDRH1:GYTFTNYGMH
【SEQ ID NO：12】
21B12CDRH2:WINTYTGEPTYADDFKG
【SEQ ID NO：13】
21B12CDRH3:DGFLYFFDY
【SEQ ID NO：14】
21B12CDRL1:KSSQSLLYSSNQKNYLA
【SEQ ID NO：15】
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【SEQ ID NO：16】
21B12CDRL3:QQYYIYPRT
【SEQ ID NO：17】
21B12人源化重链可变区
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【SEQ ID NO：18】
21B12人源化轻链可变区
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【SEQ ID NO：19】
h21B12的完整的重链免疫球蛋白序列
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【SEQ ID NO：20】
h21B12的完整的轻链免疫球蛋白序列
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【SEQ ID NO：21】
h16B5的重链的完整的核苷酸序列
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【SEQ ID NO：22】
h21B12的重链的完整的核苷酸序列
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【SEQ ID NO：23】
h16B5的轻链的完整的核苷酸序列
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【SEQ ID NO：24】
h21B12的轻链的完整的核苷酸序列
ATGGTGCTGCAGACCCAGGTGTTCATCTCCCTGCTGCTGTGGATCTCTGGCGCCTACGGCGACATCGTGATGACCCAGTCCCCCGACTCTCTGGCTGTGTCCCTGGGCGAGCGGGCCACCATCAACTGCAAGTCCTCCCAGTCCCTGCTGTACTCCTCCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCCAGCCTCCTAAGCTGCTGATCTACTGGGCCTCCACCCGGGAATCTGGCGTGCCTGACCGGTTCTCCGGCTCTGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCTCCCTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTACTACATCTACCCTCGGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAGCGGACCGTGGCCGCTCCTTCCGTGTTCATCTTCCCCCCTTCCGACGAGCAGCTGAAGTCCGGCACCGCCTCTGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGTCCGGCAACTCCCAGGAATCCGTCACCGAGCAGGACTCCAAGGACTCTACCTACTCCCTGTCCTCCACCCTGACCCTGTCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAAGTGACCCACCAGGGCCTGTCCTCTCCCGTGACCAAGTCCTTCAACCGGGGCGAGTGCTGA
【SEQ ID NO：25】(鼠类16B5VL)
DIVMSQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCKQSYNLWTFGGGTKLEFK
【SEQ ID NO：26】(h16B5VL共有序列1)
DIVMXQSPXSLAVSXGEXXTXXCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQXPKLLIYWASTRESGVPDRFXGSGSGTDFTLTISSXQAEDXAVYYCKQSYNLWTFGXGTKLEXK;
X是与SEQ ID NO：25中列出的多肽中的对应的氨基酸相比较的一个氨基酸置换。
【SEQ ID NO：27】(h16B5VL共有序列2)
DIVMXa1QSPXa2SLAVSXa3GEXa4Xa5TXa6Xa7CKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQXa8PKLLIYWASTRESGVPDRFXa9GSGSGTDFTLTISSXa10QAEDXa11AVYYCKQSYNL-WTFGXa12GTKLEXa13K
Xa1是中性亲水性氨基酸，例如T或S；
Xa2是D或S；
Xa3是疏水性氨基酸，例如L或A；
Xa4是碱性氨基酸，例如R或K；
Xa5是疏水性氨基酸，例如A或V；
Xa6是疏水性氨基酸例如I或M；
Xa7是N或S；
Xa8是P或S；
Xa9是中性亲水性氨基酸，例如S或T；
Xa10是疏水性氨基酸，例如L或V；
Xa11是疏水性氨基酸，例如V或L；
Xa12是Q或G；且
Xa13是I或F。
【SEQ ID NO：28】(h16B5VL共有序列3)
DIVMXa1QSPXa2SLAVSXa3GEXa4Xa5TXa6Xa7CKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQXa8PKLLIYWASTRESGVPDRFXa9GSGSGTDFTLTISSXa10QAEDXa11AVYYCKQSYNL-WTFGXa12GTKLEXa13K
Xa1是T或S；Xa2是D或S；Xa3是L或A；Xa4是R或K；Xa5是A或V；Xa6是I或M；Xa7是N或S；Xa8是P或S；Xa9是S或T；Xa10是L或V；Xa11是V或L；Xa12是Q或G和；Xa13是I或F。
【SEQ ID NO：29】(鼠类16B5VH)
EVQLQQSGAELVKPGASVRLSCTTSGFNIKDIYMHWVKQRPEQGLEWIGRIDPAYGNTKYDPKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCARRYDTAMDYWGQGTSVTVSS
【SEQ ID NO：30】(h16B5VH共有序列1)
XVQLXQSGAEXXKPGAXVXXSCXXSGFNIKDIYMHWVXQXPXXGLEWXGRIDPAYGNTKYDPKFQGXXTITADTSXXTAYXXLSSLXSEDTAVYYCArRYDTAMDYwgqgtXvtvsS；
X是与SEQ ID NO：29中列出的多肽中的对应的氨基酸相比较的一个氨基酸置换。
【SEQ ID NO：31】(h16B5VH共有序列2)
Xb1VQLXb2QSGAEXb3Xb4KPGAXb5VXb6Xb7SCXb8Xb9SGFNIKDIYMHWVXb10QXb11PXb12Xb13GLEWXb14GRIDPAYGNTKYDPKFQGXb15Xb16TITADTSXb17Xb18TAYXb19Xb20LSSLXb21SEDTAVYYCArRYDTAMDYwgqgtXb22vtvsS；
Xb1是Q或E；
Xb2是V或Q；
Xb3是疏水性氨基酸，例如V或L；
Xb4是K或V；
Xb5是中性亲水性氨基酸，例如T或S；
Xb6是碱性氨基酸，例如K或R；
Xb7是疏水性氨基酸，例如I或L；
Xb8是K或T；
Xb9是V或T；
Xb10是碱性氨基酸，例如Q或K；
Xb11是A或R；
Xb12是G或E；
Xb13是碱性氨基酸，例如K或Q；
Xb14是疏水性氨基酸，例如M或I；
Xb15是碱性氨基酸，例如R或K；
Xb16是疏水性氨基酸，例如V或A；
Xb17是中性亲水性氨基酸，例如T或S；
Xb18是例如D或N；
Xb19是疏水性氨基酸，例如M或L；
Xb20是E或Q；
Xb21是R或T；且
Xb22是L或S。
【SEQ ID NO：32】(h16B5VH共有序列3)
Xb1VQLXb2QSGAEXb3Xb4KPGAXb5VXb6Xb7SCXb8Xb9SGFNIKDIYMHWVXb10QXb11PXb12Xb13GLEWXb14GRIDPAYGNTKYDPKFQGXb15Xb16TITADTSXb17Xb18TAYXb19Xb20LSSLXb21SEDTAVYYCArRYDTAMDYwgqgtXb22vtvsS；
Xb1是Q或E；Xb2是V或Q；Xb3是V或L；Xb4是K或V；Xb5是T或S；Xb6是K或R；Xb7是I或L；Xb8是K或T；Xb9是V或T；Xb10是Q或K；Xb11是A或R；Xb12是G或E；Xb13是K或Q；Xb14是M或I；Xb15是R或K；Xb16是V或A；《Xb17是T或S；Xb18是D或N；Xb19是M或L；Xb20是E或Q；Xb21是R或T；且Xb22是L或S。
【SEQ ID NO：33】(鼠类21B12VL)
DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQRPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYC QQYYIYPRTFGGGTKLEIK
【SEQ ID NO：34】(h21B12VL共有序列1)
DIVMXcQSPXSLAVSXGEXXTXXCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQXPGQXPKLLIYWASTRESGVPDRFXGSGSGTDFTLTISSXXAEDXAVYYC QQYYIYPRTFGXGTKLEIK
X是与SEQ ID NO：33中列出的多肽中的对应的氨基酸相比较的一个氨基酸置换。
【SEQ ID NO：35】(h21B12VL共有序列2)
DIVMXc1QSPXc2SLAVSXc3GEXc4Xc5TXc6Xc7CKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQXc8PGQXc9PKLLIYWASTRESGVPDRFXc10GSGSGTDFTLTISSXc11Xc12AEDXc13AVYYCQQYYIYPRTFGXc14GTKLEIK；
Xc1是中性亲水性氨基酸，例如T或S；
Xc2是D或S；
Xc3是疏水性氨基酸，例如L或V；
Xc4是碱性氨基酸，例如R或K；
Xc5是疏水性氨基酸，例如A或V；
Xc6是疏水性氨基酸，例如I或M；
Xc7是N或S；
Xc8是碱性氨基酸，例如K或R；
Xc9是P或S；
Xc10是中性亲水性氨基酸，例如S或T；
Xc11是疏水性氨基酸，例如L或V；
Xc12是碱性氨基酸，例如Q或K；
Xc13是疏水性氨基酸，例如V或L；且
Xc14是Q或G。
【SEQ ID NO：36】(h21B12VL共有序列3)
DIVMXc1QSPXc2SLAVSXc3GEXc4Xc5TXc6Xc7CKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQXc8PGQXc9PKLLIYWASTRESGVPDRFXc10GSGSGTDFTLTISSXc11Xc12AEDXc13AVYYCQQYYIYPRTFGXc14GTKLEIK；
Xc1是T或S；Xc2是D或S；Xc3是L或V；Xc4是R或K；Xc5是A或V；Xc6是I或M；Xc7是N或S；Xc8是K或R；Xc9是P或S；Xc10是S或T；Xc11是L或V；Xc12是Q或K；Xc13是V或L；且Xc14is Q或G。
【SEQ ID NO：37】(鼠类21B12VH)
QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMHWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCARDGFLYFFDYWGQGTTLTVSS
【SEQ ID NO：38】(h21B12VH共有序列1)
QXQLVQSGXELKKPGXXVKXSCKASGYTFTNYGMHWVXQAPGXGLXWMGWINTYTGEPTYADDFKGRFXFSLXTSXSTAYLQIXXLKXEDTAXYXCARdGFLYFFDYwgqgtXXtvss
X是与SEQ ID NO：37中列出的多肽中的对应的氨基酸相比较的一个氨基酸置换。
【SEQ ID NO：39】(h21B12VH共有序列2)
QXd1QLVQSGXd2ELKKPGXd3Xd4VKXd5SCKASGYTFTNYGMHWVXd6QAPGXd7GLXd8WMGWINTYTGEPTYADDFKGRFXd9FSLXd10TSXd11STAYLQIXd12Xd13LKXd14EDTAXd15YXd16CARdGFLYFFDYwgqgtXd17Xd18tvss；
Xd1是疏水性氨基酸，例如V或I；
Xd2是S或P；
Xd3是A或E；
Xd4是中性亲水性氨基酸，例如S或T；
Xd5是疏水性氨基酸，例如V或I；
Xd6是碱性氨基酸，例如R或K；
Xd7是碱性氨基酸，例如Q或K；
Xd8是E或K；
Xd9是疏水性氨基酸，例如V或A；
Xd10是酸性氨基酸，例如D或E；
Xd11是疏水性氨基酸，例如V或A；
Xd12是S或N；
Xd13是S或N；
Xd14是A或N；
Xd15是V或T；
Xd16是芳香族氨基酸，例如Y或F；
Xd17是L或T；且
Xd18是疏水性氨基酸，例如V或L。
【SEQ ID NO：40】(h21B12VH共有序列3)
QXd1QLVQSGXd2ELKKPGXd3Xd4VKXd5SCKASGYTFTNYGMHWVXd6QAPGXd7GLXd8WMGWINTYTGEPTYADDFKGRFXd9FSLXd10TSXd11STAYLQIXd12Xd13LKXd14EDTAXd15YXd16CARdGFLYFFDYwgqgtXd17Xd18tvss；
Xd1是V或I；Xd2是S或P；Xd3是A或E；Xd4是S或T；Xd5是V或I；Xd6是R或K；Xd7是Q或K；Xd8是E或K；Xd9是V或A；Xd10是D或E；Xd11是V或A；Xd12是S或N；Xd13是S或N；Xd14是A或N；Xd15是V或T；《Xd16是Y或F；Xd17是L或T；和Xd18是V或L.
【SEQ ID NO：41】(16B5VL的人模型)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNSKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSTPYSFGQGTKLEIK
【SEQ ID NO：42】(16B5VH的人模型)
QVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTDYYMHWVQQAPGKGLEWMGLVDPEDGETIYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCAriplfgrdhwgqgtlvtvsr
【SEQ ID NO：43】(21B12VL的人模型)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNSKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSTPYS FGQGTKLEIK
【SEQ ID NO：58】(21B12VH的人模型)
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTSYAMNWVRQAPGQGLEWMGWINTNTGNPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARDWGQGTLVTVSSVATIDENWFDP
【SEQ ID NO：44】
16B5CDRH1:GFNIKDIY
【SEQ ID NO：45】
16B5CDRH2:IDPAYGNT
【SEQ ID NO：46】
16B5CDRH3:x1x2RYDTAMDY
X1是A；
X2是R；
或X1和X2在CDRH3之外
【SEQ ID NO：47】
16B5CDRL 1:QSLLNSRTRKNY
16B5CDRL2:WAS
【SEQ ID NO：49】
16B5CDRL3:KQSYNLWT
【SEQ ID NO：50】
21B12CDRH1:GYTFTNYG
【SEQ ID NO：51】
21B12CDRH2:INTYTGEP
【SEQ ID NO：52】
21B12CDRH3:x3x4DGFLYFFDY
X3是A；
X4是R；
或X3和X4在CDRH3之外
【SEQ ID NO：53】
21B12CDRL1:QSLLYSSNQKNY
21B12CDRL2:WAS
【SEQ ID NO：55】
21B12CDRL3:QQYYIYPRT
【参考文献】
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2.Trougakos,I.P.,等,Silencing expression of theclusterin/apolipoprotein j gene in human cancer cells using smallinterfering RNA induces spontaneous apoptosis,reduced growth ability，and cell sensitization to genotoxic and oxidative stress.Cancer Res,2004.64(5)：第1834-1842页。
3.Gleave,M.和H.Miyake,Use of antisense oligonucleotidstargeting the cytoprotective gene，clusterin,to enhance androgen-andchemo-sensitivity in prostate cancer.World J Urol,2005.23(1)：第38-46页。
4.Springate,C.M.,等,Efficacy of an intratumoral controlledrelease formulation of clusterin  antisense oligonucleotide complexedwith chitosan containing paclitaxel or docetaxel in prostate cancerxenograft models.Cancer Chemother Pharmacol,2005.56(3)：第239-247页。
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Claims (111)

1.抗簇蛋白抗体用于减小包含表达或分泌簇蛋白的细胞的肿瘤的体积的用途。
2.如权利要求1中所限定的用途，其中所述抗簇蛋白抗体选自由多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、分离的人抗体、杂合抗体及其片段组成的组。
3.如权利要求2所限定的用途，其中所述杂合抗体或其片段包括非人抗体的轻链可变区和人源化抗体的重链可变区。
4.如权利要求2所限定的用途，其中所述杂合抗体或其片段包括非人抗体的重链可变区和人源化抗体的轻链可变区。
5.如权利要求1至4中任一项所限定的用途，其中所述肿瘤是选自由以下组成的组的癌：子宫内膜癌、乳腺癌、肝细胞癌、前列腺癌、肾细胞癌、卵巢癌、胰腺癌和结直肠癌。
6.如权利要求5所限定的用途，其中所述癌是前列腺癌。
7.如权利要求5所限定的用途，其中所述癌是乳腺癌。
8.一种非人亲本抗体的人源化抗体或杂合抗体，其中所述人源化抗体包括包含非人互补性决定区氨基酸残基和天然人抗体的人框架区氨基酸残基的重链可变区和互补轻链，并且其中所述人源化抗体或杂合抗体与簇蛋白特异性地结合。
9.如权利要求8所述的人源化抗体或杂合抗体，其中所述天然人抗体包括具有与非人亲本抗体的可变区的三维结构相似的三维结构的可变区。
10.如权利要求8所述的人源化抗体或杂合抗体，其中所述人源化抗体抑制簇蛋白表达细胞或簇蛋白分泌细胞的迁移、侵袭或生长。
11.如权利要求8至10中任一项所述的人源化抗体或杂合抗体，其特征在于4.49×10-9M±8.5×10-10或更佳的亲和力。
12.如权利要求8至11中任一项所述的人源化抗体或杂合抗体，其中所述互补轻链包含来自天然人抗体轻链框架区的人框架区氨基酸残基，所述天然人抗体轻链框架区与所述非人亲本抗体的轻链框架区具有至少70%的同一性并在轻链互补性决定区中具有与所述非人亲本抗体的对应轻链互补性决定区相同或基本上相同的氨基酸。
13.如权利要求12所述的人源化抗体或杂合抗体，其中所述人框架区氨基酸残基来自与所述非人亲本抗体的轻链框架区具有至少80%同一性的天然人抗体轻链框架区。
14.如权利要求13所述的人源化抗体或杂合抗体，其中所述人框架区氨基酸残基来自与非人亲本抗体的轻链框架区具有至少83%同一性的天然人轻链框架区。
15.如权利要求8至14中任一项所述的人源化抗体或杂合抗体，其中所述人源化抗体重链的所述人框架区氨基酸残基来自天然人抗体重链框架区，所述天然人抗体重链框架区与所述非人亲本抗体的重链框架区具有至少70%的同一性并在重链互补性决定区中具有与所述非人亲本抗体的对应重链互补性决定区相同或基本上相同的大量氨基酸。
16.如权利要求15所述的人源化抗体或杂合抗体，其中所述人源化抗体重链的所述人框架区氨基酸残基来自与所述非人亲本抗体的所述重链框架区具有至少73%同一性的天然人抗体重链框架区。
17.如权利要求16所述的人源化抗体或杂合抗体，其中所述人源化抗体重链的所述人框架区氨基酸残基来自与所述非人亲本抗体的所述重链框架区具有至少80%同一性的天然人抗体重链框架区。
18.如权利要求8至17中任一项所述的人源化抗体或杂合抗体，其中所述重链可变区包含至少一个非人互补性决定区。
19.如权利要求18所述的人源化抗体或杂合抗体，其中所述重链可变区包含至少2个非人互补性决定区。
20.如权利要求19所述的人源化抗体或杂合抗体，其中所述重链可变区包含3个非人互补性决定区。
21.如权利要求8至20中任一项所述的人源化抗体或杂合抗体，其中所述轻链可变区包含至少一个非人互补性决定区。
22.如权利要求21所述的人源化抗体或杂合抗体，其中所述轻链可变区包含至少2个非人互补性决定区。
23.如权利要求22所述的人源化抗体或杂合抗体，其中所述轻链可变区包含3个非人互补性决定区。
24.如权利要求8所述的人源化抗体或杂合抗体，其中所述簇蛋白表达细胞是癌细胞。
25.如权利要求24所述的人源化抗体或杂合抗体，其中所述癌细胞是人癌细胞。
26.如权利要求25所述的人源化抗体或杂合抗体，其中所述人癌细胞来自选自由以下组成的组的癌：子宫内膜癌、乳腺癌、肝细胞癌、前列腺癌、肾细胞癌、卵巢癌、黑素瘤、胰腺癌、肺癌、膀胱癌和结直肠癌。
27.如权利要求26所述的人源化抗体或杂合抗体，其中所述癌是前列腺癌。
28.如权利要求26所述的人源化抗体或杂合抗体，其中所述癌是乳腺癌。
29.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段能够与簇蛋白结合并选自由以下组成的组：
a．抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段具有与SEQ ID NO：25至少80%同一的轻链可变区和/或与SEQ ID NO：29至少80%同一的重链可变区，其中所述抗体或其抗原结合片段相比SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：29包括至少一个氨基酸置换，并且其中所述氨基酸置换在互补性决定区（CDR）之外；和
b．抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段具有与SEQ ID NO：33至少80%同一的轻链可变区和/或与SEQ ID NO：37至少80%同一的重链可变区，其中所述抗体或其抗原结合片段相比SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：37包括至少一个氨基酸置换，并且其中所述氨基酸置换在互补性决定区（CDR）之外。
30.如权利要求29所述的抗体或抗原结合片段，其中所述至少一个氨基酸置换在所述轻链可变区中。
31.如权利要求29或30所述的抗体或抗原结合片段，其中所述氨基酸置换在所述重链可变区中。
32.如权利要求29至31中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述氨基酸置换是保守的。
33.如权利要求29至32中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO：26的至少90个连续氨基酸。
34.如权利要求33所述的抗体或抗原结合片段，其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO：27的至少90个连续氨基酸。
35.如权利要求34所述的抗体或抗原结合片段，其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO：28的至少90个连续氨基酸。
36.如权利要求35所述的抗体或抗原结合片段，其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO：8的至少90个连续氨基酸。
37.如权利要求36所述的抗体或抗原结合片段，其中所述轻链可变区为如SEQ ID NO：8中所列出的。
38.如权利要求29至37中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO：30的至少90个连续氨基酸。
39.如权利要求38所述的抗体或抗原结合片段，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO：31的至少90个连续氨基酸。
40.如权利要求39所述的抗体或抗原结合片段，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO：32的至少90个连续氨基酸。
41.如权利要求40所述的抗体或抗原结合片段，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO：7的至少90个连续氨基酸。
42.如权利要求41所述的抗体或抗原结合片段，其中所述重链可变区为如SEQ ID NO：7中所列出的。
43.如权利要求29所述的抗体或抗原结合片段，其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO：26的至少90个连续氨基酸并且其中所述重链可变区包含SEQ ID NO：30的至少90个连续氨基酸。
44.如权利要求43所述的抗体或抗原结合片段，其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO：27的至少90个连续氨基酸并且其中所述重链可变区包含SEQ ID NO：31的至少90个连续氨基酸。
45.如权利要求44所述的抗体或抗原结合片段，其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO：28的至少90个连续氨基酸并且其中所述重链可变区包含SEQ ID NO：32的至少90个连续氨基酸。
46.如权利要求45所述的抗体或抗原结合片段，其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO：8的至少90个连续氨基酸并且其中所述重链可变区包含SEQ ID NO：7的至少90个连续氨基酸。
47.如权利要求46所述的抗体或抗原结合片段，其中所述轻链可变区包含为如SEQ ID NO：8中所列出的并且其中所述重链可变区为如SEQ ID NO：7中所列出的。
48.如权利要求29至32中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO：34的至少90个连续氨基酸。
49.如权利要求48所述的抗体或抗原结合片段，其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO：35的至少90个连续氨基酸。
50.如权利要求49所述的抗体或抗原结合片段，其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO：36的至少90个连续氨基酸。
51.如权利要求50所述的抗体或抗原结合片段，其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO：18的至少90个连续氨基酸。
52.如权利要求51所述的抗体或抗原结合片段，其中所述轻链可变区为如SEQ ID NO：18中所列出的。
53.如权利要求29至32或48至52中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO：38的至少90个连续氨基酸。
54.如权利要求53所述的抗体或抗原结合片段，其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO：39的至少90个连续氨基酸。
55.如权利要求54所述的抗体或抗原结合片段，其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO：40的至少90个连续氨基酸。
56.如权利要求55所述的抗体或抗原结合片段，其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO：17的至少90个连续氨基酸。
57.如权利要求56所述的抗体或抗原结合片段，其中所述轻链可变区为如SEQ ID NO：17中所列出的。
58.如权利要求29所述的抗体或抗原结合片段，其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO：34的至少90个连续氨基酸并且其中所述重链可变区包含SEQ ID NO：38的至少90个连续氨基酸。
59.如权利要求58所述的抗体或抗原结合片段，其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO：35的至少90个连续氨基酸并且其中所述重链可变区包含SEQ ID NO：39的至少90个连续氨基酸。
60.如权利要求59所述的抗体或抗原结合片段，其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO：36的至少90个连续氨基酸并且其中所述重链可变区包含SEQ ID NO：40的至少90个连续氨基酸。
61.如权利要求60所述的抗体或抗原结合片段，其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO：18的至少90个连续氨基酸并且其中所述重链可变区包含SEQ ID NO：17的至少90个连续氨基酸。
62.如权利要求61所述的抗体或抗原结合片段，其中所述轻链可变区包含为如SEQ ID NO：18中所列出的并且其中所述重链可变区为如SEQ ID NO：17中所列出的。
63.如权利要求8至62中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体包括恒定区的氨基酸。
64.如权利要求63所述的抗体或抗原结合片段，其中所述恒定区的氨基酸来自人抗体。
65.如权利要求8至64中任一项所述的抗体或抗原结合片段，包括人IgG2恒定区。
66.如权利要求8至65中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗原结合片段是scFv、Fab、Fab’或(Fab’)2。
67.如权利要求8至66中任一项所述的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段与细胞毒性部分缀合。
68.如权利要求8至66中任一项所述的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段与可检测部分缀合。
69.如权利要求8至67中任一项所述的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段用于治疗包含表达簇蛋白或簇蛋白变体的肿瘤细胞的癌症。
70.如权利要求8至68中任一项所述的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段用于检测包含表达簇蛋白或簇蛋白变体的肿瘤细胞的癌症。
71.如权利要求1至68中任一项所述的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段用于预防或治疗转移。
72.一种分离的抗体或抗原结合片段，所述分离的抗体或抗原结合片段能够与权利要求1至68中任一项所述的抗体或抗原结合片段竞争。
73.一种抗原结合片段，所述抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区非人互补性决定区氨基酸残基和人框架区氨基酸残基，并且其中所述抗原结合片段与簇蛋白特异性地结合并具有比非人亲本抗体的抗原结合片段更佳的亲和力。
74.如权利要求73所述的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段来自权利要求8至28中任一项所述的人源化抗体或杂合抗体。
75.如权利要求73或74所述的抗原结合片段，其特征在于17×10-8M±2.97×109或更佳的亲和力。
76.一种分离的抗体，所述分离的抗体包含权利要求73或75中任一项所述的抗原结合片段的氨基酸序列。
77.一种分离的核酸，所述分离的核酸编码权利要求8至72中任一项所述的抗体的所述轻链可变区和/或所述重链可变区、权利要求73至75中任一项所述的抗原结合片段的所述轻链可变区和/或所述重链可变区或权利要求76所述的分离的抗体的所述轻链可变区和/或所述重链可变区。
78.一种载体，所述载体包含权利要求77所述的分离的核酸。
79.如权利要求78所述的载体，其中所述载体是哺乳动物表达载体。
80.一种分离的细胞，所述分离的细胞包含权利要求77所述的分离的核酸，或权利要求78或79所述的载体或表达权利要求8至72中任一项所述的人源化抗体或杂合抗体、权利要求73至75中任一项所述的抗原结合片段或权利要求76所述的分离的抗体。
81.如权利要求80所述的分离的细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
82.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求8至72中任一项所述的抗体、权利要求73至75中任一项所述的抗原结合片段或权利要求76所述的分离的抗体和药学上可接受的载体。
83.一种组合疗法，所述组合疗法包括权利要求82所述的药物组合物和化学治疗剂。
84.如权利要求83所述的组合疗法，其中所述化学治疗剂包括紫杉烷。
85.如权利要求84所述的组合疗法，其中所述紫杉烷是紫杉醇或紫杉萜。
86.如权利要求83至85中任一项所述的组合疗法，其中所述药物组合物与所述化学治疗剂同时施用。
87.如权利要求83至86中任一项所述的组合疗法，其中所述药物组合物和所述化学治疗剂以不同的时间间隔施用。
88.一种降低表达簇蛋白的癌细胞生长的方法，所述方法包括向有需要的动物施用抗簇蛋白抗体。
89.如权利要求88所述的方法，所述方法包括施用权利要求8至72中任一项所述的抗体、权利要求73至75中任一项所述的抗原结合片段或权利要求76所述的分离的抗体。
90.如权利要求88或89所述的方法，所述方法还包括施用化学治疗剂。
91.如权利要求88至90中任一项所述的方法，其中有需要的哺乳动物具有升高的簇蛋白水平。
92.如权利要求88至90中任一项所述的方法，其中所述有需要的哺乳动物具有与升高的簇蛋白水平相关的疾病。
93.如权利要求88至90中任一项所述的方法，其中所述有需要的哺乳动物容易携带能够进行上皮-间充质转化的细胞。
94.如权利要求88至90中任一项所述的方法，其中所述有需要的哺乳动物具有表达或分泌簇蛋白的肿瘤。
95.如权利要求88至94中任一项所述的方法，其中所述有需要的哺乳动物具有癌。
96.如权利要求95所述的方法，其中所述癌是前列腺癌。
97.如权利要求95所述的方法，其中所述癌是乳腺癌。
98.一种治疗与簇蛋白表达相关的疾病的方法，所述方法包括向有需要的动物施用权利要求8至72中任一项所述的人源化抗体或杂合抗体、权利要求73至75中任一项所述的抗原结合片段或权利要求76所述的分离的抗体。
99.权利要求8至72中任一项所述的人源化抗体或杂合抗体、如权利要求73至75中任一项所述的抗原结合片段或权利要求76所述的分离的抗体在制备用于治疗与簇蛋白表达相关的疾病的药物中的用途。
100.一种生成人源化或杂合抗簇蛋白抗体的方法，所述方法包括表达包含能够与簇蛋白特异性结合的非人抗体的非人重链CDR氨基酸残基和天然人抗体重链可变区的框架区残基的重链可变区和表达互补轻链可变区。
101.如权利要求100所述的方法，其中所述天然人抗体重链可变区具有：a）与所述非人抗体的重链的三维结构相似或相同的三维结构，b）具有与所述非人抗体的重链框架区至少70%同一的氨基酸序列的框架区，和/或c）重链CDR中与所述非人重链CDR氨基酸残基相同或基本上相同的大量氨基酸残基。
102.一种生成人源化或杂合抗簇蛋白抗体的方法，所述方法包括表达包含能够与簇蛋白特异性结合的非人抗体的非人轻链CDR氨基酸残基和天然人抗体轻链可变区的框架区氨基酸的轻链可变区和表达互补重链可变区。
103.如权利要求102所述的方法，其中所述天然人抗体轻链可变区具有：a）与所述非人抗体的轻链的三维结构相似或相同的三维结构，b）具有与所述非人抗体的轻链框架区至少70%同一的氨基酸序列的框架区，和/或c）轻链CDR中与所述非人重链CDR氨基酸残基相同或基本上相同的大量氨基酸残基。
104.一种试剂盒，其包括一个或多个小瓶，所述小瓶包括权利要求8至72中任一项所述的抗体、权利要求73至75中任一项所述的抗原结合片段或权利要求76所述的分离的抗体、权利要求77所述的分离的核酸或权利要求78或79所述的载体。
105.一种用于在有需要的个体中减小包含表达或分泌簇蛋白的细胞的肿瘤的体积的方法，所述方法包括施用抗簇蛋白抗体。
106.如权利要求105所述的方法，其中所述抗簇蛋白抗体选自由多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、分离的人抗体、杂合抗体和其片段组的组。
107.如权利要求106所述的方法，其中所述杂合抗体或其片段包括非人抗体的轻链可变区和人源化抗体或人抗体的重链可变区。
108.如权利要求106所述的方法，其中所述杂合抗体或其片段包括非人抗体的重链可变区和人源化抗体或人抗体的轻链可变区。
109.如权利要求105至108中任一项所述的方法，其中所述肿瘤是选自由以下组成的组的癌：子宫内膜癌、乳腺癌、肝细胞癌、前列腺癌、肾细胞癌、卵巢癌、胰腺癌和结直肠癌。
110.如权利要求109所述的方法，其中所述癌是前列腺癌。
111.如权利要求109所述的方法，其中所述癌是乳腺癌。
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