PT1530636E - Tratamento do melanoma por redução dos níveis de clusterina - Google Patents

Description

1

DESCRIÇÃO

"TRATAMENTO DO MELANOMA POR REDUÇÃO DOS NÍVEIS DE CLUSTERINA" O presente pedido de patente reivindica o beneficio e a prioridade sobre os pedidos de patentes provisórios US N°s 60/405,193 depositado a 21 de Agosto, 2002, 60/408,152 depositado a 3 de Setembro, 2002, 60/319,748 depositado a 2 de Dezembro, 2002 e 60/472, 387 depositado a 20 de Maio, 2003.

Fundamentos da Invenção O presente pedido de patente diz respeito aos tratamentos para o melanoma por inibição da clusterina, também conhecida por mensagem 2 da próstata reprimida por testosterona (TRPM-2), por exemplo, através da administração de oligonucleótidos antisenso específicos para a clusterina. A clusterina ou TRPM-2 é uma proteína ubíqua, com um intervalo diverso de actividades propostas. Nas células epiteliais da próstata, a expressão da clusterina aumenta imediatamente após a castração, alcançando níveis máximos em células da próstata de rato, 3 a 4 dias após a castração, coincidentes com o auge da morte celular massiva. Estes resultados levaram alguns investigadores à conclusão de que a clusterina é um marcador para a morte celular e um promotor da apoptose. Por outro lado, a observação de que as células de Sertoli e algumas células epiteliais expressam níveis elevados de clusterina sem niveis elevados de morte celular, levanta questões relativamente ao facto de esta conclusão ser correcta. Sensibar et al., Câncer Research 55:2431-2437 (1995) 2 descreveu experiências in vitro realizadas para elucidar mais claramente sobre o papel da clusterina na morte celular prostática. Eles utilizaram as células LNCaP transfectadas com um gene que codifica para a clusterina e observaram se a expressão desta proteína alterava ou não os efeitos do factor de necrose do tumor α (TNF a), aos quais as células LNCaP são muito sensiveis, com a morte celular a ocorrer normalmente dentro de aproximadamente 12 horas. 0 tratamento das células LNCaP transfectadas com TNFa demonstrou resultar num aumento transiente dos niveis de clusterina durante um período de algumas horas, mas estes niveis já se tinham dissipado quando foi observada a fragmentação do ADN que precede a morte celular. Utilizando uma molécula antisenso correspondendo às bases 1-21 da sequência da clusterina, não outros oligonucleótidos antisenso da clusterina, resulta numa redução substancial na expressão da clusterina e num aumento da morte celular por apoptose nas células LNCaP expostas ao TNFa. Isto levou Sensibar et al., à hipótese de que a sobre-expressão da clusterina poderia proteger as células do efeito citotóxico do TNF e que a depleção da clusterina é responsável pelo desencadeamento da morte celular, embora o mecanismo de acção permaneça por clarificar. A publicação do documento PCT WO00/049937 descreve o uso da terapia antisenso, a qual reduz a expressão da clusterina para proporcionar os benefícios terapêuticos no tratamento do cancro da próstata, cancro das células renais e alguns cancros da mama. Adicionalmente, o uso combinado da clusterina antisenso com a quimioterapia citotóxica (p.ex., taxanos) sinergisticamente potência a quimiosensibilidade no cancro da próstata refractário hormonal. A sensibilidade à radiação é também potenciada quando as células que expressam a clusterina são tratadas com oligodesoxinucleótidos de clusterina antisenso (ODN). 3

Sumário da Invenção 0 presente pedido de patente diz respeito ao tratamento do melanoma através da redução na quantidade eficaz de clusterina. Assim, de acordo com um aspecto da invenção, é proporcionado um método para o tratamento do melanoma num mamífero, preferencialmente um ser humano, compreendendo o passo de administração ao indivíduo de um agente terapêutico eficaz para reduzir a quantidade eficaz de clusterina nas células do melanoma. 0 agente terapêutico pode ser, por exemplo, um composto ODN antisenso ou um ARN inibidor pequeno (ARNsi) direccionado para a clusterina. A presente invenção também proporciona uns métodos para regular a expressão do bcl-xL num indivíduo ou linha celular compreendendo a administração ao indivíduo ou linha celular de um agente eficaz para modular a quantidade de clusterina expressa. Em particular, nas células que expressam a clusterina, a expressão do bcl-xL é regulada negativamente quando a quantidade eficaz de clusterina é reduzida. Tal inibição é significativa pois o bel-xL é conhecido é conhecido por actuar como um inibidor da apoptose. Ver, por exemplo, a Patente US N° 6,172,216.

Breve Descrição das Figuras A fig. 1 apresenta os resultados quando as células do melanoma 607B foram tratadas quer com o oligonucleótido antisenso às concentrações de 100, 250 ou 500 nM ou com um controlo do desemparelhamento codificado numa concentração de 100 nM em dois dias consecutivos. A fig. 2 proporciona representações gráficas da expressão da clusterina em células 518A2 após o tratamento com cisplatina e quer com um oligonucleótido antisenso ou com um controlo do desemparelhamento codificado. 4 A fig. 3 apresenta a sobrevivência celular das células do melanoma Mel Juso transfectadas de um modo estável quer com um vector de controlo vazio (Neo) ou com um vector director da sobre-expressão da clusterina, cultivadas em meio contendo cisplatina 10 μΜ.

Descrição da Invenção

Tal como usado na descrição e reivindicações deste pedido de patente, o termo "clusterina" refere-se à glicoproteina originalmente derivada dos testes com ratos e a proteínas homólogas derivadas de outras espécies de mamíferos, incluindo humanos, quer denominados como clusterina quer com um nome alternativo. As sequências de numerosas espécies de clusterina são conhecidas. Por exemplo, a sequência da clusterina humana é descrita pró Wong et ai., Eur. J. Biochem. 221 (3), 917-925 (1994) e no número de acesso da sequência NCBI NM_001831 e é estabelecido na Listagem de sequências como a Seq. ID. N° 1. Nesta sequência, a sequência de codificação englobas as bases 48 a 1397. A presente invenção proporciona uma composição terapêutica e os métodos para usar uma tal composição para o tratamento do melanoma, particularmente em seres humanos. As composições terapêuticas e os métodos da invenção conseguem uma redução na quantidade eficaz de clusterina presente no indivíduo a ser tratado. Tal como usado neste pedido de patente, a "quantidade eficaz de clusterina" é a quantidade de clusterina presente numa forma que seja funcional para proporcionar protecção anti-apoptose. A quantidade eficaz de clusterina pode ser reduzida por decréscimo da taxa de expressão da clusterina, aumentando a taxa de degradação da clusterina ou por modificação da clusterina (por exemplo, por ligação com um anticorpo) de modo a ser considerada inactiva. 5

Terapêutica com ODN Antisenso

Numa forma de realização da invenção, a redução na quantidade eficaz da clusterina pode ser conseguida por administração de ODNs antisenso, particularmente ODNs antisenso que são complementares a uma região do ARNm da clusterina que englobem quer o local de iniciação da tradução, quer o local de terminação. As sequências dos exemplos, que podem ser empregues como moléculas antisenso no método da invenção são divulgadas na publicação da Patente PCT US-2002-0128220-A1 e a Patente US N° 6,383,808. As sequências antisenso especificas são estabelecidas no presente pedido de patente como Seq. ID N°s: 2 a 12.

Os ODNs empregues podem ser modificados para aumentar a estabilidade do ODN in vivo. Por exemplo, os ODNs podem ser empregues como derivados do fosforotioato (substituição de átomos de oxigénio fosforilo não formadores de pontes com um átomo de enxofre) que aumentaram a resistência à digestão pela nuclease. A modificação do MOE (2'-0-(2-metoxietil) (esqueleto ISIS) também é eficaz. A construção de tal ODN modificado é descrita em detalhe no Pedido de Patente US 10/080,794. Um composição particularmente preferida é um oligonucleótido 21 mer (cagcagcagagtcttcatcat; SEQ ID NO: 4) direccionado para o codão de iniciação da tradução e 6 codões seguintes da sequência da clusterina humana (acesso Genbank n°: NM_001831) com uma modificação 2'-MOE. Este oligonucleótido tem nele inserido um esqueleto de fosforotioato. As porções de açúcar dos nucleótidos 1-4 e 18-21 (as "asas") comportam modificações em 2'-O-metoxietilo e os restantes nucleótidos (nucleótidos 5-17; a "fenda desoxi") são 2'-desoxinucleótidos. As citosinas nas asas (i.e., os nucleótidos 1, 4 e 19) são 5-metilcitosinas. 6 A administração dos ODNs antisenso pode ser efectuada usando os vários mecanismos conhecidos na técnica, incluindo a administração isolada e a administração em veículos lipidicos farmaceuticamente aceitáveis. Por exemplo, os veiculos lipidicos para a distribuição antisenso são divulgados nas Patentes U.S. N° 5,855,911 e 5,417,978. Em geral, o antisenso é administrado por via intravenosa, intraperitoneal, subcutânea ou oral, ou por injecção directa no local do tumor. A quantidade de ODN antisenso administrado é uma quantidade eficaz para inibir a expressão da clusterina nas células do melanoma. Deve ser tido em consideração que esta quantidade vai variar com ambas a eficácia do ODN antisenso empregue e com a natureza de qualquer veiculo usado. A determinação de quantidades apropriadas para qualquer dada composição está compreendida nas competências da técnica, através de séries de testes padrão designados para avaliar os niveis terapêuticos apropriados.

Terapêutica ARNi A redução na quantidade eficaz de clusterina pode também ser conseguida usando a terapia ARNi. A interferência do ARN ou "ARNi" é um termo inicialmente usado por Fire e colaboradores para descrever a observação de que o ARN de dupla cadeia (ARNds) pode bloquear a expressão dos genes quando é introduzido em minhocas (Fire et al. (1998) Nature 391, 806-811). O ARNds dirige o silenciamento especifico para os genes e pós-transcrição, em muitos organismos, incluindo vertebrados e tem proporcionado uma nova ferramenta para estudar a função genética. O ARNi envolve a degradação do ARNm mas muitos dos mecanismos bioquímicos subjacentes a esta interferência são desconhecidos. O uso do ARNi foi adicionalmente descrito em Carthew et al. 7 (2001) Current Opinions in Cell Biology 13, 244-248 e

Elbashir et al. (2001) Nature 411, 494-498.

Na presente invenção, as moléculas de ARN isoladas medeiam o ARNi. Isto é, as moléculas de ARN isoladas da presente invenção medeiam a degradação ou bloqueiam a expressão do ARNm que é o produto da transcrição do gene, o qual também é referido como sendo um gene alvo. Por conveniência, um tal ARNm também pode ser referido aqui como um ARNm a ser degradado. Os termos ARN, molécula(s) de ARN, segmento(s) de ARN e fragmento(s) de ARN podem ser usados inter permutavelmente para referir o ARN que medeia a interferência do ARN. Estes termos incluem o ARN de cadeia dupla, o ARN de cadeia simples, o ARN isolado (ARN parcialmente purificado, ARN essencialmente puro, ARN sintético, ARN produzido por recombinação), assim como o ARN alterado que difere do ARN que ocorre naturalmente por adição, deleção, substituição e/ou alteração de um ou mais nucleótidos. Tais alterações podem incluir a adição de material não nucleotidico, tal como a(s) extremidade(s) do ARN ou internamente (num ou mais nucleótidos do ARN) . Os nucleótidos nas moléculas de ARN da presente invenção também podem compreender nucleótidos não padrão, incluindo nucleótidos que não ocorrem naturalmente ou desoxiribonucleótidos. Colectivamente, todas as moléculas de ARNi assim alteradas são referidas como sendo análogos ou análogos de ARN que ocorrem naturalmente. O ARN da presente invenção apenas precisa de ser suficientemente semelhante ao ARN natural que tenha a capacidade de mediar o ARNi. Tal como aqui usado, a frase "medeia o ARNi" refere-se e indica a capacidade de distinguir qual o ARNm a ser afectado pela maquinaria ou processo do ARNi. O ARN que medeia o ARNi interage com a maquinaria do ARNi de tal modo que direcciona a maquinaria para degradar determinados ARNm ou, por outro lado, para reduzir a expressão da proteina alvo. Numa forma de realização, a presente invenção refere-se a moléculas de ARN que dirigem a clivagem de ARNm específicos para os quais a sua sequência corresponde. Não é necessário que exista uma correspondência perfeita das sequências, mas a correspondência deve ser suficiente para permitir ao ARN dirigir a inibição do ARNi por clivagem ou bloqueio da expressão do ARNm alvo.

Tal como é notado acima, as moléculas de ARN da presente invenção compreendem em geral uma porção de ARN e alguma porção adicional, por exemplo, uma porção de desoxiribonucleótido. 0 número total de nucleótidos na molécula de ARN é adequadamente menor que 49 de modo a serem mediadores eficazes do ARNi. Nas moléculas de ARN preferidas, o número de nucleótidos é 16 a 29, mais preferencialmente 18 a 23 e mais preferencialmente, 21-23. As sequências adequadas são estabelecidas no presente pedido de patente como as Seq. ID N°s. 20 a 43.

As moléculas de ARNsi da invenção são usadas na terapia para tratar pacientes, incluindo pacientes humanos, que têm cancros ou outras doenças de um tipo em que seja obtido um beneficio terapêutico pela inibição da expressão da proteína alvo. As moléculas de ARNsi da invenção são administradas aos pacientes por uma ou mais injecções diárias (intravenosa, subcutânea ou intratecal) ou por administração intravenosa ou intratecal contínua para um ou mais ciclos de tratamento para alcançar as concentrações de plasma e tecido adequadas à regulação do ARNm e proteínas alvo.

Agentes terapêuticos adicionais O método para tratar o melanoma de acordo com a invenção pode incluir adicionalmente a administração de agentes quimioterapêuticos ou outros agentes úteis na terapia do 9 melanoma e/ou ODNs antisenso adicionais direccionados para alvos diferentes, em combinação com o agente terapêutico eficaz para reduzir a quantidade de clusterina activa. Por exemplo, o ODN da clusterina antisenso aumenta a sensibilidade para os agentes quimioterapêuticos convencionais, tais como os taxanos (paclitaxel ou docetaxel), mitoxantrona e gencitabina. Outros agentes que são prováveis demonstrar actividade sinergistica incluem outros agentes citotóxicos (p.ex., ciclofosfamida, decarbazina, inibidores da topoisomerase), inibidores da angiogénese, agentes de diferenciação e inibidores da transdução de sinal. De um modo semelhante, as combinações da clusterina antisenso com outras espécies antisenso, tais como ODN Bcl-2, Bcl-xl e c-myc antisenso para proporcionar uma maior eficácia.

Método de regulação da expressão do Bcl-xL

Enquanto que foi proposta uma função semelhante a um chaperone para a proteína clusterina, o mecanismo molecular específico responsável pelo papel da clusterina na apoptose permanece elusiva. Na linha celular do melanoma humano que expressa a clusterina a níveis muito baixos, a sobre-expressão da clusterina por transfecção estável não leva apenas a um aumento marcado na resistência a um tratamento citotóxico (Figura 3), mas leva também a uma sobre-regulação do bcl-xL, membro da família bcl-2, anti-apoptótico, tal como demonstrado por western blotting. Inversamente, o tratamento das células do melanoma que expressam a clusterina levaram a uma sub-regulação marcada do bcl-xL, proporcionando assim um mecanismo possível para a potência anti-apoptótica da clusterina. Nem a sobre-expressão da clusterina por transfecção nem o tratamento antisenso da clusterina alterou a expressão de outros membros da família Bcl-2 testados em células de melanoma 10 humanas. Assim, a clusterina regula o membro da família bcl-2 anti-apoptótico, bcl-xL. Tal inibição é significativa pois o bcl-xL é conhecido por actuar como um inibidor da apoptose (ver Patente US N° 6,182,216). A invenção será, de seguida, adicionalmente descrita fazendo referência aos exemplos seguintes, não limitantes.

Exemplo 1 A expressão da clusterina em dois lotes diferentes de melanócitos humanos normais (NHEM 6083 e 2489) e quatro linhas celulares de melanoma humano (518A2, SKMEL-28, Mel-Juso e 607B). As células foram cultivadas em placas de 6 cm e colhidas quando estavam com 80-90% de confluência. Foram aplicados 30 g de proteína por faixa num gel SDS-page a 10% e aplicada uma sonda com um anticorpo policlonal de cabra anti-clusterina. Foram utilizados o marcador vermelho de Panceau e um anticorpo direccionado contra a β-actina, como um controlo de carregamento. Em cada caso, o inibidor antisenso da clusterina usado foi baseado na química antisenso avançada 2'MOE tal como descrito no Pedido de Patente US 10/080,794 e tem a sequência da Seq. ID. N° 4. A fig. 1 apresenta os resultados quando células de melanoma 607B foram tratadas quer com o oligonucleótido antisenso a concentrações de 100, 250 ou 500 nM ou com um controlo codificado a uma concentração de 100 nM em dois dias consecutivos. A lipofectina® (lip) sem oligonucleótidos foi usada como um controlo. Os números de células em 96 microplacas de poços foram medidos fotometricamente, utilizando MTS (Título de células 96®, Pierce) . Tal como demonstrado, as contagens celulares na presença de poços tratados com antisenso a 250 e 500 nM são significativamente reduzidas. 11 A fig. 2 proporciona representações gráficas da expressão da clusterina em células 518A2 após tratamento com cisplatina e quer com um oligonucleótido antisenso ou um controlo codificado. A Lip é um controlo de lipofectina sem oligonucleótidos. A detecção foi realizada usando um anticorpo direccionado contra a clusterina.

Os resultados demonstraram que em células do melanoma humanas, a clusterina é expressa a níveis significativamente mais elevados do que em melanócitos humanos em todas, menos uma, as linhas celulares testadas. 0 inibidor antisenso (modificação moe da Seq. ID. N° 4) levou a uma sub-regulação da clusterina dependente da dose, tal como demonstrado por RT-PCR ao nível do ARNm e por western-blot ao nível da proteína, quando comparado com o controlo do desemparelhamento codificado. Esta sub-regulação levou a um aumento da morte celular por apoptose, através do tratamento com antisenso, por si só. Numa linha de células do melanoma (607B), por si só, foi suficiente para levar à morte celular total (Fig. 1). Noutra linha de células do melanoma, as células sobreviventes demonstraram ter uma sensibilidade aumentada a um tratamento consecutivo com o fármaco citotóxico cisplatina, quando comparadas com células tratadas com um oligonucleótido de desemparelhamento controlado (Figura 2) .

Exemplo 2

As células do melanoma Mel Juso transfectaram de um modo estável quer com um vector de controlo vazio (Neo) ou com um vector direccionado para a sobre-expressão da clusterina foram cultivadas em meio contendo cisplatina 10 μΜ. A sobrevivência celular foi medida usando os kits de titulação de células 96 da Promega. Os resultados estão resumidos na Figura 3. Tal como demonstrado, a sobre-expressão da clusterina aumentou dramaticamente a 12 sobrevivência celular, ou referido de um modo diferente, reduziu a eficácia do agente quimioterapêutico.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> UNIVERSIDADE DE BRITISH COLUMBIA GLEAVE, Martin JANSEN, Burkhard

<120> TRATAMENTO DO MELANOMA POR REDUÇÃO DOS NÍVEIS DE CLUSTERINA <130> 49101-4 <140> AINDA NÃO REGISTADO <141> 2003-08-21 <150> US 60/405,193 <151> 2002-08-21 <150> US 60/319,748 <151> 2002-12-02 <150> US 60/408,152 <151> 2002-09-03 <150> US 60/473,387 <151> 2003-05-20 <160> 43 <170> Patentln versão 3.2 <210> 1 <211> 1676 13

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<212> ADN <213> artificial <220> <223> ARNi para clusterina humana <400> 34 acagagacua agggaccaga tt 22 <210> 35 22 <211> 22 <212> ADN <213> artificial <220> <223> ARNi para clusterina humana <400> 35 acagagacua agggaccaga tt 22 <210> 36 <211> 21

<212> ADN <213> artificial <220> <223> ARNi para clusterina humana <400> 36 ccagagcucg cccuucuact t 21 <210> 37 <211> 21

<212> ADN <213> artificial <220> <223> ARNi para clusterina humana <400> 37 guagaagggc gagcucuggt t 21

<210> 38 <211> 21 <212> ADN <213> artificial <220> <223> ARNi para clusterina humana 23 <4Ο Ο> 38 gucccgcauc guccgcagct t 21 <210> 39 <211> 21

<212> ADN <213> artificial <220> <223> ARNi para clusterina humana <400> 39 gcugcggacg augcgggact t 21

<210> 40 <211> 21 <212> ADN <213> artificial <220> <223> ARNi para clusterina humana <400> 40 cuaauucaau aaaacuguct t 21

<210> 41 <211> 21 <212> ADN <213> artificial <220> <223> ARNi para clusterina humana <400> 41 gacaguuuua uugaauuagt t 21 <210> 42 <211> 19 24

<212> ARN <213> artificial <220> <223> ARNi para clusterina humana <400> 42 augaugaaga cucugcugc 19 <210> 43 <211> 19 <212> ARN <213> artificial <220> <223> ARNi para clusterina humana <400> 43 gcagcagagu cuucaucau 19

Lisboa, 10 de Novembro de 2010.

Claims (11)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Uso de uma composição compreendendo um agente terapêutico na forma de um oligodesoxinucleótido antisenso ou um oligonucleótido ARNsi direccionado para o gene de clusterina ou um anticorpo direccionado para a clusterina e eficaz para reduzir a quantidade eficaz de clusterina em células do melanoma para a formulação de uma composição farmacêutica para o tratamento do melanoma.

2. Uso de acordo com a reivindicação 1, em que o agente terapêutico é um oligodesoxinucleótido antisenso.

3. Uso de acordo com a reivindicação 2, em que o oligodesoxinucleótido antisenso abrange quer o local de iniciação da tradução, quer o local de terminação.

4. Uso de acordo com as reivindicações 2 ou 3, em que o oligodesoxinucleótido antisenso é modificado para aumentar a estabilidade in vivo relativamente a um oligodesoxinucleótido não modificado com a mesma sequência.

5. Uso de acordo com a reivindicação 4, em que a modificação é uma modificação (2'-0-(2-metoxietil)).

6. Uso de acordo com as reivindicações 2-5, em que o oligodesoxinucleótido antisenso consiste essencialmente num oligodesoxinucleótido seleccionado do grupo que consiste nas Seq. ID N°s. 2 a 12.

7. Uso de acordo com a reivindicação 6, em que o oligodesoxinucleótido antisenso consiste na Seq. ID N° 4.

8. Uso de acordo com a reivindicação 7, em que o oligodesoxinucleótido tem incorporado um esqueleto 2 fosforotioato, as porções açúcar dos nucleótidos 1-4 e 18-21, as "asas", comportam modificações 2'-O-metoxietil e os restantes nucleótidos são 2'-desoxinucleótidos.

9. Uso de acordo com a reivindicação 1, em que o agente terapêutico é uma molécula de ARN eficaz para reduzir a quantidade eficaz de clusterina nas células do melanoma por um mecanismo de ARNi.

10. Uso de acordo com a reivindicação 9, em que a molécula de ARN compreende um oligonucleótido seleccionado do grupo que consiste nas Seq. ID N°s 20 a 43 ou numa molécula de ARN de cadeia dupla compreendendo um oligonucleótido seleccionado do grupo que consiste nas Seq. ID N°s. 20 a 43 como cadeia simples.

11. Uso de acordo com a reivindicação 9, em que a molécula de ARN consiste num oligonucleótido seleccionado do grupo que consiste nas Seq. ID N°s 20 a 43 ou numa molécula de ARN de cadeia dupla contendo um oligonucleótido que consiste num oligonucleótido seleccionado do grupo que consiste nas Seq. ID 20 a 43 como cadeia simples. Lisboa, 10 de Novembro de 2010.