附图简要说明
附图例示而不是限制性地描绘了优选的实施方式。
图1.显示来自杂交瘤CGMCC 1665的免疫球蛋白重链和轻链的可变区的核苷酸和氨基酸序列的示意图。画面A显示了CTB003Vk核苷酸和氨基酸序列。画面B显示了CTB003VH核苷酸和氨基酸序列。CDR序列加有下划线。
图2.显示CTB003的特征的图。含有人类TRAIL-R1和TRAIL-R2的细胞外结构域的异二聚形式的重组人类IgG1-Fc融合蛋白,或含有TRAIL1、TRAIL-R2、TRAIL-R3或TRAIL-R4的同二聚形式的重组人类IgG1-Fc融合蛋白被固定在ELISA平板上,与各种浓度的CTB003温育。在与HRP缀合的山羊抗小鼠IgG1反应之后,添加TMB底物来进行显色反应。通过CTB003与每种蛋白质的OD值来测定结合能力。数据表示为OD450/650作为CTB003浓度(ng/ml)的函数。
图3.显示在人类癌细胞的细胞凋亡诱导中CTB003的剂量应答关系的图。人类癌细胞系的图面:图面A.乳腺癌;图面B.结肠癌;图面C.胰腺癌;图面D.卵巢癌;图面E.前列腺癌;以及图面F.肺癌与各种的浓度的CTB003温育过夜。利用培养基对照作为100%细胞活力,通过ATPLite分析测定细胞活力。
图4.显示在癌细胞的细胞凋亡诱导中CTB003的时间依赖性应答的图。人类乳腺癌细胞(MDA231)和结肠癌细胞(Colo205)与1000ng/ml的CTB003温育标明的时间点,通过ATPLite分析测定细胞活力。数据表示为细胞活力(%)作为温育时间(小时)的函数。
图5.显示CTB003和阿霉素协同诱导癌细胞死亡的图。人类乳腺癌细胞系(BT474)在存在或不存在各种浓度的阿霉素的条件下与各种浓度的CTB003温育过夜。通过ATPLite细胞活力分析测定细胞活力。图面A显示了作为CTB003浓度(ng/ml)的函数的细胞活力(%)的图。图面B显示了各个处理组观察到的细胞活力(%)的柱形图。
图6.显示CTB003和紫杉醇(Taxol)协同诱导癌细胞死亡的图。将人类结肠癌细胞系(SW620)在存在或不存在各种浓度的紫杉醇的条件下与各种浓度的CTB003温育过夜。通过ATPLite细胞活力分析测定细胞活力。图面A显示了作为CTB003浓度(ng/ml)的函数的细胞活力(%)的图。图面B显示了各个处理组观察到的细胞活力(%)的柱形图。
图7.显示CTB003和顺铂协同诱导癌细胞死亡的图。将人类肺癌细胞系(A437)在存在或不存在各种浓度的顺式铂氨的条件下与各种浓度的CTB003温育过夜。通过ATPLite细胞活力分析测定细胞活力。图面A显示了作为CTB003浓度(ng/ml)的函数的细胞活力(%)的图。图面B显示了各个处理组观察到的细胞活力(%)的柱形图。
图8.显示CTB003和CTP-11协同诱导癌细胞死亡的图。将人类结肠癌细胞系(SW1116)在存在或不存在各种浓度的CTP-11的条件下与各种浓度的CTB003温育过夜。通过ATPLite细胞活力分析测定细胞活力。图面A显示了作为CTB003浓度(ng/ml)的函数的细胞活力(%)的图。图面B显示了各个处理组观察到的细胞活力(%)的柱形图。
图9.显示CTB003和吉西他滨(Gemcitabine)协同诱导癌细胞死亡的图。将人类胰腺癌细胞系(PANC1)在存在或不存在各种浓度的吉西他滨的条件下与各种浓度的CTB003温育过夜。通过ATPLite细胞活力分析测定细胞活力。图面A显示了作为CTB003浓度(ng/ml)的函数的细胞活力(%)的图。图面B显示了各个处理组观察的细胞活力(%)的柱形图。
图10.显示CTB003和抗TRAIL-R1(CTB007)协同诱导癌细胞死亡的图。将人类结肠癌细胞系(SW1116)在存在或不存在各种浓度的抗TRAIL-R1抗体(CTB007)的条件下与各种浓度的CTB003温育过夜。通过ATPLite细胞活力分析测定细胞活力。图面A显示了作为CTB003浓度(ng/ml)的函数的细胞活力(%)的图。图面B显示了各个处理组观察到的细胞活力(%)的柱形图。
图11.显示CTB003和抗TRAIL-R2(CTB006)协同诱导癌细胞死亡的图。将人类结肠癌细胞系(SW1116)在存在或不存在各种浓度的抗TRAIL-R2抗体(CTB006)的情况下与各种浓度的CTB003温育过夜。通过ATPLite细胞活力分析测定细胞活力。图面A显示了作为CTB003浓度(ng/ml)的浓度的函数的细胞活力(%)的图。图面B显示了对各个处理组观察的细胞活力(%)的柱形图。
图12.表现CTB003的体内抗肿瘤活性的图。Balb/c裸鼠皮下接种人类乳腺癌细胞(MDA231)。接种后10天,小鼠接受200μg CTB003的腹膜内(i.p.)注射,以三天的间隔每周两次。处理重复进行三周。每周测量肿瘤大小。数据表示为作为处理后的时间(天)的函数的肿瘤大小(cm3)。
图13.显示在鼠异种移植体内实验模型中鼠TRAIL受体结合剂CTB003对人类乳腺癌细胞系MDA231的生长的影响的时间依赖性的图。数据表示为作为治疗后的时间(天)的函数的肿瘤大小改变的百分比%。
图14.显示在鼠异种移植体内实验模型中鼠TRAIL受体结合剂CTB003对人类肝癌细胞系7402的生长的影响的时间依赖性的图。数据表示为作为治疗后的时间(天)的函数的肿瘤大小改变的百分比%。
图15.显示在鼠异种移植体内实验模型中鼠TRAIL受体结合剂CTB003对人类结肠癌细胞系Colo205的生长的影响的时间依赖性的图。数据表示为作为治疗后的时间(天)的函数的肿瘤大小改变的百分比%。
图16.显示在鼠异种移植体内实验模型中鼠TRAIL受体结合剂CTB003对人类胰腺癌细胞系MIAcapa的生长的影响的时间依赖性的图。数据表示为作为治疗后的时间(天)的函数的肿瘤大小改变的百分比%。
图17.显示与阿霉素组合的CTB003的杀肿瘤活性的直方图。Balb/c裸鼠皮下接种人类乳腺癌细胞(MDA231)。接种后10天,小鼠首先接受100μg阿霉素的腹膜内注射,一天后接受200μg CTB003的腹膜内注射。小鼠以三天的间隔每周两次地处理。重复进行处理两周的时间。在最后一次治疗后两天测量肿瘤大小。数据表示为作为处理组(之前和之后)的函数的肿瘤大小(cm3)。显示的处理组如下:未处理(对照);阿霉素;CTB003;和阿霉素+CTB003。
图18.显示在人类MDA231乳腺癌异种移植模型中与抗TRAIL-R2(CTB006)组合的CTB003的杀肿瘤活性的直方图。Balb/c裸鼠皮下接种人类乳腺癌细胞(MDA231)。接种后10天,小鼠接受200μgCTB003和CTB006的腹膜内注射。小鼠以三天的间隔每周两次地进行处理。处理重复进行两周的时间。在最后一次处理后两天测量肿瘤大小。数据表示为作为处理组(之前和之后)的函数的肿瘤大小(cm3)。显示的处理组是:未处理(对照);CTB003;CTB006;和CTB003+CTB006。
图19.显示CTB003识别的TRAIL-R2的抗原表位的分析的图。利用多肽抑制测定来确定TRAIL-R2中CTB003所识别的表位。将ELISA平板用TRAIL-R2-Fc融合蛋白包被,并与编码TRAIL-R2的细胞外结构域的不同部分的一系列多肽(A-G)温育。数据表示为作为肽浓度(nM)的函数的、所观察到的CTB003对TRAIL-R2的结合的最大结合的百分比(%)。
图20.显示CTB003所识别的TRAIL-R1和TRAIL-R2的抗原表位的实验确认的图。利用多肽抑制测定来确定TRAIL-R1和TRAIL-R2中CTB003所识别的表位。将ELISA平板用TRAIL-R1或TRAIL-R2-Fc融合蛋白包被,并将其在存在或不存在各种浓度的分别编码TRAIL-R1和TRAIL-R2的细胞外结构域的多肽(I和H)的条件下与CTB003温育。数据表示为作为肽浓度(nM)的函数的、所观察到的CTB003对TRAIL-R1(图面A)或TRAIL-R2(图面B)的结合的最大结合的百分比(%)。
图21.显示CTB003(鼠)和hCTB003(人源化、嵌合的)TRAIL受体结合剂的结合特征的比较的图。将含有TRAIL-R1/TRAIL-R2异二聚体抗原的细胞外结构域的重组人类IgG1-Fc融合蛋白(图面A)、TRAIL-R1-Fc(图面B)、TRAIL-R2-Fc(图面C)、TRAIL-R3-Fc(图面D)、TRAIL-R4-Fc(图面E)或BSA(对照;图面F)固定在ELISA平板上,与各种浓度(ng/ml)的CTB003(鼠)或hCTB003(人源化、嵌合的;也称为嵌合CTB003)温育。与HRP缀合的山羊抗小鼠CTB003(鼠)IgG1反应,或与HRP缀合的山羊抗人kappa反应之后,添加TMB底物来进行显色反应。通过CTB003或hCTB003与每种蛋白质的OD值来测定结合能力。每个图面(A-F)中的数据表示为作为抗体浓度(ng/ml)(即,CTB003浓度(ng/ml)或嵌合CTB003浓度(ng/ml))的函数的OD450/650。
图22.显示CTB006(鼠)和hCTB006(人源化、嵌合的;也称为嵌合的CTB006)TRAIL受体结合剂的结合特征的比较的图。将含有TRAIL-R1/TRAIL-R2异二聚体抗原的细胞外结构域的重组人类IgG1-Fc融合蛋白(图面A)、TRAIL-R1-Fc(图面B)、TRAIL-R2-Fc(图面C)、TRAIL-R3-Fc(图面D)、TRAIL-R4-Fc(图面E)或BSA(对照;图面F)固定在ELISA平板上,并与各种浓度(ng/ml)的CTB006(鼠)或hCTB006(人源化、嵌合的)温育。与HRP缀合的山羊抗小鼠CTB006(鼠)IgG反应,或与HRP缀合的山羊抗人kappa反应之后,添加底物来进行显色反应。通过CTB006或hCTB006与每种蛋白质的OD值来测定结合能力。每个图面(A-F)中的数据表示为作为抗体浓度(ng/ml)(即,CTB006浓度(ng/ml)或嵌合CTB006浓度(ng/ml))的函数的OD450/650。
图23.显示CTB007(鼠)和hCTB007(人源化、嵌合的;也称为嵌合的CTB007)TRAIL受体结合剂的结合特征的比较的图。将含有TRAIL-R1/TRAIL-R2异二聚体抗原的细胞外结构域的重组人类IgG1-Fc融合蛋白(图面A)、TRAIL-R1-Fc(图面B)、TRAIL-R2-Fc(图面C)、TRAIL-R3-Fc(图面D)、TRAIL-R4-Fc(图面E)或BSA(对照;图面F)固定在ELISA平板上,并与各种浓度(ng/ml)的CTB007(鼠)或hCTB007(人源化、嵌合的)温育。与HRP缀合的山羊抗小鼠CTB003(鼠)IgG反应,或与HRP缀合的山羊抗人kappa反应之后,添加底物来进行显色反应。通过CTB007或hCTB007与每种蛋白质的OD值来测定结合能力。通过CTB007或hCTB007与每种蛋白质的OD值来测定结合能力。每个图面(A-F)中的数据表示为作为抗体浓度(ng/ml)(即,CTB007浓度(ng/ml)或嵌合CTB007浓度(ng/ml))的函数的OD450/650。
图24.显示hCTB003(即,人源化、嵌合的CTB003;也称为嵌合CTB003)所识别的TRAIL-R1和TRAIL-R2的抗原表位的确认的图。利用多肽抑制测定来确定TRAIL-R1和TRAIL-R2中hCTB003所识别的表位。将ELISA平板用TRAIL-R1或TRAIL-R2-Fc融合蛋白包被,在存在或不存在各种浓度的分别编码TRAIL-R1和TRAIL-R2的细胞外结构域的多肽(I和H)的条件下与CTB003温育。数据表示为作为肽浓度(nM)的函数的、所观察到的hCTB003对TRAIL-R1(图面A)或TRAIL-R2(图面B)的结合的最大结合的百分比(%)。
图25.比较本发明的鼠的和人源化的嵌合TRAIL受体结合剂对人类乳腺癌细胞系MDA231的体外生长的影响的图。图面A是作为CTB003(鼠)或hCTB003(人源化、嵌合的;也称为嵌合CTB003)的浓度(ng/ml)的函数的细胞活力(%)的图。图面B是作为CTB006(鼠)或hCTB006(人源化、嵌合的;也称为嵌合CTB006)的浓度(ng/ml)的函数的细胞活力(%)的图。图面C是作为CTB007(鼠)或hCTB007(人源化、嵌合的;也称为嵌合CTB007)的浓度(ng/ml)的函数的细胞活力(%)的图。
图26.比较本发明的鼠的和人源化的嵌合TRAIL受体结合剂对人类结肠直肠癌细胞系Colo205的体外生长的影响的图。图面A是作为CTB003(鼠)或hCTB003(人源化、嵌合的;也称为嵌合CTB003)的浓度(ng/ml)的函数的细胞活力(%)的图。图面B是作为CTB006(鼠)或hCTB006(人源化、嵌合的;也称为嵌合CTB006)的浓度(ng/ml)的函数的细胞活力(%)的图。图面C是作为CTB007(鼠)或hCTB007(人源化、嵌合的;也称为嵌合CTB007)的浓度(ng/ml)的函数的细胞活力(%)的图。
图27.比较本发明的鼠的和人源化的嵌合TRAIL受体结合剂对人类胰腺癌细胞系MIAcapa体外生长的影响的图。图面A是作为CTB003(鼠)或hCTB003(人源化、嵌合的;也称为嵌合CTB003)的浓度(ng/ml)的函数的细胞活力(%)的图。图面B是作为CTB006(鼠)或hCTB006(人源化、嵌合的;也称为嵌合CTB006)的浓度(ng/ml)的函数的细胞活力(%)的图。图面C是作为CTB007(鼠)或hCTB007(人源化、嵌合的;也称为嵌合CTB007)的浓度(ng/ml)的函数的细胞活力(%)的图。
图28.比较本发明的鼠的和人源化的嵌合TRAIL受体结合剂对人类卵巢癌细胞系Caov3体外生长的影响的图。图面A是作为CTB003(鼠)或hCTB003(人源化、嵌合的;也称为嵌合CTB003)的浓度(ng/ml)的函数的细胞活力(%)的图。图面B是作为CTB006(鼠)或hCTB006(人源化、嵌合的;也称为嵌合CTB006)的浓度(ng/ml)的函数的细胞活力(%)的图。图面C是作为CTB007(鼠)或hCTB007(人源化、嵌合的;也称为嵌合CTB007)的浓度(ng/ml)的函数的细胞活力(%)的图。
图29.比较本发明的鼠的和人源化的嵌合TRAIL受体结合剂对人类前列腺癌细胞系Du145体外生长的影响的图。图面A是作为CTB003(鼠)或hCTB003(人源化、嵌合的;也称为嵌合CTB003)的浓度(ng/ml)的函数的细胞活力(%)的图。图面B是作为CTB006(鼠)或hCTB006(人源化、嵌合的;也称为嵌合CTB006)的浓度(ng/ml)的函数的细胞活力(%)的图。图面C是作为CTB007(鼠)或hCTB007(人源化、嵌合的;也称为嵌合CTB007)的浓度(ng/ml)的函数的细胞活力(%)的图。
图30.比较本发明的鼠的和人源化的嵌合TRAIL受体结合剂对人类肺癌细胞系H2122体外生长的影响的图。图面A是作为CTB003(鼠)或hCTB003(人源化、嵌合的;也称为嵌合CTB003)的浓度(ng/ml)的函数的细胞活力(%)的图。图面B是作为CTB006(鼠)或hCTB006(人源化、嵌合的;也称为嵌合CTB006)的浓度(ng/ml)的函数的细胞活力(%)的图。图面C是作为CTB007(鼠)或hCTB007(人源化、嵌合的;也称为嵌合CTB007)的浓度(ng/ml)的函数的细胞活力(%)的图。
图31.显示人类TRAIL受体的选定区域的氨基酸序列比对的示意图。
图32.显示在差异表达TRAIL-R1和TRAIL-R2的肿瘤细胞中CTB003的结合和细胞凋亡诱导活性的图。图面A所示的图表现了针对CTB003、CTB006和CTB007与Jurkat细胞的细胞表面结合的流式细胞术分析所得的数据。图面B所示的图表现了针对CTB003、CTB006和CTB007与Ramos细胞的细胞表面结合的流式细胞术分析所得的数据。图面C是显示CTB003、CTB006和CTB007在Jurkat细胞中的细胞凋亡诱导活性的图。图面D是显示CTB003、CTB006和CTB007在Ramos细胞中的细胞凋亡诱导活性的图。图面C和图面D中是数据表示为作为抗体浓度(ng/ml)的函数的细胞活力(%)。
发明详述
概述.要理解的是,下文以不同的详略程度描述本发明的某些方面、模式、实施方式、变化形式和特征,以提供对本发明的实质上的理解。
本发明一般地提供了TRAIL受体结合剂(例如,抗体),其可以同时结合两种类型的死亡受体来提高它的抗肿瘤谱和活性。本发明公开了这样的作用剂,它们等同地(equally)结合TRAIL-R1和TRAIL-R2,并能够诱导任何可表达单一类型的所述受体或两种类型的所述受体的肿瘤细胞的凋亡。特别地,本发明提供了本发明的TRAIL受体结合剂结合的TRAIL-R1和/或-R2受体的细胞外结构域中TRAIL-R1和TRAIL-R2的共有“表位”的鉴定。这个表位大约处在跨越人类TRAIL-R1的aa218到aa233的氨基酸残基(aa218-aa233;VKDCTPWSDIECVHKE,SEQ ID NO:45)的结构域中,或处在跨越人类TRAIL-R2的aa167到aa182的氨基酸残基(aa167-aa182;VGDCTPWSDIECVHKE,SEQ ID NO:46)的结构域中。从而,本发明的各个方面涉及TRAIL受体结合剂的制备、表达和表征。
本发明的TRAIL受体结合剂能够单独地或组合地用于检测测试样品中的TRAIL受体多肽(也称为目标多肽),以及用于调节TRAIL受体介导的功能。TRAIL受体结合剂能够用于在有需要的受试者中诊断、预防和/或治疗TRAIL受体相关的医学状况。本发明的TRAIL受体结合剂(例如,抗体)提供了抗死亡受体策略的独特的生物学功能和广泛的抗癌活性。虽然可溶的TRAIL已经显示在诱导体内肿瘤细胞的凋亡方面是有效的,但由于它非常短的半衰期,它的杀伤活性似乎非常低,通常需要大的(和重复的)剂量。根据本发明的结合剂与TRAIL及其他单特异性的抗TRAIL-R1或TRAIL-R2抗体相比在携带人类癌细胞系的动物中具有更高的药物有效性。
本发明的各个方面进一步涉及诊断方法和试剂盒,它们使用本发明的TRAIL受体结合剂来鉴定具有医学状况倾向的个体或者对于药物应答性、副作用或最佳药物剂量来对个体分类。在其他方面,本发明提供了TRAIL受体结合剂用于预防或治疗TRAIL受体介导的病症以及用于筛选和/或验证配体(例如结合TRAIL受体多肽的小分子)等用途。因而,下文将说明这些方面的各种特定的实施方式。
在以下附随的说明中将阐述本发明的一个或多个实施方式的细节。虽然类似于或等同于在此描述的那些的任何方法和材料可以被用于本发明的实践和测试,现在描述了优选的方法和材料。根据说明书和权利要求书,本发明的其他特征、目的和益处将是明显的。一般地,根据制造商的说明进行酶促反应和纯化步骤。技术和操作一般根据本领域的常规方法和各种一般参考文献(一般参见,Sambrook等人,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,2d Ed.(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989)进行,其在本申请文件全文中均有提供。
除非另外定义,此处使用的所有技术和科学术语的含义一般与本发明所属技术领域的普通技术人员通常所理解的相同。在本说明书和附随的权利要求中使用的单数形式“一种/个(a,an)”和“该(the)”包括了复数的所指,除非文章内容明确地另有所指。例如,提及“一种细胞”包括两种或更多细胞的组合,等等。一般地,在此使用的命名法,和本文所描述的细胞培养、分子遗传学、有机化学、分析化学和核酸化学及杂交中的实验方法是本领域公知和常用的。核酸和肽合成使用标准的技术。化学合成和化学分析使用标准的技术或其修改方案。在此引用的所有参考文献在此为了所有目的通过将它们完全引用来合并在此,其程度与具体的,单独的指示为了所有目的通过将其完全引用来合并每个单独的出版物、专利、或专利申请相同。
选用的缩写.选用的生物化学和血液学术语的缩写分别总结在下面的表1和表2中。
定义.以下提供了在本说明书中使用的某些术语的定义。其他术语的定义可以在Illustrated Dictionary of Immunology,2nd Edition(Cruse,J.M.和Lewis,R.E.,Eds.,Boca Raton,FL:CRC Press,1995)中找到。本发明中涉及的术语“DR4”和“TRAIL-R1”、“DR5”和“TRAIL-R2”可以互换使用。除非另外表明,在本文中使用这些术语时是指人类蛋白质和基因。
如在此使用的,术语本发明的TRAIL受体结合剂(例如,抗体)或TRAIL受体相关多肽的“生物学活性”,其抗体片段可以结合TRAIL-R1和/或TRAIL-R2,并且在癌细胞中具有体内和体外细胞死亡诱导活性。
如在此使用的,术语“TRAIL受体”是指TNF受体家族的成员。人类TRAIL受体是TRAIL的细胞表面受体(AP02配体)。迄今为止,已经鉴定了TRAIL的五种受体,其中的两种DR4(TRAIL-R1;CD261或死亡受体4)和DR5(TRAIL-R2;CD262或死亡受体5)能够转导凋亡信号,而其他三种DcR1(TRAIL-R3;CD263或诱饵受体1)、DcR2(TRAIL-R4;CD264或诱饵受体2)和护骨蛋白(osteoprotegerin,OPG)不转导凋亡信号。三聚的TRAIL对TRAIL R1或TRAIL R2的结合通过这些受体的寡聚而诱导凋亡。TRAIL R1和TRAIL R2由细胞外的半富胱氨酸结构域、跨膜结构域和细胞质死亡结构域组成。TRAIL R3和TRAIL R4也具有细胞外的富半胱氨酸结构域,但是TRAIL R3缺乏细胞质死亡结构域,TRAIL R4具有截短的死亡结构域。TRAIL的所有五种受体在它们的细胞外配体结合结构域中具有显著的同源性。DR4和DR5的细胞内区段含有一种保守的功能结构域,即所谓的“死亡结构域”,其负责转导凋亡信号。死亡结构域对凋亡信号转导负责。
如在此使用的,向受试者施用试剂或药物包括自我施用和由他人施用。还要理解的是,在此描述的医学状况的治疗或预防的各种方式意图是指“实质上的”,其不但包括完全的治疗或预防,还包括不及完全的治疗或预防,其中实现了某些生物学或医学上有意义的结果。
如在此使用的,术语“氨基酸”包括天然存在的氨基酸和合成的氨基酸,以及按照与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些氨基酸,以及后来被修饰的那些氨基酸,例如,羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基础化学结构——即结合于氢、羧基、氨基和R基的α碳——的化合物,例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这种类似物具有修饰的R基团(例如,正亮氨酸)或修饰的肽骨架,但是保持了与天然存在的氨基酸相同的基础化学结构。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构、但是以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的化合物。氨基酸在此可以通过它们公知的三字母符号或通过IUPAC-IUB生物化学术语委员会建议的单字母符号来指代。同样地,核苷酸可以通过它们公认的单字母代码来指代。
如在此使用的,术语“抗体”是指这样的多肽,其包含来自免疫球蛋白基因的框架区域或其片段,其特异性地结合并识别抗原,例如TRAIL受体多肽。使用术语“抗体”意图包括完整抗体、包括单链的完整抗体,以及其抗原结合片段。术语“抗体”包括双特异性抗体和多特异性抗体,只要它们展现了期望的生物学活性或功能。
如在此使用的,术语“抗体相关的多肽”是指抗原结合性抗体片段,包括单链抗体,其可以包含单独的可变区或与所有或部分的以下多肽元件组合的可变区:抗体分子的绞链区、CH1、CH2和CH3结构域。本发明还包括可变区与绞链区、CH1、CH2和CH3结构域的任何组合。能用作本发明的结合剂的抗体相关分子包括,例如,但不限于,Fab、Fab’和F(ab’)2、Fd、单链Fv(scFv)、单链抗体、二硫桥连接的Fv(sdFv)和包含VL或VH结构域的片段。实例包括:(i)Fab片段,由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价的片段;(ii)F(ab′)2片段,包含由绞链区的二硫键连接的两个Fab片段的二价的片段;(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段;(iv)由抗体的单个臂的VL和VH结构域组成的Fv片段,(v)dAb片段(Ward等人,Nature 341:544-546,1989),其由VH结构域组成;和(vi)分离的互补决定区(CDR)。因而,“抗体片段”可以包含全长抗体的一部分,一般是抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段;双抗体;线性抗体;单链抗体分子;和由抗体片段形成的多特异性抗体。单链抗体分子可以包括具有多个单独分子的聚合物,例如,二聚体、三聚体或其他聚合物。
如在此使用的,术语“生物样品”是指源自于活细胞或被活细胞接触过的样品材料。术语“生物样品”意图包括从受试者分离的组织、细胞和生物液体,以及存在于受试者体内的组织、细胞和液体。本发明的生物样品包括,例如,但不限于,全血、血浆、精液、唾液、泪液、尿液、粪便材料、汗液、口腔的(buccal)、皮肤、脑脊液和毛发。生物样品也可以从内脏的活检或从癌症获得。生物样品可以从用于诊断或研究的受试者获得,或者可以从未患病的个体获得,作为对照或用于基础研究。
如在此使用的,术语“CDR移植的抗体”是指这样抗体,其中“受者”抗体的至少一个CDR被来自具有期望的抗原特异性的“供者”抗体的CDR“移植物”替换。
如在此使用的,术语“嵌合抗体”是指这样的抗体,其中利用重组DNA技术,来自一个物种的单克隆抗体的Fc恒定区(例如,小鼠Fc恒定区)被来自另一个物种的抗体的Fc恒定区(例如,人类Fc恒定区)替换。一般地,参见,Robinson等人,PCT/US86/02269;Akira等人,欧洲专利申请184,187;Taniguchi,欧洲专利申请171,496;Morrison等人,欧洲专利申请173,494;Neuberger等人,WO 86/01533;Cabilly等人美国专利No.4,816,567;Cabilly等人,欧洲专利申请125,023;Better等人,Science 240:1041-1043,1988;Liu等人,Proc NatlAcadSci USA 84:3439-3443,1987;Liu等人,JImmunol 139:3521-3526,1987;Sun等人,Proc Natl Acad Sci USA84:214-218,1987;Nishimura等人,Cancer Res 47:999-1005,1987;Wood等人,Nature 314:446-449,1885;和Shaw等人,J Natl Cancer Inst 80:1553-1559,1988。
如在此使用的,术语“比较窗口”(comparison window)是指这样的区段,其具有选自由20到600个氨基酸或核苷酸、通常约50到约200个、更通常约100到约150个构成的组的连续位置的任一数目的连续位置,某一序列与具有相同数目的连续位置的参考序列最佳比对之后,可以在该窗口中与参考序列相比较。
如在此使用的,术语“共有FR”是指共有免疫球蛋白序列中的框架(FR)抗体区域。抗体的FR区域不接触抗原。
如在此使用的,术语“共有序列”是指由在相关序列的家族中最经常出现的氨基酸(或核苷酸)所形成的序列(参见,例如,Winnaker,From Genesto Clones(Verlagsgesellschaft,Weinheim,Germany 1987)。也就是说,在蛋白质的家族中,共有序列中的每个位置均被家族中在该位置上最常出现的氨基酸所占据。如果两个氨基酸出现频度相等,则其中任一个均可以被包括在共有序列中。
如在此使用的,术语“接触”当用于细胞时是指将本发明的TRAIL受体结合剂、抗体、抗体组合物、细胞毒性试剂或细胞毒性模块(moiety)、基因、蛋白质和/或反义序列递送给目标细胞或置于目标细胞的紧密邻近处的过程。这种递送可以是体外或体内的,可以涉及重组载体系统的使用。
如在此使用的,术语“细胞毒性模块”是指当接近细胞或被细胞吸收时抑制细胞生长或促进细胞死亡的模块。就此来说适合的细胞毒部分包括放射性战剂或同位素(放射性核素)、化学毒性试剂,例如分化诱导物、抑制剂和小的细胞毒性药物、毒素蛋白和其衍生物,以及核苷酸序列(或它们的反义序列)。因此,细胞毒性部分可以是,作为非限制性的例子,化疗剂、光活化的毒素或放射性试剂。
如在此使用的,术语“双抗体”是指具有两个抗原结合位点的小的抗体片段,该片段在相同的多肽链中含有相互连接的轻链可变域(VL)和重链可变域(VH)(VH-VL)。通过使用过短而不容许在同一链上两个结构域之间配对的接头,结构域被迫与另一链的互补结构域配对,并产生两个抗原结合位点。双抗体在例如EP404,097;WO93/11161和30 Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)中有更详细的描述。
如在此使用的,术语“效应物细胞”是指免疫应答的效应物阶段——与免疫反应的认知和活化阶段相对——中涉及的免疫细胞。示例性的免疫细胞包括骨髓或淋巴来源的细胞,例如,淋巴细胞(例如,B细胞和T细胞,包括细胞溶解性T细胞(CTL))、杀伤细胞、天然杀伤细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜酸细胞、嗜中性细胞、多形核细胞、粒细胞、肥大细胞和嗜碱性细胞。效应物细胞表达特定的Fc受体并进行特定的免疫功能。效应物细胞可以诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC),例如,能够诱导ADCC的嗜中性细胞。例如,表达FcαR的单核细胞、巨噬细胞、嗜中性细胞、嗜酸细胞和淋巴细胞参与目标细胞的特异性杀伤,并向免疫系统的其他成分呈递抗原,或结合呈递抗原的细胞。效应细胞也可以吞噬目标抗原、目标细胞、转移性癌细胞或微生物。
如在此使用的,术语“表位”是指能够特异性结合到抗体的蛋白质决定簇。表位通常由化学活性的表面分子群集(grouping)例如氨基酸或糖类侧链组成,并且通常具有特定的三维结构特性,以及特定的电荷特征。构象和非构象的表位的区别在于在变性溶剂的存在下与前者的结合会丧失,而与后者的结合不会丧失。在一个实施方式中,TRAIL-R1和TRAIL-R2的“表位”是本发明的TRAIL受体结合剂结合的、TRAIL-R1和/或R2受体的细胞外结构域中的共有的区域。在本发明的一个实施方式中,这个表位大约处在跨越SEQ ID NO:45的TRAIL-R1的aa218到aa233的氨基酸残基的结构域中,或处在跨越SEQ ID NO:46的TRAIL-R2的aa167到aa182的氨基酸残基的结构域中。
为了筛选结合表位的TRAIL受体结合剂,可以进行常规的交叉阻断(cross-blocking)测定,例如在Antibodies,A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory,Ed Harlow和David Lane(1988)中描述的。这种分析可以用于确定测试的TRAIL受体结合剂是否结合与本发明的TRAIL-R1和/或TRAIL-R2抗体相同的位点或表位。或者/并且,可以通过本领域已知的方法进行表位作图(epitope mapping)。例如,可以通过丙氨酸扫描来诱变抗体序列,以鉴定接触残基。在另一种方法中,与TRAIL-R1和TRAIL-R2的不同区域相应的肽可以用于与测试抗体、或与测试抗体及具有已被表征的或已知的表位的抗体进行竞争测定。
如在此使用的,术语组合物的“有效量”或“药学有效量”或“治疗有效量”,是足以实现期望的治疗和/或预防效果的量,例如,引起与被治疗的疾病相关的症状的防止或减少的数量,所述疾病例如与目标多肽相关的疾病。施用给受试者的本发明的组合物的量将取决于疾病的类型和严重度,以及取决于个体的特征,例如一般健康状态、年龄、性别、体重和对药物的耐受性。还将取决于疾病的程度、严重度和类型。技术人员将能够取决于这些和其他因素确定合适的剂量。本发明的组合物也可以相互组合、或与一种或多种其他的治疗化合物组合地施用(例如,本发明的多特异性TRAIL受体结合剂可以与一种或多种单特异性TRAIL受体结合剂组合使用。
如在此使用的,“表达”包括但不限于下面的一项或多项:基因转录成前体mRNA;前体mRNA的剪接和其他加工来产生成熟mRNA;mRNA稳定性;成熟mRNA翻译成为蛋白质(包括密码子利用和tRNA可用性);以及翻译产物的糖基化和/或其他修饰,如果对于适合的表达和功能是需要的。
如在此使用的,“融合多肽”包括TRAIL受体多肽其与之可操作连接的多肽,所述多肽具有与所述TRAIL受体多肽基本上不同源的多肽(例如,不同于TRAIL受体多肽、且来源于相同或不同生物体的多肽)相应的氨基酸序列。
如在此使用的,术语“基因”是指这样的一段DNA,其含有RNA产物的受调节的生物合成的所有信息,包括启动子、外显子、内含子和控制表达的其他翻译的区域。
如在此使用的,术语“基因型”是指在个体中一对同源染色体上的基因座中,存在于一个或多个多态性或突变位点中的、不分相的(unphased)5′到3′核苷酸对序列。如在此使用的,基因型包括完全基因型和/或亚基因型(sub-genotype)。
如在此使用的,术语“人类序列抗体”包括具有来自人类种系(germline)免疫球蛋白序列的可变区和恒定区(如果存在)的抗体。本发明的人类序列抗体可以包括不被人类种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如,通过体外的随机或定点诱变或通过体内的体细胞突变而引入的突变)。这些抗体可以在非人类转基因动物中产生,例如如PCT公布NO.WO 01/14424和WO 00/37504中所描述的。然而,如在此使用的,术语“人类序列抗体”不意图包括这样的抗体,其中源自另一个哺乳动物物种(例如小鼠)的CDR序列被移植到人类框架序列上(例如,人源化抗体)。
如在此使用的,术语非人类(例如鼠)抗体的“人源化”形式,是含有最少的来自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。大体上,人源化的抗体是人免疫球蛋白,在其中受者的高变区残基被来自非人物种(供者抗体)——例如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类——的、具有期望的特异性、亲和性和接受力(capacity)的高变区残基所替代。在有些情况下,人免疫球蛋白的Fv骨架区(FR)残基被相应的非人残基替代。此外,人源化抗体可以包含既不在受者抗体中存在也不在供者抗体中存在的残基。进行这些修饰以进一步改善抗体性能,例如结合亲和力。一般地,人源化抗体将包括至少一个可变域,一般地是两个可变域的基本上全部(substantially all),其中,所有的或基本上所有的高变环均对应于非人免疫球蛋白的高变环,而所有的或基本上所有的FR区均是具有人免疫球蛋白序列的FR区,但FR区域可以包括一个或多个氨基酸替换以改善结合亲和力。在FR区域中这些氨基酸替换的数目一般是在H链中不超过6个,在L链中不超过3个。人源化抗体任选地还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分,一般地是人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。进一步的细节参见Jones等人,Nature321:522-525(1986);Reichmann等人,Nature 332:323-329(1988);and Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。本发明考虑了在此处描述的TRAIL-R1和/或TRAIL-R2结合抗体的“氨基酸序列修饰”。例如,可能希望改善抗体的结合亲和力和/或其他生物学性质。通过向抗体核酸中导入合适的核苷酸变化或通过肽合成来制备TRAIL-R1和/或TRAIL-R2结合抗体的氨基酸序列变体。这样的修饰包括,例如,删除、和/或插入和/或替换TRAIL-R1和/或TRAIL-R2结合抗体的氨基酸序列内的残基。只要获得的抗体具有希望的性质,可进行删除、插入和替换的任何组合来获得感兴趣的抗体。修饰还包括蛋白质的糖基化模式的改变。一种有用的优选诱变位置鉴定方法称为“丙氨酸扫描诱变”,如Cunningham和Wells in Science,244:1081-1085(1989)所描述的。然后筛选突变的抗体的希望的活性。本发明包括具有CGMCC登录号1665的杂交瘤CTB003所定义的氨基酸序列中添加、删除和/或替换了一个或多个氨基酸的抗体变体,只要所述抗体变体具有希望的性质。
如在此使用的,术语“高变区”是指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区一般包含来自“互补决定区”或“CDR”(例如,VL中的残基23-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)左右,和VH中的残基31-35B(H1),50-65(H2)和95-102(H3)左右)(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD.(1991))的氨基酸残基;和/或来自“高变环”(例如,VL中的残基26-32(LI),50-52(L2)和91-96(L3)和VH中的26-32(H1),53-55(H2)和96-101(H3))(Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987))的那些残基。
如在此使用的,术语“同一性”或百分比“同一性”,当在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中使用时,是指这样的两个或更多个序列或子序列:如使用具有下文所述默认参数的BLAST或BLAST 2.0序列比较算法,或通过人工比对或目视检查(参见例如NCBI网站)所测定的,这些序列是相同的,或者具有指定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸(即,当以整个比较窗口或指定区域上的最大对应度来进行比较和比对时,在指定的区域(例如,编码本文所述抗体的核苷酸序列,或本文所述抗体的氨基酸序列)上有约60%同一性、优选的65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的同一性)。然后这些序列被称为“基本上同一的”。该术语还指,或者说可以用于,测试序列的互补序列(complement)。该术语还包括具有删除和/或添加的序列,以及那些具有替换的序列。如下所述,优选的算法可以考虑缺口等等。优选地,同一性存在于至少约25个氨基酸或核苷酸长度的区域上,或者更优选地,50-100个氨基酸或核苷酸长度的区域上。
“分离的”或“纯化的”多肽或其生物学活性部分基本上不含来自该TRAIL受体结合剂所来源的细胞或组织的细胞材料或其他污染多肽,或者,当它们为化学合成时,基本上不含化学药品前体或其他化学药品。例如,作为分离的TRAIL受体结合剂的抗TRAIL受体抗体将不含有干扰该试剂的诊断或治疗用途的材料。这样的干扰材料可以包括酶、激素和其他蛋白质性的或非蛋白质性的溶质。
如在此使用的,用语“诱导细胞死亡”或“能够诱导细胞死亡”是指本发明的TRAIL受体结合剂使有活力的细胞变得没有活力的能力。细胞死亡和细胞活力可以通过本领域的各种方法,例如锥虫蓝排出测定和其他细胞活力分析来测定。在本发明中,细胞死亡特别地由“凋亡”或称“细胞程序死亡”所诱导,其根据下列现象判定:膜联蛋白V的结合、DNA的片段化、细胞皱缩、内质网的扩张、细胞破碎、和/或膜囊(称为凋亡体)的形成。有很多方法可用于评估与凋亡相关的细胞事件。例如,磷脂酰丝氨酸(PS)转位可以通过膜联蛋白结合来测量;DNA片段化可以通过DNA梯状化(laddering)来评估;核/染色质缩合以及DNA片段化可以通过亚二倍体细胞的任何提高来评估。目标细胞是表达TRAIL-R1和/或TRAIL-R2的细胞,优选的,细胞是肿瘤细胞,例如,乳腺、结肠、卵巢、胃、子宫内膜、内皮、肝脏、脑、唾液腺、肺、肾脏、甲状腺、胰腺或膀胱细胞。
如在此使用的,术语“完整抗体”是指具有由二硫键互连的至少两个重(H)链多肽和两个轻(L)链多肽的抗体。每个重链由一个重链可变区(在此缩写为HCVR或VH)和一个重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域,CH1、CH2和CH3构成。每个轻链由一个轻链可变区(在此缩写为LCVR或VL)和一个轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域CL构成。VH和VL区域可以进一步分成高可变性的区域,称为互补决定区(CDR),这些互补决定区中间间隔着更为保守的区域,称为框架区域(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成,它们从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白对宿主组织或因子的结合,包括免疫系统的各种细胞(例如效应物细胞)和经典补体系统的第一成分(C1q)。
如在此使用的,术语“免疫应答”是指淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞和上述细胞或肝脏产生的可溶大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的协同动作,引起人体的癌性细胞、转移性肿瘤细胞、恶性黑色素瘤、侵入的病原体、病原体感染的细胞或组织的选择性的损害、破坏或消灭;或者,在自体免疫或病理性炎症的情况下,正常的人类细胞或组织的选择性的损害、破坏或消灭。
如在此使用的,术语“免疫交叉反应性”和“免疫反应性”可互换地使用,是指与抗体特异性地反应的抗原,所述抗体是利用相同的(“免疫反应性”)或不同的(“免疫交叉反应性”)抗原产生的。一般地,抗原是TRAIL受体多肽,其变体或子序列。
如在此使用的,术语“免疫反应条件”是指这样的条件,其容许针对抗原的特定表位而产生的抗体结合该表位,其结合的程度可检测地大于(detectably greater than)基本上所有结合其他表位的抗体,一般至少高于背景结合至少两倍、优选的高于背景至少五倍。免疫反应条件取决于抗体结合反应的模式,一般是在免疫分析方案中利用的那些条件。免疫分析模式和条件的描述可参见,Harlow和Lane,Antibodies,A Laboratory Manual(ColdSpring Harbor Publications,New York,1988)。
如在此使用的,术语“淋巴细胞”是指血液、淋巴和淋巴组织中存在的任何单核的、非巨噬细胞的白细胞,例如,B淋巴细胞和T淋巴细胞。
如在此使用的,术语“医学状况”包括,但不限于,希望对其治疗和/或预防的、表现为一种或多种生理和/或心理学的症状的任何状况或疾病,包括早先和新近鉴定的疾病和其他病症。
如在此使用的,术语“调节物”包括抑制剂和活化剂。抑制剂是,例如,结合于、部分地或全部地阻断刺激、降低、阻止、延迟活化、灭活、去致敏、或下调TRAIL受体多肽的活性的试剂,例如拮抗剂。活化物是,例如,结合于、刺激、提高、开放、活化、易化、增强活化、致敏或上调TRAIL受体多肽的活性的试剂,例如激动剂。调节物包括,例如,改变TRAIL受体多肽与下列物质的相互作用的试剂:结合活化剂或抑制剂的蛋白质,受体,包括蛋白质、肽、类脂、碳水化合物、多糖或上述物质的组合,例如脂蛋白、糖蛋白等等。调节物包括天然存在的TRAIL受体多肽的遗传修饰的型式,例如,活性改变的遗传修饰型式,以及天然存在的和合成的配体、拮抗剂、激动剂、小化学分子等等。
此处使用的术语“单克隆抗体”是指这样的抗体,它获自基本上同质的抗体群体,即除了可能以少量存在的可能自然发生的突变之外,构成所述群体的抗体个体是相同的。例如,单克隆抗体可以是衍生自单个克隆,包括任何真核、原核或噬菌体克隆的抗体,而不是来自产生该抗体的方法。单克隆抗体成分显示对特定表位的单一的结合特异性和亲和力。单克隆抗体是高度特异性的,针对单个的抗原性位点。此外,与常规的(多克隆的)抗体制品——它们通常包含对不同决定簇(表位)的不同抗体——形成对照的是,每种单克隆抗体针对的是抗原上的单个决定簇。修饰语“单克隆”表明了抗体“是从实质上同质的抗体群体获得的”这一特性,不能解释为要求通过任何特别的方法生产抗体。单克隆抗体可以使用本领域已知的多种多样的技术来制备,例如但不限于,杂交瘤、重组和噬菌体展示技术。例如,根据本发明使用的单克隆抗体可以通过由Kohler等人,Nature 256:495(1975)首先描述的杂交瘤方法制备,或可以通过重组DNA方法制备(参见,例如,美国专利No.4,816,567)。“单克隆抗体”也可以利用,例如,Clackson等人,Nature 352:624-628(1991)和Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗体库中分离。
如在此使用的,术语“中和抗体”是指能够消除或显著地降低TRAIL受体多肽或TRAIL受体样多肽的至少一种(1种)生物学功能的抗体分子。
如在此使用的,术语“核苷酸对”是指在两条核苷酸链之间相互结合的两个核苷酸。
如在此使用的,用术语“药学上可接受的载体”意图包括与药物施用相容的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌化合物、等渗和吸收延迟化合物,等等。
如在此使用的,术语“多克隆抗体”是指来自至少两种(2种)不同的抗体生产细胞系的抗体的制品。这个术语的使用包括至少两种(2种)抗体的制品,其含有与抗原之不同表位或区域特异性结合的抗体。
如在此使用的,术语“多核苷酸”是指任何RNA或DNA,其可以是未修饰或修饰的RNA或DNA。多核苷酸非限制性地包括:单链和双链DNA,单链和双链区域混合物的DNA;单链和双链RNA,单链和双链区域的混合物的RNA;以及包含DNA和RNA的杂交分子,其可以是单链,或更一般地是双链,或是单链和双链区域的混合物。此外,多核苷酸指包含DNA或RNA或DNA与RNA两者的三链区域。术语多核苷酸还包括含有一个或多个修饰的碱基的DNA或RNA,以及具有为了稳定性或其他理由修饰的骨架。在特定的实施方式中,多核苷酸含有来自TRAIL受体基因的多核苷酸序列。
如在此使用的,术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在此可互换地用来指包含通过肽键或修饰的肽键连接在一起的两个或更多个氨基酸的聚合物,即,肽电子等排体。多肽既指短的链,通常称为肽、糖肽或寡聚体;也指较长的链,一般称作蛋白质。多肽可以含有20种基因编码的氨基酸之外的氨基酸。多肽包括通过翻译后加工等自然过程所修饰的,或通过本领域公知的化学修饰技术所修饰的氨基酸序列。这些修饰在基础教科书以及在更详细的专著中,以及在大量研究文献中有详尽的记载。在特定的实施方式中,多肽含有来自TRAIL受体蛋白的多肽序列。
如在此使用的,术语“重组”当用来指例如细胞、或核酸、蛋白质或载体时,表明该细胞、核酸、蛋白质或载体已经通过导入异源核酸或蛋白质或天然核酸或蛋白质的改变而被修饰,或者所述材料来自这样修饰的细胞。因而,例如,重组细胞表达在该细胞的天然(非重组)形式中不存在的基因,或表达本应异常表达、少量表达或根本不表达的天然基因。
如在此使用的,用语“拯救受体结合表位”是指IgG分子(例如,IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的Fc区域的一种表位,其是提高IgG分子的体内血清半衰期的原因。为了提高抗体的血清半衰期,可以例如象美国专利5,739,277所描述的那样向抗体(特别是抗体片段)中引入拯救受体结合表位。
如在此使用的,术语“单链抗体”或“单链Fv(scFv)”是指Fv片段的两个结构域VL和VH的抗体融合分子。虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由不同的基因编码,但可以使用重组方法通过合成接头来连接它们,所述接头允许它们作为单一蛋白链产生,在该链中VL和VH区域配对形成单价的分子(称为单链Fv(scFv))。参见,例如,Bird等人,Science 242:423-426,1988;and Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:5879-5883,1988)。对术语“抗体”片段的提述包括了这种单链抗体。这种单链抗体可以通过重组技术或完整抗体的酶学或化学裂解来制备。
如在此使用的,术语“小分子”是指这样的一种成分(composition),其具有低于约5kDa,更优选低于约2kDa的分子量。小分子可以是,例如,核酸、肽、多肽、糖肽、拟肽、碳水化合物、类脂、脂多糖、这些物质的组合,或其他有机或无机分子。
如在此使用的,术语“特异性结合”是指TRAIL受体结合剂和抗原之间结合亲和力为至少10-6M的接触。优选的结合剂以至少约10-7M、优选10-8M到10-9M、10-10M、10-11M或10-12M的亲和力结合。
如在此使用的,用语“严格杂交条件”是指这样的条件,在该条件下,探针将与其目标子序列(其一般处于复杂的核酸混合物中)杂交,而不与其他的序列杂交。严格条件是序列依赖性的,在不同环境中是不同的。较长的序列在较高的温度下特异性杂交。对于核酸杂交的广泛的指导可以在Tijssen,Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridizationwith Nucleic Probes,“Overview of principles of hybridization and the strategy ofnucleic acid assays”(1993)中找到。一般地,严格条件选择为比在确定的离子强度pH下特定序列的热熔点(Tm)低约5-10℃。Tm可以是这样的温度(在确定的离子强度、pH和核酸浓度下),在该温度下,在平衡状态,与目标互补的探针有50%与目标序列杂交(由于目标序列过量存在,在Tm时,平衡状态下有50%的探针被占据)。严格条件也可以通过添加去稳定剂例如甲酰胺来达到。对于选择性或特异性杂交,阳性信号可以是至少两倍于背景的杂交,优选的10倍于背景的杂交。示例性的严格杂交条件可以是如下:50%甲酰胺、5xSSC和1%SDS,在42℃温育,或5xSSC、1%SDS、在65℃温育,在0.2xSSC和0.1%SDS中在65℃洗涤。
如在此使用的,术语“受试者”是指优选所述受试者是哺乳动物,例如人类,但也可以是其他动物,例如家养动物(例如,狗、猫等等)、农畜(例如,牛、羊、猪、马,等等)以及实验动物(例如,猴、大鼠、小鼠、兔、豚鼠,等等)。
如在此使用的,术语“替换”是指在本领域中通用的突变之一。这些替换变体在TRAIL-R1和/或TRAIL-R2结合性抗体分子中至少一个氨基酸残基被不同的残基替换。替换突变的最感兴趣的位点包括高变区,但也考虑FR改变。在以下表格中“优选替换”的标题下列出了“保守性替换”。如果这种替换引起生物学活性的变化,则可以引入更为实质性的改变(如表3中称为“示例替换”的那些,或者如下文按氨基酸类型进一步描述的),并筛选产物。
特别优选的替换变体类型包括对亲本抗体的一个或多个高变区残基的替换。一种方便地产生这种替换变体的方法包括利用噬菌体展示的亲和成熟(affinity maturity)。特别地,将几个高变区位点(例如,6-7个位点)突变来在每个位点产生所有可能的氨基酸替换。由此产生的抗体变体作为与封装在每个颗粒中的、与M13的基因III产物的融合物,以单价形式展示在丝状噬菌体颗粒上。然后筛选噬菌体所展示的变体的本文所公开的生物学活性(例如,结合亲和力)。为了鉴定用于修饰的候选的高变区位点,可以进行丙氨酸扫描诱变来鉴定对于抗原结合性TRAIL-R1和/或-R2受体有显著贡献的高变区。或者/并且,分析抗原抗体复合物的晶体结构来鉴定抗体和TRAIL-R1和/或-R2受体之间的接触点可能是有益的。这类接触残基和邻近残基是根据在此描述的技术的进行替换的候选对象。一旦产生了这类变体,则对一组变体如本文所述进行筛选,在一种或多种相关的测定中具有相似或更优性质的抗体可以选择用于进一步的开发。本发明包括具有对CGMCC登录号1665的杂交瘤CTB003所定义的免疫球蛋白重链或轻链的高变结构域的一个或多个氨基酸替换、特别是保守性替换的抗体变体,只要该抗体变体具有希望的性质。
如在此使用的,术语“目标细胞”是指受试者(例如,人类或动物)中的任何细胞,其可以被本发明的TRAIL受体结合剂所靶向。
如在此使用的,术语“治疗剂”意图指这样的化合物,当以有效量存在时,其对需要它的受试者产生期望的治疗效果。
如在此使用的,术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”或“缓解”(alleviation)是指治疗处理(therapeutic treating)以及预防或防范措施,其中的目标是阻止或减缓(减轻)作为目标的病理状况或失调。如果受试者在根据本发明的方法接受治疗量的本发明的TRAIL-R1和/或TRAIL-R2结合抗体之后,显示该特定疾病的一个或多个体征和症状的可观察的和/或可测量的降低或缺如,则称受试者被成功地“治疗”了表达TRAIL-R1和/或TRAIL-R2的癌症。例如,对于癌症,癌细胞的数目的降低或癌细胞的不存在;肿瘤大小的降低;肿瘤转移的抑制(即,减慢一定程度,优选停止);,肿瘤生长在一定程度上的抑制;与该特定癌症相关的一种或多种症状的症状的缓解时间的延长和/或在一定程度上的减轻;发病率和死亡率的降低,以及生活质量的改善。
如在此使用的,术语“可变”是指在抗体之中可变区的某些片段在序列上广泛地不同的事实。V结构域介导抗原结合,并决定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而,可变性在可变区的整个氨基酸跨度上(across the aminoacid span)不是均匀分布的。相反,V区域的组成是这样的:几个相对不变的、约15-30个氨基酸长的序列段,称为框架区(FR),以及将这些框架区分隔开来的、可变性极高的较短区域,称为“高变区”,每个高变区长度约9-12个氨基酸。天然重链和轻链的每个可变区都包含四个FR,这些FR主要采取β-片层结构,通过三个高变区相互连接,这些高变区形成环,所述环连接所述beta-片层结构,在某些情况下形成所述beta-片层结构的部分。每个链中的高变区被FR紧密维系在一起,并且与来自另一个链的高变区一道对抗体的抗原结合位点的形成起贡献(参见Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,MD.(1991))。恒定域不直接涉及抗体与抗原的结合,但是显示出各种效应物功能,例如对抗体依赖细胞细胞毒性(ADCC)的参与。
本发明的组合物
本发明的TRAIL受体结合剂.在一个方面,本发明提供了TRAIL受体结合剂组合物,也称为结合剂。在一个实施方式中,本发明的结合剂是针对TRAIL受体多肽、其同源物或衍生物的完整抗体。感兴趣的结合剂可以是特异性结合TRAIL-R1和/或TRAIL-R2的、但“基本上”不结合其他TRAIL受体,例如TRAIL-R3或TRAIL-R4的试剂。也就是说,感兴趣的抗体可不与其他TRAIL受体,例如TRAIL-R3或TRAIL-R4显著地交叉反应。在这种实施方式中,如通过荧光活化的细胞分选(FACS)分析、ELISA或放射免疫沉淀(RIA)所测定的,本发明的结合剂对这些蛋白质的结合程度将是低于约10%,优选的,低于5%、低于1%。
对于本发明的结合剂,可以就其所识别或特异性结合的本发明多肽的表位或部分,例如TRAIL受体多肽的位于多肽表面的区域(例如亲水性区域)来对其进行描述或规定。在一个实施方式中,本发明提供了TRAIL受体结合剂,例如针对包含氨基酸序列VXDCTPWSDIECVHKE(SEQ ID NO:44)的TRAIL受体多肽(也称为目标多肽)的抗体或抗体相关多肽,其中氨基酸X优选的选自K或G。这种结合剂具有独特的功能特征。通过识别TRAIL-R1和TRAIL-R2共有的共同表位,所述结合剂能够结合TRAIL-R1或TRAIL-R2中的一种类型,或TRAIL-R1和TRAIL-R2两种类型。在本发明的一个实施方式中,本发明的TRAIL受体结合剂所结合的TRAIL-R1或TRAIL-R2受体多肽在一种或多种细胞的表面表达。所述结合剂在体内和体外选择性地诱导肿瘤细胞的凋亡。癌细胞可以单独表达TRAIL-R1或TRAIL-R2,或共表达两者。根据它广泛的抗癌活性,本发明作为用于凋亡信号传导研究的试剂、以及作为有效针对表达TRAIL受体的细胞的治疗剂具有实用性,所述细胞例如包括广泛的癌细胞种类。
在优选实施方式中,本发明提供了表4中概述的TRAIL受体结合剂。
在表4(上文)中总结的与TRAIL受体结合剂相关的生物材料保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC),中国微生物菌种保藏管理委员会,北京邮政信箱2714,10080,中华人民共和国。详见下面的表5。
在另一个实施方式中,本发明提供了一种阐明TRAIL-R1和TRAIL-R2共有的其他拮抗性表位的方法,这些表位可以用于通过与TRAIL-R1和/或TRAIL-R2结合来产生凋亡诱导抗体。针对所述表位的结合剂可以具有不同的可变区或CDR区域,但应当具有本发明的抗体的结合特征和功能特征。作为产生靶向抗体的手段,可以生成显示亲水性和疏水性的区域的亲水性分布图,这样的分布图可以通过任何本领域公知的方法来生成,包括,例如,Kyte Doolittle或Hopp Woods方法,有或者没有傅里叶变换(参见,例如Hopp和Woods,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 78:3824-3828(1981);Kyte和Doolittle,J.Mol.Biol.157:105-142(1982))。表位或多肽部分可以如本文中描述的那样来具体指定,例如指定其N-末端和C-末端位置、大小(以连续氨基酸残基数计)。本发明包括特异性结合本发明的多肽并容许其排除的结合剂。本发明包括特异性结合表位的结合剂,其中所述表位是构象表位或非构象表位。如上所述,构象和非构象表位的区别在于在存在变性溶剂的情况下与前者的结合会丧失,而与后者的结合不会丧失。
本发明的结合剂也可以基于它们的交叉反应性来描述或具体指定。本发明包括不结合本发明的目标多肽的任何其他类似物、直系同源物(ortholog)或同源物的结合剂。不结合与本发明的多肽具有低于95%、低于90%、低于85%、低于80%、低于75%、低于70%、低于65%、低于60%、低于55%以及低于50%的同一性(利用本领域已知的和在此描述的方法计算的)的结合剂也被包括在本发明内。本发明进一步包括这样的结合剂,其仅结合在严格杂交条件下(如在此描述的)与本发明的多核苷酸杂交的多核苷酸所编码的多肽。一个方面,本发明提供TRAIL受体结合剂(例如,抗体),其结合TRAIL受体1(TRAIL-R1)多肽和/或TRAIL受体2(TRAIL-R2)多肽,其中所述结合剂(抗体)以它的可溶形式在低浓度下在表达TRAIL-R1和/或TRAIL-R2多肽的癌细胞中具有体内和体外的细胞死亡诱导活性。在一个实施方式中,所述TRAIL受体结合剂结合在至少一个(种)细胞(at least one cell)的表面表达的TRAIL受体1(TRAIL-R1)多肽和/或TRAIL受体2(TRAIL-R2)多肽。也就是说,本发明的TRAIL受体结合剂可以结合在单个(种)细胞上表达的TRAIL-R1和/或TRAIL-R2受体多肽,或结合在超过一个(种)细胞(例如,两个(种)细胞)上表达的TRAIL-R1/-R2多肽。在一个实施方式中,所述TRAIL受体结合剂结合TRAIL受体1(TRAIL-R1)和/或TRAIL受体2(TRAIL-R2)之间至少百分之90氨基酸同源性(例如,同一性)的多肽区域。在一个实施方式中,所述TRAIL受体结合剂结合TRAIL受体1(TRAIL-R1)和/或TRAIL受体2(TRAIL-R2)之间具有至少百分之95氨基酸同源性(例如,同一性)的多肽区域。在一个实施方式中,所述TRAIL受体结合剂结合TRAIL受体1(TRAIL-R1)和/或TRAIL受体2(TRAIL-R2)之间具有至少百分之98氨基酸同源性(例如,同一性)的多肽区域。在一个实施方式中,本发明的TRAIL受体结合剂结合TRAIL-R1和TRAIL-R2多肽之间同源的区域,其中所述区域包含氨基酸序列VXDCTPWSDIECVHKE(SEQ ID NO:44),其中X是K或G。氨基酸同源性(例如,同一性)可以使用本领域已知的和在此描述的方法计算。
本发明的结合剂也可以就它们的结合亲和力来描述或具体指定。优选的结合亲和力包括具有低于5×10-6M、10-6M、5×10-7M、10-7M、5×10-8M、10-8M、5×10-9M、10-9M、5×10-10M、10-10M、5×10-11M、10-11M、5×10-12M、10-12M、5×10-13M、10-13M、5×10-14M、10-14M、5×10-15M和10-15M的离解常数或Kd的那些。在一个实施方式中,本发明提供这样的TRAIL受体结合剂,其以不高于1×10-8的Kd值,优选的不高于约1×10-9的Kd值至少结合人类TRAIL-R1和/或TRAIL-R2。
本发明的范围内的TRAIL受体结合剂包括,例如但不限于,特异性结合目标多肽、其同源物、衍生物或片段的单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、双抗体,以及人类单克隆抗体和人类多克隆抗体。如在此使用的,“TRAIL受体样多肽”是指不同于TRAIL受体多肽但与本发明的TRAIL受体结合剂具有免疫反应性的多肽。TRAIL受体样多肽可以来自与TRAIL受体多肽相同的生物体或不同的生物体。TRAIL受体样多肽可以由与TRAIL受体多肽相同的基因或不同的基因编码。作为本发明的结合剂有用的抗体包括,例如但不限于,IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)、IgA(包括IgA1和IgA2)、IgD、IgE或IgM,以及IgY。
在另一个实施方式中,本发明的结合剂是针对TRAIL受体多肽其同源物或衍生物的抗体相关的多肽。一般地,结合剂的抗原结合区域,例如抗TRAIL受体结合区域,是本发明的结合剂的结合特异性和亲和力中最关键的。在某些实施方式中,TRAIL受体结合剂是抗TRAIL受体多肽抗体,例如抗TRAIL受体多肽单克隆抗体、抗TRAIL受体多肽嵌合抗体和抗TRAIL受体多肽人源化抗体,它们已经被修饰,例如通过删除、添加或替换抗体的一部分而被修饰。例如,抗TRAIL受体多肽抗体意图提高抗体的半衰期,例如,血清半衰期、稳定性或亲和力。
在一个实施方式中,通过产生杂交瘤来便利化对TRAIL受体多肽的特定结构域特异性的抗体的选择,所述杂交瘤结合具有这种结构域的TRAIL受体多肽的片段。因而,本文也提供这样的TRAIL受体结合剂,它们是对TRAIL受体多肽或其衍生物、片段、类似物或同源物内期望的结构域具有特异性的抗体。
本发明进一步包括这样的抗体,它们是针对本发明的结合剂的抗独特型。本发明的结合剂可以是单特异性、双特异性、三特异性的,或更多特异性的。多特异性结合剂可以特异于本发明的TRAIL受体多肽的不同的表位,或可以既特异于本发明的TRAIL受体多肽,又特异于异源组分(compositions),例如异源多肽或固相支持材料。参见,例如,WO 93/17715;WO 92/08802;WO 91/00360;WO 92/05793;Tutt等人,J.Immunol.147:60-69(1991);美国专利Nos.5,573,920,4,474,893,5,601,819,4,714,681,4,925,648;6,106,835;Kostelny等人,J.Immunol.148:1547-1553(1992)。本发明的结合剂可以来自任何动物来源,包括鸟类和哺乳动物。优选的,结合剂是人类、鼠、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡的。
本发明的结合剂适合于在有需要的场合(利用用于调节TRAIL受体多肽功能)向受试者施用。因而,本发明的进一步的目的是提供TRAIL受体结合剂组合物(compositions),它们是TRAIL受体调节物,例如TRAIL受体多肽的功能拮抗剂或功能激动剂。本发明的目的还在于提供这样的TRAIL受体结合剂成分,它们是TRAIL受体多肽的部分拮抗剂(partial antagonist)或部分激动剂(partial agonist)。同样地,本发明包括抗TRAIL受体中和抗体,其结合TRAIL受体多肽。在优选的实施方式中,本发明的结合剂将纯化至:(a)抗体如Lowry方法(Lowry等人,J.Biol.Chem.193:265.1951)所测定的超过95%重量;(2)达到通过使用旋转杯测序仪足以获得至少15个N-末端或内部氨基酸序列的程度,或(3)达到利用考马斯蓝或优选的银染色在还原或非还原条件下SDS-PAGE的均一。分离的结合剂包括原位存在于重组细胞内的多肽,这是因为抗体的天然环境的至少一种成分将不会存在。然而通常地,TRAIL受体结合剂,例如分离的抗TRAIL受体抗体,将通过至少一个纯化步骤来制备。
本发明进一步涉及在可用于鉴定、设计和生产作为TRAIL受体多肽的调节物起作用的化合物的、基于结构的方法。
本发明的结合剂可以单独地或与其他组合物(compositions)组合地使用。例如,本发明的TRAIL受体结合剂可以与本领域已知的一种或多种抗TRAIL受体单克隆抗体,例如但不限于Zhou等人,US 2003/0198637;Zhou等人,US 2003/0190687所描述的那些;以及抗TRAIL-R2抗体TRA-8(Sankyo)组合地使用。
本发明的TRAIL受体结合剂可以进一步在N或C末端重组地融合到异源多肽,或化学地缀合(包括共价和非共价地缀合)到多肽或其他组合物(compositions)。例如,本发明的TRAIL受体结合剂可以重组地融合或缀合到可在检测分析中作为标记的分子和效应分子,例如异源多肽、药物或毒素。参见,例如,WO 92/08495;WO 91/14438;WO 89/12624;美国专利No.5,314,995;和EP 0 396 387。
在某些实施方式中,本发明的TRAIL受体结合剂是抗TRAIL受体抗体或抗TRAIL受体抗体相关多肽,它们偶联或缀合到一种或多种治疗性或细胞毒性模块来产生本发明的TRAIL受体结合剂缀合蛋白质。本发明的TRAIL受体结合剂缀合蛋白质可以用于修饰给定的生物应答或产生生物应答(例如,以募集效应物细胞)。治疗性模块不应被为限于经典的化学治疗剂。例如,治疗性模块可以是具有期望的生物学活性的蛋白质或多肽。这些蛋白质可以包括,例如,酶活性毒素,或其活性片段,如相思豆毒蛋白、篦麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素或白喉毒素;蛋白质,例如肿瘤坏死因子或干扰素-α;或生物应答修饰物,例如,淋巴因子、白细胞介素-1(“IL-1”)、白细胞介素-2(“IL-2”)、白细胞介素-6(“IL-6”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)、或其他生长因子。
本发明的TRAIL受体结合剂的制备方法
一般概述.首先,选择目标多肽,针对它可以产生(raise)本发明的结合剂(例如抗TRAIL受体抗体)。产生针对目标多肽的结合剂的技术是本领域技术人员公知的。这样的技术的实例包括,例如但不限于,涉及展示库、人抗体转基因小鼠(xenomouse)或人单抗转基因小鼠(humab mouse)、杂交瘤等等的那些。在本发明的范围内的目标多肽包括能够展现抗原性的任何多肽或多肽衍生物。实例包括但不限于,蛋白质(例如,受体、酶、激素、生长因子)、肽、糖蛋白、脂蛋白、TRAIL受体多肽,等等。示范性的目标多肽还包括细菌、真菌和病毒病原体,其引起人类疾病,例如HIV、肝炎(甲型、乙型和丙型)、流感、疱疹、贾第鞭毛虫、疟疾、利什曼虫(Leishmania)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。其他目标多肽是表达水平或组成与人类疾病或其他表型相关的人类蛋白质。感兴趣的其他目标多肽包括肿瘤细胞抗原和病毒颗粒抗原。
要理解的是不仅天然存在的抗体适合作为结合剂用于根据本文的公开来使用,而且重组地工程化的抗体和抗体片段,例如,针对TRAIL受体多肽的抗体相关的多肽也是适合的。
可以进行在此阐述的技术的结合剂,例如,抗TRAIL受体抗体,包括单克隆的和多克隆的抗体,和抗体片段,例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、scFv、双抗体、抗体轻链、抗体重链和/或抗体片段。已经描述了对于含抗体Fv的多肽,例如Fab’和F(ab’)2抗体片段的高产量产生有用的方法。参见美国专利No.5,648,237。
一般地,结合剂从来源物种获得。更特别地,获得对目标多肽抗原具有特异性的来源物种抗体的轻链、重链或两者的可变部分的核酸或氨基酸序列。来源物种是任何对于产生本发明的结合剂或结合剂的文库有用的物种,例如大鼠、小鼠、兔、鸡、猴、人类,等等。
在优选的实施方式中,TRAIL受体结合剂是抗TRAIL受体抗体。噬菌体或噬菌粒展示技术是得到本发明的结合剂的有用的技术。在本发明中有用的抗TRAIL受体抗体是“人类抗体”(例如,分离自人类的抗体)或“人类序列抗体”。人类抗体可以通过本领域已知的多种方法包括噬菌体展示方法来产生。也参见,美国专利4,444,887、4,716,111、5,545,806和5,814,318;以及WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO96/34096、WO 96/33735和WO 91/10741。已经描述了用于通过筛选多聚噬菌体(polyphage)颗粒来鉴定多聚体多肽复合物中的成员的编码核酸序列的方法。Rudert等人,美国专利6,667,150。另外,可以产生重组免疫球蛋白。Cabilly,美国专利4,816,567;Cabilly等人,U.S.6,331,415和Queen等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86:10029-10033,1989。产生和克隆单克隆抗体的技术是本领域技术人员公知的。本发明的TRAIL受体结合剂优选的具有高免疫反应性,也就是说,正确折叠从而能特异性结合目标抗原的抗体分子的百分比。编码结合剂,例如本发明的抗体的序列的表达可以如下文所述在大肠杆菌(E.coli)中进行。这样的表达通常产生至少80%、90%、95%或99%的免疫反应性。
这些蛋白质或基因的某些截短物能行使完整序列蛋白质或基因的调节功能或酶功能。例如,可以通过能提供功能上等同的蛋白质或基因的替换、添加、删除或多聚体表达来改变编码它们的核酸序列。由于核酸编码序列的简并性,编码与天然存在的蛋白质的序列基本上相同的氨基酸序列的其他序列可以在本发明的实践中使用。这些序列包括但不限于:包括编码上述多肽的核酸序列的全部或部分的核酸序列,这样的核酸序列的改变是通过用编码序列内的功能等同氨基酸残基的不同密码子进行替换,由此产生沉默的改变(silent change)。要理解的是,根据本发明的免疫球蛋白的核苷酸序列可以容忍最多达25%的序列同源性变异——按照通过标准方法所计算的("Current Methods in Sequence Comparison and Analysis,"MacromoleculeSequencing and Synthesis,Selected Methods and Applications,pp.127-149,1998,Alan R.Liss,Inc.)——只要这种变体形成识别TRAIL-R1和TRAIL-R2的起作用的抗体。例如,多肽序列内的一个或多个氨基酸残基可以被替换为作为功能等同物的、具有类似极性的其他氨基酸,从而产生沉默的改变。用于替换序列内的氨基酸的氨基酸可以从被替换的氨基酸所属的类别的其他成员中选择。例如,非极性的(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸。极性的中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电的(碱性的)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电的(酸性的)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。本发明的范围还包括在翻译期间或之后被差异地修饰——例如通过糖基化、蛋白酶切割、与抗体分子或其他细胞配体连接等方式——的蛋白质或其片段或衍生物。另外,可以对抑制剂的编码核酸序列进行体外或体内突变来产生和/或破坏翻译、起始和/或终止序列,或在编码区域中产生变异,和/或形成新的限制性内切酶位点,或破坏先前存在的限制性内切酶位点,来促进进一步的体外修饰。可以使用本领域已知的用于诱变的任何技术,包括但不限于体外定点诱变J.Biol.Chem.253:6551,Tab接头(Pharmacia)的使用等等。
多克隆抗血清和免疫原的制备.产生本发明的抗体或抗体片段的方法一般包括用纯化的TRAIL受体多肽或用表达TRAIL受体多肽的细胞免疫受试者(一般是非人类受试者,例如小鼠或兔)。TRAIL受体多肽的任何免疫原性部分都可以被采用作为免疫原。合适的免疫原性制备物可以含有,例如,重组表达的TRAIL受体多肽或化学合成的TRAIL受体多肽。可以使用分离的TRAIL受体多肽或其部分或片段作免疫原,利用多克隆和单克隆抗体制备的标准技术来产生结合TRAIL受体多肽或其部分或片段的TRAIL受体结合剂。可以使用全长TRAIL受体多肽,或者,作为选择,本发明提供了TRAIL受体多肽片段作为免疫原的用途。TRAIL受体多肽包含SEQ IDNO:1所示氨基酸序列的至少四个氨基酸残基,并包括TRAIL受体多肽的表位,从而针对所述肽产生的抗体与所述TRAIL受体多肽形成特异性免疫复合物。优选地,抗原肽包含至少5、8、10、15、20或30个氨基酸残基。取决于用途并根据本领域技术人员公知的方法,更长的抗原肽有时比较短的抗原肽是更优选的。一般地,免疫原将是长度至少约8个氨基酰残基,优选的至少约10个酰基残基长度。给定表位的多聚体有时比单体更有效。
如果需要,TRAIL受体多肽(或其片段)的免疫原性可以通过融合或缀合于半抗原例如钥孔血蓝蛋白(KLH)或卵清蛋白(OVA)来提高。许多这类半抗原是本领域已知的。人们也可以组合TRAIL受体多肽和常规的佐剂,例如弗氏完全或不完全佐剂来提高受试者对所述多肽的免疫反应。用于提高免疫反应的各种佐剂包括,但不限于,弗氏(完全和不完全的)、矿物质凝胶(例如,氢氧化铝)、表面活性物质(例如,溶血卵磷脂、普流尼克(pluronic)多元醇、聚阴离子、肽、油乳液、二硝基苯酚,等等)、人类佐剂例如卡介苗和短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum),或相似的免疫刺激性化合物。这些技术是本领域标准的。
为了方便起见,在本发明中免疫应答常常被描述为“初次”或“二次”免疫反应。初次免疫应答,其也被描述为“保护性”免疫应答,是指作为对于特定抗原(例如TRAIL受体多肽)的某种初次暴露(例如初次“免疫”)的结果,在个体中产生的免疫反应。这种免疫可以,例如,作为对抗原(例如,来自某些展现或呈递抗原的病原体的初次感染)的某种天然的暴露的结果而发生,也可以来自个体中某些肿瘤(例如恶性黑色素瘤)的癌细胞所呈递的抗原。做为选择,免疫的发生可以是用含有抗原的疫苗接种个体的结果。例如,疫苗可以是包含来自TRAIL受体多肽或TRAIL受体样多肽的一种或多种抗原的TRAIL受体疫苗。
初次免疫应答可以随着时间减弱或衰减,甚至可以消失或至少变得太衰弱而不能被检测。因而,本发明还涉及“二次”免疫反应,其在此还被描述为“记忆免疫反应”。术语二次免疫反应是指在已经产生初次免疫应答之后在个体中引发的免疫反应。
因而,可以引发二次或免疫应答,例如,来增强已经变得减弱或衰减的现有免疫应答,或来重建消失的或不能再被检测的早先的免疫应答。作为实例而不是为了限制,二次免疫应答可以通过向个体重新导入引发初次免疫应答的抗原,例如TRAIL受体多肽或TRAIL受体样多肽(例如,通过重新施用疫苗)来引发。然而,针对抗原的二次免疫应答也可以通过施用不含有实际的抗原的其他试剂来引发。例如,本发明提供了通过向个体施用TRAIL受体结合剂来强化二次免疫应答的方法。在这样的方法中,实际的抗原不必与TRAIL受体结合剂一起施用,含有TRAIL受体结合剂的组合物不必含有抗原。二次或记忆免疫应答可以是体液的(抗体)应答或细胞的应答。二次或记忆体液反应在抗原的初次呈递时产生的记忆B细胞受到刺激时发生。延迟型超敏反应(DTH)反应是一种细胞的二次或记忆免疫应答,其由CD4+细胞介导。对于抗原的第一次暴露致敏免疫系统,另外的暴露引起DTH。
在合适的免疫之后,可以从受试者的血清制备TRAIL受体结合剂,例如,抗TRAIL受体多克隆抗体。如果需要,可以从哺乳动物(例如,从血液)分离针对TRAIL受体多肽的抗体分子,并进一步通过公知的技术,例如多肽A层析来进一步纯化,以获得IgG级分。
单克隆抗体.在本发明的一个实施方式中,所述结合剂是抗TRAIL受体单克隆抗体。在本发明的一个实施方式中,所述抗TRAIL受体单克隆抗体是人类抗TRAIL受体单克隆抗体。对于针对特定的TRAIL受体多肽或其衍生物、片段、类似物或同源物的单克隆抗体的制备,可以利用任何通过连续细胞系培养来提供抗体分子的产生的技术。这些技术包括,但不限于,杂交瘤技术(参见,例如Kohler和Milstein,1975.Nature 256:495-497);三源杂交瘤(trioma)技术;人类B细胞杂交瘤技术(参见,例如Kozbor等人,1983.Immunol.Today 4:72)和EBV杂交瘤技术,来产生人类单克隆抗体(参见,例如Cole等人,1985.MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCERTHERAPY,Alan R.Liss,Inc.,pp.77-96)。人类单克隆抗体可以在本发明的实践中利用,可以通过使用人类杂交瘤(参见例如Cote等人,1983.ProcNatl Acad Sci USA 80:2026-2030)或通过用EB病毒体外转化人类B细胞(参见例如Cole等人,1985.MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCERTHERAPY,Alan R.Liss,Inc.,pp.77-96)来产生。例如,可以分离编码抗体的区域的核酸的群体。利用来自编码抗体的保守区域的序列的引物进行PCR,从群体扩增编码抗体的部分的序列,然后从扩增的序列重建编码抗体或其片段(例如可变域)的DNA。这种扩增的序列还可以融合于编码其他蛋白质(例如,噬菌体包壳,或细菌细胞表面蛋白质)的DNA,用于融合多肽在噬菌体或细菌上的表达或展示。然后可以将扩增的序列加以表达,并根据,例如,所表达的抗体或其片段对TRAIL受体多肽上呈现的抗原或表位的亲和力来加以进一步选择或分离。作为选择,表达抗TRAIL受体单克隆抗体的杂交瘤可以通过免疫受试者,然后利用常规方法从受试者的脾脏分离杂交瘤来制备。参见,例如,Milstein等人(Galfre和Milstein,MethodsEnzymol(1981)73:3-46)。利用标准方法筛选杂交瘤将产生具有不同的特异性(即,针对不同的表位)和亲和力的单克隆抗体。具有希望的性质(例如TRAIL受体结合)的选定的单克隆抗体可以如杂交瘤所表达的来使用,可以将它结合到聚乙二醇(PEG)等分子来改变它的性质,或可以分离编码它的cDNA,对其加以测序并以各种方式操作。可以向合成的树型体(dendromeric)树添加反应性的氨基酸侧链,例如赖氨酸,来增强TRAIL受体多肽的免疫原性性质。并且,CPG二核苷酸技术可以用于增强TRAIL受体多肽的免疫原性性质。其他操作包括替换或删除对于保存期间或在向受试者施用之后的抗体不稳定性有贡献的特定氨基酰基残基,以及亲和成熟技术来改善TRAIL受体多肽的抗体的亲和力。
杂交瘤技术.在一个实施方式中,本发明的结合剂是通过杂交瘤产生的抗TRAIL受体单克隆抗体,所述杂交瘤包括从转基因非人动物,例如转基因小鼠获得的、具有包含人类重链转基因和轻链转基因的基因组、融合到永生细胞的B细胞。杂交瘤技术包括本领域已知的那些,在Harlow等人,Antibodies:A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory,Cold SpringHarbor,NY,349(1988);Hammerling等人,Monoclonal Antibodies And T-CellHybridomas,563-681(1981)中有所教导。产生杂交瘤和单克隆抗体的其他方法是本领域技术人员公知的。
噬菌体展示技术.如上所述,本发明的结合剂可以通过应用重组DNA和噬菌体展示技术来产生。例如,本发明的结合剂,例如,抗TRAIL受体抗体,可以使用本领域已知的各种噬菌体展示方法来制备。在噬菌体展示方法中,功能性抗体结构域被展示在噬菌体颗粒的表面,噬菌体颗粒携带编码它们的多核苷酸序列。通过直接用抗原(一般是结合或被捕获到固体表面或珠子上的抗原)进行选择,可以从抗体库或组合抗体文库(例如,人类或鼠的)选择具有希望的结合性质的噬菌体。这些方法中使用的噬菌体一般是丝状噬菌体,包括fd和M13,而Fab、Fv或二硫化键稳定化的Fv抗体结构域重组融合于噬菌体基因III或基因VIII蛋白质。此外,方法可以调适用于构建Fab表达库(参见,例如Huse等人,Science,246:1275-1281,1989)来容许快速而有效地鉴定对TRAIL受体多肽(例如,多肽或其衍生物、片段、类似物或同源物)具有希望的特异性的单克隆Fab片段。可以用来产生本发明的结合剂的噬菌体展示方法的其他实例包括在Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.,85:5879-5883,1988;Chaudhary等人,Proc.Natl.Acad.SciU.S.A.,87:1066-1070,1990;Brinkman等人,J.Immunol.Methods 182:41-50,1995;Ames等人,J.Immunol.Methods 184:177-186,1995;Kettleborough等人,Eur.J.Immunol.24:952-958,1994;Persic等人,Gene 187:9-18,1997;Burton等人,Advances in Immunology 57:191-280,1994;PCT/GB91/01134;WO 90/02809;WO 91/10737;WO 92/01047;WO 92/18619;WO 93/11236;WO 95/15982;WO 95/20401;WO 96/06213;WO 92/01047(Medical ResearchCouncil等人);WO 97/08320(Morphosys);WO 92/01047(CAT/MRC);WO 91/17271(Affymax);和美国专利5,698,426、5,223,409、5,403,484、5,580,717、5,427,908、5,750,753、5,821,047、5,571,698、5,427,908、5,516,637、5,780,225、5,658,727和5,733,743中公开的那些。对于通过用二硫键连接多肽而在噬菌体颗粒的表面上展示多肽的方法已经在Lohning,美国专利6,753,136中有所描述。如在上述参考文献中描述的,在噬菌体选择之后,可以从噬菌体分离抗体编码区并用于产生完整的抗体,包括人类抗体、或任何其他希望的抗原结合片段,并在任何希望的宿主中表达,包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌。例如,也可以利用重组产生Fab、Fab’和F(ab’)2片段的技术,这些技术利用本领域已知的方法,例如在WO 92/22324;Mullinax等人,BioTechniques 12:864-869,1992;和Sawai等人,AJRI 34:26-34,1995;和Better等人,Science 240:1041-1043,1988中公开的那些。
一般地,为了鉴定出维持了良好的结合活性的变体,可以将克隆到展示载体中的杂交抗体或杂交抗体片段针对合适的抗原来进行选择,因为抗体或抗体片段将存在于噬菌体或噬菌粒颗粒的表面上。参见,例如,BarbasIII等人,Phage Display,ALaboratory Manual(Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,N.Y.,2001)。然而,这个过程可以使用其他载体模式,例如,将抗体片段文库克隆到裂解性噬菌体载体(修饰的T7或Lambda Zap系统)中用于选择和/或筛选。
重组的TRAIL受体结合剂的表达.如上所述,本发明的结合剂可以通过重组DNA技术的应用来产生。编码本发明的TRAIL受体结合剂的重组多核苷酸构建体一般包括与抗TRAIL受体抗体链的编码序列可操作地连接的表达控制序列,包括天然相关的或异源的启动子区域。因而,本发明的另一个方面包括含有一个或多个编码本发明的TRAIL受体结合剂的核酸序列的载体。对于本发明的一种或多种多肽的重组表达,通过本领域公知的重组DNA技术,并如以下详述地,将含有编码TRAIL受体结合剂的核苷酸序列的全部或一部分的核酸插入合适的克隆载体或表达载体(即,含有用于转录和翻译所插入的多肽编码序列的必需元件的载体)中。产生多样性的载体群体的方法已经由Lerner等人,美国专利No.6,291,160;6,680,192描述了。
一般地,在重组DNA技术中有用的表达载体通常是质粒的形式。在本说明书中,“质粒”和“载体”可互换地使用,因为质粒是最常用的载体形式。然而,本发明意图包括行使等同功能的、从技术上说不属质粒的其他形式的表达载体,例如病毒载体(例如,复制缺陷性逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。这种病毒载体可用于感染受试者和在受试者中表达化合物。优选地,表达控制序列是能够转化或转染真核宿主细胞的载体中的真核启动子系统。一旦载体被掺入到合适的宿主中,宿主维持在适合于编码TRAIL受体结合剂的核苷酸序列的高水平表达、以及TRAIL受体结合剂(例如交叉反应性抗TRAIL受体抗体)的收集和纯化的条件下。参见,一般地,美国申请No.20020199213。这些表达载体一般能够在宿主生物体中作为游离体或作为宿主染色体DNA的组成部分进行复制。通常,表达载体含有选择标记物,例如,氨苄青霉素抗性或潮霉素抗性,以允许检测被希望的DNA序列转化了的那些细胞。载体还可以编码对于指导细胞外抗体片段的分泌有用的信号肽,例如果胶酸裂合酶。参见美国专利5,576,195。
本发明的重组表达载体包含编码具有TRAIL受体结合性质的核酸,该核酸处于适合于该核酸在宿主细胞中表达的形式,意思是所述重组表达载体包括一种或多种基于表达用宿主细胞而选择的、与要表达的核酸序列可操作连接的调节序列。在重组表达载体内,"可操作连接的"意指感兴趣的核苷酸序列以允许所述核苷酸序列表达的方式与调节序列连接(例如,在体外转录/翻译系统中,或者,当载体导入宿主细胞中时,在宿主细胞中)。术语“调节序列”意图包括启动子、增强子和其他表达控制元件(例如,多聚腺苷酸信号)。例如,在Goeddel,GENE EXPRESSION TECHNOLOGY:METHODS IN ENZYMOLOGY 185,Academic Press,San Diego,Calif.(1990)中描述了这些调节序列。调节序列包括在许多种类的宿主细胞中指导核苷酸序列的组成型表达的调节序列,和仅在某些宿主细胞中指导核苷酸序列表达的调节序列(例如,组织特异性调节序列)。本领域技术人员要理解的是,表达载体的设计可能取决于一些因素,例如要转化的宿主细胞的选择、希望的多肽表达水平,等等。作为重组多肽(例如,TRAIL受体结合剂)表达的启动子有用的典型的调节序列包括,例如但不限于,3-磷酸甘油酸激酶和其他糖酵解酶。诱导型的酵母启动子包括,尤其是,来自乙醇脱氢酶、异细胞色素C和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子。在一个实施方式中,编码本发明的TRAIL受体结合剂的多核苷酸与ara B启动子可操作地连接,并可以在宿主细胞中表达。参见美国专利5,028,530。本发明的表达载体可以被导入宿主细胞,从而产生多肽或肽,包括由在此描述的核酸编码的融合多肽(例如,TRAIL受体结合剂,等等)。
本发明的另一个方面涉及表达TRAIL受体结合剂的宿主细胞,其含有编码一种或多种TRAIL受体结合剂的核酸。本发明的重组表达载体可以被设计用于TRAIL受体结合剂在原核或真核细胞中的表达。例如,TRAIL受体结合剂可以在细菌细胞例如大肠杆菌、昆虫细胞(利用杆状病毒表达载体)、真菌细胞例如酵母、酵母细胞或哺乳动物细胞中表达。在Goeddel,GENE EXPRESSION TECHNOLOGY:METHODS IN ENZYMOLOGY 185,Academic Press,San Diego,Calif.(1990)中进一步讨论了适合的宿主细胞。作为选择,重组表达载体可以体外转录和翻译,例如,使用T7启动子调节序列和T7聚合酶。已经描述了通过随机地产生的多核苷酸序列的表达,对制备筛选具有预定性质的多肽例如TRAIL受体结合剂有用的方法。参见美国专利5,763,192、5,723,323、5,814,476、5,817,483、5,824,514、5,976,862、6,492,107、6,569,641。
原核生物中的多肽表达最常见地在带有载体的大肠杆菌中进行,所述载体含有指导融合或非融合多肽表达的组成型或可诱导启动子。融合载体向其中编码的多肽添加许多氨基酸,通常添加到重组多肽的氨基末端。这些融合载体一般服务于三个目的:(i)提高重组多肽的表达,(ii)提高重组多肽的溶解度,以及(iii)通过作为亲和纯化中的配体来帮助重组多肽的纯化。通常,在融合物表达载体中,将蛋白酶水解位点导入到融合模块和重组多肽的连接处,以允许在融合多肽的纯化之后从融合模块分离重组多肽。这些酶和它们的同源识别序列包括因子Xa、凝血酶和肠激酶。典型的融合表达载体包括,例如,pGEX(Pharmacia Biotech Inc;Smith and Johnson,1988.Gene 67:31-40)、pMAL(New England Biolabs,Beverly,Mass.)和pRIT5(Pharmacia,Piscataway,N.J.),其分别将谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合多肽或多肽A融合到目标重组多肽。
适合的诱导型非融合大肠杆菌载体的实例包括pTrc(Amrann等人,(1988)Gene 69:301-315)和pET11d(Studier等人,GENE EXPRESSIONTECHNOLOGY:METHODS IN ENZYMOLOGY 185,Academic Press,SanDiego,Calif.(1990)60-89)。通过多肽融合来靶向组装具有不同活性的肽或蛋白质结构域以产生多功能多肽的方法已经由Pack等人,美国专利6,294,353;6,692,935所描述。一种使大肠杆菌中的重组多肽(例如TRAIL受体结合剂)的表达最大化的策略是在蛋白水解该重组多肽的能力受损的宿主细菌中表达该重组多肽。参见,例如,Gottesman,GENE EXPRESSIONTECHNOLOGY:METHODS IN ENZYMOLOGY 185,Academic Press,SanDiego,Calif.(1990)119-128。另一个策略是改变要插入表达载体中的核酸的核酸序列,从而每个氨基酸的各自密码子是在表达宿主(例如大肠杆菌)中优先被利用的密码子(参见,例如,Wada等人,1992.Nucl.Acids Res.20:2111-2118)。本发明的这种核酸序列的改变可以通过标准的DNA合成技术来进行。
在另一个实施方式中,TRAIL受体结合剂表达载体是酵母表达载体。用于在酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerivisae)中表达的载体的实例包括pYepSecl(Baldari等人,1987.EMBO J.6:229-234)、pMFa(Kurjan和Herskowitz,Cell 30:933-943,1982)、pJRY88(Schultz等人,Gene 54:113-123,1987)、pYES2(Invitrogen Corporation,San Diego,Calif.)和picZ(In VitrogenCorp,San Diego,Calif.)。作为选择,TRAIL受体结合剂可以使用杆状病毒表达载体在昆虫细胞中表达。可用于在培养的昆虫细胞(例如,SF9细胞)中表达多肽(例如TRAIL受体结合剂)的杆状病毒载体包括pAc系列(Smith等人,Mol.Cell.Biol.3:2156-2165,1983)和pVL系列(Lucklow andSummers,1989.Virology 170:31-39)。
在又一个实施方式中,编码本发明的TRAIL受体结合剂的核酸使用哺乳动物表达载体在哺乳动物细胞中表达。哺乳动物表达载体的实例包括但不限于,pCDM8(Seed,.Nature 329:840,1987)和pMT2PC(Kaufman等人,EMBO J.6:187-195,1987)。当在哺乳动物细胞中使用时,通常由病毒调节元件来提供表达载体的控制功能。例如,常用的启动子来源于多瘤病毒(polyoma)、腺病毒2、巨细胞病毒和猿猴病毒40。对于本发明的TRAIL受体结合剂的表达有用的原核和真核细胞的其他适合的表达系统。参见,例如,Sambrook等人,MOLECULAR CLONING:A LABORATORYMANUAL.2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,第16和17章,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989.
在另一个实施方式中,重组哺乳动物表达载体能够指导核酸优先地在特定细胞类型中表达(例如,使用组织特异性调节元件来表达核酸)。组织特异性调节元件是本领域已知的。适合的组织特异性启动子的非限制性实例包括白蛋白启动子(肝脏特异性;Pinkert等人,Genes Dev.1:268-277,1987)、淋巴特异性启动子(Calame和Eaton,Adv.Immunol.43:235-275,1988)、特别是T细胞受体的启动子(Winoto和Baltimore,EMBO J.8:729-733,1989)和免疫球蛋白的启动子(Banerji等人,1983.Cell33:729-740;Queen和Baltimore,Cell 33:741-748,1983.)、神经元特异性启动子((例如,神经丝启动子;Byrne和Ruddle,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:5473-5477,1989)、胰腺特异性启动子(Edlund等人,1985.Science 230:912-916),和乳腺特异性启动子(例如,乳清启动子;美国专利4,873,316和欧洲申请公开264,166)。还包括发育性调节的启动子,例如鼠hox启动子(Kessel和Gruss,Science 249:374-379,1990)和甲胎蛋白启动子(Campes和Tilghman,.Genes Dev.3:537-546,1989)。
本发明进一步提供重组表达载体,其包含以反义方向克隆到表达载体中的本发明的编码TRAIL受体结合剂的DNA分子。也就是说,DNA分子以这样的方式与调节序列可操作地连接,从而能够表达(通过DNA分子的转录)TRAIL受体结合剂mRNA的反义RNA分子。至于与按反义方向克隆的核酸可操作连接的调节序列,可以选择指导反义RNA分子在各种细胞类型中的连续表达的调节序列,例如病毒启动子或增强子,或可以选择指导反义RNA的组成型、组织特异性或细胞类型特异性表达的调节序列。反义表达载体可以是重组质粒、噬菌粒或减毒病毒的形式,其中反义核酸在高效调节区域的控制下产生,其活性可通过导入了该载体的细胞类型来测定。对于利用反义基因调节基因表达的论述。参见,例如,Weintraub等人,"Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis,"Reviews-Trends inGenetics,Vol.1(1)1986。
本发明的另一个方面涉及其中导入了本发明的重组表达载体的宿主细胞。术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”在此可互换地使用。要理解的是,该术语不仅仅指特定的受试者细胞,而且指这种细胞的子代或可能的子代。由于在后代中可能因突变或环境影响而出现某些改变,这种子代实际上可能不与母细胞完全相同,但仍然包括在此处使用的该术语的范围内。
宿主细胞可以是任何原核或真核细胞。例如,TRAIL受体结合剂可以在细菌细胞例如大肠杆菌、昆虫细胞、酵母或哺乳动物细胞中表达。哺乳动物细胞是用于表达编码免疫球蛋白或其片段的核苷酸区段的优选的宿主。参见Winnacker,From Genes To Clones,(VCH Publishers,NY,1987)。本领域已经开发了能够分泌完整的异源蛋白质的许多适合的宿主细胞系,包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系、各种COS细胞系、HeLa细胞、L细胞和骨髓瘤细胞系。优选地,所述细胞是非人类的。这些细胞的表达载体可以包括表达控制序列,例如复制起点,启动子,增强子和必需的加工信息位点,例如核糖体结合位点,RNA剪接位点,多聚腺苷酸位点,和转录终止子序列。Queen等人,Immunol.Rev.89:49,1986。优选的表达控制序列是来自内源的基因、巨细胞病毒、SV40、腺病毒、牛乳头瘤病毒等等的启动子。Co等人,JImmunol.148:1149,1992.其他适合的宿主细胞是本领域技术人员公知的。
可以通过常规转化或转染技术将载体DNA导入到原核或真核细胞中。如在此使用的,术语“转化”和“转染”意指各种本领域已知的用于将外源核酸(例如DNA)导入宿主细胞的技术,包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体转染或电穿孔,基因枪(biolistics)或基于病毒的转染可以用于其他细胞宿主。用于转化哺乳动物的其他方法包括使用聚凝胺(polybrene)、原生质体融合、脂质体、电穿孔和显微注射(一般参见,Sambrook等人,Molecular Cloning)。可以在Sambrook等人(MOLECULARCLONING:A LABORATORY MANUAL.2nd ed.,Cold Spring HarborLaboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989)和其他实验手册中找到转化或转染宿主细胞的适合的方法。根据细胞宿主的种类,含有感兴趣的DNA片段的载体可以通过公知的方法转移到宿主细胞中。
对于哺乳动物细胞的稳定转染,已知的是,取决于使用的表达载体和转染技术,仅小部分细胞可能将外源DNA整合到它们的基因组中。为了鉴定和选择这些整合体,一般将编码选择标记(例如,抗生素抗性)的基因与感兴趣的基因一起导入宿主细胞。各种选择标记包括提供对药物,例如G418、潮霉素和氨甲蝶呤的抗性的那些选择标记。编码选择标记的核酸可以在编码TRAIL受体结合剂的相同载体上导入宿主细胞,或可以在单独的载体上导入。可以通过药物选择来鉴定导入的核酸稳定转染的细胞(例如,纳入了选择标记基因的细胞将生存,而其他细胞将死亡)。
包括本发明的TRAIL受体结合剂的宿主细胞,例如培养中的原核或真核宿主细胞,可以用于生产(即表达)重组TRAIL受体结合剂。在一个实施方式中,所述方法包括在适合的培养基中培养本发明的宿主细胞(其中已经导入了编码TRAIL受体结合剂的重组表达载体),从而产生TRAIL受体结合剂。在另一个实施方式中,所述方法进一步包括从培养基或宿主细胞分离TRAIL受体结合剂的步骤。一旦被表达,从培养基和宿主细胞中纯化TRAIL受体结合剂(例如抗TRAIL受体抗体pRNA抗TRAIL受体抗体相关多肽)的收集物(collections)。TRAIL受体结合剂可以根据本领域的标准方法来纯化,包括HPLC纯化、柱层析、凝胶电泳,等等。在一个实施方式中,TRAIL受体结合剂通过Boss等人,美国专利4,816,397的方法在宿主生物体中产生。通常,抗TRAIL受体抗体链与信号序列一起表达,因而被释放到培养基中。然而,如果宿主细胞天然地不分泌抗TRAIL受体抗体链,可以通过用温和洗涤剂处理来释放抗TRAIL受体抗体链。重组多肽的纯化是本领域公知的,包括硫酸铵沉淀、亲和层析纯化技术、柱层析、离子交换纯化技术、凝胶电泳等等(一般参见Scopes,Protein Purification(Springer-Verlag,N.Y.,1982)。
编码TRAIL受体结合剂的多核苷酸,例如抗TRAIL受体抗体编码序列,可以掺入转基因中,用于导入转基因动物的基因组,随后在该转基因动物的乳汁中表达。参见,例如,美国专利5,741,957、5,304,489和5,849,992。适合的转基因包括与来自乳腺特异性基因,例如酪蛋白或β-乳球蛋白的启动子和增强子可操作连接的轻链和/或重链的编码序列。为产生转基因动物,可以将转基因显微注射到受精的卵母细胞中,或可以掺入胚胎干细胞的基因组中,并这些细胞的核转移到去核的卵母细胞中。
单链抗体.在一个实施方式中,本发明的结合剂是单链抗TRAIL受体抗体。根据本发明,可以将一些技术加以调适用于生产对TRAIL受体多肽特异性的单链抗体(参见,例如,美国专利4,946,778)。可以用于产生本发明的单链Fv和抗体的技术的实例包括在美国专利4,946,778和5,258,498;Huston等人,Methods in Enzymology,203:46-88,1991;Shu,L等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:7995-7999,1993;和Skerra等人,Science 240:1038-1040,1988中公开的那些。
嵌合抗体和人源化抗体.在一个实施方式中,本发明的结合剂是嵌合的抗TRAIL受体抗体。在一个实施方式中,本发明的结合剂是人源化的抗TRAIL受体抗体。在本发明的一个实施方式中,供者抗体和受者抗体是来自不同物种的单克隆抗体。例如,受者抗体是人类抗体(以使得它在人类中的抗原性最小化),在这种情况下,如此产生的CDR移植的抗体被称为“人源化”抗体。
可以使用标准重组DNA技术产生的重组抗TRAIL受体抗体,例如包含人类和非人类部分的嵌合和人源化单克隆抗体,处在本发明的范围之内。对于某些应用,包括本发明的结合剂在人体中的体内使用以及这些试剂用于体外检测分析的应用,优选的是使用嵌合的、人源化的或人类抗TRAIL受体抗体。这些嵌合的和人源化的单克隆抗体可以通过本领域已知的重组DNA技术产生。这些有用的方法包括,例如但不限于,在国际申请PCT/US86/02269;美国专利5,225,539;欧洲专利184187,欧洲专利171496;欧洲专利173494;PCT国际公开WO 86/01533;美国专利4,816,567;5,225,539;欧洲专利125023;Better等人,1988.Science 240:1041-1043;Liu等人,1987.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:3439-3443;Liu等人,1987.J.Immunol.139:3521-3526;Sun等人,1987.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:214-218;Nishimura等人,1987.Cancer Res.47:999-1005;Wood等人,1985.Nature 314:446-449;Shaw等人,1988.J.Natl.Cancer Inst.80:1553-1559);Morrison(1985)Science 229:1202-1207;Oi等人(1986)BioTechniques 4:214;Jones等人,1986.Nature 321:552-525;Verhoeyan等人,1988.Science239:1534;Morrison,Science 229:1202,1985;Oi等人,BioTechniques 4:214,1986;Gillies等人,J.Immunol.Methods,125:191-202,1989;美国专利No.5,807,715;和Beidler等人,1988.J.Immunol.141:4053-4060中描述的方法。例如,抗体可以使用各种技术,包括CDR移植(EP 0 239 400;WO91/09967;美国专利5,530,101;5,585,089;5,859,205;6,248,516;EP460167)、饰面(veneering)或表面重修(resurfacing)(EP 0 592 106;EP 0 519 596;PadlanE.A.,Molecular Immunology,28:489-498,1991;Studnicka等人,ProteinEngineering 7:805-814,1994;Roguska等人,PNAS 91:969-973,1994)和链改组(chain shuffling)(美国专利NO.5,565,332)来人源化。在一个实施方式中,编码鼠抗TRAIL受体单克隆抗体的cDNA用限制性内切酶消化,所述限制性内切酶被特别地选择来移动编码Fc恒定区的序列,替换编码人类Fc恒定区的cDNA的相当的部分(参见Robinson等人,PCT/US86/02269;Akira等人,欧洲专利申请184,187;Taniguchi,欧洲专利申请171,496;Morrison等人,欧洲专利申请173,494;Neuberger等人,WO 86/01533;Cabilly等人,美国专利4,816,567;Cabilly等人,欧洲专利申请125,023;Better等人(1988)Science 240:1041-1043;Liu等人(1987)Proc Natl Acad Sci USA84:3439-3443;Liu等人(1987)J Immunol 139:3521-3526;Sun等人(1987)Proc Natl Acad Sci USA 84:214-218;Nishimura等人(1987)Cancer Res 47:999-1005;Wood等人(1985)Nature 314:446-449;and Shaw等人(1988)JNatl Cancer Inst 80:1553-1559);美国专利6,180,370;美国专利6,300,064;6,696,248;6,706,484;6,828,422。
在一个实施方式中,本发明容许构建人源化的抗TRAIL受体抗体,其不太可能诱导人类抗小鼠抗体(以下称为“HAMA”)应答,而仍然具有有效的抗体效应物功能。如在此使用的,术语“人类”和“人源化的”,就抗体而言,涉及任何预计在人类受试者中引发治疗上可耐受的弱免疫原性反应的抗体。在一个实施方式中,本发明提供了人源化的TRAIL-R1和/或TRAIL-R2双特异性抗体,CTB003或hCTB003重链和轻链免疫球蛋白。
CDR抗体.在一个实施方式中,本发明的结合剂是抗TRAIL受体CDR抗体。一般地,用于产生抗TRAIL受体CDR抗体的供者和受者抗体是来自不同物种的单克隆抗体;一般受者抗体是人类抗体(以使它在人体中的免疫原性最小化),在这种情况下,如此产生的CDR移植的抗体被称为“人源化的”抗体。移植物可以是受者抗体的单个VH或VL内的单个CDR(或甚至单个CDR的一部分),或可以是VH和VL之一或两者之内的多个CDR(或其部分)。很多时候,受者抗体的所有可变域中的所有三个CDR都将被相应的供者CDR替换,尽管人们只需要替换必需数目的CDR以允许产生的CDR移植抗体对MetAp3的充分结合。产生CDR移植的抗体和人源化抗体的方法在Queen等人,美国专利5,585,089,美国专利5,693,761;美国专利5,693,762;和Winter U.S.5,225,539;以及EP 0682040中有所教导。制备VH和VL多肽的有用方法在Winter等人,美国专利4,816,397;6,291,158;6,291,159;6,291,161;6,545,142;EP 0368684;EP0451216;EP0120694中有所教导。
在从同一家族和/或同一家族成员选择了适合的候选框架区域之后,通过将来源物种的CDR移植到杂合框架区域中来产生重链和/或轻链可变区。,具有杂合(就上述两个方面中的任一个而言)的可变链区域的杂合抗体或杂合抗体片段的组装可以使用本领域技术人员已知的常规方法来实现。例如,编码在此描述的杂合可变域(即,基于目标物种的框架和来源物种的CDR)的DNA序列可以通过寡核苷酸合成和/或PCR来产生。也可以使用适合的限制性内切酶从来源物种抗体分离编码CDR区域的核酸,并通过用适合的连接酶连接来将其连接到目标物种框架中。作为选择,可以通过定点诱变来改变来源物种抗体的可变链的框架区域。
由于杂合体是从对应于各个框架区域的多个候选物之中的选择来构建的,存在着许多可以依照本文描述的原则来进行构建的序列组合。因而,可以组装杂合体的文库,这样的文库的成员具有单个框架区域的不同组合。这种文库可以是序列的电子数据库集合或杂合体的实体集合。
这个过程一般不改变位于被移植的CDR侧面的受者抗体的FR。然而,本领域技术人员有时可以通过替换给定FR的某些残基来使得FR更类似于相应的供者抗体的FR,来改善产生的抗TRAIL受体CDR移植抗体的抗原结合亲和力。优选的替换位置包括邻近CDR的氨基酸残基,或者能够与CDR相互作用的残基(参见,例如,US 5,585,089,特别是第12-16栏)。或者本领域技术人员可以从供者FR开始,对它进行修饰来使它更类似于受者FR或人类共有FR。产生这些修饰的技术是本领域已知的。特别地,如果产生的FR在该位置符合人类共有FR,或与这种共有FR有至少90%或更高的同一性,那么这样做可能不会使得到的修饰的抗TRAIL受体CDR抗体的抗原性与具有完全人类FR的相同抗体相比发生显著提高。
融合蛋白.在一个实施方式中,本发明的结合剂是融合蛋白。本发明的TRAIL受体结合剂当与第二种蛋白质融合时,可以用作抗原标签。可以融合到多肽的结构域的实例不仅包括异源信号序列,还包括其他异源功能区域。融合不一定需要是直接的,可以通过接头序列来融合。此外,本发明的融合蛋白也可以被工程化来改善TRAIL受体结合剂的特征。例如,可以将由其他氨基酸,特别是带电氨基酸构成的区域添加到TRAIL受体结合剂的N-末端,来改善在从宿主细胞纯化或后续的处理和保存期间的稳定性和持久性。并且,可以将肽模块添加到TRAIL受体结合剂以便于纯化。这些区域可以在TRAIL受体结合剂的最终制备之前予以去除。添加肽模块以便于多肽的处理是本领域惯用的和常规的技术。本发明的TRAIL受体结合剂可以融合到标记物序列,例如,便于融合多肽的纯化的肽。在优选的实施方式中,标记物氨基酸序列是六聚组氨酸肽,例如在pQE载体(QIAGEN,Inc.,9259 Eton Avenue,Chatsworth,Calif.,91311)等中提供的标签,它们中许多是商业上可获得的。如Gentz等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:821-824,1989中描述的,六聚组氨酸使得纯化融合蛋白易于进行。对于纯化有用的另一个肽标签,“HA”标签,对应于来自流感血凝素蛋白质的表位。Wilson等人,Cell 37:767,1984。
因而,这些上述融合物的任一种可以利用本发明的多核苷酸或多肽来工程化。并且,融合蛋白可以显示增加的体内半衰期。
具有二硫键连接的二聚结构(由于IgG)的融合蛋白,与单独的单体型分泌蛋白质或蛋白质片段相比,在结合和中和其他分子方面可能是更有效的。Fountoulakis等人,J.Biochem.270:3958-3964,1995.
类似地,EP-A-O 464 533(对应于加拿大的2045869)公开了一些融合蛋白,它们包含免疫球蛋白的恒定区的不同部分以及另一种人类蛋白质或其部分的。在很多情况下,融合蛋白中的Fc部分对于治疗和诊断是有益的,因而可以产生,例如,改善的药物动力学性质。参见EP-A 0232 262。作为选择,可能希望在表达、检测和纯化了融合蛋白之后删除Fc部分。例如,如果融合蛋白被用作免疫的抗原,Fc部分可能阻碍治疗和诊断。在药物发现中,例如,人类蛋白质,如hIL-5已经与Fc部分融合,为了高通量筛选分析来鉴定hIL-5的拮抗剂。Bennett等人,J.Molecular Recognition 8:52-58,1995;Johanson等人,J.Biol.Chem.,270:9459-9471,1995。
通过T细胞表位修饰的治疗蛋白质的去免疫(de-immunization).临床使用中的许多治疗蛋白质已经显示了引发不希望的抗体应答,这些应答在某些情况下伴随着不良事件。在本发明的一个实施方式中,通过鉴定重组抗TRAIL受体抗体、TRAIL受体多肽或TRAIL受体结合剂的氨基酸序列中对于给定物种的T细胞的一个或多个潜在的表位,并修饰所述氨基酸序列来消除至少一个T细胞表位,使得所述抗体、多肽或结合剂对于给定的物种具有非免疫原性或较低的免疫原性。这样就消除了或降低了多肽或蛋白质暴露于给定物种的免疫系统时所述多肽或蛋白质的免疫原性。这样的去免疫化对单克隆抗体和其他免疫球蛋白样分子可能特别有益,例如,可以对小鼠衍生的免疫球蛋白加以去免疫以用于人类治疗用途。对于去免疫多肽或蛋白质的方法,参见,例如,Carr等人,美国专利申请20030153043;和De Groot等人,AIDS Res.and Human Retroviruses 13:539-541(1997);Schafer等人,Vaccine 16:1880-1884(1998);De Groot等人,Dev.Biol.112:71-80(2003);De Groot等人,Vaccine 19:4385-4395(2001);Reijonen and KwokMethods 29:282-288;Novak等人,J.Immunology 166:6665-6670(2001)。
在一个实施方式中,使用编码作为融合蛋白的一部分的候选结合剂(其中这些融合蛋白在宿主细胞中表达时形成包涵体)的基因组DNA或EST来制备本发明的TRAIL受体结合剂。这种编码作为融合蛋白的一部分的候选结合剂(其中这些融合蛋白在宿主细胞中表达时形成包涵体)的基因组DNA或EST的制备方法已经有所描述,参见专利6,653,068;U.S.S.N.20040157291。例如,包涵体可用于产生特异性结合目标(多)肽的结合配偶体,例如TRAIL受体结合剂。
TRAIL受体结合剂缀合蛋白如上所述,在某些优选的实施方式中,本发明的TRAIL受体结合剂是抗TRAIL受体抗体或抗TRAIL受体抗体相关多肽,其偶联或缀合于一种或多种治疗性或细胞毒性模块来产生本发明的TRAIL受体结合剂缀合蛋白。任选地,本发明的TRAIL受体结合剂可用作TRAIL受体结合剂-细胞毒素缀合分子,例如用于肿瘤疾病治疗的施用。
一般地,治疗模块可以缀合于本发明的TRAIL受体结合剂,例如,通过任何合适的技术,同时适当地考虑药物动力学稳定性和降低对受试者的总体毒性的需要。治疗性、细胞毒性、或标记/显象试剂(即,“模块”)可以直接或间接(例如通过接头基团)偶联于适合的TRAIL受体结合剂。当模块和TRAIL受体结合剂各自具有能够相互起作用的功能基团时,模块和TRAIL受体结合剂之间的直接反应是可能的。例如,亲核基团,例如氨基或巯基基团,能够与含有羰基的基团例如酐或酸性卤化物(acid halide)反应,或与含有良好的离去基团(例如卤素)的烷基(alkyl group)反应。作为选择,可以使用适合的化学接头基团。接头基团可以起间隔区的作用,使所述模块远离所述TRAIL受体结合剂,以避免对结合能力的干扰。接头基团也可以用来提高所述模块或TRAIL受体结合剂上的取代基的化学反应性,并从而提高偶联效率。化学反应性的提高也可以使得本不可能使用的模块或模块上的功能基团变得容易使用。
适合的连接化学包括马来酰亚胺基接头和烷基卤接头(其与抗体模块上的巯基反应)和琥珀酰亚胺基接头(其与抗体模块上的伯胺反应)。几个伯胺和巯基基团存在于免疫球蛋白上,其他的基团可以设计到重组免疫球蛋白分子中。对于本领域技术人员明显的是,各种双官能或多官能试剂,包括同官能和异官能的(例如,在Pierce Chemical Co.,Rockford,Ill.的目录中描述的那些),可以用作接头基团。结合可以例如通过氨基、羧基、巯基或氧化的糖残基来进行(参见,例如,美国专利4,671,958)。
作为备选的偶联方法,可以,例如,经由糖基化位点处的氧化的糖基团将模块偶联到本发明的TRAIL受体结合剂上,如在美国专利5,057,313和5,156,840中描述的。结合TRAIL受体结合剂到所述部分上的又一个可选择的方法是通过使用非共价结合配对,例如,链霉抗生物素蛋白/生物素,或抗生物素蛋白/生物素。在这些实施方式中,将所述配对的一个成员共价结合到TRAIL受体结合剂,结合配对的另一个成员共价结合到所述模块上。
可裂解(cleavable)的接头.如果本发明的免疫缀合物的细胞毒性或治疗模块在没有TRAIL受体结合剂部分时效力更强,则可能希望是使用这样的接头基团,其在内在化到细胞中的期间或当时可裂解,或在细胞外环境中可随着时间逐渐地裂解。已经描述了许多不同的可裂解接头基团。在细胞内将细胞毒性模块从这些接头基团上释放的实例包括,例如,但不限于,通过二硫键的还原来裂解(例如,美国专利4,489,710)、通过对光不稳定键的照射(例如,美国专利4,625,014)、通过衍生化的氨基酸侧链的水解(例如,美国专利4,638,045)、通过血清补体介导的水解(例如,美国专利4,671,958),和酸催化的水解(例如,美国专利4,569,789)。
在一个实施方式中,本发明的TRAIL受体结合剂与超过一种治疗性、细胞毒性和/或显像模块结合。通过多衍生化(poly-derivatizing)本发明的TRAIL受体结合剂,可以同时地实现几种细胞毒策略,可以将TRAIL受体结合剂制成对几种可视化技术有用的造影剂,或可以对治疗性抗体加以标记以用于通过可视化技术来追踪。在一个实施方式中,将细胞毒性模块的多个分子连接到一个TRAIL受体结合剂上。在一个实施方式中,将本发明的TRAIL受体结合剂与至少两种模块的混合物偶联,所述模块选自由细胞毒性模块、治疗模块、和标记/显像模块构成的组。也就是说,多于一种类型的模块可以连接到一个TRAIL受体结合剂上。例如,治疗模块,例如多核苷酸或反义序列,可以与细胞毒性或放射毒性模块一起缀合于TRAIL受体结合剂,以提高化学或放射毒性治疗的有效性,以及降低获得希望的治疗效果所必需的剂量。不考虑特定的实施方式,可以以各种方式制备与多于一种模块所成的免疫缀合物。例如,可以将多于一种模块直接偶联到TRAIL受体结合剂上,或者可以使用提供多个附接位点的接头(例如,树枝状聚合物(dendrimers))。作为选择,可以使用具有容纳多于一种细胞毒模块的容量的载体。
如上文说明的,TRAIL受体结合剂可以以各种方式携带所述模块,包括直接或经由接头基团的共价键合,和非共价的缔合。在一个实施方式中,TRAIL受体结合偶联的蛋白质可以与封装载体组合。这在化学毒性治疗实施方式中是特别有用的,因为它们可以容许治疗组合物随着时间逐渐地释放TRAIL受体结合剂化学毒性模块,同时将它浓缩在目标细胞的附近。
与放射性核素缀合的TRAIL受体结合剂.在一个实施方式中,本发明的TRAIL受体结合剂与细胞毒性模块偶联,所述细胞毒性模块是放射性核素。优选用作本发明的细胞毒性模块的放射性核素是适合于药理学施用的放射性核素。这些放射性核素包括123I、125I、131I、90Y、211At、67Cu、186Re、188Re、212pb、和212Bi。碘和砹同位素是用于本发明的治疗组合物中的更优选的放射性核素,关于它们的用途已经积累了大量的文献。131I是特别优选的,其他的β-辐射发射性核素也是,它们具有几毫米的有效范围。123I、125I、131I或211At可以与TRAIL受体结合剂缀合,用于利用几种已知的缀合试剂的组合物和方法中,所述已知的缀合试剂包括非水溶性碘化试剂(lodogen)、3-[211At]砹代苯甲酸(astatobenzoate)N-琥珀酰亚胺酯、3-[131I]碘代苯甲酸N-琥珀酰亚胺酯(SIB)和5-[131I]碘-3-吡啶羧酸N-琥珀酰亚胺酯(SIPC)。可以在上述碘代试剂中利用任何碘同位素。其他放射性核素可以通过核医学领域的技术人员已知的适合的螯合试剂缀合到本发明的TRAIL受体结合剂上。
化学毒性模块.在一个实施方式中,本发明的TRAIL受体结合剂与化学毒性模块偶联。在本发明中有用的优选的化学毒性试剂包括,但不限于,小分子药物,例如氨甲蝶呤,和嘧啶和嘌呤类似物。优选的化学毒素分化诱导物包括佛波醇酯和丁酸。化学毒性模块可以直接缀合于本发明的TRAIL受体结合剂。在一个实施方式中,本发明的TRAIL受体结合剂经由化学接头缀合于细胞毒性模块。在另一个实施方式中,模块被封装在载体中,载体则偶联于本发明的TRAIL受体结合剂。
蛋白质毒素.在一个实施方式中,本发明的TRAIL受体结合剂与蛋白质毒素模块偶联。用作本发明的细胞毒性模块的优选的毒素蛋白质包括,例如但不限于,放线菌或链霉菌抗生素、duocarmycin、紫杉醇(taxol)、细胞松弛素(cytochalasin)B、短杆菌肽D(gramicidin D)、溴化乙锭(ethidiumbromide)、依米丁(emetine)、丝裂霉素C(mitomycin)、鬼臼乙叉甙(etoposide)、鬼臼噻吩甙(tenoposide)、长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、秋水仙碱(colchicin)、阿霉素(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、二羟炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin didne)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光神霉素(mithramycin)、放线菌素D(actinomycin D)、1-去氢睾酮(1-dehydrotestosterone)、糖皮质激素(glucocorticoids)、普鲁卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛尔(propranolol)和嘌呤霉素(puromycin)和其类似物或同源物。用作细胞毒性模块的优选的毒素蛋白质进一步包括蓖麻毒蛋白(ricin)、相思豆毒蛋白(abrin)、白喉毒素(diphtheriatoxin)、霍乱毒素(cholera toxin)、白树毒素(gelonin)、假单胞菌外毒素(Pseudomonas exotoxin)、志贺氏菌毒素(Shigella toxin)、商陆抗病毒蛋白(pokeweed antiviral protein)和医学生物化学领域已知的其他毒素蛋白质。由于这些毒素试剂可能在受试者中引发不希望的免疫应答,如果血管内注射尤为如此,因此优选是将它们封装在载体中用于偶联到本发明的TRAIL受体结合剂,例如本发明的抗TRAIL受体抗体和抗体相关多肽。
酶活性毒素.在一个实施方式中,本发明的TRAIL受体结合剂与酶活性毒素结合。酶活性毒素可以是细菌或植物来源的,或这种毒素的酶活性片段(“A链”)。在本发明中有用的的酶活性毒素和其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素(modeccin)A链、α-帚曲菌素(α-sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白质、石竹素(dianthin)蛋白质、美洲商陆(Phytolacca americana)蛋白质(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制物、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(Sapaonaria officinalis)抑制物、白树毒素(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素和伊诺霉素。本发明的TRAIL受体结合剂与细胞毒性模块的缀合物可以使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备。这些试剂的实例有:SPDP;IT;亚氨酸酯(诸如盐酸二甲基己二酰亚胺酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对重氮苯甲酰基)乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)的双功能衍生物。毒素的溶解性部分(lysingportion)可以与抗体(例如TRAIL受体结合剂)的Fab片段连接。
治疗性模块.在一个实施方式中,本发明的TRAIL受体结合剂与治疗模块偶联。本发明的治疗部分包括,例如但不限于,抗代谢物(例如,氨甲蝶呤(methotrexate)、巯嘌呤(6-mercaptopurine)、6-硫代鸟嘌呤(6-thioguanine)、阿糖胞苷(cytarabine)、5-氟尿嘧啶氨烯咪胺(5-fluorouracildecarbazine)),烷化剂(例如,氮芥(mechlorethamine)、塞替派瘤可宁(thioepachlorambucil)、美法仑(melphalan)、卡莫司汀(carmustine,BSNU)和洛莫司汀(lomustine,CCNU)、环磷酰胺(cyclothosphamide)、白消安(busulfan)、二溴甘露醇(dibromomannitol)、链唑霉素(streptozotocin)、丝裂霉素C(mitomycin C)和顺式二氯二胺铂(cis-dichlorodiamine platinum)(II)(DDP)顺铂),蒽环类抗生素(anthracyclines)(例如,柔红霉素(daunorubicin)(旧称道诺霉素(daunomycin))和阿霉素(doxorubicin)),抗生素(例如,放线菌素D(dactinomycin)(旧称放线菌素(actinomycin))、博来霉素(bleomycin)、光神霉素(mithramycin)和氨茴霉素(anthramycin)(AMC))、阿霉素(doxorubicin)(亚德里亚霉素(adriamycin))、顺铂、硫酸博来霉素(bleomycin sulfate)、卡莫司汀(carmustine)、瘤可宁(chlorambucil)、环磷酰胺羟基脲(cyclophosphamide hydroxyurea)或蓖麻毒蛋白A(ricin A),和抗有丝分裂试剂(例如,长春新碱(vincristine)和长春碱(vinblastine))。
将这种治疗模块缀合到本发明的TRAIL受体结合剂的技术是公知的,参见,例如,Arnon等人,“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting OfDrugs In Cancer Therapy”,in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy,Reisfeld等人(编),pp.243-56(Alan R.Liss,Inc.1985);Hellstrom等人,“Antibodies For Drug Delivery”,in Controlled Drug Delivery(2nd Ed.),Robinson等人(编),pp.623-53(Marcel Dekker,Inc.1987);Thorpe,“AntibodyCarriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review”,in MonoclonalAntibodies‘84:Biological And Clinical Applications,Pinchera等人(编),pp.475-506(1985);“Analysis,Results,And Future Prospective Of TheTherapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”,in MonoclonalAntibodies For Cancer Detection And Therapy,Baldwin等人(编),pp.303-16(Academic Press 1985),和Thorpe等人,“The Preparation And CytotoxicProperties Of Antibody-Toxin Conjugates”,Immunol.Rev.,62:119-58(1982)。
标记的TRAIL受体结合剂.在一个实施方式中,本发明的TRAIL受体结合剂与标记模块,即可检测基团结合。缀合于本发明的TRAIL受体结合剂的特定的标记物或可检测基团不是本发明的关键方面,只要它不显著地影响本发明的TRAIL受体结合剂对TRAIL受体多肽或TRAIL受体样多肽的特异性结合。可检测基团可以是具有可检测的物理或化学性质的任何材料。这些可检测标记在免疫分析和显像领域已经得到了良好的开发,一般地,在这些方法中有用的几乎任何标记物都可以用于本发明中。因而,标记物是可由分光的、光化学的、生物化学的、免疫化学的、电的、光学的或化学的手段检测的任何组合物(composition)。在本发明中有用的标记物包括磁性珠子(例如,DynabeadsTM)、荧光染料(例如,异硫氰酸荧光素、Texas红、罗丹明,等等)、放射性标记物(例如,3H、14C、35S、125I、121I、112In、99mTc),其他的显像试剂,例如微泡(microbubbles)(用于超声波显像)、18F、11C、15O、(用于正电子发射层析成像)、99mTC、111In(用于单光子发射层析成像)、酶(例如,辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和其他通常在ELISA中使用的酶),和量热标记物,例如胶体金或有色玻璃或塑料(例如,聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶,等等)珠子。描述了这些标记物的用途的专利包括美国专利3,817,837;3,850,752;3,939,350;3,996,345;4,277,437;4,275,149和4,366,241,为了所有目的通过引用将它们每一个完全并入本文。也参见Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals(6thEd.,Molecular Probes,Inc.,Eugene OR.)。
标记物可以根据本领域公知的方法直接或间接地偶联到测定系统的希望组分上。如上所指出,可以使用各种各样的标记物,标记物的选择取决于需要的敏感性、与化合物缀合的便利性、稳定性要求、可用的测试设备和处置规定。
非放射性标记通常通过间接的方式来附接。一般地,配体分子(例如生物素)共价地结合于分子。配体然后连接于抗配体(例如,链霉抗生物素蛋白)分子,抗配体本身可被检测或者共价结合于信号系统,例如,可检测的酶、荧光化合物,或化学发光化合物。可以使用多种配体和抗配体。当配体具有天然的抗配体时,例如,生物素、甲状腺素和可的松,它可以与标记的、天然存在的抗配体结合使用。作为选择,任何半抗原性或抗原性化合物可以用于与抗体,例如抗TRAIL受体抗体组合。
分子也可以直接缀合于信号发生化合物,例如,与酶或荧光基团缀合。作为标记物感兴趣的酶将主要是水解酶,特别是磷酸酶、酯酶和糖苷酶,或氧化还原酶,特别是过氧化物酶。作为标记模块有用的荧光化合物包括但不限于,例如,荧光素和它的衍生物,罗丹明和它的衍生物、丹磺酰、伞形酮,等等。作为标记模块有用的化学发光化合物包括,但不限于,例如,萤光素和2,3-二氢酞嗪二酮(2,3-dihydrophthalazinediones),例如,鲁米诺。对于可以使用的各种标记和信号产生系统的综述,参见,美国专利4,391,904。
检测标记物的方法是本领域技术人员公知的。因而,例如,当标记物是放射性标记时,检测的手段包括闪烁计数器或放射自显影中的感光胶片。当标记物是荧光标记物时,它可以通过用合适波长的光线激发荧光染料并检测产生的荧光来检测。荧光可以通过目视、通过感光胶片、通过使用电子探测器例如电荷耦合器件(CCD)或光电倍增器等等来检测。类似地,酶标记物可以通过提供合适的酶底物并检测产生的反应产物来检测。最后,简单的比色标记物可以仅通过观察与标记物相关的颜色来检测。因而,在各种浸渍测定中,缀合的金常常呈现粉色,而各种缀合的珠子呈现珠子的颜色。
某些测定模式不需要使用标记的成分。例如,凝集测定可以用于检测目标抗体,例如抗TRAIL受体抗体的存在。在这种情况下,抗原包被的颗粒通过包含目标抗体的样品来凝聚。在这种形式中,没有组分需要被标记,目标抗体的存在通过简单的目测检查来检测。
药物组合物的配制剂.本发明的TRAIL受体结合剂可以掺入适合于施用的药物组合物中。药物组合物一般包含至少一种TRAIL受体结合剂和处于适合于向受试者施用的形式的药学上可接受的载体。药学上可接受的载体部分地根据要施用的特定组合物,以及根据用于施用组合物的特定方法来确定。因而,存在着各种各样的适合的药物组合物的制剂用于施用所述抗体组合物(参见,例如,Remington’s Pharmaceutical Sciences,MackPublishing Co.,Easton,PA 18thed.,1990)。药物组合物一般地被配制为无菌的,基本上等渗的,并完全符合美国食品和药品管理局的所有的优质生产规范(GMP)规则。
术语“药学上可接受的”、“生理学上可耐受的”和其语法上的变体,当涉及组合物、载体、稀释剂和试剂时,可互换使用,表明所述材料能够施用给受试者而不产生阻止所述组合物的施用的程度的不良生理影响。例如,“药学上可接受的赋形剂”是指在制备一般安全、无毒、可取的药物组合物中有用的赋形剂,并且包括对于兽医学用途以及人类药物用途可接受的赋形剂。这些赋形剂可以是固体、液体、半固体,或对于气雾剂组合物来说,是气体。“药学上可接受的盐和酯”是指药学上可接受的并具有希望的药理学性质的盐和酯。这些盐包括在酸性质子存在于TRAIL受体结合剂中时可以形成、并能够与无机或有机碱反应的盐。适合的无机盐包括与碱金属,例如钠和钾、镁、钙和铝形成的无机盐。适合的有机盐包括与有机碱,例如胺碱,例如,乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨丁三醇、N-甲基葡糖胺等等形成的有机盐。这些盐还包括与无机酸(例如,盐酸和氢溴酸)和有机酸(例如,乙酸、柠檬酸、顺丁烯二酸和烷烃和芳烃-磺酸,例如甲磺酸和苯磺酸)形成的酸加成盐。药学上可接受的酯包括从存在于TRAIL受体结合剂上的羧基、磺酰氧基、和膦羧基(phosphonoxy)基团形成的酯,例如,C1-6烷基酯。当存在两个酸性基团时,药学上可接受的盐或酯可以是单酸单盐或酯,或二盐或酯;类似地,当存在超过两个酸性基团时,某些或者所有这些基团可以被盐化或酯化。本发明中述及的TRAIL受体结合剂可以以未盐化或未酯化的形式存在,或处于盐化和/或酯化形式,对这样的TRAIL受体结合剂的提述意图包括最初的(未盐化和未酯化的)化合物和它的药学上可接受的盐或和酯。并且,本发明中提述的某些TRAIL受体结合剂可以以超过一种立体异构形式存在,这种TRAIL受体结合剂的提述意图包括所有单立体异构体和这些立体异构体的所有混合物(无论是外消旋的还是相反)。对于本发明的特定药物和组合物,本领域的普通技术人员将不难确定施用的合适的时间、顺序和剂量。
这些载体或稀释剂的优选的实例包括,但不限于,水、盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液和5%人血清白蛋白。也可以使用脂质体和非水媒介物,例如不挥发油。这些介质和化合物用于药学活性物质的用途是本领域公知的。除非任何常规的介质或化合物与TRAIL受体结合剂不相容,本发明考虑其在治疗组合物中的使用。补充的活性化合物也可以掺入到组合物中。
本发明的药物组合物被配制以适合于它预期的施用途径。本发明的TRAIL受体结合剂组合物可以通过胃肠外的、表面的、静脉内的、口服的、皮下的、动脉内的、皮内的、穿表皮的、直肠的、颅内的、腹膜内的、鼻内的、肌肉内的途径,或作为吸入物来施用。免疫原性剂如TRAIL受体多肽的最典型的施用途径是皮下途径,而其他途径可以是同样有效的。第二最常规的途径是肌内注射。这种类型的注射最一般地在手臂或腿部肌肉中进行。在本发明的某些方法中,试剂被直接注射到积累了沉积物(deposits)特定的组织中,例如颅内注射。静脉内输注或肌肉内注射(intramuscularinjection on intravenous infusion)对于TRAIL受体结合剂,例如抗TRAIL受体抗体的施用是优选的。在某些方法中,本发明的特定的TRAIL受体结合剂直接注射到颅骨中。在某些方法中,本发明的TRAIL受体结合剂作为持续释放组合物或装置,例如MedipadTM设备来施用。
本发明的TRAIL受体结合剂任选地可以与其他试剂组合地施用,所述其他试剂在治疗各种疾病,包括各种TRAIL受体相关疾病中是至少部分有效的。在向受试者的中枢神经系统施用的情况下,本发明的TRAIL受体结合剂也可以与提高本发明的试剂对血脑屏障的跨越的其他试剂一起施用。
用于胃肠外的、皮内的或皮下施用的溶液或悬浮液可以包括以下的成分:无菌的稀释剂例如注射用水、盐水溶液、不挥发油类、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成的溶剂;抗菌化合物例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯;抗氧化剂例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠;螯合化合物例如乙二胺四乙酸(EDTA);缓冲剂例如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐,以及用于调整张度的化合物例如氯化钠或葡萄糖。使用酸或碱,例如盐酸或氢氧化钠,可以调节pH值。胃肠外的制品可以封装到由玻璃或塑料制成的安瓿瓶、一次性注射器或多剂量小瓶中。
适合于可注射使用的药物组合物一般包括无菌水溶液(在水可溶时)或分散体,以及用于无菌可注射溶液或分散体的临时制备的无菌粉剂。对于静脉内施用,适合的载体包括,生理盐水、抑菌水、克列莫佛(Cremophor)ELTM(BASF;Parsippany,N.J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下,组合物应当是无菌的,并应当具有易于通针(easy syringeability)的程度的流动性。它在制造和储存条件下必须是稳定的,并且必须保持不受抗微生物例如细菌和真菌的污染作用。载体可以是溶剂或分散介质,其含有,例如,水、乙醇、多元醇(例如,甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等等)、以及其适合的混合物。适当的流动性可以通过下述方式维持:例如,通过使用包衣例如卵磷脂;在分散体的情况下通过维持所需的粒子大小;以及通过使用表面活性剂。可以通过各种抗菌和抗真菌化合物,例如,对羟苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等等,来实现对微生物作用的防护。在很多情况下,组合物中优选包括等渗化合物,例如,糖类、多元醇如甘露醇、山梨醇、氯化钠。通过在组合物中包括延迟吸收的化合物,例如单硬脂酸铝和明胶,可以实现可注射组合物的延长的吸收。
可以通过将TRAIL受体结合剂以所需的量掺入到具有一种上文列举的成分或上文列举的成分的组合的适合的溶剂中,根据需要,继之以过滤灭菌,来制备无菌可注射溶液。一般地,通过将结合剂掺入到含有基础分散介质以及来自以上列举那些的其他所需成分的无菌运载体中,来制备分散体。对于用于制备无菌可注射溶液其无菌粉剂来说,制备方法是通过真空干燥和冻干产生粉剂,这样的粉剂包含活性成分以及任何期望的成分,后者来自所述成分的事先经无菌过滤的溶液。本发明的试剂可以以储库注射剂(depot injection)或植入制剂的形式施用,这样的试剂可以配制成允许活性成分的持续或脉冲释放的形式。
口服组合物一般包括惰性稀释剂或可食用的载体。它们可以包装入胶囊中或压缩成片剂。对于口服治疗施用来说,粘合剂可以与赋形剂混合,以片剂、锭剂或胶囊的形式使用。口服组合物也可以施用液体载体制备来用作漱口水,其中所述液体载体中的化合物口服地应用并被吸入和吐出或吞咽。可以包括药学上相容的结合化合物、和/或佐剂材料作为组合物的一部分。片剂、药丸、胶囊、锭剂等等可以含有任何以下的成分,或性质类似的化合物:粘合剂,例如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶;赋形剂,例如淀粉或乳糖,崩解化合物,例如海藻酸、乙醇酸淀粉钠(Primogel)或玉米淀粉;润滑剂,例如硬脂酸镁或氢化植物油(STEROTES);助流剂,例如胶体二氧化硅;甜味化合物,例如蔗糖或糖精;调味化合物,例如薄荷、水杨酸甲酯或橙味剂。
对于通过吸入施用,TRAIL受体结合剂来自压缩容器或分配器的气溶胶喷雾来施用,所述容器或分配器含有适合的推进剂,例如气体,如二氧化碳,或来自喷雾器。
全身性施用也可以通过穿粘膜或穿表皮的方式。对于穿粘膜或穿表皮施用,适合于需透过的障碍物的渗透剂可以用于制剂中。这种渗透剂一般是本领域已知的,包括,例如,对于穿粘膜施用,洗涤剂、胆汁盐、和夫西地酸衍生物。穿粘膜施用可以通过使用鼻喷雾或栓剂来实现。对于穿表皮施用,如本领域一般已知的,将TRAIL受体结合剂配制到软膏剂(ointments)、油膏剂(salves)、凝胶剂或乳膏剂中。
TRAIL受体结合剂也可以制备为用于直肠递送的栓剂(例如,具有常规的栓剂基质,例如可可脂和其他甘油酯)或滞留灌肠剂(retention enemas)的形式的药物组合物。
在一个实施方式中,使用载体制备TRAIL受体结合剂,所述载体将保护所述TRAIL受体结合剂对抗机体的快速清除,例如控释制剂,包括植入物和微封装的递送系统。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物,例如乙烯醋酸乙烯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯(polyorthoesters)和聚乳酸。这类配制剂的制备方法对于本领域技术人员是显而易见的。这些材料也可以自Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals,Inc商购。脂质体悬液(包括带有针对病毒抗原的单克隆抗体的、靶向受感染细胞的脂质体)也可以用作药学上可接受的载体。这些可以根据本领域技术人员已知的方法来制备,例如,如美国专利No.4,522,811中描述的。
特别有利的是以单位剂型配置口服的或胃肠外的组合物,以便于施用和剂量的均匀化。在此使用的单位剂型是指适合作为单位剂量用于要治疗的受试者的、物理上离散的单位;每个单位含有经过计算可产生期望治疗效果的预定量的结合剂以及与之结合的药物载体。本发明的单位剂型的规格由下列因素决定并且直接依赖于它们:结合剂的独特特征和要实现的特定治疗效果、以及用于治疗受试者的TRAIL受体结合剂配制技术的固有限制。
本发明的核酸分子可以插入到载体中,用作基因治疗载体。可以通过,例如,静脉内注射、局部施用(参见,例如,美国专利5,328,470)或通过立体定向(stereotactic)注射(参见,例如Chen等人,1994.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:3054-3057)将基因治疗载体递送给受试者。基因治疗载体的药物制剂可以包括处在可接受的稀释剂中的基因治疗载体,或可以包含内部包埋有基因递送载体的缓释基质。作为选择,当可以从重组细胞完整地产生整个基因递送载体时,例如,逆转录病毒载体,药物配制剂可以包括一个或多个产生该基因递送系统的细胞。所述药物组合物可以与施用说明书一起装入容器、包装袋或分配器中。
本发明的TRAIL受体结合剂的鉴定和表征
鉴定和/或筛选本发明的结合剂的方法.对于鉴定和筛选结合剂——例如具有对TRAIL受体多肽的期望的特异性的抗TRAIL受体抗体和抗TRAIL受体抗体相关多肽——有用的方法,包括本领域已知的任何免疫介导的技术。免疫应答的成分可以通过本领域普通技术人员公知的各种方法体外地检测。例如,(1)可以将细胞毒T淋巴细胞与放射活性标记的目标细胞温育,通过放射性的释放检测这些目标细胞的裂解;(2)可以将辅助T淋巴细胞与抗原和抗原呈递细胞温育,通过标准方法测量细胞因子的合成和分泌(Windhagen A;等人,Immunity,2:373-80,1995);(3)可以将抗原呈递细胞与完整的蛋白质抗原温育,通过T淋巴细胞活化分析或生物物理学方法检测所述抗原在MHC上的呈递(Harding等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,86:4230-4,1989);(4)可以将肥大细胞与能交联它们的Fc-epsilon受体的试剂温育,并通过酶免疫分析来测量组胺释放(Siraganian等人,TIPS,4:432-437,1983);和(5)酶联免疫吸附测定(ELISA)。
类似地,在模型生物(例如,小鼠)或人类受试者中免疫应答的产物可以通过本领域普通技术人员公知的各种的方法来检测。例如,(1)响应于疫苗接种的抗体产生可以通过当前临床实验室中使用的标准方法,例如ELISA来容易地检测;(2)免疫细胞向炎症部位的迁移可以通过在皮肤表面划痕并置于无菌容器上来捕获划痕部位上的迁移细胞来检测(Peters等人,Blood,72:1310-5,1988);(3)响应于促细胞分裂剂或者混合淋巴细胞反应的外周血单个核细胞增殖可以使用3H-胸腺嘧啶核苷来测定;(4)PBMC中粒细胞、巨噬细胞和其他吞噬细胞的吞噬力可以通过将PMBC与标记的颗粒一起置于孔中来测量(Peters等人,Blood,72:1310-5,1988);和(5)免疫系统细胞的分化可以通过用针对CD分子例如CD4和CD8的抗体标记PBMC并测量表达这些标记物的PBMC的级分来测量。
在一个实施方式中,本发明的TRAIL受体结合剂利用候选结合剂在可复制的遗传包装体(replicable genetic packages)的表面上展示来选择。参见,例如,美国专利5,514,548;5,837,500;5,871,907;5,885,793;5,969,108;6,225,447;6,291,650;6,492,160;EP 585 287;EP 605522;EP 616640;EP1024191;EP 589 877;EP 774 511;EP 844 306。已经描述了可用于生产/选择含有编码具有希望特异性的结合分子的噬菌粒基因组的丝状噬菌体颗粒的方法。参见,例如,EP 774 511;US 5871907;US 5969108;US 6225447;US 6291650;US 6492160。
在一个实施方式中,本发明的TRAIL受体结合剂利用候选结合剂在酵母宿主细胞的表面上展示来选择。可用于通过酵母表面展示分离scFc多肽的方法已经由Kieke等人,Protein Eng.1997Nov;10(11):1303-10描述了。
在一个实施方式中,本发明的TRAIL受体结合剂利用核糖体展示来选择。利用核糖体展示鉴定肽库中的配体的方法已经由Mattheakis等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:9022-26,1994;和Hanes等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:4937-42,1997描述了。
在一个实施方式中,本发明的TRAIL受体结合剂利用候选结合剂的tRNA展示来选择。利用tRNA展示体外选择配体的方法已经由Merryman等人,Chem.Biol.,9:741-46,2002描述了。
在一个实施方式中,本发明的TRAIL受体结合剂利用RNA展示来选择。利用RNA展示选择肽和蛋白质的方法已经由Roberts等人Proc.NatlAcad.Sci.USA,94:12297-302,1997;和Nemoto等人,FEBSLett.,414:405-8,1997描述了。利用非天然RNA展示库选择肽和蛋白质的方法已经由Frankel等人,Curr.Opin.Struct.Biol.,13:506-12,2003描述了。
在一个实施方式中,本发明的TRAIL受体结合剂在革兰氏阴性细菌的周质中表达,并与标记的TRAIL受体多肽混合。参见WO 02/34886。在表达具有对TRAIL受体多肽的亲和力的重组多肽的克隆中,与结合剂结合的标记的TRAIL受体多肽的浓度被提高,从而可以将细胞与文库的其余部分分离,如在Harvey等人,Proc.NatlAcad.Sci.22:9193-982004和美国专利公开2004/0058403中描述的。
在选择希望的TRAIL受体结合剂之后,考虑可以通过本领域技术人员已知的任何技术,例如,原核或真核细胞表达等等来大规模地产生它。TRAIL受体结合剂(例如但不限于抗TRAIL受体杂合抗体或片段)可以通过利用常规技术来构建编码这样的抗体重链的表达载体来产生,所述重链中,为保持原始物种抗体的结合特异性所必需的CDR和(如有必要的话)可变区框架的最小部分(根据在此描述的技术来工程化)来自于来源物种抗体,而抗体的其余部分来源于目标物种免疫球蛋白(其可以如本文所述的加以操作),从而产生用于表达杂交抗体重链的载体。
TRAIL受体结合的测量.在一个实施方式中,TRAIL受体结合测定是指一种测定模式,其中将TRAIL受体多肽和TRAIL受体结合剂在适合于TRAIL受体多肽和TRAIL受体结合剂之间的结合的条件下混合,并评估TRAIL受体多肽和TRAIL受体结合剂之间的结合的量。将结合的量与合适的对照进行比较,其中所述对照可以是在不存在TRAIL受体多肽的情况下的结合量、存在非特异性免疫球蛋白组合物(composition)的情况下的结合量,或二者皆是。结合量可以通过任何适合的方法来评估。结合测定方法包括,例如,ELISA、放射受体结合测定、闪烁迫近测定、细胞表面受体结合测定、荧光能量转移测定、液相层析、膜过滤测定,等等。用于结合TRAIL受体结合剂的TRAIL受体多肽的直接测量的生物物理学测定有,例如,核磁共振、荧光、荧光偏振、表面等离子体共振(BIACOR芯片)等等。通过本领域已知的标准测定方法测定特异性结合,例如,放射性配体结合测定、ELISA、FRET、免疫沉淀、SPR、NMR(2D-NMR)、质谱法,等等。如果候选TRAIL受体结合剂的特异性结合比不存在候选TRAIL受体结合剂的情况下观察到的结合大至少百分之一,则候选TRAIL受体结合剂作为本发明的TRAIL受体结合剂是有用的。
本发明还提供了TRAIL受体多肽和TRAIL受体结合剂的共结晶(co-crystals)作为测定分子间相互作用的方法。适合于TRAIL受体结合剂和TRAIL受体多肽之间结合的条件将取决于化合物和它的配体,可以由本领域普通技术人员容易地测定。
TRAIL受体结合剂生物学活性的测量.本发明的TRAIL受体结合剂,例如抗TRAIL受体抗体和抗TRAIL受体抗体相关多肽,可以被具体指定为生物学活性的激动剂或拮抗剂,其含有本文所公开的特定活性。例如,作为TRAIL受体结合剂的TRAIL受体激动剂和拮抗剂可以利用本领域已知的方法来产生。参见,例如,WO 96/40281;美国专利No.5,811,097;Deng等人,Blood 92:1981-1988,1998;Chen等人,Cancer Res.,58:3668-3678,1998;Harrop等人,J.Immunol.161:1786-1794,1998;Zhu等人,Cancer Res.,58:3209-3214,1998;Yoon等人,J.Immunol.,160:3170-3179,1998;Prat等人,J.Cell.Sci.,111:237-247,1998;Pitard等人,J.Immunol.Methods,205:177-190,1997;Liautard等人,Cytokinde,9:233-241,1997;Carlson等人,J.Biol.Chem.,272:11295-11301,1997;Taryman等人,Neuron,14:755-762,1995;Muller等人,Structure,6:1153-1167,1998;Bartunek等人,Cytokinem,8:14-20,1996。生物学活性,即TRAIL受体结合剂的激动剂或拮抗剂性质,可以利用任何被开发用于测量TRAIL受体多肽的生物学活性的常规体内和体外测定来表征。
本发明的TRAIL受体结合剂的用途
概述.本发明的结合剂在涉及TRAIL受体多肽的定位和/或定量的本领域已知方法中是有用的(例如,用于测量适合的生物学样品中的TRAIL受体多肽的水平,用于诊断方法,用于为所述多肽显像,等等。)。在一个实施方式中,含有抗体衍生的结合结构域的TRAIL受体结合剂作为药理学活性组合物(以下称“治疗剂”)是有用的。本发明的结合剂对于通过标准技术,例如亲和层析或免疫沉淀来分离TRAIL受体多肽是有用的。本发明的TRAIL受体结合剂可以有助于纯化来自生物样品例如细胞的天然的免疫反应性TRAIL受体多肽或免疫反应性TRAIL受体样多肽、以及在宿主系统中表达的重组产生的免疫反应性TRAIL受体多肽或TRAIL受体样多肽。此外,TRAIL受体结合剂可以用于检测免疫反应性TRAIL受体多肽或免疫反应性TRAIL受体样多肽(例如,在细胞溶胞产物中或细胞上清液中)以评估免疫反应性多肽的表达丰度和表达模式。本发明的TRAIL受体结合剂可以用于诊断来监视组织中免疫反应性TRAIL受体和/或免疫反应性TRAIL受体样免疫反应性多肽的水平,作为临床测试程序的一部分,用来,例如,确定给定治疗方式的效力。如上所述,通过偶联(即,物理地连接)本发明的TRAIL受体结合剂到可检测的物质,可以使检测更容易。
TRAIL受体多肽表达的检测.一种示例性的用于检测生物样品中TRAIL受体多肽或TRAIL受体样多肽的有无的方法包括:从测试受试者获得生物样品,使所述生物样品接触能够检测TRAIL受体多肽或TRAIL受体样多肽的本发明的TRAIL受体结合剂,从而检测TRAIL受体多肽或TRAIL受体样多肽在所述生物样品中的存在。TRAIL受体结合剂的实例是能够结合TRAIL受体多肽或TRAIL受体样多肽的、针对SEQ ID NO:1产生的抗体,优选的具有可检测标记的抗体。术语“标记的”对于结合剂而言意图包括通过将结合剂与可检测物质偶联(即,物理连接)而直接标记该结合剂,以及通过与直接被标记的另一个化合物反应而间接标记该结合剂。间接标记的实例包括使用荧光标记的第二抗体检测第一抗体,和用生物素对DNA的末端标记,使得它可以用荧光标记的链霉抗生物素蛋白加以检测。
本发明的检测方法可以用于体外和体内检测生物样品中的TRAIL受体多肽或TRAIL受体样多肽。用于检测TRAIL受体多肽或TRAIL受体样多肽的体外技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、Western印迹、免疫沉淀和免疫荧光。此外,用于检测TRAIL受体多肽或TRAIL受体样多肽的体内技术包括向受试者中导入标记的TRAIL受体结合剂,例如抗TRAIL受体抗体。例如,可以用放射性标记物标记抗体,所述放射性标记物在受试者中的存在和位置可以通过标准显像技术来检测。在一个实施方式中,所述生物样品含有来自测试受试者的多肽分子。
免疫测定和显像.本发明的TRAIL受体结合剂可以用来利用基于抗体的技术分析生物样品中TRAIL受体多肽水平或TRAIL受体样多肽水平。例如,可以用标准的免疫组织学方法来研究组织中的蛋白质表达。Jalkanen,M.等人,J.Cell.Biol.101:976-985,1985;Jalkanen,M.等人,J.Cell.Biol.105:3087-3096,1987。对于检测蛋白质基因表达有用的其他基于抗体的方法包括免疫分析,例如,酶联免疫吸附分析(ELISA)和放射免疫分析(RIA)。适合的抗体分析标记物是本领域已知的,包括酶标记物,例如,葡萄糖氧化酶,和放射性同位素或其他放射性试剂,例如,碘(125I,121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(112In)和锝(99mTc),以及荧光标记物,例如荧光素和罗丹明,以及生物素。
除了分析生物样品中的分泌的TRAIL受体多肽水平或TRAIL受体样多肽水平之外,分泌的TRAIL受体多肽水平或TRAIL受体样多肽水平也可以通过显像来体外检测。用于TRAIL受体多肽水平或TRAIL受体样多肽的体内显像的TRAIL受体结合剂,例如,抗TRAIL受体抗体标记物或标示物包括可通过X射线照相术、NMR或ESR检测的那些。对于X射线照相术,适合的标记物包括放射性同位素,例如钡或铯,其产生可检测的辐射,但对受试者不是明显有害的。NMR和ESR的适合的标示物包括具有可检测的特征性自旋的标示物,例如,氘,其可以通过标记相关scFv克隆的营养物来掺入到TRAIL受体结合剂中。
将已经用合适的可检测显像模块——例如放射性同位素(例如,131I、112In、99mTc)、放射不透明物质、或可通过核磁共振检测的材料——标记的TRAIL受体结合剂导入(例如,通过胃肠外、皮下或腹膜内导入)受试者中。本领域中要理解的是,受试者的体格(size)和使用的显像系统将决定产生诊断图像所需的显像模块的量。对于放射性同位素模块来说,对于人类受试者,注射的放射性的量通常范围将是约5到20毫居里的99mTc。标记的TRAIL受体结合剂然后将优先地积累在细胞中含有特异性目标多肽的位置。例如,在S.W.Burchiel等人,Tumor Imaging:The RadiochemicalDetection of Cancer 13(1982)中描述了体内肿瘤显像。
因而,本发明提供了医学状况的诊断方法,其涉及:(a)通过测量个体的细胞或体液中本发明的TRAIL受体结合剂的结合来测定多肽的表达;(b)将基因表达的水平与标准的基因表达水平相比较,与标准表达水平相比所分析的多肽基因表达水平方面的提高或降低指示医学状况。
诊断用途.本发明的TRAIL受体结合组合物(compositions)在诊断方法中是有用的。因而,本发明提供了利用在诊断受试者中TRAIL受体相关医学状况中有用的本发明的结合剂的方法。可以这样地选择本发明的结合剂,使得它们对TRAIL受体多肽具有任何水平的表位结合特异性以及非常高的结合亲和力。一般地,结合剂的结合亲和力越高,在免疫测定中可以实施越严格的洗涤条件,来除去非特异性结合的材料而不移除目标多肽。因而,在诊断测定中有用的本发明的TRAIL受体结合剂通常具有至少108、109、1010、1011或1012M-1的结合亲和力。进一步地,理想的是用作诊断试剂的TRAIL受体结合剂具有足够的动力学启动速率(kinetic on-rate)以在至少12小时、优选的至少五(5)小时、更优选的至少一(1)小时中在标准条件下达到平衡。
本发明的某些方法采用了本发明的抗TRAIL受体抗体的多克隆制备物以及抗TRAIL受体抗体组合物(compositions)作为诊断试剂,其他方法采用了单克隆分离物。相比由一种单克隆抗TRAIL受体抗体组成的组合物(composition),多克隆混合物的使用具有许多优势。通过结合到TRAIL受体多肽、多克隆抗TRAIL受体抗体或其他多肽上的多个位点,可以产生比结合到TRAIL受体多肽或TRAIL受体样多肽上单个位点的单克隆更强的(用于诊断的)信号。进一步地,多克隆制备物可以结合到原型目标序列的多种变体(例如,等位变体、种间变体、株系变体、药物诱导的逃逸变体(escape variant)),而单克隆抗体仅可以结合原型序列或较上述范围为窄的变体。然而,在存在或潜在存在近相关抗原的情况下,单克隆的抗TRAIL受体抗体对于检测单一抗原是有利的。
在采用根据上述方法制备的多克隆人类抗TRAIL受体抗体的方法中,制备物一般包含具有针对目标多肽的不同表位特异性的TRAIL受体结合剂(例如抗体)的配列(assortment)。在某些采用单克隆抗体的方法中,理想的是具有不同的表位结合特异性的两种抗体。表位结合特异性上的差异可以通过竞争性结合测定法来测定。
虽然作为人类抗体的TRAIL受体结合剂可以用作任何类型的样品的诊断试剂,它们作为对于人类生物样品的诊断试剂是最有用的。TRAIL受体结合剂可以用于在各种标准的测定模式中检测给定的TRAIL受体多肽。这些模式包括免疫沉淀、Western印迹、ELISA、放射免疫测定和免疫测定分析(immunometric assay)。参见Harlow & Lane,Antibodies,A LaboratoryManual(Cold Spring Harbor Publications,New York,1988);美国专利3,791,932;3,839,153;3,850,752;3,879,262;4,034,074,3,791,932;3,817,837;3,839,153;3,850,752;3,850,578;3,853,987;3,867,517;3,879,262;3,901,654;3,935,074;3,984,533;3,996,345;4,034,074;和4,098,876。生物样品可以从受试者的任何组织或体液获得。
免疫测定或夹心分析是本发明的诊断方法的优选的形式。参见美国专利4,376,110,4,486,530,5,914,241和5,965,375。这些分析使用固定到固相上的一种TRAIL受体结合剂,例如,抗TRAIL受体抗体或抗TRAIL受体抗体的群体,以及另一种抗TRAIL受体抗体或抗TRAIL受体抗体的群体。一般地,对溶液抗TRAIL受体抗体或抗TRAIL受体抗体的群体加以标记。如果使用抗体群体,所述群体一般含有结合于目标多肽的不同表位特异位点的抗体。因而,对于固相和溶液抗体可以使用相同的群体。如果使用抗TRAIL受体单克隆抗体,则对于固体和液相使用具有不同的结合特异性的第一和第二TRAIL受体单克隆抗体。固相和溶液抗体可以顺序地或同时地与目标抗原接触。如果固相抗体首先接触,则分析称为正向分析。反之,如果溶液抗体首先接触,则分析称为反向分析。如果目标与两种抗体同时地接触,则分析称为同时分析。在使抗TRAIL受体抗体接触TRAIL受体多肽之后,将样品温育一定时期,通常从约10分钟到约24小时,通常是约1小时。然后进行洗涤步骤来除去样品中没有特异性地结合于用作诊断试剂的抗TRAIL受体抗体的成分。当固相抗体和溶液抗体在不同的步骤中结合时,可以在任一或两个结合步骤之后进行洗涤。在洗涤之后对结合加以定量,定量一般通过检测连接到固相上的标记物来进行,其中所述标记物是通过被标记的溶液抗体的结合而连接到固相的。通常,对于给定的一对抗体或一对抗体群体,以及给定的反应条件,从含有已知浓度的目标抗原的样品制备标准曲线。然后通过标准曲线的内插来读取被测试的样品中TRAIL受体多肽的浓度。被分析物可以根据在平衡状态结合的标记溶液抗体的量,或通过在达到平衡之前一系列时间点上结合的标记溶液抗体的动力学测量来测量。这种曲线的斜率是样品中TRAIL受体多肽的浓度的度量。
用于上述方法的适合的支持物包括,例如,硝酸纤维素膜、尼龙膜和衍生化的尼龙膜,以及颗粒,例如琼脂糖、基于葡聚糖的凝胶、浸渍片(dipsticks)、颗粒、微球体、磁性颗粒、试管、微量滴定孔、SEPHADEXTM(Amersham Pharmacia Biotech,Piscataway N.J.)等等。固定可以通过吸附或通过共价附接来实现。任选地,抗TRAIL受体抗体可以连接到接头分子,例如,生物素,用于附接于结合在表面上的接头,例如抗生物素蛋白上。
预测医学.本发明还涉及预测医学(predictive medicine)的领域,其中为了预后(预测)目的使用诊断分析、预后分析、药物基因组学以及监控临床试验等来预防性地处理个体。因而,本发明的一个方面涉及用于确定生物样品(即,血液、血清、细胞、组织)中TRAIL受体多肽表达的诊断分析,以确定受试者是否患有与异常的TRAIL受体多肽表达相关的疾病或病症,或具有发生这样的病症的风险。
本发明还提供了预后(或预测)分析,用于确定个体是否存在发展出与TRAIL受体多肽表达或活性相关的病症的风险。这些分析可以用于预后或预测目的,以便在以TRAIL受体多肽为特征、或与TRAIL受体多肽相关的病症发作之前预防性地处理个体。此外,在本发明的TRAIL受体结合剂对TRAIL受体多肽相对于对其多态型具有更高亲和力的情况下(反之亦然),本发明的方法也可以用于评估个体是表达TRAIL受体多肽或是表达TRAIL受体多肽的多态型。
在受试者的特定组织中(或在血液中)某些多肽的水平可能是当给定药物施用给受试者时该药物的毒性、效力、清除速率或代谢速率的指示。在此描述的方法也可以用于测定这样的多肽在受试者中的水平以帮助预测这些受试者对这些药物的反应。本发明的另一个方面提供了一种方法来测定个体中TRAIL受体多肽的表达,从而为该个体选择合适的治疗性或预防性化合物(在此称为“药物基因组学”)。利用药物基因组学,可以根据个体的基因型选择用于个体的治疗或预防性处理的化合物(例如药物)(例如,检查个体的基因型来确定个体对于特定化合物的响应能力)。
本发明的TRAIL受体结合剂与TRAIL受体多肽或TRAIL受体样多肽的结合,例如,可以被利用来鉴定具有发生与TRAIL受体多肽或TRAIL受体样多肽表达或活性相关的病症(如上文描述的)的风险的受试者。作为选择,可以利用预后分析来鉴定具有或存在风险发生所述疾病或病症的受试者。因而,本发明提供了一种方法来鉴定与异常的TRAIL受体多肽或TRAIL受体样多肽表达或活性相关的疾病或病症,其中从受试者获得测试样品,检测TRAIL受体结合剂,其中TRAIL受体结合剂的改变的存在是受试者具有或有风险发生与异常的TRAIL受体多肽或TRAIL受体样多肽表达或活性相关的疾病或病症的诊断依据。如在此使用的,“测试样品”是指从感兴趣的受试者获得的生物样品。
此外,在此描述的预后分析可以用于确定受试者是否可以施用化合物(例如,激动剂、拮抗剂、拟肽(peptidomimetics)、多肽、肽、核酸、小分子或其他药物候选物)来治疗与异常的TRAIL受体多肽或TRAIL受体样多肽表达或活性相关的疾病或病症。例如,这种方法可用于确定是否可以用化合物有效地治疗受试者的TRAIL受体多肽或TRAIL受体样多肽相关的病症。因而,本发明提供了确定是否可以用化合物有效地治疗受试者的与异常的TRAIL受体多肽或TRAIL受体样多肽表达或活性相关的病症的方法,其中获得测试样品,利用TRAIL受体结合剂检测TRAIL受体多肽或TRAIL受体样多肽(例如,其中TRAIL受体多肽或TRAIL受体样多肽的存在是可以施用所述化合物来治疗该受试者的与异常的TRAIL受体多肽或TRAIL受体样多肽表达或活性相关的病症的诊断依据)。
从受试者获得血液或组织样品,测定其中TRAIL受体多肽或TRAIL受体样多肽的水平,并与获自没有所述疾病的个体的血液样品或相同组织类型的样品中存在的水平相比较。与获自健康受试者的样品相比,在获自怀疑患有TRAIL受体多肽或TRAIL受体样多肽相关疾病的受试者的样品中TRAIL受体多肽或TRAIL受体样多肽的过高丰度(或过低丰度)是在被测试的受试者中与TRAIL受体多肽或TRAIL受体样多肽相关的疾病的指示。作出阳性诊断可能需要进一步的测试。
在许多疾病中,某些TRAIL受体多肽或TRAIL受体样多肽分子的过量表达(或减量表达)的程度是受试者是否患有可能响应于特定种类的治疗或处理的疾病的指示。因而,检测样品中TRAIL受体多肽或TRAIL受体样多肽的方法可以用作预后的方法,例如,来评估受试者所述治疗或处理应答的可能性。测定来自所述受试者的适合的组织或血液样品中相关的预后性多肽的水平,并与适合的对照——例如患有相同疾病但是对治疗应答良好的受试者中的水平——相比较。与对照相比在样品中预后性多肽过量表达(或减量表达)的程度可以是受试者将不会良好地应答处理或治疗的可能性的预示。相对于对照的过量表达(或减量表达)越多,受试者将对治疗有应答的可能性越小。
已经知道,在多种疾病中,本文中称为“预测性多肽”的某些目标多肽的过量表达(或减量表达)的程度是受试者是否将发病的指示。因而,检测样品中TRAIL受体多肽或TRAIL受体样多肽的方法可以用作预测受试者是否将发生疾病的方法。测定来自处于发生疾病的风险中的受试者的适合的组织或血液样品中相关的预测性多肽的水平,并与适合的对照——例如不具有发生所述疾病的风险的受试者中的水平——相比较。与对照相比在样品中预测性多肽过量表达(或减量表达)的程度可以是受试者将发生疾病的可能性的预示。相对于对照的过量表达(或减量表达)越多,受试者将发生疾病的可能性越高。
在此描述的方法可以,例如,通过利用包含在此描述的至少一种探针试剂(例如TRAIL受体结合剂)的预包装的诊断试剂盒来进行,所述试剂盒可以在例如临床医疗设施中方便地使用来诊断表现涉及TRAIL受体多肽或TRAIL受体样多肽的疾病或病状的症状或家族史的受试者。此外,其中表达TRAIL受体多肽或TRAIL受体样多肽的任何细胞类型或组织均可以在本文描述的预后分析中加以利用。
TRAIL受体结合剂的预防性和治疗性用途.
概述.本发明的TRAIL受体结合剂对于预防或治疗疾病是有用的。具体地,本发明提供了用于治疗有患病症的风险(或对病症易感),或患有病症的受试者的预防性和治疗性方法,其中所述病症与异常的TRAIL受体结合剂表达或活性相关。因而,本发明提供了预防和/或治疗受试者中TRAIL受体相关的医学状况的方法,包括向需要的受试者施用有效量的TRAIL受体结合剂。例如,可以给受试者施用本发明的TRAIL受体结合剂组合物,以替代(replace)TRAIL受体多肽(例如胰岛素)的缺乏或降低的水平,来补充另一种多肽(例如抗TRAIL受体抗体)的缺乏或降低的水平,来抑制多肽(例如癌基因)的活性,来活化TRAIL受体多肽的活性(例如通过与受体结合),来通过与膜结合受体竞争游离的配体(例如消炎中使用的可溶TNF受体)而降低膜结合受体的活性,来产生期望的应答(例如血管生长)。
本发明的TRAIL受体结合剂在涉及受试者中的多种病症的预防性和治疗性应用中是有用的,这些病症包括但不限于:涉及骨细胞的发育、分化和活化的病症;血液循环中的细胞例如红细胞和血小板的疾病或病理;各种免疫学病症和/或病理;肺部的疾病和病症;自身免疫和炎症性疾病;心血管疾病;代谢疾病;生殖疾病、肾脏疾病、糖尿病、脑外伤、癌症生长和转移;病毒感染、癌症治疗、牙周疾病;组织再生;急性淋巴母细胞性白血病;胶质瘤;神经疾病;神经变性病症;阿尔茨海默氏病;帕金森氏病;和造血功能障碍。
在本发明的优选的实施方式中,使药学有效量的抗TRAIL-R1和TRAIL-R2抗体通过与目标细胞接触来诱导细胞死亡。识别TRAIL-R1和TRAIL-R2的抗体或识别TRAIL-R1和TRAIL-R2的人源化抗体的药学有效量是施用给个体足以引起期望效果的量。施用药学上有效量的TRAIL-R1和TRAIL-R2识别抗体的期望效果包括目标细胞的死亡、目标细胞的生长抑制、TRAIL-R1和TRAIL-R2的刺激、以及在目标细胞中与TRAIL-R1和/或TRAIL-R2的结合。目标细胞是表达TRAIL-R1和/或TRAIL-R2的细胞,包括异常生长的细胞,例如人类癌瘤细胞(carcinoma cell)和白血病细胞。还包括具有病理状况的细胞,这样的病理状况包括细胞增殖异常或失调的病理状况,例如恶性癌症或良性癌症(benign cancer)。从而,在本发明的某些实施方式中,本发明的抗TRAIL受体结合剂在预防或治疗有需要的受试者中癌症的生长和/或转移的方法中是有用的,所述癌症例如但不限于,乳腺癌、肝癌、前列腺癌、卵巢癌、肺癌、脑癌、胰腺癌、以及结肠直肠癌。在一个实施方式中,本发明的TRAIL受体结合剂具有体外凋亡诱导活性,其中所述结合剂可以在等于或低于10μg/ml的浓度下诱导至少30%的细胞死亡,优选的至少50%、70%、90%,更优选100%的细胞死亡。在一个实施方式中,本发明的TRAIL受体结合剂具有体内凋亡诱导活性,其中结合剂当用等于或低于10mg/kg体重的剂量治疗时可以在人类癌症异种移植模型中降低至少30%肿瘤大小,优选的,至少50%、70%、90%,更优选100%的肿瘤大小。
当体内用于治疗时,本发明的TRAIL受体结合剂,例如抗TRAIL受体抗体以有效量(即,具有期望的治疗效果的量)施用给所述受试者。它们通常将胃肠外地施用。剂量和给药方案将取决于TRAIL受体相关疾病或病症的程度、使用的特定TRAIL受体结合剂的特征,例如它的治疗指数,受试者和受试者的病史。有利的是,TRAIL受体结合剂在1-2周的时间内连续地进行静脉内施用来治疗血管系统中的细胞,以及皮下和腹膜内施用来治疗局部的淋巴结。
任选地,在辅助治疗的过程中进行施用,辅助治疗例如联合放射、化疗的循环,或肿瘤坏死因子、干扰素或其他细胞保护或免疫调节试剂的施用。因而,本发明的结合剂和在辅助治疗中有用的化合物可以向需要其施用的受试者同时地和连续地施用。在一个实施方式中,本发明的TRAIL受体结合剂可以用于增强治疗性抗体,特别是抗TRAIL-R1或抗TRAIL-R2单特异性抗体的治疗效力。
本发明的抗体还与致敏剂(sensitizer)共同起作用。在此使用的致敏剂被定义为包括任何诱导凋亡的刺激物,包括有机分子,例如化疗剂和放射试剂,其可以显著地增强本发明的抗体的效力。另一方面,本发明的抗体可以用于增强化疗和放射治疗的治疗效力。并且,它可以用于预防或逆转(reverse)肿瘤细胞对化疗和放射治疗的抗性的发展。本发明的抗体还作为致敏剂起作用,以促进由TRAIL-R1或TRAIL-R2的单特异性抗体诱导的癌细胞的凋亡。
在恶性肿瘤治疗的情境中,本发明的抗体,特别是CTB003和hCTB003,能够诱导大多数TRAIL敏感肿瘤细胞的凋亡。CTB003展现体内的强杀肿瘤活性。在此详述的大部分肿瘤细胞表达细胞表面TRAIL-R1和/或TRAIL-R2,它们对CTB003或hCTB003诱导的细胞死亡的敏感性与它们对TRAIL的敏感性相似(parallel)。CTB003或hCTB003绕过了诱饵受体来诱导凋亡。产生本发明的抗体的小鼠-小鼠杂交瘤CTB003已经被保藏,分配了登录号CGMCC1665。理解的是,对于论争的人类TRAIL-R1和/或TRAIL-R2双特异性单克隆抗体CTB003和hCTB003详述的技术和结果完全可以扩展到并适用于类似种类的双特异性抗体。这种优点一般地扩展到本发明的人源化双特异性抗体。
对于胃肠外施用,TRAIL受体结合剂将与药学上可接受的胃肠外赋形剂相结合配制成单位可注射剂型(溶液,悬浮液,乳剂)。这些赋形剂是本身无毒的,并且无治疗性。
使用抗TRAIL受体IgM抗体对于某些应用是优选的。然而,IgG分子由于更小,比IgM分子更有能力定位到某些类型的感染细胞。有证据表明,体内的补体激活产生了多种生物学效果,包括炎症性反应的诱导和巨噬细胞的活化(Unanue和Benecerraf,Textbook of Immunology,2nd Edition,Williams & Wilkins,p.218(1984))。伴随炎症的提高的血管舒张可以提高各种试剂定位到受感染细胞中的能力。因此,本发明指定的类型的TRAIL受体抗体组合可以通过多种方式治疗性地使用。另外,抗原,例如纯化的TRAIL受体多肽,其片段或类似物(Hakomori,Ann.Rev.Immunol.2:103,1984)或与这些抗原相关的抗独特型抗体(Nepom等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:2864,1985;Koprowski等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:216,1984)可以用于在人类受试者中诱导主动免疫应答。这样的应答包括形成能够活化人类补体的抗体,以实现期望的生物学效果,例如破坏目标细胞。
疾病和病症.对于以TRAIL受体多肽水平或生物学活性提高(相对于不患有所述疾病或病症的受试者)为特征的疾病和病症,可以用拮抗(即,降低或抑制)活性的基于TRAIL受体结合剂的治疗化合物来加以治疗,所述化合物可以以治疗性或预防性的方式施用。可以利用的治疗化合物包括,但不限于:(i)前述的TRAIL受体结合剂;和(ii)编码TRAIL受体结合剂的核酸。
对于以TRAIL受体多肽水平或生物学活性降低(相对于不患有所述疾病或病症的受试者)为特征的疾病和病症,可以用提高TRAIL受体活性(即,是TRAIL受体活性激动剂)的基于TRAIL受体结合剂的治疗化合物来加以治疗。上调活性的治疗剂可以以治疗性或预防性方式来施用。可以利用的治疗剂包括但不限于,提高生物利用率的TRAIL受体结合剂。
提高或降低的水平可以容易地通过定量TRAIL受体结合剂诱导的肽和/或RNA来检测,定量是通过获得受试者的组织样品(例如来自活检组织)并体外分析它的RNA或肽水平,表达的TRAIL受体多肽的结构和/或活性(或前述多肽的mRNA)。本领域公知的方法包括但不限于,免疫测定(例如通过Western印迹分析,免疫沉淀、继而十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳,免疫细胞化学,等等)和/或杂交测定来检测mRNA的表达(例如Northern测定、斑点印迹、原位杂交,等等)。
预防方法.在一个方面中,本发明提供了一种方法,通过向所述受试者施用调节TRAIL受体多肽表达或至少一种TRAIL受体多肽活性的TRAIL受体结合剂,来预防受试者中与异常的TRAIL受体表达或活性相关的疾病或状况。
处于由异常的TRAIL受体多肽表达或活性引起或促发的疾病的风险中的受试者可以通过例如在此描述的诊断或预后分析的任何或组合来鉴定。在预防性的应用中,针对有风险发生或易感于疾病或状况(即免疫疾病)的受试者施用TRAIL受体结合剂的药物组合物或药物,施用的量以足够消除或降低疾病风险、降低疾病严重度、或延迟疾病的发作,包括疾病的生物化学、组织学和/或行为症状,疾病的并发症,以及在疾病的发展期间呈现的中间病理表型。预防性TRAIL受体结合剂的施用可以发生在出现异常的特征症状之前,从而预防疾病或病症,或者延迟其发展。取决于异常的类型,例如,可以用TRAIL受体结合剂作为TRAIL受体激动剂或TRAIL受体拮抗剂来治疗所述受试者。合适的化合物可以根据在此描述的筛选分析来确定。
治疗方法.本发明的另一个方面包括为治疗目的调节受试者中TRAIL受体多肽表达或活性的方法。本发明的调节方法包括用本发明的TRAIL受体结合剂接触细胞,所述试剂调节与细胞相关的TRAIL受体多肽活性中的一种或多种活性。在治疗应用中,对怀疑患有或已经患有疾病的受试者施用组合物或药物,施用的量足够治愈、或至少部分地延滞所述疾病的症状(生物化学的、组织学的和/或行为的),包括它的并发症和疾病的发展中的中间病理表型。足够实现治疗或预防性治疗的量被定义为治疗或预防有效量。
在此描述了调节TRAIL受体多肽活性的化合物,可以包括,例如编码TRAIL受体结合剂或TRAIL受体结合剂相关多肽的核酸。在一个实施方式中,TRAIL受体结合剂刺激一种或多种TRAIL受体多肽活性。这种刺激性化合物的实例包括TRAIL受体结合剂和已经被导入细胞中、编码TRAIL受体结合剂的核酸分子。在另一个实施方式中,TRAIL受体结合剂抑制一种或多种TRAIL受体多肽活性。这些调节方法可以在体外进行(例如通过将细胞和TRAIL受体结合剂一起培养),或作为选择,在体内进行(例如通过向受试者施用所述TRAIL受体结合剂)。因而,本发明提供一种方法来治疗患有TRAIL受体相关疾病或病症的个体,所述疾病或病症以TRAIL受体多肽或编码TRAIL受体多肽的核酸分子的异常的表达或活性为特征。在一个实施方式中,所述方法包括施用TRAIL受体结合剂(例如通过在此描述的筛选分析方法鉴定的化合物),所述结合剂调节(例如上调或下调)TRAIL受体多肽表达或活性,或组合TRAIL受体结合剂。在另一个实施方式中,所述方法包括施用TRAIL受体结合剂或编码TRAIL受体结合剂的核酸分子,作为补偿降低的或异常的TRAIL受体多肽表达或活性的疗法。在TRAIL受体多肽被异常下调的情况中,对TRAIL受体多肽活性的刺激是期望的。
基于TRAIL受体结合剂的治疗剂的生物学效果的确定.在本发明的各种实施方式中,进行适合的体外或体内测定来确定基于特异性TRAIL受体结合剂的治疗剂的效果,并确定受试者中受影响组织的治疗是否需要使用所述治疗剂。
在各种实施方式中,可以使用受试者的病症中涉及的代表性的细胞类型来进行体外测定,以确定给定的基于TRAIL受体结合剂的治疗剂是否对所述细胞类型发挥期望的效果。在人类受试者中测试之前,用于治疗的化合物可以在适合的动物模型系统中测试,包括但不限于大鼠、小鼠、鸡、牛、猴、兔,等等。类似地,对于体内测试,在向人类受试者施用之前,可以使用本领域已知的任何动物模型系统。
治疗方案和有效剂量.某些组合物包括多种(例如两种或更多)本发明的TRAIL受体结合剂的组合。在某些组合物中,组合物的每一种TRAIL受体结合剂都是结合一种或多种TRAIL受体多肽的独特的、预先选择的表位的单克隆抗体或人类序列抗体。
对于本发明的TRAIL受体结合剂,例如抗TRAIL受体抗体或抗TRAIL受体抗体-细胞毒素缀合物而言,其用于治疗本文所述的TRAIL受体相关状况和疾病的有效剂量取决于许多不同的因素而变化,包括施用的方式、目标部位、受试者的生理状态、受试者是人类还是动物、使用的其他药物、以及治疗是预防性还是治疗性的。通常,受试者是人类,但非人哺乳动物包括转基因哺乳动物也可以被治疗。治疗剂量需要被滴定以优化安全性和效力。
一般地,本发明的组合物(compositions)的足以实现治疗或预防效果的有效量,范围为从约0.000001mg/千克体重/天到约10,000(100)mg/千克体重/天。优选的,剂量范围从约0.0001mg/千克体重/天到约100mg/千克体重/天。对于施用TRAIL受体结合剂,例如抗TRAIL受体抗体,剂量范围从约0.0001到100mg/kg宿主体重,更通常地0.01到5mg/kg宿主体重每周、每两周或每三周。例如剂量可以是1mg/kg体重或10mg/kg体重每周、每两周或每三周,或在1-10mg/kg每周、每两周或每三周的范围内。在一个实施方式中,抗体的单个剂量的范围是0.1-10,000微克/千克体重。在一个实施方式中,载体中的抗体浓度为每个递送的立方厘米0.2到2000微克。示范性的治疗方式需要每两周施用一次,或每月一次,或每3到6个月一次。在某些方法中,具有不同的结合特异性的两种或更多TRAIL受体结合剂同时地施用,在这种情况下,施用的每种抗体的剂量落入所标明的范围内。TRAIL受体结合剂,例如抗TRAIL受体抗体通常在多种场合施用。单次给药之间的间隔可以是每周、每月或每年。间隔也可以是不规则的,通过测量受试者中抗体的血液水平来指示。在某些方法中,调节剂量来实现血浆TRAIL受体结合剂(例如抗TRAIL受体抗体)浓度为1-1000μg/ml,在某些方法中25-300μg/ml。作为选择,TRAIL受体结合剂(例如抗TRAIL受体抗体)可以作为持续释放配制剂施用,在这种情况下需要的施用频率较低。剂量和频率取决于受试者中TRAIL受体结合剂的半衰期而变化。一般地,人类抗TRAIL受体抗体显示的半衰期最长,接着是人源化抗TRAIL受体抗体、嵌合抗TRAIL受体抗体、和非人类抗TRAIL受体抗体。施用的剂量和频率可以取决于治疗是预防性的还是治疗性的而变化。在预防性的应用中,用一段较长的时间以相对低频率的间隔施用相对低的剂量。某些受试者终身持续接受治疗。在治疗应用中,有时是需要相对短间隔的相对高剂量,直到疾病的发展被降低或终止,优选地,直到受试者显示疾病的症状的部分或完全改善。此后,本专利可以施用预防性的方案(the patent canbe administered a prophylactic regime)。编码TRAIL受体免疫原的核酸的剂量范围是从约10ng到1g、100ng到100mg、1μg到10mg或30-300μg DNA每位受试者。传染性病毒载体的剂量为每剂10-100或更多个病毒颗粒不等。
毒性.优选地,在此描述的有效量(例如剂量)的TRAIL受体结合剂将提供治疗益处而不产生对受试者的实质上的毒性。在此描述的TRAIL受体结合剂的毒性可以在细胞培养或实验动物中利用标准药学程序,例如通过测定LD50(对50%的群体致死的剂量)或LD100(对100%的群体致死的剂量)来确定。毒性作用的和治疗作用之间的比例是治疗指数。利用这些细胞培养测定和动物研究获得的数据,可制定对人类使用无毒的剂量范围。在此描述的TRAIL受体结合剂的剂量优选地处于一定范围的循环浓度内,所述浓度包括毒性很小或没有毒性的有效剂量。取决于采用的剂型和使用的给药途径,剂量可以在这个范围内变动。可以由医师个人根据受试者的状况选择确切的配方、给药途径和剂量。参见,例如Fingl等人,In:ThePharmacological Basis of Therapeutics,Ch.1(1975)。
试剂盒.本发明的范围还涵盖包含本发明的TRAIL受体结合剂组合物(compositions)(例如抗体细胞毒素缀合物、单克隆抗体、人类序列抗体、人类抗体、多特异性和双特异性分子)和使用说明书的试剂盒。所述试剂盒对于检测生物样品中TRAIL受体多肽或TRAIL受体样多肽的存在是有用的。例如所述试剂盒可包含:能够结合生物样品中TRAIL受体多肽或TRAIL受体样多肽的、经标记的TRAIL受体结合剂;用于测定样品中TRAIL受体多肽或TRAIL受体样多肽的量的手段;以及用于将TRAIL受体多肽或TRAIL受体样多肽的量与标准品比较的手段。试剂盒成分(例如试剂)可以包装在适合的容器中。所述试剂盒可以进一步包括使用该试剂盒检测TRAIL受体多肽或TRAIL受体样多肽的说明。
在一个实施方式中,本发明的组合物试剂盒(composition kit)包含本发明的抗体与疾病抑制化合物的组合,其中所述化合物是抗肿瘤药物,例如放射性同位素、化疗剂、治疗性抗体或细胞因子。
提供以下实施例以进一步说明本发明的优选的实施方式。这些实施例决不应看作是限制本发明的范围,本发明的范围由附随的权利要求确定。
实施例
实施例1.本发明的鼠TRAIL受体结合剂的制备和表征的一般方法
具体而言,可以通过培养杂交瘤获得TRAIL-R1和/或TRAIL-R2双特异性单克隆抗体CTB003,所述杂交瘤是通过用人类TRAIL-R1和/或TRAIL-R2免疫小鼠,随后使来自该小鼠的脾脏细胞或淋巴结细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合来获得杂交瘤。
单克隆抗体的制备涉及以下步骤:
1.用作抗原的蛋白质的纯化;
2.抗体产生细胞的制备:在最后免疫动物之后,收集血清样品,分析特异性抗体产生的滴度以确定是否已经产生了抗体生产细胞。
3.骨髓瘤细胞的制备;
4.使所述抗体生产细胞和骨髓瘤细胞融合;
5.选择产生期望的抗体的杂交瘤;
6.制备单细胞克隆(克隆);
7.培养杂交瘤细胞用于单克隆抗体的大规模制备;
8.纯化所述单克隆抗体
9.分析单克隆抗体的生物学活性和特异性。
以下参照上述步骤详述了本发明的抗体的制备过程。用于制备本发明的抗体的这种方法意图仅是制备方法的说明,而不是对其的限制。可以遵循其他已知的过程。
A.抗原的制备
本发明利用了包含TRAIL-R1和TRAIL-R2的细胞外结构域的异二聚化重组蛋白质作为免疫原来诱导同时识别这两种受体的抗体。
将编码TRAIL-R1和TRAIL-R2的细胞外结构域的cDNA与编码人类IgG1的Fc部分的cDNA融合。将融合的cDNA进一步克隆到表达载体pcDNAIII(Invitrogen)中。用表达载体pcDNAIII-TRAIL-R1-Fc和pcDNAIII-TRAIL-R2-Fc共转染QBI-293A细胞。转染后48小时,通过蛋白A层析来纯化培养上清液中分泌的融合蛋白质。
作为选择,包含SEQ ID NO:15和/或SEQ ID NO:16的氨基酸序列的肽,可以通过已知的方法例如Sanger方法化学合成,并用作抗原。
B:单克隆抗体的制备
a:小鼠的免疫
将步骤(a)中制备的免疫原与佐剂,例如弗氏完全或不完全佐剂混合。其他适合的实验动物可以包括大鼠、豚鼠、兔、犬、鸡、马、猪、牛和绵羊。免疫实验动物的适合的给药途径包括皮下、腹膜内、静脉内、皮内和肌肉内注射,其中皮下的和腹膜内注射是优选的。免疫任选地可以通过单次剂量,或通过合适的间隔的几次重复剂量来进行。免疫的动物的抗体生产可以通过抗原特异性抗体的血清水平来确定。当达到高的抗体滴度时,动物可以用作抗体生产细胞的制备的来源。一般地,抗体生产细胞可以在免疫原的最后注射之后3-5天时收集。
分析血清抗体滴度的方法包括各种公知的技术,例如放射免疫测定(在下文中称为“RIA”)、固相酶免疫测定(下文中称为“ELISA”)、荧光抗体测定和被动凝集测定,出于检测灵敏度、速度、精确性和自动化的潜力的原因,RIA和ELISA是优选的。
通过ELISA测定抗体滴度:首先,使纯化或部分纯化的TRAIL-R1-Fc/TRAIL-R2-Fc吸附到固相表面,例如96孔ELISA平板的表面上。在封闭任何剩余的表面之后,使孔表面与经过连续稀释的小鼠血清样品接触。添加作为第二抗体的酶标记的抗小鼠抗体,来结合小鼠抗体。通过测定由于底物等等的改变产生的颜色显示的吸光度变化来评估抗体滴度。
b:骨髓瘤细胞的制备
用来自确立的小鼠细胞系的细胞充当骨髓瘤细胞的来源,这些细胞包括P3X63Ag8U.1(P3-U1)、P3/NSI/1-Ag4-1(NS-1)、Sp2/0-Ag14(SP-2)、P3X63Ag8.653和P3X63Ag8(X63),它们可以从ATCC获得。将选择的细胞系连续转移到合适的培养基例如8-氮鸟嘌呤培养基中。8-氮鸟嘌呤培养基包括Iscove′s Modified Dulbecco′s培养基(以下称为“IMDM”)或Dulbecco′s Modified Eagle培养基(以下称为“DMEM”)。RPMI-1640培养基补充有谷氨酰胺、2-巯基乙醇、庆大霉素、胎牛血清(以下称为“FCS”)和8-氮鸟嘌呤。
c:细胞融合
获自动物的任何适合部分的淋巴细胞和浆细胞是产生抗体的前体细胞。淋巴细胞或浆细胞来源包括脾脏、淋巴结、外周血,或其任何适合的组合,脾脏细胞是最常见的来源。在最后一次强化注射之后,从存在抗体生产细胞的淋巴组织制备单一的淋巴细胞悬浮液。融合技术包括用无血清培养基(例如RPMI 1640)或磷酸盐缓冲盐水(以下称为“PBS”)洗涤脾脏和骨髓瘤细胞,使得脾脏细胞与骨髓瘤细胞的数量比例大约在5:1和10:1之间,然后离心。在弃去上清液之后,充分地疏松沉降的细胞,在搅拌下滴加含有50%(w/v)聚乙二醇(m.w.1,000到4,000)1ml的无血清培养基。随后,慢慢地添加10ml的无血清培养基,然后离心。再次弃去上清液,将离心沉降的细胞悬浮在适量的含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷(以下称为“HAT”)的HAT培养基中。
d:杂交瘤的选择
在融合之后,任何未融合的骨髓瘤细胞和任何骨髓瘤-骨髓瘤融合物均不能在HAT培养基中存活。另一方面,抗体生产细胞相互的融合物以及抗体生产细胞与骨髓瘤细胞的杂交瘤均可以存活,但前者仅具有有限的寿命。因而,在HAT培养基中继续温育,可导致仅期望的杂交瘤被选择。所得的杂交瘤生长成菌落,然后转移到缺乏氨基蝶呤的HAT培养基(HT培养基)中。此后,从培养上清液取出等分来测定抗体滴度,例如通过ELISA。
e:杂交瘤的克隆
然后,通过利用步骤b中描述的类似的方法测定抗体滴度,将已经显示产生特异性抗体的杂交瘤转移到另一个平板用于克隆。适合的克隆方法包括:有限稀释方法,其中杂交瘤被稀释到平板的每个孔含有一个细胞,然后加以培养;软琼脂方法,其中在软琼脂培养基中培养之后回收集落;利用微型机械手来分离单个细胞用于培养的方法;和“分选-克隆”,其中通过细胞分选仪分离单个细胞。例如,对展现抗体滴度的每个孔,重复2-4次根据限制稀释方法的克隆操作,选择具有稳定的抗体滴度的克隆作为抗体生产杂交瘤。
作为本发明的抗体的基础的小鼠-小鼠杂交瘤CTB003于2006年3月28日在CGMCC保藏,登录号CGMCC1665。
f:单克隆抗体的制备和纯化
通过细胞培养的单克隆抗体的制备:在获得稳定的抗体生产杂交瘤之后,可以对所选的杂交瘤培养物扩大培养。然后收获来自大规模培养的上清液,通过适合的方法纯化,例如亲和层析和凝胶过滤。杂交瘤还可以在同基因的小鼠(例如BALB/c小鼠或nu/nu小鼠)的腹膜内生长,来获得大量地含有抗TRAIL-R1和TRAIL-R2单克隆抗体的腹水。
g:单克隆抗体的表征
单克隆抗体的同种型和亚类可以通过ELISA来测定。抗体浓度的测定可以通过Folin-Lowry方法进行,或根据280nm的吸光度/1.4(OD280)=免疫球蛋白1mg/ml)来计算。
C:单克隆抗体的特异性的分析
为了获得结合TRAIL-R1和TRAIL-R2而不结合其他TRAIL受体例如TRAIL-R3和TRAIL-R4的单克隆抗体,用以下重组蛋白质包被ELISA平板:1.TRAIL-R1和TRAIL-R2异二聚体抗原,2.TRAIL-R1-Fc融合抗原,3)TRAIL-R2-Fc融合抗原,4.TRAIL-R3-Fc融合抗原,5.TRAIL-R4-Fc融合抗原,和BSA作为阴性对照。在与各种浓度的纯化抗体温育之后,添加HRP缀合的山羊抗小鼠IgG。在TMB底物反应之后,在ELISA酶标仪中记录光密度。利用光密度值评估抗体与相应的抗原的结合。CTB003展现了对TRAIL-R1/TRAIL-R2异二聚体抗原以及TRAIL-R1-Fc或TRAIL-R2-Fc融合抗原的剂量依赖性结合,但是不结合TRAIL-R3-Fc、TRAIL-R4-Fc融合抗原和BSA,表明CTB003是识别TRAIL-R1和/或TRAIL-R2的抗体。
D.单克隆抗体的功能的分析
a:体外的人类恶性肿瘤细胞凋亡的诱导
将一组人类癌细胞系与各种浓度的抗体温育过夜,利用抗体处理之后的细胞活力来确定杀伤活性。
b:体内的CTB003杀肿瘤活性
在人类肿瘤细胞异种移植模型中评估CTB003的杀肿瘤活性。用人类癌细胞皮下接种裸鼠。在可见的肿瘤生长之后,对带有肿瘤的小鼠腹膜内注射CTB003。用处理之后肿瘤大小的降低程度评估体内杀肿瘤活性。
E.抗体序列的分析
从杂交瘤细胞分离总RNA用作模板。利用逆转录酶合成cDNA。利用一组15个VH 5’引物和一个CH 3’引物进行PCR来获得编码免疫球蛋白重链的可变区的cDNA。利用一组8个VK5’引物和一个CK3’引物进行PCR来获得编码免疫球蛋白轻链的可变区的cDNA。将PCR产物进一步克隆到TA克隆载体(Invitrogen)中。挑取五个独立的克隆并测序。通过CDR1、CDR2和CDR3序列的高变异性和它们在重链中的位置来确定CDR1、CDR2和CDR3序列。
F.抗体识别表位的的鉴定
一系列抗原的制备:抗原组包含抗体识别的全部或部分抗原表位。这些抗原可以通过多肽的化学合成或通过重组DNA技术来获得。在确定了含有表位的区域之后,通过进一步缩短含有表位的多肽来实现精确的作图。此外,可以通过使用含有表位的多肽的竞争性抑制测定来确认表位。
实施例2.TRAIL-R1和TRAIL-R2抗原的异二聚形式的制备
1.TRAIL-R1和TRAIL-R2cDNA的克隆
通过以下RT-PCR方法克隆编码人类TRAIL-R1和TRAIL-R2蛋白质的DNA,该方法使用:
a)模板
利用TRIzol试剂(Gibco BRL)提取HeLa细胞的总RNA。利用第一链cDNA合成试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech),根据试剂盒提供的使用手册来获得PCR反应的模板。
b)PCR引物
合成以下寡核苷酸引物用于PCR:
5′-gacgatgcccgatctactttaaggg-3′(DR5p1:SEQ ID NO.:49);
5’-ccactgggtgatgttggatggg-3′(DR5p2:SEQ ID NO.:50);
5′-gacgatgcccgatctactttaaggg-3′(DR4p1:SEQ ID NO.:51);
5′-gacgatgcccgatctactttaaggg-3′(DR4p2:SEQ ID NO.:52);
c)PCR反应
PCR反应溶液的组成:
模板cDNA,总共33μl的反应物中的5μl,
引物DR5p1,10pmol;
引物DR5p2,10pmol;
10x.浓缩的PCR缓冲液(试剂盒提供的),10μl;
dNTPs(各2.5mM),4μl;以及
Taq聚合酶(Promega),5单位。
添加无菌蒸馏水到溶液中达到100μl的总体积。
如下进行PCR反应。首先将溶液在94℃加热2分钟,之后将加热到94℃ 30秒、52℃ 1分钟和72℃3分钟的循环重复40次。在这个过程完成之后,将反应溶液在72℃加热10分钟。由此获得的扩增的DNA片段在含有0.25μg/ml溴化乙锭的1%琼脂糖凝胶上予以分离。确定条带含有期望的DNA片段,利用Gene Clean试剂盒(BIO101)回收。
d)PCR产物的TA克隆
DNA片段使用TA克隆试剂盒(Invitrogen,CA)克隆。如下进行:将从PCR反应溶液回收的DNA片段,与TA克隆试剂盒提供的50ng pCR2.1载体一起,与1μl的10×连接酶反应缓冲液(6mM Tris-HCl(pH 7.5)、6mM氯化镁、5mM氯化钠、7mM.β-巯基乙醇、0.1mM ATP、2mM DTT、1mM亚精胺、和0.1mg/ml牛血清白蛋白)混合,该缓冲液中已经添加了4单位的T4DNA连接酶(1μl)。混合物的总体积用无菌去离子水调整到10μl,所得的连接酶溶液在14℃温育15小时。在这段时间以后,将2μl的连接酶反应溶液添加到50μl的感受态大肠杆菌菌株TOP10F中,该菌株由TA克隆试剂盒提供,并根据使用手册制备为感受态,产生的混合物在冰上保持30分钟,然后在42℃30秒,再次在冰上5分钟。然后,将含有2%v/v胰蛋白胨、0.5%(w/v)酵母提取物、0.05%w/v氯化钠、2.5mM氯化钾、1mM氯化镁和20mM葡萄糖的500μl培养基(以下称为“SOC”培养基)添加到培养物中,将混合物在37℃摇动培养1小时。在这之后,将培养物涂布在含有100μg/ml的L-肉汤琼脂平板(1%v/v胰蛋白胨、0.5% w/v酵母提取物、0.5% w/v氯化钠、0.1% w/v葡萄糖和0.6% w/v细菌琼脂(Difco))上。选择平板上出现的氨苄青霉素抗性菌落,用铂接种环刮下,在含有100μg/ml氨苄青霉素的L-肉汤培养基中200rpm振荡下37℃培养过夜。温育之后,通过离心收获细胞,用碱法从中制备质粒DNA。将编码TRAIL-R1或TRAIL-R2的细胞外结构域的cDNA进一步克隆到含有编码人类IgG1的Fc部分的cDNA的pcDNA3表达载体(Invitrogen,CA)中。从而,获得了编码TRAIL-R1-Fc或TRAIL-R2-Fc融合蛋白的融合cDNA。
2.TRAIL-R1-Fc和TRAIL-R2-Fc融合蛋白的表达和纯化
用pcDNAIII-TRAIL-R1-Fc和pcDNAIII-TRAIL-R2-Fc共转染QBI-293A细胞。在转染48小时之后收获培养基。
将收集自上述转染的细胞的总共500ml上清液用于蛋白A-SepharoseCL-4B亲和层析(Pharmacia)。流速是2ml/分钟。在培养物上清液通过之后,用50ml PBS洗涤柱子。用洗脱缓冲液(0.1M甘氨酸(PH 2.4)、0.15M NaCl)来洗脱蛋白质。在OD280nm测量每个洗脱级分(1ml)的光密度。收集OD280>0.1的级分。在添加100μl的中和缓冲液(1M Tris-HCL pH 8.5)之后,将洗脱物单独地置于透析管中,洗脱物在4℃相对于1升的PBS(pH7.5)透析。透析缓冲液更换两次。将纯化的蛋白质浓缩到1mg/ml,在-80℃保存。蛋白质的纯度通过SDS-PAGE测定大于95%。在非还原条件下,纯化的蛋白质的分子量是90kD,而在还原条件下,分子量是45kD。
3.重组TRAIL-R1-Fc和TRAIL-R2融合蛋白的表征
ELISA平板用PBS中的2μg/ml山羊抗人IgG在4℃过夜来包被。在用PBS洗涤三次之后,平板用3%BSA PBS在室温下封闭1小时。添加10μg/ml纯化的融合蛋白,在37℃温育1小时。在用PBS洗涤三次之后,添加2μg/ml单克隆抗TRAIL-R1和抗TRAIL-R2抗体在37℃再过一个小时。通过用PBS洗涤三次来除去未结合的抗体,然后在37℃添加HRP-缀合的山羊抗小鼠IgG30分钟。在用PBS洗涤三次之后,添加TMB底物缓冲液10分钟,然后通过添加2N H2SO4停止反应。在ELISA酶标仪中使用450nm/650nm的双波长记录光密度的值。
结果总结在表6中。抗TRAIL-R1和抗TRAIL-R2单克隆抗体与纯化的融合蛋白反应,但不与人类IgG反应。
异二聚的TRAIL-R1和TRAIL-R2融合物的表征:将ELISA平板用1μg/ml的抗TRAIL-R1(CTB007)或抗TRAIL-R2(CTB006)在4℃包被过夜。用PBS洗涤三次之后,用3%BSA PBS封闭平板。然后在37℃添加100ng/ml的纯化的二聚TRAIL-R1/TRAIL-R2融合蛋白1小时。用PBS洗涤三次之后,添加100ng/ml的HRP缀合的抗TRAIL-R1和抗TRAIL-R2抗体另一小时。用PBS洗涤三次之后,添加TMB底物缓冲液10分钟,然后通过添加2N H2SO4停止反应。在ELISA酶标仪中使用450nm/650nm的双波长记录光密度的值。表7中的结果显示,当包被抗体是抗TRAIL-R1时,HRP缀合的抗TRAIL-R2与融合蛋白反应。类似地,当包被抗体是抗TRAIL-R2时,HRP缀合的抗TRAIL-R1与融合蛋白也反应。相比之下,与抗体对TRAIL-R1/TRAIL-R1或TRAIL-R2/TRAIL-R2的反应表现为弱反应。这些结果表明大部分纯化的蛋白质是处于TRAIL-R1/TRAIL-R2的异二聚形式。
实施例3.针对人类TRAIL-R1和TRAIL-R2的单克隆抗体的产生
1.免疫
6-8周龄的雌性Balb/c小鼠(Jackson Laboratory,Bar Harbor,Me.)用亲和纯化的人类TRAIL-R1和TRAIL-R2-Fc融合蛋白免疫。对于初次爪垫免疫,将融合蛋白(50μg)在弗氏完全佐剂(Difco,Detroit,Mich.)中乳化。然后不含佐剂的50μg融合蛋白注射四次来强化免疫小鼠,注射每两天进行一次。在最后一次注射之后三天,收集来自局部淋巴结的淋巴细胞。
2.细胞融合
从淋巴结制备单细胞悬浮液,以2:1的比例与NS1骨髓瘤细胞混合。产生的混合物用PRMI-1640洗涤三次。然后将一毫升37℃预热的50%(w/v)聚乙二醇1500(Boehringer Manheim)缓慢地添加到试管中,使用移液管的尖端一直搅动沉淀。随后,慢慢地添加预热到37℃的50ml无血清RPMI培养基。然后将产生的混合物离心,弃去上清液,添加含有12%(v/v)FCS的50ml HAT培养基,同时用移液管的尖端轻轻地搅动。悬浮液以100μl/孔分配到96孔细胞微量培养板上,在5%(v/v)CO2的气氛中37℃温育7-10天。
3.单克隆抗体的筛选
将ELISA平板用1μg/ml的异二聚TRAIL-R1和TRAIL-R2-Fc融合蛋白在4℃包被过夜。用PBS洗涤三次之后,用3%BSA PBS在室温下封闭平板1小时。然后添加100μl杂交瘤培养上清液,在37℃经过1小时。用PBS洗涤三次之后,添加HRP缀合的抗小鼠IgG抗体,经过30分钟。用PBS洗涤三次之后,添加TMB底物缓冲液,经过10分钟,然后通过添加2NH2SO4终止反应。在ELISA酶标仪中使用450nm/650nm的双波长记录光密度值。
对所有阳性克隆进行二次确认筛选来排除TRAIL-R1或TRAIL-R2单特异性克隆以及与人类IgG1反应的假阳性克隆。将ELISA平板分别用1μg/ml的异二聚TRAIL-R1和TRAIL-R2-Fc融合蛋白、TRAIL-R1-Fc、TRAIL-R2-Fc或人类IgG1在4℃包被过夜。用PBS洗涤三次之后,用3%BSA PBS在室温下封闭平板1小时。然后添加100μl杂交瘤培养上清液,37℃经过1小时。用PBS洗涤三次之后,然后添加HRP偶联的抗小鼠IgG抗体,经过30分钟。用PBS洗涤三次之后,添加TMB底物缓冲液,经过10分钟,然后通过添加2N H2SO4终止反应。在ELISA酶标仪中使用450nm/650nm的双波长记录光密度值。
在所有的250个阳性克隆中,大约40%与TRAIL-R1-Fc反应,25%与TRAIL-R2-Fc反应,其余的与人类IgG1反应。仅仅一个称为CTB003的克隆与异二聚的TRAIL-R1和TRAIL-R2-Fc融合蛋白、TRAIL-R1-Fc、TRAIL-R2-Fc反应,而不与人类IgG1反应。因此,选择CTB003作为针对TRAIL-R1和/或TRAIL-R2的双特异性克隆。
4.通过有限稀释克隆
最初的CTB003杂交瘤细胞用含有12%FCS的RPMI-1640稀释到每ml0.3个细胞,在存在105个Balb/c小鼠的胸腺细胞作为饲养细胞的情况下在两个96孔平板中培养。7-10天后,收集100μl的培养上清液,如上所述通过ELISA测定抗体产生。通过有限稀释来将阳性克隆亚克隆三次。
克隆的CTB003保持了与TRAIL-R和TRAIL-R2的反应性,而不与人类IgG1反应,因而确认了它的双特异性反应性。CTB003杂交瘤克隆已经保藏到GCMCC,登录号GCMCC 1665。
通过小鼠免疫球蛋白同种型测试试剂盒,CTB003的同种型被确定为鼠的IgG1kappa。
5.CTB003单克隆抗体的纯化
从培养上清液纯化CTB003:将培养上清液加到蛋白G-Sepharose CL-4B亲和层析(Pharmacia)。流速是2ml每分钟。在培养物上清液通过之后,用50ml PBS洗涤柱子。用洗脱缓冲液(0.1M甘氨酸(pH 2.4)、0.15M NaCl)来洗脱蛋白质。在OD280nm测量每个洗脱级分(1ml)的光密度。收集OD280>0.1的级分。在添加100μl的中和缓冲液(1M His-HCL pH 8.5)之后,洗脱物单独地置于透析管中,洗脱物在4℃相对于1升的PBS(pH 7.5)透析。透析缓冲液更换两次。纯化的蛋白质浓缩到1mg/ml,灭菌并在-4℃保存待用。
实施例4.CTB003对TRAIL受体的结合特异性
由于针对TRAIL和针对TNFR家族的其他蛋白质的所有受体有显著的同源性,通过ELISA来测定示例性抗体CTB003对TRAIL-R1和TRAIL-2的特异性,其中使用一组以上描述的可溶形式的TRAIL受体作为抗原。ELISA平板用含1μg/ml的下列重组蛋白质的PBS在4℃包被过夜:1.TRAIL-R1和TRAIL-R2异二聚抗原,2.TRAIL-R1-Fc融合抗原,3.TRAIL-R2-Fc融合抗原,4.TRAIL-R3-Fc融合抗原,5.TRAIL-R4-Fc融合抗原,或BSA作为阴性对照。在用PBS洗涤三次之后,平板用3%BSA PBS在室温下封闭1小时。平板用各种浓度的纯化的CTB003在37℃温育一小时。用PBS洗涤三次,然后添加HRP缀合的抗小鼠IgG抗体,经过30分钟。用PBS洗涤三次之后,添加TMB底物缓冲液,经过10分钟,然后通过添加2NH2SO4终止反应。在ELISA酶标仪中使用450nm/650nm的双波长记录光密度的值。CTB003展现了与TRAIL-R1/TRAIL-R2异二聚体抗原以及TRAIL-R1-Fc或TRAIL-R2-Fc融合抗原的剂量依赖性结合。在测试的抗体浓度的范围内,CTB003不与TRAIL-R3-Fc、TRAIL-R4-Fc融合抗原和BSA反应(图2)。
实施例5.CTB003的体外凋亡诱导活性
1.人类癌细胞系:
使用一组人类癌细胞系评估CTB003的体外凋亡诱导活性,包括:三种人类乳腺癌细胞系(图3,图面A);三种人类结肠癌细胞系(图3,图面B);三种人类胰腺癌细胞系(图3,图面C);三种人类卵巢癌细胞系(图3,图面D);三种人类前列腺癌细胞系(图3,图面E);三种人类肺癌细胞系(图3,图面F)。通过流式细胞计测试,所有的细胞系都是TRAIL-R1和TRAIL-R2细胞表面表达阳性的。(所有的细胞购自ATCC)。
2.ATPLite分析来测定细胞活力
在96孔平板中将每孔1,000个目标细胞在存在七种浓度的10倍稀释CTB003的条件下培养,其中CTB003最高浓度是1000ng/ml,最低浓度0.01ng/ml。在37℃培养过夜之后,根据厂家的说明书(Packard Instruments,Meriden,Conn.)使用ATPLite试剂盒测定细胞活力:添加50μl的细胞裂解缓冲液,然后添加50μl的底物缓冲液。将反应物在发光读数器中计数。细胞活力计算为(处理细胞的cmp/对照细胞的cmp)×100%。
3.CTB003对肿瘤细胞的剂量依赖性杀伤
这些结果表明,CTB003对大多数测试的人类肿瘤细胞展现了可变的杀伤活性。在三种测试的人类乳腺癌细胞系中,两种细胞系的活力在处理之后被降低到低于10%(图3,图面A)。所有三种结肠细胞系的活力低于10%(图3,图面B)。虽然所有人类胰腺癌细胞系对于CTB003是敏感的,三种人类胰腺癌细胞系中的两种对于CTB003是更加敏感的。在用1000ng/ml的CTB003处理之后,存在的活细胞低于5%(图3,图面C)。虽然所有的人类卵巢癌细胞对于CTB003是敏感的,三种人类卵巢癌细胞中的两种是更加敏感的(图3,图面D)。所有三种人类前列腺癌系对CTB003是敏感的(图3,图面E)。三种人类肺癌系中的两种对于CTB003处理是敏感的,而另外一种细胞系似乎对CTB003有抗性。结果表明,CTB003在测试的大多数类型的人类癌细胞中具有杀伤活性。
4.CTB003对肿瘤细胞的时间依赖性杀伤
将人类结肠癌细胞(Colo205)或人类乳腺癌细胞(MDA231)以每孔1000个细胞在存在1000ng/ml CTB003的情况下在96孔平板中培养标明的时间点。在每个时间点结束时通过ATPLite分析测定细胞活力。用1000ng/mlCTB003处理细胞之后,在4、8、12和24小时的时点测定处理的Colo205和MDA231的细胞活力。结果表明CTB003的杀伤活性是时间依赖性的。两种细胞系的活细胞在处理后4h降低到低于50%,处理后24小时低于5%(图4)。
实施例6.CTB003与化疗药物的协同杀伤
1.人类癌细胞系
为了确定CTB003与化疗剂的协同杀伤活性,挑选了一组与其他癌细胞系相比对CTB003介导的杀伤的敏感性较低的人类癌细胞系。选择用于研究的细胞系包括:人类乳腺癌细胞(BT474)、人类结肠癌细胞(SW620)、人类肺癌细胞(A437)、人类结肠癌细胞(SW1116)和人类胰腺癌细胞(Panc
1)。所有的细胞购自ATCC。
2.化疗药物
测试的化疗药物包括:阿霉素、紫杉醇(Taxol)、顺铂和CTP-11和吉西他滨。
3.ATPLite分析来测定细胞活力
在96孔平板中,将每孔1,000个目标细胞在存在四种浓度的10倍稀释CTB003的情况下与三种不同浓度的化疗药物培养,CTB003的最高浓度是1000ng/ml,最低浓度10ng/ml。在37℃培养过夜之后,根据厂家的说明书(Packard Instruments,Meriden,Conn.)使用ATPLite试剂盒测定细胞活力:添加50μl的细胞裂解缓冲液,然后添加50μl的底物缓冲液。将反应物在发光读数器中计数。细胞活力计算为(处理细胞的cmp/对照细胞的cmp)×100%。
4.CTB003和阿霉素对人类乳腺癌细胞(BT474)的协同杀伤
在不存在阿霉素的情况下,CTB003展现对BT474细胞的弱的杀伤活性。使用单独的1000ng/ml CTB003,细胞活力仅降低20%。然而,阿霉素以剂量依赖性方式协同地增强CTB003杀伤。在存在0.1μM阿霉素的情况下,细胞活力降低到低于25%,而用更高浓度的阿霉素(0.5和1.0μM),细胞活力在相同浓度的CTB003下低于5%(图5,图面A)。图5、图面B中呈现了CTB003与阿霉素的协同效应。以从培养基对照孔获得的ATPLite计数作为100%细胞活力,如下计算处理孔中细胞活力的百分比:处理孔的计数除以对照孔的计数,然后乘以100%。结果表示为三个复孔的平均值。
5.CTB003和紫杉醇(Taxol)对人类结肠癌细胞(SW620)的协同杀伤
在不存在紫杉醇的情况下,CTB003展现了对SW620细胞的弱的杀伤活性。使用单独的1000ng/ml CTB003,细胞活力仅降低20%。然而,紫杉醇以剂量依赖性方式协同地增强CTB003杀伤。在存在0.2μM紫杉醇的情况下,细胞活力降低到低于25%,而用更高浓度的阿霉素(1.0μM),细胞活力在相同浓度的CTB003下低于5%(图6,图面A)。CTB003与紫杉醇的协同效应在图6、图面B中呈现。利用从培养基对照孔获得的ATPLite计数作为100%细胞活力,如下计算处理孔中细胞活力的百分比:处理孔的计数除以对照孔的计数,然后乘以100%。结果表示为三个复孔的平均值。
6.CTB003和顺铂对人类肺癌细胞(A437)的协同杀伤
在不存在顺铂的情况下,CTB003对A437细胞不具有杀伤活性。相比之下,顺铂以剂量依赖性方式协同地增强CTB003杀伤。在存在50μM顺铂的情况下,细胞活力降至低于20%(图7,图面A)。CTB003与顺铂的协同效应在图7、图面B中呈现。以从培养基对照孔获得的ATPLite计数作为100%细胞活力,如下计算处理孔中细胞活力的百分比:处理孔的计数除以对照孔的计数,然后乘以100%。结果表示为三个复孔的平均值。
7.CTB003和CTP-11对人类结肠癌细胞(SW1116)的协同杀伤
在不存在CTP-11的情况下,CTB003展现对SW1116细胞的弱的杀伤活性。使用单独的1000ng/ml CTB003,细胞活力仅降低10%。然而,CTP-11以剂量依赖性方式协同地增强CTB003杀伤。在存在5μMCTP-11的情况下,细胞活力降低到50%,而用更高浓度的CTP-11(20μM),细胞活力在相同浓度的CTB003下低于25%(图8,图面A)。CTB003与CTP-11的协同效应在图8、图面B中呈现。以从培养基对照反应孔获得的ATPLite计数作为100%细胞活力,如下计算处理孔中细胞活力的百分比:处理孔的计数除以对照孔的计数,然后乘以100%。结果表示为三个复孔的平均值。
8.CTB003和吉西他滨对人类胰腺癌细胞(Panc-1)的协同杀伤
在不存在吉西他滨的情况下,CTB003不能杀伤Panc-1细胞。然而,吉西他滨以剂量依赖性方式协同地增强CTB003杀伤。在存在1μM吉西他滨的情况下,细胞活力降低25%,而用更高浓度的吉西他滨(10μM),细胞活力在相同浓度的CTB003下低于25%(图9,图面A)。CTB003与吉西他滨的协同效应在图9、图面B中呈现。以从培养基对照孔获得的ATPLite计数作为100%细胞活力,如下计算处理孔中细胞活力的百分比:处理孔的计数除以对照孔的计数,然后乘以100%。结果表示为三个复孔的平均值。
实施例7.CTB003与抗TRAIL-R1或抗TRAIL-R2单特异性单克隆抗体的协同杀伤活性
1.人类癌细胞系
为了测定CTB003与抗TRAIL-R1或抗TRAIL-R2单特异性抗体的协同杀伤活性,选择人类结肠癌细胞系(SW1116)。单独的CTB003或抗TRAIL-R1或抗TRAIL-R2不诱导SW1116细胞中的细胞杀伤。
2.单特异性抗TRAIL-R1或抗TRAIL-R2抗体
CTB007是针对TRAIL-R1的单克隆抗体,其诱导表达TRAIL-R1的肿瘤细胞的凋亡。CTB006是针对TRAIL-R2的单克隆抗体,其诱导表达TRAIL-R2的肿瘤细胞的凋亡。
3.ATPLite分析来测定细胞活力
在96孔平板中,将每孔1,000个目标细胞在存在四种浓度的10倍稀释CTB003的情况下与三种不同浓度的抗TRAIL-R1或抗TRAIL-R2抗体培养,CTB003的最高浓度是1000ng/ml,最低浓度10ng/ml。在37℃培养16h之后,根据厂家的说明书(Packard Instruments,Meriden,Conn.)使用ATPLite试剂盒测定细胞活力:添加50μl的细胞裂解缓冲液,然后添加50μl的底物缓冲液。将反应物在发光读数器中计数。细胞活力计算为(处理细胞的cmp/对照细胞的cmp)×100%。
4.CTB003和CTB007对人类结肠癌细胞(SW1116)的协同杀伤
在不存在CTB007的情况下,CTB003展现对SW1116细胞的弱的杀伤活性。使用单独的1000ng/ml CTB003,细胞活力仅降低10%。然而,CTB007以剂量依赖性方式协同地增强了CTB003杀伤。在存在10ng/ml CTB007的情况下,细胞活力降低到50%,而用更高浓度的CTB007(100ng/ml),细胞活力在相同浓度的CTB003下低于25%(图10,图面A)。CTB003与CTB007的协同效应在图10、图面B中呈现。以从培养基对照孔获得的ATPLite计数作为100%细胞活力,如下计算处理孔中细胞活力的百分比:处理孔的计数除以对照孔的计数,然后乘以100%。结果表示为三个复孔的平均值。
5.CTB003和CTB006对人类结肠癌细胞(SW1116)的协同杀伤
在不存在CTB007的情况下,CTB003展现对SW1116细胞的弱的杀伤活性。使用单独的1000ng/ml CTB003,细胞活力仅降低10%。然而,CTB006以剂量依赖性方式协同地增强了CTB003杀伤。在存在10ng/ml CTB006的情况下,细胞活力降低到50%,而用更高浓度的CTB006(100ng/ml),细胞活力在相同浓度的CTB003下低于25%(图11,图面A)。CTB003与CTB006的协同效应在图11、图面B中呈现。以从培养基对照孔获得的ATPLite计数作为100%细胞活力,如下计算处理孔中细胞活力的百分比:处理的反应孔的计数除以对照孔的计数,然后乘以100%。结果表示为三个复孔的平均值。
实施例8.体内的CTB003杀肿瘤活性
1.人类癌细胞系
用于产生人类癌症的鼠异种移植模型的人类癌细胞系是:a)MDA231人类乳腺癌细胞系;b)7402人类肝癌细胞系;c)Colo205人类结肠癌细胞系;和d)MIAcapa人类胰腺癌细胞系。所有细胞购自ATCC,在补充有10%FCS的DMEM中培养。
2.异种移植模型
用1×107个人类癌细胞皮下接种六(6)至8周龄的Balb/c裸鼠。在肿瘤接种后7-14天(因接种的肿瘤细胞系而不同),超过90%的小鼠长出了活肿瘤块。将荷瘤小鼠随机地分成两个组:一个是未处理的对照组,另一个是CTB003处理的组。人类癌症肿瘤生长通过肿瘤的大小来评估。在接种之后,每周地测量肿瘤大小。
3.用CTB003处理异种移植小鼠
对荷瘤小鼠以三天的间隔每周两次腹膜内注射200μg的CTB003。治疗在三周内重复六次。
4.人类乳腺癌异种移植模型中CTB003的体内抗肿瘤活性
在未处理的组中,肿瘤倍增时间(tumor doubling time)是约7天。在用CTB003处理之后,肿瘤大小快速地降低。在两个剂量的处理之后,在处理组中七只小鼠中的三只发生了完全的肿瘤消退。在另外三只和一只小鼠中分别观察到肿瘤大小的超过70%和50%的降低。在四个剂量的处理之后,所有七只小鼠中发生了完全的肿瘤消退。相比之下,在未处理的对照组的所有小鼠中肿瘤大小继续增长。这些结果表明,CTB003具有强的抗肿瘤效力(图12)。在另一个实验中,评估MDA231异种移植模型中CTB003的抗肿瘤效力直到癌细胞接种后的49天,未处理组中100%(8/8)的小鼠显示了肿瘤大小的继续增长,而CTB003处理的小鼠的大多数(7/8)显示了肿瘤的完全消退(图13)。因而,在人类癌症(例如人类乳腺癌)的体内模型中,当给受试者施用本发明的TRAIL受体结合剂时,本发明的TRAIL受体结合剂显示了治疗效益(例如肿瘤生长的抑制)。因而,本发明的TRAIL受体结合剂及其同源物和功能等同物(例如hCTB003),当以有效量施用于有需要的受试者时,在预防或治疗人类癌症(例如人类乳腺癌)的方法中是有用的。
5.人类肝癌异种移植模型中CTB003的体内抗肿瘤活性
在7402人类肝癌异种移植模型中,CTB003展现了显著的抑制活性。在未处理组中肿瘤倍增时间是约10天,相比之下,CTB003处理组中是35天(图14)。因而,在人类癌症(例如人类肝癌)的体内模型中,本发明的TRAIL受体结合剂当施用于受试者时显示了治疗效益(例如肿瘤生长的抑制)。因而,本发明的TRAIL受体结合剂及其同源物和功能等同物(例如hCTB003),当以有效量施用于有需要的受试者时,在预防或治疗人类癌症(例如人类肝癌)的方法中是有用的。
6.人类结肠癌异种移植模型中CTB003的体内抗肿瘤活性
在Colo205人类结肠癌异种移植模型中,与未处理组中100%的肿瘤进展相比,CTB003实现了100%的完全肿瘤消退(图15)。因而,在人类癌症(例如人类结肠癌(例如结肠直肠癌))的体内模型中,本发明的TRAIL受体结合剂当施用于受试者时显示了治疗效益(例如肿瘤生长的抑制)。因而,本发明的TRAIL受体结合剂,以及其同源物和功能等同物(例如hCTB003),当有效量施用于有需要的受试者时,在预防或治疗人类癌症(例如人类结肠癌)的方法中是有用的。
7.人类胰腺癌异种移植模型中CTB003的体内抗肿瘤活性
在MIAcapa人类胰腺癌异种移植模型中,CTB003展现显著的抑制活性。在未处理的组中观察到的肿瘤倍增时间为约14天,相比之下,CTB003处理的组中为70天(图16)。因而,在人类癌症(例如胰腺癌)的体内模型中,本发明的TRAIL受体结合剂当施用于受试者时显示了治疗效益(例如肿瘤生长的抑制)。因而,本发明的TRAIL受体结合剂及其同源物和功能等同物(例如hCTB003)当以有效量施用于有需要的受试者时,在预防或治疗人类癌症(例如人类胰腺癌)的方法中是有用的。
总的来说,在多种人类癌症(例如人类乳腺癌;人类肝癌;人类结肠癌;人类胰腺癌)的体内模型中,本发明的TRAIL受体结合剂当施用给受试者时显示了治疗效益(例如与未处理的对照受试者中观察到的肿瘤生长相比,肿瘤细胞生长的降低)。这些癌症共有TRAIL-R1和/或TRAIL-R2多肽表达的生物学特征。如以上讨论的,细胞(包括癌细胞)上功能性TRAIL-R1和/或TRAIL-R2多肽的活化可以导致细胞死亡(例如凋亡性细胞死亡)。因而,本发明的TRAIL受体结合剂及其同源物和功能等同物(例如hCTB003),当以有效量施用于有需要的受试者时,在预防或治疗表达表达TRAIL-R1和/或TRAIL-R2多肽的人类癌细胞的方法中是有用的,所述癌细胞包括但不限于乳腺癌;肝癌;结肠癌;胰腺癌。
实施例9.CTB003和阿霉素的协同的体内抗肿瘤效力
1.人类癌细胞系
人类乳腺癌细胞系(MDA231)用于裸鼠中异种移植模型的制备。
2.异种移植模型
用1×107个人类MDA231乳腺癌细胞皮下接种六(6)至8周龄的Balb/c裸鼠。在肿瘤接种后7-10天,超过90%的小鼠长出了活肿瘤块。将荷瘤小鼠随机分成四组:第一组是未处理的对照组,第二组是用阿霉素单独处理的;第三组是用CTB003单独处理的,第四组是用阿霉素和CTB003组合处理的。通过测量肿瘤的大小来评估人类乳腺癌肿瘤生长。在接种之后,每周测量小鼠中的肿瘤大小。
3.用CTB003和阿霉素处理异种移植小鼠
100μg每剂的阿霉素以三天的间隔每周两次地腹膜内注射三次。200μg每剂的CTB003以三天的间隔每周两次腹膜内注射总共六剂。阿霉素在CTB003注射之前一天给药。
4.CTB003和阿霉素的协同的体内抗肿瘤效力
在未处理的组中,肿瘤倍增时间是约7天。在用单独的阿霉素处理之后,观察到肿瘤抑制作用,但是与处理前相比肿瘤大小的降低不显著。在CTB003处理的组中,肿瘤大小快速地降低。在两个剂量的处理之后,在处理组中七只小鼠中的三只发生了完全的肿瘤消退。在另外三只和一只小鼠中分别观察到肿瘤大小的超过70%和50%的降低。在四个剂量处理之后所有七只小鼠中都发生了几乎完全的肿瘤消退。当用CTB003和阿霉素处理小鼠时,在两轮的处理之后,在七只小鼠的五只中发生了完全的肿瘤消退,其它小鼠中的肿瘤大小显著地小于用单独的CTB003处理的小鼠中观察到的肿瘤大小。由于单独给予阿霉素几乎未显示效果,因此CTB003和阿霉素联合处理中完全肿瘤消退的显著增加表明CTB003和阿霉素具有体内的协同抗肿瘤效力(图17)。
因而,在人类癌症(例如人类乳腺癌)的体内模型中,本发明的TRAIL受体结合剂当与另一种化疗剂(例如阿霉素)组合施用给受试者时,显示了协同的治疗效益(例如肿瘤生长的抑制作用)。因而,本发明的TRAIL受体结合剂及其同源物和功能等同物(例如hCTB003),当以有效量与一种或多种化疗剂(例如阿霉素)组合施用于有需要的受试者时,在预防或治疗人类癌症(例如人类乳腺癌)的方法中是有用的。
实施例10.CTB003和CTB006的协同的体内抗肿瘤效力
1.人类癌细胞系
人类乳腺癌细胞系(MDA231)用于在制备裸鼠中的异种移植模型。
2.异种移植模型
用1×107个人类MDA231乳腺癌细胞皮下接种六(6)至8周龄的Balb/c裸鼠。在肿瘤接种后7-10天,超过90%的小鼠长出了活肿瘤块。将荷瘤小鼠随机分成四组:第一组是未处理的对照组,第二组是用CTB006单独处理的;第三组是用CTB003单独处理的,第四组是用CTB006和CTB003联合处理的。通过测量肿瘤的大小来评估人类乳腺癌肿瘤生长。在接种之后,每周测量小鼠中的肿瘤大小。
3.用CTB003和CTB006处理异种移植小鼠
CTB003处理的组中带有肿瘤的小鼠以三天的间隔每周两次地腹膜内注射100μgCTB003三次。CTB003处理的组中带有肿瘤的小鼠以三天的间隔每周两次地腹膜内注射200μg CTB003。在三周内重复进行处理六次。同时地给予两种抗体。
4.CTB003和阿霉素的体内抗肿瘤效力
在未处理的组中,肿瘤倍增时间是约7天。在用单独的CTB006处理之后,观察到肿瘤抑制作用,但是与处理前相比肿瘤大小降低不是显著的。在CTB003处理的组中,肿瘤大小快速地降低。在两个剂量的处理之后,在处理组中七只小鼠中的三只观察到完全的肿瘤消退。在另外三只和一只小鼠中分别观察到肿瘤大小的超过70%和50%的降低。在四个剂量处理之后所有七只小鼠中发生了完全的肿瘤消退。当用CTB003和CTB006的组合处理小鼠时,在两轮的处理之后,在七只小鼠的四只中发生了完全的肿瘤消退,处理组中其余小鼠的肿瘤大小显著地小于单独的CTB003处理组中观察到的肿瘤大小。这些结果表明,CTB003和CTB006具有协同的体内抗肿瘤效力(图18)。
因而,在人类癌症(例如人类乳腺癌)的体内模型中,本发明的TRAIL受体结合剂当与另一种TRAIL受体结合剂(例如CTB006)组合施用给受试者时,显示了协同的治疗效益(例如肿瘤生长的抑制作用)。因而,本发明的TRAIL受体结合剂及其同源物和功能等同物(例如hCTB003)当以有效量与另一种TRAIL受体结合剂(例如CTB006;hCTB006)组合施用于有需要的受试者时,在预防或治疗人类癌症(例如人类乳腺癌)的方法中是有用的。
实施例11.CTB003的重链和轻链的可变区的序列的分析
1.编码CTB003的重链和轻链的可变区的cDNA的克隆
从CTB003杂交瘤分离总RNA。通过逆转录合成cDNA,将其作为PCR模板用于克隆编码CTB003的重链和轻链的可变区的cDNA。
2.PCR寡核苷酸引物的合成:
a)15种重链可变区引物(含有Sfi I限制性位点)如下:
VH1(49mer):5’-GGA ACC CTT TGG CCC AGC CGG CCA TGG CC(C或G)AGG T(C或T)C AGC T(C或G或T)C AGC AGT C-3’(SEQID NO.:53)
VH2(49mer):5’-GGA ACC CTT TGG CCC AGC CGG CCA TGG CCCAGG TTC ACC TGC AGC A(A或G)T C-3’(SEQ ID NO.:54)
VH3(49mer):5’-GGA ACC CTT TGG CCC AGC CGG CCA TGG CCCAGG T(A或G)C AGC TGA AGG AGT C-3’(SEQ ID NO.:55)
VH4(49mer):5’-GGA ACC CTT TGG CCC AGC CGG CCA TGG CCCAGG TCC AAC T(A或C或G)C AGC A(A或G)C C-3’(SEQ ID NO.:56)
VH5(49mer):5’-GGA ACC CTT TGG CCC AGC CGG CCA TGG CCCAGA TCC AGT TGG T(A或C或G)C AGT C-3’(SEQ ID NO.:57)
VH6(49mer):5’-GGA ACC CTT TGG CCC AGC CGG CCA TGG CCCAGG TGC AGC TGA AG(C或G)A(C或G)T C-3’(SEQ ID NO.:58)
VH7(49mer):5’-GGA ACC CTT TGG CCC AGC CGG CCA TGG CCGAGG TGC AG(C或G)(G或T)GG TGG AGT C-3’(SEQ ID NO.:59)
VH8(49mer):5’-GGA ACC CTT TGG CCC AGC CGG CCA TGG CCGAAG TGA ARS TTG AGG AGT C-3’(SEQ ID NO.:60)
VH9(49mer):5’-GGA ACC CTT TGG CCC AGC CGG CCA TGG CCGA(G或T)G T(C或G)(A或C或G)AGC TTC AGG AGT C-3’(SEQID NO.:61)
VH10(49mer):5’-GGA ACC CTT TGG CCC AGC CGG CCA TGG CCGAGG TGA A(C或G)(C或G)TGG TGG AAT C-3’(SEQ ID NO.:62)
VH11(49mer):5’-GGA ACC CTT TGG CCC AGC CGG CCA TGG CCGAGG TGA AGC TG(A或G)TGG A(A或G)T C-3’(SEQ ID NO.:63)
VH12(49mer):5’-GGA ACC CTT TGG CCC AGC CGG CCA TGG CCGA(A或G)G TGA AGC TG(A或G)TGG AGT C-3’(SEQ ID NO.:64)
VH13(49mer):5’-GGA ACC CTT TGG CCC AGC CGG CCA TGG CCGAAG TGC AGC TGT TGG AGA C-3’(SEQ ID NO.:65)
VH14(49mer):5’-GGA ACC CTT TGG CCC AGC CGG CCA TGG CCGA(A或G)G TGA AGC TTC TC(C或G)AGT C-3’(SEQ ID NO.:66)
VH15(48mer):5’-GGA ACC CTT TGG CCC AGC CGG CCA TGG CCCA(A或G)G TTA CTC TGA AAG AGT-3’(SEQ ID NO.:67)
b)IgG恒定区引物:
IgG CH(20mer):5’-TAR CCY TTG ACM AGG CAT CC-3’(SEQ IDNO.:68)
c)8种轻链可变区引物:
VK1(32mer):5’-TAT TCG TCG ACG GAT ATT GTG ATG AC(C或G或T)CAG(A或G或T)C-3’(SEQ ID NO.:69)
VK2(32mer):5’-TAT TCG TCG ACG GAT(A或G)TT(G或T)TG ATG ACC CA(A或G)AC-3’(SEQ ID NO.:70)
VK3(32mer):5’-TAT TCG TCG ACG GAA AAT GTG CTC ACC CAGTC-3’(SEQ ID NO.:71)
VK4(32mer):5’-TAT TCG TCG ACG GA(C或T)ATT GTG ATG ACACAG TC-3’(SEQ ID NO.:72)
VK5(32mer):5’-TAT TCG TCG ACG GAC ATC CAG ATG ACA CAGAC-3’(SEQ ID NO.:73)
VK6(32mer):5’-TAT TCG TCG ACG GA(C或T)ATT GTG CTS AC(C或T)CA(A或G)TC-3’(SEQ ID NO.:74)
VK7(32mer):5’-TAT TCG TCG ACG GAC ATC CAG ATG AC(C或T)CA(A或G)TC-3’(SEQ ID NO.:75)
VK8(32mer):5’-TAT TCG TCG ACG CAA ATT GTT CTC ACC CAGTC-3’(SEQ ID NO.:76)
d)Kappa轻链恒定区引物:
IgG CK(18mer):5’-CGT TCA CTG CCA TCA ATC-3’(SEQ ID NO.:77)
3.PCR反应:
为了获得编码CTB003的重链可变区的cDNA,设置总共15个PCR反应,为获得编码轻链可变区的cDNA设置8个反应。PCR反应溶液的组成:模板cDNA 5μl,10pmol 5′引物:VH1-VH15或VK1-VK8,10pmol 3’引物CH或CK,10μl10×浓缩的PCR缓冲液,4μl dNTP(各2.5mM),5单位的Taq聚合酶(Promega)。添加无菌蒸馏水至溶液达到100μl的总体积。如下进行PCR反应。首先将溶液在94℃加热2分钟,之后重复40次加热到94℃ 30秒、52℃ 1分钟和72℃ 3分钟的循环。在这个过程完成之后,将反应溶液在72℃加热10分钟。将由此获得的扩增的DNA片段在含有0.25μg/ml的溴化乙锭的1%琼脂糖凝胶上分离。利用Gene Clean试剂盒(BIO101)回收确定含有期望的DNA片段的条带。
4.PCR产物的TA克隆
DNA片段使用TA克隆试剂盒(Invitrogen,CA)克隆。克隆如下进行:从PCR反应溶液回收DNA片段,与TA克隆试剂盒提供的50 ng pCR2.1载体一起,与1μl的10×连接酶反应缓冲液(6mM Tris-HCl(pH 7.5)、6mM氯化镁、5mM氯化钠、7mM.β-巯基乙醇、0.1mM ATP、2mM DTT、1mM亚精胺、和0.1mg/ml牛血清白蛋白)混合,所述缓冲液中已经添加了4个单位的T4DNA连接酶(1μl)。混合物的总体积用无菌去离子水调整到10μl,所得的连接酶溶液在14℃温育15小时。在这以后,将2μl的连接酶反应溶液添加到50μl的感受态大肠杆菌菌株TOP10F中,所述菌株由TA克隆试剂盒提供,根据使用手册制备为感受态,将所得混合物在冰上保持30分钟,然后在42℃保持30秒,再次在冰上保持5分钟。然后,将含有2% v/v胰蛋白胨、0.5%(w/v)酵母提取物、0.05% w/v氯化钠、2.5mM氯化钾、1mM氯化镁和20mM葡萄糖的500μl培养基(以下称为"SOC"培养基)添加到培养物中,将混合物在37℃振荡培养1小时。在这之后,将培养物涂布在L-肉汤琼脂平板(1%v/v胰蛋白胨、0.5% w/v酵母提取物、0.5% w/v氯化钠、0.1% w/v葡萄糖和0.6% w/v细菌琼脂(Difco))上。选取平板上出现的氨苄青霉素抗性菌落,用铂接种环刮下,在含有100μg/ml氨苄青霉素的L-肉汤培养基中在200rpm振荡下37℃培养过夜。温育之后,通过离心收获细胞,通过碱法从中制备质粒DNA。
5.序列分析:
随机挑选五个单独的TA克隆。纯化DNA并利用M13引物双方向地测序。
6.结果:
利用VH1和VK1引物,PCR反应产生了特异性DNA产物。轻链和重链的可变区的序列在图1中列出。
实施例12.CTB003识别的表位的分析
1.编码TRAIL-R2的细胞外结构域的多肽的合成:
肽A.TRAIL-R2(aa52-aa81)
ESALITQQDLAPQQRAAPQQKRSSPSEGLC(SEQ ID NO.:6)
肽B.TRAIL-R2(aa72-aa101)
KRSSPSEGLCPPGHHISEDGRDCISCKYGQ(SEQ ID NO.:78)
肽C.TRAIL-R2(aa92-aa121)
RDCISCKYGQDYSTHWNDLLFCLRCTRCDS(SEQ ID NO.:79)
肽D.TRAIL-R2(aa112-aa141)
FCLRCTRCDSGEVELSPCTTTRNTVCQCEE(SEQ ID NO.:80)
肽E.TRAIL-R2(aa132-aa161)
TRNTVCQCEEGTFREEDSPEMCRKCRTGCP(SEQ ID NO.:81)
肽F.TRAIL-R2(aa154-aa183)
RKCRTGCPRGMVKVGDCTPWSDIECVHKES(SEQ ID NO.:82)
肽G.TRAIL-R2(aa164-aa193)
MVKVGDCTPWSDIECVHKESGTKHSGEAPA(SEQ ID NO.:83)
2.竞争性抑制ELISA
ELISA平板用含1μg/ml TRAIL-R2-Fc融合蛋白的PBS在4℃包被过夜。用PBS洗涤三次之后,用3%BSA PBS在室温下封闭平板1小时。分别添加1μg/ml的CTB003及各种浓度的TRAIL-R2多肽A、B、C、D、E、F、G,在37℃1小时。通过用PBS洗涤三次来除去未结合的抗体,然后在37℃添加HRP-缀合的山羊抗小鼠IgG1经过30分钟。在用PBS洗涤三次之后,添加TMB底物缓冲液,经过10分钟,然后通过添加2N H2SO4终止反应。在ELISA酶标仪中使用450nm/650nm的双波长记录光密度的值。
以不存在肽的情况下的OD值作为CTB003对TRAIL-R2的最大结合。各种浓度的肽对CTB003与TRAIL-R2的结合的竞争性抑制计算为相对最大结合的百分比。
3.结果:
如图19中所示,不同于被测试的其他肽(即,肽A-E),肽F和肽G以剂量依赖性方式抑制CTB003与TRAIL-R2的结合。因而,CTB003识别的表位位于TRAIL-R2的aa163到aa211之间。
4.编码TRAIL-R2和TRAIL-R1的细胞外结构域的多肽的合成.
为了进一步确认CTB003的表位,比较了TRAIL-R1和TRAIL-R2的细胞外结构域的氨基酸序列同源性。在TRAIL-R2的aa167到aa182之间和TRAIL-R1的aa218到aa233之间鉴定了一个高度同源的区域,而在TRAIL-R3和TRAIL-R4(图31)的相应区域中则没有这样的区域。因而,我们假定CTB003中被TRAIL-R1和TRAIL-R2同时识别的表位位于这个区域中。为了检验这种假定,合成了肽H和肽I,如下:
肽H.TRAIL-R2(aa167-aa182)VGDCTPWSDIECVHKE(SEQ IDNO.:46)
肽I.TRAIL-R1(aa218-aa233)VKDCTPWSDIECVHKE(SEQ ID NO.:45)
5.竞争性抑制ELISA
ELISA平板用含1μg/ml TRAIL-R1或TRAIL-R2-Fc融合蛋白的PBS在4℃包被过夜。用PBS洗涤三次之后,用3%BSA PBS在室温下封闭平板1小时。添加1μg/ml的CTB003并分别添加不同浓度的多肽H和多肽I,在37℃1经过小时。通过用PBS洗涤三次来除去未结合的抗体,然后在37℃添加HRP-缀合的山羊抗小鼠IgG1,经过30分钟。用PBS洗涤三次之后,添加TMB底物缓冲液,经过10分钟,然后通过添加2N H2SO4终止反应。在ELISA酶标仪中使用450nm/650nm的双波长记录光密度的值。以不存在肽的情况下的OD值作为CTB003对TRAIL-RI或TRAIL-R2的最大结合。各种浓度的肽对CTB003与TRAIL-R2的结合的竞争性抑制被计算为相对最大结合的百分比。
6.结果:
如图20,图面A所示,肽H或I都以剂量依赖性方式抑制了CTB003对TRAIL-R1的结合。同样地,如在图20,图面B中所示,肽H或I以剂量依赖性方式抑制了CTB003对TRAIL-R2的结合。因而,CTB003识别的表位位于TRAIL-R2的aa167到aa182和TRAIL-R1的aa218到aa233之间(即,TRAIL-R1和TRAIL-R2间的序列同源性区域)。就申请人所知,这是该区域首次被鉴定为TRAIL-R1和TRAIL-R2多肽共有的表位,可以用该区域作为靶标来产生拮抗剂抗体,用于诱导表达TRAIL-R1和/或TRAIL-R2的癌细胞的凋亡。
实施例13.本发明的小鼠-人类嵌合的CTB003、CTB006和CTB007TRAIL受体结合剂的制备和表征
I.小鼠-人类嵌合CTB003、CTB006和CTB007TRAIL受体结合剂的制备
鼠可变区基因.用于小鼠-人类嵌合抗体的构建的轻链和重链可变区来自小鼠-小鼠杂交瘤CTB003(CGMCC NO.1665)、CTB006(CGMCC NO.1691)或CTB007(CGMCC NO.1733)。将这些重链和轻链克隆用作PCR诱变的模板,来引入用于克隆到TA克隆载体中的限制性位点。
人类IgG1恒定区cDNA的克隆.利用分离自人类外周血单个核细胞的总RNA,通过RT-PCR来克隆编码人类IgG1重链和轻链恒定区的cDNA克隆。在确认序列之后,将cDNA克隆到表达载体(pcDNAIII)中。
嵌合CTB003、CTB006和CTB007表达载体的构建.以来自如上所述的杂交瘤的克隆的重链和轻链可变区cDNA作为模板进行PCR。通过PCR所使用的引物来引入用于连接到已经以正确的阅读框插入了人类IgG1重链或轻链恒定区的cDNA的pcDNAIII表达载体中的限制性位点。PCR产物首先连接到pCRII中,在大肠杆菌中克隆,然后再次测序来确保在引入新限制性位点的期间没有发生突变。将轻链和重链可变区产物分别克隆到Ig表达载体的DraIII和BsiWI(kappa轻链)和MluI和NheI(gamma 1重链)位点。产生的完整的表达载体命名为pcDNAIII-hCTB003LC、pcDNAIII-hCTB003HC、pcDNAIII-hCTB006LC、pcDNAIII-hCTB006HC、pcDNAIII-hCTB007LC、pcDNAIII-hCTB007HC。这些cDNA克隆和表达载体于2007年4月13日保藏在中国普通微生物菌种保藏中心(GCMCC)。
转染CHO细胞用于嵌合抗体的表达和抗体生产克隆的选择配对的质粒:pcDNAIII-hCTB003LC和pcDNAIII-hCTB003HC;pcDNAIII-hCTB006LC和pcDNAIII-hCTB006HC;或pcDNAIII-hCTB007LC和pcDNAIII-hCTB007HC,单独地通过DNA-脂质体介导的转染导入中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。简要地,2μg的质粒DNA与8μl的脂质转染试剂(Lipofectamine)(Gibco,Gaithersberg,Md.)在1ml的无血清培养基的最终体积中混合。容许转染混合物在37℃温育5h。洗涤细胞,添加新鲜培养基,温育细胞48h。收获细胞,重悬浮在含有G418(400μg/ml;Gibco)的培养基中,以不同的稀释度铺板在12孔平板上。通过酶联免疫吸附测定(ELISA)来测定在抗生素选择下生长的细胞的嵌合抗体生产。ELISA平板用2μg的TRAIL-R1-Fc或TRAIL-R2-Fc融合蛋白包被,培养上清液中mAbs(即,单克隆抗体)的结合用HRP缀合的山羊抗人类kappa轻链特异性抗体(SoutherBiotech,Birmingham,Alabama)来测定。
嵌合抗体的纯化通过蛋白A亲和层析(Pharmacia)从组织培养上清液中纯化嵌合的IgG抗体。来自转染的CHO细胞的500ml的培养物上清液以2ml每分钟的流动速度通过蛋白A琼脂糖柱。在培养物上清液通过之后,用50lm PBS洗涤柱子。用洗脱缓冲液(0.1M甘氨酸(pH2.4)、0.15M NaCl)来洗脱蛋白质。测量每个洗脱级分(1ml)的OD280nm光密度。收集OD280>0.1的级分。添加100μl的中和缓冲液(1M His-HCL pH 8.5)之后,将洗脱物单独地置于透析管中,洗脱物在4℃相对于1升的PBS(pH 7.5)透析。透析缓冲液更换两次。纯化的蛋白质浓缩到1mg/ml,灭菌并在-4℃保存待用。通过10%SDS-PAGE测定,人类嵌合抗体的纯度大于95%。
II.嵌合的CTB003、CTB006和CTB007对TRAIL受体的结合特征
通过ELISA将嵌合的CTB003、CTB006和CTB007对TRAIL受体的结合活性与它们的亲本鼠抗体相比较。ELISA平板用含1μg/ml以下重组蛋白质的PBS在4℃包被过夜:1.TRAIL-R1和TRAIL-R2异二聚抗原,2.TRAIL-R1-Fc融合抗原,3.TRAIL-R2-Fc融合抗原,4.TRAIL-R3-Fc融合抗原,5.TRAIL-R4-Fc融合抗原,或BSA作为阴性对照。在用PBS洗涤三次之后,平板用3%BSA PBS在室温下封闭1小时。平板与各种浓度的纯化的嵌合或亲本鼠抗体在37℃温育一小时。通过用PBS洗涤三次来除去未结合的抗体,然后对于鼠抗体添加HRP缀合的山羊抗小鼠IgG1,或对于人类嵌合抗体添加HRP缀合的山羊抗人kappa,在37℃经过30分钟。用PBS洗涤三次之后,添加TMB底物缓冲液经过10分钟,然后通过添加2N H2SO4终止反应。在ELISA酶标仪中用450nrn/650nm的双波长记录光密度的值。
嵌合的CTB003展现了对TRAIL-R1/TRAIL-R2异二聚体抗原(图21,图面A)以及TRAIL-R1-Fc(图21,图面B)或TRAIL-R2-Fc(图21,图面C)融合抗原的剂量依赖性结合,且其结合动力学与对亲本鼠CTB003所观察到的结合特征几乎不能区分。在测试的抗体浓度的范围内,嵌合的CTB003不与TRAIL-R3-Fc(图21,图面D)、TRAIL-R4-Fc(图21,图面E)融合抗原或BSA(图21,图面F)反应。
嵌合的CTB006和嵌合的CTB007的特征分别总结在图22和23中。这些结合剂的人源化嵌合形式的结合特征基本上不能与它们对应的鼠亲本对应物相区别。也就是说,嵌合的CTB006展现了对TRAIL-R1/TRAIL-R2异二聚体抗原(图22,图面A)以及TRAIL-R2-Fc(图22,图面C)融合抗原的剂量依赖性结合,结合动力学非常类似于亲本CTB006。在测试的抗体浓度的范围内,嵌合的CTB006不与TRAIL-R1-Fc(图22,图面B)、TRAIL-R3-Fc(图22,图面D)、TRAIL-R4-Fc(图22,图面E)融合抗原或BSA(图22,图面F)反应。
嵌合的CTB007展现了对TRAIL-R1/TRAIL-R2异二聚体抗原(图23,图面A)以及TRAIL-R1-Fc(图23,图面B)融合抗原的剂量依赖性结合,结合动力学非常类似于亲本CTB007的那些。在测试的抗体浓c的范围内,CTB007不与TRAIL-R2-Fc(图23,图面C)、TRAIL-R3-Fc(图23,图面D)、TRAIL-R4-Fc(图23,图面E)融合抗原或BSA(图23,图面F)反应。
类似于在实施例12中描述的研究,在互反实验中用TRAIL-R1和TRAIL-R2融合多肽进行竞争性抑制ELISA来进一步对人类嵌合CTB003的表位特异性加以定位。如图24,图面A所示,肽H或I都以剂量依赖性方式抑制了人源化嵌合的CTB003对TRAIL-R1的结合。同样地,如在图20,图面B中所示,肽H或I以剂量依赖性方式抑制人源化嵌合的CTB003对TRAIL-R2的结合。因而,人源化嵌合的CTB003所识别的表位位于TRAIL-R2的aa167到aa182和TRAIL-R1的aa218到aa233之间(即,TRAIL-R1和TRAIL-R2之间具有序列同源性的区域)。显著地,人源化嵌合的CTB003结合剂的结合特征基本上不能与鼠CTB003相区别。为了确定这些结合剂是否共有相同的生物学性质,如下所述在许多癌细胞系中将嵌合的CTB003的体外凋亡诱导活性与鼠CTB003进行了比较。
III.嵌合的CTB003、CTB006和CTB007的体外凋亡诱导活性
使用一组人类癌细胞系来于评估嵌合的CTB003、CTB006和CTB007的体外凋亡诱导活性,包括:人类乳腺癌细胞系,MDA231;人类结肠癌细胞系,Colo205;人类胰腺癌细胞系,MIAcapa;人类卵巢癌细胞系,CaOvc3;人类前列腺癌细胞系,Du145;和人类肺癌细胞系,H2122。
用ATPLite分析测定细胞活力和每种抗体的IC50。在96孔平板中,将每孔1,000个目标细胞在存在七种浓度的10倍稀释嵌合抗体或它们的相应亲本鼠抗体的情况下培养,抗体最高浓度是1000ng/ml,最低浓度0.01ng/ml。在37℃培养过夜之后,根据厂家的说明书(Packard Instruments,Meriden,Conn.)使用ATPLite试剂盒测定细胞活力:添加50μl的细胞裂解缓冲液,然后添加50μl的底物缓冲液。反应物在发光读数器中计数。细胞活力计算为(处理细胞的cmp/对照细胞的cmp)×100%。产生了剂量依赖性杀伤曲线。IC50通过线性回归来计算。结果表示为三个重复培养物的平均值±SD。
所有六种测试的人类癌细胞系,包括MDA231人类乳腺癌细胞(图25)、Colo205人类结肠癌细胞(图26)、MIAcapa人类胰腺癌细胞(图27)、Caov3人类卵巢癌细胞(图28)、Du145人类前列腺癌细胞(图29)和H2122人类肺癌细胞,对于鼠CTB003和人类嵌合CTB003(图面A)或鼠CTB006和嵌合的CTB006(图面B)或鼠CTB007和嵌合的CTB007(图面C)所诱导的凋亡是同样地敏感的。重组嵌合抗体展现了与它们相应的亲本鼠抗体相似的剂量应答关系。这些结果表明,所有工程化的嵌合抗体保持了它们的鼠亲本抗体的凋亡诱导活性。
人类嵌合的和鼠抗体的凋亡诱导活性在表8中以IC50表示,其显示在所有测试的人类癌症细胞中,重组嵌合的CTB003、CTB006和CTB007展现了与它们的鼠亲本抗体非常相似的IC50。根据在人源化嵌合CTB003和鼠CTB003之间观察到的共有的结合特征和体外生物学应答,我们认为,本领域普通技术人员将认识到,人源化的嵌合CTB003也将如鼠CTB003一样产生体内的肿瘤生长抑制作用。因而,本发明的结合剂(例如hCTB003)当以有效量施用给有需要的受试者(包括人类受试者)时在抑制肿瘤生长的方法中是有效的。
实施例14.CTB003在非人灵长类中的临床前毒性研究
在北京国家药物安全评估和研究中心(中国北京)在非人灵长类中评估了CTB003的全身毒性。对体重4.5kg的4-5月龄的雄性恒河猴以40mg/kg剂量静脉内输注CTB003。CTB003以3mg/ml溶于PBS中,总输注体积是每kg体重20ml。输注速率是每分钟5滴,输注在90分钟内完成。从处理前第7天开始到处理后15天止,每天检查受处理动物的一般生理状况。在处理前第7天和在处理后0、3、7和14天检查体重、体温、EKG、血液学参数、血液生物化学参数。
在处理之后,动物的一般身体状况看起来是正常的。体重稍有增高,体温保持在正常范围之内(表9)。
在处理后所有测试的血液学参数(表10)没有显著的改变,生物化学测量值在处理后保持正常(表11)。结果表明,CTB003以40mg/kg的全身性施用在恒河猴中得到了良好的耐受。
结果表明,CTB003以40mg/kg的全身性施用在恒河猴中得到了良好的耐受。
实施例15.CTB006和CTB007在非人灵长类中的临床前毒性研究
在北京国家药物安全评估和研究中心(中国北京)在非人灵长类中评估了CTB006和007的全身毒性。对体重4.0-4.3kg的4-5月龄的雌性恒河猴以40mg/kg的剂量静脉内输注CTB006或CTB007。CTB006或CTB007以3mg/ml溶于PBS中,总输注体积是每kg体重20ml。输注速率是每分钟40滴,输注在90分钟内完成。从处理前第7天开始到处理后15天止,每天检查受处理动物的一般生理状况。在处理前第7天和在处理后0、3、7和14天检查体重、体温、EKG、血液学参数、血液生物化学参数。
在用CTB006或CTB007处理之后,动物的一般身体状况看起来是正常的。体重没有改变,体温保持在正常范围之内(表12)。
在用CTB006(表13)或CTB007(表14)处理后所有测试的血液学参数没有显著改变,所有的生物化学测量值(表15和16)保持正常,只是在处理后血浆ALT和AST中轻微和短暂的增加,其在处理后7天回到正常。
这些结果表明,CTB006或CTB007以40mg/kg对恒河猴的全身性施用得到了良好的耐受。
实施例16.CTB003、CTB006和CTB007的重链和轻链的N-末端氨基酸序列的确定
为了获得CTB003、CTB006和CTB007的重链和轻链的cDNA,通过已知技术测定了CTB003、CTB006和CTB007的重链和轻链的N-末端氨基酸序列。将5μg的亲和纯化的CTB003、CTB006和CTB007在10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(“SDS-PAGE”)中在还原条件下分离。在电泳之后,将凝胶中的蛋白质转移到聚乙二烯二氟化物膜(“PVDF”)上。在转移之后,用洗涤缓冲液25mM NaCl、10mM硼酸钠缓冲液(pH8.0)洗涤PVDF膜,然后在染色溶液(50% v/v甲醇、20% v/v乙酸和0.05%(w/v)考马斯亮蓝)中洗涤5分钟来确定蛋白质条带的位置。然后用90%(v/v)含水甲醇脱色PVDF膜,将早先在PDVF膜上定位的与重链相应的条带(具有较低泳动能力的条带)和与轻链相应的条带(具有较高泳动能力的条带)切下,并用去离子水洗涤。利用蛋白质测序仪(PROCISE 491,ABI,USA)通过Edman自动化方法来测定重链和轻链的N-末端氨基酸序列。
测得与CTB003的重链相应的N-末端氨基酸序列为:Glu-Val-His-Leu-Val-Glu-Ser-Gly-Gly-Gly-Leu-Val-Arg-Pro-Gly-Gly-Ser(SEQID NO.:84)
测得与CTB003的轻链相应的条带的N-末端氨基酸序列为:Ala-Thr-Met-Arg-Leu-Pro-Ala-Gln-Leu-Leu-Gly-Leu-Leu-Met-Leu-Trp-Val-Ser(SEQ ID NO.:85)
测得与CTB006的重链相应的N-末端氨基酸序列为:Gln-Val-Gln-Leu-Gln-Gln-Pro-Gly-Pro-Glu-Leu-Val-Lys-Pro-Gly-Ala-Ser(SEQ ID NO.:86)
测得与CTB006的轻链相应的条带的N-末端氨基酸序列为:Asp-Ile-Val-Met-Thr-Gln-Ser-His-Lys-Phe-Met-Ser-Thr-Ser-Val-Gly(SEQ IDNO.:87)
测得与CTB007的重链相应的N-末端氨基酸序列为:Glu-Val-Gln-Leu-Gln-Gln-Ser-Gly-Ala-Glu-Leu-Val-Lys-Pro-Gly-Ala-Ser(SEQ ID NO.:88).
测得与CTB007的轻链相应的条带的N-末端氨基酸序列为:Asp-Ile-Gln-Met-Thr-Gln-Ser-Pro-Ala-Ser-Leu-Ser-Val-Ser-Val(SEQ IDNO.:89).
实施例17.CTB003相关的序列
以下提供了CTB003相关的序列。
鼠CTB003轻链可变区核酸序列在下文的表17中显示。
表17.鼠CTB003轻链可变区核酸序列 |
GACATCCAGATGACCCAATCTTCATCCTCCTTTTCTGTATCTCTAGGAGACAGAGTCACCATTACTTGCAAGGCAGGTGAGGACATATATAATCGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGAAATGCTCCTAGGCTCTTAATATCTGGTGCACCAATTTGGAAACTGGGGTTCCTTCAAGATTCAGTGGCAGTGGATCTGGAAAGGATTACACTCTCAGCATTACCAGTCTTCAGACTGAAGATGTTGCTACTTATTACTGTCAACAGTATTGGAGTACTCCGCTCSEQ ID NO.:1 |
鼠CTB003轻链可变区氨基酸序列在下文的表18中显示。
表18.鼠CTB003轻链可变区氨基酸序列 |
D I Q M T Q S S S S F S V S L G D R V TI T C K A G E D I Y N R L A W Y Q Q K PG N A P R L L I S G A T N L E T G V P SR F S G S G S G K D Y T L S L T S L Q TE D V A T Y Y C Q Q Y W S T P L SEQ ID NO.:2 |
鼠CTB003轻链可变区核酸和氨基酸序列在下文的表19中显示。
表19.鼠CTB003轻链可变区核酸和氨基酸序列 |
GACATCCAGATGACCCAATCTTCATCCTCCTTTTCTGTATCTCTAGGAGACAGAGTCACCD I Q M T Q S S S S F S V S L G D R V TATTACTTGCAAGGCAGGTGAGGACATATATAATCGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAI T C K A G E D I Y N R L A W Y Q Q K PGGAAATGCTCCTAGGCTCTTAATATCTGGTGCAACCAATTTGGAAACTGGGGTTCCTTCAG N A P R L L I S G A T N L E T G V P SAGATTCAGTGGCAGTGGATCTGGAAAGGATTACACTCTCAGCATTACCAGTCTTCAGACTR F S G S G S G K D Y T L S I T S L Q TGAAGATGTTGCTACTTATTACTGTCAACAGTATTGGAGTACTCCGCTCSEQ ID NO.:1E D V A T Y Y C Q Q Y W S T P L SEQ ID NO.:2 |
鼠的CTB003轻链CDR1核酸和氨基酸序列在下文的表20中显示。
表20.鼠CTB003轻链CDR1氨基酸序列 |
K A G E D I Y N R L A SEQ ID N0.:3 |
鼠的CTB003轻链CDR2核酸和氨基酸序列在下文的表21中显示。
表21.鼠CTB003轻链CDR2氨基酸序列 |
G A T N L E T SEQ ID NO.:4 |
鼠的CTB003轻链CDR3核酸和氨基酸序列在下文的表22中显示。
表22.鼠CTB003轻链CDR3氨基酸序列 |
Q Q Y W S T P L SEQ ID NO.:5 |
鼠CTB003重链可变区核酸序列在下文的表23中显示。
GAGGTGCATCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAGGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCGGCCTCTGGATTCGCTTTCAGTAGCTATGACATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCGGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCATACATTAGTGATGGTGGTGGTATCACCTACTATCCAGACACAATGAAGGGCCGACTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAATACCCTGTCCCTGCAAATGAGCAGTCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGACATATTACTATGGTGGTAGGACCCTTTGCT SEQ ID NO.:7 |
鼠CTB003重链可变区氨基酸序列在下文的表24中显示。
表24.鼠CTB003重链可变区氨基酸序列 |
E V H L V E S G G G L V R P G G S L K LS C A A S G F A F S S Y D M S W V R Q TP E K R L E W V A Y I S D G G G I T Y Y P D T M K G R L T I S R D N A K N T L SL Q M S S L K S E D T A M Y Y C A R H I T M V V G P F A SEQ ID NO.:8 |
鼠的CTB003重链可变区核酸和氨基酸序列在下文的表25中显示。
表25.鼠CTB003重链可变区核酸和氨基酸序列 |
GAGGTGCATCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAGGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCE V H L V E S G G G L V R P G G S L K LTCCTGTGCGGCCTCTGGATTCGCTTTCAGTAGCTATGACATGTCTTGGGTTCGCCAGACTS C A A S G F A F S S Y D M S W V R Q TCCGGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCATACATTAGTGATGGTGGTGGTATCACCTACTATP E K R L E W V A Y I S D G G G I T Y YCCAGACACAATGAAGGGCCGACTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAATACCCTGTCCP D T M K G R L T I S R D N A K N T L SCTGCAAATGAGCAGTCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGACATATTL Q M S S L K S E D T A M Y Y C A R H IACTATGGTGGTAGGACCCTTTGCTSEQ ID NO.:7T M V V G P F A SEQ ID NO.:8 |
鼠的CTB003重链CDR1氨基酸序列在下文的表26中显示。
表26.鼠CTB003重链CDR1氨基酸序列 |
S Y D M S SEQ ID NO.:9 |
鼠的CTB003重链CDR2氨基酸序列在下文的表27中显示。
表27.鼠CTB003重链CDR2氨基酸序列 |
Y I S D G G G I T Y Y P D T M K G SEQ ID NO.:10 |
鼠的CTB003重链CDR3氨基酸序列在下文的表28中显示。
表28.鼠CTB003重链CDR3氨基酸序列 |
H I T M V V G P F A SEQ ID NO.:11 |
人类嵌合CTB003轻链核酸序列在下文的表29中显示。
表29.人类嵌合CTB003轻链核酸序列 |
ATGAGGCTCCCTGCTCAGCTCCTGGGGCTGCTAATGCTCTGGGTCTCTGGATCCAGTGGTGACATCCAGATGACTCAGTCTTCATCCTCCTTTTCTGTATCTCTAGGAGACAGAGTCACCATTACTTGCAAGGCAAGTGAGGACATATATAATCGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGAAATGCTCCTAGGCTCTTAATATCTGGTGCAACCAGTTTGGAAACTGGGGTTCCTTCAAGATTCAGTGGCAGTGGATCTGGAAAGGATTACACTCTCAGCATTACCAGTCTTCAGACTGAAGATGTTGCTACTTATTACTGTCAACAGTATTGGAGTACTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGGGCTGTGGCTGCACCATCTGTCGATATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTACCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTTACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG SEQ ID NO.:12 |
人类嵌合CTB003轻链氨基酸序列在下文的表30中显示。
表30.人类嵌合CTB003轻链氨基酸序列 |
M R L P A Q L L G L L M L W V S G S S GD I Q M T Q S S S S F S V S L G D R V TI T C K A S E D I Y N R L A W Y Q Q K PG N A P R L L I S G A T S L E T G V P SR F S G S G S G K D Y T L S I T S L Q TE D V A T Y Y C Q Q Y W S T P L T F G AG T K L E L K R A V A A P S V D I F P PS D E Q L K S G T A S V V C L L N N F YP R E A K V Q W K V D N A L Q S G N S QE S V T E Q D S K D S T Y S L S S T L TL S K A D Y E K H K V Y A C E V T H Q GL S S P V T K S F N R G E C * SEQ ID NO.:13 |
人类嵌合CTB003轻链核酸和氨基酸序列在下文的表31中显示。
表31.人类嵌合CTB003轻链核酸和氨基酸序列 |
ATGAGGCTCCCTGCTCAGCTCCTGGGGCTGCTAATGCTCTGGGTCTCTGGATCCAGTGGTM R L P A Q L L G L L M L W V S G S S GGACATCCAGATGACTCAGTCTTCATCCTCCTTTTCTGTATCTCTAGGAGACAGAGTCACCD I Q M T Q S S S S F S V S L G D R V TATTACTTGCAAGGCAAGTGAGGACATATATAATCGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAI T C K A S E D I Y N R L A W Y Q Q K PGGAAATGCTCCTAGGCTCTTAATATCTGGTGCAACCAGTTTGGAAACTGGGGTTCCTTCAG N A P R L L I S G A T S L E T G V P SAGATTCAGTGGCAGTGGATCTGGAAAGGATTACACTCTCAGCATTACCAGTCTTCAGACTR F S G S G S G K D Y T L S I T S L Q TGAAGATGTTGCTACTTATTACTGTCAACAGTATTGGAGTACTCCGCTCACGTTCGGTGCTE D V A T Y Y C Q Q Y W S T P L T F G AGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGGGCTGTGGCTGCACCATCTGTCGATATCTTCCCGCCAG T K L E L K R A V A A P S V D I F P P |
TCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTACS D E Q L K S G T A S V V C L L N N F YCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGP R E A K V Q W K V D N A L Q S G N S QGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGE S V T E Q D S K D S T Y S L S S T L TCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTTACCCATCAGGGCL S K A D Y E K H K V Y A C E V T H Q GCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG SEQ ID NO.:12L S S P V T K S F N R G E C * SEQ ID NO.:13 |
人类嵌合CTB003重链核酸序列在下文的表32中显示。
表32.人类嵌合CTB003重链核酸序列 |
ATGGGGANNTTGGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGTTATATTAGAAGGTGTCCAGTGTGAGGTGCATCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAGGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCGGCCTCTGGATTCGCTTTCAGTAGCTATGACATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCGGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCATACATTAGTGATGGTGGTGGTATCACCTACTATCCAGACACAATGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAATACCCTGTCCCTGCAAATGAGCAGTCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGACATATTACTATGGTGGTAGGACCCTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCATGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA SEQ ID NO.:14 |
人类嵌合CTB003重链氨基酸序列在下文的表33中显示。
表33.人类嵌合CTB003重链氨基酸序列 |
M G X L G L S W V F L V V I L E G V Q CE V H L V E S G G G L V R P G G S L K LS C A A S G F A F S S Y D M S W V R Q TP E K R L E W V A Y I S D G G G I T Y YP D T M K G R F T I S R D N A K N T L S |
L Q M S S L K S E D T A M Y Y C A R H IT M V V G P F A Y W G Q G T L V T V S AA S T K G P S V F P L A P C S R S T S GG T A A L G C L V K D Y F P E P V T V SW N S G A L T S G V H T F P A V L Q S SG L Y S L S S V V T V P S S S L G T Q TY I C N V N H K P S N T K V D K R V E PK S C D K T H T C P P C P A P E L L G GP S V F L F P P K P K D T L M I S R T PE V T C V V V D V S H E D P E V K F N WY V D G V E V H N A K T K P R E E Q Y NS T Y R V V S V L T V L H Q D W L N G KE Y K C K V S N K G L P A P I E K T I SK A K G Q P R E P Q V Y T L P P S R E EM T K N Q V S L T C L V K G F Y P S D IA V E W E S N G Q P E N N Y K T T P P VL D S D G S F F L Y S K L T M D K S R WQ Q G N V F S C S V M H E A L H N H Y TQ K S L S L S P G K * SEQ ID NO.:15 |
人类嵌合CTB003重链核酸和氨基酸序列在下文的表34中显示。
表34.人类嵌合CTB003重链核酸和氨基酸序列 |
ATGGGGANNTTGGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGTTATATTAGAAGGTGTCCAGTGTM G X L G L S W V F L V V I L E G V Q CGAGGTGCATCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAGGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCE V H L V E S G G G L V R P G G S L K LTCCTGTGCGGCCTCTGGATTCGCTTTCAGTAGCTATGACATGTCTTGGGTTCGCCAGACTS C A A S G F A F S S Y D M S W V R Q TCCGGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCATACATTAGTGATGGTGGTGGTATCACCTACTATP E K R L E W V A Y I S D G G G I T Y YCCAGACACAATGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAATACCCTGTCCP D T M K G R F T I S R D N A K N T L SCTGCAAATGAGCAGTCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGACATATTL Q M S S L K S E D T A M Y Y C A R H IACTATGGTGGTAGGACCCTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAT M V V G P F A Y W G Q G T L V T V S AGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCTGGGA S T K G P S V F P L A P C S R S T S GGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGG T A A L G C L V K D Y F P E P V T V STGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAW N S G A L T S G V H T F P A V L Q S SGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCG L Y S L S S V V T V P S S S L G T Q TTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCC |
Y I C N V N H K P S N T K V D K R V E PAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGAK S C D K T H T C P P C P A P E L L G GCCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTP S V F L F P P K P K D T L M I S R T PGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGE V T C V V V D V S H E D P E V K F N WTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACY V D G V E V H N A K T K P R E E Q Y NAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGS T Y R V V S V L T V L H Q D W L N G KGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCE Y K C K V S N K G L P A P I E K T I SAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGK A K G Q P R E P Q V Y T L P P S R E EATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCM T K N Q V S L T C L V K G F Y P S D IGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGA V E W E S N G Q P E N N Y K T T P P VCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCATGGACAAGAGCAGGTGGL D S D G S F F L Y S K L T M D K S R WCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGQ Q G N V F S C S V M H E A L H N H Y TCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA SEQ ID NO.:14Q K S L S L S P G K * SEQ ID NO.:15 |
实施例18.CTB006相关的序列
以下提供了CTB006相关的序列。
鼠CTB006轻链可变区核酸序列在下文的表35中显示。
表35.鼠CTB006轻链可变区核酸序列 |
1 GACATCGTCATGACCCAATCTCACAAATTCATGTCCACTTCAGTAGGAGACAGGGTCAGC61 ATCACCTGCAAGGCCAGTCAGGATGTGAGTACTGCTGTAGCCTGGTATCAACAAAAACCA121 GGGCAATCTCCTAGACTACTGATTTACTGGGCATCCACCCGGCACACTGGAGTCCCTGAT181 CGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTATACTCTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCT241 GAAGACCAGGCACTTTATTACTGTCAGCAACATTATCGCACTCCGTGG SEQ ID NO.:16 |
鼠CTB006轻链可变区氨基酸序列在下文的表36中显示。
1 D I V M T Q S H K F M S T S V G D R V S21 I T C K A S Q D V S T A V A W Y Q Q K P41 G Q S P R L L I Y W A S T R H T G V P D61 R F T G S G S G T D Y T L T I S S V Q A81 E D Q A L Y Y C Q Q H Y R T P WSEQ ID NO:17 |
鼠CTB006轻链可变区核酸和氨基酸序列在下文的表37中显示。
表37.鼠CTB006轻链可变区核酸和氨基酸序列 |
1 GACATCGTCATGACCCAATCTCACAAATTCATGTCCACTTCAGTAGGAGACAGGGTCAGC1 D I V M T Q S H K F M S T S V G D R V S61 ATCACCTGCAAGGCCAGTCAGGATGTGAGTACTGCTGTAGCCTGGTATCAACAAAAACCA21 I T C K A S Q D V S T A V A W Y Q Q K P121 GGGCAATCTCCTAGACTACTGATTTACTGGGCATCCACCCGGCACACTGGAGTCCCTGAT41 G Q S P R L L I Y W A S T R H T G V P D181 CGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTATACTCTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCT61 R F T G S G S G T D Y T L T I S S V Q A241 GAAGACCAGGCACTTTATTACTGTCAGCAACATTATCGCACTCCGTGG SEQ ID NO.:1681 E D Q A L Y Y C Q Q H Y R T P W SEQ ID NO.:17 |
鼠CTB006轻链CDR1氨基酸序列在下文的表38中显示。
表38.鼠CTB006轻链CDR1氨基酸序列 |
K A S Q D V S T A V A SEQ ID NO.:18 |
鼠CTB006轻链CDR2氨基酸序列在下文的表39中显示。
表39.鼠CTB006轻链CDR2氨基酸序列 |
W A S T R H T SEQ ID NO.:19 |
鼠CTB006轻链CDR3氨基酸序列在下文的表40中显示。
表40.鼠CTB006轻链CDR3氨基酸序列 |
Q Q H Y R T P W SEQ ID NO.:20 |
鼠CTB006重链可变区核酸序列在下文的表41中显示。
表41.鼠CTB006重链可变区核酸序列 |
1 CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAGGATG61 TCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACAAGCTACTTTATACATTGGGTGAAGCAGAGG121 CCTGGACAGGGACTTGAGTGGATTGGATGGATTTATCCTGGAAATGTTAATACTAAGTAC181 AGTGAGAAGTTCAAGGGTAAGGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTAC241 ATGCAGTTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGAGGGGAG301 GCTGGGTACTTTGAC SEQ ID NO.:21 |
鼠CTB006重链可变区氨基酸序列在下文的表42中显示。
1 Q V Q L Q Q P G P E L V K P G A S V R M21 S C K A S G Y T F T S Y F I H W V K Q R41 P G Q G L E W I G W I Y P G N V N T K Y61 S E K F K G K A T L T A D K S S S T A Y81 M Q F S S L T S E D S A V Y F C A R G E101 A G Y F D SEQ ID NO.:22 |
鼠的CTB006重链可变区核酸和氨基酸序列在下文的表43中显示。
表43.鼠CTB006重链可变区核酸和氨基酸序列 |
1 CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAGGATG1 Q V Q L Q Q P G P E L V K P G A S V R M61 TCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACAAGCTACTTTATACATTGGGTGAAGCAGAGG21 S C K A S G Y T F T S Y F I H W V K Q R121 CCTGGACAGGGACTTGAGTGGATTGGATGGATTTATCCTGGAAATGTTAATACTAAGTAC41 P G Q G L E W I G W I Y P G N V N T K Y181 AGTGAGAAGTTCAAGGGTAAGGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTAC61 S E K F K G K A T L T A D K S S S T A Y241 ATGCAGTTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGAGGGGAG81 M Q F S S L T S E D S A V Y F C A R G E301 GCTGGGTACTTTGAC SEQ ID NO.:21101 A G Y F D SEQ ID NO.:22 |
鼠CTB006重链CDR1氨基酸序列在下文的表44中显示。
表44.鼠CTB006重链CDR1氨基酸序列 |
S Y F I H SEQ ID NO.:23 |
鼠CTB006重链CDR2氨基酸序列在下文的表45中显示。
表45.鼠CTB006重链CDR2氨基酸序列 |
W I Y P G N V N T K Y S E K F K G SEQ ID NO.:24 |
鼠CTB006重链CDR3氨基酸序列在下文的表46中显示。
表46.鼠CTB006重链CDR3氨基酸序列 |
G E A G Y F D SEQ ID NO.:25 |
人类嵌合CTB006轻链核酸序列在下文的表47中显示。
1 ATGAGGCTCCCTGCTCAGCTCCTGGGGCTGCTAATGCTCTGGGTCTCTGGATCCAGTGGT61 GACATCGTCATGACCCAATCTCACAAATTCATGTCCACTTCAGTAGGAGACAGGGTCAGC121 ATCACCTGCAAGGCCAGTCAGGATGTGAGTACTGCTGTAGCCTGGTATCAACAAAAACCA181 GGGCAATCTCCTAGACTACTGATTTACTGGGCATCCACCCGGCACACTGGAGTCCCTGAT241 CGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTATACTCTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCT301 GAAGACCAGGCACTTTATTACTGTCAGCAACATTATCGCACTCCGTGGACGTTCGGTGGA361 GGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGGCTGTGGCTGCACCATCTGTCGATATCTTCCCGCCA421 TCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTAC481 CCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAG541 GAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACG601 CTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTTACCCATCAGGGC661 CTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG SEQ ID NO.:26 |
人类嵌合CTB006轻链氨基酸序列在下文的表48中显示。
表48.人类嵌合CTB006轻链氨基酸序列 |
1 M R L P A Q L L G L L M L W V S G S S G21 D I V M T Q S H K F M S T S V G D R V S41 I T C K A S Q D V S T A V A W Y Q Q K P61 G Q S P R L L I Y W A S T R H T G V P D81 R F T G S G S G T D Y T L T I S S V Q A101 E D Q A L Y Y C Q Q H Y R T P W T F G G121 G T K L E I K R A V A A P S V D I F P P141 S D E Q L K S G T A S V V C L L N N F Y161 P R E A K V Q W K V D N A L Q S G N S Q181 E S V T E Q D S K D S T Y S L S S T L T201 L S K A D Y E K H K V Y A C E V T H Q G221 L S S P V T K S F N R G E C * SEQ ID NO.:27 |
人类嵌合CTB006轻链核酸和氨基酸序列在下文的表49中显示。
表49.人类嵌合CTB006轻链核酸和氨基酸序列 |
1 ATGAGGCTCCCTGCTCAGCTCCTGGGGCTGCTAATGCTCTGGGTCTCTGGATCCAGTGGT1 M R L P A Q L L G L L M L W V S G S S G61 GACATCGTCATGACCCAATCTCACAAATTCATGTCCACTTCAGTAGGAGACAGGGTCAGC21 D I V M T Q S H K F M S T S V G D R V S121 ATCACCTGCAAGGCCAGTCAGGATGTGAGTACTGCTGTAGCCTGGTATCAACAAAAACCA41 I T C K A S Q D V S T A V A W Y Q Q K P181 GGGCAATCTCCTAGACTACTGATTTACTGGGCATCCACCCGGCACACTGGAGTCCCTGAT61 G Q S P R L L I Y W A S T R H T G V P D241 CGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTATACTCTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCT81 R F T G S G S G T D Y T L T I S S V Q A301 GAAGACCAGGCACTTTATTACTGTCAGCAACATTATCGCACTCCGTGGACGTTCGGTGGA101 E D Q A L Y Y C Q Q H Y R T P W T F G G361 GGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGGCTGTGGCTGCACCATCTGTCGATATCTTCCCGCCA121 G T K L E I K R A V A A P S V D I F P P421 TCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTAC |
141 S D E Q L K S G T A S V V C L L N N F Y481 CCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAG161 P R E A K V Q W K V D N A L Q S G N S Q541 GAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACG181 E S V T E Q D S K D S T Y S L S S T L T601 CTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTTACCCATCAGGGC201 L S K A D Y E K H K V Y A C E V T H Q G661 CTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG SEQ ID NO.:26221 L S S P V T K S F N R G E C * SEQ ID NO.:27 |
人类嵌合CTB006重链核酸序列在下文的表50中显示。
表50.人类嵌合CTB006重链核酸序列 |
1 ATGGAGTTGGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGTTATATTAGAAGGTGTCCAGTGTGAG61 GTTCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAGGATGTCC121 TGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACAAGCTACTTTATACATTGGGTGAAGCAGAGGCCT181 GGACAGGGACTTGAGTGGATTGGATGGATTTATCCTGGAAATGTTAATACTAAGTACAGT241 GAGAAGTTCAAGGGTAAGGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATG301 CAGTTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGAGGGGAGGCT361 GGGTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGCTAGCACCAAG421 GGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCC481 CTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGC541 GCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCC601 CTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAAC661 GTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGAC721 AAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTC781 CTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGC841 GTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGC901 GTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGT961 GTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGC1021 AAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGG1081 CAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAAC1141 CAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGG1201 GAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGAC1261 GGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCATGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAAC1321 GTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTC1381 TCCCTGTCTCCGGGTAAATGA SEQ ID NO.:28 |
人类嵌合CTB006重链氨基酸序列在下文的表51中显示。
表51.人类嵌合CTB006重链氨基酸序列 |
1 M E L G L S W V F L V V I L E G V Q C E21 V Q L Q Q S G P E L V K P G A S V R M S41 C K A S G Y T F T S Y F I H W V K Q R P61 G Q G L E W I G W I Y P G N V N T K Y S81 E K F K G K A T L T A D K S S S T A Y M101 Q F S S L T S E D S A V Y F C A R G E A121 G Y F D Y W G Q G T T L T V S S A S T K |
141 G P S V F P L A P C S R S T S G G T A A161 L G C L V K D Y F P E P V T V S W N S G181 A L T S G V H T F P A V L Q S S G L Y S201 L S S V V T V P S S S L G T Q T Y I C N221 V N H K P S N T K V D K R V E P K S C D241 K T H T C P P C P A P E L L G G P S V F261 L F P P K P K D T L M I S R T P E V T C281 V V V D V S H E D P E V K F N W Y V D G301 V E V H N A K T K P R E E Q Y N S T Y R321 V V S V L T V L H Q D W L N G K E Y K C341 K V S N K G L P A P I E K T I S K A K G361 Q P R E P Q V Y T L P P S R E E M T K N381 Q V S L T C L V K G F Y P S D I A V E W401 E S N G Q P E N N Y K T T P P V L D S D421 G S F F L Y S K L T M D K S R W Q Q G N441 V F S C S V M H E A L H N H Y T Q K S L461 S L S P G K * SEQ ID NO.:29 |
人类嵌合CTB006重链核酸和氨基酸序列在下文的表52中显示。
1 ATGGAGTTGGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGTTATATTAGAAGGTGTCCAGTGTGAG1 M E L G L S W V F L V V I L E G V Q C E61 GTTCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAGGATGTCC21 V Q L Q Q S G P E L V K P G A S V R M S121 TGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACAAGCTACTTTATACATTGGGTGAAGCAGAGGCCT41 C K A S G Y T F T S Y F I H W V K Q R P181 GGACAGGGACTTGAGTGGATTGGATGGATTTATCCTGGAAATGTTAATACTAAGTACAGT61 G Q G L E W I G W I Y P G N V N T K Y S241 GAGAAGTTCAAGGGTAAGGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATG81 E K F K G K A T L T A D K S S S T A Y M301 CAGTTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGAGGGGAGGCT101 Q F S S L T S E D S A V Y F C A R G E A361 GGGTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGCTAGCACCAAG121 G Y F D Y W G Q G T T L T V S S A S T K421 GGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCC141 G P S V F P L A P C S R S T S G G T A A481 CTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGC161 L G C L V K D Y F P E P V T V S W N S G541 GCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCC181 A L T S G V H T F P A V L Q S S G L Y S601 CTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAAC201 L S S V V T V P S S S L G T Q T Y I C N661 GTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGAC221 V N H K P S N T K V D K R V E P K S C D721 AAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTC241 K T H T C P P C P A P E L L G G P S V F781 CTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGC261 L F P P K P K D T L M I S R T P E V T C841 GTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGC281 V V V D V S H E D P E V K F N W Y V D G901 GTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGT301 V E V H N A K T K P R E E Q Y N S T Y R961 GTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGC321 V V S V L T V L H Q D W L N G K E Y K C1021 AAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGG341 K V S N K G L P A P I E K T I S K A K G1081 CAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAAC361 Q P R E P Q V Y T L P P S R E E M T K N1141 CAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGG381 Q V S L T C L V K G F Y P S D I A V E W1201 GAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGAC401 E S N G Q P E N N Y K T T P P V L D S D1261 GGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCATGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAAC421 G S F F L Y S K L T M D K S R W Q Q G N1321 GTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTC441 V F S C S V M H E A L H N H Y T Q K S L |
1381 TCCCTGTCTCCGGGTAAATGA SEQ ID NO.:28461 S L S P G K * SEQ ID NO.:29 |
实施例19.CTB007相关的序列
以下提供了CTB007相关的序列。
鼠CTB007轻链可变区核酸序列在下文的表53中显示。
表53.鼠CTB007轻链可变区核酸序列 |
1 GACATCCAGATGACCCAATCTCCAGCCTCCCTATCTGTATCTGTGGGAGAAACTGTCACC61 ATCACATGTCGAGCAAGTGAGAATATTTACAGTAATTTAGAATGGTATCAGCAGAAACAG121 GGAAAATCTCCTCAGCTCCTGGTCTATGCTGCAACAAACTTAGCAGATGGTGTGCCATCA181 AGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACACAGTATTCCCTCAAGATCAACAGCCTGCAGTCT241 GAAGATTTTGGGAGTTATTACTGTCAACATTTTTGGGGTACTTGG SEQ ID NO.:30 |
鼠CTB007轻链可变区氨基酸序列在下文的表54中显示。
表54.鼠CTB007轻链可变区氨基酸序列 |
1 D I Q M T Q S P A S L S V S V G E T V T21 I T C R A S E N I Y S N L E W Y Q Q K Q41 G K S P Q L L V Y A A T N L A D G V P S61 R F S G S G S G T Q Y S L K I N S L Q S81 E D F G S Y Y C Q H F W G T W SEQ ID NO.:31 |
鼠CTB007轻链可变区核酸和氨基酸序列在下文的表55中显示。
表55.鼠CTB007轻链可变区核酸和氨基酸序列 |
1 GACATCCAGATGACCCAATCTCCAGCCTCCCTATCTGTATCTGTGGGAGAAACTGTCACC1 D I Q M T Q S P A S L S V S V G E T V T61 ATCACATGTCGAGCAAGTGAGAATATTTACAGTAATTTAGAATGGTATCAGCAGAAACAG21 I T C R A S E N I Y S N L E W Y Q Q K Q121 GGAAAATCTCCTCAGCTCCTGGTCTATGCTGCAACAAACTTAGCAGATGGTGTGCCATCA41 G K S P Q L L V Y A A T N L A D G V P S181 AGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACACAGTATTCCCTCAAGATCAACAGCCTGCAGTCT61 R F S G S G S G T Q Y S L K I N S L Q S241 GAAGATTTTGGGAGTTATTACTGTCAACATTTTTGGGGTACTTGG SEQ ID NO.:3081 E D F G S Y Y C Q H F W G T W SEQ ID NO.:31 |
鼠CTB007轻链CDR1氨基酸序列在下文的表56中显示。
表56.鼠CTB007轻链CDR1氨基酸序列 |
R A S E N I Y S N L E SEQ ID NO.:32 |
鼠CTB007轻链CDR2氨基酸序列在下文的表57中显示。
表57.鼠CTB007轻链CDR2氨基酸序列 |
A A T N L A D SEQ ID NO.:33 |
鼠CTB007轻链CDR3氨基酸序列在下文的表58中显示。
表58.鼠CTB007轻链CDR3氨基酸序列 |
Q H F W G T W SEQ ID NO.:34 |
鼠CTB007重链可变区核酸序列在下文的表59中显示。
表59.鼠CTB007重链可变区核酸序列 |
1 GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGAGCTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTG61 TCCTGCACAGCTTCGGGCTTCAACATTAAAGACACCTATATGCACTGGGTGAAGCAGAGG121 CCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGCGAATGGTAATACTAAATAT181 GACCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACTATAACAGCAGACACATCCTCCAACACAGCCTAC241 CTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCCTATTACTAC301 GTTAGTAACGCCTGGTTTACT SEQ ID NO.:35 |
鼠CTB007重链可变区氨基酸序列在下文的表60中显示。
表60.鼠CTB007重链可变区氨基酸序列 |
1 E V Q L Q Q S G A E L V K P G A S V K L21 S C T A S G F N I K D T Y M H W V K Q R41 P E Q G L E W I G R I D P A N G N T K Y61 D P K F Q G K A T I T A D T S S N T A Y81 L Q L S S L T S E D T A V Y Y C A Y Y Y101 V S N A W F T SEQ ID NO.:36 |
鼠的CTB007重链可变区核酸和氨基酸序列在下文的表61中显示。
表61.鼠CTB007重链可变区核酸和氨基酸序列 |
1 GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGAGCTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTG1 E V Q L Q Q S G A E L V K P G A S V K L61 TCCTGCACAGCTTCGGGCTTCAACATTAAAGACACCTATATGCACTGGGTGAAGCAGAGG21 S C T A S G F N I K D T Y M H W V K Q R121 CCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGCGAATGGTAATACTAAATAT41 P E Q G L E W I G R I D P A N G N T K Y181 GACCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACTATAACAGCAGACACATCCTCCAACACAGCCTAC61 D P K F Q G K A T I T A D T S S N T A Y241 CTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCCTATTACTAC81 L Q L S S L T S E D T A V Y Y C A Y Y Y301 GTTAGTAACGCCTGGTTTACT SEQ ID NO.:35101 V S N A W F T SEQ ID NO.:36 |
鼠CTB007重链CDR1氨基酸序列在下文的表62中显示。
表62.鼠CTB007重链CDR1氨基酸序列 |
D T Y M H SEQ ID NO.:37 |
鼠CTB007重链CDR2氨基酸序列在下文的表63中显示。
表63.鼠CTB007重链CDR2氨基酸序列 |
R I D P A N G N T K Y D P K F Q G |
鼠CTB007重链CDR3氨基酸序列在下文的表64中显示。
表64.鼠CTB007重链CDR3氨基酸序列 |
Y Y V S N A W F T SEQ ID NO.:39 |
人类嵌合CTB007轻链核酸序列在下文的表65中显示。
表65.人类嵌合CTB007轻链核酸序列 |
1 ATGAGGCTCCCTGCTCAGCTCCTGGGGCTGCTAATGCTCTGGGTCTCTGGATCCAGTGGT61 GACATCCAGATGACCCAATCTCCAGCCTCCCTATCTGTATCTGTGGGAGAAACTGTCACC121 ATCACATGTCGAGCAAGTGAGAATATTTACAGTAATTTAGAATGGTATCAGCAGAAACAG181 GGAAAATCTCCTCAGCTCCTGGTCTATGCTGCAACAAACTTAGCAGATGGTGTGCCATCA241 AGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACACAGTATTCCCTCAAGATCAACAGCCTGCAGTCT301 GAAGATTTTGGGAGTTATTACTGTCAACATTTTTGGGGTACTTGGACGTTCGGTGGAGGC361 ACCAAGCTGGAAATCAAACGGGCTGTGGCTGCACCATCTGTCGATATCTTCCCGCCATCT421 GATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTACCCC481 AGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAG541 AGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTG601 AGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTTACCCATCAGGGCCTG661 AGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAGA SEQ ID NO.:40 |
人类嵌合CTB007轻链氨基酸序列在下文的表66中显示。
表66.人类嵌合CTB007轻链氨基酸序列 |
1 M R L P A Q L L G L L M L W V S G S S G21 D I Q M T Q S P A S L S V S V G E T V T41 I T C R A S E N I Y S N L E W Y Q Q K Q61 G K S P Q L L V Y A A T N L A D G V P S81 R F S G S G S G T Q Y S L K I N S L Q S101 E D F G S Y Y C Q H F W G T W T F G G G121 T K L E I K R A V A A P S V D I F P P S141 D E Q L K S G T A S V V C L L N N F Y P161 R E A K V Q W K V D N A L Q S G N S Q E181 S V T E Q D S K D S T Y S L S S T L T L201 S K A D Y E K H K V Y A C E V T H Q G L221 S S P V T K S F N R G E C * SEQ ID NO.:41 |
人类嵌合CTB007轻链核酸和氨基酸序列在下文的表67中显示。
表67.人类嵌合CTB007轻链核酸和氨基酸序列 |
1 ATGAGGCTCCCTGCTCAGCTCCTGGGGCTGCTAATGCTCTGGGTCTCTGGATCCAGTGGT1 M R L P A Q L L G L L M L W V S G S S G61 GACATCCAGATGACCCAATCTCCAGCCTCCCTATCTGTATCTGTGGGAGAAACTGTCACC21 D I Q M T Q S P A S L S V S V G E T V T121 ATCACATGTCGAGCAAGTGAGAATATTTACAGTAATTTAGAATGGTATCAGCAGAAACAG41 I T C R A S E N I Y S N L E W Y Q Q K Q181 GGAAAATCTCCTCAGCTCCTGGTCTATGCTGCAACAAACTTAGCAGATGGTGTGCCATCA |
61 G K S P Q L L V Y A A T N L A D G V P S241 AGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACACAGTATTCCCTCAAGATCAACAGCCTGCAGTCT81 R F S G S G S G T Q Y S L K I N S L Q S301 GAAGATTTTGGGAGTTATTACTGTCAACATTTTTGGGGTACTTGGACGTTCGGTGGAGGC101 E D F G S Y Y C Q H F W G T W T F G G G361 ACCAAGCTGGAAATCAAACGGGCTGTGGCTGCACCATCTGTCGATATCTTCCCGCCATCT121 T K L E I K R A V A A P S V D I F P P S421 GATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTACCCC141 D E Q L K S G T A S V V C L L N N F Y P481 AGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAG161 R E A K V Q W K V D N A L Q S G N S Q E541 AGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTG181 S V T E Q D S K D S T Y S L S S T L T L601 AGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTTACCCATCAGGGCCTG201 S K A D Y E K H K V Y A C E V T H Q G L661 AGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAGA SEQ ID NO.:40221 S S P V T K S F N R G E C * SEQ ID NO.:41 |
人类嵌合CTB007重链核酸序列在下文的表68中显示。
表68.人类嵌合CTB007重链核酸序列 |
1 ATGGAGTTGGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGTTATATTAGAAGGTGTCCAGTGTGAG61 GTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGAGCTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCC121 TGCACAGCTTCGGGCTTCAACATTAAAGACACCTATATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCT181 GAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGCGAATGGTAATACTAAATATGAC241 CCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACTATAACAGCAGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTG301 CAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCCTATTACTACGTT361 AGTAACGCCTGGTTTACTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCTAGC421 ACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCTGGGGGCACA481 GCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAAC541 TCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTC601 TACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATC661 TGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCT721 TGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCA781 GTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTC841 ACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTG901 GACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACG961 TACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTAC1021 AAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCC1081 AAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACC1141 AAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTG1201 GAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGAC1261 TCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCATGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAG1321 GGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAG1381 AGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA SEQ ID NO.:42 |
人类嵌合CTB007重链氨基酸序列在下文的表69中显示。
表69.人类嵌合CTB007重链氨基酸序列 |
1 M E L G L S W V F L V V I L E G V Q C E21 V Q L Q Q S G A E L V K P G A S V K L S41 C T A S G F N I K D T Y M H W V K Q R P61 E Q G L E W I G R I D P A N G N T K Y D81 P K F Q G K A T I T A D T S S N T A Y L101 Q L S S L T S E D T A V Y Y C A Y Y Y V121 S N A W F T Y W G Q G T L V T V S A A S141 T K G P S V F P L A P C S R S T S G G T161 A A L G C L V K D Y F P E P V T V S W N181 S G A L T S G V H T F P A V L Q S S G L201 Y S L S S V V T V P S S S L G T Q T Y I221 C N V N H K P S N T K V D K R V E P K S241 C D K T H T C P P C P A P E L L G G P S261 V F L F P P K P K D T L M I S R T P E V281 T C V V V D V S H E D P E V K F N W Y V301 D G V E V H N A K T K P R E E Q Y N S T321 Y R V V S V L T V L H Q D W L N G K E Y341 K C K V S N K G L P A P I E K T I S K A361 K G Q P R E P Q V Y T L P P S R E E M T381 K N Q V S L T C L V K G F Y P S D I A V401 E W E S N G Q P E N N Y K T T P P V L D421 S D G S F F L Y S K L T M D K S R W Q Q441 G N V F S C S V M H E A L H N H Y T Q K461 S L S L S P G K * SEQ ID NO.:43 |
人类嵌合CTB007重链核酸和氨基酸序列在下文的表70中显示。
1 ATGGAGTTGGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGTTATATTAGAAGGTGTCCAGTGTGAG1 M E L G L S W V F L V V I L E G V Q C E61 GTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGAGCTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCC21 V Q L Q Q S G A E L V K P G A S V K L S121 TGCACAGCTTCGGGCTTCAACATTAAAGACACCTATATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCT41 C T A S G F N I K D T Y M H W V K Q R P181 GAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGCGAATGGTAATACTAAATATGAC61 E Q G L E W I G R I D P A N G N T K Y D241 CCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACTATAACAGCAGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTG81 P K F Q G K A T I T A D T S S N T A Y L301 CAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCCTATTACTACGTT101 Q L S S L T S E D T A V Y Y C A Y Y Y V361 AGTAACGCCTGGTTTACTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCTAGC121 S N A W F T Y W G Q G T L V T V S A A S421 ACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCTGGGGGCACA141 T K G P S V F P L A P C S R S T S G G T481 GCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAAC161 A A L G C L V K D Y F P E P V T V S W N541 TCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTC181 S G A L T S G V H T F P A V L Q S S G L601 TACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATC201 Y S L S S V V T V P S S S L G T Q T Y I661 TGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCT221 C N V N H K P S N T K V D K R V E P K S721 TGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCA241 C D K T H T C P P C P A P E L L G G P S781 GTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTC261 V F L F P P K P K D T L M I S R T P E V841 ACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTG281 T C V V V D V S H E D P E V K F N W Y V901 GACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACG301 D G V E V H N A K T K P R E E Q Y N S T961 TACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTAC321 Y R V V S V L T V L H Q D W L N G K E Y1021 AAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCC341 K C K V S N K G L P A P I E K T I S K A1081 AAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACC361 K G Q P R E P Q V Y T L P P S R E E M T1141 AAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTG381 K N Q V S L T C L V K G F Y P S D I A V1201 GAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGAC401 E W E S N G Q P E N N Y K T T P P V L D1261 TCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCATGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAG421 S D G S F F L Y S K L T M D K S R W Q Q1321 GGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAG441 G N V F S C S V M H E A L H N H Y T Q K |
1381 AGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA SEQ ID NO.:42461 S L S L S P G K * SEQ ID NO.:43 |
实施例20.CTB003和hCTB003识别的表位的分析
要理解的是,对于本发明的TRAIL受体结合剂(例如CTB003和hCTB003)识别的共同的表位,可以进一步分析其氨基酸序列VXDCTPWSDIECVHKE(SEQ ID NO:44)的亚区(片段)或同源物,上述序列中,X如本文规定的是K或G,当其被本发明的TRAIL受体结合剂结合时可以在体内或体外系统的表达TRAIL-R1和/或TRAIL-R2受体多肽的细胞中诱导细胞(例如癌细胞)凋亡。
通过本领域已知的方法制备选择候选肽(select candidate peptides),它们是氨基酸序列VXDCTPWSDIECVHKE(SEQ ID NO:44)的片段或同源物。在如下所述的竞争性ELISA中测试这些候选物肽抑制TRAIL受体结合剂结合TRAIL受体(例如TRAIL-R1和TRAIL-R2)的能力。
竞争性抑制ELISA
ELISA平板用含1μg/ml TRAIL-R1或TRAIL-R2-Fc融合蛋白的PBS在4℃包被过夜。用PBS洗涤三次之后,用3%BSA PBS在室温下封闭平板1小时。将1μg/ml的CTB003或hCTB003(TRAIL受体结合剂)分别与各种浓度的候选物肽一起添加,在37℃经过1小时。通过用PBS洗涤三次来除去未结合的TRAIL受体结合剂,然后在37℃添加HRP缀合的山羊抗小鼠IgG1,经过30分钟。用PBS洗涤三次之后,添加TMB底物缓冲液,经过10分钟,然后通过添加2N H2SO4终止反应。在ELISA酶标仪中使用450nm/650nm的双波长记录光密度的值。以不存在候选肽的情况下的OD值作为CTB003(或hCTB003;TRAIL受体结合剂))对TRAIL-R1或TRAIL-R2的最大结合。各种浓度的候选肽对CTB003与TRAIL-R2的结合的竞争性抑制计算为相对最大结合的百分比。
结果和解释:
如果候选肽以浓度依赖性方式抑制TRAIL受体结合剂与TRAIL-R1和TRAIL受体结合剂与TRAIL-R2两者的结合,则该候选肽代表了TRAIL受体结合剂(例如CTB003或hCTB003)所共同识别的区域。此外,可以将候选序列作为靶标来产生抗性抗体,以诱导表达TRAIL-R1和/或TRAIL-R2的癌细胞的凋亡。进一步的,可以在本发明的体外和体内模型中测试该候选肽来确定所述候选肽是否能够抑制TRAIL受体结合剂介导的细胞生长(例如肿瘤生长)抑制。
实施例21.CTB003对差异表达TRAIL-R1和TRAIL-R2的肿瘤细胞的CTB003的结合和凋亡诱导活性
肿瘤细胞可能以不同的水平表达细胞表面TRAIL-R1和TRAIL-R2,因而,针对TRAIL-R1或TRAIL-R2的单特异性抗体单独施用时,可能无法结合所有的肿瘤细胞并诱导其凋亡。为了确定CTB003是否具有比单特异性TRAIL-R1或TRAIL-R2抗体更广泛的结合和凋亡诱导活性,在两个代表性的细胞系:人类T白血病细胞和人类B淋巴瘤细胞中进行了研究。人类T白血病细胞(Jurkat)仅表达TRAIL-R2而不表达TRAIL-R1。人类B淋巴瘤细胞(Ramos)表达高水平的TRAIL-R1,但表达低水平的TRAIL-R2。它们还展现对TRAIL-R1或TRAIL-R2单特异性抗体诱导的凋亡的不同的敏感性。
CTB003的细胞表面结合的流式细胞分析
从细胞培养基中收集1×106个单细胞,用FACS缓冲液(含有5%FCS,0.1%NaN3,pH7.4的PBS)洗涤两次。用20μl的10μg/ml CTB003、CTB006或CTB007在冰上温育细胞30分钟。用1mL FACS缓冲液洗涤两次之后,将细胞进一步与PE缀合的山羊抗小鼠IgG1抗体在冰上温育30分钟。用1mlFACS缓冲液洗涤两次之后,将细胞重悬浮在0.5ml的FACS缓冲液中,通过FACScan流式细胞计分析10,000个活细胞。
ATPLite分析来测定细胞活力
在96孔平板中,将每孔1,000个目标细胞在存在四种浓度(最高浓度1000ng/ml,最低浓度10ng/ml)的10倍稀释的CTB003、CTB006或CTB007的情况下培养。在37℃培养16h之后,利用ATPLite试剂盒根据厂家的说明书(Packard Instruments,Meriden,Conn.)测定每个培养物的细胞活力:添加50μl的细胞裂解缓冲液,然后添加50μl的底物缓冲液。将反应物在发光读数器中计数。细胞活力计算为(处理细胞的cmp/对照细胞的cmp)×100%。
结果:
Jurkat细胞被CTB006而不是CTB007阳性染色(图32,图面A),表明Jurkat仅表达TRAIL-R2而不表达TRAIL-R1。虽然Jurkat细胞不表达TRAIL-R1,它们却被CTB003等同地染色。相比之下,Ramos细胞被CTB007或CTB003强烈地染色,但仅被CTB006微弱地染色(图32,图面B),表明Ramos细胞主要地表达TRAIL-R1。这些结果表明,CTB003具有对肿瘤细胞表面的等同的结合能力,而与这些细胞的TRAIL-R1或TRAIL-R2的水平差异无关。
Jurkat细胞对CTB006和CTB003诱导的凋亡的敏感性相似,但是在测试的抗体浓度范围内对CTB007完全无应答(图32,图面C)。相比之下,Ramos细胞对于CTB006或CTB007诱导的凋亡不敏感(图32,图面D),但是对CTB003诱导的凋亡是相对敏感的。这些结果表明,CTB003能用来诱导仅差异地表达一种类型的死亡受体的肿瘤细胞的凋亡。因而,结合TRAIL-R1和/或TRAIL-R2的本发明的TRAIL受体结合剂(例如CTB003或hCTB003),与仅结合TRAIL-R1或TRAIL-R2的试剂相比,在癌症患者的治疗中具有更大的临床利用的优势,因为患者的原发肿瘤细胞中TRAIL受体的表达和功能预计将会有很大的变异。
等同物
本发明不被本申请中描述的具体实施方式所限制,这些实施方式是为了单独地例示本发明的个别方面而提供的。可以进行对本发明的许多修改和变化而不背离它的精神和范围,这对于本领域的技术人员是显而易见的。除了在此列举的那些,在本发明的范围内的功能等效方法和设备根据以上的描述对于本领域技术人员是显而易见的。这些修饰和变化意图落入附随的权利要求的范围内。本发明将仅由附随的权利要求的用语、以及这些权利要求声明的等同物的完整范围来限制。要理解的是,本发明不限于特定的方法、试剂、化合物组成或生物系统,这些理所当然是可以变化的。还需要理解的是,在此使用的专有名词仅是用于描述本发明的特定实施方式的目的,不意味着限制本发明。