CN101505793A

CN101505793A - 用于治疗癌症的抗c35抗体

Info

Publication number: CN101505793A
Application number: CNA2007800309441A
Authority: CN
Inventors: E·E·伊万斯; M·J·帕瑞斯; D·M·萨哈斯拉巴德赫; M·佐德尔; E·S·史密斯
Original assignee: Vaccinex Inc
Current assignee: Vaccinex Inc
Priority date: 2006-06-22
Filing date: 2007-06-22
Publication date: 2009-08-12
Also published as: CA2656918A1; EP2029172A2; WO2007149586A3; AU2007261247A1; JP2009544574A; EP2029172A4; WO2007149586A2; US20080305111A1

Abstract

本发明涉及杀死癌细胞的方法，该方法包括施用至少一种C35抗体和化疗试剂。在一些优选的实施方案中，将两种C35抗体与化疗试剂一起施用。本发明进一步涉及在这些方法中使用的C35抗体。

Description

用于治疗癌症的抗C35抗体

发明背景

技术领域

本发明涉及杀死癌细胞的方法，该方法包括施用至少一种C35抗体和化疗试剂。在一些优选的实施方案中，将两种C35抗体与化疗试剂一起施用。本发明进一步涉及用于这些方法的C35抗体。

背景技术

细胞生长是响应于机体的特定需要的精确调节过程。有时候，指示了细胞分裂规则的复杂且受到高度调节的调控会失效。当发生这种情况时，细胞开始不依赖于其稳态调节而生长并分裂，从而导致通常被称为癌症的病况。事实上，在25-44岁的美国人中，癌症是导致死亡的第二个主要原因。

目前用于癌症的疗法包括化学疗法和放射疗法。化疗药品主要通过诱导细胞凋亡来杀死癌细胞(Fisher，D.E.，Cell 78：539-542(1994)；Fung，C.Y.，and D.E.Fisher，J.Clin.Oncol.13：801-807(1995)；Lowe，S.W.，et al，Cell 74：957-967(1993))。放射疗法通过诱导细胞凋亡并通过其他机制来杀死癌细胞。但是，化学疗法和放射疗法不能杀死给定肿瘤中的所有的细胞，并且在经过这种治疗后存活下来的细胞会继续生长。因此，这些治疗通常不足以根除整个肿瘤。因此，需要经改善的治疗癌症的治疗性方法。

已经研发出用于癌症的免疫治疗性策略，这些策略使用抗体靶向在肿瘤细胞中差异性表达的表面膜标记物(例如美国专利序号5,770,195，“Monoclonal Antibodies to the HER2 Receptor”，1995年5月23日提交，1998年6月23日授权)。但是，肿瘤中差异性表达的许多抗原并非暴露在肿瘤细胞的表面上。因此，这种细胞内抗原不适于作为基于抗体的治疗剂的靶标。因此，需要用于治疗癌症的免疫治疗性方法的其他靶标。

发明概述

杀死癌细胞的方法

本发明提供了通过以下过程杀死癌细胞的方法，所述过程为施用有效量的治疗性试剂，以及施用有效量的至少一种、优选为两种、或者多于两种的结合C35的抗体，其中所述的C35为癌症相关抗原，其在癌细胞中细胞内表达，但是在发生细胞凋亡的癌细胞中，变为暴露于细胞的表面上。

在一些实施方案中，所述的治疗性试剂是化疗试剂。在一些实施方案中，所述的化疗试剂为细胞凋亡诱导试剂。对细胞凋亡诱导疗法和一种或多种抗体的施用时间进行计划，使得一种或多种抗体在细胞凋亡正在被诱导或者已经被诱导时到达癌细胞。在一些实施方案中，将至少一种C35抗体与毒素缀合或复合，这确保了与所述抗体结合的细胞将被杀死，和/或暴露于毒素的被包围的癌细胞得以被杀死。在一个实施方案中，所述的毒素为放射性同位素。在另一个实施方案中，所述的毒素是化疗试剂。

在一个实施方案中，所述方法涉及在施用一种或多种(优选为两种)抗体或其片段或其变体之前、之后或同时，施用化疗试剂。在一些实施方案中，将至少一种抗体与放射性试剂缀合。

在另一个实施方案中，所述的方法涉及施用一种或多种(优选为两种)未与毒素缀合或复合的抗体或其片段或其变体，并且与所述的抗体或片段结合的细胞死亡。在一个优选的实施方案中，所述的一种或多种抗体与未与该抗体缀合的化疗试剂一起施用。

本发明的方法可以在体外或体内实施，并且可以用作患者(包括哺乳动物，例如人)的治疗剂。

抗C35抗体以及使用C35抗体的方法

本发明还提供了结合C35多肽的抗体。本发明包括与C35多肽(例如SEQ ID NO：2所示的多肽)、或者C35多肽的多肽片段或变体免疫特异性结合的抗体(包括含有抗体片段或其变体的分子，或者备选地由抗体片段或其变体构成的分子)。

本发明人已经制备出与一种或多种C35多肽(例如SEQ ID NO：2)免疫特异性结合的小鼠和人抗体、以及编码得自这些抗体的VH和VL区域的多核苷酸。因此，本发明包括了这些多核苷酸，其中包括在SEQID NO：70和71中所示的那些、以及在下表2、3和4中列出的那些，其中的一些以表2和3中列出的日期保藏于每个典型培养物保藏中心(“ATCC”)并给予表2和3中确定的ATCC保藏编号。ATCC位于10801University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209，USA。ATCC保藏是根据布达佩斯条约的条款为了专利程序而对微生物的保藏进行国际认证来进行的。

本发明还包括：经保藏的多核苷酸克隆，该克隆编码与一种或多种C35多肽(例如SEQ ID NO：2)免疫特异性结合的VH和VL区域；细胞，该细胞包含所述的经保藏的多核苷酸；抗体，该抗体包含由所述的经保藏的多核苷酸或其部分(例如VH或VL CDR)编码的VH和/或VL区域；多核苷酸，该多核苷酸编码所述的抗体；以及细胞，该细胞包含所述的多核苷酸。本发明还包括：细胞，该细胞包含SEQ ID NO：70和71所示的多核苷酸；抗体，该抗体包含由SEQ ID NO：70和71所示的核苷酸编码的VH和/或VL区域，或者由SEQ ID NO：62和66所示的多肽编码的VH和/或VL区域；多核苷酸，该多核苷酸编码所述的抗体；以及细胞，该细胞包含所述的多核苷酸。所述的抗体可以具有或不具有与原始抗体相同的表位特异性，其中所述的原始抗体包含由所述的多核苷酸编码的VH和VL区域；并且所述的抗体具有或不具有与原始抗体和C35的亲和力相同或更高的与C35的亲和力。在一个实施方案中，本发明的抗体与包含在SEQ ID NO：2中的残基105至115范围内的C35表位结合。在另一个实施方案中，本发明的抗体与包含在SEQ ID NO：2中的残基48至104范围内的C35表位结合。在另一个实施方案中，本发明的抗体与包含在SEQ ID NO：2中的残基48至104范围内的C35表位结合。

此外，本发明包括抗体，其包含这些抗体的片段或变体(例如scFv、双链抗体、三链抗体、四链抗体、微型抗体(minibody)、重链、VH区域、VH CDR(互补决定区)、轻链、VL区域或VL CDR)，或者备选地由这些抗体的片段或变体构成，其中这些抗体具有由本发明的多核苷酸编码的VH、VH CDR、VL、VL CDR中的任意一项的氨基酸序列。这种抗体可以具有或不具有与原始抗体相同的表位特异性，其中所述的原始抗体包含由所述的经保藏的多核苷酸编码的VH和VL区域；并且这种抗体具有或不具有与原始抗体和C35的亲和力相同或不同，或者更高的与C35的亲和力。

本发明还提供了与一种或多种C35多肽结合的抗体、或者其片段或其变体，并且该抗体、或者其片段或其变体与诸如酶、荧光标记物、发光标记物或生物发光标记物偶联。本发明还提供了与一种或多种C35多肽结合的抗体、或者其片段或其变体，并且该抗体、或者其片段或其变体与治疗剂或毒素(例如放射性材料)偶联。在一个实施方案中，本发明的抗体与放射性同位素偶联。

本发明还提供了通常分离的、编码本发明的抗体(包括含有抗体片段或其变体的、或者备选地由抗体片段或其变体构成的分子，例如scFv、双链抗体、三链抗体、四链抗体、微型抗体、VH区域或VL区域)的核酸分子。本发明还提供了使用编码本发明抗体(包括含有抗体片段或其变体的、或者备选地由抗体片段或其变体构成的分子，例如scFv、双链抗体、三链抗体、四链抗体、微型抗体、VH区域或VL区域)的核酸分子转化的宿主细胞及其后代。本发明还提供了用于制备本发明的抗体(包括含有抗体片段或其变体的、或者备选地由抗体片段或其变体构成的分子)的方法。本发明进一步提供了由核酸分子表达本发明的抗体(包括含有抗体片段或其变体的、或者备选地由抗体片段或其变体构成的分子)的方法。

本发明涉及用于治疗癌症的方法和组合物，其包括向哺乳动物(优选为人)施用有效量的一种或多种(优选为两种)与C35多肽或其片段或其变体免疫特异性结合的抗体或其片段或其变体、或者相关的分子。在优选的实施方案中，本发明涉及用于治疗乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、结肠癌和黑素瘤的基于抗体的方法和组合物。

在优选的实施方案中，本发明涉及用于治疗癌症的组合疗法，其包括向哺乳动物(优选为人)施用有效量的化疗试剂和有效量的一种或多种抗体或其片段或其变体。在一些实施方案中，所述的抗体或其片段或其变体与毒素(例如放射性材料)缀合。在一些实施方案中，所述的抗体或其片段与一种试剂缀合，其中所述的试剂选自：治疗性试剂、前体药物、肽、蛋白质、酶、病毒、脂质、生物应答修饰剂、药物试剂或PEG。在优选的实施方案中，本发明涉及杀死表达C35的癌细胞的方法，其包括向所述的细胞施用两种能够与C35特异性结合的抗体或其片段或其变体、以及有效量的治疗性试剂。在特定的实施方案中，所述的治疗性试剂是化疗试剂。在更具体的实施方案中，所述的化疗试剂为紫杉醇。在另一特定的实施方案中，至少一种并且优选两种C35抗体或其片段选自1B3(Mab 11)、1F2(Mab 76)、MAb 163、MAb 165、Mab 171、MAbc009、以及其变体或衍生物。在更具体的实施方案中，所述的两种抗体为1B3和1F2、或者其片段或其变体。

本发明还包括了用于检测、诊断或预测癌症的方法和组合物，其包括向哺乳动物(优选为人)施用有效量的一种或多种与C35或其片段或其变体免疫特异性结合的抗体或其片段或其变体、或者相关分子。在优选的实施方案中，本发明涉及用于检测、诊断或预测乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、结肠癌和黑素瘤的基于抗体的方法和组合物。

本发明的另一实施方案包括本发明的抗体作为诊断工具在监测C35的表达中或者在癌症中的用途。在某些实施方案中，所述的方法还可以被用作证实细胞凋亡诱导方案的效果的诊断方法。

下文中进一步详细描述本发明的这些以及其他方面。

附图说明

图1示出了在表达C35肿瘤抗原的21MT1乳腺肿瘤细胞中在经历放射性诱导细胞凋亡之后，乳腺肿瘤的C35表面染色。图1A示出了未发生细胞凋亡(膜联蛋白V阴性)的未经处理的活细胞(PI阴性)没有在表面膜上表达C35，这可由使用抗C35抗体和同种型对照抗体进行的差异性染色的缺乏来证实。图1B相似地示出了保持活力(PI阴性)且没有被诱导发生细胞凋亡(膜联蛋白V阴性)的、经照射的肿瘤细胞也没有在肿瘤细胞表面膜上表达C35。图1C相反地示出了与同种型对照抗体相比，具有活力(PI阴性)的但发生了细胞凋亡(膜联蛋白V阳性)的、经照射的肿瘤细胞由抗C35抗体清楚地差异性染色。

图2示出了乳腺肿瘤细胞在丝裂霉素C药物诱导细胞凋亡之后的C35表面染色情况。图2A示出了未发生细胞凋亡(膜联蛋白V阴性)的未经处理的活细胞(PI阴性)没有在表面膜上表达C35，这可由使用抗C35抗体和同种型对照抗体进行的差异性染色的缺乏来证实。图2B相似地示出了保持活力(PI阴性)且没有被诱导发生细胞凋亡(膜联蛋白V阴性)的、经丝裂霉素C处理的肿瘤细胞也没有在肿瘤细胞表面膜上表达C35。图2C相反地示出了与同种型对照抗体相比，具有活力(PI阴性)的但发生了细胞凋亡(膜联蛋白V阳性)的、经丝裂霉素C处理的肿瘤细胞由抗C35抗体清楚地差异性染色。

图3A-3C示出了定位于C35+肿瘤的坏死区域的抗C35的单克隆抗体。使用同系非小细胞肺癌衍生系1肿瘤细胞移植到BALB/c小鼠的相对的侧腹中，其中所述的肿瘤细胞已经被转染或者未转染人C35。使用抗C35抗体通过免疫组织化学染色来证实C35蛋白质的表达。在经过14天的体内生长之后，动物接受静脉注射的125I标记的抗C35抗体。在注射放射性标记的抗体之后120小时，处死动物，并通过将肿瘤切片暴露于胶片上来测定C35阳性肿瘤和C35阴性肿瘤中的抗C35抗体的浓度。图4A仅示出了C35阳性肿瘤中放射性标记的抗C35抗体的浓度，而没有示出C35阴性肿瘤中的所述抗体的浓度。图4B和4C比较了标记物的分布和肿瘤中完好细胞的H&E染色，证明在这些条件下，经标记的抗C35抗体特异性地集中在C35阳性肿瘤的坏死区域中。

图4示出了Taxol^TM(紫杉醇)诱导细胞凋亡，从而使得C35暴露在细胞凋亡肿瘤细胞的表面上。在使用0.5uM Taxol^TM处理后24小时，使用膜联蛋白V-FITC、碘化丙啶、并使用100ng抗C35抗体1F2(黑线)或同种型对照抗体(灰色填充)对2 1MT1肿瘤细胞进行染色。两种抗体均直接与Alexa-647缀合。对发生细胞凋亡的细胞(膜联蛋白V阳性/PI阴性)绘制(gate)柱状图。使用PAB缓冲液(图3A)、100倍摩尔过量的重组C35蛋白质(图3B)或100倍摩尔过量的β-半乳糖苷酶蛋白质(图3C)对抗体进行预温育。

图5示出了在移植有Colau.C35肿瘤细胞的Swiss裸鼠中，使用¹³¹I标记的1B3抗C35鼠单克隆抗体和化学疗法(氟尿嘧啶：150mg/kg；甲酰四氢叶酸：100mg/kg)的组合放射性免疫疗法对肿瘤体积的影响。在移植肿瘤后的第11天开始化学疗法，并在第14天时施用300μ Ci的¹³¹I标记的1B3抗C35抗体。跟踪肿瘤的生长情况最多至8周。

图6示出了化学疗法与放射性免疫疗法的组合方式治疗对肿瘤体积的影响。在第0天对Swiss裸鼠移植Colau.C35细胞。化学疗法：在第15和第18天时以2mg/kg的量静脉(i.v.)注射顺铂；在第18天以180/120mg/kg的量静脉注射5FU/LV。放射性免疫疗法：在第21天时施用300μ Ci(50μg)的¹³¹I标记的鼠1B3抗C35 IgG。

图7示出了在天然表达和C35转染的人乳腺肿瘤和结肠肿瘤中的等价表达情况。使用与Alexa-647缀合的抗C35MAb 1F2或同种型对照对细胞进行染色。MFI X为1F2的平均荧光强度/同种型对照的平均荧光强度的比率。衍生自正常乳腺上皮细胞的H16N2、MDAMB231(乳腺肿瘤)和Colau(结肠肿瘤)都表达低的基础水平的C35。衍生自乳腺癌瘤的21MT1天然表达高水平的C35。使用空(裸)载体或人C35重组载体转导Colau和MDA231。所有的肿瘤都在体内培养，然后将这些肿瘤切除、分离并染色。

图8示出了通过重量损失来测定化学疗法、放射性免疫疗法和组合疗法在Swiss裸鼠中的毒性。

图9示出了使用Lys-C内切蛋白酶来完全消化6xHis标签的重组人C35(rhC35)之后所的预期肽片段。示出了包含氨基末端6xHis标签附加物的rhC35的完整序列。相对于天然人C35序列的氨基末端蛋氨酸(粗体M)对氨基酸的位置进行编号。第一个和第三个赖氨酸(K)残基处的星号表示这些位置的消化无效，并且可以产生一些更长的片段。

图10示出了1B3(MabII)或1F2与抗6xHis标签的Western bolt的染色对比，该图表明了各个抗体所结合的C35的片段。

图11示出了MAb165对C35具有特异性。141D10重组疫苗病毒与UH8重组疫苗病毒共感染到HeLa细胞中。通过ELISA就与C35或对照蛋白质A27L(疫苗病毒蛋白质)的结合测试所得的分泌的抗体。

图12示出了总剂量为40mg/kg的鼠C35抗体1B3(20mg/kg剂量)和1F2(20mg/kg剂量)与剂量为30mg/kg的紫杉醇(TAXOL

)的组合在移植有MDA-MB231.hC35肿瘤的小鼠中减慢肿瘤生长中是有效的。

图13示出了Western证实的MAb163与C35的肿瘤特异性结合。泳道1：由大肠杆菌(100ng/泳道)纯化得到的重组人C35蛋白质(rC35)；泳道2：21MT1-D人乳腺肿瘤细胞裂解物(100,000个细胞等价物/泳道)；泳道3：H16N2正常的永生化人乳腺细胞系裂解物(100,000个细胞等价物/泳道)。在图的左侧，分子量标记物以千道尔顿的形式显示。

图14示出了使用C35阳性21MT1-D乳腺癌细胞系和C35阴性H16N2正常乳腺细胞系通过流式细胞法对抗C35单克隆抗体MAb163和Mab1的C35特异性的分析。使用同种型对照单克隆抗体的染色由黑色填充的区域表示。使用抗C35抗体的染色由中空的线表示。

图15示出了在人乳腺细胞系中使用MAb163的免疫荧光染色。在C35+细胞中高水平的MAb163荧光表明MAb163与C35结合。

图16示出了使用用于Biacore分析的1:1动力学模式测量的MAb163的结合亲和力。使用BIAevaluation软件，按照下式计算MAb163的Ka和Kd：(a)ka(1/Ms)＝2.84e5；(b)kd(l/s)＝9.59e-4；(c)KA(1/M)＝2.96e8；和(d)KD(nM)＝3.38。

图17示出了使用Lys-C内切蛋白质对6-His标签的重组人C35(rhC35)进行部分酶切所得到的预期肽片段。

图18示出了在对重组人C35进行Lys-C消化后，通过考马斯蓝染色和抗6-His染色所观察到的肽片段。所预期片段在印迹的左侧示出，用于比较。

图19示出了使用Western印迹的MAb163染色与考马斯蓝和抗6-His印迹的比较，指示了MAb163所结合的C35的片段。所预期片段在印迹的左侧示出，用于比较。可见MAb163与对应于所预期的片段1-4结合，但是不与所预期的片段5-11结合。

图20以图示的方式描述了MAb163的表位的特异性。MAb163识别C35的氨基酸残基48至87范围内的表位，其中所述的氨基酸的位置是相对于天然人序列的氨基末端的蛋氨酸来编号的(参见图9)。这一区域具有以下氨基酸序列：

EQYPGIEIESRLGGTGAFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEK。

图21示出了与H16N2 C35-/Her2-正常乳腺细胞系相比，使用抗C35抗体MAb163、Mab11(嵌合体1B3)、Mab76(嵌合体1F2)或赫赛汀(抗人Her2)来抑制C35+/Her2+ BT474乳腺肿瘤细胞系的增殖的增殖分析的结果。使用美罗华(抗人CD20)作为阴性对照，这是因为两种乳腺细胞系均为CD20阴性。使用赫赛汀作为Her2阳性细胞系的阳性对照。

图22示出了使用兔多克隆抗C35通过Western印迹对来自C35+21MT1乳腺细胞的nC35的免疫沉淀。数字“15”表示15千道尔顿的分子量标记物。数字“163”表示mAb163单克隆抗体。“Neg IgG”表示IgG阴性对照抗体。

图23示出了在移植有MDA231.rvC35肿瘤细胞的小鼠中在经过以下处理之后的平均肿瘤体积(cm²)：单独的阿霉素(＂ADM＂)；鼠抗C35抗体、1F2和1B3的组合；阿霉素、1F2和1B3的组合；阿霉素和1B3；阿霉素和1F2；阿霉素和IgG同种型抗体(＂iso＂)；以及非抗体(＂无＂)。封闭的黑色箭头表示肿瘤移植后的第3天和第10天施用阿霉素。粗的中空的箭头表示在肿瘤移植后的第3天、7天、10天、13天、17天、20天和23天进行抗体处理。在移植后的第6天开始测量。

图24示出了在移植有MDA231.rvC35肿瘤细胞的小鼠中在经过以下处理之后的肿瘤体积的平均变化(％)：单独的阿霉素(＂ADM＂)；鼠抗C35抗体、1F2和1B3的组合；阿霉素、1F2和1B3的组合；阿霉素和1B3；阿霉素和1F2；阿霉素和IgG同种型抗体(＂iso＂)；以及非抗体(＂无＂)。封闭的黑色箭头表示肿瘤移植后的第3天和第10天施用阿霉素。粗的中空的箭头表示在肿瘤移植后的第3天、7天、10天、13天、17天、20天和23天进行抗体处理。在移植后的第6天开始测量。

发明详述

综述

许多研究已经描述了发生细胞凋亡的细胞的表面膜的改变。这些变化中，主要的变化是磷脂不对称性的早期丧失，这由表面膜外页上的磷脂酰丝氨酸的暴露反应出来。已经报道，表面膜组合物的这种改变有助于巨噬细胞识别和除去细胞调亡的细胞(Fadok，V.A.，et al.，J.Immunol.148：2207-2216(1992))。已经研发出一种普通的方法，其通过使抗凝血剂膜联蛋白V与暴露的磷脂酰丝氨酸分子结合来检测发生细胞调亡的细胞(Koopman，G.，et al，Blood 84：1415-1420(1994))。

更加关注的是细胞调亡的细胞中其他表面膜分子(特别是蛋白质)的表达和暴露发生改变的可能性。许多报道描述了似乎在细胞内被表达的细胞凋亡的特异性蛋白质(Grand，R.J.A.，et al.，Exp.CellRes.218：439-451(1995)；美国专利序号5,972,622，＂Method ofDetecting Apoptosis Using an Anti-Human GP46 MonoclonalAntibody＂，提交日期为1997年2月6日，授权日期为：1999年10月26日)。更加直接相关的是一篇单克隆抗体的报道，其中所述的单克隆抗体会检测到38kD的蛋白质抗原，该抗原与细胞调亡的细胞的表面膜和线粒体膜有关，但是在正常细胞中却不能检测到该抗原(美国专利序号5,935,801，＂Monoclonal Antibody that Detects ApoptoticAntigen＂，提交日期为：1996年三月29日，授权日期为1999年8月10日)。已经描述了其他多种差异性地暴露于细胞调亡的角化细胞表面或该表面附近的抗原(Casciola-Rosen，L.A.，et al.，J.Exp.Med.179：1317-1330(1994))、以及在胚胎发育过程中发生细胞调亡的细胞中的抗原(Rotello，R.J.，et al.，Development 120：1421-1431(1994))。已经表明三种经定义的蛋白质抗原CD3、CD69和CD25在细胞调亡的角化细胞的表面膜上被上调(Kishimoto，H.，et al.，J.Exp.Med.181：649-655(1995))。在各种情况中，他们是正常细胞和组织中的细胞凋亡的表面标记物。虽然，这些相同的标记物可能还与发生细胞调亡的肿瘤细胞有关，但是它们不会使得细胞调亡的肿瘤细胞与作为正常组织运转的一部分发生细胞调亡的正常细胞区分开。因此，它们不会用作治疗癌症的靶标。

本发明人确定，存在有细胞内肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原的亚类，其在化学疗法或放射性诱导的细胞凋亡的条件下变得暴露于肿瘤细胞膜上，并且可以成为用于将与放射性同位素或毒素缀合的抗体集中于肿瘤内的有效靶标。使用针对这种抗原的抗体的方法是特别有效的，这是因为所述的抗体会增强标准的细胞凋亡诱导化学疗法和放射疗法在治疗癌症中的治疗益处。本发明鉴定出与内细胞膜相连的肿瘤特异性抗原(具体而言，为差异性表达分子，例如表达异戊二烯化的基序的C35癌症特异性抗原)作为一类细胞内肿瘤抗原，该抗原在通过放射和/或化学疗法而被诱导发生细胞凋亡的肿瘤细胞的表面膜上变得暴露。

本发明描述了一种方法，在一个实施方案中，所述的方法与通过化学疗法或放射性治疗来诱导细胞凋亡(优选为大范围的细胞凋亡)联合作用，从而增强对肿瘤的根除。这是基于如下新的观察结果，即，肿瘤细胞内差异性表达的一类细胞内标记物会变得暴露于细胞调亡的细胞的表面上，在该细胞的表面上，所述的标记物可以被特异性抗体所靶向，其中所述的抗体可以以未与毒性负载物缀合或者与毒性负载物缀合的方式进行施用。这种处理方法的益处可以达到若干倍。例如，通过使用缀合的抗体，该方法可以将毒性负载物递送至肿瘤环境中，其中所述的毒性负载物可以破坏位于细胞凋亡靶标附近的其他非细胞调亡的肿瘤细胞。此外，该方法可以以其他方式防止活细胞的细胞凋亡过程发生逆转及重新生长，其中所述的活力细胞已经通过(例如)采用细胞凋亡诱导的化疗试剂处理而启动了细胞凋亡过程，这可由表面膜的构成的改变来证实(Hammill，A.K.，et al，Exp.Cell Res.251：16-21(1999))。

应该将靶向细胞调亡细胞的本发明与靶向坏死细胞的现有发明相区别(美国专利序号6,071,491，＂Detection of Necrotic MalignantTissue and Associated Therapy＂，提交日期：1999年8月9日，授权日期：2000年6月6日)。坏死导致细胞内容物被释放到细胞外的肿瘤环境中。这些细胞内抗原中的一些在上述环境中累积，并可以被特异性的抗体所靶向。但是，坏死与更大肿瘤的低含氧量区域有关，由于缺乏氧自由基，所以更大的肿瘤对放射性治疗以及可能的放射性免疫疗法具有相对的抗性。虽然在使用化疗试剂进行治疗后坏死可能发生一定程度的增大(Desrues B.，et al.，Br.J.Cancer 72：1076-82，(1995))，化疗试剂的主要作用是增大细胞凋亡。因此，与用于癌症的免疫疗法、以及特别是更小肿瘤的根除和造成肿瘤扩散的微转移的细胞凋亡相比，坏死更不适于作为靶标。因此，根除小肿瘤和微转移的有效方法对于治疗侵入性癌症是特别有用的。

还应该将本发明与专利公开序号US 2002/0052308 A1(May 2，2002)中的公开内容相区别，后者公开了842种癌症抗原，包括其大区域与C35的部分(SEQ ID NO：2)相一致的抗原(SEQ ID NO：966)。US2002/0052308 A1在第205页第[0229]段总体上公开了将抗842种癌症抗原的抗体“单独施用或者与其他类型的处理结合施用(例如放射疗法、化学疗法、激素疗法、免疫疗法和抗肿瘤试剂)”。但是，该公开的申请没有详细说明已经通过施用细胞凋亡诱导试剂(例如化学疗法、放射疗法或其他抗肿瘤试剂)诱导出肿瘤细胞的细胞调亡之后，应该施用有效地抗C35相关靶标的、与毒素缀合的C35特异性抗体。事实上，对定向于抗原(该抗原与C35截然不同的是，其天然地在肿瘤细胞的表面膜上表达)的化学疗法与放射性免疫疗法的组合的许多研究得出了这样的结论，通过在化学疗法前(即，在诱导细胞凋亡之前)施用放射性免疫治疗抗体可获得最佳的效果(DeNardo S.J.，et al.Anticancer Res.18：4011-18，(1998)；Clarke K.，et al.，Clin.Cancer Res.6：3621-28，(2000)；Burke P.A.，Cancer94：1320-31(2002)；Stein，R.et al.，Cancer 94：51-61(2002)；Odonnel R.T.，et al.，Prostate 50：27-37(2002))。在US2005/0158323中提出如下发现，细胞凋亡使得包括C35在内的一类细胞内抗原在表面膜上暴露出来，其中所述的抗原被异戊二烯化，并且与未经处理的肿瘤细胞的内层膜相连，在此将该文献以引用方式全文并入本文。US 2005/0158323还提出，以最佳方式施用定向于上述种类目标分子的放射性免疫疗法，使得抗体在大约通过施用细胞凋亡诱导试剂已经诱导肿瘤细胞的细胞调亡的同时，或之后片刻，能够在肿瘤位置处累积。US 2002/0052308 A1没有描述C35相关癌症抗原的亚细胞位置，也没有描述应该如何施用针对该抗原的抗体用于治疗效果。US 2002/0052308 A1还没有描述将两种或多种抗C35抗体与化疗试剂一起施用。

其他研究者观察到，使用诸如Her2之类的细胞外表达抗原，施用两种不同的抗Her2的抗体(其针对所述蛋白质的不同的表位)在体内和体外产生抗肿瘤活性。Spiridon et al，Clin.Cancer Res.8：1720-30(2002)(在此将该文献以引用方式全文并入本文)。但是，虽然Spiridon等人观察到了细胞外表达蛋白质Her2，但是如上文所述，C35为细胞内抗原，其与细胞凋亡相关联变为在细胞表面上表达。

I.定义

应该注意，术语“一”、“一个”实体是指一个或多个该实体；例如“C35抗体”应该理解为代表了一个或多个C35抗体。这样，术语“一”(或“一个”)、“一个或多个”和“至少一个”在本文中可以交换使用。

如本文所用，术语“多肽”意指包括了单个“多肽”以及多个“多肽”，并指由单体(核酸)通过酰胺键(还称为肽键)线性连接而构成的分子。术语“多肽”是指两个或多个氨基酸形成的任何链，并且不指特定长度的产物。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或者用于指两个或多个氨基酸的链的任何其他术语都包括在“多肽”的定义内，并且术语“多肽”可以代替这些术语中的任何一个来使用，或者可以与上述中的任何一个术语交换使用。术语“多肽”还意指多肽的表达后修饰产物，其中所述的修饰包括，但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团的衍生化、蛋白水解切割、或者使用非天然氨基酸进行修饰。多肽可以衍生自天然生物来源或者通过重组技术产生，但不是必需由指定的核酸序列翻译。多肽可以采用任何方式产生，包括通过化学合成形成。

本发明多肽的大小可以为约3个或更多、5个或更多、10个或更多、20个或更多、25个或更多、50个或更多、75个或更多、100个或更多、200个或更多、500个或更多、1,000个或更多、2,000个或更多的氨基酸。多肽可以具有所定义的三维结构，但是他们不是必需具有这种结构。具有所定义的三维结构的多肽被称为折叠的，而不具有所定义的三维结构、而是采用大量不同构型的多肽被称为非折叠的。如本文所用，术语糖蛋白是指与至少一个糖类部分偶联的蛋白质，其中所述的糖类部分通过氨基酸残基(例如丝氨酸残基或天冬氨酸残基)的含氧侧链或含氮侧链与蛋白质相连

“分离的”多肽或其片段、变体或衍生物意指不在其天然环境的多肽。不需要特定的纯化水平。例如，分离的多肽可以是从其本身的或天然的环境中隔离出来的。在宿主细胞中表达的、经重组产生的多肽和蛋白质被认为是用于本发明的分离的，如同通过任何合适的技术分离、分级或者部分或基本上纯化的天然或重组多肽。

本发明的多肽还包括上述多肽的片段、衍生物、类似物或变体，以及它们的任意组合。当术语“片段”、“变体”、“衍生物”和“类似物”用于指本发明的C35抗体或抗体多肽时，包括保留了相应天然抗体或多肽的至少一些抗原结合性质的任何多肽。本发明的多肽片段除了包括本文中其他处讨论的特定抗体片段以外，还包括蛋白水解片段以及缺失片段。本发明的C35抗体和抗体多肽的变体包括上文所述的片段，还包括具有源于氨基酸取代、缺失或插入而经改变的氨基酸序列的多肽。变体可以是天然的或者是非天然的。非天然的变体可以使用本领域已知的突变技术产生。变体多肽可以包含保守性或非保守性的氨基酸取代、缺失或插入。C35抗体的变体包括人源化的抗体以及经亲和力成熟或优化的C35抗体。亲和力优化可以通过本领域公知的常规方法来实施。备选地，用于增大本发明的抗体的亲和力的优选方法公开在US 2002 0123057 A1中。本发明的C35抗体和抗体多肽的衍生物为如下多肽，该多肽经过改变从而表现出天然多肽不具有的其他特征。实例包括融合蛋白质。如本文所用，C35抗体或抗体多肽的“衍生物”是指如下对象多肽，该多肽具有通过功能性侧基反应而以化学方式衍生出的一个或多个残基。此外，“衍生物”还包括这样的肽，该肽包含20个标准氨基酸的一个或多个天然氨基酸衍生物。例如，4-羟基脯氨酸可以取代脯氨酸，5-羟基赖氨酸可以取代赖氨酸，3-甲基组氨酸可以取代组氨酸，高丝氨酸可以取代丝氨酸，并且鸟氨酸可以取代赖氨酸。

术语“多核苷酸”意指包括了单个核酸以及多个核酸，并且指分离的核酸分子或构建体，例如信使RNA(mRNA)或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸可包含常规的磷酸二酯键或非常规的键(例如酰胺键，例如在肽核酸(PNA)中发现的键)。术语“核酸”是指在多核苷酸中存在的任何一个或多个核酸节段，例如DNA或RNA片段。“分离的”核酸或多核苷酸意指已经由其天然环境中隔离出来的核酸分子、DNA或RNA。例如，就本发明的目的而言，包含于载体中的编码C35抗体的重组多核苷酸被认为是分离的。分离的多核苷酸的其他实例包括保持在异源宿主细胞中的重组多核苷酸或溶液中经纯化(部分或基本上地)的多核苷酸。分离的RNA分本包括本发明多核苷酸的体内或体外的RNA转录本。根据本发明的分离的多核苷酸或核酸进一步包括合成产生的那些分子。此外，多核苷酸或核酸可以为或者可以包括诸如启动子、核糖体结合位点或转录终止子之类的调节元件。

如本文所用，“编码区域”为由被翻译形成氨基酸的密码子构成的核酸部分。虽然，“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)没有被翻译形成氨基酸，但是该密码子可以被认为是编码区域的一部分，但是任何侧翼序列，例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子等，均不是编码区域的一部分。本发明的一个或多个编码区域可以存在于单一核苷酸构建体(例如在单一载体上)中或者存在于分别的多核苷酸构建体(例如在分别(不同)的载体上)中。此外，任何载体都可以包含单一编码区域，或者可以包含两个或多个编码区域，例如单一载体可以分别编码免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区。此外，本发明的载体、多核苷酸或核酸可以编码异源编码区域，该异源编码区域融合到或未融合到编码C35抗体或其片段、变体或衍生物的核酸中。异源编码区域包括，但不限于专用的元件或基序，例如分泌信号肽或异源功能结构域。

在某些实施方案中，所述的多核苷酸或核酸为DNA。在DNA的情况下，包含核酸(其编码多肽)的多核苷酸通常包含启动子和/或其他与一个或多个编码区域可操作地连接的其他转录或翻译调控元件。可操作地连接是，基因产物(例如多肽)的编码区域以某种方式与一个或多个调节序列相连接，从而使基因产物的表达处于调节序列的影响或调控之下。例如，如果启动子功能的诱导使得编码所需基因产物的mRNA被转录，并且如果两个DNA片段之间的连接性质没有干扰指导基因产物表达的表达调节序列的能力或者干扰待转录的DNA模板的能力，则这两个DNA片段(例如多肽编码区域及其相连的启动子)是“可操作地连接的”。因此，如果启动子能够影响核酸的转录，则启动子区域与编码多肽的核酸可操作地连接。所述的启动子可以为只在预定细胞中指导DNA的基本转录的细胞特异性启动子。除了启动子以外，可以使其他转录调控元件(例如增强子、操作子、抑制子和转录终止信号)与多核苷酸可操作地连接以指导细胞特异性转录。合适的启动子和其他转录调控区域在本文中有所公开。

多种转录调控区域对于本领域的技术人员而言是已知的。这些区域包括，但不限于在脊椎动物细胞中发挥功能的转录调控区域，例如，但不限于得自细胞巨化病毒(即刻早期启动子，与内含子A结合)、猿猴病毒40(早期启动子)和逆转录病毒(例如劳氏肉瘤病毒)的启动子和增强子节段。其他转录调控区域包括由脊椎动物基因(例如肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素和兔β球蛋白、以及能够调控真核细胞基因表达的其他序列)衍生的那些。其他合适的转录调控区域包括组织特异性启动子和增强子、以及淋巴因子诱导的启动子(例如可通过干扰素或白细胞介素诱导的启动子)。

类似地，多种翻译调控元件对于本领域的普通技术人员而言是已知的。这些元件包括，但不限于核糖体结合位点、翻译起始密码子和终止密码子、以及由小核糖核酸病毒衍生的元件(具体而言为内部核糖体进入位点或IRES，还称为CITE序列)。

在其他实施方案中，本发明的多核苷酸为RNA，例如以信使RNA(mRNA)的形式。

本发明的多核苷酸和核酸编码区域可以与其他编码分泌肽或信号肽的编码区域相连，其中所述的分泌肽或信号肽指导了由本发明的多核苷酸编码的多肽的分泌。根据信号假说，由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列，一旦生长的蛋白质链穿过粗糙内质网的输出被启动，所述的信号肽或分泌前导序列便从成熟蛋白质上切除。本领域的普通技术人员意识到由脊椎动物细胞分泌的多肽通常具有融合至多肽N末端的信号肽，该信号肽从完整或“全长”多肽上切除，从而产生被分泌的或“成熟”形式的多肽。在某些实施方案中，使用天然的信号肽(例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽)，或者使用保持指导与其可操作地连接的多肽分泌的能力的所述序列的功能衍生物。备选地，可以使用异源哺乳动物信号肽或其功能衍生物。例如，可以使用人组织型纤溶酶原激活物(TPA)或小鼠β葡萄糖苷酶的前导序列取代野生型前导序列。

本发明涉及某种C35抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物。除非特别指出是全长抗体(例如天然抗体)，术语“C35抗体”(本文中，该术语可以与术语“抗C35抗体”交换使用)包括了全长抗体以及此类抗体的抗原结合片段、变体、类似物或衍生物，例如天然的抗体或免疫球蛋白分子或以与抗体分子相同的方式结合抗原的基因工程抗体分子或片段。

本文中，术语“抗体”与“免疫球蛋白”可以交换使用。抗体或免疫球蛋白至少包含重链可变结构域，并且通常至少包含重链可变结构域和轻链可变结构域。脊椎动物系统中的基本免疫球蛋白结构是相对公知的。例如参见Harlow等人的Antibodies：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press，2nd ed.1988)。

术语“免疫球蛋白”包括可以通过生物化学方式区分的种类广泛的多肽，这将在下文中进行更详细的讨论。本领域的技术人员知道重链可以分为gamma、mu、alpha、delta或epsilon，(γ、μ、α、δ、ε)，并且其中还有一些亚类(例如γ1-γ4)。该链的性质将抗体的“类别”分别确定为IgG、IgM、IgA、IgG或IgE。免疫球蛋白亚类(同种型)(例如IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁等)是经过充分表征的，并且已知其赋予了功能特异性。根据本公开，这些类别和同种型的抗体中的每个的修饰形式对于技术人员而言都是易于辨别的，因此它们都在本发明的范围内。所有免疫球蛋白类别清楚地在本发明的范围内，以下讨论总体上针对免疫球蛋白分子的IgG类别。关于IgG，其是标准的免疫球蛋白分子，包含两条分子量为约23,000道尔顿的相同的轻链多肽和两条分子量为53,000-70,000的相同的重链多肽。四条连通常通过二硫键以“Y”的构型连接，其中轻链在“Y”的开口处开始括住重链并延续至整个可变区。

轻链可以分类为kappa或lambda(κ，λ)。每种类别的重链都可以与κ或λ轻链结合。总体而言，当免疫球蛋白是由杂交瘤细胞、B细胞或遗传改造的宿主细胞产生时，轻链和重链以共价方式彼此键合，并且两条重链的“尾”部通过共价二硫键连接或非共价连接彼此键合。在重链中，氨基酸序列是由位于Y构型的叉状末端的N末端开始直至位于各条链底端的C末端。

轻链和重链均被分成结构和功能同源的区域。术语“恒定的”和“可变的”是就功能而言来使用的。在这一点上，应该理解轻链的可变结构域(V_L)部分和重链的可变结构域(V_H)部分决定了抗原的识别和特异性。相反，轻链的恒定结构域(C_L)和重链的恒定结构域(C_H1，C_H2或C_H3)赋予了诸如分泌、经胎盘的灵活性、Fc受体的结合、补体的结合等等的重要的生物性质。根据惯例，随着恒定区结构域与抗体的抗原结合位点或氨基末端的距离越远，该结构域的数量增加。N末端部分为可变区，而C末端部分为恒定区；C_H3和C_L结构域实际上分别包含重链和轻链的羧基末端。

如上文所述，可变区允许抗体选择性地识别并特异性地结合抗原上的表位。换言之，抗体的V_L结构域和V_H结构域、或者互补决定区(CDR)的亚区相结合，从而形成定义了三维抗原结合位点的可变区。这种四元抗体结构在Y构型的各个臂的末端处形成了抗原结合位点。更具体而言，抗原结合位点是由每个V_H和V_L链的三个CDR来定义的。在一些情况下，例如衍生自骆驼科物种(camelid species)或者基于骆驼科动物免疫球蛋白改造的某些免疫球蛋白分子，完整的免疫球蛋白分子可以仅由重链构成而不具有轻链。例如参见Hamers-Casterman et al.，Nature 363：446-448(1993)。

在天然抗体中，存在于各抗原结合结构域中的6个“互补决定区”或“CDR”是短的、非邻近的氨基酸序列，当所述的抗体在水性环境中呈现其三维构型时，所述的氨基酸序列特异性地定位，从而形成抗原结合结构域。抗原结合结构域中的其余氨基酸(称为“框架”区域)显示为低的分子内可变性。框架区主要采用β片构型，而CDR形成与β片结构相连的环，并且在某些情况下所述的环形成了β片结构的一部分。因此，框架区起到了形成支架的作用，其中所述的支架使得CDR通过链内非共价作用以正确的方向定位。由定位的CDR形成的抗原结合位点定义了与位于免疫反应性抗原上的表位互补的表面。这种互补的表面促进了抗体与其同源的表位的非共价结合。对于任何给定的重链可变区和轻链可变区，本领域的任何普通技术人员都可以容易地分别鉴定含CDR区域和框架区的氨基酸，这是因为这些氨基酸已经被精确地定义(参见＂Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，＂Kabat，E.，et al.，U.S.Department of Health andHuman Services，(1983)；以及Chothia and Lesk，J.Mol.Biol.，196：901-917(1987)，在此，这些文献均以引用方式全文并入本文)。

在本领域使用和/或接受的术语具有两个或多个定义的情况下，本文所用的术语的定义旨在包括了所有的这些含义，除非明确地做出了相反的说明。具体实例为术语“互补决定区”(＂CDR＂)的使用，该术语描述的是在重链多肽和轻链多肽的可变区内发现的非连续的抗原结合位点。该特定的区域已经由Kabat等人，U.S.Dept.of Health andHuman Services，＂Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest＂(1983)和Chothia等人，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)描述，在此将上述文献以引用方式并入本文，其中在将该区域彼此对比时，其定义包括氨基酸残基的重叠或亚区。但是，关于抗体或其变体的CDR的定义应用均在本文所定义和使用的术语的范围内。包括了由上述各引用文献所定义的CDR的合适的氨基酸残基均列于下表1中，以用于比较。包括了特定CDR的确切的残基数将随着CDR的序列和大小的变化而改变。根据抗体的可变区的氨基酸序列，本领域的技术人员可以通过常规方式确定哪些残基包含特定的CDR。

表1.CDR定义¹

	Kabat	Chothia
	Kabat	Chothia	V_H CDR1	31-35	26-32
V_H CDR2	50-65	52-58	V_H CDR1	31-35	26-32
V_H CDR2	50-65	52-58	V_H CDR3	95-102	95-102
V_L CDR1	24-34	26-32	V_H CDR3	95-102	95-102
V_L CDR1	24-34	26-32	V_L CDR2	50-56	50-52
V_L CDR3	89-97	91-96	V_L CDR2	50-56	50-52

¹表1中所示的所有CDR定义的编号是根据由Kabat等人提出的编号惯例而来的(参见下文)。

Kabat等人还定义了用于任何抗体的可变结构域序列的编号系统。本领域的普通技术人员可以明确地将该“Kabat编号”系统指定用于任何可变结构域序列，而无需依靠序列本身以外的任何试验数据。如本文所用，“Kabat编号”是指由Kabat等人U.S.Dept.of Healthand Human Services，＂Sequence of Proteins of ImmunologicalInterest＂(1983)提出的编号系统。除非另作说明，否则关于本发明的C35抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物中的特定氨基酸残基位置的编号均是根据Kabat编号系统而来的。

在骆驼科物种中，被称为V_HH的重链可变区形成了完整的抗原结合结构域。骆驼科动物V_HH可变区与由常规抗体衍生得到的可变区(V_H)之间的主要差异包括：(a)与V_HH的轻链接触表面相比，V_H的轻链接触表面中含有更多的疏水性氨基酸；(b)V_HH中的CDR3更长；以及(c)V_HH中CDR1和CDR3之间的二硫键频繁形成。

本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物包括，但不限于：多克隆、单克隆、多特异性、人、人源化、灵长类源化或嵌合抗体；单链抗体；表位结合片段，例如Fab、Fab′、F(ab′)₂、Fd、Fvs、单链Fvs(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fvs(sdFv)、包含V_L或V_H结构域的片段、由Fab表达库形成的片段；以及抗独特型(抗Id)抗体(例如包括抗本文公开的C35抗体的抗Id抗体；此外例如参见Hudson，PJ.and Couriau，C，Nature Med.9：129-134(2003)；美国专利公开序号20030148409；美国专利序号5,837,242)。例如，scFv分子是本领域已知的并且在例如美国专利5,892,019中有所描述。本发明的免疫球蛋白或抗体分子可以为任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类的免疫球蛋白分子。

包括单链抗体在内的抗体片段可以包含单独的可变区或者可变区与以下的全部或部分的组合：铰链区、C_H1结构域、C_H2结构域和C_H3结构域。此外，本发明还包括抗原结合片段，该片段还包含可变区与铰链区、C_H1结构域、C_H2结构域和C_H3结构域的任意的组合。用于本文所公开的诊断和治疗方法中的抗体或其免疫特异性片段可以来自包括鸟和哺乳动物在内的任何动物来源。优选地，所述的抗体为人、鼠、驴、兔、山羊、豚鼠、骆驼、美洲驼羊、马或鸡的抗体。在另一个实施方案中，所述的可变区可以condricthoid in origin(例如得自鲨鱼)。如本文所用，“人”抗体包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，并且包括由人免疫球蛋白库中或由对于一种或多种人免疫球蛋白转基因的动物中分离得到的抗体，其中所述的动物转基因不表达内源免疫球蛋白，如下文和例如Kucherlapati等人的美国专利序号5,939,598所述。

如本文所用，术语“重链部分”包括衍生自免疫球蛋白重链的氨基酸序列。包含重链部分的多肽包含以下中的至少一种：C_H1结构域、铰链(例如上游铰链区、中游铰链区和/或下游铰链区)结构域、C_H2结构域、C_H3结构域、或者它们的变体或片段。例如，用于本发明的结合多肽可以包括：包含C_H1结构域的多肽链；包含C_H1结构域、铰链结构域的至少一部分和C_H2结构域的多肽链；包含C_H1结构域和C_H3结构域的多肽；包含C_H1结构域、铰链结构域的至少一部分和C_H3结构域的多肽链；或者包含C_H1结构域、铰链结构域的至少一部分、C_H2结构域和C_H3结构域的多肽链。在另一个实施方式中，本发明的多肽包括：包含C_H3结构域的多肽链。此外，用于本发明的结合多肽可以缺乏C_H2结构域的至少一部分(例如C_H2结构域的全部或部分)。如上文所述，本领域的普通技术人员都应该理解这些结构域(例如重链部分)可以被修饰使得它们的氨基酸序列由天然的免疫球蛋白分子发生了改变。

在本文所公开的某些C35抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物中，多聚体的一条多肽链的重链部分与该多聚体的第二条多肽链的重链部分相同。备选地，本发明的包含重链部分的单体是不同的。例如，各种单体可以包含不同的目标结合位点，从而形成例如双特异性抗体。

用于本文所公开的诊断和治疗方法中的结合多肽的重链部分可以衍生自不同的免疫球蛋白分子。例如，多肽的重链部分可以包含衍生自IgG1分子的C_H1结构域、以及衍生自IgG3分子的铰链区。在另一实例中，重链部分可以包含部分衍生自IgG1分子和部分衍生自IgG3分子的铰链区。在另一实例中，重链部分可以包含部分衍生自IgG1分子和部分衍生自IgG4分子的嵌合铰链。

如本文所用，术语“轻链部分”包含衍生自免疫球蛋白轻链的氨基酸序列。优选地，所述的轻链部分包含至少一个V_L或C_L结构域。

可以根据抗原(例如抗体可以识别或特异性结合的靶多肽(C35))的表位或部分来描述或详细说明本文所公开的C35抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物。可以与抗体的抗原结合结构域特异性相互作用的靶多肽部分为“表位”或“抗原决定簇”。靶多肽可以包含单一表位，但是通常包含至少两个表位，并且可以包含任意数量的表位，这取决于抗原的大小、构型和类型。此外，应该注意靶多肽上的“表位”可以为或者可以包含非多肽元件，例如表位可以包含糖侧链。

认为用于抗原的肽或多肽的最小大小为约4至5个氨基酸。肽或多肽表位优选包含至少7个、更优选为至少9个、最优选为约15至约30个氨基酸。由于CDR以三级结构形式识别抗原性肽或多肽，所以具有表位的氨基酸不需要是相邻的，并且在某些情况下，这些氨基酸甚至可以不在相同的肽链上。在本发明中，被本发明的c35抗体识别的肽或多肽表位包含C35序列的至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、更优选地至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、或者约15至约30个相邻或不相邻的氨基酸。

“特异性结合”通常是指抗体通过其抗原结合结构域与表位结合，并且这种结合需要抗原结合结构域与表位之间一定的互补性。根据这个定义，当抗体通过其抗原结合结构域比该抗体与随意的、无关的表位结合得更容易与表位结合时，认为抗体与表位“特异性的结合”。术语“特异性”在本文中用于对某种抗体与某种表位结合的相对亲和力进行定性。例如，对于给定的表位，可以认为抗体“A”比抗体“B”具有更高的特异性；或者与相关的表位“D”相比，可以认为抗体“A”与表位“C”的结合具有更高的特异性。

“优先结合”是指与相关的、相似的、同源的或类似的表位相比，抗体更容易与表位特异性结合。因此，与相关的表位相比，与给定表位“优先结合”的抗体更可能与所述的给定表位结合，尽管该抗体与所述的相关表位可以发生交叉反应。

通过非限定性实例，如果抗体以一定的解离常数(K_D)与第一表位结合，而该解离常数小于该抗体与第二表位的K_D，则可认为该抗体优先与第一表位结合。在另一非限定性实例中，如果抗体以一定的亲和力与第一表位结合，而该亲和力比该抗体与第二表位的K_D小至少一个数量级，则可认为该抗体优先与第一表位结合。在另一非限定性实例中，如果抗体以一定的亲和力与第一表位结合，而该亲和力比该抗体与第二表位的K_D小至少两个数量级，则可认为该抗体优先与第一表位结合。

在另一非限定性实例中，如果抗体以一定的解离速率(k(off))与第一表位结合，而该解离速率小于该抗体与第二表位的k(off)，则可认为该抗体优先与第一表位结合。在另一非限定性实例中，如果抗体以一定的亲和力与第一表位结合，而该亲和力比该抗体与第二表位的k(off)小至少一个数量级，则可认为该抗体优先与第一表位结合。在另一非限定性实例中，如果抗体以一定的亲和力与第一表位结合，而该亲和力比该抗体与第二表位的k(off)小至少两个数量级，则可认为该抗体优先与第一表位结合。

可以认为本文所公开的抗体或者抗原结合片段、变体或衍生物以一定的解离速率(k(off))与本文所公开的靶多肽、或其片段或变体结合，其中所述的解离速率小于或等于5 X 10^-2sec^-1、10^-2sec^-1、5 X10^-3sec^-1或10^-3sec^-1。更优选地，可以认为本发明的抗体以一定的解离速率(k(off))与本文所公开的靶多肽、或其片段或变体结合，其中所述的解离速率小于或等于5 X 10^-4sec^-1、10^-4sec^-1、5 X 10^-5sec^-1、10^-5sec^-15 X 10^-6sec^-1、10^-6sec^-1、5 X 10^-7sec^-1或10^-7sec^-1。

可以认为本文所公开的抗体或者抗原结合片段、变体或衍生物以一定的结合速率(k(on))与本文所公开的靶多肽、或其片段或变体结合，其中所述的结合速率大于或等于10³M^-1sec^-1、5 X 10³M^-1sec^-1、10⁴M^-1sec^-1或5 X 10⁴M^-1sec^-1。更优选地，可以认为本发明的抗体以一定的结合速率(k(on))与本文所公开的靶多肽、或其片段或变体结合，其中所述的结合速率大于或等于10⁵M^-1sec^-1、5 X 10⁵M^-1sec^-1、10⁶M^-1sec^-1、5 X 10⁶M^-1sec^-1或10⁷M^-1sec^-1。

如果抗体优先结合给定的表位，其程度使得该抗体在一定程度上阻断了参照抗体与该表位的结合，则认为该抗体竞争性地抑制了参照抗体与所述的表位的结合。可以通过本领域中任何已知的方法(例如竞争性ELISA分析)来确定竞争性抑制。可以认为抗体竞争性地抑制了参照抗体与给定表位的结合至少90％、至少80％、至少70％、至少60％或至少50％。

如本文所用，术语“亲和力”是指个别表位与免疫球蛋白分子的CDR的结合强度的量度。例如参见Harlow et al.，Antibodies：ALaboratory Manual，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，2nded.1988)，第27-28页。术语“亲合性”是指免疫球蛋白与抗原群体之间的复合物的总体稳定性，即，免疫球蛋白与抗原形成的混合物的功能性结合强度。例如参见Harlow，第29-34页。亲合性与所述群体中个别免疫球蛋白分子与特定表位的亲和力有关，并且还与免疫球蛋白与抗原的效价有关。例如，二价单克隆抗体与具有高度重复表位结构(例如聚合物)的抗原之间的相互作用是一种高亲合性。

此外，可以根据本发明的C35抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的交叉反应性来对它们进行描述或详细说明。如本文所用，术语“交叉反应性”是指对一种抗原具有特异性的抗体与第二种抗原发生反应的能力；其为两种不同的抗原性物质之间的相关性的量度。因此，如果抗体除了与诱导其构造的一种表位结合外，还与另一种表位结合，则该抗体具有交叉反应性。交叉反应性表位通常包含与诱导表位相同的许多互补性结构特征，并且在某些情况下，交叉反应性表位实际上可以比原始的表位更合适。

例如，某些抗体具有一定程度的交叉反应性，这是因为它们与相关的但却不同的表位结合，例如与参照表位具有至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％、至少60％、至少55％、以及至少50％的一致性(其可以采用本领域已知的方法和本文所述的方法来计算)的表位。如果抗体不能结合与参照表位的一致性(其可以采用本领域已知的方法和本文所述的方法来计算)小于95％、小于90％、小于85％、小于80％、小于75％、小于70％、小于65％、小于60％、小于55％、和小于50％的表位，则可认为该抗体几乎不具有或不具有交叉反应性。如果抗体不能与某种表位的任何其他类似物、直向同源物或同源物结合，则可认为该抗体对该表位具有“高度特异性”。

此外，可以根据本发明的C35抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物与本发明多肽的结合亲和力来对它们进行描述或详细说明。优选的结合亲和力包括解离常数或Kd小于5 x 10^-2M、10^-2M、5 x 10^-3M、10^-3M、5 x 10^-4M、10^-4M、5 x 10^-5M、10^-5M、5 x 10^-6M、10^-6M、5 x 10^-7M、10^-7M、5 x 10^-8M、10^-8M、5 x 10^-9M、10^-9M、5 x 10^-10M、10^-10M、5 x 10^-11M、10^-11M、5 x 10^-12M、10^-12M、5 x 10^-13M、10^-13M、5 x 10^-14M、10^-14M、5 x 10^-15M、或10^-15M的那些。

本发明的C35抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可以是“多特异性的”，例如双特异性的、三特异性的、或者更多的多特异性，这是指其同时识别并结合存在于一个或多个不同的抗原(例如蛋白质)上的两个或更多个不同的表位。因此，不论C35抗体是“单特异性的”或“多特异性的”(例如双特异性的)，均是指与结合多肽发生反应的不同表位的数量。多特异性抗体可以对本文所述的靶多肽的不同表位具有特异性，或者可以对靶多肽以及异源表位(例如异源多肽或固体支持材料)具有特异性。

如本文所用，术语“效价”是指存在于C35抗体中、结合多肽或抗体上的潜在结合结构域(例如抗原结合结构域)的数目。每个结合结构域都特异性地与一个表位结合。当C35抗体、结合多肽或抗体包含多于1个的结合结构域时，每个结合结构域可以特异性地结合相同的表位，对于具有两个结合结构域的抗体而言，其被称为“二价单特异性”；或者每个结合结构域可以与不同的表位结合，对于具有两个结合结构域的抗体而言，其被称为“二价双特异性”。就各种特异性而言，抗体还可以是双特异性且二价的(其被称为“双特异性四价抗体”)。在另一个实施方案中，可以制备四价微型抗体或结构域缺失抗体。

双特异性二价抗体及其制备方法在(例如)美国专利序号5,731,168、5,807,706、5,821,333、以及美国公开序号2003/020734和2002/0155537中有所描述，所有这些文献的公开内容均以引用方式并入本文。双特异性四价抗体及其制备方法在(例如)WO 02/096948和WO00/44788中有所描述，这两份文献的公开内容均以引用方式并入本文。通常可参见PCT公开WO 93/17715；WO 92/08802；WO 91/00360；WO 92/05793；Tutt et al.，J.Immunol.147：60-69(1991)；美国专利序号4,474,893；4,714,681；4,925,648；5,573,920；5,601,819；Kostelny et al.，J.Immunol.148：1547-1553(1992)。

如之前所述，多种免疫球蛋白类别的恒定区的亚单元结构和三维构型是公知的。如本文所用，术语“V_H结构域”包括免疫球蛋白重链的氨基末端可变结构域，而术语“C_H1结构域”包括免疫球蛋白重链的第一(大部分的氨基末端)恒定区结构域。C_H1结构域与V_H结构域相邻，并且在免疫球蛋白重链分子的铰链区的氨基末端。

如本文所用，术语“C_H2结构域”包括例如采用常规的编号方案由抗体的约第244个残基延伸至第360个残基(第244个残基至第360个参见，Kabat编号系统；第231-340个残基，EU编号系统，参见KabatEA et al.在引文中列举)的重链分子部分。C_H2结构域是独特的，这是因为它没有与另一结构域紧密成对。而是，两条N连接的分枝糖链插入在完整的天然IgG分子的两个C_H2结构域之间。此外，已经清楚证明了C_H3结构域由C_H2结构域延伸至IgG分子的C末端，并且包含大约108个残基。

如本文所用，术语“铰链区”包括将C_H1结构域与C_H2结构域连接的重链分子的部分。该铰链区包含大约25个残基，并且是柔性的，由此使得两个N末端抗原结合区域可以独立地移动。铰链区可以被分为三个不同的结构域：上游、中部和下游铰链结构域(Roux et al.，J.Immunol.161：4083(1998))。

如本文所用，术语“二硫键”包括在两个硫原子之间形成的共价键。氨基酸半胱氨酸具有巯基，该巯基可以与第二个巯基形成二硫键或桥。在大部分天然的IgG分子中，C_H1和C_L区域通过二硫键连接，并且两条重链在对应于采用Kabat标号系统的239和242的位置(采用EU编号系统的226或229的位置)处通过二硫键连接。

如本文所用，术语“嵌合抗体”被用于指其中免疫反应性区域或位点得自或衍生自第一种物种，而恒定区(其可以是完整的、部分的或是根据本发明修饰的)得自第二种物种的任何抗体。在优选的实施方案中，靶标结合区域或位点来自非人来源(例如小鼠或灵长类动物)而恒定区是人的。

如本文所用，术语“基因工程抗体”是其中重链和/或轻链中的可变区通过以下方式被改变的抗体：通过使用来自特异性已知的抗体的一个或多个CDR的至少部分替代，以及如果需要的话，通过部分框架区替代和序列变化。虽然，CDR可以衍生自与衍生出框架区的抗体相同类别、甚至亚类的抗体，但是应该想到是CDR衍生自不同类别的抗体，并且优选地衍生自来自不同物种的抗体。其中来自特异性已知的非人抗体的一个或多个“供体”CDR被移植到人重链或轻链框架区中的基因工程抗体在本文中被称为“人源化的抗体”。并非必需使用来自供体可变区的完整CDR来替代所有的CDR，以将一个可变区的抗原结合能力转移给另一个可变区。而是仅需要转移保持靶标结合位点的活性所必需的那些残基。考虑到在例如美国专利序号5,585,089、5,693,761、5,693,762和6,180,370中提出的解释，通过进行常规的实验或者通过试误测试以获得功能性改造的或人源化的抗体在本领域技术人员的能力范围内。

如本文所用，术语“适当折叠的多肽”包括如下多肽(例如C35抗体)，其中包含所述多肽的所有功能性结构域都具有明确的活性。如本文所用，术语“非适当折叠的多肽”包括如下多肽，其中所述多肽的至少一个功能性结构域不具有活性。在一个实施方案中，适当折叠的多肽包括通过至少一个二硫键连接的多肽链，相反地，非适当折叠的多肽包括没有通过至少一个二硫键连接的多肽链。

如本文所用，术语“改造的(engineered)”包括通过合成方法(例如通过重组技术、体外肽合成、通过肽的酶或化学偶联或者这些技术的某些组合)对核酸或多肽分子进行操作。

如本文所用，术语“连接的”、“融合的”或“融合”可交换使用。这些术语是指通过包括化学缀合或重组方法在内的任何方法将两个或多个元件或成分连接在一起。“符合读框融合(in-frame fusion)”是指将两个或多个多核苷酸开放阅读框(ORF)连接起来，从而以保持原始ORF的正确翻译阅读框的方式形成连续的并且更长的ORF。因此，重组融合蛋白质是单一一种蛋白质，其包含与原始ORF所编码的多肽相对应的两个或多个节段(这些节段在天然条件下通常不会连接)。虽然由此制得了在整个融合节段中连续的阅读框，但是这些节段可以通过例如符合读框连接体序列以物理地或空间地分离。例如，可以将编码免疫球蛋白可变区的CDR的多核苷酸符合读框融合，但是通过编码至少一个免疫球蛋白框架区或其他的CDR区域的多核苷酸分开，只要“融合的”CDR作为连续多肽的一部分进行共翻译即可。

在关于多肽的内容中，“线性序列”或“序列”是指多肽中由氨基末端至羧基末端方向的氨基酸的次序，其中在所述的序列中彼此相邻的残基在所述多肽的一级结构中是相邻的。

如本文所用，术语“表达”是指如下过程，通过该过程基因产生了生物化学物质，例如多肽。所述的过程包括在细胞内呈现基因功能的任何表现，包括，但不限于基因敲减、以及瞬时表达和稳定表达。表达包括，但不限于将基因转录成信使RNA(mRNA)，以及将该mRNA翻译成多肽。如果最终需要的产物为生物化学物质，则表达包括形成该生物化学物质及其任何前体。基因的表达产生了“基因产物”。如本文所用，基因产物可以为核酸(例如通过基因转录而产生的信使RNA)或多肽(其由转录本经翻译而得到)。本文所述的基因产物进一步包括经过转录后修饰(例如聚腺苷酸化)的核酸或者经过翻译后修饰(例如甲基化、糖基化、加入脂质、与其他蛋白质亚单元连接、蛋白水解切割等)的多肽。

如本文所用，术语“治疗”或“处理”是指治疗性处理、和预防性或防护性措施，其中对受试者预防或减慢(减轻)不需要的生理学变化或紊乱，例如多发性硬化的进展。有益的或所需要的临床效果包括，但不限于缓解症状、减轻疾病的程度、稳定(即，不恶化)疾病的状态、延迟或减慢疾病的进程、改善或减轻疾病的状态、以及消除(部分或全部)疾病的状态，而无论这些是可检测的或不可检测的。与在未接受治疗下所期望的存活相比，“治疗”还可以指延长的存活。需要治疗的对象包括已经患有症状或紊乱的那些、以及倾向于患有症状或紊乱的那些或者其中症状或紊乱有待预防的那些。

“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”是指需要诊断、预后或治疗的任何受试者，特别是哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括人，家畜，农业动物，以及动物园、运动竞技或宠物动物，例如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、奶牛等。

如本文所用，短语例如“受益于施用C35抗体的受试者”和短语“需要治疗的动物”包括如下受试者，例如哺乳动物受试者，该受试者受益于所用的C35抗体的施用(例如用于检测C35多肽(例如用于诊断过程))和/或受益于使用C35抗体的治疗(即，减轻或预防疾病)。如本文更详细描述那样，C35抗体可以以非缀合方式使用或者可以以缀合与例如药品、药物前体或同位素缀合。

II.C35靶多肽

C35是一种在乳腺癌和某些其他类型的肿瘤(包括黑素瘤、结肠癌、卵巢癌、肝细胞癌和胰腺癌。)中差异表达的抗原。已经显示，C35蛋白质是异戊二烯化的，并且与内层细胞膜相连，但是在存活肿瘤细胞表面膜上不能检测到。本发明人已经制备出了多种免疫特异性识别C35表位的抗体，包括小鼠单克隆抗体、人源化的抗体和人抗体。本发明人还证明，通过使用化疗试剂或照射进行治疗诱导肿瘤细胞的细胞凋亡，使得C35暴露于表面膜上，从而允许通过C35的特异性抗体识别完整的肿瘤细胞。

C35多核苷酸和氨基酸序列(SEQ ID NOs：1和2)：

gccgcg atg agc ggg gag ccg ggg cag acg tcc gta gcg ccc cct ccc

Met Ser Gly Glu pro Gly Gln Thr Ser Val Ala pro pro Pro

1 5 10

gag gag gtc gag ccg ggc agt ggg gtc cgc atc gtg gtg gag tac tgt

Glu Glu Val Glu pro Gly Ser Gly Val Arg Ile Val Val Glu Tyr Cys

15 20 25 30

gaa ccc tgc ggc ttc gag gcg acc tac ctg gag ctg gcc agt gct gtg

Glu Pro Cys Gly phe Glu Ala Thr Tyr Leu Glu Leu Ala Ser Ala Val

35 40 45

aag gag cag tat ccg ggc atc gag atc gag tcg cgc ctc ggg ggc aca

Lys Glu Gln Tyr pro Gly Ile Glu Ile Glu Ser Arg Leu Gly Gly Thr

50 55 60

ggt gcc ttt gag ata gag ata aat gga cag ctg gtg ttc tcc aag ctg

Gly Ala phe Glu Ile Glu Ile Asn Gly Gln Leu Val phe Ser Lys Leu

65 70 75

gag aat ggg ggc ttt ccc tat gag aaa gat ctc att gag gcc atc cga

Glu Asn Gly Gly phe pro Tyr Glu Lys Asp Leu Ile Glu Ala Ile Arg

80 85 90

aga gcc agt aat gga gaa acc cta gaa aag atc acc aac agc cgt cct

Arg Ala Ser Asn Gly Glu Thr Leu Glu Lys Ile Thr Asn Ser Arg pro

95 100 105 110

ccc tgc gtc atc ctg tga

Pro Cys Val Ile Leu

115

III.C35抗体

本发明涉及：针对C35的抗体(在本文中被称为“抗C35抗体”或“C35抗体”)、编码该抗体的多核苷酸、使用C35抗体和多核苷酸治疗与C35相关的癌症的方法、以及使用C35抗体和多核苷酸进行检测和诊断的方法。此外，本发明还提供了包含C35抗体的多核苷酸的载体和宿主细胞、以及生产C35抗体的方法。如本文更详细描述的，本发明还涉及使用C35抗体来用于癌症治疗、检测和诊断的方法。上文中关于抗体的描述也适用于本文所述的C35抗体。

本发明进一步涉及用于治疗一种或多种C35癌症的基于抗体的治疗方法，其包括向受试者(优选为哺乳动物、最优选为人)施用一种本发明的C35抗体或在其他实施方案中，至少两种本发明的C35抗体。本发明的治疗性化合物包括，但不限于本发明的抗体(包括本文所述的其片段、类似物和衍生物)以及编码本发明抗体的核酸(包括本文所述的其片段、类似物和衍生物)。本发明的抗体可用于治疗、检测或诊断与C35相关的癌症，包括乳腺癌、肝癌、卵巢癌、结肠癌、胰腺癌、膀胱癌和黑素瘤。本发明的C35抗体可以以本领域已知的或者本文所述的可药用的组合物的形式提供。

本发明的抗体包括，但不限于：多克隆、单克隆、多特异性、人、人源化的或嵌合的抗体；单链抗体；scFv；双链抗体；三链抗体；四链抗体；微型抗体；结构域缺失抗体；Fab片段；F(ab’)2片段；由Fab表达库形成的片段；以及抗独特型(抗Id)抗体(包括例如针对本发明抗体的抗Id抗体)；以及上述中任一项的表位结合片段。如本文所用，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子(即，包含与抗原进行免疫特异性结合的抗原结合位点的分子)的免疫活性部分。本发明的免疫球蛋白分子可以为任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类的免疫球蛋白分子。

采用杂交瘤技术制备对C35多肽具有特异性的杂交瘤细胞系1F2.4.1和1B3.6.1(Kohler et al，Nature 256：495(1975)；Kohleret al.，Eur.J.Immunol.6：511(1976)；Kohler et al，Eur.J.Immunol.6：292(1976)；Hammerling et al.，in：MonoclonalAntibodies and T-CeI1 Hybridomas，Elsevier，N.Y.，pp.571-681(1981))。简而言之，采用标准的PEG融合使非分泌型骨髓瘤细胞系NS-1(P3/NS1/1-AG4-1，ATCC#TIB-18)与来自BALB/c小鼠的脾细胞融合来产生杂交瘤细胞系，其中所述的BALB/c小鼠使用经转导从而过表达C35的同系BCA34成纤维肿瘤细胞免疫。在对NS-1进行PEG融合之后，使杂交瘤在甲基纤维素半固体介质中生长。大约2个星期后，将杂交瘤菌落分离到96孔板中，并通过ELISA、Western印迹和免疫组织化学方法就与C35的反应性来测试各种上清液。对阳性杂交瘤菌落进行亚克隆，并就反应性筛选两次以确保克隆性。采用标准的方法，通过蛋白质G亲和纯化由杂交瘤上清液中分离抗体。在ELISA和Western印迹分析中，来自两种杂交瘤细胞系1F2和1B3的抗体特异性地与重组C35蛋白质结合。通过免疫组织化学方法，来自杂交瘤细胞系1F2的抗体还特异性地染色福尔马林固定的、石蜡包埋的C35阳性肿瘤和细胞系。此外，本发明人研发出使用来自杂交瘤细胞系1F2的、与Alexa-647荧光色素缀合的抗体，用于定量分析的细胞内染色流式细胞仪分析。这些抗体中的每一种抗体都是独特的，但是两种抗体对C35蛋白质都具有特异性。可以使来自细胞裂解物的C35蛋白质与这两种抗体中的任一种抗体进行免疫沉淀，并可以使用另一种抗体进行检测。竞争性结合ELISA测定表明，由杂交瘤细胞系1F2和1B3产生的单克隆抗体结合C35蛋白质的不同的表位。

本发明的C35抗体包括与本发明的SEQ ID NO：2所示的C35多肽、多肽片段或变体，和/或表位免疫特异性结合的抗体(其可以通过用于测试特异性抗体-抗原结合的、本领域公知的免疫分析法来进行测定)。

如本文所述，术语“分离的”是描述如下目的化合物(例如C35抗体)，该化合物处于与所述化合物天然出现的环境有所不同的环境中。“分离的”是指包括如下化合物，该化合物包含于样品中，该样品基本上富集了目的化合物和/或在所述的样品中目的化合物是部分或基本上纯化的。

如本文所用，术语“基本上富集的”和“基本上纯化的”是指化合物被从其天然环境中移取出来，并且至少60％、优选为75％、最优选为90％不含有与所述化合物天然相关的其他成分。如本文所用，与参照抗体具有“相同特异性”的抗体是指该抗体结合与参照抗体结合相同的表位。是否抗体与参照抗体结合了相同的表位的测定可以采用下文所述的分析方法来进行。

本文所讨论的由小鼠杂交瘤细胞系衍生而来的抗体为1F2和1B3。如实施例6所述，将编码这些抗体的VL区域和VH区域的多核苷酸克隆到TOPO载体中，其在表2所述的日期保藏于美国典型培养物保藏中心(“ATCC”)并给予表2中所列出的ATCC保藏编号。所述的ATCC位于10801 University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209，USA。ATCC保藏是根据布达佩斯条约的条款为了专利程序而对微生物的保藏进行国际认证来进行的。

克隆1F2G于2003年11月11日保藏于ATCC中，并给予ATCC保藏编号为PTA-5639。克隆1F2K于2003年11月11日保藏于ATCC中，并给予ATCC保藏编号为PTA-5640。克隆1B3G于2003年11月11日保藏于ATCC中，并给予ATCC保藏编号为PTA-5637。克隆1B3K于2003年11月11日保藏于ATCC中，并给予ATCC保藏编号为PTA-5638。

表2.编码小鼠抗C35可变区的经保藏的多核苷酸克隆子

多核苷酸克隆	ATCC登记号.	保藏日期
多核苷酸克隆	ATCC登记号.	保藏日期	1F2G	PTA-5639	2003年11月11日
1F2K	PTA-5640	2003年11月11日	1F2G	PTA-5639	2003年11月11日
1F2K	PTA-5640	2003年11月11日	1B3G	PTA-5637	2003年11月11日
1B3K	PTA-5638	2003年11月11日	1B3G	PTA-5637	2003年11月11日

经保藏的克隆的小鼠可变区基因和载体的部分的序列如下所示。

斜体字＝Topo载体序列(包含于经保藏的克隆中)

＝Topo载体的EcoR1克隆位点

小写字母＝5’非翻译区，其中包括generacer启动子

ATG＝鼠信号肽开始位点

粗体字＝框架区(FWR)

＝CDR1、CDR2或CDR3

下划线＝小鼠IgG1或κ恒定区的5’部分。

1F2鼠抗C35 Vγ1基因多核苷酸序列(来自克隆1F2G)

GAATTTAGCGGCCG

GCCCTTcgactggagcacggg

gaaaacatctctctcattag

aggttgatctttgaggaaaacagggtgttgcctaaaggATGAAAGTGTTGAGTCTGTTGTACCTGTTGACAGCCATT

CCTGGTATCCTGTCTGATGTACAGCTTCAGGAGTCAGGACCTGGCCTCGTGAAACCTTCT

CAGTCTCTGTCTCTCACCTGCTCTGTCACTGGCTACTCCATCACC

CDR1

TGGATCCGGCAGTTTCCAGGGAACAAACTGGAATGGATGGGC

CDR2

CGAATCTCCTTCACTCGTGACACATCT

AAGAACCAGTTTTTCCTGAAGTTTAATTCTGTGACTACTGACGACTCAGCTGCATATTA

CTGTACAAGA

TGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTC

CDR3

TGCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTA

ACTCCAAGGGC

GTTTAAACCTGCAGGACTAGTCCCTT(SEQ ID NO：3)

信号肽＝18AA

FR1＝30AA

CDR1＝6AA

FR2＝14AA

CDR2＝16AA

FR3＝32AA

CDR3＝7AA

FR4＝11AA

1F2 VH氨基酸序列(由克隆1F2G编码)

DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITSGYFWNWIRQFPGNKLEWMGYISYDGSNNSNPSLK

NRISFTRDTSKNQFFLKFNSVTTDDSAAYYCTRGTTGFAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO：4)

1F2鼠抗C35 κV基因多核苷酸序列(来自克隆1F2K)

CGC

GCCCTTcgactggagcacgagg

gaaaaattagctagggaccaaaattcaaagacaga

ATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCAGAATGTCCAGA

GGACAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGT

CACCATATCCTGC

TGGTACCAGCAGAAGCC

CDR1

AGGATCCTCCCCCAAACCCTGGATTTATGGAGTCCCTGC

CDR2

TCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAG

GCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGC

TTCGGA

CDR3

GGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCAC

CATCCAGTGAGCAAAGGGCGAATTCGTTT(SEQ ID NO：5)

信号肽＝22AA

FR1＝23AA

CDR1＝10AA

FR2＝15AA

CDR2＝7AA

FR3＝32AA

CDR3＝9AA

FR4＝10AA

1F2-VK核酸序列(由克隆1F2K编码)

QIVLTQSPAIMSASPGEKVTISCSASSSVSYMNWYQQKPGSSPKPWIYHTSNLASGVPARFSGSGS

GTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQYHSYPPTFGGGTKLEIK(SEO ID NO：6)

1B3鼠抗C35VγV基因(由克隆1B3G编码)(NC1-A7V139-D-J1(VH36-60)M13281)

CGC

GCCCTTcgactggagcacga

aaaatctctctcactggaggctgatttttgaagaa

aggggttgtagcctaaaagATGATGGTGTTAAGTCTTCTGTACCTGTTGACAGCCCTTCCGGGTATCCTG

TCAGAGGTGCAGCTTCAGGAGTCAGGACCTAGCCTCGTGAAACCTTCTCAGACTCTGTC

CCTCACCTGTTCTGTCACTGGCGACTCCATCACC

TGGATCCGGAA

CDR1

ATTCCCAGGAAATAAACTTGAATACGTGGGG

CDR2

CGAATCTCCATCACTCGAGACACATCCAAGAACCACTACTA

CCTGCAGTTGAATTCTGTGACTACTGAGGACACAGCCACATATTACTGTGCAAGA

TGGGGCGCTGGGACCACGGTCAC

CDR3

CGTCTCCTCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTAICCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCC

AAACTAACTCCAAGGGC

GTTTAAACCTGC(SEQ ID NO：7)

SIG1PEP＝18AA

FR1＝30AA

CDR1＝5AA

FR2＝14AA

CDR2＝16AA

FR3＝32AA

CDR3＝14AA

FR4＝11AA

1B3VH氨基酸序列(由克隆1B3G编码)

EVQLQESGPSLVKPSQTLSLTCSVTGDSITSGYWNWIRKFPGNKLEYVGYISYSGGTYYNPSLKSR

ISITRDTSKNHYYLQLNSVTTEDTATYYCARGAYYGGAFFPYFDVWGAGTTVTVSS(SEQ ID

NO：8)

1B3鼠抗C35κV基因(来自克隆1B3K)

SP＝20AA

FR1＝23aa

CDR1＝11aa

FR2＝15aa

CDR2＝7AA

FR3＝32aa

CDR3＝9AA

FR4＝10AA

1B3VK氨基酸序列(由克隆1B3K编码)

DVQITQSPSFLAASPGETITINCRASKYISKHLVWYQEKPGETKKLLIYSGSTLQSGLPSRFSGSGSG

TDFTLTISSLEPEDFAMYYCQQHNEYPLTFGAGTKLELK(SEQ ID NO：10)

本发明人采用在US 2002 0123057 A1(于2002年9月5日公开)中公开的方法还制备出两种C35抗体，MAb 165和MAb 171。MAb 165和MAb 171的重链可变区包含与上文所述的1B3抗体重链可变区相同的CDR3区域。其余的MAb 165和MAb 171是人来源的。本发明涉及免疫特异性结合C35多肽的抗体，其包含SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：60中所示的VH或VL区域的任意一个，或者是由SEQ IDNO：56或SEQ ID NO：60编码的VH区域与由SEQ ID NO：58编码的VL区域的组合，并且优选地是C35特异性的抗体MAb 165或MAb 171。MAb 165和MAb 171二者都包含相同的κ轻链，UH8 VK L120。

MAb 165和MAb 171的重链可变区和轻链可变区的序列如下所示。

下划线＝CDR1、CDR2或CDR3。

MAb 165 VH(141D10 VH H732)核苷酸序列：

CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTCCGGAGACCCTGTCCCTCAC

CTGCAATGTCTCTGGTGGCTCTATCGGTAGATACTATTGGAACTGGATCCGACAGTCCCCAG

CDR1

GGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGCCATATCCATTACAGTGGGAGCACCATCTACCATCCCTCC

CDR2

CTCAAGAGTCGAGTCAGCATATCGCTGGACACGTCCAAGAACCAGGTCTCCCTGAAGTTGAG

TTCTGTGACCGCTGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCACGAGGTGCTTACTACGGGGGGG

CDR3

CCTTTTTTCCTTACTTCGATGTCTGGGGCCAAGGGACCA CGGTCACCGTCTCCTCA(SEQ IDNO：56)

MAb 165 VH(141D10 VH H732)氨基酸序列：

QVQLQESGPGLVKPPETLSLTCNVSGGSIGRYYWNWIRQSPGKGLEWIGHIHYSGSTIYHPSLKSR

VSISLDTSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCARGAYYGGAFFPYFDVWGQGTTVTVSS(SEQ ID

NO：57)

MAb 171 VH(MSH3 VH H835)核苷酸序列：

CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGAGGAGGCTTAGTTCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTC

TTGTGCAGGCTCTGGATTCACCTTCAGTAGTTACTGGATGCACTGGGTC

CDR1

CGCCAAGCTCCAGGGAAGGGGCTGGTGTGGGTCTCACGTATTGACACTGATGGGAGTACCAC

AACCTACGCGGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAA

CDR2

CGCCAAGAACACACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGTCGAGGACACGGCCGTGTATT

ACTGTGCACGAGGTGCTTACTACGGGGGGGCCTTTTTTCCTTACTTCGA

CDR3

TGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO：60)

MAb 171 VH(141D10 VH H732)氨基酸序列：

QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAGSGFTFSSYWMHWVRQAPGKGLVWVSRIDTDGSTTTYADS

VKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRVEDTAVYYCARGAYYGGAFFPYFDVWGQGTTVTVSS

(SEQ ID NO：61)

UH8 VK L120核苷酸序列

GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTATGGGAGACAGAGTCACCAT

CACTTGCCGGGCGAGTCAGGGCATTAGGAATCATTTAGCCTGGTATCAG

CDR1

CAGAAACCAGGGAAAGCTCCTAATCTCCTGATCTCTGCTGCATCCACTTTGCAAT

CDR2

CAGGGGTCCCAACTCGATTCAGTGGCAGTGGATCTGGAACAGATTTCACTCTCAC

CATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGACTCTGCAACTTATTACTGCCAACAGTATAATCGGTACC

CCCTCACTTTCGGCCAA GGGACCAAGCTCGAGATCAAA(SEQ ID NO：58)

CDR3

UH8 VK L120氨基酸序列

DIQMTQSPSSLSASMGDRVTITCRASQGIRNHLAWYQQKPGKAPNLLISAASTLQSGVPTRFSGSG

SGTDFTLTISSLQPEDSATYYCQQYNRYPLTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO：59)

本发明人采用在US 2002 0123057 A1中公开的方法还制备出人C35抗体，MAbc009。本发明涉及免疫特异性结合C35多肽的抗体，该抗体包含由表3所列的多核苷酸克隆编码的VH和VL区域，并且优选地是全长人C35特异性抗体MAbc009。按照实施例6所述，将编码该抗体的VL和VH区域的多核苷酸克隆到TOPO载体中，其于表3所述的日期保藏于美国典型培养物保藏中心(“ATCC”)并给予表3中所列出的ATCC保藏编号。所述的ATCC位于10801 University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209，USA。ATCC保藏是根据布达佩斯条约的条款为了专利程序而对微生物的保藏进行国际认证来进行的。

克隆H0009于2003年11月11日保藏于ATCC中，并给予ATCC保藏编号为PTA-5641。克隆L0010于2003年11月11日保藏于ATCC中，并给予ATCC保藏编号为PTA-5542。

表3.编码人抗C35可变区的经保藏的多核苷酸克隆

多核苷酸克隆	所编码的抗体区域	ATCC登录号	保藏日期
多核苷酸克隆	所编码的抗体区域	ATCC登录号	保藏日期	H0009	MAbc009的VH	PTA-5641	2003年11月11日
L0010	MAbc009的VL	PTA-5642	2003年11月11日	H0009	MAbc009的VH	PTA-5641	2003年11月11日

经保藏的克隆的人可变区基因的序列和载体的部分的序列如下所示。

＝Topo载体的EcoR1克隆位点。

ATG＝人信号肽开始位点。

粗体字＝框架工作区域。

＝CDR1、CDR2或CDR3。

下划线＝人IgGlGS或κ恒定区。

MAbc0009 VH核苷酸序列(来自克隆H0009)

GCCCTTAATTGCGGCCGCAAACCATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTA

GCAACAGCTACAGGCGCGCACTCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGT

CCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCGTCTGGATTCAACTTCGGT

TGGGTCCGCCAGGCTCAAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCA

CDR1

CGATACACCATCTCCA

CDR2

GAGACAATTCCCAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACACCCTGAGAGCCGACGACAC

GGCTGTGTATTACTGTGCGAAA

GACTACTGGGGCCA

CDR3

GGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCA

CCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTT

AAGGGC

(SEQ ID NO：11)

MAbc0009 VH氨基酸序列(由克隆H0009编码)

EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFNFGTYAMHWVRQAQGKGLEWVALIWYDGTKKYYA

DSVKGRYTISRDNSQNTLYLQMNTLRADDTAVYYCAKSKLQGRVIDYWGQGTLVTVSS(SEQ

ID NO：12)

MAbc0009 VK核苷酸序列(来自克隆L0010)

GCCCTTAATTGCGGCCGCAAACATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTT

GGTAGCAACAGCTACAGGCGTGCACTCCGACATCCAGATGACCCAGTCTCCAGAC

TCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGC

CDR1

TGGTACCAGCAGAAACC

AGGACAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTAC

GGGGTC

CDR2

CCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGC

AGCCTGCAGGCTGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGT

CDR3

TGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGCTCGAGATCAAACGAACTGTGGCTG

CACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTC

TGTTGTGTGCCTGCTGAAAAGGGC

(SEQ ID NO：13)

MAbc0009 VK氨基酸序列(由克隆L0010编码)

IQMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPD

RFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSTPLWTFGQGTKLEIK(SEQ ID ON：14)

小鼠C35抗体具有SEQ ID No：3-10指定的重链可变区和轻链可变区。小鼠抗体1F2和1B3具有gamma1同种型和κ轻链。具有与小鼠抗体1B3相同的重链可变区CDR3的抗体MAb 165和MAb 171具有SEQ IDNOs：56-60指定的重链可变区和轻链可变区。抗体MAb 165和MAb 171具有κ轻链。人抗体MAbc009具有SEQ ID Nos：11-14指定的重链可变区和轻链可变区。人抗体MAbc009具有γ1同种型和κ轻链。

本发明人采用在US 2002 0123057 A1中公开的方法还制备出另一种人C35抗体，MAb163。本发明涉及免疫特异性结合C35多肽的抗体，该抗体包含由表4所列的多核苷酸克隆编码的VH和VL区域，并且优选地是全长人C35特异性抗体MAb163。

表4.编码人抗C35可变区的多核苷酸克隆

多核苷酸克隆	所编码的抗体区域
多核苷酸克隆	所编码的抗体区域	H730	MAb163的VH
L74	MAb163的VL	H730	MAb163的VH

载体的人可变区基因和克隆的部分的序列如下所示，其中CDR带有下划线。

MAb163的VH的氨基酸序列(来自克隆H730)

EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCEVSGITFSNAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSKTDGGTTDYA

APVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCSIGYYYDSSFKYGMDVWGQGTTVTVSS

(SEQ ID NO：62)

MAb163的VH CDR1的氨基酸序列(来自克隆H730)

GITFSNAWMS(SEQ ID NO：63)

MAb163的VH CDR2的氨基酸序列(来自克隆H730)

RIKSKTDGGTTDYAAPVKG(SEQ ID NO：64)

MAb163的VH CDR3的氨基酸序列(来自克隆H730)

GYYYDSSFKYGMDV(SEQ ID NO：65)

MAb163的VL的氨基酸序列(来自克隆L74)

DIQMTQSPATLSASVGDRVTITCRASQSISRWLAWYQQKPGQAPKVLIYKASTLQSGVPSRFSGS

GSGTEFSLTINSLQPDDFATYYCQQYYSYLRTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO：66)

MAb163的VL CDR1的氨基酸序列(来自克隆L74)

RASQSISRWLA(SEQ ID NO：67)

MAb163的VL CDR2的氨基酸序列(来自克隆L74)

KASTLQS(SEQ ID NO：68)

MAb163的VL CDR3的氨基酸序列(来自克隆L74)

QQYYSYLRT(SEQ ID NO：69)

MAb163的VH的核苷酸序列(来自克隆H730)

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTAAAGCCGGGGGGGTCCCTTAGACTCTC

CTGTGAAGTCTCTGGAATCACTTTCAGTAATGCCTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAG

CDR1

GGAAGGGGCTGGAGTGGGTTGGCCGTATTAAAAGCAAAACTGATGGTGGGACAACAGACTA

CDR2

CGCTGCACCCGTGAAAGGCAGATTCACCATCTCAAGAGATGATTCAAAAAACACGCTGTATC

TGCAAATGAACAGCCTGAAAACCGAGGACACAGCCGTGTATTATTGTAGCATAGGGTATTAC

CDR3

TATGATAGTAGTTTCAAATACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTC

CTCA(SEQ ID NO：70)

MAb163的VH CDR1的核苷酸序列(来自克隆H730)

GGAATCACTTTCAGTAATGCCTGGATGAGC(SEQ ID NO：72)

MAb163的VH CDR2的核苷酸序列(来自克隆H730)

CGTATTAAAAGCAAAACTGATGGTGGGACAACAGACTACGCTGCACCCGTGAAAGGC(SEQ

ID NO：73)

MAb163的VH CDR3的核苷酸序列(来自克隆H730)

GGGTATTACTATGATAGTAGTTTCAAATACGGTATGGACGTC(SEQ ID NO：74)

MAb163的VL的核苷酸序列(来自克隆L74)

GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTGCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCAT

CACTTGCCGGGCCAGTCAGAGTATTAGTCGGTGGTTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCAGGAC

CDR1

AAGCCCCTAAAGTCTTGATCTATAAGGCGTCTACTTTACAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTC

CDR2

AGCGGCAGTGGGTCTGGGACAGAATTCAGTCTCACCATCAACAGCCTGCAGCCTGATGATTT

TGCAACTTATTATTGCCAACAGTATTATAGTTATCTTCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGCT

CDR3

CGAGATCAAA(SEQ ID NO：71)

MAb163的VL CDR1的核苷酸序列(来自克隆L74)

CGGGCCAGTCAGAGTATTAGTCGGTGGTTGGCC(SEQ ID NO：75)

MAb163的VL CDR2的核苷酸序列(来自克隆L74)

AAGGCGTCTACTTTACAAAGT(SEQ ID NO：76)

MAb163的VL CDR3的核苷酸序列(来自克隆L74)

CAACAGTATTATAGTTATCTTCGGACG(SEQ ID NO：77)

本发明包括了免疫特异性结合C35多肽或者其片段、其变体或其融合蛋白质的抗体(包括如下分子，其包含抗体片段或其变体，或者备选地由抗体片段或其变体构成)。C35多肽包括，但不限于SEQ IDNO：2所示的C35多肽。可以通过编码SEQ ID NO：2所示多肽的核酸的重组表达来制备C35多肽(参见WO 01/74859和美国专利申请序号2004/0063907，其针对C35的包含表位的片段)。

优选地，通过保守性的氨基酸取代而得到的示例性抗体的类似物与示例性抗体不同。为了将氨基酸的取代情况划分为保守性的或非保守性的，可以将氨基酸分成以下几组：组I(疏水性侧链)，met、ala、val、leu、ile；组II(中性亲水性侧链)，cys、ser、thr；组III(酸性侧链)，asp、glu；组IV(碱性侧链)，asn、gln、his、lys、arg；组V(影响链方向的残基)，gly、pro；以及组VI(芳香侧链)，trp、tyr、phe。保守性的取代包括同一类别中的氨基酸之间的取代。非保守性的取代构成了这些类别中的一个类别的一个氨基酸与另一类别的氨基酸交换。

在本发明的一个实施方案中，免疫特异性结合C35多肽或者其片段或变体的抗体包含如下多肽，该多肽具有SEQ ID NOs：62-69中的任意一个所示的氨基酸序列，或者由表4和/或SEQ ID NO：70所示的多核苷酸编码的VH区域的氨基酸序列，或由表4和/或SEQ ID NO：71所示的多核苷酸编码的VL区域的氨基酸序列。在优选的实施方案中，本发明的抗体包含由克隆H730编码的VH区域的氨基酸序列和克隆L74编码的VL区域的氨基酸序列，参见表4。

在一些优选的实施方案中，本发明的抗体包含由克隆H730编码的VH区域的氨基酸序列和克隆L74编码的VL区域的氨基酸序列。本发明还包括了如下分子，该分子包含可免疫特异性结合C35多肽的、由表2、3或4中所示的多核苷酸中的至少一个多核苷酸编码VH和/或VL区域的抗体片段或其变体，或者备选地由这样的抗体片段或其变体构成，本发明还包括了编码这些VH和VL区域、分子、片段和/或变体的核酸分子。

本发明还提供了可免疫特异性结合C35多肽的多肽或多肽片段或变体的抗体，其中所述的抗体包含如下多肽，该多肽具有包含于由SEQID NOs：62-64或SEQ ID NO：70或者表4所示编码的VH区域中的任意一个、两个或三个VH CDR的氨基酸序列，或者备选地所述的抗体由上述多肽构成。具体而言，本发明提供了免疫特异性结合C35多肽的抗体，该抗体包含如下多肽，该多肽具有包含于由SEQ ID NO：70或表4所示编码的VH区域中的VH CDR1的氨基酸序列，或者备选地所述的抗体由上述多肽构成。在另一个实施方案中，免疫特异性结合C35多肽的抗体包含如下多肽，该多肽具有包含于由SEQ ID NO：70或表4所示编码的VH区域中的VH CDR2的氨基酸序列，或者备选地所述的抗体由上述多肽构成。在优选的实施方案中，免疫特异性结合C35多肽的抗体包含如下多肽，该多肽具有包含于由SEQ ID NO：70或表4所示编码的VH区域中的VH CDR3的氨基酸序列，或者备选地所述的抗体由上述多肽构成。本发明还包括了包含免疫特异性结合C35多肽或C35多肽片段或其变体的抗体或抗体片段或其变体的分子，或者备选地由所述的抗体或抗体片段或其变体构成的分子，本发明还包括了编码这些抗体、分子、片段和/或变体的核酸分子。

本发明还提供了免疫特异性结合C35多肽的多肽或多肽片段或变体的抗体，其中所述的抗体包含如下多肽，该多肽具有包含于由SEQ IDNO：71或者表4所示编码的VL区域中的任意一个、两个或三个VL CDR的氨基酸序列，或者备选地所述的抗体由上述多肽构成。具体而言，本发明提供了免疫特异性结合C35多肽的抗体，该抗体包含如下多肽，该多肽具有包含于由SEQ ID NO：71或表4所示编码的VL区域中的VLCDR1的氨基酸序列，或者备选地所述的抗体由上述多肽构成。在另一个实施方案中，免疫特异性结合C35多肽的抗体包含如下多肽，该多肽具有包含于由SEQ ID NO：71或表4所示编码的VL区域中的VL CDR2的氨基酸序列，或者备选地所述的抗体由上述多肽构成。在优选的实施方案中，免疫特异性结合C35多肽的抗体包含如下多肽，该多肽具有包含于由SEQ ID NO：71或表4所示的多核苷酸序列编码的VL区域中的VL CDR3的氨基酸序列，或者备选地所述的抗体由上述多肽构成。本发明还包括了包含免疫特异性结合C35多肽或C35多肽片段或其变体的抗体或抗体片段或其变体的分子，或者备选地由所述的抗体或抗体片段或其变体构成的分子，本发明还包括了编码这些抗体、分子、片段和/或变体的核酸分子。

本发明还提供了免疫特异性结合C35多肽或者C35多肽的多肽片段或其变体的抗体(包括如下分子，其包含抗体片段或其变体，或者备选地由所述的抗体片段或其变体构成)，其中所述的抗体包含由SEQID NOs：62-69所示的一个或多个多核苷酸编码的一个、两个、三个或多个VH CDR，以及一个、两个、或三个VL CDR；或者备选地所述的抗体由上述的CDR构成。具体而言，本发明提供了免疫特异性结合C35多肽的多肽、多肽片段或变体的抗体，其中所述的抗体包含由SEQ IDNOs：62-69所示的VH CDR和VL CDR中的、或者包含于由SEQ ID NOs：56、58或60或者表2、3或4所示的一个或多个多核苷酸编码的VH区域或VL区域中的VH CDR1和VL CDR1、VH CDR1和VL CDR2、VH CDR1和VL CDR3、VH CDR2和VL CDR1、VH CDR2和VL CDR2、VH CDR2和VL CDR3、VH CDR3和VH CDR1、VH CDR3和VL CDR2、VH CDR3和VL CDR3、或它们任意的组合，或者备选地所述的抗体由上述CDR构成。所述的一个、两个、三个或多个VH CDR和一个、两个、三个或多个VL CDR可以选自：克隆H0009和L0010、克隆H0009和1F2K、克隆H0009和1B3K、克隆H009和SEQ ID NO：58、克隆1F2G和1F2K、克隆1F2G和1B3K、克隆1F2G和L0010、克隆1F2G和SEQ ID NO：58、克隆1B3G和1B3K、克隆1B3G和1F2K、克隆1B3G和L0010、克隆1B3G和SEQID NO：58、SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：56和克隆L0010、SEQ ID NO：56和克隆1F2K、SEQ ID NO：56和克隆1B3K、SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60和克隆L0010、SEQID NO：60和克隆1F2K、SEQ ID NO：60和克隆1B3K、克隆H730和克隆L74、SEQ ID NO：70和克隆L74、或者克隆H730和SEQ ID NO：71。本发明还包括了包含免疫特异性结合C35多肽的抗体的片段或变体的分子，或者备选地由所述的抗体的片段或变体构成的分子，本发明还包括了编码这些抗体、分子、片段和/或变体的核酸分子。

最优选地，所述的抗体为本发明的人、嵌合的(例如人-小鼠嵌合的)或人源化的抗体，或者抗原结合抗体片段，其包括，但不限于：Fab；Fab′和F(ab′)2；Fd；单链Fvs(scFv)；双链抗体；三链抗体；四链抗体；微型抗体；单链抗体；二硫键连接的Fv(sdFv)；内抗体；以及含有VL区域或VH区域的片段。包括单链抗体的抗原结合抗体片段可以包含单独的可变区，或者可变区与以下区域的全部或部分的组合，所述的区域为：铰链区、CH1结构域、CH2结构域和CH3结构域。本发明还包括抗原结合片段，该抗原结合片段也包含可变区与铰链区、CH1结构域、CH2结构域和CH3结构域的任意组合。在本发明的治疗方法中，优选的C35抗体为含有CH2结构域缺失的那些抗体。

可以根据本发明的多肽的表位或部分来描述或详细说明本发明的抗体，其中所述抗体识别或特异性结合所述的表位或部分。按照本文所述，可以通过例如N末端和C末端的位置或者通过在相邻氨基酸残基中的大小来对所述的表位或多肽部分进行详细说明。还排除特异性结合本发明的任何表位或多肽的抗体。因此，本发明包括与本发明的多肽进行特异性结合的抗体，并且可以排除该抗体。

还可以根据本发明的抗体与本发明的多肽的结合亲和力来对所述的抗体进行描述或详细说明。优选的结合亲和力包括解离常数或Kd小于5 X 10(-7)M、10(-7)M、5 X 10(-8)M、10(-8)M、5 X 10(-9)M、10(-9)M、5 X 10(-10)M、10(-10)M、5 X 10(-11)M、10(-11)M、5 X 10(-12)M、10(-12)M、5 X 10(-13)M、10(-13)M、5 X 10(-14)M、10(-14)M、5 X 10(-15)M或10(-15)M的那些。

本发明的抗体与C35的亲和力和抗体1F2、1B3、MAb 163、MAb 165、MAb 171或MAbc009与C35的亲和力相同或近似。优选地，本发明的抗体与C35的亲和力要高于抗体1F2、1B3、MAb 163、MAb 165、MAb 171或MAbc009与C35的亲和力。在优选的实施方案中，本发明的抗体与C35的亲和力等于、近似或高于MAb163与C35的亲和力。

本发明还提供了竞争性地抑制抗体与C35表位结合的抗体，所述的竞争性抑制可以通过本领域中用于测定竞争性结合的任何已知的方法(例如本文所述的免疫测定法和抗体结合测定法)来测定。在优选的实施方案中，所述的抗体竞争性地抑制与所述的表位的结合达至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少60％或者至少50％。

此外，根据本发明抗体的交叉反应性来对该抗体进行描述或详细说明。包括不结合本发明的多肽的任何其他类似物、直向同源物和同源物的抗体。本发明还包括结合与本发明多肽的一致性(其可以采用本领域已知的方法以及本文所述的方法来计算)至少99％、至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％、至少60％、至少55％和至少50％的多肽的抗体。在具体的实施方案中，本发明的抗体与人蛋白质或其相应的表位的鼠、大鼠和/或兔的同源物发生交叉反应。本发明还包括不结合与本发明多肽的一致性(其可以采用本领域已知的方法以及本文所述的方法来计算)低于95％、低于90％、低于85％、低于80％、低于75％、低于70％、低于65％、低于60％、低于55％、低于50％的多肽的抗体。在具体的实施方案中，上文所述的交叉反应性是针对任何单一一种特异性抗原性或免疫原性的多肽或者2、3、4、5或多种本文所公开的特异性抗原性和/或免疫原性的多肽的组合。本发明进一步包括如下抗体，该抗体结合由多核苷酸编码的多肽，所述的多核苷酸在严格的杂交条件下与本发明的多核苷酸杂交(如本文所述)。

根据本发明多肽的表位或部分来对本发明的抗体进行描述或详细说明，其中所述抗体识别或特异性结合所述的表位或部分。按照本文所述，可以通过例如N末端和C末端的位置、通过在相邻氨基酸残基中的大小或者通过表和图中所列的来对所述的表位或多肽部分进行详细说明。还排除特异性结合本发明的任何表位或多肽的抗体。因此，本发明包括特异性结合本发明的多肽的抗体，并且可以排除该抗体。

在具体的实施方案中，本发明的抗体结合包含于天然C35序列的第105至115的残基所示的片段中的表位。在另一个实施方案中，本发明的抗体结合包含于天然C35序列的第53至104的残基所示的片段中的表位。在一些实施方案中，本发明的抗体结合与MAb163相同的表位。

可以根据本发明抗体的交叉反应性的存在或缺乏情况来对该抗体进行描述或详细说明。包括不结合本发明的多肽的任何其他类似物、直向同源物和同源物的抗体。本发明也包括结合与本发明多肽的一致性(其可以采用本领域已知的方法以及本文所述的方法来计算)至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％、至少60％、至少55％和至少50％的多肽的抗体。在具体的实施方案中，本发明的抗体与人蛋白质或其相应的表位的鼠、猴、大鼠和/或兔的同源物发生交叉反应。本发明也包括不结合与本发明多肽的一致性(其可以采用本领域已知的方法以及本文所述的方法来计算)低于95％、低于90％、低于85％、低于80％、低于75％、低于70％、低于65％、低于60％、低于55％、低于50％的多肽不发生结合的抗体。在具体的实施方案中，上文所述的交叉反应性是针对任何单一一种特异性抗原性或免疫原性的多肽或者2、3、4、5或多种本文所公开的特异性抗原性和/或免疫原性的多肽的组合。本发明进一步包括如下抗体，该抗体结合由多核苷酸编码的多肽，所述的多核苷酸在严格的杂交条件下与本发明的多核苷酸杂交(如本文所述)。

本发明还提供了如下抗体，该抗体包含本文所述的抗体分子(例如VH区域和/或VL区域)的变体(包括衍生物)，或者备选地该抗体由所述的变体构成，其中所述的抗体免疫特异性结合C35多肽或其片段或变体。可以使用本领域的技术人员所知的标准的技术(包括例如产生氨基酸取代的定点突变和PCR介导的突变)来向编码本发明分子的核苷酸序列中引入突变。优选地，相对于参照VH区域、VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VL区域、VLCDR1、VLCDR2或VLCDR3，所述的变体(包括衍生物)编码少于50氨基酸的取代、少于40个氨基酸的取代、少于30个氨基酸的取代、少于25个氨基酸的取代、少于20个氨基酸的取代、少于15个氨基酸的取代、少于10个氨基酸的取代、少于5个氨基酸的取代、少于4个氨基酸的取代、少于3个氨基酸的取代、少于2个氨基酸的取代。“保守性的氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有带相同电荷的侧链的氨基酸残基所代替。本领域已经定义具有带相同电荷的侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括：具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、具有β分枝侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。备选地，可以通过例如饱和突变来在编码序列的全部或一部分随机引入突变，并且可以针对生物活性来对所得的突变体进行筛选，从而鉴定出保留活性(例如结合C35多肽的能力)的突变体。

例如，可以只在抗体分子的框架区或只在抗体分子的CDR区域引入突变。所引入的突变可以是沉默突变或中性的错义突变，即，对抗体结合抗原的能力不具有影响或几乎不具有影响。这些类型的突变可用于优化密码子选择或者提高杂交瘤抗体的产量。备选地，非中性的错义突变可以改变抗体结合抗原的能力。大部分沉默突变和中性的错义突变的位置可能位于框架区中，而大部分非中性的错义突变的位置可能位于CDR中，但这不是绝对必需的。本领域的技术人员能够设计和测试具有所需性质(例如抗原结合活性没有改变或者结合活性发生改变(例如抗原结合活性中的亲和力成熟或优化或者其他改善，或者抗体特异性的变化))的突变体分子。突变后，可以按常规方式表达所编码的蛋白质，并且可以采用本文所述的技术或通过本领域已知的常规修改的技术来测定编码蛋白质的功能活性和/或生物活性(例如免疫特异性结合C35多肽的能力)。

在具体的实施方案中，免疫特异性结合C35多肽或其片段或变体的本发明的抗体(包括如下分子，该分子包含抗体片段或其变体，或者备选地，该分子由所述的抗体片段或其变体构成)包含由核苷酸序列编码的氨基酸序列，或者备选地由所述的氨基酸序列构成，其中所述的核苷酸序列在严格条件下、在高度严格的条件下或者在本领域的技术人员所知的其他严格的杂交条件下与编码VH区域或VL区域中的一种的核苷酸序列互补的核苷酸序列杂交，其中所述的VH区域或VL区域由SEQ ID NOs：56、58、60、70或71所示的或者由表2、3或4所示的一个或多个核酸所编码，其中所述的严格条件为例如在约45℃下在6x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中与滤膜结合的DNA杂交，然后在约50-65℃下在0.2xSSC/0.1％ SDS中洗涤一次或多次；所述的高度严格的条件为例如在约45℃下在6x SSC中与滤膜结合的核酸进行杂交，然后在约68℃下在0.1xSSC/0.2％SDS中洗涤一次或多次(例如参见Ausubel，F.M.et al，eds.，1989，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY，VOL.I，Green Publishing Associates，Inc.and JohnWiley & Sons，Inc.，New York，在6.3.1-6.3.6页和2.10.3页)。编码这些抗体的核酸分子也被包括在本发明的范围内。

本领域所公知的是，具有相似氨基酸序列的多肽或其片段或变体通常具有相似的结构，并且许多相同的生物活性。因此，在一个实施方案中，免疫特异性结合C35多肽或者C35多肽的片段或变体的抗体(包括如下分子，该分子包含抗体片段或其变体，或者备选地，该分子由所述的抗体片段或其变体构成)包含具有与SEQ ID NO：56、60或70所示的或者由表2、3或4所示的核酸所编码的VH区域的氨基酸序列的一致性为至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的氨基酸序列的VH区域，或者备选地所述的抗体由上述VH区域构成。

在另一个实施方案中，免疫特异性结合C35多肽或者C35多肽的片段或变体的抗体(包括如下分子，该分子包含抗体片段或其变体，或者备选地，该分子由所述的抗体片段或其变体构成)包含具有与SEQID NO：58或71所示的或者由表2、3或4所示的核酸所编码的VL区域的氨基酸序列的一致性为至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的氨基酸序列的VL区域，或者备选地所述的抗体由上述VL区域构成。

本发明还包括如下抗体(包括如下分子，该分子包含抗体片段或其变体，或者备选地，该分子由所述的抗体片段或其变体构成)，该抗体具有与本文所述的一种或多种抗体相同的一种或多种生物学特性。“生物学特征”是指抗体的体外或体内活性、或者性质，例如结合C35多肽(例如在细胞凋亡过程中在细胞表面上表达的C35多肽)的能力；基本抑制或破坏C35多肽介导的生物学活性的能力；杀死C35相关癌细胞(例如治疗或诊断C35相关癌症)或者检测C35的能力。任选地，本发明的抗体结合与本文特别指明的抗体中的至少一种相同的表位。可以采用本领域已知的测定法和下文所述的方法来以常规方式测定这种表位的结合。

还可以采用下文所述的用于制备衍生自小鼠VH和VL区域的人源化的抗体的规则来制备包含由SEQ ID NO：56、58或60所示的或者由表3所示的核酸所编码的人VH和/或VL区域的抗体变体，其中所述的小鼠VH和VL区域由表2所示的核酸编码。

本发明的人源化的免疫球蛋白和人抗体变体具有基本上来自人免疫球蛋白(称为受体免疫球蛋白)的可变框架区、和基本上来自小鼠C35VH和VL区域(其由表2所示的克隆编码)或来自人C35VH和VL区域(其由表3和4所示的克隆、以及SEQ ID NOs：70和71所示的序列编码)(称为供体免疫球蛋白)的CDR。此外，恒定区如果存在的话也基本上来自人免疫球蛋白。人源化的抗体和人抗体变体表现出对C35的特异性结合亲和力为至少10(2)、10(3)、10(4)、10(5)、10(6)、10(7)、10(8)、10(9)或10(10)M(-1)。通常，人源化的抗体和人抗体变体与人C35的结合亲和力的上限是小鼠抗体1F2或1B3、人抗体MAbc009、或者抗体MAb 163、MAb 165或MAb 171与C35的结合亲和力的3、4、5或10倍范围内。通常，人源化的抗体和人抗体变体与人C35的结合亲和力的下限同样也是小鼠抗体1F2或1B3、人抗体MAbc009、或者抗体MAb 163、MAb 165或MAb 171与C35的结合亲和力的3、4、5或10倍范围内。优选的人源化的免疫球蛋白与人抗体变体与小鼠抗体1F2或1B3、人抗体MAbc009、或者抗体MAb 163、MAb 165或MAb 171竞争与C35的结合，并阻止C35与各种小鼠或人抗体结合。

可能的人受体抗体的重链可变区和轻链可变区在Kabat，Sequences of Proteins of Immunological Interest(NationalInstitutes of Health，Bethesda，Md.，1987 and 1991)中有所描述。选择人受体抗体，使得其可变区表现出与小鼠C35抗体的可变区的高度序列一致性。重链可变框架区和轻链可变框架区可以衍生自相同或不同的人抗体序列。人抗体序列可以是天然人抗体的序列或者可以是多种人抗体的共有序列。

可以按如下方式设计人源化的免疫球蛋白。当氨基酸落入以下范畴内时，待使用的人免疫球蛋白(受体免疫球蛋白)的框架氨基酸被来自用于提供CDR的非人免疫球蛋白(供体免疫球蛋白)的框架氨基酸替代：

(a)受体免疫球蛋白的人框架区中的氨基酸通常不用于在上述位置处的人免疫球蛋白，而供体免疫球蛋白的相应氨基酸通常用于上述位置处的人免疫球蛋白；

(b)氨基酸的位置与一个CDR紧密相邻；或者

(c)氨基酸能够与CDR相互作用(分别参见Queen et al.，WO92/11018.，and Co et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88，2869(1991)，这两份文献均以引用方式并入本文)。关于人源化的免疫球蛋白的生产的详细描述参见Queen et al.和Co et al。

通常，人源化的抗体和人抗体变体中的CDR区域与该CDR区域所衍生而来的小鼠或人抗体中的相应的CDR区域基本上一致，并且更通常是一致。可以产生CDR残基的一个或多个氨基酸取代，而没有明显地影响所得人源化的免疫球蛋白或人抗体变体的结合亲和力，并且有时候，CDR区域或CDR区域范围内的取代可以增强结合亲和力。例如参见Iwahashi et al.，Mol.Immunol.36：1079-1091(1999)；Glaseret al.，J.Immunol.149(8)：2607-2614(1992)；and Tamura et al.，J.Immunol.164：1432-1441(2000)。

除了上文所述的特定的氨基酸取代以外，人源化的免疫球蛋白和人抗体变体的框架区与该框架区所衍生而来的人抗体(受体免疫球蛋白)的框架区通常基本上一致，并且更通常是一致。当然，框架区中的许多氨基酸几乎不会或不会直接有助于抗体的特异性或亲和力。因此，可以在不明显改变所得的人源化的免疫球蛋白或人抗体变体的特异性或亲和力的条件下容忍框架残基的许多单独的保守性的取代。

噬菌体展示技术提供了用于选择类似物的有力技术，所述的类似物与亲代序列具有基本上序列一致性，同时保留了结合亲和力和特异性(例如参见Dower et al.，WO 91/17271；McCafferty et al，WO92/01047；和Huse，WO 92/06204，为了任何目的，这些文献中的每份文献均全文并入本文)。

可以使用在表2、3或4或者SEQ ID NOs：56、58、60、70或71所示的核酸克隆中的VH和VL基因，根据2002年9月5日出版的US20020123057A1，“In vitro methods of producing and identifyingimmunoglobulin molecules in eukaryotic cells”所教导的方法来选择对C35具有特异性的全长人抗体。简言之，使用与人CH连接的小鼠(或人)VH以从如下轻链的库中选择全长的人免疫球蛋白轻链，当该轻链与小鼠(或人)VH配对时，会赋予针对C35的特异性。然后，使用所选的全长人免疫球蛋白轻链以从如下重链的库中选择全长的人免疫球蛋白重链，当该重链与全长人轻链配对时，会赋予针对C35的特异性。类似地，可以使用与人CL连接的小鼠(或人)VL以从如下重链的库中选择全长的人免疫球蛋白重链，当该重链与小鼠(或人)VL配对时，会赋予针对C35的特异性。然后，使用所选的全长人免疫球蛋白重链以从如下轻链的库中选择全长的人免疫球蛋白轻链，当该轻链与全长的人重链配对时，会赋予针对C35的特异性。通常，以这种方式选择的全长人抗体具有与原始的小鼠(或人)C35特异性抗体的表位特异性相同或密切相关的表位特异性。

还可以对其中所有的成员都具有一个或多个非人(例如小鼠)CDR的重链或轻链库使用US 2002 0123057 A1中所述的方法。在一个实施例中，所述库的每个成员都包含衍生自分离的、对C35具有特异性的鼠单克隆抗体(例如1F2或1B3)的CDR3区域。

本发明包括了所有全长人抗体或具有一个或多个非人(例如小鼠)CDR的抗体(包括如下分子，该分子包含抗体片段或其变体，或者备选地，该分子由所述的抗体片段或其变体构成)，其中所述的CDR是通过US 2002 0123057 A1所述的方法选择的，并且所述的抗体以SEQID NOs：56、58、60、70或71或者表2、3或4所示的核酸编码的免疫球蛋白重链可变区或轻链可变区起始。

按照上文所述的方法制备的人源化的抗体或人抗体变体的可变节段通常与免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分连接，通常与人免疫球蛋白恒定区的至少一部分连接。可以根据公知的过程从多种人细胞(例如永生化的B细胞)中分离人恒定区DNA序列(参见上文的Kabat etal.和WO 87/02671)。所述的抗体可以包含轻链恒定区和重链恒定区二者。重链恒定区可以包含CH1、铰链、CH2、CH3，有时还包含CH4区域。对于治疗目的而言，CH2区域可以缺失或省略。

人源化的抗体或人抗体变体包括具有所有类型恒定区的抗体，恒定区包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE和任何同种型(包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)。当希望人源化的抗体或人抗体变体表现出细胞毒活性时，恒定结构域通常为补体结合性恒定结构域，并且其类别通常为IgG1。当不需要这种细胞毒活性时，恒定结构域可以为IgG2类别。人源化的抗体或人抗体变体可以包含来自多于一种类别或同种型的序列。

本发明还包括了嵌合抗体。这种抗体可以包含由SEQ ID NOs：56、58、60、70或71或者表2、3或4所示的核酸编码的VH区域和/或VL区域，而该VH区域和/或VL区域与另一物种(例如人、小鼠或马，等)的CH区域和/或CL区域融合。在优选的实施方案中，嵌合抗体包含与人C区域融合的、由鼠抗C35抗体编码的VH和/或VL区域。当将抗体用于治疗目的时，人CH2结构域可以缺失。嵌合抗体包括了抗体片段，如上文所述。

按照上文所述的方法制备的嵌合抗体的可变节段通常与免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分连接，通常与人免疫球蛋白恒定区的至少一部分连接。可以根据公知的过程从多种人细胞(例如永生化的B细胞)中分离人恒定区DNA序列(参见上文的Kabat et al.和WO87/02671)。所述的抗体可以包含轻链恒定区和重链恒定区二者。重链恒定区可以包含CH1、铰链、CH2、CH3，有时还包含CH4区域。对于治疗目的而言，CH2区域可以缺失或省略。

嵌合抗体包括具有所有类型恒定区的抗体，恒定区包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE和任何同种型的抗体(包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)。当希望嵌合抗体表现出细胞毒活性时，恒定结构域通常为补体结合性恒定结构域，并且其类别通常为IgG1。当不需要这种细胞毒活性时，恒定结构域可以为IgG2类别。嵌合抗体可以包含来自多于一种类别或同种型的序列。

多种方法可以用于产生此类免疫球蛋白。由于遗传密码简并性，多种核酸序列编码每种免疫球蛋白氨基酸序列。可以通过从头固相DNA合成或者通过所希望的多核苷酸的较早制备的变体的PCR诱变产生所希望的核酸序列。编码本申请中描述的抗体的所有核酸都明确地包括在本发明内。

本发明的整体抗体、其二聚体、单独的轻链和重链或其他免疫球蛋白形式一经表达，便可根据本领域中标准的过程(包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱层析、凝胶电泳等)来进行纯化(通常参见Scopes，R.，Protein Purification，Springer-Verlag，N.Y.(1982)，该文献以参考方式并入本文)。同质性(homogeneity)为至少约90％至95％的基本纯的免疫球蛋白可优选地用于药物用途，并且同质性为98％至99％或更高的基本纯的免疫球蛋白最优选地用于药物用途。一旦部分纯化或者纯化到所希望的同质性，就可以将所述多肽治疗性(包括体外)地用于开发或者进行测定步骤、免疫荧光染色等等(一般见，Immunological Methods，Vols.I and II，Lefkovits and Pernis，eds.，Academic Press，New York，N.Y.(1979和1981)，或者检测C35或者诊断C-35相关的癌症。

本发明还提供了融合蛋白质，其包含免疫特异性结合C35多肽的抗体(包括如下分子，该分子包含抗体片段或其变体，或者备选地，该分子由所述的抗体片段或其变体构成)、以及异源多肽，或者备选地其由所述的抗体和所述的多肽构成。优选地，抗体与之融合的异源多肽可用于发挥功能或用于靶向表达C35多肽的细胞，包括，但不限于乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、膀胱癌细胞、结肠癌细胞和胰腺癌细胞、以及黑素瘤细胞。在备选的优选实施方案中，抗体与之融合的异源多肽可用于起T细胞、巨噬细胞和/或单核细胞的功能，或者用于使抗体靶向T细胞、巨噬细胞或单核细胞。在一个实施方案中，本发明的融合蛋白质包含多肽或其片段或变体、以及异源多肽序列，或者备选地所述的融合蛋白质由所述的多肽或其片段或变体、以及异源多肽序列构成，其中所述的多肽具有本发明抗体的任何一个或多个VH区域的氨基酸序列或者本发明抗体的任何一个或多个VL区域的氨基酸序列。在另一个实施方案中，本发明的融合蛋白质包含多肽或其片段或变体、以及异源多肽序列，或者备选地所述的融合蛋白质由所述的多肽或其片段或变体、以及异源多肽序列构成，其中所述的多肽具有本发明抗体的任何一个、两个、三个或多个VH CDR的氨基酸序列或者本发明抗体的任何一个、两个、三个或多个VL CDR的氨基酸序列。在优选的实施方案中，所述的融合蛋白质包含多肽或其片段或变体、以及异源多肽序列，或者备选地所述的融合蛋白质由所述的多肽或其片段或变体、以及异源多肽序列构成，其中所述的多肽具有本发明抗体的VH CDR3的氨基酸序列，并且所述的融合蛋白质免疫特异性地结合C35多肽。在另一个实施方案中，融合蛋白质包含多肽或其片段或变体、以及异源多肽序列，或者备选地所述的融合蛋白质由所述的多肽或其片段或变体、以及异源多肽序列构成，其中所述的多肽具有本发明抗体的至少一个VH区域的氨基酸序列和本发明抗体的至少一个VL区域的氨基酸序列。优选地，所述的融合蛋白质的VH和VL区域对应于本发明的单个抗体(或者scFv或Fab片段)。在另一个实施方案中，本发明的融合蛋白质包含多肽或其片段或变体、以及异源多肽序列，或者备选地所述的融合蛋白质由所述的多肽或其片段或变体、以及异源多肽序列构成，其中所述的多肽具有本发明抗体的任何一个、两个、三个或多个VH CDR的氨基酸序列和本发明抗体的任何一个、两个、三个或多个VL CDR的氨基酸序列。优选地，两个、三个、四个、五个、六个或多个VH CDR或VL CDR对应于本发明的单个抗体(或者scFv或Fab片段)。本发明还包括了编码这些融合蛋白质的核酸分子。

如下文中更详细说明的那样，本发明的抗体可以单独使用，抗体之间组合使用，或者与其他组合物组合使用。所述的抗体可以进一步重组融合至异源多肽的N末端或C末端，或者化学缀合(包括共价缀合和非共价缀合)至多肽或其他组合物。例如，本发明的抗体可以以重组融合或缀合至检测测试中用作标记物的分子、以及诸如异源多肽、药品、放射性核素或毒素之类的效应器分子。例如参见PCT公开WO92/08495、WO 91/14438、WO 89/12624、美国专利序号5,314,995和EP 396,387，这些文献均以引用方式全文并入本文。

根据另一非限定性实例，可以将本发明的抗体以被动免疫的方式施用至个体。备选地，本发明的抗体可用于表位绘图(epitopemapping)，以鉴定被所述抗体结合的表位。以这种方式鉴定的表位可以反过来例如用作疫苗候选分子，即，对个体进行免疫以引发抗天然形式的C35的抗体，从而用于治疗方法。

本发明的抗体可以作为C35多肽的激动剂或拮抗剂其作用。

本发明的抗体可用于例如，但不限于纯化、检测和靶向本发明的多肽，包括体外和体内诊断和治疗方法。例如，所述抗体用于对生物样品中的本发明多肽的水平进行定性和定量测量的免疫测定方法中。例如参见Harlow et al.，Antibodies：A Laboratory Manua l(ColdSpring Harbor Laboratory Press，2nd ed.1988)(该文献以引用方式全文并入本文)。

本发明的抗体包括修饰的衍生物，所述的修饰即为使任何类型的分子与所述的抗体共价连接，使得这种共价相连不会妨碍抗体产生抗独特型的应答或结合C35。例如但不限于，所述的抗体衍生物包括已经被修饰的抗体，所述的修饰例如通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、phosphylation、磷酸化、酰胺化、由已知的保护/封闭基团的衍生化、蛋白水解切割、与细胞配体或其他蛋白质相连等等。可以采用已知的技术进行多种化学修饰中的任何修饰，其中所述的化学修饰包括，但不限于：特异性的化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等等。此外，所述的衍生物可以包含一种或多种非典型氨基酸。

本发明的抗体可以由彼此通过肽键或经修饰的肽键而连接的氨基酸(即，肽的等排体)构成，并且可以包含除了20个基因编码的氨基酸以外的氨基酸。C35抗体可以通过天然方法(例如翻译后加工)或者通过本领域公知的化学修饰技术来进行修饰。这些修饰在基础课本中和更详细的专论中、以及在大量的研究文献中都具有较好的描述。修饰可以在C35抗体中的任何位置处发生，所述的位置包括肽骨架、氨基酸侧链、以及氨基或羧基末端。应该理解，在给定的C35抗体中，相同类型的修饰可以以相同的程度或不同的程度存在于多个位置处。此外，给定的C35抗体可以包含许多类型的修饰。C35抗体可以是分枝的，例如由于泛素化所导致，并且它们可以是环状的，具有或不具有分枝。环状、分枝、以及分枝环状的C35抗体可以通过翻译后的天然过程形成，或者可以通过合成方法形成。修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、核黄素的共价连接、亚铁血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键的形成、去甲基化、共价交联体的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、γ羧酸化、糖基化、GPI锚的形成、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊二烯化、外消旋化、硒化、硫化、由转移RNA介导的向蛋白质中加入氨基酸(例如精氨酰化)以及泛素化(例如参见PROTEINS-STRUCTURE ANDMOLECULAR PROPERTIES，2nd Ed.，T.E.Creighton，W.H.Freemanand Company，New York(1993)；POSTTRANSLATIONAL COVALENTMODIFICATION OF PROTEINS，B.C.Johnson，Ed.，Academic Press，New York，pgs.1-12(1983)；Seifter et al.，Meth Enzymol182：626-646(1990)；Rattan et al.，Ann NY Acad Sci 663：48-62(1992))。

本发明的另一实施方案涉及包含C35抗体序列的氨基酸序列的多肽，其中所述的C35抗体序列具有如下氨基酸序列，该氨基酸序列包含至少1个氨基酸取代，但不超过50个氨基酸取代，甚至更优选地不超过40个氨基酸取代，还更优选地不超过30个氨基酸取代，并且甚至还更优选地不超过20个氨基酸取代。当然，随着优选级别的逐渐增加，高度优选具有包含C35抗体序列的氨基酸序列的多肽，所述的氨基酸序列包含至少1个氨基酸取代，但不超过10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个氨基酸取代。在具体的实施方案中，C35抗体序列中的加入、取代和/或缺失的个数为1-5、5-10、5-25、5-50、10-50或50-150。就取代而言，保守性的氨基酸取代是优选的。所述的取代可以在框架区或CDR或者两者内。

该部分的说明适用于在本发明的方法中使用的C35抗体和其他抗体。这种抗体可以如本文所述的那样与毒素缀合或复合，或者可以为非缀合的或非复合的。

IV.编码C35抗体的多核苷酸

本发明还提供了编码本发明的C35抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物的核酸分子。

在一个实施方案中，本发明提供了分离的多核苷酸，其包含编码免疫球蛋白重链可变区(VH)的核酸，或者基本上由所述的核酸构成，或者由所述的核酸构成，其中所述的重链可变区的至少一个CDR或者所述的重链可变区的至少两个CDR与来自本文所公开的单克隆C35抗体的参照重链CDR1、CDR2或CDR3氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％的一致性。备选地，所述的VH的CDR1、CDR2和CDR3区域与来自本文所公开的单克隆C35抗体的参照重链CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％的一致性。因此，例如，根据该实施方案，本发明的重链可变区具有与SEQ IDNOs：62-65所示的多肽序列相关的CDR1、CDR2或CDR3多肽序列。

在某些实施方案中，包含由所述的多核苷酸编码的VH的抗体或抗原结合片段特异性地或者优先地与C35结合。

在另一个实施方案中，本发明提供了分离的多核苷酸，其包含编码免疫球蛋白重链可变区(VH)的核酸，或者基本上由所述的核酸构成，或者由所述的核酸构成，其中CDR1、CDR2和CDR3区域具有与SEQ IDNOs：62-65所示的CDR1、CDR2和CDR3群相一致的多肽序列。在某些实施方案中，包含由所述的多核苷酸编码的VH的抗体或抗原结合片段特异性地或者优先地与C35结合。

在另一个实施方案中，本发明包括分离的多核苷酸，其包含编码与SEQ ID NO：62所示的参照VH多肽序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％一致性的VH的核酸，或者基本上由所述的核酸构成，或者由所述的核酸构成。在某些实施方案中，包含由所述的多核苷酸编码的VH的抗体或抗原结合片段特异性地或者优先地与C35结合。

在其他的实施方案中，本发明包括编码重链可变区(VH)的分离的多核苷酸，其中所述的多核苷酸包含选自SEQ ID NO：70的VH核酸序列。在某些实施方案中，包含由所述的多核苷酸编码的VH的抗体或抗原结合片段特异性地或者优先地与C35结合。

在另一个实施方案中，本发明包括分离的多核苷酸，其包含与SEQID NO：70所示的序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％一致性的编码VH的核酸，或者基本上由所述的编码VH的核酸构成，或者由所述的编码VH的核酸构成。在某些实施方案中，所述的多核苷酸编码特异性地或者优先地与C35结合的VH多肽。

在另一个实施方案中，本发明提供了分离的多核苷酸，其包含编码免疫球蛋白轻链可变区(VL)的核酸，或者基本上由所述的核酸构成，或者由所述的核酸构成，其中所述的轻链可变区的至少一个CDR或者所述的轻链可变区的至少两个CDR与来自本文所公开的单克隆C35抗体的参照轻链CDR1、CDR2或CDR3氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％或100％的一致性。备选地，所述的VL的CDR1、CDR2和CDR3区域与来自本文所公开的单克隆C35抗体的参照轻链CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％的一致性。因此，例如，根据上述实施方案，本发明的轻链可变区具有与SEQ IDNOs：66-69所示的多肽序列相关的CDR1、CDR2或CDR3多肽序列。

在某些实施方案中，本发明提供了分离的多肽，其包含编码MAb163单克隆抗体的至少一个互补性决定区(CDR)或其变体的核酸序列，其中所述的多核苷酸编码特异性结合C35的多肽。在其他实施方案中，本发明提供了分离的多核苷酸，其包含编码MAb163单克隆抗体的至少两个、三个、四个、五个、六个互补性决定区(CDR)或其变体的核酸序列，其中所述的多核苷酸编码特异性结合C35的多肽。在优选的实施方案中，所述的多核苷酸包含MAb163单克隆抗体的至少一个CDR，其中所述的CDR为重链CDR3。

在某些实施方案中，包含由所述的多核苷酸编码的VL的抗体或抗原结合片段特异性地或者优先地与C35结合。

在另一个实施方案中，本发明提供了分离的多肽，其包含编码免疫球蛋白轻链可变区(VL)的核酸，或者基本上由所述的核酸构成，或者由所述的核酸构成，其中CDR1、CDR2和CDR3区域具有与SEQ IDNOs：66-69所示的CDR1、CDR2和CDR3一致的多肽序列。在某些实施方案中，包含由所述的多核苷酸编码的VL的抗体或抗原结合片段特异性地或者优先地与C35结合。

在另一个实施方案中，本发明包括分离的多核苷酸，其包含编码与选自SEQ ID NO：71的参照VL多肽序列具有至少80％、85％、90％、95％或100％的一致性的VL的核酸，或者基本上由所述的核酸构成，或者由所述的核酸构成。在某些实施方案中，包含由所述的多核苷酸编码的VL的抗体或抗原结合片段特异性地或者优先地与C35结合。

在另一方面中，本发明包括分离的多核苷酸，其包含编码VL的核酸序列，或者基本上由所述的核酸序列构成，或者由所述的核酸序列构成，其中所述的VL具有由SEQ ID NO：66构成的多肽序列。在某些实施方案中，包含由所述的多核苷酸编码的VL的抗体或抗原结合片段特异性地或者优先地与C35结合。

在另一个实施方案中，本发明包括分离的多核苷酸，其包含编码与由SEQ ID NO：66构成的参照VL多肽序列具有至少80％、85％、90％、95％或100％一致性的VL的核酸，或者基本上由所述的核酸构成，或者由所述的核酸构成。在某些实施方案中，包含由所述的多核苷酸编码的VL的抗体或抗原结合片段特异性地或者优先地与C35结合。

在另一方面中，本发明包括分离的多核苷酸，其包含编码本发明VL的核酸序列(例如SEQ ID NO：71)，或者基本上由所述的核酸序列构成，或者由所述的核酸序列构成。在某些实施方案中，包含由所述的多核苷酸编码的VL的抗体或抗原结合片段特异性地或者优先地与C35结合。

在其他实施方案中，本发明包括编码轻链可变区(VL)的分离的多核苷酸，其中所述的多核苷酸包含由SEQ ID NO：71构成的VL核酸序列。在某些实施方案中，包含由所述的多核苷酸编码的VL的抗体或抗原结合片段特异性地或者优先地与C35结合。

在另一个实施方案中，本发明包括分离的多核苷酸，其包含编码与由SEQ ID NO：71构成的VL多核苷酸具有至少80％、85％、90％、95％或100％的一致性的VL的核酸，或者基本上由所述的核酸构成，或者由所述的核酸构成。在某些实施方案中，所述的多核苷酸编码特异性地或者优先地与C35结合的VL多肽。

在某些实施方案中，包含由上文所述的一种或多种多核苷酸编码的VH或VL的抗体或其抗原结合片段，或者基本上由所述的VH或VL构成的抗体或其抗原结合片段，或者由所述的VH或VL构成的抗体或其抗原结合片段，特异性地或优先地与表位结合，而该表位与选自1F2、1B3、MAbc009、MAb 163、MAb 165或MAb 171中的单克隆抗体所结合的表位相同，或者竞争性地抑制此类单克隆抗体与C35结合。

在某些实施方案中，包含由上文所述的一种或多种多核苷酸编码的VH或VL的抗体或其抗原结合片段，或者基本上由所述的VH或VL构成的抗体或其抗原结合片段，或者由所述的VH或VL构成的抗体或其抗原结合片段，特异性地或优先地与C35多肽或其片段、或者C35变体多肽结合，其亲和力可表征为解离常数(K_D)不大于5 x 10^-2M、10^-2M、5 x 10^-3M、10^-3M、5 x 10^-4M、10^-4M、5 x 10^-5M、10^-5M、5 x 10^-6M、10^-6M、5 x 10^-7M、10^-7M、5 x 10^-8M、10^-8M、5 x 10^-9M、10^-9M、5 x 10^-10M、10^-10M、5 x 10^-11M、10^-11M、5 x 10^-12M、10^-12M、5 x 10^-13M、10^-13M、5 x 10^-14M、10^-14M、5 X 10^-15M或10^-15M。

上文所述的任意多核苷酸可以进一步包含编码例如指导编码的多肽分泌的信号肽、本文所述的抗体的恒定区、或本文所述的其他异源多肽的其他核酸。

此外，如本文中其他处所更详细描述的那样，本发明包括含有所述的多核苷酸的组合物，其中所述的多核苷酸包含一种或多种上文所述的多核苷酸。在一个实施方案中，本发明包括含有第一种多核苷酸和第二种多核苷酸的组合物，其中所述的第一种多核苷酸编码本文所述的VH多肽，并且其中所述的第二种多核苷酸编码本文所述的VL多核苷酸。具体而言，组合物包含VH多核苷酸和VL多核苷酸，或者基本上由VH多核苷酸和VL多核苷酸构成，或者由VH多核苷酸和VL多核苷酸构成，其中所述的VH多核苷酸和所述的VL多核苷酸分别为SEQID NO：70和SEQ ID NO：71。

本发明还包括本文中其他处所述的本发明的多核苷酸的片段。此外，编码本文所述的融合多核苷酸、Fab片段和其他衍生物的多核苷酸也包括在本发明内。

可以通过本领域中已知的任何方法来生产或制备所述的多核苷酸。例如，如果抗体的核苷酸序列是已知的，则编码所述抗体的多核苷酸可以由化学合成的寡核苷酸组装(例如如Kutmeier et al..BioTechniques 17：242(1994)所述)，简而言之，其包括：合成包含编码所述抗体的部分序列的重叠的寡核苷酸，退火并连接这些寡核苷酸，然后通过PCR扩增所连接的寡核苷酸。

备选地，可以由来自合适来源的核酸来制备编码C35抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸。如果包含编码特定抗体的核酸的克隆不可获得，但是所述抗体分子的序列是已知的，那么编码所述抗体的核酸可以通过化学合成，或者使用可以与所述序列的3′和5′末端杂交的合成引物通过PCR扩增从合适的来源(例如抗体cDNA文库、或者由表达所述抗体或其他C35抗体的任何组织或细胞(例如选择用于表达抗体的杂交瘤细胞)中形成的cDNA文库或者由表达所述抗体或其他C35抗体的任何组织或细胞(例如选择用于表达抗体的杂交瘤细胞)中分离的核酸(优选为poly A+RNA))处获得，或者使用对特定的基因序列具有特异性的寡核苷酸探针用于鉴定例如来自鉴定编码所述的抗体或其他C35抗体cDNA文库中的cDNA克隆而通过克隆获得。然后，采用本领域中任何公知的方法将通过PCR产生的经扩增的核酸克隆到可复制的克隆载体中。

一旦确定C35抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物的核苷酸序列和相应的氨基酸序列，便可以采用本领域中用于处理核苷酸序列的公知的方法来对其核苷酸序列进行处理，从而产生具有不同的氨基酸序列的抗体，例如产生了氨基酸取代、缺失和/或插入，其中所述的处理方法例如有重组DNA技术、定点突变、PCR等(例如参见在Sambrooket al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2d Ed.，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.(1990)和Ausubel et al.，eds.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，NY(1998)中所描述的技术，上述两份文献均以引用方式全文并入本文)。

编码C35抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸可以由任何多核糖核苷酸或者多脱氧核糖核苷酸(其可以为未修饰的RNA或DNA，或者为修饰的RNA或DNA)构成。例如，编码C35抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸可以由单链DNA、双链DNA、作为单链区域和双链区域的混合物的DNA、单链RNA、双链RNA、作为单链区域和双链区域的混合物的RNA、包含DNA和RNA的杂交分子(其可以为单链的，或者更通常地，其可以为双链的或者是单链区域与双链区域的混合物)构成。此外，编码C35抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸可以由包含RNA或DNA或此两者的三链区域构成。编码C35抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸还可以包含为了稳定或其他原因而被修饰的一个或多个修饰的碱基或者DNA或RNA骨架。“修饰的”碱基包括例如，三苯甲基化的碱基和少见的碱基(例如肌苷)。可以对DNA和RNA进行各种修饰；因此，“多核苷酸”包括化学修饰形式、酶修饰形式或代谢修饰形式。

可以通过将一个或多个核苷酸的取代、加入或缺失引入到免疫球蛋白(例如免疫球蛋白重链部分或轻链部分)的核苷酸序列中、使得一个或多个氨基酸的取代、加入或缺失被引入到所编码的蛋白质中，来产生编码衍生自所述的免疫球蛋白的多肽非天然变体的分离的多核苷酸。可以通过标准的技术(例如定点突变和PCR介导的突变)来引入突变。优选地，在一个或多个非必需的氨基酸残基处形成保守性的氨基酸取代。

V.C35抗体多肽

本发明进一步涉及构成C35抗体的分离的多肽、以及编码该多肽的多核苷酸。本发明的C35抗体包括多肽，例如编码衍生自免疫球蛋白分子的C35特异性抗原结合区域的氨基酸序列。多肽或氨基酸序列“衍生自”指定蛋白质是指多肽的来源。在某些情况下，衍生自特定的初始多肽或氨基酸序列的多肽或氨基酸序列具有与所述的初始序列或其一部分的氨基酸序列基本一致的氨基酸序列，其中所述的初始序列的一部分由至少10-20个氨基酸、至少20-30个氨基酸、至少30-50个氨基酸构成，或者另外由于具有初始序列的来源，所述的氨基酸序列可以被本领域的任一普通技术人员识别。

在一个实施方案中，本发明提供了分离的多肽，其包含免疫球蛋白重链可变区(VH)，或者基本上由免疫球蛋白重链可变区构成，或者由免疫球蛋白重链可变区构成，其中所述的重链可变区的至少一个CDR或者所述的重链可变区的至少两个CDR与来自本文所公开的单克隆C35抗体的参照重链CDR1、CDR2或CDR3氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％的一致性。备选地，所述的VH的CDR1、CDR2和CDR3区域与来自本文所公开的单克隆C35抗体的参照重链CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％的一致性。因此，根据上述实施方案，本发明的重链可变区具有与SEQ ID NOs：62-65所示的多肽序列相关的CDR1、CDR2或CDR3多肽序列。在某些实施方案中，包含由所述的多核苷酸编码的VH的抗体或抗原结合片段特异性地或者优先地与C35结合。

在另一个实施方案中，本发明提供了分离的多肽，其包含免疫球蛋白重链可变区(VH)，或者基本上由免疫球蛋白重链可变区构成，或者由免疫球蛋白重链可变区构成，其中CDR1、CDR2和CDR3区域具有与SEQ ID NOs：62-65所示的CDR1、CDR2和CDR3一致的多肽序列。在某些实施方案中，包含由所述的多核苷酸编码的VH的抗体或抗原结合片段特异性地或者优先地与C35结合。

在另一个实施方案中，本发明包括分离的多肽，其包含与SEQ IDNO：62构成的参照VH多肽序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％的一致性的VH多肽，或者基本上由所述的VH多肽构成，或者由所述的VH多肽构成。在某些实施方案中，包含所述的VH多肽的抗体或抗原结合片段特异性地或者优先地与C35结合。

在另一方面中，本发明包括分离的多肽，其包含由SEQ ID NO：62构成的VH多肽，或者基本上由所述的VH多肽构成，或者由所述的VH多肽构成。在某些实施方案中，包含所述的VH多肽的抗体或抗原结合片段特异性地或者优先地与C35结合。

在某些实施方案中，包含由上文所述的一种或多种VH多肽的抗体或其抗原结合片段，或者基本上由所述的VH多肽构成的抗体或其抗原结合片段，或者由所述的VH多肽构成的抗体或其抗原结合片段，特异性地或优先地与表位结合，而该表位与选自1F2、1B3、MAbc009、MAb163、MAb 165或MAb 171中的单克隆抗体所结合的表位相同，或者竞争性地抑制此类单克隆抗体与C35结合。

在某些实施方案中，本发明提供了分离的抗体或其抗原结合片段，其包含MAb 163单克隆抗体的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR，其中所述的抗体或片段特异性地结合C35。在优选的实施方案中，所述的抗体或其抗原结合片段包含MAb163单克隆抗体的至少三个CDR。在另一个实施方案中，所述的抗体或其抗原结合片段包含MAb163的至少一个CDR。在具体的实施方案中，所述的一个CDR为重链CDR3。

在某些实施方案中，包含上文所述的一种或多种VH多肽的抗体或其抗原结合片段，或者基本上由所述的VH多肽构成的抗体或其抗原结合片段，或者由所述的VH多肽构成的抗体或其抗原结合片段，特异性地或优先地与C35多肽或其片段、或者C35变体多肽结合，其亲和力可表征为解离常数(K_D)不大于5 x 10^-2M、10^-2M、5 x 10^-3M、10^-3M、5 x 10^-4M、10^-4M、5 x 10^-5M、10^-5M、5 x 10^-6M、10^-6M、5 x 10^-7M、10^-7M、5 x 10^-8M、10^-8M、5 x 10^-9M、10^-9M、5 x 10^-10M、10^-10M、5 x 10^-11M、10^-11M、5 x 10^-12M、10^-12M、5 x 10^-13M、10^-13M、5 x 10^-14M、10^-14M、5 x 10^-15M或10^-15M。

在另一个实施方案中，本发明提供了分离的多肽，其包含免疫球蛋白轻链可变区(VL)，或者基本上由免疫球蛋白轻链可变区构成，或者由免疫球蛋白轻链可变区构成，其中所述的轻链可变区的至少一个CDR或者所述的轻链可变区的至少两个CDR与来自本文所公开的单克隆C35抗体的参照重链CDR1、CDR2或CDR3氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％的一致性。备选地，所述的VL的CDR1、CDR2和CDR3区域与来自本文所公开的单克隆C35抗体的参照轻链CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％的一致性。因此，根据该实施方案，本发明的轻链可变区具有与SEQ ID NOs：66-69所示的多肽相关的CDR1、CDR2或CDR3多肽序列。在某些实施方案中，包含所述的VL多肽的抗体或抗原结合片段特异性地或者优先地与C35结合。

在另一个实施方案中，本发明提供了分离的多肽，其包含免疫球蛋白轻链可变区(VL)，或者基本上由免疫球蛋白轻链可变区构成，或者由免疫球蛋白轻链可变区构成，其中CDR1、CDR2和CDR3区域具有与SEQ ID NO：66所示的CDR1、CDR2和CDR3一致的多肽序列。在某些实施方案中，包含所述的VL多肽的抗体或抗原结合片段特异性地或者优先地与C35结合。

在另一个实施方案中，本发明包括分离的多肽，其包含与由SEQ IDNO：66构成的参照VL多肽序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％的一致性的VL多肽，或者基本上由所述的VL多肽构成，或者由所述的VL多肽构成。在某些实施方案中，包含所述的VL多肽的抗体或抗原结合片段特异性地或者优先地与C35结合。

在另一方面中，本发明包括分离的多肽，其包含由SEQ ID NO：66构成的VL多肽，或者基本上由所述的VL多肽构成，或者由所述的VL多肽构成。在某些实施方案中，包含所述的VL多肽的抗体或抗原结合片段特异性地或者优先地与C35结合。

在某些实施方案中，包含由上文所述的一种或多种VL多肽的抗体或其抗原结合片段，或者基本上由所述的VL多肽构成的抗体或其抗原结合片段，或者由所述的VL多肽构成的抗体或其抗原结合片段，特异性地或优先地与表位结合，而该表位与选自1F2、1B3、MAbc009、MAb163、MAb 165或MAb 171中的单克隆抗体所结合的表位相同，或者竞争性地抑制此类单克隆抗体与C35结合。

在某些实施方案中，包含上文所述的一种或多种VL多肽的抗体或其抗原结合片段，或者基本上由所述的VL多肽构成的抗体或其抗原结合片段，或者由所述的VL多肽构成的抗体或其抗原结合片段，特异性地或优先地与C35多肽或其片段、或者C35变体多肽结合，其亲和力可表征为解离常数(K_D)不大于5 x 10^-2M、10^-2M、5 x 10^-3M、10^-3M、5 x 10^-4M、10^-4M、5 x 10^-5M、10^-5M、5 x 10^-6M、10^-6M、5 x 10^-7M、10^-7M、5 x 10^-8M、10^-8M、5 x 10^-9M、10^-9M、5 x 10^-10M、10^-10M、5 x 10^-11M、10^-11M、5 x 10^-12M、10^-12M、5 x 10^-13M、10^-13M、5 x 10^-14M、10^-14M、5 X 10^-15M或10^-15M。

在其他实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含选自SEQ IDNOs：62、SEQ ID NO：66或这二者的组合中的VH多肽和VL多肽，或者基本上由所述的VH多肽和VL多肽构成，或者由所述的VH多肽和VL多肽构成。

上文所述的任何多肽可以进一步包含其他多肽，例如指导所编码的多肽分泌的信号肽、本文所述的抗体恒定区、或本文所述的其他异源多肽。此外，本发明的多肽包括在本文其他处所述的多肽片段。此外，如本文所述，本发明的多肽包括融合多肽、Fab片段和其他衍生物。

此外，如本文中其他处所详细描述的，本发明包括包含上文所述的多肽的组合物。

此外，可以被本领域的任一普通技术人员所理解的是，本文所公开的C35抗体可以经修饰，使得它们的氨基酸序列由它们衍生而来的、天然的结合多肽发生改变。例如，衍生自指定蛋白质的多肽或氨基酸序列可以是相似的，例如具有与初始序列的一定的百分率一致性，例如与初始序列的一致性可以为60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。

此外，可以在“非必需”氨基酸区域中产生导致保守性取代或变化的核苷酸或氨基酸的取代、缺失或插入。例如，衍生自指定蛋白质的多肽或氨基酸序列可以与初始序列相同，除了一个或多个单个氨基酸的取代、插入或缺失，例如一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十五个、二十个或更多个单个氨基酸的取代、插入或缺失。在某些实施方案中，衍生自指定蛋白质的多肽或氨基酸序列相对于初始序列具有1至5、1至10、1至15、或者1至20个单个氨基酸的取代、插入或缺失。

本发明的某些C35抗体多肽包含衍生自人氨基酸序列的氨基酸序列，或者基本上由所述的氨基酸序列构成，或者由所述的氨基酸序列构成。但是，某些C35抗体多肽包含一个或多个衍生自其他哺乳动物物种的相邻的氨基酸。例如，本发明的C35抗体可以包含灵长动物的重链部分、铰链部分或抗原结合区域。在另一个实施例中，一个或多个衍生自鼠的氨基酸可以存在于非鼠类的抗体多肽中，例如C35抗体的抗原结合位点中。在某些治疗性应用中，C35特异性抗体或者其抗原结合片段、或其变体或其类似物经设计，使其在施用了所述的抗体的动物中是非免疫原性的。

在某些实施方案中，C35抗体多肽包含通常与抗体无关的氨基酸序列或一个或多个部分。下文中更详述地描述了示例性的修饰。例如，本发明的单链fv抗体片段可以包含柔性连接体序列，或者可以经修饰以加入功能性的部分(例如PEG、药品、毒素或标记物)。

本发明的C35抗体多肽可以包含融合蛋白质，或者基本上由融合蛋白质构成，或者由融合蛋白质构成。融合蛋白质为嵌合分子，其包含例如：具有至少一个靶标结合位点的免疫球蛋白抗原结合结构域、和至少一个异源部分，即，自然界中非天然连接的部分。所述的氨基酸序列通常可以存在于分开的蛋白质中，并在融合多肽中被集合在一起；或者所述的氨基酸序列通常可以存在于同一蛋白质中，而在融合多肽中以新的排列方式放置。例如可以通过化学合成或者通过产生和翻译出多肽(其中肽的区域以所需的关系编码)来形成融合蛋白质。

用于多核苷酸或多肽的术语“异源的”是指多核苷酸或多肽衍生自与其相比较的其他实体不同的实体。例如，如本文所用，与C35抗体或者其抗原结合片段、变体或类似物融合的“异源多肽”衍生自同一物种的非免疫球蛋白多肽，或者不同物种的免疫球蛋白或非免疫球蛋白多肽。

“保守性的氨基酸取代”是指其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代的情况。本领域已经对具有相似侧链的氨基酸残基家族进行了定义，所述的氨基酸残基的家族包括：碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β分枝侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，免疫球蛋白多肽中的非必需氨基酸残基优选地由来自相同侧链家族中的另一种氨基酸残基替代。在另一个实施方案中，一串氨基酸可以由侧链家族成员的次序和/或组成不同的一串结构相似的氨基酸替代。

备选地，在另一个实施方案中，可以通过例如饱和突变，沿着免疫球蛋白编码序列的全部或一部分随机地引入突变，并且可以将所得的突变体引入到C35抗体中，从而用于本文所公开的诊断和治疗方法中，并就所得突变体结合所需抗原(例如C35)的能力进行筛选。

VI.融合蛋白质和抗体缀合物

如本文其他处更详细讨论的，本发明的C35抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物可以进一步在N末端或C末端与异源多肽重组融合，或者化学缀合(包括共价缀合和非共价缀合)至多肽或其他组合物。例如，C35特异性抗体可以重组融合或缀合至作为检测测定法中的标记物的分子、以及效应器分子(例如异源多肽、药品、放射性核素或毒素)。例如参见PCT公开WO 92/08495、WO 91/14438、WO89/12624、美国专利序号5,314,995和EP 396,387。

本发明的C35抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物包括修饰的衍生物，即，任何类型的分子与所述的抗体形成共价连接，使得该共价连接不会阻碍抗体与C35的结合。例如但不限于，所述的抗体衍生物包括已经通过例如糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、phosphylation、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团的衍生化、蛋白水解切割、与细胞配体或其他蛋白质连接等方式而已经被修饰的抗体。可以采用已知的技术进行多种化学修饰中的任何修饰，其中所述的化学修饰包括，但不限于：特异性的化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等等。此外，所述的衍生物可以包含一种或多种非常规的氨基酸。

本发明的C35抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物可以由彼此通过肽键或修饰的肽键(即，肽的等排体)而连接的氨基酸构成，并且可以包含除了20个基因编码的氨基酸以外的氨基酸。C35特异性抗体可以通过天然方法(例如翻译后加工)或者通过本领域公知的化学修饰技术来进行修饰。这种修饰在基础课本中和更详细的专论中、以及在大量的研究文献中都具有较好的描述。修饰可以在C35特异性抗体中的任何位置处发生，所述的位置包括肽骨架、氨基酸侧链、氨基或羧基末端、或多个部分(例如糖)。应该理解，在给定的C35特异性抗体中，相同类型的修饰可以以相同的程度或不同的程度存在于多个位置处。此外，给定的C35特异性抗体可以包含许多类型的修饰。C35特异性抗体可以是分枝的(例如由于泛素化所导致)，并且它们可以是环状的，并具有或不具有分枝。环状、分枝、以及分枝环状的C35特异性抗体可以通过翻译后的天然过程形成，或者可以通过合成方法形成。修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、核黄素的共价连接、亚铁血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键的形成、去甲基化、共价交联体的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、γ羧酸化、糖基化、GPI锚的形成、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊二烯化、外消旋化、硒化、硫化、由转运RNA介导的向蛋白质中加入氨基酸(例如精氨酰化)、以及泛素化(例如参见Proteins-Structure And Molecular Pproperties，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，New York 2nd Ed.，(1993)；POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS，B.C.Johnson，Ed.，Academic Press，NewYork，pgs.1-12(1983)；Seifter et al.，Meth Enzymol 182：626-646(1990)；Rattan et al.，Ann NY Acad Sci 663：48-62(1992))。

本发明还提供了融合蛋白质，其包含C35抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物，以及异源多肽。抗体与之融合的异源多肽可用于发挥功能或用于靶向表达C35多肽的细胞。在一个实施方案中，本发明的融合蛋白质包含多肽或其片段或变体、以及异源多肽序列，或者所述的融合蛋白质基本上由所述的多肽或其片段或变体、以及异源多肽序列构成，或者所述的融合蛋白质由所述的多肽或其片段或变体、以及异源多肽序列构成，其中所述的多肽具有本发明抗体的任何一个或多个V_H区域的氨基酸序列或者本发明抗体的任何一个或多个V_L区域的氨基酸序列。在另一个实施方案中，用于本文所述的诊断和治疗方法中的融合蛋白质包含多肽或其片段或变体、以及异源多肽序列，或者所述的融合蛋白质基本上由所述的多肽或其片段或变体、以及异源多肽序列构成，或者所述的融合蛋白质由所述的多肽或其片段或变体、以及异源多肽序列构成，其中所述的多肽具有C35特异性抗体或者其片段、或变体或衍生物的任何一个、两个、三个V_HCDR的氨基酸序列或者C35特异性抗体或者其片段、或变体或衍生物的任何一个、两个、三个V_LCDR的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述的融合蛋白质包含多肽或其片段或其衍生物或其变体、以及异源多肽序列，其中所述的多肽具有本发明C35特异性抗体的V_HCDR3的氨基酸序列，并且所述的融合蛋白质特异性结合C35的至少一个表位。在另一个实施方案中，融合蛋白质包含多肽或其片段或其衍生物或其变体、以及异源多肽序列，其中所述的多肽具有本发明C35特异性抗体的至少一个V_H区域的氨基酸序列和本发明C35特异性抗体的至少一个V_L区域的氨基酸序列。优选地，所述的融合蛋白质的V_H和V_L区域对应于特异性结合C35的至少一个表位的单一来源的抗体(或者scFv或Fab片段)。在另一个实施方案中，用于本文所述的诊断和治疗方法中的融合蛋白质包含多肽或其片段或变体、以及异源多肽序列，其中所述的多肽具有C35特异性抗体的任何一个、两个、三个或多个V_HCDR的氨基酸序列和C35特异性抗体的任何一个、两个、三个或多个V_LCDR的氨基酸序列。优选地，两个、三个、四个、五个、六个或多个V_HCDR或V_LCDR对应于本发明的单一来源的抗体(或者scFv或Fab片段)。本发明还包括编码所述的融合蛋白质的核酸分子。

文献中报道的示例性融合蛋白质包括以下物质的融合物，所述的物质为T细胞受体(Gascoigne et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：2936-2940(1987))；CD4(Capon et al.，Nature 537：525-531(1989)；Traunecker et al，Nature 339：68-70(1989)；Zettmeisslet al.，DNA Cell Biol.USA P：347-353(1990)；和Byrn et al，Nature 344：667-670(1990))；L-选择蛋白(归巢受体)(Watson etal，J.Cell.Biol.110：2221-2229(1990)；和Watson et al，Nature349：164-167(1991))；CD44(Aruffo et al，Cell 61：1303-1313(1990))；CD28和B7(Linsley et al，J.Exp.Med.173：721-730(1991))；CTLA-4(Lisley et al，J.Exp.Med.174：561-569(1991))；CD22(Stamenkovic et al，Cell 66：1133-1144(1991))；TNF受体(Ashkenazi et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：10535-10539(1991)；Lesslauer et al，Eur.J.Immunol..27：2883-2886(1991)；和Peppel et al，J.Exp.Med.174：1483-1489(1991))；以及IgE受体(Ridgway和Gorman，J.Cell.Biol.Vol.115，Abstract No.1448(1991))。

如本文中其他处所述，可以将本发明的C35抗体或者其抗原结合片段、或其变体、或其衍生物融合到异源多肽中，以增长所述多肽的体内半衰期，或者用于使用本领域已知的方法的免疫测定。例如，在一个实施方案中，PEG可以与本发明的C35抗体缀合，从而增长它们的体内半衰期(Leong，S.R.，et al.，Cytokine 16：106(2001)；Adv.in Drug Deliv.Rev.54：531(2002)；or Weir et al.，Biochem.Soc.Transactions 30：512(2002))。

此外，本发明的C35抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物可以被融合到标记物序列(例如肽)中，从而有利于它们的纯化和检测。在优选的实施方案中，所述的标记物氨基酸序列为六组氨酸的肽，例如pQE载体(QIAGEN，Inc.，9259 Eton Avenue，Chatsworth，Calif.，91311)中提供的标签等，许多这种标记物是市售可得的。例如，如Gentz等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：821-824(1989)所述，六组氨酸提供融合蛋白质的方便的纯化方法。可用于纯化的其他肽标签包括，但不限于“HA”标签，其对应于衍生自流感血凝素蛋白质的表位(Wilson et al.，Cell 37：767(1984))和“flag”标签。

可以采用本领域公知的方法来制备融合蛋白质(例如参见美国专利序号5,116,964和5,225,538)。可以凭经验选择进行融合的精确位点，从而优化融合蛋白质的分泌或结合特征。然后，将编码融合蛋白质的DNA转染到宿主细胞中，以用于表达。

本发明的C35抗体可以以非缀合的形式使用，或者可以与多种分子中的至少一种缀合，从而例如改善所述分子的治疗性质，以有助于靶标的检测，或者用于患者的成像或治疗。当进行纯化时，可以在纯化之前或纯化之后将本发明的C35抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物标记或缀合。

具体而言，可以将本发明的C35抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物缀合至治疗性试剂、前体药物、肽、蛋白质、酶、病毒、脂质、生物应答修饰剂、药物试剂或PEG。

本领域的技术人员可以理解的是，还可以根据所选的待缀合的试剂来采用多种技术对缀合物进行组装。例如，通过例如使结合多肽与生物素的活化酯(例如生物素N-羟基琥珀酸亚胺酯)发生反应来制备具有生物素的缀合物。类似地，在偶联剂(例如本文所列出的那些)存在下，或者通过与异硫氰酸酯(优选为异硫氰酸荧光素)反应来制备具有荧光标记物的缀合物。可以按照类似的方式制备本发明的C35抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物的缀合物。

本发明还包括了缀合至诊断试剂或治疗性试剂的本发明的C35抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物。所述的C35抗体可以在诊断中使用，例如，作为临床检验过程的一部分来监测疾病的发展或进程，以例如确定给定的治疗和/或预防方案的效果。可以通过使C35抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物与可检测的物质偶联来帮助检测。可检测物质的实例包括多种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性材料、利用了各种正电子发射断层显像的正电子发射金属、以及非放射性的顺磁金属离子。例如参见美国专利序号4,741,900中的金属离子，该金属离子可以与抗体缀合从而用于根据本发明的诊断剂。合适的酶的实例包括：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的实例包括：链霉亲核素/生物素、以及抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光材料的实例包括：伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的实例包括鲁米诺(luminol)；生物发光材料的实例包括：荧光素酶、萤光素和发光蛋白质；合适的放射性材料的实例包括¹²⁵I、¹³¹I、¹¹¹In或⁹⁹Tc。

还可以通过将C35抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物与化学发光化合物偶联来可检测地标记所述的C35抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物。然后，通过检测在发生化学反应的过程中产生的荧光的存在来确定化学发光标记的C35抗体的存在情况。具体可用的化学发光标记化合物的实例为鲁米诺、异鲁米诺(isoluminol)、theromatic吖啶酯、咪唑、吖啶盐和草酸酯。

C35抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物被可检测地标记的一种方式是通过将所述的C35抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物与酶连接，并在酶免疫测定(EIA)中使用所得的连接产物(Voller，A.，＂The Enzyme Linked Immunosorbent Assay(ELISA)＂Microbiological Associates Quarterly Publication，Walkersville，Md.，Diagnostic Horizons 2：1-7(1978)；Voller etal.，J.Clin.Pathol.31：507-520(1978)；Butler，J.E.，Meth.Enrymol.73：482-523(1981)；Maggio，E.(ed.)，EnzymeImmunoassay，CRC Press，Boca Raton，Fla.，(1980)；Ishikawa，E.et al.，(eds.)，Enzyme Immunoassay，Kgaku Shoin，Tokyo(1981))。与所述的C35抗体结合的酶与合适的底物(优选地显色底物)反应，以这种方式使得产生可以通过例如分光光度法、荧光法或目测方式检测的化学部分。可以用于以可检测地标记抗体的酶包括，但不限于：苹果酸脱氢酶、金黄色葡萄球菌核酸酶、δ-5-类固醇异构酶、酵母乙醇脱氢酶、α-磷酸甘油脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡萄糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。此外，可以通过使用酶的显色底物的比色方法来完成所述的检测。还可以通过将底物的酶反应的程度与相似制备的标准品进行目视比较来完成检测。

还可以采用多种其他免疫测定法中的任何方法来完成检测。例如，使用放射性标记C35抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物，可以通过利用放射性免疫测定(RIA)来检测抗体(例如参见Weintraub，B.，Principles of Radioimmunoassays，Seventh Training Course onRadioligand Assay Techniques，The Endocrine Society，(March，1986)，这些文献以引用方式并入本文)。可以通过使用包括，但不限于γ计数器、闪烁计数器或放射自显影术在内的方法来检测放射性同位素。

还可以采用荧光发射金属(例如¹⁵²Eu或镧系的其他元素)可检测地标记C35抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物。利用例如二乙烯三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)的金属的螯合基团将这些金属与所述的抗体连接。

用于将各种部分缀合至C35抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物的技术是公知的，例如参见Arnon et al.，＂MonoclonalAntibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy＂，inMonoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld et al.(eds.)，pp.243-56(Alan R.Liss，Inc.(1985)；Hellstrom et al.，＂Antibodies For Drug Delivery＂，in Controlled Drug Delivery(2nd Ed.)，Robinson et al.(eds.)，Marcel Dekker，Inc.，pp.623-53(1987)；Thorpe，＂Antibody Carriers Of Cytotoxic AgentsIn Cancer Therapy：A Review＂，in Monoclona lAntibodies′84：Biological And Clinical Applications，Pinchera et al.(eds.)，pp.475-506(1985)；＂Analysis，Results，And Future ProspectiveOf The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In CancerTherapy＂，in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection AndTherapy，Baldwin et al.(eds.)，Academic Press pp.303-16(1985)，以及Thorpe et al.，＂The Preparation And CytotoxicProperties Of Antibody-Toxin Conjugates＂，Immunol.Rev.62：119-58(1982)。这些文献的每一份文献均全文并入本文。

VII.抗体多肽的表达

如所公知的那样，可以采用标准的技术(例如异硫氰胍提取并沉淀，然后进行离心或层析)来从原始的杂交瘤细胞或从其他的转化细胞中分离RNA。如需要，可以采用标准的技术(例如层析)在寡dT纤维素上从总RNA中分离mRNA。合适的技术是本领域熟悉的。

在一个实施方案中，根据公知的方法，可以使用逆转录酶和DNA聚合酶同时或分开制备编码所述抗体的轻链和重链的cDNA。可以根据所公开的重链和轻链DNA以及氨基酸序列，通过共有的恒定区引物或通过更具有特异性的引物来开始PCR。如上文所讨论的那样，还可以利用PCR来分离编码抗体轻链和重链的DNA克隆。在这种情况下，可以使用共有引物或更大的同源探针(例如小鼠恒定区探针)筛选文库。

可以采用本领域已知的技术从细胞中分离DNA，通常为质粒DNA，然后根据详细阐明(例如在关于重组DNA技术的现有文献中)的标准的公知的技术来制作限制性图谱并测序。当然，可以在分离过程或随后的分析过程中的任何时间点，根据本发明合成DNA。

在对用于提供本发明的C35抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物的分离的基因材料进行处理后，通常将编码C35抗体的多核苷酸插入到用于引入宿主细胞中的表达载体中，其中所述的宿主细胞可以用于产生所需量的C35抗体。

与本文所述的靶分子(例如C35)结合的抗体或者其片段、衍生物或类似物(例如抗体的重链或轻链)的重组表达需要构建包含编码所述抗体的多核苷酸的表达载体。编码本发明的抗体分子或者抗体的重链或轻链、或者其部分(优选包含重链或轻链可变结构域)的多核苷酸一经获得，便可以采用本领域公知的技术通过重组DNA技术制备用于产生所述的抗体分子的载体。因此，本文描述了通过表达包含编码抗体的核苷酸序列的多核苷酸来制备蛋白质的方法。可以使用本领域的技术人员公知的方法来构建表达载体，所述的表达载体包含抗体编码序列、以及合适的转录和反应的调控信号。这些方法包括例如体内重组DNA技术、合成技术和体内基因重组。因此，本发明提供了可复制的载体，其包含与启动子可操作地连接的、编码本发明抗体分子或者其重链或轻链、或重链或轻链可变结构域的核苷酸序列。这种载体可以包含编码所述的抗体分子的恒定区的核苷酸序列(例如参见PCT公开WO 86/05807；PCT公开WO 89/01036；和美国专利序号5,122,464)，并且所述抗体的可变结构域可以被克隆到这种载体中，以用于表达完整的重链或轻链。

术语“载体”或“表达载体”在本文中用于指根据本发明使用的、作为用于引入到宿主细胞中并在宿主细胞中表达所需的基因的媒介物的载体。如本领域的技术人员所知道的那样，这种载体可以容易地选自质粒、噬菌体、病毒和逆转录病毒。通常，与本发明相容的载体包含选择标记物、有助于克隆所需基因的合适的限制性位点、以及进入真核或原核细胞和/或在真核或原核细胞中复制的能力。

为了实现本发明的目的，可以使用多种表达载系统统。例如，类中类别的载体使用了衍生自动物病毒(例如牛乳头瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、牛痘病毒、杆状病毒、逆转录病毒(RSV、MMTV或MOMLV)或SV40病毒)的DNA元件。其他涉及使用具有内部核糖体结合位点的多顺反子系统。此外，可以通过引入可对转染的宿主细胞进行选择一种或多种标记物来选择将所述DNA整合到其染色体中的细胞。所述的标记物可以提供针对营养缺陷型宿主的原营养、生物杀灭剂的抗性(例如抗生素)或者对重金属(例如铜)的抗性。可选择的标记物基因可以直接与待表达的DNA序列相连，或者通过共转化而被引入到相同的细胞中。还需要其他元件用于mRNA的最佳合成。这些元件包括信号序列、拼接信号、以及转录启动子、增强子和终止信号。

在特别优选的实施方案中，将克隆的可变区基因与按照上文所述合成的重链和轻链恒定区基因(优选为人的)一起插入到表达载体中。当然，本发明可以使用能够在真核细胞中引发表达的任何表达载体。合适的载体的实例包括，但不限于：质粒pcDNA3、pHCMV/Zeo、pCR3.1、pEF1/His、pIND/GS、pRc/HCMV2、pSV40/Zeo2、pTRACER-HCMV、pUB6/V5-His、pVAX1和pZeoSV2(来自Invitrogen，San Diego，CA)以及质粒pCI(来自Promega，Madison，WI)。通常，就表达了适当高水平的免疫球蛋白重链和轻链的细胞筛选大量转化细胞为常规试验，其可以通过(例如)自动系统来进行。

更通常的是，一旦制备出编码C35抗体的单体亚单元的载体或DNA序列，便可以将表达载体引入到合适的宿主细胞中。可以采用本领域的技术人员公知的多种技术来完成质粒向宿主细胞中的引入。这些技术包括，但不限于：转染(包括电泳和电穿孔)、原生质体融合、磷酸钙沉淀、使用包膜DNA的细胞融合、显微注射以及使用完整病毒进行感染。参见Ridgway，A.A.G.＂Mammalian Expression Vectors＂Vectors，Rodriguez和Denhardt，Eds.，Butterworths，Boston，Mass.，Chapter 24.2，pp.470-472(1988)。通常，向宿主中引入质粒是通过电穿孔进行的。使包含表达构建体的宿主细胞在适于产生轻链和重链的条件下生长，并就重链和/或轻链蛋白质的合成进行测试。示例性的测试技术包括酶联免疫吸附测试(ELISA)、放射性免疫测定(RIA)、荧光激活细胞分拣仪分析(FACS)、免疫组织化学等。

通过常规技术将表达载体转移到宿主细胞中，然后通过常规技术培养转染的细胞，从而产生在本文所述的方法中使用的抗体。因此，本发明包括宿主细胞，其包含编码与异源启动子可操作地连接的、本发明抗体或其片段或者其重链或轻链的多核苷酸。在用于表达双链抗体的优选实施方案中，可以将既编码重链又编码轻链的载体在宿主细胞中共表达，从而表达完整的免疫球蛋白分子，如下文所述。

如本文所用，“宿主细胞”是指如下细胞，其包含采用重组DNA技术构建的并编码至少一个异源基因的载体。在从重组细胞分离抗体的过程的描述中，除非明确作出相反的说明，否则术语“细胞”和“细胞培养物”可交换使用，以表示抗体的来源。换言之，从“细胞”中回收多肽可以指由经离心的完整细胞中得到，或者由包含培养基和悬浮细胞的细胞培养物中得到。

可以使用多种宿主表达载体系统来表达在本文所述的方法中使用的抗体分子。这种宿主表达系统代表了如下媒介物，通过该媒介物，可以产生并随后纯化目的编码序列，而且所述的宿主表达系统还代表了如下细胞，当使用合适的核苷酸编码序列对该细胞进行转化或转染时，其可以原位表达本发明的抗体分子。这种宿主表达系统包括，但不限于如下微生物：使用包含抗体编码序列的重组细菌噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的诸如细菌(例如大肠杆菌、枯草杆菌(B.subtilis))；使用包含抗体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如啤酒酵母(Saccharomyces)、毕赤酵母(pichia))；使用包含抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；使用重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaic virus，CaMV)、烟草花叶病毒(tobacco mosaicvirus，TMV))感染的、或者使用包含抗体编码序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统；或者包含重组表达构建体(其包含衍生自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子)或衍生自哺乳动物病毒基因组(例如腺病毒晚期启动子、牛痘病毒7.5K启动子)的启动子)的哺乳动物细胞系统(例如COS、CHO、BLK、293、3T3细胞)。优选地使用专门用于表达完整重组抗体分子的诸如大肠杆菌之类的细菌细胞，更优选地是真核细胞，来表达重组抗体分子。例如，诸如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)之类的哺乳动物细胞与诸如来自人细胞巨化病毒的主要即刻早期基因启动子之类的载体相联合，是对于抗体的有效的表达系统(Foecking et al.，Gene 45：101(1986)；Cockett et al.，Bio/Technology 8：2(1990))。

用于蛋白质表达的宿主细胞系通常是哺乳动物来源的；相信本领域的技术人员具有优先地确定具体的宿主细胞系的能力，所述的宿主细胞系最适合本文所述的、待表达的所需的基因产物。示例性的宿主细胞系包括，但不限于：CHO(中国仓鼠卵巢细胞)、DG44和DUXB11(中国仓鼠卵巢细胞系，DHFR缺陷)、HELA(人子宫颈癌)、CVI(猴肾细胞系)、COS(具有SV40 T抗原的CVI衍生物)、VERY、BHK(幼仓鼠肾细胞)、MDCK、293、WI38、R1610(中国仓鼠成纤维细胞)、BALBC/3T3(小鼠成纤维细胞)、HAK(仓鼠肾细胞系)、SP2/0(小鼠骨髓瘤细胞)、P3x63-Ag3.653(小鼠骨髓瘤细胞)、BFA-1c1BPT(牛内皮细胞)、RAJI(人淋巴细胞)和293(人肾细胞)。宿主细胞系通常来自商业机构、美国组织培养物保藏中心(American Tissue Culture Collection)或者来自公开的文献。

此外，可以选择调节插入序列的表达、或者以所需的特定方式修饰并加工基因产物的宿主细胞株。蛋白质产物的修饰(例如糖基化)和加工(例如切割)对于所述蛋白质的功能而言是重要的。对于蛋白质和基因产物的翻译后加工和修饰而言，不同的宿主细胞具有特征性且特异性的机制。可以选择合适的细胞系或宿主系统，以确保所表达的外源蛋白质的正确修饰和加工。至此，可以使用如下真核宿主细胞，其具有初始转录本进行适当的加工，并对基因产物进行糖基化和磷酸化的细胞机制。

为了长期、高产量地产生重组蛋白质，稳定的表达是优选的。例如，稳定地表达抗体分子的细胞系可以是经改造的。不使用包含病毒来源的复制物的表达载体，可以使用由合适的表达调控元件(例如启动子、增强子、序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点等)和可选择的标记物调控的DNA来转化宿主细胞。在引入了外源DNA之后，可以使改造的细胞在富集培养基中生长1-2天，然后转换到选择性培养基中。重组质粒中的可选择标记物赋予了选择抗性，从而使细胞可以稳定地将质粒整合到其染色体中，并生长形成转化灶(foci)，该转化灶反过来可以被克隆并扩展到细胞系中。可以有利地使用该方法来对稳定表达抗体分子的细胞系进行改造。

可以分别在tk-、hgprt-或aprt-细胞中使用大量的选择系统，包括，但不限于：单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler et al.，Cell 11：223(1977))基因、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska &Szybalski，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48：202(1992))基因和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy et al.，Cell 22：8171980)基因。此外，可以利用以下基因产生的抗代谢物的抗性来作为选择基础，所述的基因为：dhfr，其赋予了对甲氨蝶呤的抗性(Wigler et al.，Natl.Acad.Sci.USA 77：357(1980)；O’Hare et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：1527(1981))；gpt，其赋予了对霉酚酸的抗性(Mulligan& Berg，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：2072(1981))；neo，其赋予了对氨基糖苷G-418的抗性(Clinical Pharmacy 12：488-505；Wuand Wu，Biotherapy 3：87-95(1991)；Tolstoshev，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32：573-596(1993)；Mulligan，Science260：926-932(1993)；以及Morgan and Anderson，Ann.Rev.Biochem.62：191-217(1993)；TIB TECH 11(5)：155-215(May，1993)；以及hygro，其赋予对潮霉素的抗性(Santerre et al.，Gene 30：147(1984))。可以使用的、在重组DNA技术领域中通常已知的方法在Ausubel et al.(eds.)，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，NY(1993)；Kriegler，Gene Transfer andExpression，A Laboratory Manual，Stockton Press，NY(1990)；以及在Chapters 12 and 13，Dracopoli et al.(eds)，CurrentProlocols in Human Genetics，John Wiley & Sons，NY(1994)；Colberre-Garapin et al.，J.Mol.Biol.150：1(1981)中有所描述，这些文献以引用方式全文并入本文。

可以通过载体的扩增来提高抗体分子的表达水平(综述，参见Bebbington and Hentschel，The use of vectors based on geneamplification for the expression of cloned genes in mammaliancells in DNA cloning，Academic Press，New York，Vol.3.(1987))。当表达抗体的载体系统中的标记物是可扩增的时，宿主细胞培养物中存在的抑制剂的水平提高会增加标记物基因的拷贝数。由于所扩增的区域与抗体基因有关，所述抗体的产量也增高(Grouse et al.，Mol.Cell.Biol.3：257(1983))。

在体外，可以放大产量，从而得到大量所需的多肽。用于在组织培养条件下培养哺乳动物细胞的技术是本领域已知的，包括在例如气升式反应器或连续搅拌反应器中的异源悬浮培养或者在例如中空纤维、微囊中、琼脂糖微珠或陶瓷筒上的固定化或截留的细胞培养。如果必需和/或需要，多肽溶液可以在例如优先生物合成合成的铰链区多肽之后、或者在进行本文所述的HIC层析步骤之前或之后通过常规的层析方法(例如凝胶过滤、离子交换层析、在DEAE纤维素上层析或(免疫)亲和层析)来纯化。

编码本发明的C35抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物的基因还可以在诸如细菌、酵母或植物细胞之类的非哺乳动物细胞中表达。容易获得核酸的细菌包括：肠杆菌科的成员，例如大肠杆菌或沙门氏菌菌株；芽孢杆菌科的成员，例如枯草杆菌(Bacillus subtilis)；肺炎球菌属的成员；链球菌属的成员；以及流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)。应该进一步理解，当异源多肽在细菌中表达时，该异源多肽通常成为包涵体的一部分。必须将异源多肽分离、纯化，然后组装到功能分子中。在需要抗体的四价形式时，可以将亚单元自组装到四价抗体中(WO02/096948A2)。

在细菌系统中，可以根据所计划的表达的抗体分子的用途来有利地选择多种表达载体。例如，当准备产生大量的所述蛋白质用于制备抗体分子的药物组合物时，指导了融合蛋白质产物(其易于纯化)高水平表达的载体是理想的。这种表达载体包括，但不限于：大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther et al.，EMBO J.2：1791(1983))，其中可以将抗体编码序列单独地连接到所述载体的lacZ编码区域的框架中，从而产生融合蛋白质；pIN载体(Inouye & Inouye，Nucleic AcidsRes.13：3101-3109(1985)；Van Heeke & Schuster，J.Biol.Chem.24：5503-5509(1989))等。还可以使用pGEX载体表达与谷胱甘肽S-转移酶(GST)形成融合蛋白质的外源多肽。通常，这种融合蛋白质是可溶的，并且可以通过吸附并结合到基质谷胱甘肽琼脂糖珠子上、然后通过在游离谷胱甘肽存在的条件下洗脱，从裂解细胞中纯化。pGEX载体经设计以包含凝血酶或因子Xa蛋白酶切割位点，使得可以从GST部分中释放出克隆的目标基因产物。

除了原核生物外，还可以使用真核微生物。在真核微生物中，最通常使用的是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或普通的发酵面包酵母，但是大量的其他菌株(例如巴斯德毕赤酵母(pichiapastoris))通常也可以利用。

为了在酿酒酵母(Saccharomyces)中表达，通常使用例如质粒YRp7(Stinchcomb et al.，Nature 282：39(1979)；Kingsman et al.，Gene 7：141(1979)；Tschemper et al.，Gene 10：157(1980))。这种质粒已经包含了TRP1基因，该基因提供了缺乏在色氨酸中生长的能力的酵母突变株(例如ATCC No.44076或PEP4-1)的选择标记物(Jones，Genetics 85：12(1977))。那么，作为酵母宿主细胞基因组特征的trp1的损坏提供了用于通过缺乏色氨酸条件中生长检测转化的有效环境。

在昆虫系统中，通常使用苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒(AcNPV)作为表达外源基因的载体。该病毒在草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞中生长。可以将抗体编码序列单独地克隆到所述病毒的非必需区域(例如多角体蛋白基因)中，并置于AcNPV启动子(例如多角体蛋白启动子)的调控之下。

一旦本发明的抗体分子被重组表达，便可以通过用于纯化免疫球蛋白分子领域中的任何已知的方法(例如层析(例如离子交换层析、亲和层析，特别是对蛋白质A之后的特异性抗原的亲和层析)以及分子筛柱层析)、离心、差异溶解或用于纯化蛋白质的任何其他标准的技术)来纯化该抗体分子。备选地，用于增加本发明抗体的亲和力的优选方法在US 2002/0123057 A1中有所公开。

VIII.使用治疗性C35抗体的治疗方法

本发明涉及使用C35抗体来治疗过度增殖性疾病，例如治疗癌症。在一些实施方案中，可以施用一种C35抗体。在另一个实施方案中，施用两种或多种C35抗体，优选施用两种C35抗体。此外，所述的一种或多种抗体可以与治疗性试剂一起施用。在具体的实施方案中，所述的治疗性试剂是化疗试剂。在更具体的实施方案中，所述的化疗试剂为紫杉醇。在另一具体的实施方案中，所述的化疗试剂为阿霉素。

在其中施用至少两种C35抗体的实施方案中，所述的抗体可以分别与C35中的不同的表位结合。例如，一种抗体可以与位于C35(SEQID NO：2)的第105-115残基内的表位结合，而其他抗体可以与位于C35(SEQ ID NO：2)的第48-104残基内的表位结合。在具体的实施方案中，与C35的这些区域内的表位结合的C35抗体为1B3和1F2。在另一个实施方案中，所述的至少两种C35抗体中的至少一种抗体与C35(SEQ ID NO：2)的第48-87残基内的表位结合。在具体的实施方案中，与C35(SEQ ID NO：2)的第48-87残基内的表位结合的至少一种抗体为MAb163。

本发明还包括施用与相同表位结合的两种C35抗体。例如，可以施用与位于C35(SEQ ID NO：2)的第105-115残基内的表位结合的两种不同的C35抗体。类似地，可以施用与位于C35(SEQ ID NO：2)的第48-104残基内的表位结合的两种不同的C35抗体。

在一些实施方案中，可以根据在本发明的方法中使用的C35抗体与C35多肽或者其片段、或者C35变体多肽的结合能力来选择在本发明的方法中使用的一种或多种C35抗体，其中所述抗体与所述多肽的亲和力可以通过解离常数(K_D)来表征，所述的解离常数低于参照单克隆抗体的K_D。本发明包括本文所公开的所有的C35抗体作为用于这些实施方案中的参照单克隆抗体。在具体的实施方案中，本文所公开的单克隆抗体1B3和1F2为参照抗体。

在另一个实施方案中，所述的参照单克隆抗体为MAb163。因此，在一些实施方案中，所述的一种或多种C35抗体与C35多肽或其片段、或者C35变体多肽结合，其亲和力可通过解离常数(K_D)来表征，所述的解离常数低于MAb163的K_D(参见下文中的实施例16)。

在一些实施方案中，在本发明的方法中使用的至少一种C35抗体或片段特异性地与C35多肽或其片段、或者C35变体多肽结合，其亲和力可通过解离常数(K_D)来表征，所述的解离常数不大于5 x 10^-2M、10^-2M、5 x 10^-3M、10^-3M、5 x 10^-4M、10^-4M、5 x 10^-5M、10^-5M、5 x 10^-6M、10^-6M、5 x 10^-7M、10^-7M、5 x 10^-8M、10^-8M、5 x 10^-9M、10^-9M、5 x 10^-10M、10^-10M、5 x 10^-11M、10^-11M、5 x 10^-12M、10^-12M、5 x 10^-13M、10^-13M、5 x 10^-14M、10^-14M、5 x 10^-15M、或10^-15M。

在一些实施方案中，本发明包括将一种C35抗体与化疗试剂一起施用。在所述的方法中，可以使用本文所公开的任何C35抗体。在一些实施方案中，在施用化疗试剂之前、之后或同时施用C35抗体。在优选的实施方案中，MAb163与化疗试剂一起施用。在一个实施方案中，所述的化疗试剂为紫杉醇。

在一些优选的实施方案中，本发明包括将至少两种C35抗体与化疗试剂一起施用。可以施用C35抗体的任何组合，并且所有的组合都被包括在本发明的范围内。例如，可以使用以下组合中的任何组合：1F2与1B3、1F2与MAbc009、1F2与MAb 163、1F2与MAb 165、1F2与MAb171、1B3与MAbc009、1B3与MAb 163、1B3与MAb 165、1B3与MAb 171、MAbc009与MAb 163、MAbc009与MAb 165、MAbc009与MAb 171、MAb 163与MAb 165、MAb 163与MAb 171、或者MAb 165与MAb 171。本发明还包括施用这些抗体中的任何抗体的变体(例如人源化的形式、亲和力得到优化的形式)或衍生物彼此构成的组合、以及治疗性试剂(例如化疗试剂)。本发明还包括包含抗体与或不与治疗性试剂的组合的组合物。

在一些优选的实施方案中，可以将MAb163与MAb165和化疗试剂组合施用。类似地，图12示出了鼠C35抗体1F2和1B3与紫杉醇的组合在小鼠中减小肿瘤体积是有效的。

在其中患有癌症的受试者为人的实施方案中，施用的抗体优选为完全人抗体或完全人源化的抗体。这些人源化的抗体可以包括，但不限于MAb165、或者本文所公开的任何鼠C35抗体的人源化形式，例如人源化的1F2和/或1B3。此外，包括但不限于MAb 163、MAb 165、1B3和1F2的抗体的亲和力优化形式也被包括在本发明的范围内。

本发明的方法和组合物可以用于治疗过度增殖性疾病、紊乱和/或症状，包括肿瘤。可以采用本发明的方法治疗的过度增殖性疾病、紊乱和/或症状的实例包括，但不限于位于以下器官中的肿瘤：前列腺、结肠、腹、骨、乳腺、消化系统、肝、胰腺、腹膜、内分泌腺(肾上腺、副甲状腺、垂体、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺)、眼睛、头和颈部、神经(中枢神经和外周神经)、淋巴系统、骨盆、皮肤、软组织、脾、胸和泌尿生殖器。

所述的增殖性紊乱的其他实例包括，但不限于：急性儿童成淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病(Acute LymphoblasticLeukemia)、急性淋巴细胞性白血病(Acute Lymphocytic Leukemia)、急性髓性白血病、肾上腺皮质癌、成人(原发性)肝细胞癌、成人(原发性)肝癌、成人急性淋巴细胞性白血病、成人急性髓性白血病、成人霍奇金病、成人霍奇金淋巴瘤、成人淋巴细胞性白血病、成人非霍奇金淋巴瘤、成人原发性肝癌、成人软组织肉瘤、艾滋病相关淋巴瘤、艾滋病相关恶性肿瘤、肛门癌、星形细胞瘤、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑干神经胶质瘤、脑瘤、乳腺癌、肾盂和输尿管癌、中枢神经系统(原发性)淋巴瘤、中枢神经系统淋巴瘤、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤、宫颈癌、儿童期(原发性)肝细胞癌、儿童(原发性)肝癌、儿童急性成淋巴细胞性白血病、儿童急性髓性白血病、儿童脑干神经胶质瘤、儿童小脑星形细胞瘤、儿童大脑星形细胞瘤、儿童颅外生殖细胞瘤、儿童霍奇金病、儿童霍奇金淋巴瘤、儿童下丘脑和视觉通路神经胶质瘤、儿童成淋巴细胞性白血病、儿童成神经管细胞瘤、儿童非霍奇金淋巴瘤、儿童松果体和幕上原始神经瘤、儿童原发性肝癌、儿童横纹肌肉瘤、儿童软组织肉瘤、儿童视觉通路和下丘脑神经胶质瘤、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病、结肠癌、皮肤T-细胞淋巴瘤、内分泌胰腺胰岛细胞瘤、子宫内膜癌、室管膜细胞瘤、上皮癌、食管癌、尤文氏肉瘤及相关肿瘤、外分泌胰腺癌、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、眼癌、女性乳腺癌、高歇病(Gaucher’s Disease)、胆囊癌、胃癌、胃肠道类癌肿瘤、胃肠道肿瘤、生殖细胞瘤、妊娠滋养细胞瘤、毛细胞白血病、头颈癌、肝细胞癌、霍奇金病、霍奇金淋巴瘤、血丙种球蛋白过多、下咽癌、肠内肿瘤、眼内黑素瘤、胰岛细胞瘤、胰岛细胞胰腺癌、卡波西肉瘤、肾癌、喉癌、嘴唇和口腔癌、肝癌、肺癌、淋巴组织增生性紊乱、巨球蛋白血症、男性乳腺癌、恶性间皮瘤、恶性胸腺瘤、成神经管细胞瘤、黑素瘤、间皮瘤、转移性隐性原发性鳞片状颈癌、转移性原发性鳞片状颈癌、转移性鳞片状颈癌、多发性骨髓瘤、多发性骨髓瘤/血浆细胞瘤、骨髓发育不良综合征、髓细胞性白血病、髓性白血病、骨髓增生紊乱、鼻腔及鼻旁窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、怀孕期非霍奇金淋巴瘤、非黑色素皮肤癌、非小细胞肺癌、隐性原发转移性鳞片状颈癌、口咽癌、骨/恶性纤维肉瘤、骨肉瘤/恶性纤维性组织细胞瘤、骨的肉瘤/骨恶性纤维性组织细胞瘤、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞瘤、卵巢低恶性潜在瘤、胰腺癌、病变蛋白血、紫癜、副甲状腺癌、阴茎癌、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、血浆细胞瘤/多发性骨髓瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性肝癌、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、肾盂和输尿管瘤、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、结节病肉瘤(SarcoidosisSarcomas)、Sezary综合征、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞片状颈癌、胃癌、幕上原发性神经外胚层和松果体瘤、T-细胞淋巴瘤、睾丸癌、胸腺瘤、甲状腺瘤、肾盂和输尿管过渡细胞瘤、过渡肾盂和输尿管瘤、滋养细胞瘤、输尿管和肾盂细胞瘤、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、视觉通路和下丘脑神经胶质瘤、外阴癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、Wilms瘤、以及位于上述器官系统中除了瘤形成以外的任何其它过度增殖性疾病。

在一些具体的实施方案中，所述的增殖性紊乱为选自乳腺、膀胱、肝、结肠、卵巢和皮肤中的组织或器官的癌症。

可以使用本发明的方法和组合物来治疗恶化前的病状并预防发展到肿瘤或恶性状态，包括但不限于上文所述的那些紊乱。在已知或者怀疑向肿瘤或癌症发展之前的情况下，特别是在由增生、组织转化或者最特别发育不良构成的非肿瘤细胞生长已经发生的情况下，适用所述的用途(对于这种异常生长情况的综述，参见Robbins and Angell，1976，Basic Pathology，2d Ed.，W.B.Saunders Co.，Philadelphia，pp.68-79)。

增生是一种受控的细胞增殖形式，涉及组织或器官中细胞数量的增加，而在结构或功能上没有明显的改变。可以采用本发明的方法治疗的增生紊乱包括，但不限于：血管滤泡性纵隔淋巴结增生、血管淋巴样增生伴嗜酸性粒细胞增多、非典型黑素细胞增生、基底细胞增生、良性巨淋巴结增生、牙骨质增生、先天性肾上腺增生、先天性皮脂增生、囊性增生、乳腺囊性增生、义齿增生、导管增生、子宫内膜增生、纤维肌性增生、灶性上皮增生、牙龈增生、炎性纤维增生、炎性乳头状增生、血管内乳头状内皮增生、前列腺结节性增生、结节性再生性增生、假性上皮瘤样增生、老年皮脂腺增生和疣状增生。

组织转化是一种受控的细胞生长形式，其中一种成体或完全分化的细胞取代了另一种成体细胞。可以采用本发明的方法治疗的组织转化紊乱包括，但不限于：原因不明性髓样组织转化、顶浆分泌腺组织转化、非典型组织转化、自体实质组织转化(autoparenchymatousmetaplasia)、结缔组织组织转化、上皮组织转化、肠内组织转化、组织转化性贫血、组织转化性骨化、组织转化性息肉、髓样组织转化、原发性髓样组织转化、继发性髓样组织转化、鳞片状组织转化、羊膜的鳞片状组织转化以及症状性髓样组织转化。

发育不良通常为一种癌症前兆，并且主要在上皮中发生；其为一种最混乱形式的非肿瘤细胞生长，涉及单个细胞均一性的丧失以及细胞构造取向的丧失。发育不良的细胞通常具有异常大的、染色深的细胞核，并且表现出多形性。发育不良特征性地发生在存在慢性刺激或炎症的地方。可以采用本发明的方法治疗的发育不良紊乱包括，但不限于：无汗性外胚层发育不良、anterofacial dysplasia、窒息性胸廓发育不良、心房一手指发育不良(atriodigital dysplasia)、支气管肺发育不良、大脑发育不良、子宫颈发育不良、软骨外胚层发育不良、锁骨颅骨发育不良、先天性外胚层发育不良、颅骨骨干发育不良(craniodiaphysial dysplasia)、颅腕跖骨发育不良、颅骨干骺端发育不良、牙本质发育不良、骨干发育不良、外胚层发育不良、牙釉质发育不良、脑眼发育不良、半肢骨骺发育不良、多发性骨骺发育不良、点状骨骺发育不良、上皮发育不良、faciodigitogenitaldysplasia、家族颌骨纤维性发育不良、家族白皱褶性发育不良、肌纤维发育不良、骨纤维性发育不良、旺盛骨性发育不良、遗传性肾-视网膜性发育不良(hereditary renal-retinal dysplasia)、出汗性外胚层发育不良、少汗性外胚层发育不良、淋巴细胞减少性胸腺发育不良、乳腺发育不良、下颌面骨发育不良、干骺端发育不良、Mondini发育不良、单骨性纤维性发育不良、粘液上皮发育不良(mucoepithelial dysplasia)、多发骺发育不良、眼耳脊椎发育不良、眼-齿-指发育不良、眼脊椎发育不良、牙源性发育不良、眼下颌支发育不良(ophthalmomandibulomelic dysplasia)、根尖周牙骨质发育不良、多发性骨纤维性发育不良、假性软骨发育不全性脊椎骨骺发育不良(pseudoachondroplastic spondyloepiphysialdysplasia)、视网膜发育不良、中隔-眼发育不良(septo-opticdysplasia)、脊椎干骺端发育不良以及ventriculoradial dysplasia。

可以采用本发明的方法和组合物治疗的其他肿瘤形成前紊乱包括，但不限于：良性增殖障碍紊乱(例如良性肿瘤、纤维囊性病状、组织肥大、肠息肉、结肠息肉和食道发育不良)、黏膜白斑病、角化病、鲍恩氏病(Bowen’s disease)、慢性光化性皮炎(Farmer’s Skin)、日光性唇炎(solar chelitis)和日光性角化病。

在优选的实施方案中，本发明的方法和组合物可用于抑制癌症(特别是上文所列出的那些癌症)的生长、进展和/或转移。

在优选的实施方案中，本发明的方法和组合物可用于治疗、抑制癌症，特别是选自乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、胰腺癌、结肠癌和黑素瘤中的癌症的生长、进展和/或转移。

治疗过度增殖性疾病而施用的一种或多种抗体可以可任选地与能够诱导细胞凋亡的试剂一起施用。细胞凋亡诱导疗法包括化疗试剂(也称为抗肿瘤试剂)、放射疗法、以及放射疗法与化疗的组合。

在一些优选的实施方案中，治疗过度增殖性疾病(例如癌症)而施用的C35抗体与化疗试剂一起施用。例如，本发明包括治疗癌症的方法，其包括与治疗性试剂一起施用至少两种C35抗体。

示例性的治疗性试剂为长春花生物碱、表鬼臼毒素、蒽环类抗生素、放线菌素D、普卡霉素、嘌呤毒素、短杆菌肽D、紫杉醇(Taxol^TM.，Bristol Myers Squibb)、秋水仙碱、细胞松弛素B、依米丁、美登素以及安吖啶(或者＂mAMSA＂)。长春花生物碱类别在Goodman和Gilman的The Pharmacological Basis of Therapeutics(7th ed.)，(1985)，pp.1277-1280中有所描述。长春花生物碱的实例为长春新碱、长春碱、以及长春地辛。表鬼臼毒素类别在Goodman和Gilman的ThePharmacological Basis of Therapeutics(7th ed.)，(1985)，pp.1280-1281中有所描述。表鬼臼毒素的实例为依托泊苷、依托泊苷邻醌以及替尼泊苷。蒽环类抗生素类别在Goodman和Gilman的ThePharmacological Basis of Therapeutics(7th ed.)，(1985)，pp.1283-1285中有所描述。蒽环类抗生素的实例为柔红霉素、多柔比星、米托蒽醌以及比生群。放线菌素D，还称为更生霉素，在Goodmand和Gilman的The Pharmacological Basis of Therapeutics(7th ed.)，(1985)，pp.1281-1283中有所描述。普卡霉素，还称为光神霉素，在Goodmand和Gilman的The Pharmacological Basis ofTherapeutics(7th ed)，(1985)，pp.1287-1288中有所描述。其他化疗试剂包括：顺铂(Platinol^TM.，Bristol Myers Squibb)、卡铂(Paraplatin^TM.，Bristol Myers Squibb)、丝裂霉素(Mutamycin^TM.，Bristol Myers Squibb)、六甲蜜胺(Hexalen^TM，U.S.Bioscience，Inc.)、环磷酰胺(Cytoxan^TM，Bristol Myers Squibb)、洛莫司汀(CCNU)(CeeNU^TM Bristol Myers Squibb)、卡莫司汀(BCNU)(BiCNU^TM，BristolMyers Squibb)。

示例性的化疗试剂还包括：阿克拉霉素A、阿柔比星、阿克罗宁、山油柑碱、亚德里亚霉素(adriamycin)、阿地白介素(白细胞介素-2)、六甲蜜胺(hexamiethylmelamine)、氨鲁米特、氨鲁米特(cytadren)、氨基咪唑甲酰胺、安吖啶(m-AMSA；胺苯吖啶)、阿那曲唑(瑞宁得)、环胞苷、anthracyline、安曲霉素、天冬酰胺酶(爱施巴)、阿扎胞苷、阿扎胞苷(拉达卡霉素)、氮鸟嘌呤、重氮乙酰丝氨酸、氮杂尿苷、1，1′，1＂-塞替派(phosphinothioylidynetrisaziridine)、azirino(2′，3′：3，4)吡咯并(1，2-a)吲哚-4，7-二酮、BCG(theracys)、BCNU、BCNU氯乙基亚硝基脲、苯甲酰胺、4-(双(2-氯乙基)氨基)苯丁酸、比卡鲁安、氯乙亚硝脲、博来霉素、博来霉素(blenozane)、博来霉素类、溴脱氧尿苷、溴尿苷、白消安(马利兰)、氨基甲酸乙酯、碳铂、碳铂(伯尔定)、卡莫司汀、卡莫司汀(BCNU；BiCNU)、苯丁酸氮芥(留可然)、氯乙基亚硝基脲、chorozotocin(DCNU)、色霉素A3、顺式视黄酸、顺铂(cis-ddpl；顺氯氨铂)、克拉屈滨(2-氯脱氧腺苷；2cda；克拉屈滨)、助间型霉素、环亮氨酸、环磷酰胺、无水环磷酰胺、瘤可宁、阿糖胞苷、阿糖胞苷、阿糖胞苷HCl(cytosar-u)、2-脱氧-2-(((甲基亚硝胺)羰基)氨基)-D-葡萄糖、达卡巴嗪、放线菌素D(cosmegen)、柔红霉素、柔红霉素HCl(cerubidine)、氮烯咪胺、氮烯咪胺(DTIC-dome)、地美可辛、地塞米松、二去水矛醇、重氮氧代正亮氨酸、己烯雌酚、多西他赛(泰索帝)、亚德利亚霉素HCl(阿霉素)、盐酸盐阿霉素、依洛尼塞、雌莫司汀、雌莫司汀磷酸钠(emcyt)、乙碘油、依托格鲁、氨基甲酸乙酯、甲基磺酸乙酯、依托泊苷(VP 16-213)、味甲酰酚胺、氟尿苷、氟尿苷(fudr)、氟他拉滨(fludara)、氟尿嘧啶(5-FU)、氟氢甲睾酮(halotestin)、氟他米特、氟他米特(eulexin)、氟尿苷、硝酸镓(花岗岩)、吉西他滨(gemzar)、燃料木黄酮、2-脱氧-2-(3-甲基-3-nitrosoureido)-D-吡喃葡萄糖、戈舍瑞林(zoladex)、己烷雌酚、羟基脲(hydra)、伊达比星(idamycin)、ifosfagemcitabine、异环磷酰胺(iflex)、异环磷酰胺和美司钠(MAID)、干扰素、α干扰素、α干扰素-2a、α干扰素-2b、α干扰素-n3、白细胞介素-2、碘苄胍、碘苄胍碘苄胍、依立替康(camptosar)、异维甲酸(accutane)、酮康唑、4-(二(2-氯乙基)氨基)-L-苯丙氨酸、L-丝氨酸重氮基醋酸酯、香菇多糖、亚叶酸、醋酸亮丙瑞林(LHRH-类似物)、左旋咪唑(ergamisol)、罗氮芥(CCNU；cee-NU)、甘露莫司汀、美登素、氮芥、氮芥HCl(氮芥)、醋酸甲羟孕酮(普维拉、depoprovera)、醋酸甲地孕酮(menace)、醋酸美仑孕酮、苯丙氨酸氮芥(alkeran)、美洛格瑞、巯嘌呤、巯嘌呤(purinethol)、无水巯嘌呤、MESNA、美司钠(mesne)、甲磺酸乙酯、氨甲喋呤(mtx；氨甲喋呤)、赛氮芥、含羞草碱、醚醇硝唑、光辉霉素、米托蒽醌、二溴甘露醇、丙米腙、二溴卫矛醇、丝裂霉素(mutamycin)、丝裂霉素C、米托坦(o，p′-DDD；lysodren)、米托蒽醌、米托蒽醌HCl(novantrone)、单哌潘生丁、N，N-双(2-氯乙基)四氢-2H-1，3，2-oxazaphosphorin-2-胺-2-氧化物、N-(1-甲基乙基)-4-((2-甲基肼基)甲基)苯甲酰胺、N-甲基-双(2-氯乙基)胺、尼卡地平、尼鲁米特(nliandron)、嘧啶亚硝脲、二胺硝吖啶、氮芥、洛可达唑、诺加拉霉素、奥曲肽(sandostatin)、紫杉醇(taxon)、紫杉醇、密旋霉素、天门冬酰胺酶(PEGx-1)、喷司他丁(2′-脱氧柯福霉素)、培来霉素、苯丙氨酸芥肽、photophoresis、普卡霉素(mithracin)、溶血链球菌Su、哌泊溴烷、普卡霉素、普达非洛、鬼臼毒素、泊非霉素、泼尼松、甲基苄肼、甲基苄肼HCl(matulane)、prospidium、嘌呤霉素、嘌呤霉素氨基核苷、PUVA(补骨脂素+紫外线a)、吡喃共聚物、雷帕霉素、s-氮胞苷、2，4，6-三(1-氮丙啶基)-s-三嗪、甲环亚硝脲、焦土霉素、西罗莫司、链脲霉素(zanosar)、苏拉明、柠檬酸他莫昔芬(nolvadex)、taxon、喃氟啶、替尼泊苷(VM-26；vumon)、细格孢氮杂酸、TEPA、睾内酯、噻替哌、硫鸟嘌呤、噻替哌(thioplex)、替洛龙、拓扑替康、维甲酸(vesanoid)、三亚胺醌、木霉素、环氧甘醚、三亚胺嗪、三亚乙基磷酰胺、噻替哌、曲美沙特(neutrexin)、三(1-氮丙啶基)氧化膦、三(1-氮丙啶基)硫化膦、三(氮丙啶基)-对-苯醌、三(氮丙啶基)硫化膦、尿嘧啶氮芥、阿糖腺苷、磷酸阿糖腺苷、长春碱、硫酸长春碱(velban)、硫酸长春新碱(oncovin)、长春地辛、长春瑞滨、长春瑞滨(navelbine)、(1)-含羞草碱、1-(2-氯乙基)-3-(4-甲基环己基)-1-亚硝脲、(8S-顺式)-10-((3-氨基-2，3，6-三脱氧-α-L-lyxo-hexopyranosyl)氧)-7，8，9，10-四氢-6，8、11-三羟基-8-(羟基乙酰基)-1-甲氧基-5，12-萘并萘二酮、131-间-碘代苄基胍(I-131MIBG)、5-(3，3-二甲基-1-三氮烯基)-1H-咪唑-4-羧酰胺、5-(二(2-氯乙基)氨基)-2，4(1H，3H)-嘧啶二酮、2，4，6-三(1-氮丙啶基)-s-噻嗪、2，3，5-三(1-氮丙啶基)-2，5-环己二烯-1，4-二酮、2-氯-N-(2-氯乙基)-N-甲基乙胺、N，N-二(2-氯乙基)四氢-2H-1，3，2-oxazaphosphor in-2-胺-2-氧化物、3-去氮杂尿苷、3-碘代苄基胍、5，12-萘并萘二酮、5-氮胞苷、5-氟尿嘧啶、(1aS，8S，8aR，8bS)-6-氨基-8-(((氨基羰基)氧基)甲基)-1，1a，2，8，8a，8b-六氢-8a-甲氧基-5-甲基azirino(2′，3′：3，4)吡咯并(1，2-a)吲哚-4，7-二酮、6-氮尿苷、6-巯嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤、和其组合。

在具体的实施方案中，在本发明的方法中使用的化疗试剂为紫杉醇。在另一具体的实施方案中，在本发明的方法中使用的化疗试剂为阿霉素。

优选的治疗性试剂及其组合可以作为细胞凋亡的诱导治疗剂进行施用，所述的细胞凋亡的诱导治疗剂包括：阿霉素(Doxorubicin和Doxetaxel)、拓扑替康、紫杉醇(泰素帝(Taxol))、卡铂和泰素帝、顺铂和放射物、5-氟尿嘧啶(5-FU)、5-FU和放射、toxotere、氟达拉滨、Ara C、依托泊苷、长春新碱和长春花碱。

可以在本发明的方法中施用的化学治疗剂包括，但不限于，抗生素衍生物(例如，阿霉素、博来霉素、柔红霉素和更生霉素)；抗雌激素药(例如，他莫昔芬)；抗代谢物(例如，氟尿嘧啶、5-FU、氨甲喋呤、氟尿苷、α干扰素-2b、谷氨酸、普卡霉素、巯嘌呤、和6-硫代鸟嘌呤)；细胞毒性剂(例如，卡氮芥、BCNU、罗氮芥、CCNU、阿糖胞苷、环磷酰胺、雌莫司汀、羟基脲、甲基苄肼、丝裂霉素C、白消安、顺铂和硫酸长春新碱)；激素(例如，甲羟孕酮、磷雌氮芥、乙炔基雌二醇、雌二醇、醋酸甲地孕酮、甲睾酮、二磷酸已烯雌酚、氯烯雌醚和睾内酯)；氮芥衍生物(例如，mephalen、chorambucil、氮芥和噻替哌)；类固醇和组合(例如，倍他米松磷酸酯钠)；和其它(例如，达卡巴嗪、天冬酰胺酶、曼托坦、硫酸长春新碱、硫酸长春碱、和依托泊苷)。

在具体的实施方案中，本发明的抗体与CHOP(环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和泼尼松)或者与CHOP成分的任意组合一起施用。

表5：用于主要癌症适应症的通常使用的化疗药品

1.乳腺癌：佐剂治疗(作为手术的辅助或者除了手术以外的系统治疗)。多柔比星(阿霉素Adriamycin)、环磷酰胺和紫杉类药物[紫杉醇(Taxol)和多西他赛(Taxotere)]。这三种药品在转移性乳腺癌中还具有活性，但是如果患者已经接受这三种药品作为辅助治疗，则共同使用的药品为卡培他滨(Xeloda)、吉西他滨(Gemzar)、长春瑞滨(Navelbine)。用于激素受体阳性肿瘤的骨转移的普通处方激素试剂为：他莫昔芬和芳香酶抑制剂(瑞宁得、弗隆、阿诺新)。
	2.结肠癌：5-FU加亚叶酸、伊立替康(camptosar)、奥沙利铂和中卡培他滨。
3.肺癌：顺铂、卡铂、紫杉醇、多西他赛、吉西他滨、长春瑞滨。	2.结肠癌：5-FU加亚叶酸、伊立替康(camptosar)、奥沙利铂和中卡培他滨。
3.肺癌：顺铂、卡铂、紫杉醇、多西他赛、吉西他滨、长春瑞滨。	4.前列腺癌：烯醇紫杉醇、雌莫司汀、米托蒽醌(Novantrone)、和泼尼松。
5.非霍奇金淋巴瘤：环磷酰胺、阿霉素、长春新碱(Oncovin)和泼尼松。	4.前列腺癌：烯醇紫杉醇、雌莫司汀、米托蒽醌(Novantrone)、和泼尼松。

本发明还涉及至少两种C35抗体在制备用于治疗癌症的药剂中的用途。在一个实施方案中，所述的用途进一步包括施用化疗试剂。在具体的实施方案中，将所述的抗体同时施用。在其他实施方案中，将所述的抗体依次施用。在其他实施方案中，将所述的抗体以变化的时间间隔施用。在一些实施方案中，将化疗试剂与一种或多种所述抗体同时施用。在其他实施方案中，如本文中其他处所述，将化疗试剂以不同于抗体的时间过程施用。

在一些实施方案中，本发明的方法涉及施用C35抗体及治疗性放射。任选地，这些方法还可以包括施用化疗试剂。例如，在一些实施方案中，本发明可以包括将至少一种C35抗体与化疗试剂以及治疗性放射一起施用。

治疗性放射包括(例如)：分割放射疗法、非分割放射疗法、超分割放射疗法、以及放射疗法与化学疗法的组合。放射的类型还包括：电离(γ)放射、粒子放射、低能透射(LET)、高能透射(HET)、紫外线放射、红外线放射、可见光放射以及光敏放射。如本文所用，化学疗法包括使用单一化疗试剂、或者多种试剂组合的治疗。在需要治疗的受试者中，化学治疗可以与手术治疗或放射疗法，或者与其他抗肿瘤治疗形式相结合。

在其他实施方案中，将本发明的抗体或其组合与抗病毒试剂组合施用。可以与本发明的抗体一起施用的抗病毒试剂包括，但不限于阿昔洛韦、利巴韦林、金刚烷胺和remantidine。

本发明的抗体还可以与止吐剂，如2-(乙基硫代)-10-(3-(4-甲基-1-哌嗪基)丙基)-10H-吩噻嗪(乙基硫代培拉嗪)、1-(对-氯-α-苯基苄基)-4-(间-甲基苄基)-哌嗪(美克洛嗪，氯苯甲嗪)等等，和它们的组合施用。本发明的多核苷酸和多肽还可以与本文公开或者本领域已知的其他治疗剂，和它们的组合施用。

可以与本发明的抗体或其组合以组合施用的常规的非特异性免疫抑制剂包括，但不限于：类固醇、环孢霉素、环孢霉素类似物、环磷酰胺、甲泼尼松、泼尼松、硫唑嘌呤、FK-506、15-去氧精胍啉(15-deoxyspergualin)和通过抑制响应T细胞的功能来起作用的其他免疫抑制剂。

在具体的实施方案中，本发明的抗体与免疫抑制剂组合施用。可以与本发明的抗体施用的免疫抑制剂制剂包括，但不限于，ORTHOCLONE^TM(OKT3)、SANDIMMUNE^TM/NEORAL^TM/SANGDYA^TM(环胞菌素)、PROGRAF^TM(他克莫司)、CELLCEPT^TM(麦考酚酯)、硫唑嘌呤、糖皮质类固醇和RAPAMUNE^TM(西罗莫司)。在特定实施方案中，免疫抑制剂可以用于预防器官或者骨髓移植的排斥。

在其他的实施方案中，本发明的抗体可以单独施用，或者与一种或多种静脉内免疫球蛋白制备物组合施用。可以与本发明的抗体一起施用的静脉内免疫球蛋白制备物包括，但不限于：GAMMAR^TM、IVEEGAM^TM、SANDOGLOBULIN^TM、GAMMAGARD S/D^TM和GAMIMUNE^TM。在具体的实施方案中，在移植治疗(例如骨髓移植)中，本发明的抗体与静脉内免疫球蛋白制备物组合施用。

在其他的实施方案中，本发明的抗体单独或者与消炎剂组合施用。可以与本发明的抗体施用的消炎剂包括，但不限于，糖皮质激素和非类固醇消炎剂、氨基芳基羧酸衍生物、芳基乙酸衍生物、芳基丁酸衍生物、芳基羧酸、芳基丙酸衍生物、吡唑、吡唑酮、水杨酸衍生物、噻嗪羧酰胺、e-乙酰氨基己酸、S-腺苷甲硫氨酸、3-氨基-4-羟基丁酸、阿米西群、苄吲酸、苄达明、丁环己巴比妥、联苯吡胺、地他唑、依莫法宗、愈创蓝油烃、萘普酮、尼美舒利、奥古蛋白、奥沙西罗、瑞尼托林、哌异噁唑、哌酰苯肟、普罗喹宗、胺丙噁二唑和替尼达普。

在其他的实施方案中，本发明的抗体与细胞因子组合施用。可以与本发明的抗体一起施用的细胞因子包括，但不限于：IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL10、IL12、IL13、IL15、抗CD40、CD40L、IFN-γ和TNF-α。在另一个实施方案中，本发明的抗体可以与任何白细胞介素一起施用，其中所述的白细胞介素包括，但不限于：IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20和IL-21。

在其他的实施方案中，本发明的抗体与血管生成蛋白质组合施用。可以与本发明的抗体一起施用的血管生成蛋白质包括，但不限于：神经胶质瘤衍生生长因子(GDGF)，如欧洲专利号EP-399816中所公开；血小板衍生生长因子-A(PDGF-A)，如欧洲专利号EP-6821 10中所公开；血小板衍生生长因子-B(PDGF-B)，如欧洲专利号EP-282317中所公开；胎盘生长因子(PIGF)，如国际专利公开号WO 92/06194中所公开；胎盘生长因子-2(PIGF-2)，如Hauser等人在Growth Factors，4：259-268(1993)中所公开；血管内皮生长因子(VEGF)，如国际专利公开号WO90/13649中所公开；血管内皮生长因子-A(VEGF-A)，如欧洲专利号EP-506477中所公开；血管内皮生长因子-2(VEGF-2)，如国际专利公开号WO 96/39515中所公开；血管内皮生长因子-B(VEGF-3)；血管内皮生长因子B-186(VEGF-B186)，如国际专利公开号WO 96/26736中所公开；血管内皮生长因子-D(VEGF-D)，如国际专利公开号WO 98/02543中所公开；血管内皮生长因子-D(VEGF-D)，如国际专利公开号WO98/07832中所公开；以及血管内皮生长因子-E(VEGF-E)，如德国专利号DE19639601中所公开。上述提及的参考在此均以引用方式并入本文。

在其他的实施方案中，本发明的抗体与造血生长因子组合施用。可以与本发明的抗体一起施用的造血生长因子包括，但不限于：LEUKINE^TM(SARGRAMOSTIM^TM)和NEUPOGEN^TM(FILGRASTIM^TM)。

在其他的实施方案中，本发明的抗体与成纤维细胞生长因子组合施用。可以与本发明的抗体一起施用的成纤维细胞生长因子包括，但不限于：FGF-1、FGF-2、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6、FGF-7、FGF-8、FGF-9、FGF-10、FGF-11、FGF-12、FGF-13、FGF-14和FGF-15。

施用时间

本文所述的任何细胞凋亡诱导治疗剂可以与本发明的一种或多种C35抗体同时施用。在一些实施方案中，两种或多种C35抗体同时进行施用。在其他的实施方案中，C35抗体分开施用。例如，第一种C35抗体可以在某一时间施用，然后第二种C35抗体可以在同一天的晚些时候或者该天之后的一天或多天施用。多种C35抗体的施用可以在施用化疗试剂(例如紫杉醇(Taxol^TM)、阿霉素或本文所述的任何其他试剂)之前、之后或同时进行施用。例如，一种、两种或多种C35抗体可以与紫杉醇、阿霉素或其他试剂在同一时间施用或者在同一天施用。备选地，紫杉醇、阿霉素或其他试剂可以在没有施用C35抗体的那一天(例如在施用至少一种C35抗体之前的某一天或者在施用至少一种C35抗体之后的某一天)施用。

在一些实施方案中，细胞凋亡诱导试剂可以在施用至少一种C35抗体之后施用。例如，细胞凋亡诱导试剂可以在向需要治疗的受试者施用至少一种C35抗体之后的大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时施用。在一些实施方案中，细胞凋亡诱导试剂可以在向需要治疗的受试者施用至少一种C35抗体之后的大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天时施用。在优选的实施方案中，细胞凋亡诱导试剂是化疗试剂，例如紫杉醇。

在一些实施方案中，细胞凋亡诱导试剂可以在施用至少一种C35抗体之前施用。例如，细胞凋亡诱导试剂可以在向需要治疗的受试者施用至少一种C35抗体之前的大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时时施用。在一些实施方案中，细胞凋亡诱导试剂可以在向需要治疗的受试者施用至少一种C35抗体之前的大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天时施用。在优选的实施方案中，细胞凋亡诱导试剂是化疗试剂，例如紫杉醇或阿霉素。

在一个实施方案中，在治疗过程中，化疗试剂以一周的时间间隔进行施用。在具体的实施方案中，在治疗过程中，将化疗试剂以每周一次的方式施用两个星期。在更具体的实施方案中，在治疗过程第一个两个星期中，将化疗试剂以每周一次的方式进行施用。在一些实施方案中，在治疗过程中，将至少两种C35抗体以每周一次、两次或三次的方式进行施用。在具体的实施方案中，在治疗过程中，将C35抗体以每周两次的方式施用。

在一个实施方案中，将至少两种C35抗体每周施用两次，而细胞凋亡诱导试剂每周施用一次。在一个实施方案中，在治疗的第一天施用细胞凋亡诱导试剂，在一个星期后，施用第二剂量的细胞凋亡诱导。试剂，而C35抗体则每周施用两次。

在具体的实施方案中，治疗过程可以持续一周、两周、三周、四周、五周、六周、七周、八周、一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月或者一年。治疗过程的持续时间将取决于癌症的类型、所使用的抗体、化疗试剂、患者的年龄等。这些参数可以由本领域的技术人员确定。

治疗活性的证明

优选地，在体外对本发明的方法和抗体进行测试，然后针对所需的治疗性或预防性活性在体内进行测试，然后用于人。例如，用于证明化合物或药物组合物的治疗性或预防性效用的体外测试包括化合物对细胞系或患者的组织样品的作用。可以采用本领域的技术人员已知的技术(包括但不限于玫瑰花瓣形成测定(rosette utilizing assays)和细胞裂解测试)来测定化合物或组合物对细胞系和/或组织样品的作用。根据本发明，可以用于确定施用特定的化合物是否适用的体外测试包括体外细胞培养测试，其中使患者的组织样品在培养基中生长，然后使其暴露于化合物或者除次以外，可以将化合物对使经培养的组织样品进行施用，并观察这种化合物对组织样品的作用。

试剂盒

本发明提供了可以在上述方法中使用的试剂盒。在一个实施方案中，试剂盒在一个或多个容器中包含一种或多种本发明的抗体，优选地一种或多种纯化的抗体。在具体的实施方案中，本发明的试剂盒包括基本上分离的多肽，该多肽包含与所述试剂盒中包括的抗体发生特异性免疫反应的表位。优选地，本发明的试剂盒进一步包括不与目的多肽发生反应的对照抗体。在另一个具体的实施方案中，本发明的试剂盒包括用于检测抗体与目的多肽的结合的方法(例如，将所述的抗体与可检测的物质缀合，所述可检测的物质例如由荧光化合物、酶底物、放射性化合物、发光化合物或识别第一种抗体的第二种抗体与可检测物质缀合)。

在本发明的另一具体的实施方案中，所述的试剂盒为诊断试剂盒，其用于筛选包含特异性抗增殖和/或癌症多核苷酸和多肽的抗体的血清。这种试剂盒可以包括不与目的多肽发生反应的对照抗体。这种试剂盒包括基本上分离的多肽抗原，该多肽抗原包含与至少一种抗多肽抗原的抗体发生特异性免疫反应的表位。此外，这种试剂盒包括用于检测所述抗体与所述抗原的结合的方法(例如所述的抗体可以与可使用流式细胞仪检测的荧光化合物(例如荧光素或罗丹明)缀合)。在具体的实施方案中，所述的试剂盒可以包括重组产生的或化学合成的多肽抗原。所述的试剂盒中的多肽抗原还可以与固体支持物连接。

在更具体的实施方案中，上文所述的试剂盒的检测方法包括所述的多肽的抗原可以与之连接的固体支持物。这种试剂盒还可以包括由非连接的报告物质标记的抗人抗体。在该实施方案中，抗体与多肽抗原的结合可以通过所述的报告物质标记的抗体的结合来检测。

在另一个实施方案中，本发明包括诊断试剂盒，其用于筛选包含本发明的多肽的抗原的样品。所述的诊断试剂盒包括：与多肽或多核苷酸抗原发生特异性免疫反应的基本上分离的抗体、以及用于检测多核苷酸或多肽抗原与抗体的结合的手段。在一个实施方案中，所述的抗体与固体支持物连接。在具体的实施方案中，所述的抗体可以为单克隆抗体。所述试剂盒的检测方法可以包含第二种标记的单克隆抗体。备选地，所述的检测方法可以包括标记的竞争性抗原。

在一种诊断方案中，测试样品与具有表面结合的抗原(通过本发明的方法获得)的固相试剂发生反应。在特异性抗原的抗体与所述的试剂结合并通过洗涤出去未结合的抗原成分之后，所述的试剂与经报告物质标记的抗人抗体发生反应，从而使报告物质与固体支持物上结合的抗抗原的抗体的量成一定的比例与所述的试剂结合。再次洗涤所述的试剂，从而出去未结合的标记的抗体，并测定与所述的试剂集合的报道分子的量。通常，所述的报道分子为酶，其可以在合适的荧光、发光或量热底物存在下通过温育所述的固相来测定(Sigma，St.Louis，Mo.)。

可以通过用于将蛋白质材料连接到固体支持材料上的已知技术来制备上述测定法中的固体表面试剂，其中所述的技术例如有聚合物珠子、标尺、96孔板或过滤材料。这些连接方法通常包括蛋白质与支持物的非特异性吸附，或者蛋白质通过游离的氨基与固体支持物上的化学反应性基团(例如活性羧基、羟基或醛基)的共价连接。备选地链霉亲和素涂敷的板可以与生物素化的抗原联合使用。

因此，本发明提供了用于实施所述的诊断方法的测试系统或试剂盒。该试剂盒通常包含具有表面结合的重组抗体的支持物、以及用于检测表面结合的抗-抗原抗体的报道分子标记的抗人抗体。

基因疗法

在具体的实施方案中，施用包含编码诸如C35抗体之类的抗体或其功能衍生物的序列的核酸，以通过基因疗法治疗、抑制或预防与C35的异常表达和/或异常活性有关的疾病或紊乱。基因疗法是通过向受试者施用表达的或可表达的核酸来进行的。在本发明的这种实施方案中，所述的核酸产生可调节治疗效果的它们的编码蛋白质。

根据本发明，可以使用本领域可用的任何基因疗法的方法。示例性的方法如下所述。

对于基因疗法的综述，参见Goldspiel et al.，ClinicalPharmacy 12：488-505(1993)；Wu and Wu，Biotherapy 3：87-95(1991)；Tolstoshev，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32：573-596(1993)；Mulligan，Science 260：926-932(1993)；以及Morgan andAnderson，Ann.Rev.Biochem.62：191-217(1993)；May，TIBTECH11(5)：155-215(1993)。在可以使用的重组DNA技术领域中通常已知的方法在Ausubel et al.(eds.)，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，NY(1993)；and Kriegler，GeneTransfer and Expression，A Laboratory Manual，Stockton Press，NY(1990)中有所描述。

在优选的方面中，所述的化合物包含编码抗体的核酸序列，该核酸序列为在合适的宿主中表达所述的抗体、其片段、嵌合蛋白质或者重链或轻链的表达载体的一部分。具体而言，此类核酸序列具有与所述的抗体编码区域可操作地连接的启动子，所述的启动子为诱导型的或组成型的，以及可任选的组织特异型的。在另一具体的实施方案中，使用了如下核酸，其中抗体编码序列和任何其他所需的序列处于在基因组中的所需位置处促进同源重组的区域的侧翼，由此提供了抗体编码核酸的染色体内表达(Koller and Smithies，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：8932-8935(1989)；Zijlstra et al.，Nature342：435-438(1989))。在具体的实施方案中，所述的表达的抗体分子为单链抗体；备选地，所述的核酸序列包含编码所述抗体的重链和轻链两者、或者其片段的序列。

核酸向患者中的递送可以为直接的或者为间接的，在为直接的情况下患者直接暴露于核酸或带有核酸的载体，在为间接的情况下，首先在体外用核酸转化细胞，然后将所得的细胞移植到患者中。这两种方法分别称为体内或离体基因疗法。

在具体的实施方案中，在体内直接施用核酸序列，其中该核酸序列表达从而产生编码产物。该过程可以通过本领域已知的多种方法中的任意方法来完成，所述的方法例如有：将所述的核酸序列构建成合适的核酸表达载体的一部分，然后施用所得的表达载体，这样它们将成为细胞内的；例如通过使用缺陷的或减毒的逆转录病毒或其他病毒载体进行感染(参见美国专利序号4,980,286)；或者直接注射裸DNA；或者采用微粒轰击(例如基因枪；Biolistic，Dupont)；或者使用脂质、细胞表面受体或转染试剂进行涂敷，从而封装于脂质体、微粒或微囊中；或者使所述的核酸序列与已知能够进入核中的肽连接后施用；施用与配体对象连接的所述的核酸序列，从而导致受体介导的细胞内吞作用(例如参见Wu and Wu，J.Biol.Chem.262：4429-4432(1987))(其可以用于靶向特异性表达所述受体的细胞种类)，等等。在另一个实施方案中，可以形成核酸-配体复合物，其中包含促融病毒肽，从而破坏内涵体，使得所述的核酸免于被溶酶体降解。在另一个实施方案中，可以通过靶向特定的受体来在体内靶向所述的核酸，用于细胞的特异性吸收和表达(例如参见PCT公开WO 92/06180、WO 92/22635、WO92/20316、WO93/14188、WO 93/20221)。备选地，可以将所述的核酸引入到细胞内，并通过同源重组并入到宿主细胞DNA中，用于表达(Koller and Smithies，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：8932-8935(1989)；Zijlstra et al.，Nature 342：435-438(1989))。

在具体的实施方案中，使用了包含编码本发明抗体的核酸序列的病毒载体。例如可以使用逆转录病毒载体(参见Miller et al.，Meth.Enzymol.217：581-599(1993))。这些逆转录病毒载体包含正确包装病毒基因组以及整合到宿主细胞DNA中所必需的成分。将在编码基因疗法中使用的抗体的核酸序列克隆到一种或多种有助于基因专递至患者中的载体中。关于逆转录病毒载体的更详细的情况可以在Boesenet al.，Biotherapy 6：291-302(1994)中找到，所述文献描述了逆转录病毒载体在将mdrl基因递送至造血干细胞中、从而使得该干细胞对化学治疗更具有抗性中的用途。阐述了逆转录病毒载体在基因疗法中的用途的其他文献为：Clowes et al.，J.Clin.Invest.93：644-651(1994)；Kiem et al.，Blood 83：1467-1473(1994)；Salmons and Gunzberg，Human Gene Therapy 4：129-141(1993)；以及Grossman and Wilson，Curr.Opin.in Genetics and Devel.3：110-114(1993)。

腺病毒为可以在基因疗法中使用的其他病毒载体。腺病毒是将基因递送至呼吸上皮的特别引人注意的媒介物。腺病毒天然地感染呼吸上皮，在这种情况下，它们导致轻微的疾病。用于基于腺病毒的递送系统的其他靶标为肝、中枢神经系统、内皮细胞和肌肉。腺病毒具有能够感染非分裂细胞的优点。Kozarsky and Wilson，Current Opinionin Genetics and Development 3：499-503(1993)介绍了基于腺病毒的基因疗法的综述。Bout et al.，Human Gene Therapy 5：3-10(1994)证明了腺病毒载体在将基因转移至猕猴呼吸上皮中的用途。腺病毒在基因疗法中的用途的其他例子可以在Rosenfeld et al.，Science252：431434(1991)；Rosenfeld et al.，Cell 68：143-155(1992)；Mastrangeli et al.，J.Clin.Invest.91：225-234(1993)；PCTPublication WO94/12649；and Wang，et al.，GeneTherapy2：775-783(1995)中发现。在优选的实施方案中，使用了腺病毒载体。

还建议将腺相关病毒(AAV)用于基因疗法(Walsh et al.，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204：289-300(1993)；美国专利序号5,436,146)。

基因疗法的另一种方法包括通过诸如电穿孔、脂转染、磷酸钙介导的转染或病毒感染之类的方法将基因转移至组织培养中细胞中。通常，转移方法包括将可选择的标记物转移到细胞中。然后将所得细胞置于选择条件下，从而分离出已经摄取转移基因并且正表达转移基因的那些细胞。然后将这些细胞递送给患者。

在该实施方案中，在体内施用所得的重组细胞之前将所述的核酸引入到细胞中。可以通过本领域已知的任何方法来进行，这些方法包括，但不限于：转染、电穿孔、显微注射、使用包含所述的核酸序列的病毒或噬菌体载体进行感染、细胞融合、染色体介导的基因转移、微细胞介导的基因转移、原生质球融合等。在本领域中，已知有多种技术用于将外源基因引入到细胞中(例如参见Loeffler and Behr，Meth.Enzymol.217：599-618(1993)；Cohen et al.，Meth.Enzymol.217：618-644(1993)；Cline，Pharmac.Ther.29：69-92m(1985))，并且可以根据本发明使用这些技术，前提条件是受体细胞的必需的发育和生理学功能不能被破坏。该技术提供将核酸稳定地转移至细胞中，从而该核酸可以被所述的细胞表达，并且优选地所述的核酸是可遗传的并且可以被细胞后代所表达。

所得的重组细胞可以采用本领域已知的多种方法递送给患者。重组血细胞(例如造血干细胞或祖细胞)优选地以静脉内方式施用。预计使用的细胞量取决于希望的效果、患者的状态等，并且可以通过本领域的技术人员来确定。

为了基因疗法而将核酸引入其中的细胞包括了任何所需的、可利用的细胞类型，其包括，但不限于：上皮细胞、内皮细胞、角质细胞、成纤维细胞、肌细胞、肝细胞、血细胞(例如T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨核细胞、粒细胞)、各种干细胞或祖细胞(特别是造血干细胞或祖细胞(例如来自骨髓、脐带血、外周血、胎肝等的那些))。

在优选的实施方案中，用于基因疗法的细胞为患者自体的。

在其中将重组细胞用于基因疗法中的实施方案中，将编码抗体的核酸序列引入细胞中，使得这些核酸序列可以被所述的细胞或其后代表达，然后将体内施用重组细胞以达到治疗作用。在具体的实施方案中，使用了干细胞或祖细胞。可以分离并在体外保持的任何干细胞和/或祖细胞都可以潜在地根据本发明的该实施方案来使用(例如参见PCT专利公开WO 94/08598；Stemple and Anderson，Cell 71：973-985(1992)；Rheinwald，Meth.Cell Bio.21A：229(1980)；以及Pittelkow and Scott，Mayo Clinic Proc.61：771(1986))。

在具体的实施方案中，为了基因疗法而被引入的核酸包含与所述的编码区可操作地连接的诱导型启动子，使得通过调控合适的转录诱导物的存在或缺乏来调控所述核酸的表达。

IX.药物组合物和施用方法

制备本发明的一种或多种C35抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物的方法、以及将其施用至有此需要的受试者的方法是本领域的技术人员所公知的，并且可以容易地确定。一种或多种C35抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物的施用途径可以为例如：经口施用、肠胃外施用、吸入施用或局部施用。如本文所用，术语肠胃外包括例如：静脉内、动脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、直肠或阴道施用。虽然施用的所有剂型都被清楚地包括在本发明的范围内，但是对于注射(特别对于静脉内注射或动脉内注射、或者点滴)而言，用于施用的剂型应该为溶液。通常，用于注射的合适的药物组合物可以包含：缓冲剂(例如醋酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐缓冲剂)、表面活性剂(例如聚山梨醇酯)、可任选的稳定剂(例如人清蛋白)等。但是，在与本文所教导的方法相容的其他方法中，可以将本发明的C35抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物直接递送至有害细胞群体的位置处，从而增多疾病组织在治疗性试剂中的暴露情况。

如上文所讨论的那样，可以以用于体内治疗癌症的药物有效量施用本发明的至少一种C35抗体(或者更优选地至少两种或多种C35抗体)或者其抗原结合片段、变体或衍生物。在优选的实施方案中，可以以用于体内治疗癌症的药物有效量施用本发明的两种或多种C35抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物。

就这一点而言，应该理解的是对本文所公开的抗体进行配制，从而有助于施用和促进活性剂的稳定。优选地，根据本发明的药物组合物包含可药用的非毒性无菌载体，例如生理盐水、非毒性缓冲剂、防腐剂等。就本申请的目的而言，缀合的或非缀合的C35抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物的药物有效量是指：该量足以形成与靶标的有效结合，并且足以获得益处(例如缓解疾病或紊乱的症状)或者足以检测物质或细胞。

在一个实施方案中，所述的完整抗体的剂量在单一推注中提供。备选地，所述的剂量可以通过多次施用来提供，例如为增多灌注量的方法或者通过在几小时或几天的时间段(例如约2至约4天的时间段)内反复注射施用的方法。此外，参见实施例5、9、10和14，以及表7-10。

在一些实施方案中，两种或多种C35抗体可以在相同的药物制备物中一起施用。在其他的实施方案中，所述的抗体以分开的药物制备物的形式同时或依次施用。

制剂以及施用方法(这些方法可以在所述的化合物包含核酸或免疫球蛋白时采用)如上文所述；其他合适的制剂及施用途径可以选自下文所述的那些。

多种递送系统是已知的并且可以用于施用本发明的化合物，例如，封装在脂质体中、微粒、微囊、能够表达所述化合物的重组细胞、受体介导的内吞(见，例如，Wu and Wu，J.Biol.Chem.262：4429-4432(1987))，和构建核酸作为逆转录病毒或者其他载体的部分，等等。导入方法包括但不限于皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和经口途径。可以通过常规途径施用化合物或组合物，例如，通过输注或者推注，通过上皮或者粘膜皮肤内层(例如，口腔粘膜、直肠和肠粘膜等等)吸收，并且可以与其他生物活性剂一起施用。施用可以是全身或局部的。此外，希望通过适宜的途径向中枢神经系统导入本发明的药物化合物或组合物，所述途径包括心室内和鞘内注射；可以通过心室内导管，例如，附着到贮库，如Ommaya贮库的导管方便心室内注射。例如，使用吸入器或者喷雾器，和具有雾化剂的制剂，可以使用经肺施用。

在特定实施方案中，希望对需要治疗的部位局部施用本发明的药物化合物或者组合物；这可以通过例如，但不限于，在手术期间局部输注、局部应用，例如与手术后伤口敷料结合，通过注射，通过导管，通过栓剂，或者通过植入物来实现，所述植入物是有孔的、无孔的、或者胶状材料，包括膜，如sialastic膜或者纤维。优选地，当施用本发明的蛋白质，包括抗体时，必须小心使用蛋白质不吸收的材料。

在另一实施方案中，化合物或者组合物可以以囊泡，尤其以脂质体递送(见Langer，Science 249：1527-1533(1990)；Treat et al.，in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer，Lopez-Berestein and Fidler(eds.)，Liss，New York，pp.353-365(1989)；Lopez-Berestein，同前，pp.317-327；一般见同前)。

在另一个实施方案中，所述的化合物或组合物可以以控释系统的形式递送。在一个实施方案中，采用了渗透泵控释的形式(参见Langer，supra；Sefton，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14：201(1987)；Buchwald et al.，Surgery 88：507(1980)；Saudek et al.，N.Engl.J.Med.321：574(1989))。在另一个实施方案中，可以使用聚合物材料(参见Medical Applications of Controlled Release，Langerand Wise(eds.)，CRC Pres.，Boca Raton，Florida(1974)；Controlled Drug Bioavailability，Drug Product Design andPerformance，Smolen and Ball(eds.)，Wiley，New York(1984)；Ranger and Peppas，J.，Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23：61(1983)；还参见Levy et al.，Science 228：190(1985)；During etal.，Ann.Neurol.25：351(1989)；Howard et al.，J.Neurosurg.71：105(1989))。在另一个实施方案中，可以将控释系统放置于治疗靶标(即，大脑)的附近，这样仅需要系统剂量的一小部分(例如参见Goodson，in Medical Applications of Controlled Release，supra，vol.2，pp.115-138(1984))。

其他控释系统在Langer的综述(Science 249：1527-1533(1990))中有所讨论。

在其中本发明的化合物为编码蛋白质的核酸的具体实施方案中，可以通过将该核酸构建成合适的核酸表达载体的一部分、并将所得物进行施用使其成为细胞内的物质(例如通过使用逆转录病毒载体(参见美国专利序号4,980,286)；通过直接注射；通过使用微粒子轰击(例如基因枪；Biolistic，Dupont)；使用脂质、细胞表面受体或转染试剂进行涂敷；以所述的核酸序列与已知能够进入核中的同源盒肽相连接的方式施用；施用与配体对象连接的所述的核酸序列，从而导致受体介导的细胞内吞作用(例如参见Joliot et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：1864-1868(1991)，等等)来促进所述核酸的编码蛋白质的表达。备选地，可以将核酸引入到细胞中，并通过同源重组并入到宿主细胞的DNA中，从而进行表达。

本发明还提供了药物组合物。这种药物组合物包含治疗有效量的化合物以及可药用的载体。在具体的实施方案中，术语“可药用的”是指由联邦或州政府的管理机构批准或者是在美国药典或其他公认的药典中列出用于动物，更具体为人。术语“载体”是指与治疗剂一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。所述的药物载体可以为无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、蔬菜或合成来源的那些油(例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等)。当静脉内施用药物组合物时，水是优选的载体。特别就可注射的溶液而言，还可以使用生理盐水溶液以及水性葡萄糖与甘油的溶液作为液体载体。合适的药物赋形剂包括：淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、凝胶、麦芽、稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油、滑石、氯化钠、干态脱脂乳、甘油、丙二醇、乙二醇、水、乙醇等。如果需要的话，所述的组合物还可以包含少量的润湿剂或乳化剂、或者pH缓冲剂。这些组合物可以为溶液、悬浮液、乳液、片、丸、胶囊、粉末、缓释制剂等形式。所述的组合物可以与常规的粘结剂和载体，如三脂酸甘油一起配制成栓剂。口服制剂可以包括标准的载体，例如药物等级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药物载体的实例在E.W.Martin的＂Remington′s Pharmaceutical Sciences＂中有所描述。这种组合物包含治疗有效量的所述的化合物(优选为纯化形式)以及适量的载体，从而提供了正确施用于患者的形式。所述的制剂适合施用的模式。

在优选的实施方案中，根据常规方法将组合物配制成适于静脉内施用于人的药物组合物。通常，用于静脉内施用的组合物为无菌等渗水性缓冲液中的溶液。在需要时，所述的组合物还可以包含增溶剂和局部麻醉剂(例如利多卡因)，以减轻注射部位的疼痛。通常，所述的多种组分可以以分开的方式或者以单位剂量的形式混合提供，例如将冻干粉或无水浓缩物盛装在标记出活性剂的量的紧密密封的容器(例如安瓿或药囊)中。在通过灌注来施用组合物时，可以将该组合物分散于盛装有无菌药物等级的水或盐水的灌注瓶中。在通过注射来施用组合物时，可以提供无菌水(用于注射)或盐水的安瓿，这样可以在施用前混合各种组分。

本发明的化合物可以被配制成中性或盐的形式。可药用的盐包括由阴离子形成的那些(例如由盐酸、磷酸、醋酸、草酸、酒石酸等衍生而来的那些)、以及由阳离子形成的那些(例如由氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等衍生而来的那些)。

可以通过标准的临床技术来确定能够有效治疗、抑制和预防与本发明多肽的异常表达和/或异常活性有关的疾病或紊乱的本发明化合物的量。此外，可以进行体外测试以帮助确定最佳的剂量范围。制剂中使用的精确剂量还取决于施用途径、以及疾病或紊乱的严重程度，并且根据从业者的判断和各患者的情况来确定。可以根据由体外或动物模型测试系统得到的剂量-应答曲线来推断有效剂量。

就抗体而言，对患者进行施用的剂量通常为患者体重的约0.1mg/kg至约100mg/kg。优选地，对患者进行施用的剂量为患者体重的约0.1mg/kg至约20mg/kg，更优选的为患者体重的约1mg/kg至约10mg/kg。在一些实施方案中，以总剂量为患者体重的约10mg/kg至约50mg/kg来施用两种或多种C35抗体。在另一个实施方案中，以总剂量为约20mg/kg至约40mg/kg来施用抗体。通常，由于对外源多肽的免疫应答，在人体内人抗体的半衰期要比来自其他物种的抗体的半衰期更长。因此，较低剂量的人抗体以及较少次数的施用通常是可行的。此外，通过修饰(例如脂化)来增大抗体的摄取或组织渗透可以减少本发明抗体的施用剂量和施用频率。此外，参见实施例5。

如上文所讨论的那样，本发明还提供了包含一个或多个容器的药物包装或试剂盒，其中所述的容器填充有一种或多种本发明药物组合物中的组分。例如，所述的药物包装或试剂盒可以包含抗体制备物，该抗体制备物包含两种或多种C35抗体、以及化疗试剂(例如紫杉醇或阿霉素)。在一些实施方案中，抗体在相同的容器中。在其他的实施方案中，抗体在分开的容器中。在一些实施方案中，化疗试剂与抗体制备物在相同的容器中。在其他的实施方案中，化疗试剂在分开的容器中。可任选的，对于所述容器需要注意的是其为由管理药物或生物产品的制造、使用或出售的政府机构所规定的形式，所述的注意事项反映了用于人类施用的制造、使用或售出机构的许可。

多种抗体可用于采用本领域的技术人员已知的常规的免疫组织学方法来测试生物样品中由本发明的多核苷酸编码的多肽的水平(例如参见Jalkanen，et al.，J.Cell.Biol.101：976-985(1985)；Jalkanen，et al.，J.Cell.Biol.105：3087-3096(1987))。用于检测蛋白质基因表达情况的其他基于抗体的方法包括免疫测定法，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射性免疫测定(RIA)。合适的抗体测试标记是本领域已知的，并且包括：酶标记，例如葡萄糖氧化酶；放射性同位素，例如碘(¹³¹I、¹²⁵I、¹²³I、¹²¹I)、碳(¹⁴C)、硫(³⁵S)、氚(³H)、铟(¹¹⁵mIn，¹¹³In，¹¹²In，¹¹¹In)、锝(⁹⁹Tc、⁹⁹mTc)、铊(²⁰1Ti)、镓(⁶⁸Ga、⁶⁷Ga)、钯(¹⁰³Pd)、钼(⁹⁹Mo)、氙(¹³³Xe)、氟(¹⁸F)、¹⁵³Sm、¹⁷⁷Lu、¹⁵⁹Gd、¹⁴⁹Pm、¹⁴⁰La、¹⁷⁵Yb、¹⁶⁶Ho、⁹⁰Y、⁴⁷Sc、¹⁸⁶Re、⁸⁸Re、¹⁴²Pr、¹⁰⁵Rh、⁹⁷Ru；发光标记，例如鲁米诺；以及荧光标记，例如荧光素、罗丹明和生物素。

除了测试生物样品中本发明多肽的水平以外，还可以通过成像在体内检测蛋白质。用于蛋白质体内成像的抗体标记或标记物包括可通过X-放射显影法、NMR或ESR检测的那些。对于X-放射显影法而言，合适的标记包括诸如钡或铯之类的放射性同位素，这种放射性同位素发射可检测的放射线，但是不会对受试者造成明显的伤害。对于NMR和ESR而言，合适的标记物包括具有可检测的特征性自旋的那些(例如氘)，可以通过标记用于相关杂交瘤细胞的营养物来将所述的合适的标记物并入到所述的抗体中。

将已经用合适的、可检测的成像部分标记的蛋白质特异性抗体或抗体片段引入(例如肠胃外、皮下或腹膜内)到待检测免疫系统紊乱的哺乳动物中，其中所述的合适的、可检测的成像部分例如有：放射性同位素(例如¹³¹I、I¹²In、⁹⁹mTc、(¹³¹I、¹²⁵I、¹²³I、¹²¹I)、碳(¹⁴C)、硫(³⁵S)、氚(³H)、铟(¹¹⁵mIn、¹¹³mIn、¹¹²In、¹¹¹In)、锝(⁹⁹Tc、⁹⁹mTc)、铊(²⁰¹Ti)、镓(⁶⁸Ga、⁶⁷Ga)、钯(¹⁰³Pd)、钼(⁹⁹Mo)、氙(¹³³Xe)、氟(¹⁸F、¹⁵³Sm、¹⁷⁷Lu、⁵⁹Gd、¹⁴⁹Pm、¹⁴⁰La、¹⁷⁵Yb、¹⁶⁶Ho、⁹⁰Y、⁴⁷Sc、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、¹⁴²Pr、¹⁰⁵Rh、⁹⁷Ru))、不透射线的物质或可通过核磁共振检测的物质。本领域应该理解的是，受试者的大小和所采用的成像系统决定了产生诊断图像所需的成像部分的量。在放射性同位素部分的情况，对于人受试者，所注入的放射性的量通常为约5至20毫居里的⁹⁹mTc。然后，标记的抗体或抗体片段优先积累在表达由本发明的多核苷酸编码的多肽的细胞位置。体内的肿瘤成像在S.W.Burchiel等人的＂Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and TheirFragments＂(Tumor Imaging中的第13章：The RadiochemicalDetection of Cancer，S.W.Burchiel and B.A.Rhodes，eds.，Masson Publishing Inc.(1982))中有所描述。

在一个实施方案中，本发明提供了通过施用与异源多肽或核酸结合的本发明的多肽(例如通过本发明的多核苷酸编码的多肽和/或抗体)来将本发明的组合物特异性地递送至细胞中的方法。在一个实施例中，本发明提供用于将治疗性蛋白质递送至靶细胞中的方法。在另一个实施例中，本发明提供了用于将单链核酸(例如反义核酸或核酶)或双链核酸(例如可以整合到细胞基因组或并进行附加型复制的、并且可以被转录的DNA)递送至靶细胞中的方法。

可以采用本领域已知的技术来标记本发明的多肽(包括抗体)。所述的技术包括，但不限于双功能缀合剂的使用(例如参见美国专利序号5,756,065、5,714,631、5,696,239、5,652,361、5,505,931、5,489,425、5,435,990、5,428,139、5,342,604、5,274,119、4,994,560和5,808,003，上述文献中每份文献的内容在此均以引用方式全文并入本文)。

X.诊断

本发明进一步提供了在癌症的诊断过程中使用的诊断方法，该方法包括：测量来自个体的组织、其他细胞或体液中的C35蛋白质或转录子的表达水平；将所测量的表达水平与正常组织或体液中的标准的C35表达水平进行比较，因此，与标准的表达水平相比，表达水平的升高是紊乱的指示。

C35特异性抗体可以用于采用本领域技术人员已知的常规的免疫组织学方法来测试生物样品中蛋白质的水平(例如参见Jalkanen，etal.，J.Cell.Biol.101：976-985(1985)；Jalkanen，et al.，J.Cell Biol.105：3087-3096(1987))。其他用于检测蛋白质表达情况的基于抗体的方法包括(例如)免疫测定，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫沉淀法或蛋白质印迹法。合适的测定法在本文的其他处由更详细的描述。

“测试C35多肽的表达水平”是指对第一种生物样品中的C35多肽的水平进行直接的(例如测定或估测绝对蛋白质水平)或间接的(例如与第二种生物样品中的疾病相关多肽进行比较)定性或定量的测量或估测。优选地，对第一种生物样品中的C35多肽表达水平进行测量或估测，并将其与标准的C35多肽水平作比较，其中所述的标准水平来自第二种生物样品，而该第二种生物样品是来自未患有紊乱的个体或者是通过由未患有紊乱的个体人群的平均水平来确定的。如本领域所理解的那样，一旦已知“标准”的C35多肽水平，便可以将其作为标准反复用于比较。

“生物样品”是指来自个体、细胞系、组织培养或潜在地表达C35的细胞的其他来源。用于获得哺乳动物的组织活检和体液的方法是本领域公知的。

在上文所述的诊断方法中使用的C35抗体包括与C35基因产物进行特异性结合的任何C35抗体，如本文其他处所述。

XI.免疫测定

可以通过本领域已知的任意方法测定本发明抗体的免疫特异结合。可以使用的免疫测定包括但不限于竞争和非竞争测定系统，使用诸如蛋白质印迹、放射免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、“三明治”免疫测定、免疫沉淀测定、沉淀反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定、凝集测定、补体结合测定、免疫放射测定、荧光免疫测定、蛋白A免疫测定，等等。此类测定是本领域常规和公知的(见，例如，Ausubel et al，eds，1994，Current Protocols in MolecularBiology，Vol.1，John Wiley & Sons，Inc.，New York，将其完整引入本文作为参考)。下面简要描述代表性免疫测定(但是意在作为示例)。

免疫沉淀方案通常包括在补加蛋白质磷酸酶和/或蛋白酶抑制剂(例如，EDTA、PMSF、抑肽酶、钒酸钠)的裂解缓冲液中裂解细胞群体，所述裂解缓冲液为诸如RIPA缓冲液(1％ NP-40或Triton X-100，1％去氧胆酸钠，0.1％ SDS，0.15M NaCl，0.01M磷酸钠，pH7.2，1％ Trasylol)，向细胞裂解物中加入目的抗体，在4℃孵育一定时间(例如1-4小时)，向细胞裂解物中加入蛋白A和/或蛋白Gsepharose珠，在4℃孵育约1小时或以上，在裂解缓冲液中洗涤珠子，并在SDS/样品缓冲液中重悬浮珠子。目的抗体免疫沉淀特定抗原的能力可以通过例如蛋白质印迹分析评估。本领域技术人员将理解这样的参数，可以修改这些参数以增加抗体对抗原的结合和降低背景(例如，用sepharose珠子预清除细胞裂解物)。关于免疫沉淀方案的进一步讨论，见，例如，Ausubel et al，eds，1994，Current Protocols inMolecular Biology，Vol.1，John Wiley & Sons，Inc.，New York的10.16.1。

蛋白质印迹分析通常包括制备蛋白质样品，在聚丙烯酰胺凝胶(例如，8％-20％SDS-PAGE，取决于抗原的分子量)中电泳蛋白质样品，将蛋白质样品从聚丙烯酰胺凝胶转移到膜，如硝酸纤维素、PVDF或者尼龙，在封闭溶液中封闭膜(例如，含有3％BSA或者脱脂奶的PBS)，用洗涤缓冲液(例如，PBS-Tween 20)洗涤膜，用在封闭缓冲液中稀释的一级抗体(目的抗体)封闭膜，在洗涤缓冲液洗涤膜，用在封闭缓冲液中稀释的缀合酶底物(例如，辣根过氧化物酶或者碱性磷酸酶)或者放射性分子(例如，32P或者125I)的二级抗体(其识别一级抗体，例如，抗-人抗体)封闭膜，在洗涤缓冲液中洗涤膜，并检测所述抗原的存在。本领域技术人员将理解可以修改用以增强所检测的信号和减小背景噪声的参数。关于蛋白质印迹方案的进一步讨论，见，例如，Ausubel et al，eds，1994，Current Protocols in MolecularBiology，Vol.1，John Wiley & Sons，Inc.，New York的10.8.1。

ELISA包括制备抗原，用该抗原包被96孔微量滴定板的孔，向孔中加入缀合可检测的化合物，如酶促底物(例如，辣根过氧化物酶或者碱性磷酸酶)的目的抗体，并孵育一定时间，检测所述抗原的存在。在ELISA中，目的抗体不用必须缀合到可检测的化合物；或者，可以向孔中加入缀合可检测化合物的二级抗体(其识别目的抗体)。此外，可以用抗体包被孔，来代替用抗原包被孔。在该情况下，可以在向包被的孔加入目的抗原后，加入缀合到可检测化合物的二级抗体。本领域技术人员将理解可以修改后增强检测的参数以及本领域已知的ELISA的其他变量。关于ELISA的进一步讨论，见，例如，Ausubel etal，eds，1994，Current Protocols in Molecular Biology，Vol.1，John Wiley & Sons，Inc.，New York的11.2.1。

可以通过竞争结合测定法测定抗体对抗原的结合亲和性和抗体-抗原相互作用的解离速率。竞争结合测定的一个实例是放射免疫测定，其包括在数量逐渐增加的未标记抗原的存在下孵育标记的抗原(例如，³H或者¹²⁵I)与目的抗体，并检测与标记的抗原结合的抗体。目的抗体对特定抗原的亲和性和结合解离速率可以从斯卡查德图(scatchardplot)分析的数据确定。还可以使用放射免疫测定法确定与第二种抗体的竞争。在该情况中，在数量逐渐增加的未标记的第二种抗体的存在下，将抗原与缀合标记的化合物(例如，³H或者¹²⁵I)的目的抗体孵育。

本发明的抗体(或者其片段)和/或癌抗原多肽可以额外地用于组织学，如在免疫荧光、免疫电子显微术或者非免疫学测定中，用于原位检测癌抗原基因产物或者其保守变体或者肽片段。从患者取出组织学样品，并对其应用本发明的标记的抗体或者癌抗原多肽，可以完成原位检测。优选将标记的抗体(或者片段)覆盖在生物样品上来应用抗体(或者片段)或者癌抗原多肽。通过使用这种方法，可以不仅确定癌抗原基因产物或者保守变体或者肽片段的存在，或者癌抗原多肽结合，还可以确定它在所检查的组织中的分布。本领域技术人员使用本发明将容易地理解为了实现这种原位检测，可以修改多种组织学方法(如染色步骤)的任一种。

用于C35基因产物或者保守变体或肽片段的免疫测定和非免疫测定通常包括：在能够与C35或者其保守变体或肽片段结合的可检测的标记抗体存在下，对已经在细胞培养物中温育的样品(例如生物流体、组织提取物、新收获的细胞或者细胞裂解物)进行温育；以及通过本领域中公知的多种技术中的任何技术检测结合的抗体。

可以将生物样品接触或者固定在固相支持体或者载体上，如硝酸纤维素，或者能够固定细胞、细胞颗粒或者可溶性蛋白质的其他固相支持体。然后可以用适宜的缓冲液洗涤支持体，接着用可检测的经标记的抗癌抗原抗体或者可检测的癌抗原多肽处理。然后可以用缓冲液再次洗涤固相支持体以除去未结合的抗体或者多肽。任选地，随后标记抗体。然后可以通过常规方法检测固相支持体上结合的标记的量。

“固相支持体或者载体”意指能够结合抗原或者抗体的任意支持体。公知的支持体或者载体包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、天然和修饰的纤维素、聚丙烯酰胺、辉长岩和磁石。对于本发明，载体的形式可以是一定程度上可溶的或者不溶的。支持体材料可以几乎是任意可能的结构形状，只要偶联的分子能够结合抗原或抗体。从而，支持体形状可以是球形的，如珠子，或者圆柱形，如试管的内表面，或者棒的外表面。备选地，表面可以是平的，如片、试验带，等等。优选的支持体包括聚苯乙烯珠。本领域技术人员将知道用于结合抗体或者抗原的许多其他适宜的载体，或者将能够使用常规实验确定所述载体。

可以根据本领域公知的方法确定给定的许多抗-癌抗原抗体或者癌抗原多肽的结合活性。本领域技术人员将能够用常规实验方法对每次测定确定可操作的和最佳的测定条件。

有多种方法可用于测量抗体-抗原相互作用的亲和性，但是相对少的方法可以用于确定速率常数。多数方法依赖标记抗体或者抗原，其不可避免地使得常规测量复杂化并且在所测量的量中引入了不确定性。

在BIAcore上进行的表面等离子体共振(SPR)相对于测量抗体-抗原作用的亲和性的常规方法提供了许多优点：(i)不需要标记抗体或抗原；(ii)抗体不必预先纯化，细胞培养上清液可以直接使用；(iii)能够进行实时测量，允许快速半定量比较不同的单克隆抗体相互作用，并且实时测量对于许多评估目的是足够的；(iv)可以再生生物特异表面使得可以在相同条件下容易地比较一系列不同的单克隆抗体；(v)分析步骤完全自动化，并且不用用户干预就可以进行广泛系列的测量。BIAapplications Handbook，版本AB(再版1998)，BIACORE code No.BR-1001-86；BIAtechnology Handbook，版本AB(再版1998)，BIACORE code No.BR-1001-84。

基于SPR的结合研究需要结合对的一个成员固定在传感器表面上。所固定的结合配偶体称作配体。溶液中的结合配偶体称作分析物。在一些情况中，配体通过另一固定的分子(称作捕获分子)间接附着到表面。SPR反应反映了检测器表面由于分析物结合或者解离引起的质量浓度的改变。

基于SPR，实时BIAcore测量直接监视发生的相互作用。该技术很适合确定动力学参数。比较亲和性等级评定非常容易进行，并且可以从sensorgram数据得到动力学和亲和常数。

当分析物以不连续脉冲注射穿过配体表面时，可以将所得sensorgram分成三个基本阶段：(i)在样品注射期间分析物与配体的结合；(ii)样品注射期间的平衡或者稳态，其中分析物结合速率受到从复合物解离的平衡；(iii)缓冲液流动期间分析物从表面的解离。

结合和解离期提供了关于分析物-配体相互作用的动力学的信息(k_a和k_d，复合物形成和解离的速率，k_d/k_a＝KD)。平衡期提供了关于分析物-配体相互作用的亲和性的信息(KD)。

BIAevaluation软件提供了多种功能用于通过数字积分和总体拟合算法进行曲线拟合。使用适当的数据分析，可以从简单的BI Acore研究得到相互作用的单独的速率和亲和常数。通过该技术可以测量的亲和性范围非常宽，从mM到pM。

表位特异性是单克隆抗体的重要特征。与使用放射免疫测定、ELISA或其它表面吸附方法的常规技术相比，用BIAcore进行表位作图不需要标记或者纯化的抗体，并且允许用一些单克隆抗体进行多位点特异性测试。此外，可以自动处理许多分析。

逐对结合实验测试两种MAb同时结合相同抗原的能力。针对分隔表位的MAb将独立地结合，而针对密切相关的表位的MAb将干扰相互的结合。用BIAcore进行的这些结合实验可以直接进行。

例如，可以使用捕获分子结合第一种MAb，然后顺序加入抗原和第二种MAb。Sensorgram将揭示：1.有多少抗原结合到第一种MAb，2.第二种MAb结合到表面附着的抗原的程度，3.如果第二种MAb不结合，那么改变逐对测试的顺序是否改变结果。

肽抑制是用于表位作图的另一种技术。该方法可以补充逐对抗体结合研究，并且当抗原的一级序列是已知的时候，可以将功能表位与结构特征联系起来。测试肽或者抗原片段抑制不同MAb对固定化抗原的结合。认为干扰给定MAb的结合的肽在结构上与该MAb定义的表位相关。

除非另作说明，否则本发明的实施使用了细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA以及免疫学的常规技术，这些技术都在本领域的技术范围内。这些技术在文献中都有充分的说明。例如参见Molecular Cloning A Laboratory Manual，2ndEd.，Sambrook et al.，ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press：(1989)；Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Sambrook et al.，ed.，Cold Springs Harbor Laboratory，New York(1992)，DNACloning，D.N.Glovered.，Volumes I and II(1985)；Oligonucleotide Synthesis，M.J.Gait ed.，(1984)；Mullis etal.U.S.Pat.No：4,683,195；Nucleic Acid Hybridization，B.D.Hames & S.J.Higgins eds.(1984)；Transcription And Translation，B.D.Hames & S.J.Higgins eds.(1984)；Culture Of Animal Cells，R.I.Freshney，Alan R.Liss，Inc.，(1987)；Immobilized CellsAnd Enzymes，IRL Press，(1986)；B.Perbal，A Practical GuideTo Molecular Cloning(1984)；the treatise，Methods InEnzymology，Academic Press，Inc.，N.Y.；Gene Transfer VectorsFor Mammalian Cells，J.H.Miller and M.P.Calos eds.，ColdSpring Harbor Laboratory(1987)；Methods In Enzymology，VoIs.154 and 155(Wu et al.eds.)；Immunochemical Methods In CellAnd Molecular Biology，Mayer and Walker，eds.，Academic Press，London(1987)；Handbook Of Experimental.Immunology，VolumesI-IV，D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，(1986)；Manipulatingthe MouseEmbryo，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.，(1986)；以及in Ausubel et al，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，Baltimore，Maryland(1989)。

抗体工程的主要原理在Antibody Engineering，2nd edition，C.A.K.Borrebaeck，Ed.，Oxford Univ.Press(1995)中列出。蛋白质工程的主要原理在Protein Engineering，A Practical Approach，Rickwood，D.，et al.，Eds.，IRL Press at Oxford Univ.Press，Oxford，Eng.(1995)中列出。抗体以及抗体-半抗原的结合的主要原理在Nisonoff，A.，Molecular Immunology，2nd ed.，SinauerAssociates，Sunderland，MA(1984)；以及Steward，M.W.，Antibodies，Their Structure and Function，Chapman and Hall，NewYork，NY(1984)中列出。此外，本领域已知的并且并非特异描述的标准的免疫学方法通常可以根据Current Protocols in Immunology，John Wiley & Sons，New York；Stites et al.(eds)，Basic andClinical-Immunology(8th ed.)，Appleton & Lange，Norwalk，CT(1994)and Mishell and Shiigi(eds)，Selected Methods inCellular Immunology，W.H.Freeman and Co.，New York(1980)。

列出了免疫学的主要原理的标准的文献著作包括CurrentProtocols in Immunology，John Wiley & Sons，New York；Klein，J.，Immunology：The Science of Self-Nonself Discrimination，John Wiley & Sons，New York(1982)；Kennett，R.，et al.，eds.，Monoclonal Antibodies，Hybridoma：A New Dimension in BiologicalAnalyses，Plenum Press，New York(1980)；Campbell，A.，＂Monoclonal Antibody Technology＂in Burden，R.，et al.，eds.，Laboratory Technique s in Biochemistry and Molecular Biology，Vol.13，El severe，Amsterdam(1984)，Kuby Immunnology 4* ed.Ed.Richard A.Goldsby，Thomas J.Kindt and Barbara A.Osborne，H.Freemand & Co.(2000)；Roitt，L，Brostoff，J.and Male D.，Immunology 6^thed.London：Mosby(2001)；Abbas A.，Abul，A.andLichtman，A.，Cellular and Molecular Immunology Ed.5，ElsevierHealth Sciences Division(2005)；Kontermann and Dubel，AntibodyEngineering，Springer Verlan(2001)；Sambrook and Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual.Cold Spring HarborPress(2001)；Lewin，Genes VIII，Prentice Hall(2003)；Harlowand Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborPress(1988)；Dieffenbach and Dveksler，PCR Primer Cold SpringHarbor Press(2003)。

上文所述的所有文献、以及现在和下文中所述的所有文献均以引用方式全文并入本文。

以下为本发明的某些具体的非限定性的实施方案：

项目1：一种杀死表达C35的癌细胞的方法，该方法包括向所述的细胞施用(a)特异性结合C35的第一种C35抗体或者其抗原结合片段；(b)特异性结合C35的第二种C35抗体或者其抗原结合片段；以及(c)治疗性试剂。

项目2：项目1所述的方法，其中所述的方法是在体内实施的。

项目3：项目2所述的方法，其中所述的方法是在哺乳动物中实施的。

项目4：项目3所述的方法，其中所述的哺乳动物为人。

项目5：项目1-4的任何一项中所述的方法，其中所述的第一种和第二种C35抗体或片段分别与不同的C35表位结合。

项目6：项目1-5的任何一项中所述的方法，其中所述的第一种C35抗体或片段、或者第二种C35抗体或片段中的至少一种与C35表位结合，其中所述的C35表位选自：位于SEQ ID NO：2的第105-115的氨基酸残基内的C35表位；位于SEQ ID NO：2的第48-87的氨基酸残基内的C35表位；以及位于SEQ ID NO：2的第48-104的氨基酸残基内的C35表位。

项目7：项目1-6的任何一项中所述的方法，其中所述的治疗性试剂是化疗试剂。

项目8：项目7所述的方法，其中所述的化疗试剂选自：顺铂、卡铂、紫杉醇、阿霉素、多西他赛、泰素帝、吉西他滨和长春瑞滨。

项目9：项目8所述的方法，其中所述的化疗试剂为紫杉醇。

项目10：项目8所述的方法，其中所述的化疗试剂为阿霉素。

项目11：项目1-10的任何一项中所述的方法，其中在施用所述的第一种C35抗体或所述的第二种C35抗体中的至少一种之前，施用所述的治疗性试剂。

项目12：项目1-10的任何一项中所述的方法，其中在施用所述的第一种C35抗体或所述的第二种C35抗体中的至少一种之后，施用所述的治疗性试剂。

项目13：项目1-10的任何一项中所述的方法，其中在施用所述的第一种C35抗体或所述的第二种C35抗体中的至少一种的同时，施用所述的治疗性试剂。

项目14：项目1-10的任何一项中所述的方法，其中所述的第一种C35抗体或所述的第二种C35抗体同时施用。

项目15：项目1-10的任何一项中所述的方法，其中所述的第一种C35抗体或所述的第二种C35抗体依次施用。

项目16：项目1-15的任何一项中所述的方法，其中各种所述的C35抗体或片段的施用剂量为患者体重的约0.1mg/kg至约100mg/kg。

项目17：项目1-16的任何一项中所述的方法，其中所述的第一种C35抗体或片段或者所述的第二种C35抗体或片段中的至少一种选自1F2、1B3、MAbc0009、MAb 163、MAb 165、MAb 171、以及它们的变体或衍生物。

项目18：项目17所述的方法，其中所述的第一种C35抗体或片段或者所述的第二种C35抗体或片段中的一种为MAb163或者其变体或衍生物。

项目19：项目17所述的方法，其中所述的第一种C35抗体或片段或者所述的第二种C35抗体或片段中的一种为1B3或者其变体或衍生物。

项目20：项目17所述的方法，其中所述的第一种C35抗体或片段或者所述的第二种C35抗体或片段中的一种为1F2或者其变体或衍生物。

项目21：项目17所述的方法，其中所述的第一种C35抗体或者所述的第二种C35抗体选自1F2、1B3、MAbc0009、MAb 163、MAb 165、MAb 171、以及它们的变体或衍生物。

项目22：项目21所述的方法，其中所述的第一种C35抗体或者所述的第二种C35抗体为1B3和1F2、或者它们的变体或衍生物。

项目23：项目1-22的任何一项中所述的方法，其中所述的癌细胞选自乳腺癌、肝癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、结肠癌和黑素瘤。

项目24：项目23所述的方法，其中所述的癌细胞为乳腺癌细胞。

项目25：项目23所述的方法，其中所述的癌细胞为肝癌细胞。

项目26：项目1-25的任何一项中所述的方法，其中所述的方法包括施用多于两种的C35抗体或其片段。

项目27：一种分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性地结合与参照抗体MAb163相同的C35表位。

项目28：一种特异性结合C35的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体或其片段竞争性地抑制参照单克隆抗体MAb 163与C35进行的特异性结合。

项目29：一种特异性结合C35的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体或其片段为MAb 163。

项目30：项目27-29的任何一项中所述的抗体或其片段，其与线性的表位结合。

项目31：项目27-29的任何一项中所述的抗体或其片段，其与非线性构型的表位结合。

项目32：项目27-31的任何一项中所述的抗体或其片段，其为多价的，并且包含至少两条重链和至少两条轻链。

项目33：项目27-32的任何一项中所述的抗体或其片段，其为多特异性的。

项目34：项目27-32的任何一项中所述的抗体或其片段，其为双特异性的。

项目35：项目27-28或者30-34的任何一项中所述的抗体或其片段，其为人源化的。

项目36：项目27-34的任何一项中所述的抗体或其片段，其为嵌合的。

项目37：项目27-34的任何一项中所述的抗体或其片段，其为灵长动物化的。

项目38：项目27-34的任何一项中所述的抗体或其片段，其完全为人的。

项目39：项目27-38的任何一项中所述的抗体或其片段，其为Fab片段。

项目40：项目27-38的任何一项中所述的抗体或其片段，其为Fab’片段。

项目41：项目27-38的任何一项中所述的抗体或其片段，其为F(ab)₂片段。

项目42：项目27-38的任何一项中所述的抗体或其片段，其为Fv片段。

项目43：项目27-38的任何一项中所述的抗体或其片段，其为单链抗体。

项目44：项目27-28或者28-43的任何一项中所述的抗体或其片段，其特异性结合C35多肽或其片段、或者C35变体多肽，它们的亲和力可表征为解离常数(K_D)，该解离常数低于MAb 163的K_D。

项目45：项目27-43的任何一项中所述的抗体或其片段，其特异性结合C35多肽或其片段、或者C35变体多肽，它们的亲和力可表征为解离常数(K_D)，该解离常数不大于5 x 10^-2M、10^-2M、5 x 10^-3M、10^-3M、5 x 10^-4M、10^-4M、5 x 10^-5M、10^-5M、5 x 10^-6M、10^-6M、5 x 10^-7M、10^-7M、5 x 10^-8M、10^-8M、5 x 10^-9M、10^-9M、5 x 10^-10M、10^-10M、5 x 10^-11M、10^-11M、5 x 10^-12M、10^-12M、5 x 10^-13M、10^-13M、5 x 10^-14M、10^-14M、5 X 10^-15M或10^-15M。

项目46：项目45所述的抗体或其片段，其中所述的抗体或片段特异性结合C35多肽或其片段、或者C35变体多肽，它们的亲和力可表征为解离(K_D)，该解离常数不大于约3.4 x 10^-9M。

项目47：项目27-46的任何一项中所述的抗体或其片段，其进一步包含与其融合的异源多肽。

项目48：项目27-47的任何一项中所述的抗体或其片段，其中所述的抗体与一种试剂缀合，其中所述的试剂选自：治疗性试剂、药物前体、肽、蛋白质、酶、病毒、脂质、生物应答修饰剂、药物试剂或PEG。

项目49：一种组合物，其包含项目27-48或者214-220的任何一项中所述的抗体或其片段、以及载体。

项目50：一种包含VH区域和VL区域的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述的VH和VL区域分别包含与由SEQ ID NO：62和SEQ IDNO：66构成的参照多肽具有至少90％的一致性的多肽序列，并且其中包含所述的VH和VL的抗体或其抗原结合片段特异性结合C35。

项目51：项目50所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述的VH区域和所述的VL区域分别包含与所述的参照多肽具有至少95％的一致性的多肽序列。

项目52：一种包含VH区域和VL区域的分离的抗体或其抗原结合片段，其中除了少于20个氨基酸的取代以外，所述的VH区域和所述的VL区域分别与由SEQ ID NO：62和SEQ ID NO：66构成的参照多肽相同，并且其中包含所述的VH和VL的抗体或其抗原结合片段特异性结合C35。

项目53：项目51所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中除了少于10个氨基酸的取代以外，所述的VH区域和所述的VL区域分别与参照多肽相同。

项目54：一种包含VH区域和VL区域的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述的VH和VL区域分别包含SEQ ID NO：62和SEQ ID NO：66所示的多肽。

项目55：一种分离的多核苷酸，其包含编码免疫球蛋白重链可变区(VH)的核酸，其中除了少于10个氨基酸的取代以外，所述VH的CDR1、CDR2和CDR3区域分别与SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64和SEQID NO：65所示的参照重链CDR1、CDR2和CDR3序列相同，并且其中包含所述的VH的抗体或其抗原结合片段特异性结合C35。

项目56：项目55所述的多核苷酸，其中除了少于5个氨基酸的取代以外，所述VH的所述CDR1、CDR2和CDR3区域分别相同。

项目57：项目55-56的任何一项中所述的多核苷酸，其中所述VH的所述CDR1、CDR2和CDR3区域包含SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64和SEQ ID NO：65所示的多肽序列。

项目58：一种分离的多核苷酸，其包含编码免疫球蛋白重链(VH)的核酸，其中所述VH的所述CDR1、CDR2和CDR3区域由SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73和SEQ ID NO：74所示的参照核酸序列编码。

项目59：一种分离的多核苷酸，其包含编码VH区域的核酸，其中所述的VH区域与SEQ ID NO：62所示的参照VH多肽序列具有至少90％的一致性，其中包含所述VH的抗体或其抗原结合片段特异性结合C35。

项目60：项目59所述的多核苷酸，其中所述的VH区域与SEQ IDNO：62所示的参照VH多肽序列具有至少95％的一致性。

项目61：一种分离的多核苷酸，其包含编码VH区域的核酸，其中除了少于20个氨基酸的取代以外，所述VH区域与SEQ ID NO：62所示的参照VH多肽序列相同，并且其中包含所述的VH的抗体或其抗原结合片段特异性结合C35。

项目62：项目61所述的多核苷酸，其中除了少于10个氨基酸的取代以外，所述的编码VH区域的核酸与SEQ ID NO：62所示的参照VH多肽序列相同。

项目63：项目55-62的任何一项中所述的多核苷酸，其中所述的VH与所述的参照VH相同。

项目64：项目55-62的任何一项中所述的多核苷酸，其中所述的VH是由SEQ ID NO：70所示的核酸序列编码的。

项目65：一种分离的多核苷酸，其包含与SEQ ID NO：70所示的序列具有90％、95％、99％或100％的一致性的核酸序列。

项目66：项目55-65的任何一项中所述的多核苷酸，其进一步包含编码与所述的VH融合的单链肽的核酸。

项目67：项目55-66的任何一项中所述的多核苷酸，其进一步包含与所述的VH融合的重链恒定区或其片段。

项目68：项目67所述的多核苷酸，其中所述的恒定区或其片段为CH1结构域。

项目69：项目68所述的多核苷酸，其中所述的恒定区或其片段为CH2结构域。

项目70：项目67所述的多核苷酸，其中所述的恒定区或其片段为CH3结构域。

项目71：项目67所述的多核苷酸，其中所述的恒定区或其片段为铰链区。

项目72：项目67-71的任何一项中所述的多核苷酸，其中所述的恒定区或其片段为人的。

项目73：项目72所述的多核苷酸，其中所述的恒定区或其片段来自IgG。

项目74：项目55-73的任何一项中所述的多核苷酸，其中包含所述的VH的抗体或其抗原结合片段特异性结合与MAb 163所结合的相同的表位。

项目75：项目55-73的任何一项中所述的多核苷酸，其中包含所述的VH的抗体或其抗原结合片段竞争性地抑制MAb163与C35的结合。

项目76：一种分离的多核苷酸，其包含编码免疫球蛋白轻链可变区(VL)的核酸，其中除了少于10个氨基酸的取代以外，所述VL的CDR1、CDR2和CDR3区域分别与由SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68和SEQ ID NO：69构成的参照轻链CDR1、CDR2和CDR3序列相同，并且其中包含所述的VL的抗体或其抗原结合片段特异性结合C35。

项目77：项目76所述的多核苷酸，其中除了少于5个氨基酸的取代以外，所述VL的所述CDR1、CDR2和CDR3区域分别与所述的参照轻链CDR1、CDR2和CDR3序列相同。

项目78：项目76-77的任何一项中所述的多核苷酸，其中所述的VL的CDR1、CDR2和CDR3区域包含多肽序列，该多肽序列选自SEQ IDNO：67、SEQ ID NO：68和SEQ ID NO：69。

项目79：一种分离的多核苷酸，其包含编码免疫球蛋白重链可变区(VL)的核酸，其中所述VL的所述CDR1、CDR2和CDR3区域由参照核酸序列SEQ ID NO：75、SEQ ID NO.76和SEQ ID NO：77编码。

项目80：一种分离的多核苷酸，其包含编码VL区域的核酸，该VL区域与SEQ ID NO：66所示的参照VL多肽序列具有至少90％的一致性，其中包含所述的VL的抗体或其抗原结合片段特异性结合C35。

项目81：项目80所述的分离的多核苷酸，其中所述的VL区域与所述的参照VL多肽序列具有至少95％的一致性。

项目82：一种分离的多核苷酸，其包含编码VL区域的核酸，其中除了少于20个氨基酸的取代以外，所述VL区域与SEQ ID NO：66所示的参照VL多肽序列相同，并且其中包含所述的VL的抗体或其抗原结合片段特异性结合C35。

项目83：项目81所述的多核苷酸，其中除了少于10个氨基酸的取代以外，所述的编码VL区域的核酸与所述的参照VL多肽序列相同。

项目84：项目76-83的任何一项中所述的多核苷酸，其中所述的VL与所述的参照VL相同。

项目85：项目84所述的多核苷酸，其中所述的VL由SEQ ID NO：71所构成的核酸序列编码。

项目86：一种分离的多核苷酸，其包含与SEQ ID NO：71所示的序列具有90％、95％、99％或100％的一致性的核酸序列。

项目87：项目76-86的任何一项中所述的多核苷酸，其进一步包含编码与所述的VL融合的信号肽的核酸。

项目88：项目76-87的任何一项中所述的多核苷酸，其进一步包含编码与所述的VL融合的CL结构域的核酸。

项目89：项目88所述的多核苷酸，其编码与所述的VL融合的CL结构域，其中所述的CL结构域为κ链。

项目90：项目88所述的多核苷酸，其编码与所述的VL融合的CL结构域，其中所述的CL结构域为λ链。

项目91：项目88-90的任何一项中所述的多核苷酸，其编码与所述的VL融合的CL结构域，其中所述的CL结构域为人的。

项目92：项目76-91的任何一项中所述的多核苷酸，其中包含所述的VL的抗体或其抗原结合片段特异性结合与MAb 163所结合的相同的表位。

项目93：项目76-92的任何一项中所述的多核苷酸，其中包含所述的VL的抗体或其抗原结合片段竞争性地抑制MAb 163与C35的结合。

项目94：项目55-93的任何一项中所述的多核苷酸，其进一步包含异源多核苷酸。

项目95：项目94所述的多核苷酸，其中所述的异源核酸编码异源多肽。

项目96：项目55-95的任何一项中所述的多核苷酸，其中包含所述的VH或所述的VL的抗体或其抗原结合片段特异性结合线性表位。

项目97：项目55-95的任何一项中所述的多核苷酸，其中包含所述的VH或所述的VL的抗体或其抗原结合片段特异性结合非线性构型的表位。

项目98：项目55-97的任何一项中所述的多核苷酸，其中包含所述的VH或所述的VL的抗体或其抗原结合片段为包含至少两条重链和至少两条轻链的多价抗体分子。

项目99：项目55-98的任何一项中所述的多核苷酸，其中包含所述的VH或所述的VL的抗体或其抗原结合片段为多特异性的。

项目100：项目55-98的任何一项中所述的多核苷酸，其中包含所述的VH或所述的VL的抗体或其抗原结合片段为双特异性的。

项目101：项目55-100的任何一项中所述的多核苷酸，其中包含所述的VH或所述的VL的抗体或其抗原结合片段为一价、二价、多价或双功能的。

项目102：项目55-101的任何一项中所述的多核苷酸，其中包含所述的VH或所述的VL的抗体或其抗原结合片段是人源化的。

项目103：项目55-101的任何一项中所述的多核苷酸，其中包含所述的VH、所述的VL、或所述的VH和所述的VL两者的抗体或其抗原结合片段是嵌合的。

项目104：项目55-101的任何一项中所述的多核苷酸，其中包含所述的VH或所述的VL的抗体或其抗原结合片段完全是人的。

项目105：项目55-101的任何一项中所述的多核苷酸，其中包含所述的VH或所述的VL的抗体或其抗原结合片段为Fab片段。

项目106：项目55-101的任何一项中所述的多核苷酸，其中包含所述的VH或所述的VL的抗体或其抗原结合片段为Fab′片段。

项目107：项目55-101的任何一项中所述的多核苷酸，其中包含所述的VH或所述的VL的抗体或其抗原结合片段为F(ab)₂片段。

项目108：项目55-101的任何一项中所述的多核苷酸，其中包含所述的VH或所述的VL的抗体或其抗原结合片段为Fv片段。

项目109：项目55-101的任何一项中所述的多核苷酸，其中包含所述的VH或所述的VL的抗体或其抗原结合片段为单链抗体。

项目110：项目55-109的任何一项中所述的多核苷酸，其中包含所述的VH或所述的VL的抗体或其抗原结合片段特异性结合C35多肽或其片段、或者C35变体多肽，它们的亲和力可表征为解离常数(KD)，该解离常数不大于5 x 10^-2M、10^-2M、5 x 10^-3M、10^-3M、5 x 10^-4M、10^-4M、5 x 10^-5M、10^-5M、5 x 10^-6M、10^-6M、5 x 10^-7M、10^-7M、5 x 10^-8M、10^-8M、5 x 10^-9M、10^-9M、5 x 10^-10M、10^-10M、5 x 10^-11M、10^-11M、5 x 10^-12M、10^-12M、5 x 10^-13M、10^-13M、5 x 10^-14M、10^-14M、5 X 10^-15M或10^-15M。

项目111：项目110所述的多核苷酸，其中所述的抗体或片段特异性结合C35多肽或其片段、或者C35变体多肽，它们的亲和力可表征为解离常数(K_D)，该解离常数不大于约3.4 x 10^-9M。

项目112：一种分离的多核苷酸，其包含编码MAb 163单克隆抗体的至少一个互补决定区(CDR)或其变体的核酸序列，其中所述的多核苷酸编码特异性结合C35的多肽。

项目113：项目112所述的分离的多核苷酸，其中所述的多核苷酸包含编码Mab 163单克隆抗体的至少两个CDR的核酸序列。

项目114：项目112所述的分离的多核苷酸，其中所述的多核苷酸包含编码Mab 163单克隆抗体的至少三个CDR的核酸序列。

项目115：项目112所述的分离的多核苷酸，其中所述的多核苷酸包含编码Mab 163单克隆抗体的至少四个CDR的核酸序列。

项目116：项目112所述的分离的多核苷酸，其中所述的多核苷酸包含编码Mab 163单克隆抗体的至少五个CDR的核酸序列。

项目117：项目112所述的分离的多核苷酸，其中所述的多核苷酸包含编码Mab 163单克隆抗体的至少六个CDR的核酸序列。

项目118：包含项目55-117或213的任何一项中所述的多核苷酸的载体。

项目119：项目118所述的载体，其中所述的多核苷酸可操作地与启动子关联。

项目120：项目119所述的载体，其中所述的编码VH的多核苷酸和所述的编码VL的多核苷酸融合于框架中，从与它们可操作地连接的单一启动子共转录，并共翻译形成单链抗体或其抗原结合片段。

项目121：项目119所述的载体，其中所述的编码VH的多核苷酸和所述的编码VL的多核苷酸从与它们可操作地连接的单一启动子共转录，但是分别翻译。

项目122：项目121所述的载体，其进一步包含被设置在所述的编码VH的多核苷酸和所述的编码VL的多核苷酸之间的IRES序列。

项目123：项目121所述的载体，其中所述的编码VH的多核苷酸和所述的编码VL的多核苷酸被分别转录，其中每一个多个甘酸都与分开的启动子可操作地连接。

项目124：项目123所述的载体，其中所述的分开的启动子为同一启动子的拷贝。

项目125：项目123所述的载体，其中所述的分开的启动子是不同的。

项目126：一种包含项目55-125的任何一项中所述的多核苷酸或载体的组合物。

项目127：一种包含VH编码多核苷酸和VL编码多核苷酸的组合物，其中所述的VH编码多核苷酸和所述的VL编码多核苷酸分别包含如下多核苷酸，该多核苷酸编码与由SEQ ID NO：62和SEQ ID NO：66构成的参照多肽具有至少90％的一致性的氨基酸序列，并且其中所述的VH编码多核苷酸和所述的VL编码多核苷酸一起编码特异性结合C35的抗体或其结合片段。

项目128：项目127所述的组合物，其中所述的VH编码多核苷酸和所述的VL编码多核苷酸包含如下多核苷酸，该多核苷酸编码与所述的参照多肽具有至少95％的一致性的氨基酸序列。

项目129：一种包含VH编码多核苷酸和VL编码多核苷酸的组合物，其中所述的VH编码多核苷酸和所述的VL编码多核苷酸分别包含编码氨基酸序列的多核苷酸，除了少于20个氨基酸的取代以外，所述的氨基酸序列与由SEQ ID NO：62和SEQ ID NO：66构成的参照多肽相同，并且其中所述的VH编码多核苷酸和所述的VL编码多核苷酸一起编码特异性结合C35的抗体或其结合片段。

项目130：项目129所述的组合物，其中所述的VH编码多核苷酸和所述的VL编码多核苷酸包含编码氨基酸序列的多核苷酸，除了少于10个氨基酸的取代以外，所述的氨基酸序列与所述的参照多肽相同。

项目131：一种包含VH编码多核苷酸和VL编码多核苷酸的组合物，其中所述的VH编码多核苷酸和所述的VL编码多核苷酸分别包含编码氨基酸序列的多核苷酸，其中所述的氨基酸序列与由SEQ IDNO：62和SEQ ID NO：66构成的参照多肽相同。

项目132：项目126-131的任何一项中所述的组合物，其中所述的VH编码多核苷酸和所述的VL编码多核苷酸分别包含SEQ ID NO：70和SEQ ID NO：71。

项目133：项目126-132的任何一项中所述的组合物，其中所述的VH编码多核苷酸和所述的VL编码多核苷酸包含于相同的开放阅读框中，使得由所述的多核苷酸编码的VH多肽和VL多肽包含于单链抗体或其片段中。

项目134：项目126-133的任何一项中所述的组合物，其中包含所述的VH和VL的抗体或其抗原结合片段特异性结合线性表位。

项目135：项目126-133的任何一项中所述的组合物，其中包含所述的VH和VL的抗体或其抗原结合片段特异性结合非线性构型的表位。

项目136：项目126-135的任何一项中所述的组合物，其中包含所述的VH和VL的抗体或其抗原结合片段为包含至少两条重链和至少两条轻链的多价抗体分子。

项目137：项目126-136的任何一项中所述的组合物，其中包含所述的VH和VL的抗体或其抗原结合片段为多特异性的。

项目138：项目126-136的任何一项中所述的组合物，其中包含所述的VH和VL的抗体或其抗原结合片段为双特异性的。

项目139：项目126-136的任何一项中所述的组合物，其中包含所述的VH和VL的抗体或其抗原结合片段为一价、二价、多价或双功能的。

项目140：项目126-139的任何一项中所述的组合物，其中包含所述的VH和VL的抗体或其抗原结合片段为人源化的。

项目141：项目126-139的任何一项中所述的组合物，其中包含所述的VH和VL的抗体或其抗原结合片段为嵌合的。

项目142：项目126-139的任何一项中所述的组合物，其中包含所述的VH和VL的抗体或其抗原结合片段完全为人的。

项目143：项目126-139的任何一项中所述的组合物，其中包含所述的VH和VL的抗体或其抗原结合片段为Fab片段。

项目144：项目126-139的任何一项中所述的组合物，其中包含所述的VH和VL的抗体或其抗原结合片段为Fab’片段。

项目145：项目126-139的任何一项中所述的组合物，其中包含所述的VH和VL的抗体或其抗原结合片段为F(ab)₂片段。

项目146：项目126-139的任何一项中所述的组合物，其中包含所述的VH和VL的抗体或其抗原结合片段为Fv片段。

项目147：项目126-139的任何一项中所述的组合物，其中包含所述的VH和VL的抗体或其抗原结合片段为单链抗体。

项目148：项目126-147的任何一项中所述的组合物，其中包含所述的VH和VL的抗体或其抗原结合片段特异性结合C35多肽或其片段、或者C35变体多肽，它们的亲和力可表征为解离常数(KD)，该解离常数不大于5 x 10^-2M、10^-2M、5 x 10^-3M、10^-3M、5 x 10^-4M、10^-4M、5 x 10^-5M、10^-5M、5 x 10^-6M、10^-6M、5 x 10^-7M、10^-7M、5 x 10^-8M、10^-8M、5 x 10^-9M、10^-9M、5 x 10^-10M、10^-10M、5 x 10^-11M、10^-11M、5 x 10^-12M、10^-12M、5 x 10^-13M、10^-13M、5 x 10^-14M、10^-14M、5 X 10^-15M或10^-15M。

项目149：一种包含第一种载体和第二种载体的组合物，其中所述的第一种载体包含项目55-75的任何一项中所述的VH编码多核苷酸，所述的第二种载体包含项目76-93的任何一项中所述的VL编码多核苷酸。

项目150：一种宿主细胞，其包含项目55-117的任何一项中所述的多核苷酸，或者项目112-119的任何一项中所述的载体。

项目151：一种包含第一种载体和第二种载体的宿主细胞，其中所述的第一种和第二种载体是不同的，其中所述的第一种载体包含项目55-75的任何一项中所述的多核苷酸，该多核苷酸编码免疫球蛋白重链可变区，并且其中所述的第二种载体包含项目76-93的任何一项中所述的多核苷酸，该多核苷酸编码免疫球蛋白轻链可变区。

项目152：一种制备抗C35抗体或其抗原结合片段的方法，其包括：培养项目150-151的任何一项中所述的宿主细胞，以及回收所述的抗体或片段。

项目153：通过项目152所述的方法制备的抗C35抗体或其抗原结合片段。

项目154：一种包含免疫球蛋白重链可变区(VH)的分离的多肽，其中除了少于10个氨基酸的取代以外，所述的VH的CDR1、CDR2和CDR3区域分别与由SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64和SEQ ID NO：65构成的参照重链CDR1、CDR2和CDR3序列相同，并且其中包含所述的VH的抗体或其抗原结合片段特异性结合C35。

项目155：项目154所述的多肽，其中除了少于5个氨基酸的取代以外，所述的VH的CDR1、CDR2和CDR3区域分别与所述的参照重链CDR1、CDR2和CDR3序列相同。

项目156：一种包含免疫球蛋白重链可变区(VH)的分离的多肽，其中所述的VH的CDR1、CDR2和CDR3区域分别包含SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64和SEQ ID NO：65。

项目157：一种分离的多肽，其包含与由SEQ ID NO：62构成的参照VH序列具有至少90％的一致性的VH，其中包含所述的VH的抗体或其抗原结合片段特异性结合C35。

项目158：项目157所述的多肽，其中所述的多肽包含与所述的VH序列具有至少95％的一致性的VH。

项目159：一种分离的多肽，其包含VH，除了少于20个氨基酸的取代以外，所述的VH与由SEQ ID NO：62构成的参照VH相同，并且其中包含所述的VH的抗体或其抗原结合片段特异性结合C35。

项目160：项目159所述的多肽，其中除了少于10个氨基酸的取代以外，所述的多肽包含与所述的参照VH序列相同的VH。

项目161：项目154-160的任何一项中所述的多肽，其中包含所述的VH的抗体或其抗原结合片段特异性结合与参照抗体MAb 163所结合的相同的表位。

项目162：项目154-161的任何一项中所述的多肽，其中包含所述的VH的抗体或其抗原结合片段竞争性地抑制MAb 163与C35的结合。

项目163：项目154-162的任何一项中所述的多肽，其中包含所述的VH的抗体或其抗原结合片段特异性结合C35多肽或其片段、或者C35变体多肽，它们的亲和力可表征为解离常数(K_D)，该解离常数不大于5 x 10^-2M、10^-2M、5 x 10^-3M、10^-3M、5 x 10^-4M、10^-4M、5 x 10^-5M、10^-5M、5 x 10^-6M、10^-6M、5 x 10^-7M、10^-7M、5 x 10^-8M、10^-8M、5 x 10^-9M、10^-9M、5 x 10^-10M、10^-10M、5 x 10^-11M、10^-11M、5 x 10^-12M、10^-12M、5 x 10^-13M、10^-13M、5 x 10^-14M、10^-14M、5 X 10^-15M或10^-15M。

项目164：项目163所述的多肽，其中包含所述的VH的抗体或其抗原结合片段特异性结合C35多肽或其片段、或者C35变体多肽，它们的亲和力可表征为解离常数(K_D)，该解离常数不大于约3.40 x 10^-9M。

项目165：一种包含免疫球蛋白轻链可变区(VL)的分离的多肽，其中除了少于10个氨基酸的取代以外，所述的VL的CDR1、CDR2和CDR3区域分别与由SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68和SEQ ID NO：69构成的参照轻链CDR1、CDR2和CDR3序列相同，并且其中包含所述的VL的抗体或其抗原结合片段特异性结合C35。

项目166：项目165所述的多肽，其中除了少于5个氨基酸的取代以外，所述的VL的所述CDR1、CDR2和CDR3区域与参照轻链CDR1、CDR2和CDR3序列相同。

项目167：一种包含免疫球蛋白轻链可变区(VL)的分离的多肽，其中所述的VL的CDR1、CDR2和CDR3区域分别包含SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68和SEQ ID NO：69。

项目168：一种分离的多肽，其包含与由SEQ ID NO：66构成的参照VL序列具有至少90％的一致性的VL，其中包含所述的VL的抗体或其抗原结合片段特异性结合C35。

项目169：项目168所述的多肽，其中所述的VL与所述的参照VL序列具有至少95％的一致性。

项目170：一种分离的多肽，其包含VL，除了少于20个氨基酸的取代以外，所述的VL与由SEQ ID NO：66构成的参照VL序列相同，其中包含所述的VL的抗体或其抗原结合片段特异性结合C35。

项目171：项目170所述的分离的多肽，其中除了少于10氨基酸的取代以外，所述的VL与所述的参照VL序列相同。

项目172：项目165-171的任何一项中所述的多肽，其中所述的VL为SEQ ID NO：66。

项目173：项目165-171的任何一项中所述的多肽，其中包含所述的VL的抗体或其抗原结合片段特异性结合与参照抗体MAb163所结合的相同的表位。

项目174：项目165-173的任何一项中所述的多肽，其中包含所述的VL的抗体或其抗原结合片段竞争性地抑制MAb 163与C35的结合。

项目175：项目165-174的任何一项中所述的多肽，其中包含所述的VL的抗体或其抗原结合片段特异性结合C35多肽或其片段、或者C35变体多肽，它们的亲和力可表征为解离常数(K_D)，该解离常数不大于5 x 10^-2M、10^-2M、5 x 10^-3M、10^-3M、5 x 10^-4M、10^-4M、5 x 10^-5M、10^-5M、5 x 10^-6M、10^-6M、5 x 10^-7M、10^-7M、5 x 10^-8M、10^-8M、5 x 10^-9M、10^-9M、5 x 10^-10M、10^-10M、5 x 10^-11M、10^-11M、5 x 10^-12M、10^-12M、5 x 10^-13M、10^-13M、5 x 10^-14M、10^-14M、5 X 10^-15M或10^-15M。

项目176：项目175所述的多肽，其中包含所述的VL的抗体或其抗原结合片段特异性结合C35多肽或其片段、或者C35变体多肽，它们的亲和力可表征为解离常数(K_D)，该解离常数不大于约3.40 x 10^-9M。

项目177：项目154-176的任何一项中所述的多肽，其进一步包含与之融合的异源多肽。

项目178：项目154-177的任何一项中所述的多肽，其中所述的多肽与一种试剂缀合，其中所述的试剂选自：治疗性试剂、药物前体、肽、蛋白质、酶、病毒、脂质、生物应答修饰剂、药物试剂或PEG。

项目179：项目178所述的多肽，其中所述的治疗性试剂是化疗试剂。

项目180：项目178所述的多肽，其中所述的治疗性试剂为放射性试剂。

项目181：一种组合物，其包含项目154-180的任何一项中所述的多肽，其中包含所述的VH和所述的VL的抗体或其抗原结合片段特异性结合C35。

项目182：项目154-180的任何一项中所述的多肽或者项目181所述的组合物，其中包含所述的VH、所述的VL、或所述的VH和所述的VL两者的抗体或其抗原结合片段特异性结合线性表位。

项目183：项目154-180的任何一项中所述的多肽或者项目181所述的组合物，其中包含所述的VH、所述的VL、或所述的VH和所述的VL两者的抗体或其抗原结合片段特异性结合非线性构型的表位。

项目184：项目154-180的任何一项中所述的多肽或者项目181所述的组合物，其中包含所述的VH、所述的VL、或所述的VH和所述的VL两者的抗体或其抗原结合片段为包含至少两条重链和至少两条轻链的多价抗体分子。

项目185：项目154-180的任何一项中所述的多肽或者项目181所述的组合物，其中包含所述的VH、所述的VL、或所述的VH和所述的VL两者的抗体或其抗原结合片段为多特异性的。

项目186：项目154-180的任何一项中所述的多肽或者项目181所述的组合物，其中包含所述的VH、所述的VL、或所述的VH和所述的VL两者的抗体或其抗原结合片段为双特异性的。

项目187：项目154-180的任何一项中所述的多肽或者项目181所述的组合物，其中包含所述的VH、所述的VL、或所述的VH和所述的VL两者的抗体或其抗原结合片段为一价、二价、多价或双功能的。

项目188：项目154-180的任何一项中所述的多肽或者项目181所述的组合物，其中包含所述的VH、所述的VL、或所述的VH和所述的VL两者的抗体或其抗原结合片段为人源化的。

项目189：项目154-180的任何一项中所述的多肽或者项目181所述的组合物，其中包含所述的VH、所述的VL、或所述的VH和所述的VL两者的抗体或其抗原结合片段为嵌合的。

项目190：项目154-180的任何一项中所述的多肽或者项目181所述的组合物，其中包含所述的VH、所述的VL、或所述的VH和所述的VL两者的抗体或其抗原结合片段完全为人的。

项目191：项目154-180的任何一项中所述的多肽或者项目181所述的组合物，其中包含所述的VH、所述的VL、或所述的VH和所述的VL两者的抗体或其抗原结合片段为Fab片段。

项目192：项目154-180的任何一项中所述的多肽或者项目181所述的组合物，其中包含所述的VH、所述的VL、或所述的VH和所述的VL两者的抗体或其抗原结合片段为Fab′片段。

项目193：项目154-180的任何一项中所述的多肽或者项目181所述的组合物，其中包含所述的VH、所述的VL、或所述的VH和所述的VL两者的抗体或其抗原结合片段为F(ab)₂片段。

项目194：项目154-180的任何一项中所述的多肽或者项目181所述的组合物，其中包含所述的VH、所述的VL、或所述的VH和所述的VL两者的抗体或其抗原结合片段为Fv片段。

项目195：项目154-180的任何一项中所述的多肽或者项目181所述的组合物，其中包含所述的VH、所述的VL、或所述的VH和所述的VL两者的抗体或其抗原结合片段为单链抗体。

项目196：项目154-180的任何一项中所述的多肽或者项目181所述的组合物，其中包含所述的VH、所述的VL、或所述的VH和所述的VL两者的抗体或其抗原结合片段特异性结合C35多肽或其片段、或者C35变体多肽，它们的亲和力可表征为解离常数(K_D)，该解离常数不大于5 x 10^-2M、10^-2M、5 x 10^-3M、10^-3M、5 x 10^-4M、10^-4M、5 x 10^-5M、10^-5M、5 x 10^-6M、10^-6M、5 x 10^-7M、10^-7M、5 x 10^-8M、10^-8M、5 x 10^-9M、10^-9M、5 x 10^-10M、10^-10M、5 x 10^-11M、10^-11M、5 x 10^-12M、10^-12M、5 x 10^-13M、10^-13M、5 x 10^-14M、10^-14M、5 X 10^-15M或10^-15M。

项目197：项目196所述的多肽，其中包含所述的VH或所述的VL的抗体或其抗原结合片段特异性结合C35多肽或其片段、或者C35变体多肽，它们的亲和力可表征为解离常数(K_D)，该解离常数不大于约3.40 x 10^-9M。

项目198：一种包含项目154-197的任何一项中所述的多肽、以及载体的组合物。

项目199：一种分离的抗体或其抗原结合片段，其包含项目154-198的任何一项中所述的多肽。

项目200：一种用于治疗癌症的方法，其包括：向患有癌症的动物施用有效量的试剂，其中所述的试剂选自：项目24-51的任何一项中所述的分离的MAb 163抗体或其片段；项目55-117的任何一项中所述的分离的多核苷酸；项目154-197的任何一项中所述的分离的多核苷酸；或者项目126-149的任何一项中所述的组合物。

项目201：项目200所述的方法，其中所述的动物为哺乳动物。

项目202：项目201所述的方法，其中所述的哺乳动物为人。

项目203：一种组合物，其包含：(a)特异性结合C35的第一种C35抗体；(b)特异性结合C35的第二种C35抗体；以及(c)治疗性试剂。

项目204：项目203所述的组合物，其中所述的治疗性试剂是化疗试剂。

项目205：项目204所述的组合物，其中所述的化疗试剂为紫杉醇。

项目206：项目205所述的组合物，其中所述的化疗试剂为阿霉素。

项目207：项目206所述的组合物，其中所述的第一种C35抗体或所述的第二种C35抗体中的至少一种选自：1F2、1B3、MAbc0009、MAb 163、MAb 165、MAb 171、以及其变体或衍生物。

项目208：项目207所述的组合物，其中所述的第一种C35抗体为MAb 163。

项目209：项目203所述的组合物，其中所述的第一种C35抗体和所述的第二种C35抗体均选自：1F2、1B3、MAbc0009、MAb163、MAb165和MAb 171。

项目210：一种检测C35的存在的方法，其包括：(a)使样品或细胞与根据项目27-54或者217-220的任何一项中所述的抗体或其抗原结合片段接触；以及(b)检测所述的抗体或其抗原结合片段与C35的结合。

项目211：项目210所述的方法，其中所述的检测步骤在体内进行。

项目212：项目210所述的方法，其中所述的检测步骤在体外进行。

项目213：一种根据项目55-58、75-79和112-117的任何一项中所述的分离的多核苷酸，其中所述的CDR选自SEQ ID NOs：72-77。

项目214：一种分离的抗体或其抗原结合片段，其包含MAb163单克隆抗体的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR，其中所述的抗体或片段特异性结合C35。

项目215：项目214所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体或片段包含所述MAb 163单克隆抗体的至少一个CDR。

项目216：项目214所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述的至少一个CDR为MAb 163的重链CDR3。

项目217：项目214所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述的至少一个CDR为SEQ ID NO：65。

项目218：项目214所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体或片段包含所述MAb 163单克隆抗体的至少三个CDR。

项目219：项目214所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述的至少三个CDR包含SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64和SEQ ID NO：65。

项目220：项目214所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述的至少三个CDR包含SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68和SEQ ID NO：69。

实施例

实施例1

放射诱导的细胞凋亡后暴露于乳腺肿瘤细胞的表面膜上的C35

将表达C35肿瘤抗原的连续生长的乳腺肿瘤细胞系用300Gy辐射或者不处理。在体外连续培养数天以允许发生细胞凋亡后，收获细胞，将其洗涤并用50ng1F2单克隆抗-C35抗体或者小鼠IgG抗体对照染色，所述抗体都缀合荧光染料Alexa 647。在25℃孵育50分钟后，使用标准商业试剂盒(Pharmingen)将细胞用膜联蛋白V和碘化丙锭(PI)染色。通过流式细胞术，使用标准方案分析细胞用膜联蛋白V、碘化丙锭和Alexa 647的染色。

图1的结果显示没有经历细胞凋亡(膜联蛋白V阴性)的未处理的活细胞(PI阴性)不在表面膜上表达C35，如用抗-C35抗体和同种型对照抗体不存在差别染色所证明的(图1A)。类似地，保持存活(PI阴性)和诱导但不经历细胞凋亡(膜联蛋白V阴性)的放射的肿瘤细胞也不在肿瘤细胞表面膜上表达C35(图1B)。形成鲜明对照的是，存活(PI阴性)但是经历细胞凋亡(膜联蛋白V阳性)的经放射的肿瘤细胞用抗-35抗体与同种型对照抗体相比清楚地差别染色(图1C)。

实施例2

药物诱导的细胞凋亡后乳腺肿瘤细胞的表面膜上暴露的C35

将表达C35肿瘤抗原的连续生长的乳腺肿瘤细胞系用6ug/ml丝裂霉素C处理或者不处理。在体外连续培养48小时以允许发生细胞凋亡后，收获细胞，将其洗涤并用50ng1F2单克隆抗-C35抗体或者小鼠IgG抗体对照染色，所述抗体都缀合荧光染料Alexa 647。在25℃孵育50分钟后，使用标准商业试剂盒(Pharmingen)将细胞用膜联蛋白V和碘化丙锭(PI)染色。通过流式细胞术，使用标准方案分析细胞用膜联蛋白V、碘化丙锭和Alexa 647的染色。

图2的结果显示没有经历细胞凋亡(膜联蛋白V阴性)的未处理的活细胞(PI阴性)不在表面膜上表达C35，如用抗-C35抗体和同种型对照抗体不存在差别染色所证明的(图2A)。类似地，保持存活(PI阴性)和没有诱导经历细胞凋亡(膜联蛋白V阴性)的丝裂霉素C处理的细胞也不在肿瘤细胞表面膜上表达C35(图2B)。形成鲜明对照的是，存活(PI阴性)但是经历细胞凋亡(膜联蛋白V阳性)的丝裂霉素C处理的肿瘤细胞用抗-35抗体与同种型对照抗体相比清楚地差别染色(图2C)。

实施例3

哺乳动物细胞中抗体的表达

本发明的多肽可以在哺乳动物细胞中表达。典型的哺乳动物表达载体含有介导mRNA转录启动的启动子元件、蛋白质编码序列和转录终止和转录物多聚腺苷酸化所需的信号。额外的元件包括增强子、Kozak序列和间插序列，其侧翼是RNA剪接的供体和受体位点。用来自SV40的早期和晚期启动子、来自逆转录病毒(例如RSV、HTLVI、HIVI)的长末端重复序列(LTR)和来自巨细胞病毒(CMV)的早期启动子实现高度有效转录。然而，也可以使用细胞元件(例如，人肌动蛋白启动子)。

用于实践本发明的适宜的表达载体包括，例如，诸如pSVL和pMSG(Pharmacia，Uppsala，Sweden)、pRSVcat(ATCC37152)、pSV2dhfr(ATCC 37146)、pBC12MI(ATCC 67109)、pCMVSport 2.0和pCMVSport3.0的载体。可以使用的哺乳动物宿主细胞包括人Hela、293、H9和Jurkat细胞、小鼠NIH3T3和C127细胞、Cos1、Cos7和CV1、quailQC1-3细胞、小鼠L细胞和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。

备选地，多肽可以在含有掺入到基因组的多核苷酸的稳定细胞系中表达。用选择性标记，如DHFR、gpt、新霉素、潮霉素共转染允许鉴定和分离转染的细胞。

也可以扩增转染的基因以大量表达编码的蛋白质。DHFR(二氢叶酸还原酶)标记可用于开发携带数百或者甚至数千拷贝的目的基因的细胞系(见，例如，Alt，F.W.，et al.，J.Biol.Chem.253：1357-1370(1978)；Hamlin，J.L.and Ma，C.，Biochem.et Biophys.Acta，1097：107-143(1990)；Page，M.J.and Sydenham，M.A.，Biotechnology 9：64-68(1991).)。另一种有用的选择标记是谷氨酰胺合酶(GS)(Murphy et al.，Biochem J.227：277-279(1991)；Bebbington et al.，Bio/Technology 10：169-175(1992)。使用这些标记，哺乳动物细胞生长在选择培养基中并且选择具有最高抗性的细胞。这些细胞系含有整合到染色体的扩增的基因。中国仓鼠卵巢(CHO)和NSO细胞通常用于产生蛋白质。

质粒pSV2-dhfr(ATCC检索号37146)、表达载体pC4(ATCC检索号209646)和pC6(ATCC检索号209647)的衍生物含有劳氏肉瘤病毒的强启动子(LTR)(Cullen et al.，Molecular and Cellular Biology，438-447(March，1985))和CMV-增强子的片段(Boshart et al.，Cell41：521-530(1985).)。多克隆位点，例如具有限制酶切割位点BamHI、XbaI和Asp718的多克隆位点允许克隆目的基因。载体还含有3’内含子、大鼠前胰岛素原基因的多聚腺苷酸化和终止信号，和处于SV40早期启动子控制下的小鼠DHFR基因。

特别地，例如，将质粒pC6用适宜的限制酶消化然后通过本领域已知的步骤使用小牛肠磷酸酶去磷酸化。然后从1％琼脂糖凝胶分离载体。

根据本领域已知的方案扩增本发明的多核苷酸。如果用天然发生的信号序列产生本发明的多肽，那么载体不需要第二种信号肽。备选地，如果不使用天然发生的信号序列，那么可以修饰载体以包含异源信号序列(见，例如，WO 96/34891.)。

用通过商业途径可获得的试剂盒(＂Geneclean，＂BIO 101 Inc.，LaJolla，Calif.)从1％琼脂糖凝胶分离扩增的片段。然后将该片段用适宜的限制酶消化并在1％琼脂糖凝胶上再次纯化。

然后将扩增片段用相同的限制酶消化并在1％琼脂糖凝胶上纯化。然后将分离的片段和去磷酸化的载体用T4DNA连接酶连接。然后转化大肠杆菌HB101或XL-1Blue细胞并使用例如限制酶分析鉴定含有插入质粒pC6的片段的细菌。

缺少活性DHFR基因的中国仓鼠卵巢细胞用于转染。用lipofectin将5mu.g表达质粒pC6或pC4与0.5mu.g质粒pSVneo共转染(Felgneret al.，如前)。质粒pSV2-neo含有显性选择标记，来自Tn5的neo基因(编码赋予对包括G418的一组抗生素的抗性的酶)。将细胞接种在补加1mg/ml G418的alpha minus MEM中。2天后，将细胞用胰蛋白酶消化并接种在杂交瘤克隆板(Greiner，Germany)中补加10、25或50ng/ml氨甲蝶呤加上1mg/ml G418的alpha minus MEM中。约10-14天后，将单个克隆用胰蛋白酶处理并接种在6孔培养皿中或者10ml培养瓶中，使用不同浓度的氨甲蝶呤(50nM、100nM、200nM、400nM、800nM)。然后将在最高浓度的氨甲蝶呤中生长的克隆转移到含有甚至更高浓度氨甲蝶呤(1uM、2uM、5uM、10mM、20mM)的6孔板中。重复相同的步骤直到获得生长在100-200uM浓度的克隆。通过例如，SDS-PAGE和蛋白质印迹或者通过反相HPLC分析法分析所希望的基因产物的表达。

实施例4

放射标记的C-35特异抗体浓集在表达C35的活肿瘤的坏死区中

将BALB/c小鼠在相对的两个侧腹移植同基因小细胞肺癌来源的系1肿瘤细胞，其已经用人C35转染或者没有转染。通过用抗-C35抗体进行免疫组织化学染色证实C35蛋白质表达。体内生长14天后，动物接受静脉内注射¹²⁵I-标记的抗-C35抗体。注射放射标记的抗体后120小时处死动物并通过将肿瘤切片对胶片曝光确定C35阳性和C35阴性肿瘤中抗-C35抗体的浓度。如图3中所示，放射标记的C-35抗体仅在C35阳性并且不在C-35阴性肿瘤中浓集。比较肿瘤内完整细胞的标记分布和H&E染色证实在这些条件下标记的抗C-35抗体在C35阳性肿瘤的坏死区中特异浓集。

实施例5

施用剂量测定法的(dosimetric)和治疗性放射标记的抗体的方案

以注射形式在静脉内或者动脉内施用放射标记的抗体(或者抗体片段)组合物，其包括剂量测定法的放射标记的抗体和治疗性放射标记抗体。可注射的放射标记的抗体组合物将在5分钟到约60分钟，优选约15分钟到30分钟时间内输入静脉或者动脉。当肿瘤由已知的动脉供应时，动脉内施用优选适用于治疗性放射标记的抗体组合物。剂量测定法的放射标记的抗体和治疗性放射标记的抗体将作为生理磷酸缓冲盐溶液或者适于肠胃外注射的其他载体中的无菌水溶液施用。最初剂量测定法的放射标记的抗体剂量将约为5-100mg抗体，其将递送约5-50mCi放射。施用剂量测定法的剂量后约5-10天，治疗性放射标记的抗体将以约10-500mg的剂量施用，其对于每个治疗剂量将递送多达300mCi放射。该剂量测定法/治疗方案可以重复。也参见US5,057,313和US 5,120,525。

实施例6

将抗-C35小鼠和人抗体可变区基因克隆到保藏的TOPO克隆中

将免疫球蛋白重链和轻链可变区通过V区的PCR扩增并TA克隆到TOPO载体中从而克隆到TOPO载体(Invitrogen)中。该连接系统不需要限制酶消化(尽管TOPO载体掺入EcoRI位点以允许插入片段的随后切除)。TA克隆利用Taq聚合酶的PCR扩增产物中天然加入的3’A突出端，该突出端可以与TOPO克隆试剂盒(Invitrogen)中提供的线性化载体的5’T突出端配对。

为了PCR扩增用于插入TOPO的可变区基因，我们利用与恒定区序列(对于重链和轻链是不同的并且对于小鼠和人也是不同的)的5’末端互补的下游引物并且通过5’RACE使用Invitrogen GeneRacer试剂盒在可变区的5’末端加入已知的固定化引物序列。这些方法是本领域技术人员公知的。

实施例7

将来自保藏的TOPO克隆的可变基因克隆到pCMV表达构建体

产生pCMV表达构建体

痘苗转移质粒-pVHE、pVKE和pVLE-的构建已经在以前的专利申请(US 2002 0123057 A1，“In vitro Methods of Producing andIdentifying Immunoglobulin Molecules in Eukaryotic Cells”，2002-09-05公布)中描述。为了产生哺乳动物表达载体来表达免疫球蛋白重链和轻链，从这些痘苗转移质粒切除从NotI到SalI的表达盒并克隆到pCMV-Script载体(其在载体多克隆位点中的XhoI位点通过填充和钝端连接而破坏)，产生pCMV-VH、pCMV-VK和pCMV-VL载体。这些表达盒含有信号肽、V基因的克隆位点和来自膜结合的μ重链和κ轻链基因的恒定区。

在pCMV-VH中，表达盒含有从相对于起始密码子氨基酸位置-19[aa(-19)]到aa(-3)的信号肽，接着是VH基因的aa(109到113)和完整重链恒定区。所选的VH基因(从aa(-4)到aa(110))可以克隆到pCMV-VH中BssHII[aa(-4到-3)]和BstEII[aa(109-110)]位点。

在pCMV-VK(κ)中，表达盒含有从aa(-19)到aa(-2)的信号肽，接着是VK基因的aa(104到107)和完整κ链恒定区。所选的VK基因(从aa(-3)到aa(105))可以克隆到pCMV-VK中ApaLI[aa(-3到-2)]和XhoI[aa(104-105)]位点。

在pCMV-VL(λ)中，表达盒含有从aa(-19)到aa(-2)的信号肽，接着是VL基因的aa(103到107)和完整κ链恒定区。所选的VL基因(从aa(-3)到aa(104))可以克隆到pCMV-VL中ApaLI[aa(-3到-2)]和HindIII[aa(103-104)]位点。所得λ轻链将显示出VλCκ嵌合结构。

为了将所选抗体表达为分泌型人IgG1，通过RT-PCR从B细胞或者骨髓细胞克隆IgG1的恒定区。使用的引物对为：

5′正向引物：5′-ATTAGGATCCGGTCACCGTCTCCTCAGCC-3′(SEQ IDNO.15)

3′反相引物：5′-ATTAGTCGACTCATTTACCCGGAGACAGGGA-3′(SEQ IDNO：16)

所得PCR产物显示出下面的结构：BamHI-BstEII(aa109-110)-(aa111-113)-Cγ1-TGA-SalI。使用标准方案将PCR产物亚克隆到pBluescriptII/KS中BamHI和SalI位点以进行定点诱变，从而通过沉默突变除去CH1区的内部BstEII。然后一旦VH基因亚克隆到该载体中的BssHII/BstEII处，将所得Cγ1亚克隆到pCMV-VH中BstEII和SalI以产生pCMV-Cγ1用来指导分泌型IgG1重链的表达。

用于插入V基因的分泌型IgG1、人γ1重链前导序列和恒定区盒的序列如下。

下划线＝限制位点

粗体＝恒定区

粗体/斜体＝信号肽

Not 1 NcoI

gcggccgcaaaccatgggatggagctgtatcatcctcttcttggtagcaacagctacag

BssHII BsteII

gcgcgcatatggtcaccgtctcctcagcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctcc

aagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggt

gtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactct

actccctcagcagcgtcgtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaat

cacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgccc

accgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccc

tcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaag

ttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacag

cacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgca

aggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaa

ccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggt

caaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaaga

ccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcagg

tggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagag

cctctccct

Sal1

Gtctccgggtaaatgagtcgac(SEQ ID NO：17)

用于插入Vκ基因的人轻链前导序列和κ恒定区盒的序列如下：

Not 1 NcoI

gcggccgcaaaccatgggatggagctgtatcatcctcttcttggtagcaacagctacag

ApaL1 XhoI

gcgtgcacttgactcgagatcaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatga

gcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtac

agtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggac

agcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctg

cgaagtcaccc

Sal1

Atcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttaggtcgac(SEQ ID

NO：18)

用于插入Vλ基因的人轻链前导序列和κ恒定区盒的序列如下：

Not 1 Ncol

gcggccgcaaaccatgggatggagctgtatcatcctcttcttggtagcaacagctacag

ApaL1 HindIII

gcgtgcacttgactcgagaagcttaccgtcctacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgcc

atctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagagg

ccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggac

agcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagt

ctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt

SAL 1

Taggtcgac(SEQ ID NO：19)

为了构建表达其他同种型的分泌型人抗体(包括IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD、IgE和IgM的分泌型)的载体，可以用相同方法克隆各自恒定区，诱变任意内部BstEII位点，并在pCMV-Cγ1载体的BstEII和SalI位点之间用其他同种型的恒定区替代Cγ1。

为了克隆其他同种型的恒定区，使用下面的引物对：

IgG2-F：5’-ATTAGGATCCGGTCACCGTCTCCTCAGCC-3’(SEQ ID NO：20)

IgG2-R：5’-ATTAGTCGACTCATTTACCCGGAGACAGGGA-3’(SEQ ID NO：21)

IgG3-F：5’-ATTAGGATCCGGTCACCGTCTCCTCAGCT-3’(SEQ ID NO：22)

IgG3-R：5’-ATTAGTCGACTCATTTACCCGGAGACAGGGA-3’(SEQ ID NO：23)

IgG4-F：5’-ATTAGGATCCGGTCACCGTCTCCTCAGCT-3’(SEQ ID NO：24)

IgG4-R：5’-ATTAGTCGACTCATTTACCCAGAGACAGGGA-3’(SEQ ID NO：25)

IgA1-F：5’-ATTAGGATCCGGTCACCGTCTCCTCAGCAT-3’(SEQ ID NO：26)

IgA1-R：5’-ATTAGTCGACTCAGTAGCAGGTGCCGTCCAC-3’(SEQ ID NO：27)

IgA2-F：5’-ATTAGGATCCGGTCACCGTCTCCTCAGCAT-3’(SEQ ID NO：28)

IgA2-R：5’-ATTAGTCGACTCAGTAGCAGGTGCCGTCCAC-3’(SEQ ID NO：29)

IgD-F：5’-ATTAGGATCCGGTCACCGTCTCCTCAGCAC-3’(SEQ ID NO：30)

IgD-R：5’-ATTAGTCGACTCATTTCATGGGGCCATGGTC-3’(SEQ ID NO：31)

IgE-F：5’-ATTAGGATCCGGTCACCGTCTCCTCAGCC-3’(SEQ ID NO：32)

IgE-R：5’-ATTAGTCGACTCATTTACCGGGATTTACAGA-3’(SEQ ID NO：33)

IgM-F：5’-ATTAGGATCCGGTCACCGTCTCCTCAGGG-3’(SEQ ID NO：34)

IgM-R：5’-ATTAGTCGACTCAGTAGCAGGTGCCAGCTGT-3’(SEQ ID NO：35)

注意到因为高度序列保守性，所用的引物在IgG1和IgG2之间、IgG3和IgG4之间、IgA1和IgA2之间相同。

将来自Topo克隆的可变基因克隆到pCMV表达构建体。

步骤1：产生V-基因片段

A.人v-基因

MMH1

1.使用标准方法用BssHII(GCGCGC(SEQ ID NO：36))和BsteII(GGTCACC(SEQ ID NO：37))消化MMH1质粒DNA(克隆H0009)。

2.用标准方法在琼脂糖凝胶上分离DNA。

3.用标准方法从凝胶切除357bp片段并分离DNA。

MMK1

1.用标准方法使用ApaL1(GTGCAC(SEQ ID NO：38))和Xho1(CTCGAG(SEQ ID NO：39))消化MMK1质粒DNA(克隆L0010)。

2.用标准方法在琼脂糖凝胶上分离DNA。

3.用标准方法从凝胶切除343bp片段并分离DNA。

B.小鼠杂交瘤v-基因：

1F2 VK

1.必须使用下面的引物从ATCC保藏的克隆1F2K PCR扩增小鼠杂交瘤v基因。这对于在人κ轻链恒定区表达盒中产生具有人恒定区的小鼠v-基因的嵌合抗体是必要的。

1F2VK正向引物：

5’-tatccgtgcactccCAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAG-3’(SEQ ID NO：40)

1F2VK反向引物：

5’-atattctcgAGCTTGGTCCCCCCTCCGAA-3’(SEQ ID NO：41)

(小写＝不与小鼠1F2VK同源，包括限制性位点。大写＝与小鼠1F2 VK序列同源)

2.使用标准方法用ApaL1(GTGCAC(SEQ ID NO：42))和Xho1(CTCGAG(SEQ ID NO：43))消化331bp PCR产物。

3.用标准方法在琼脂糖凝胶上分离DNA。

4.用标准方法从凝胶切除315bp片段并分离DNA。

1F2 VH

1.必须使用下面的引物从ATCC保藏的克隆1F2G PCR扩增小鼠杂交瘤v基因。这对于在人重链恒定区表达盒中产生具有人恒定区的小鼠v-基因的嵌合抗体是必要的。

1F2VH正向引物：

5’-tataagcgcgcactccGATGTACAGCTTCAGGAGTCAGGAC(SEQ ID NO：44)

1F2VH反向引物：

5′-atattgGTGACCAGAGTCCCTTGGCCCC-3′(SEQ ID NO：45)

(小写＝非同源的，含有限制性位点。大写＝同源的)

2.用标准方法使用BssHII(GCGCGC(SEQ ID NO：36))和BsteII(GGTCACC(SEQ ID NO：37))消化360bp PCR产物。

3.用标准方法在琼脂糖凝胶上分离DNA。

4.用标准方法切除含有343bp的DNA消化片段的凝胶片并分离DNA。

1B3VK

1.必须使用下面的引物从保藏的克隆1B3K通过PCR扩增小鼠杂交瘤v基因。这对于在人κ轻链恒定区表达盒中产生具有人恒定区的小鼠v-基因的嵌合抗体是必要的。

1B3VK正向引物：

5’-tatccgtgcactccGATGTCCAGATAACCCAGTCTCCATC-3’(SEQ ID NO：46)

1B3VK反向引物：

5’-atattctcgAGCTTGGTCCCAGCACCGAA-3’(SEQ ID NO：47)

(小写＝非同源的，含有限制性位点。大写＝同源的)

2.使用标准方法用ApaL1(GTGCAC(SEQ ID NO：42))和Xho1(CTCGAG(SEQ ID NO：43))消化334bp PCR产物。

3.用标准方法在琼脂糖凝胶上分离DNA。

4.用标准方法切除含有消化的322bp的DNA片段的凝胶片并分离DNA。

1B3VH

1.必须使用下面的引物从保藏的克隆1B3G通过PCR扩增小鼠杂交瘤v基因。这对于在人重链恒定区表达盒中产生具有人恒定区的小鼠v-基因的嵌合抗体是必要的。

1B3VH正向引物：

5’-tataagcgcgcactccGAGGTGCAGCTTCAGGAGTCAGGAC-3’(SEQ ID NO：48)

1B3VH反向引物：

5’-atattGGTGACCGTGGTCCCAGCG-3’(SEQ ID NO：49)

(小写＝非同源的，含有限制性位点。大写＝同源的)

2.使用标准方法用BssHII(GCGCGC(SEQ ID NO：36))和BsteII(GGTCACC(SEQ ID NO：37))消化378bp PCR产物。

3.用标准方法在琼脂糖凝胶上分离DNA。

4.用标准方法切除含有366bp消化的DNA片段的凝胶片并分离DNA。

步骤2：表达构建体的装配

1.用标准方法使用适宜的酶消化pCMV-VH和pCMV-VK表达载体：

a.pCMV-VH-BsteII和BssHII

b.pCMV-VK-ApaL1和XhoI

2.用标准方法在琼脂糖凝胶上分离DNA并切除线性化的载体。

3.用标准方法从凝胶片分离DNA。

4.用标准方法将轻链v基因连接到pCMV-VK并将重链v-基因连接到pCMV-VH。

5.用标准方法将连接的DNA转化到感受态细胞并分离质粒DNA。

实施例8

免疫球蛋白恒定区的序列

下面的基因和编码的氨基酸序列可以用于制备人源化抗体、人变异抗体、嵌合抗体，和其片段。

免疫球蛋白恒定区的智人G2基因(IgG2(n-)同种异型)(GenBank号Z49802)(SEQ ID NO：50)

1 tcttctctct gcagagcgca aatgttgtgt cgagtgccca ccgtgcccag gtaagccagc

61 ccaggcctcg ccctccagct caaggcggga caggtgccct agagtagcct gcatccaggg

121 acaggcccca gctgggtgct gacacgtcca cctccatctc ttcctcagca ccacctgtgg

181 caggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga

241 cccctgaggt cacgtgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccccgag gtccagttca

301 actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccacgg gaggagcagt

361 tcaacagcac gttccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgttgt gcaccaggac tggctgaacg

421 gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aaggcctccc agcccccatc gagaaaacca

481 tctccaaaac caaaggtggg acccgcgggg tatgagggcc acatggacag acggcggctt

541 cggcccaccc tctgccctgg gagtgaccgc tgtgccaacc tctgtcccta cagggcagcc

601 ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag gagatgacca agaaccaggt

661 cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta ccccagcgac atcgccgtgg agtgggagag

721 caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacacctccc atgctggact ccgacggctc

781 cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt

841 ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct

901 gtctccgggt aaatgagtgc cacggccggc aagcc

免疫球蛋白恒定区的智人G2基因(IgG2(n+)同种异型)(GenBank号Z49801)(SEQ ID NO：51)

1 tcttctctct gcagagcgca aatgttgtgt cgagtgccca ccgtgcccag gtaagccagc

61 ccaggcctcg ccctccagct caaggcggga caggtgccct agagtagcct gcatccaggg

121 acaggcccca gctgggtgct gacacgtcca cctccatctc ttcctcagca ccacctgtgg

181 caggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga

241 cccctgaggt cacgtgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccccgag gtccagttca

301 actggtacgt ggacggcatg gaggtgcata atgccaagac aaagccacgg gaggagcagt

361 tcaacagcac gttccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcgt gcaccaggac tggctgaacg

421 gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aaggcctccc agcccccatc gagaaaacca

481 tctccaaaac caaaggtggg acccgcgggg tatgagggcc acatggacag acggcggctt

541 cggcccaccc tctgccctgg gagtgaccgc tgtgccaacc tctgtcccta cagggcagcc

601 ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag gagatgacca agaaccaggt

661 cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta ccccagcgac atcgccgtgg agtgggagag

721 caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacacctccc atgctggact ccgacggctc

781 cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt

841 ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acacagaaga gcctctccct

901 gtctccgggt aaatgagtgc cacggccggc aagcc

编码免疫球蛋白恒定区重链α-2亚基的智人CH基因(GenBankNo.AJ012264)(SEQ ID NO：52)

1 ctcgaggacc tgctcttagg ttcagaagcg aacctcacgt gcacactgac cggcctgaga

61 gatgcctctg gtgccacctt cacctggacg ccctcaagtg ggaagagcgc tgttcaagga

121 ccacctgagc gtgacctctg tggctgctac agcgtgtcca gtgtcctgcc tggctgtgcc

181 cagccatgga accatgggga gaccttcacc tgcactgctg cccaccccga gttgaagacc

241 ccactaaccg ccaacatcac aaaatccggt gggtccagac cctgctcggg gccctgctca

301 gtgctctggt ttgcaaagca tattcctggc ctgcctcctc cctcccaatc ctgggctcca

361 gtgctcatgc caagtacaca gggaaactga ggcaggctga ggggccagga cacagcccag

421 ggtgcccacc agagcagagg ggctctctca tcccctgccc agccccctga cctggctctc

481 taccctccag gaaacacatt ccggcccgag gtccacctgc tgccgccgcc gtcggaggag

541 ctggccctga acgagctggt gacgctgacg tgcctggcac gtggcttcag ccccaaggat

601 gtgctggttc gctggctgca ggggtcacag gagctgcccc gcgagaagta cctgacttgg

661 gcatcccggc aggagcccag ccagggcacc accacctacg ctgtaaccag catactgcgc

721 gtggcagctg aggactggaa gaagggggag accttctcct gcatggtggg ccacgaggcc

781 ctgccgctgg ccttcacaca gaagaccatc gaccgcatgg cgggtaaacc cacccacatc

841 aatgtgtctg ttgtcatggc ggaggcggat ggcacctgct actgagccgc ccgcctgtcc

901 ccacccctga ataaactcca tgctccccca agcagcccca cgcttccatc cggcgcctgt

961 ctgtccatcc tcagggtctc agcacttggg aaagggccag ggcatggaca gggaagaata

1021 ccccctgccc tgagcctcgg ggggcccctg gcacccccat gagactttcc accctggtgt

1081 gagtgtgagt tgtgagtgtg agagtgtgtg gtgcaggagg cctcgctggt gtgagatctt

1141 aggtctgcca aggcaggcac agcccaggat gggttctgag agacgcacat gccccggaca

1201 gttctgagtg agcagtggca tggccgtttg tccctgagag agccgcctct ggctgtagct

1261 gggagggaat agggagggta aaaggagcag gctagccaag aaaggcgcag gtagtggcag

1321 gagtggcgag ggagtgaggg gctggactcc agggccccac tgggaggaca agctccagga

1381 gggccccacc accctagtgg gtgggcctca ggacgtccca ctgacgcatg caggaagggg

1441 cacctcccct taaccacact gctctgtacg gggcacgtgg gcacacatgc acactcacac

1501 tcacatatac gcctgagccc tgcaggagtg gaacgttcac agcccagacc cagttccaga

1561 aaagccaggg gagtcccctc ccaagccccc aagctcagcc tgctccccca ggcccctctg

1621 gcttccctgt gtttccactg tgcacagctc agggaccaac tccacagacc cctcccaggc

1681 agcccctgct ccctgcctgg ccaagtctcc catcccttcc taagcccaac taggacccaa

1741 agcatagaca gggaggggcc gcgtggggtg gcatcagaag

智人恒定区重链α-2亚基(GenBank No.CAA09968.1)(SEQ IDNO：53)

LEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGATFTWTPSSGKSAVQGPPER

DLCGCYSVSSVLPGCAQPWNHGETFTCTAAHPELKTPLTANITKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALN

ELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTYAVTSILRVAAEDWKK

GETFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRMAGKPTHINVSVVMAEADGTCY

智人免疫球蛋白重链恒定区α1(IGHA1基因)的部分mRNA(GenBank No.AJ294729)(SEQ ID NO：54)

1 gcaagcttga ccagccccaa ggtcttcccg ctgagcctct gcagcaccca gccagatggg

61 aacgtggtca tcgcctgcct ggtccagggc ttcttccccc aggagccact cagtgtgacc

121 tggagcgaaa gcggacaggg cgtgaccgcc agaaacttcc cacccagcca ggatgcctcc

181 ggggacctgt acaccacgag cagccagctg accctgccgg ccacacagtg cctagccggc

241 aagtccgtga catgccacgt gaagcactac acgaatccca gccaggatgt gactgtgccc

301 tgcccagttc cctcaactcc acctacccca tctccctcaa ctccacctac cccatctccc

361 tcatgctgcc acccccgact gtcactgcac cgaccggccc tcgaggacct gctcttaggt

421 tcagaagcga acctcacgtg cacactgacc ggcctgagag atgcctcagg tgtcaccttc

481 acctggacgc cctcaagtgg gaagagcgct gttcaaggac cacctgaccg tgacctctgt

541 ggctgctaca gcgtgtccag tgtcctgtcg ggctgtgccg agccatggaa ccatgggaag

601 accttcactt gcactgctgc ctaccccgag tccaagaccc cgctaaccgc caccctctca

661 aaatccggaa acacattccg gcccgaggtc cacctgctgc cgccgccgtc ggaggagctg

721 gccctgaacg agctggtgac gctgacgtgc ctggcacgtg gcttcagccc caaggatgtg

781 ctggttcgct ggctgcaggg gtcacaggag ctgccccgcg agaagtacct gacttgggca

841 tcccggcagg agcccagcca gggcaccacc accttcgctg tgaccagcat actgcgcgtg

901 gcagccgagg actggaagaa gggggacacc ttctcctgca tggtgggcca cgaggccctg

961 ccgctggcct tcacacagaa gaccatcgac cgcttggcgg gtaaacccac ccatgtcaat

1021 gtgtctgttg tcatggcgga ggtggacggc acctgctac

免疫球蛋白重链恒定区α1(GenBank No.CAC20453.1)(SEQ IDNO：55)

ASLTSPKVFPLSLCSTQPDGNVVLACLVQGFFPQEPLSVTWSESGQGVTARNFPPSQDASGDLYTT

SSQLTLPATQCLAGKSVTCHVKHYTNOSQDVTVPCPVPSTPPTPSPSTPPTPSPSCCHPRLSLHRPA

LEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGVTFTWTPSSGKSAVQGPPDRDLCGCYSVSSVLSGCAEPWN

HGKTFTCTAAYPESKTPLTATLSKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVR

WLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQK

TIDRLAGKPTHVNVSVVMAEVDGTCY

其他恒定区序列(人IgM1、IgM2、IgD1、IgA1、IgG1、IgG3、IgE1、IgE2、κ、和λ；小鼠IgM1、κ、和λ；兔IgM1、κ、和λ；和狗IgM1)可以见FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY(3d ed.)，William E.Paul(ed.)，Raven Press，New York，NY(1993)的296-300页。许多其他恒定区序列(多核苷酸和氨基酸)是本领域已知的并且可以用于本发明。

实施例9

组合放射免疫疗法和化学疗法

化学疗法和抗-C35放射免疫疗法的组合经证明在减小肿瘤体积方面比单独任一种疗法更有效。在第一个实验中，在用Colau.C35肿瘤细胞移植的Swiss裸小鼠中测试¹³¹I标记的1B3抗-C35单克隆抗体与用150mg/kg的5-氟尿嘧啶(FU)以及100mg/kg的亚叶酸(LV)的组合放射免疫疗法的效果。Colau.C35是Colau细胞的C35抗原阳性克隆，其是从人结肠癌适应并且用C35逆转录病毒重组体转导的组织培养物。

肿瘤移植后11天开始化学治疗并在第14天施用300μCi¹³¹I标记的1B3抗-C35单克隆抗体。跟踪肿瘤生长长达8周。

图5中的结果表明与仅接受化学治疗或者非-放射标记的(“冷的”)1B3抗-C35抗体和化学治疗的组相比，在接受放射免疫治疗和化学治疗组合的组中肿瘤生长受到抑制。将接受组合放射免疫治疗和化学治疗的组与未治疗的对照组相比较，计算生长抑制的标准参数。

如图5中显示，肿瘤倍增延迟(TDD)等于3.8(在400mm³肿瘤体积)，其中TDD等于(治疗的-对照{达到特定体积的天数})/TVDT，并且TVDT＝对照的肿瘤体积倍增时间{在指数生长期}。将细胞杀死对数(LCK)定义为TDD/3.3＝1.15，其满足有效肿瘤治疗的公认标准(见，例如，Skipper HE et al.，Cancer Chemotherapy Rep.35：1-111(1964)；Coldman AJ and Goldie JH，Mathematical Biosciences65：291-307(1983)；和Norton L and Simon R，Cancer Treat.Rep.61：1307-1317(1977))。

在第二个实验中，在移植Colau.C35肿瘤细胞的Swiss裸小鼠中测试在第15和18天时，组合放射免疫治疗¹³¹I标记的1B3抗-C35单克隆抗体与用2mg/kg的顺铂的化学治疗的效果。肿瘤移植后第15和18天施用顺铂。在第21天施用300μCi ¹³¹I标记的1B3抗-C35单克隆抗体。跟踪肿瘤生长长达10周。

在相同实验中，单独组的用Colau.C35肿瘤细胞移植的Swiss裸小鼠用180mg/kg的5-氟尿嘧啶(5FU)，以及120mg/kg的亚叶酸(LV)治疗或者该相同的化学治疗方案在第18天施用，然后在第21天施用300μCi ¹³¹I标记的1B3抗-C35单克隆抗体。

图6中的结果显示了在仅接受化学治疗(顺铂或者5FU/LV)的组中Colau.C35肿瘤生长的一定抑制，接受¹³¹I标记的1B3抗-C35单克隆抗体的组中的抑制更大，接受组合化学治疗和¹³¹I标记的1B3抗-C35单克隆抗体的组中肿瘤的抑制最大。见下面的表6。

表6：图6中治疗方式对肿瘤体积的影响的比较

RIT＝放射免疫疗法

T-C＝治疗的(T)和对照(C)肿瘤达到给定体积(1200mm³)

所需时间的差异

TDD＝肿瘤倍增延迟＝T-C/未处理的肿瘤体积倍增时间

LCK＝细胞杀死对数＝TDD/3.32

为了在这些实验模型中方便使用，选择生长相对快速并且必须用重组C35转导的肿瘤异种移植物。然而，组合疗法的成功不是由于转导的肿瘤中C35表达的异常高的水平。图7表明C35表达在肿瘤中非常相似，如在天然表达C35的21MT1的肿瘤中，和在C35-转导的肿瘤如Colau.C35和MDA231.C35中。将细胞用缀合Alexa-647的抗-C35MAb1F2或者同种型对照染色。“MFI X”是1F2的平均荧光强度/同种型对照的平均荧光强度的比例。来自正常乳腺上皮的H16N2，和乳腺肿瘤MDAMB231和结肠肿瘤Colau表达低的基底水平的C35。来自乳腺癌的21MT1天然表达高水平C35。用空载体(空的)或者人C35重组载体转导Colau和MDA231。所有肿瘤都在体内生长，切除肿瘤、解离并染色。

实施例10

确定化疗试剂的最大耐受剂量(MTD)

因为化学疗法和免疫放射疗法组合时，涉及累积剂量限制的骨髓毒性的考虑时，必须确定组合疗法的最大耐受剂量(MTD)，并且当两种治疗剂的毒性是累加的时候，采取将允许施用两种毒性剂的策略。通过与外周循环中血小板和白细胞回收所需的时间有关的管理标准建立MTD。此类标准是本领域技术人员熟悉的。对于鼠模型的情况，通常使用的对MTD的代替定义是导致平均小于20％重量减轻或者小于10％死亡率的最大剂量。用于标准临床方案或者动物模型中最常用的化学治疗剂的当前建立的MTD在下面的表7到10中显示。

表7：异种移植模型(裸小鼠)中代表性化学治疗方案

细胞毒性药品	最大耐受剂量	剂量+RIT	方案
细胞毒性药品	最大耐受剂量	剂量+RIT	方案	氟尿嘧啶/亚叶酸	180/120mg/kg¹	150/100mg/kg	静脉内推注
奥沙利铂	5mg/kg³	TBD	每日腹膜内注射，5个循环	氟尿嘧啶/亚叶酸	180/120mg/kg¹	150/100mg/kg	静脉内推注
奥沙利铂	5mg/kg³	TBD	每日腹膜内注射，5个循环	顺铂	4mg/kg^4，5	2mg/kg	每3天静脉内注射一次，2个循环
伊立替康	15mg/kg³	TBD	每日腹膜内注射，5个循环	顺铂	4mg/kg^4，5	2mg/kg	每3天静脉内注射一次，2个循环
伊立替康	15mg/kg³	TBD	每日腹膜内注射，5个循环	Taxol	没有毒性²	30mg/kg^4，6	每7天静脉内注射一次，2-3个循环
环磷酰胺	没有毒性²	175mg/kg^4，7	每7天静脉内注射一次，2个循环	Taxol	没有毒性²	30mg/kg^4，6	每7天静脉内注射一次，2-3个循环
环磷酰胺	没有毒性²	175mg/kg^4，7	每7天静脉内注射一次，2个循环	阿霉素	10mg/kg¹	8mg/kg	每4天静脉内注射一次，3个循环
吉西他滨	没有毒性⁵	120mg/kg⁵	每3天腹膜内注射，4个循环	阿霉素	10mg/kg¹	8mg/kg	每4天静脉内注射一次，3个循环
吉西他滨	没有毒性⁵	120mg/kg⁵	每3天腹膜内注射，4个循环	长春瑞滨	20mg/kg⁴	TBD	静脉内推注
外部光线辐射	没有毒性²	20Gy	局部递送	长春瑞滨	20mg/kg⁴	TBD	静脉内推注

注释

TBD：待定

1.MTD通过本发明人确定。最大耐受剂量定义为≥20％平均重量减轻和/或>10致死率。

2.所示方案的无毒剂量。

3.Fichtner I et al.Anticancer drug response and expressionof molecular markers in early-passage xenotransplanted coloncarcinomas.Eur J Can 2004.40：298-307.

4.Villena-Heinsen C et al.Human ovarian cancer xenograftsin nude mice：chemotherapy trials with paclitaxel，cisplatin，vinorelbine，and titanocene dichloride.Anticancer Drugs 1998.9：557-563.

5.Higgins B.et al.Antitumor activity of erlotinib(OSI-774，Tarceva)alone or in combination in human non-smallcell lung cancer tumor xenograft models.Anti-Cancer Drugs 2004.15：503-512.

6.Kraeber-Bodere F.et al.Enhanced Antitumor Activity ofCombined pretargeted radioimmunotherapy and Paclitaxel inMedullary Thyroid Cancer Xenograft.Mol Can Ther 2002.1：267-274

7.Kraus-Berthier，L et al.Histology and sensitivity toanticancer Drugs of two human non-small cell lungcar cinomasimplanted in the pleural cavity of nude mice.2000.Clin CanRes6：297-304.

表8：代表性乳腺癌化学治疗方案

食用方法细胞毒性药物剂量方案

AC 阿霉素 60mg/m2 IV 每3周重复一次，4个循环

环磷酰胺 600mg/m2 IV

CAF 环磷酰胺在第1-14天每28天重复一次，6个循环

100mg/m2/天 P0

阿霉素在第1和8天

30mg/m2 IV

氟尿嘧啶在第1和8天

500mg/m2 IV

CMF 环磷酰胺在第1-14天每28天重复一次，6个循环

100mg/m2/天 P0

甲氨蝶呤在第1和8天

40mg/m2IV

氟尿嘧啶在第1和8天

600mg/m2 IV

长春瑞滨在第1和8天每21天重复一次，6-8个循

30mg/m2 IV 环

紫杉醇175mg/m2 IV 每21天重复一次，6个循环

来源：DataMonitor Pipeline Insight：Breast Cancer June 2004；http://www.bccancer.bc.ca

表9：代表性结肠癌治疗方法

食用方法药物剂量方案

AC 亚叶酸 20mg/m2/天X5天(d1-5)IV，每28天重复一次，6个

然后为氟尿嘧啶循环

氟尿嘧啶 425mg/m2/天X5天(d1-5)IV

伊立替康 35020mg/m2 VI 每21天重复一次，2-6

个循环，取决于临床效益

和毒性

FOLFOX 奥沙利铂 100mg/m2 IV 每14天重复一次，最多

12个循环

亚叶酸 400mg/m2 IV

氟尿嘧啶在亚叶酸，THEN之后

400mg/m2 IV推注

氟尿嘧啶在46小时内2400mg/m2 IV

FOLFIRI 伊立替康 180mg/m2 IV 每14天重复一次，最多

12个循环

亚叶酸 400mg/m2 IV

氟尿嘧啶在亚叶酸，THEN之后

400mg/m2 IV推注

氟尿嘧啶在46小时内2400mg/m2 IV

来源：http://www.bccancer.bc.ca

表10：代表性肺癌化学治疗方案

药物剂量方案

多西他赛 75mg/m2 IV 每21天重复一次，6个循环

多西他赛 75mg/m2 IV 每21天重复一次，4个循环

顺铂 75mg/m2 IV

顺铂在第1天，75mg/m2 IV 每21天重复一次，6个循环

吉西他滨在第1天和第8天，

1250mg/m2 IV

来源：http: //www.bccancer.bc.ca

减小化学治疗和放射免疫治疗的组合MTD的有效策略包括：将施用的化学治疗剂的剂量减小到当与MTD的放射免疫疗法组合施用时不导致累加毒性的水平(见，下面的实施例10A)；选择当与放射免疫疗法组合使用时不促进累加毒性的化学治疗剂(见下面的实施例10B)；和减小放射免疫治疗剂的骨髓毒性(见下面的实施例10C)。

A.减小化学治疗剂的剂量以减小毒性

将2mg/kg顺铂(约MTD的50％)在第15和18天施用于Swiss裸小鼠并且在72小时后使用MTD(300μCi)的¹³¹I-标记的1B3抗-C35单克隆抗体。如图8中所示，通过重量减轻确定的顺铂和放射免疫治疗剂的组合毒性与在MTD施用的单独放射免疫治疗剂的毒性没有显著不同。

B.化学治疗剂不促进累加毒性

在第18天施用180mg/kg的处于MTD的5-氟尿嘧啶与120mg/kg的亚叶酸，然后在第21天以MTD(300μCi)施用¹³¹I-标记的1B3抗-C35单克隆抗体。如图8中所示，不超过两种毒性剂组合的MTD，尽管每种毒性剂都以各自的MTD施用。

C.放射免疫治疗剂的减小的骨髓毒性

备选策略是通过生物化学修饰减小放射免疫治疗剂的骨髓毒性，所述修饰导致放射标记的抗体从外周循环中加速清除。适宜的修饰包括使用不同的抗体同种型，如表10中所示的IgG3、IgA、IgD或IgE，或者缺失IgG的CH2结构域，其负责它的延长的血清半寿期(见Mueller BM，RA Reisfeld，and SD Gillies，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：5702-5705(1990)；Slavin-Chiorini DC，et al.，Int.J.Cancer 53：97-103(1993))。

表11.人免疫球蛋白同种型的血清半衰期

免疫球蛋白同种型血清半衰期

IgG 121天

IgG2 20天

IgG3 7天

IgG4 21天

IgM 10天

IgA 6天

IgD 3天

IgE 2天

其他工程化抗体和/或抗体片段，或者修饰抗体结构以减小血清半寿期的策略也是可行的。此类工程化的抗体和/或抗体片段的实例包括，但不限于，结构域缺失的抗体、Fab、F(ab’)2、scFv、微型抗体、双链抗体、三链抗体、四链抗体等等。

实施例11

1B3和1F2抗体的C35肽表位

为了定位1B3和1F2抗体的表位特异性，将在大肠杆菌中合成的具有6x His标签的重组人C35(rhC35)用Lys-C内切蛋白酶消化。该酶在蛋白质序列中赖氨酸(K)残基后切割。图9显示了用Lys-C完全消化rhC35后预计的肽片段。显示了rhC35的完整序列，包括氨基末端添加的6x His标签。氨基酸位置相对于天然人序列的氨基末端甲硫氨酸(M)编号。注意到在后面为带负电残基的第一和第三个赖氨酸处消化是无效的，并且可以产生一些更长的组合片段。以50:1的重量比加入Lys-C内切蛋白酶至纯化的rhC35并在37℃在25mM Tris，pH8.0中孵育18小时。将消化物用乙醇沉淀并在还原性Tricine样品缓冲液中再溶解。100℃下加热5分钟后，在16％Tricine凝胶(Invitrogen)上通过电泳分离样品。将肽转移到PVDF膜并用考马斯蓝对图10中描绘的印迹染色(左和右图中的泳道1-3)以检测所有肽或者用下面的一种方式处理：1μg/ml鼠1F2抗-C35抗体，然后是碱性磷酸酶缀合的山羊抗-小鼠抗体(左图的泳道4)；1μg/ml连接人恒定区(MAb11)的1B3抗-C35免疫球蛋白可变区，然后是碱性磷酸酶缀合的山羊抗-人抗体(左图的泳道5)；或者抗-6xHis标签小鼠抗体(Amersham)，然后是碱性磷酸酶缀合的山羊抗-小鼠抗体(右图的泳道4和5)。加入BCIP/NBT底物并显色以检测二级试剂。在两个图的侧翼泳道中显示了分子量标记。

在图10中，所指示的条带A迁移到未消化的rhC35的位置。注意到条带B被1F2但不被MAb11(1B3)抗-C35抗体染色，而条带C不被1F2也不被MAb11(1B3)抗体染色。因为条带B和C都用针对rhC35的氨基末端的6x His标签的抗-6x His标签抗体染色，所以可以推断两个片段都缺少C-末端肽片段。对于约15kDa条带B的情况，用MAb11(1B3)染色所需的丧失的表位是11个氨基酸的C-末端C35肽ITNSRPPCVIL，其代表天然C35序列的残基105-115。该表位不是用1F2染色所需的。相反，1F2抗体不与约8kDa的条带C反应，带C还缺少天然C35序列的残基48-104。结果表明1B3抗体对C35残基105-115(ITNSRPPCVIL)内的表位是特异的，而1F2抗体对C35残基48-104内的表位是特异的。

实施例12

与1B3抗-C35单克隆抗体相关的人抗体

通过2002年9月5日公布的US 2002 0123057 A1中公开的方法产生两种抗体，其是人来源的，只是与小鼠1B3抗-C35单克隆抗体有相同的免疫球蛋白重链CDR3区。

MAb 165包含141D10 VH H732重链可变区(SEQ ID NOS：56和57)，和UH8 VK L120κ轻链可变区(SEQ ID NOS：58和59)。如图11中所示，MAb 165是C35特异的。将141D10重组痘苗病毒与UH8重组痘苗病毒共转染到HeLa细胞中。通过ELISA测试所分泌的抗体对C35或者对照蛋白质A27L(痘苗病毒蛋白)的结合。

MAb 171包含MSH3VH H835重链可变区(SEQ ID NOS：60和61)和UH8 VK L120κ轻链可变区(SEQ ID NOS：58和59)。

实施例13

鉴定抗-C35抗体识别的C35肽表位

用本领域公知的标准免疫方法产生针对重组C35的兔多克隆抗体。合成长为15个氨基酸的重叠肽，其对应于在从1到101的每个氨基酸残基开始的115个氨基酸长的C35蛋白质序列。基于每15个氨基酸肽中氨基末端残基的C35位置命名肽。在重叠天然C35序列的30、33和112位的半胱氨酸残基的每种肽中，用丙氨酸取代半胱氨酸以避免形成二硫键交联的肽。

用2μg C35蛋白质或者来自C35蛋白质序列的14μg或40μg所指示的15个氨基酸的肽包被96孔Maxisorp微量滴定板的孔并如下面详细描述的测定兔C35免疫血清中抗体的结合。对阳性和阴性对照和检测到阳性结合的那些C35衍生肽在下面的表12中显示了数据。肽结合水平的差异可以是由于特定抗体种类的浓度差异、抗体亲和性的差异或者它们的组合。

A.肽样品制备

将100％ DMSO中的C35肽15聚体(10mg/ml)在无菌条件下等分到1.5ml管(40μg/管)，然后真空离心除去DMSO。将肽以1ml/管重悬浮在PBS(pH7.2)中，混合均匀并离心。每种肽浓度(“肽溶液”)为40μg/ml。肽溶液应该保存在-20℃待用。一旦解冻，它将保持在4℃不超过2周。

B.在Maxisorp板上包被样品

对于14g/ml肽包被的板，每孔加入65μl PBS，pH7.2，然后每孔加入35μl肽溶液(总体积100μl/孔)，并混合均匀。对于40μg/ml肽包被的板，将100μl肽溶液直接置于板上，100μl/孔。将对照C35蛋白质稀释入PBS，pH7.2中至2μg/ml并加入到板中，100μl/孔。将包被的板在室温孵育2小时，然后4℃过夜。

C.ELISA条件

每板在板洗涤器上洗涤3次。将板在室温下用“封闭缓冲液”(PBS，pH7.2和10％ FBS)封闭2小时，然后在板洗涤器上每板洗涤3次。将一级抗体兔抗-人C35多克隆抗体(由Bethyl生产，批次62902)稀释到“测定稀释剂”(PBS，pH7.2加上0.05％ Tween 20和10％FBS)中并加入板中，100μl/孔。将板在室温孵育2小时。对于14μg/ml肽包被的板，加入100ng/ml一级抗体。对于40μg/ml肽包被的板，加入1μg/ml一级抗体。将板在板洗涤器上洗涤5次。将二级抗体HRP(来自Zymed的辣根过氧化物酶缀合的山羊抗兔Fc多克隆抗体)以1:20,000稀释到测定稀释剂中并加入平板，100μl/孔。平板在室温孵育2小时。在板洗涤器上洗涤平板7次。按照试剂盒生产商的说明加入底物并在室温黑暗中孵育15分钟。通过加入2N H₂SO₄，100μl/孔停止反应。立即读取450-570nm的吸收。

表12：与C35表位结合的抗体

在450-570nm下的吸光率

肽序列 14μg/ml 40μg/ml

无 0.009 0.013

一级兔抗体 C35蛋白质或肽 0.009 0.009

C35蛋白质 C35蛋白质 3.765 3.5225

P1 MSGEPGQTSVAPPPE 0.257

P2 SGEPGQTSVAPPPEE 0.108 1.227

P3 GEPGQTSVAPPPEEV 1.458 3.349

P4 EPGQTSVAPPPEEVE 1.254 3.282

P5 PGQTSVAPPPEEVEP 2.719 3.383

P6 GQTSVAPPPEEVEPG 2.483 3.381

P7 QTSVAPPPEEVEPGS 2.635 3.388

P8 TSVAPPPEEVEPGSG 0.059 0.394

P9 SVAPPPEEVEPGSGV 2.31 3.367

P10 VAPPPEEVEPGSGVR 1.736 3.407

P11 APPPEEVEPGSGVRI 1.526 3.317

P12 PPPEEVEPGSGVRIV 0.836

P13 PPEEVEPGSGVRIVV 0.385 2.522

P14 PEEVEPGSGVRIVVE 0.127 0.972

P15 EEVEPGSGVRIVVEY 0.039 0.334

P16 EVEPGSGVRIVVEYA 0.027 0.172

P62 TGAFEIEINGQLVFS 0.023 0.107

P63 GAFEIEINGQLVFSK 0.079 0.557

P64 AFEIEINGQLVFSKL 0.055 0.423

P65 FEIEINGQLVFSKLE 0.043 0.269

P66 EIEINGQLVFSKLEN 0.028 0.182

P80 NGGFPYEKDLIEAIR 0.018 0.1

P81 GGFPYEKDLIEAIRR 0.032 0.204

P82 GFPYEKDLIEAIRRA 0.02 0.18

P83 FPYEKDLIEAIRRAS 0.025 0.19

P84 PYEKDLIEAIRRASN 0.037 0.391

P85 YEKDLIEAIRRASNG 0.024 0.179

P86 EKDLIEAIRRASNGE 0.023 0.166

P88 DLIEAIRRASNGETL 0.025 0.135

P89 LIEAIRRASNGETLE 0.015 0.053

P90 IEAIRRASNGETLEK 0.04 0.403

P91 EAIRRASNGETLEKI 0.023 0.144

P92 AIRRASNGETLEKIT 0.04 0.267

P93 IRRASNGETLEKITN 0.051 0.389

P94 RRASNGETLEKITNS 0.061 0.526

P95 RASNGETLEKITNSR 0.062 0.462

P97 SNGETLEKITNSRPP 0.046 0.373

P98 NGETLEKITNSRPPA 0.035 0.213

P99 GETLEKITNSRPPAV 0.026 0.18

P100 ETLEKITNSRPPAVI 0.017 0.124

P101 TLEKITNSRPPAVIL 0.472 2.519

实施例14

两种C35抗体和化学疗法的组合疗法

如图12所示及本实施例所描述的那样，对涉及施用两种C35抗体与化疗试剂的组合的癌症治疗方法进行测试。将5百万个C35阳性MDA231肿瘤细胞皮下移植到Swiss裸鼠的乳房脂肪垫中。在由至少5只小鼠构成的多个试验组中，每只小鼠都在移植后的第17天开始分别接受以下治疗：

1.未处理(对照组)

2.在第17和24天以30mg/kg的量腹膜内注射紫杉醇。

3.在第17和24天以30mg/kg的量腹膜内注射紫杉醇，并且从第17天开始每只静脉内注射400μg(20mg/kg)的1B2鼠单克隆抗体，并且每周两次，持续三个星期。

4.在第17和24天以30mg/kg的量腹膜内注射紫杉醇，并且从第17天开始每只静脉内注射400μg(20mg/kg)的1F2鼠单克隆抗体，并且每周两次，持续三个星期。

5.在第17和24天以30mg/kg的量腹膜内注射紫杉醇，并且从第17天开始每只进行静脉内注射400μg(20mg/kg)的1F2鼠单克隆抗体和静脉内注射400μg的1B3鼠单克隆抗体的组合疗法(总计40mg/kg)，并且每周两次，持续三个星期。

6.在第17和24天以30mg/kg的量腹膜内注射紫杉醇，并且从第17天开始每只静脉内注射400μg(20mg/kg)的单克隆同种型对照抗体，并且每周两次，持续三个星期。

在移植后的各时间点时测量小鼠的平均肿瘤体积。使用游标卡尺对各个肿瘤测量两次；使用公式：(长度x宽度²)/2计算肿瘤体积。将所得的结果示于图12中，并且该结果表明两种鼠抗C35抗体(1F2和1B3)与化学疗法(紫杉醇)的组合抑制了体内C35阳性肿瘤的生长。如图12所示，分别与化疗试剂紫杉醇一起施用的1F2和1B3均不能有效地抑制小鼠肿瘤的生长。在使用1F2和1B3与紫杉醇的组合治疗的小鼠中，在最后一次抗体治疗后的大约一个星期，肿瘤生长重新开始，这与所预计的体内抗体的半衰期有关。

实施例15

MAb163显示出针对C35的肿瘤特异性结合

如图13所示，采用蛋白质印迹检测方法，显示MAb163与肿瘤特异性结合。将样品重悬浮于Laemli缓冲剂中，用β-ME和加热进行还原，然后在4-20％的SDS-PAGE上电泳，再转移至PVDF膜上。将所得的膜与MAb163(4.4ug/ml)一起温育，然后使用山羊抗人IgG-HRP进行检测，并通过化学发光显影。

图13示出了以下几条泳道：泳道1：从大肠杆菌纯化的重组人C35蛋白质(rC35)(100ng/泳道)；泳道2：21MT1-D人乳腺肿瘤细胞裂解物(100,000细胞等价物/泳道)；以及泳道3：H16N2正常永生化人乳腺细胞系裂解物(100,000细胞等价物/泳道)。在所述图的左侧，分子量标志物以千道尔顿示出。

该试验表明，MAb 163与肿瘤细胞裂解物中的天然C35单体结合；但是，这种结合在正常细胞系中没有发生。MAb 163还与rC35单体(16kD)、二聚体(～32kD)和较大的聚集体结合。由于在该rC35中存在有6 x His标签，重组C35(泳道1)稍大于天然的C35(泳道2)。

图14示出了使用流式细胞仪对MAb 163特异性的分析。细胞内FACS按照如下方式进行：将H16N2(C35阴性正常永生化乳腺细胞系)和21MT1(C35阳性乳腺肿瘤细胞系)细胞固定，并透性化，然后使用Xenon标记试剂盒(Molecular Probes)将50万个细胞与1μg的抗C35抗体(MAb 163或Mab 11)或同种型匹配对照抗体(均与Alexa-647缀合)温育45分钟。然后在FACS Calibur(BD Biosciences)上对经洗涤的细胞进行分析。使用同种型对照Mab的染色情况如图14中带有黑色填充区域表示；使用抗C35 Mab的染色情况以中空的线表示。中空线的变化代表了在C35抗体的21MT特异性中的MAb 163或Mab 11。

在人乳腺细胞系中使用MAb 163进行的免疫荧光测试还表明了MAb 163特异性结合C35。通过以下方法形成了图15所示的图像。将多聚甲醛固定的细胞(C35+或C35-)与多种浓度的MAb 163(3μg/ml、1μg/ml、0.3μg/ml或0.1μg/ml)一起温育，然后使用二级抗体(与APC缀合的抗人IgG)进行检测，并在FMAT上进行目视观察。图15显示出上述测试的结果，其中C35阴性H16N2细胞没有显示出任何免疫荧光染色，而C35阳性21MT1-D细胞显示出剂量依赖度饿免疫荧光。

如图22所示，在表达C35的21MT1-D细胞系的细胞裂解物中，使用MAb 163对C35进行免疫沉淀。简而言之，将CH0细胞上清液中的10ml MAb163缓冲剂交换入到PBS中，并被浓缩至1ml。在超过1小时的时间中，将浓缩的MAb 163加入到蛋白质A珠子中。经过洗涤后，在2小时内，将蛋白质A/MAb 163加入到C35阳性的21MT1-D细胞裂解物中。在对所述的珠子进行洗涤后，在100℃下用还原样品缓冲剂稀释所述的蛋白质。

使用兔抗C35多克隆血清，通过蛋白质印迹分析经免疫沉淀的样品。如图22的左侧泳道所示，在蛋白质印迹上包含来自100,00021MT1-D细胞的裂解物作为对照。图22中的数字“15”表示分子量标记物为15千道尔顿。图22示出了经MAb 163(在中心处以“163”标识)免疫沉淀的C35蛋白质，而IgG阴性对照抗体(右侧以“阴性IgG”标识)则没有发生免疫沉淀。

实施例16

MAb 163的亲和力测试

如图16所示，采用1:1的动力学模型进行试验，从而测定MAb 163的KA和KD。为了使用Biacore测量亲和力，通过胺缀合来固定山羊抗人IgG Fc，从而制备CM5芯片表面。然后通过使单克隆人抗体MAb 163流过包含山羊抗人IgG的芯片来捕获所述的抗体。然后，将rC35系列稀释成两个独立的系列，从而包括了范围广泛的浓度点和结合效率，然后使C35流过包含结合MAb 163的芯片。在一系列传感图谱中记录结合情况。使用BIAevaluation对结合情况进行评价，其中通过拟合曲线并校正质量转移(Mass Transfer)来计算Ka和Kd。就MAb163而言，上述试验得到了以下结果：(a)ka(1/Ms)＝2.84e5；(b)kd(l/s)＝9.59e-4；(c)KA(1/M)＝2.96e8；以及(d)KD(nM)＝3.38。

实施例17

MAb 163表位的图谱

为了对MAb 163的特异性表位进行定位，使用Lys-C内切蛋白酶消化在大肠杆菌中使用6 x His标签合成的重组人C35(rhC35)。该酶切割了蛋白质序列中赖氨酸(K)残基以后的残基。在10个孔的16％Tricine凝胶(Ihvitrogen)上通过电泳分离样品。通过以下过程，采用蛋白质印迹方法进行检测，所述的过程为：与人抗体进行温育，然后与辣根过氧化酶缀合的山羊抗人二级抗体温育，再使用TMB(3，3′，5，5′-四甲基联苯胺)作为色原来进行检测。采用考马斯亮兰染色来检测所有的肽。对于本发明的其他的详细描述，参见上述的实施例11。

图17示出了使用Lys-C内切蛋白酶对6-His标签的重组人C35(rhC35)进行部分消化后所预期的肽片段。预期的11条消化片段中的每一条都由不同类型的线表示，其对应于在用于比较的图18和19中的蛋白质印迹中左侧示出的相同的预期片段。

图18示出了在对rhC35进行Lys-C消化后，使用考马斯亮兰染色和抗6-His染色的所观察到的肽片段。所预期部分消化片段在所述印迹的左侧示出以用于比较。注意，较小的预期片段(即，6-11)没有转移至孔中以形成印迹。

图19示出了MAb 163染色与考马斯亮兰和抗6-His印迹的蛋白质印迹比较，标识了包含MAb 163所结合的C435表位的片段。预期片段在印迹的左侧示出以用于比较。在图19中示出MAb 163结合与预期片段1-4对应的C35片段，但是该图中没有示出与预期片段5-11的结合。

如图20所示的结果表明，MAb 163对C35的第48-87位氨基酸残基内的表位具有特异性，其中所述的氨基酸的位置以相对于天然人序列的氨基末端的蛋氨酸来进行编码(参见图9)。上述区域具有以下的氨基酸序列：EQYPGIEIESRLGGTGAFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEK。

实施例18

人抗C35Mab或赫赛汀对C35+/Her2+肿瘤细胞系的体内增殖的抑制

图21示出了使用BT474细胞(一种C35阳性/Her2阴性乳腺肿瘤细胞系)和H16N2细胞(一种C35阴性/Her2阴性正常乳腺细胞系)进行的细胞增殖测试的结果。将细胞一式三份进行接种，并使它们粘着过夜。使用90μm奎尼定使细胞同步处于G0期，并持续24小时。在经过洗涤从而将细胞由G0期释放后，加入150μg/ml或大约1M的抗体。将美罗华(人抗CD20)作为阴性对照抗体，这是因为所有测试的乳腺细胞系均为CD20阴性的。将赫赛汀(抗Her2/neu)作为用于Her2阳性肿瘤细胞系的阳性对照抗体。在上述试验中使用的抗C35抗体为MAb 163、MAb 11(嵌合1B3)和MAb 76(嵌合1F2)。

在各时间点时加入阿尔玛蓝(alamar blue)，以分析增殖情况。在多种代谢酶的存在下，阿尔玛蓝还原并改变颜色。与MTT类似，阿尔马蓝可以由NADPH、FADH、FMNH和NADH还原，但是与MTT不同的是，阿尔马蓝还可以由细胞色素还原。在与阿尔马蓝温育90分钟后，在荧光微孔板读取器上在530nm处检测荧光。图21所示的数据来自在加入或未加入抗体的条件下体外培养第6天的数据。

增殖测试的结果表明，抗C35抗体或赫赛汀抑制了BT474(一种C35阳性/Her2阳性乳腺细胞系)的增殖，但不抑制H16N2(一种C35阴性/Her2阴性正常乳腺细胞系)的增殖。其中存在一种低水平的体外细胞凋亡的自发性诱导，这种诱导产生了用于抗C35抗体的靶标，并且看起来有助于在抗C35抗体的存在下细胞增殖的减少。这种体外抑制效果的敏感性似乎比体内的抑制效果的敏感性更高，这是由于抑制是由单种抗体介导的，并且不需要特异性或化学疗法(其在体外诱导细胞大范围死亡)的组合。

实施例19

通过使用两种C35抗体和阿霉素的组合来抑制肿瘤的生长

如图23和24所示以及由本实施例所述，测试两种C35抗体与化疗试剂的组合对体内肿瘤生长的作用。如上文实施例14所述，将5百万个C35阳性MDA231肿瘤细胞皮下移植到Swiss裸鼠的乳房脂肪垫中。在由至少6只小鼠构成的多个试验组中，使每只小鼠都在移植后的第3天开始分别接受以下治疗：

1.未处理(对照组)

2.在移植后的第3天和10天以8mg/kg的量静脉内施用阿霉素。

3.在移植后的第3、7、10、13、17、20和23天以20mg/kg的量静脉内施用1B3鼠单克隆抗体以及以20mg/kg的量静脉内施用1F2。

4.在移植后的第3和10天以8mg/kg的量静脉内施用阿霉素以及在移植后的第3、7、10、13、17、20和23天以40mg/kg的量静脉内施用1F2鼠单克隆抗体。

5.在移植后的第3和10天以8mg/kg的量静脉内施用阿霉素以及在移植后的第3、7、10、13、17、20和23天以40mg/kg的量静脉内施用1B2鼠单克隆抗体。

6.在移植后的第3和10天以8mg/kg的量静脉内施用阿霉素以及在移植后的第3、7、10、13、17、20和23天以20mg/kg的量静脉内施用1F2和以20mg/kg的量静脉内施用1B3的组合疗法(总计40mg/kg)。

7.在移植后的第3和10天以8mg/kg的量静脉内施用阿霉素以及在移植后的第3、7、10、13、17、20和23天以40mg/kg的量静脉内施用单克隆同种型对照抗体。

如上述实施例14所述，在移植后的各时间点时测量小鼠的平均肿瘤体积。图23和24所示的结果表明，与总剂量为40mg/kg的1B3和1F2、总剂量为40mg/kg的1B3和阿霉素、总剂量为40mg/kg的1F2和阿霉素、单独的阿霉素、IgG同种型抗体对照或未处理相比，总剂量为40mg/kg的鼠C35抗体1B3(剂量为20mg/kg)和1F2(剂量为20mg/kg)与剂量为8mg/kg的阿霉素(多柔比星)的组合在抑制移植有MDA231.C35肿瘤的小鼠中的肿瘤生长方面是更有效的。到移植后的18天为止，只有采用1B3和1F2与阿霉素的组合在抑制肿瘤生长方面是有效的(参见图23和24)。在采用1F2和1B3与阿霉素的组合治疗的小鼠中，在移植后的第23天的最后一次抗体治疗后，在一个星期内，肿瘤生长重新开始(参见图23和24)。

序列表

<110>Vaccinex，Inc.

<120>用于治疗癌症的抗C35的抗体

<130>1843.048PC01

<150>US 60/815,562

<151>2006-06-22

<160>77

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>354

<212>DNA

<213>人

<220>

<221>CDS

<222>(7)..(354)

<400>1

<210>2

<211>115

<212>PRT

<213>人

<400>2

<210>3

<211>627

<212>DNA

<213>小鼠

<400>3

<210>4

<211>116

<212>PRT

<213>小鼠

<400>4

<210>5

<211>540

<212>DNA

<213>小鼠

<400>5

<210>6

<211>106

<212>PRT

<213>小鼠

<400>6

<210>7

<211>618

<212>DNA

<213>小鼠

<400>7

<210>8

<211>122

<212>PRT

<213>小鼠

<400>8

<210>9

<211>528

<212>DNA

<213>小鼠

<400>9

<210>10

<211>107

<212>PRT

<213>小鼠

<400>10

<210>11

<211>553

<212>DNA

<213>人

<400>11

<210>12

<211>119

<212>PRT

<213>人

<400>12

<210>13

<211>528

<212>DNA

<213>人

<400>13

<210>14

<211>113

<212>PRT

<213>人

<400>14

<210>15

<211>29

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>在所选抗体以分泌的人IgG1的表达中使用的引物

<400>15

<210>16

<211>31

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>在所选抗体以分泌的人IgG1的表达中使用的引物

<400>16

<210>17

<211>1084

<212>DNA

<213>人

<400>17

<210>18

<211>413

<212>DNA

<213>人

<400>18

<210>19

<211>422

<212>DNA

<213>人

<400>19

<210>20

<211>29

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>IgG2-F引物

<400>20

<210>21

<211>31

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>IgI2-R引物

<400>21

<210>22

<211>29

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>IgG3-F引物

<400>22

<210>23

<211>31

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>IgG3-R引物

<400>23

<210>24

<211>29

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>IgG4-F引物

<400>24

<210>25

<211>31

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>IgG4-R引物

<400>25

<210>26

<211>30

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>IgA1-F引物

<400>26

<210>27

<211>31

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>IgA1-R引物

<400>27

<210>28

<211>30

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>IgA2-F引物

<400>28

<210>29

<211>31

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>IgA2-R引物

<400>29

<210>30

<211>30

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>IgD-F引物

<400>30

<210>31

<211>31

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>IgD-R引物

<400>31

<210>32

<211>29

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>IgE-F引物

<400>32

<210>33

<211>31

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>IgE-R

<400>33

<210>34

<211>29

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>IgM-F

<400>34

<210>35

<211>31

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>IgM-R

<400>35

<210>36

<211>6

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>BssHII位点

<400>36

<210>37

<211>7

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>BsteII位点

<400>37

<210>38

<211>6

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>ApaL1位点

<400>38

<210>39

<211>6

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>Xho1位点

<400>39

<210>40

<211>39

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>1F2VK正向引物

<400>40

<210>41

<211>29

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>1F2VK反向引物

<400>41

<210>42

<211>6

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>ApaL1位点

<400>42

<210>43

<211>6

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>Xho1位点

<400>43

<210>44

<211>41

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>1F2VH正向引物

<400>44

<210>45

<211>28

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>1F2VH反向引物

<400>45

<210>46

<211>40

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>1B3VK正向引物

<400>46

<210>47

<211>29

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>1B3VK反向引物

<400>47

<210>48

<211>41

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>1B3VH正向引物

<400>48

<210>49

<211>24

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>1B3VH反向引物

<400>49

<210>50

<211>935

<212>DNA

<213>人

<400>50

<210>51

<211>935

<212>DNA

<213>人

<400>51

<210>52

<211>1780

<212>DNA

<213>人

<400>52

<210>53

<211>220

<212>PRT

<213>人

<400>53

<210>54

<211>1059

<212>DNA

<213>人

<400>54

<210>55

<211>353

<212>PRT

<213>人

<400>55

<210>56

<211>366

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>嵌合小鼠/人141D10 VH H732

<400>56

<210>57

<211>122

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>嵌合小鼠/人141D10 VH H732

<400>57

<210>58

<211>321

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>嵌合小鼠/人UH8VK L120

<400>58

<210>59

<211>107

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>嵌合小鼠/人UH8 VK L120

<400>59

<210>60

<211>369

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>嵌合小鼠/人MSH3VH(H835)

<400>60

<210>61

<211>123

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>嵌合小鼠/人MSH3 VH(H835)

<400>61

<210>62

<211>125

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>MAb163(H730)的VH

<400>62

<210>63

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>MAb163(H730)的VH CDR 1

<400>63

<210>64

<211>19

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>MAb163(H730)的VH CDR 2

<400>64

<210>65

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>MAb163(H730)的VH CDR 3

<400>65

<210>66

<211>107

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>MAb163(L74)的VL

<400>66

<210>67

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>MAb163(L74)的VL CDR 1

<400>67

<210>68

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>MAb163(L74)的VL CDR 2

<400>68

<210>69

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>MAb163(L74)的VL CDR 3

<400>69

<210>70

<211>375

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>MAb163(H730)的VH

<400>70

<210>71

<211>321

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>MAb163(L74)的VL

<400>71

<210>72

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>CDR 1核苷酸(H730)

<400>72

<210>73

<211>57

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>CDR 2核苷酸(H730)

<400>73

<210>74

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>CDR 3核苷酸(H730)

<400>74

<210>75

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>CDR 1核苷酸(L74)

<400>75

<210>76

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>CDR 2核苷酸(L74)

<400>76

<210>77

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>CDR 3核苷酸(L74)

<400>77

Claims

1.一种杀死表达C35的癌细胞的方法，该方法包括：向所述的细胞施用：(a)特异性结合C35的第一种C35抗体或其抗原结合片段；(b)特异性结合C35的第二种C35抗体或其抗原结合片段；以及(c)治疗性试剂。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述的方法在体内进行。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述的方法在哺乳动物中进行。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述的哺乳动物是人。

5.根据权利要求1-4的任何一项中所述的方法，其中所述的第一种C35抗体或其片段、以及所述的第二种C35抗体或其片段分别结合不同的C35表位。

6.根据权利要求1-5的任何一项中所述的方法，其中所述的第一种C35抗体或片段、或者第二种C35抗体或片段中的至少一种结合C35表位，所述的C35表位选自：位于SEQ ID NO：2的第105-115的氨基酸残基内的C35表位；位于SEQ ID NO：2的第48-87的氨基酸残基内的C35表位；以及位于SEQ ID NO：2的第48-104的氨基酸残基内的C35表位。

7.根据权利要求1-6的任何一项中所述的方法，其中所述的治疗剂是化疗试剂。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述的化疗试剂选自：顺铂、卡铂、紫杉醇、阿霉素、多西他赛、泰素帝、吉西他滨和长春瑞滨。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述的化疗试剂是紫杉醇。

10.根据权利要求8所述的方法，其中所述的化疗试剂是阿霉素。

11.根据权利要求1-10的任何一项中所述的方法，其中在施用所述的第一种C35抗体或所述的第二种C35抗体中的至少一种之前，施用所述的治疗性试剂。

12.根据权利要求1-10的任何一项中所述的方法，其中在施用所述的第一种C35抗体或所述的第二种C35抗体中的至少一种之后，施用所述的治疗性试剂。

13.根据权利要求1-10的任何一项中所述的方法，其中在施用所述的第一种C35抗体或所述的第二种C35抗体中的至少一种的同时，施用所述的治疗性试剂。

14.根据权利要求1-10的任何一项中所述的方法，其中所述的第一种C35抗体或所述的第二种C35抗体同时施用。

15.根据权利要求1-10的任何一项中所述的方法，其中所述的第一种C35抗体或所述的第二种C35抗体依次施用。

16.根据权利要求1-15的任何一项中所述的方法，其中各种所述的C35抗体或片段以患者体重的约0.1mg/kg至约100mg/kg的剂量施用。

17.根据权利要求1-16的任何一项中所述的方法，其中所述的第一种C35抗体或片段、或者所述的第二种C35抗体或片段中的至少一种选自：1F2、1B3、MAbc0009、MAb 163、MAb 165、MAb 171以及它们的变体或衍生物。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述的第一种C35抗体或片段、或者所述的第二种C35抗体或片段中的一种为MAb 163或者其变体或衍生物。

19.根据权利要求17所述的方法，其中所述的第一种C35抗体或片段、或者所述的第二种C35抗体或片段中的一种为1B3或者其变体或衍生物。

20.根据权利要求17所述的方法，其中所述的第一种C35抗体或片段、或者所述的第二种C35抗体或片段中的一种为1F2或者其变体或衍生物。

21.根据权利要求17所述的方法，其中所述的第一种C35抗体和所述的第二种C35抗体选自：1F2、1B3、MAbc0009、MAb 163、MAb 165、MAb 171以及它们的变体或衍生物。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述的第一种C35抗体和所述的第二种C35抗体为1B3和1F2、或者它们的变体或衍生物。

23.根据权利要求1-22的任何一项中所述的方法，其中所述的癌细胞选自：乳腺癌、肝癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、结肠癌和黑素瘤。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述的癌细胞是乳腺癌细胞。

25.根据权利要求23所述的方法，其中所述的癌细胞是肝癌细胞。

26.根据权利要求1-25的任何一项中所述的方法，其中所述的方法包括施用多于两种的C35抗体或其片段。

27.一种特异性结合C35的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体或其片段竞争性地抑制参照单克隆抗体MAb 163与C35特异性的结合。

28.权利要求27所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体或其片段是MAb 163。

29.权利要求27或28的任何一项中所述的抗体或其片段，其中所述的抗体或其片段是经改造的形式，所述的形式选自：多特异性抗体、双特异性抗体、Fab片段、Fab’片段、F(ab)₂片段、Fv片段和单链抗体。

30.权利要求27-29的任何一项中所述的抗体或其片段，其进一步包含与之融合的异源多肽。

31.权利要求27-29的任何一项中所述的抗体或其片段，其中所述的抗体与试剂缀合，所述的试剂选自：治疗性试剂、药物前体、肽、蛋白质、酶、病毒、脂质、生物应答修饰剂、药物试剂或PEG。

32.一种组合物，其包含权利要求27-31的任何一项中所述的抗体或其片段、以及载体。

33.一种包含VH区域和VL区域的分离的抗体或其抗原结合片段，其中除了少于20个氨基酸的取代以外，所述的VH区域和所述的VL区域分别与由SEQ ID NO：62和SEQ ID NO：66构成的参照多肽相同，并且其中包含所述的VH和VL的抗体或其抗原结合片段特异性结合C35。

34.一种分离的多核苷酸，其包含编码免疫球蛋白重链可变区(VH)的核酸，其中除了少于10个氨基酸的取代以外，所述VH的CDR1、CDR2和CDR3区域分别与SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64和SEQ ID NO：65所示的参照重链CDR1、CDR2和CDR3序列相同，并且其中包含所述的VH的抗体或其抗原结合片段特异性结合C35。

35.一种分离的多核苷酸，其包含编码VH区域的核酸，其中除了少于20个氨基酸的取代以外，所述VH区域与由SEQ ID NO：62所示的参照VH多肽序列相同，并且其中包含所述的VH的抗体或其抗原结合片段特异性结合C35。

36.权利要求34或35的任何一项中所述的多核苷酸，其进一步包含编码与所述VH融合的信号肽的核酸。

37.权利要求34或35所述的多核苷酸，其进一步包含与所述VH融合的重链恒定区或其片段。

38.一种分离的多核苷酸，其包含编码免疫球蛋白轻链可变区(VL)的核酸，其中除了少于10个氨基酸的取代以外，所述VL的CDR1、CDR2和CDR3区域分别与由SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68和SEQ ID NO：69构成的参照轻链CDR1、CDR2和CDR3序列相同，并且其中包含所述的VL的抗体或其抗原结合片段特异性结合C35。

39.一种分离的多核苷酸，其包含编码VL区域的核酸，其中除了少于20个氨基酸的取代以外，所述VL区域与SEQ ID NO：66所示的参照VL多肽序列相同，并且其中包含所述的VL的抗体或其抗原结合片段特异性结合C35。

40.权利要求38或39所述的多核苷酸，其进一步包含编码与所述VL融合的信号肽的核酸。

41.权利要求38或39所述的多核苷酸，其进一步包含编码与所述VL融合的CL结构域的核酸。

42.一种分离的多核苷酸，其包含编码MAb 163单克隆抗体的至少一个互补决定区(CDR)或其变体的核酸序列，其中所述的多核苷酸编码特异性结合C35的多肽。

43.权利要求42所述的分离的多核苷酸，其中所述的多核苷酸包含编码MAb 163单克隆抗体的至少三个CDR的核酸序列。

44.权利要求42所述的分离的多核苷酸，其中所述的多核苷酸包含编码MAb 163单克隆抗体的至少六个CDR的核酸序列。

45.包含权利要求34-44的任何一项中所述的多核苷酸的载体。

46.一种宿主细胞，其包含权利要求34-44的任何一项中所述的多核苷酸，或者权利要求45所述的载体。

47.一种制备抗C35抗体或其抗原结合片段的方法，其包括：培养权利要求46所述的宿主细胞，以及回收所述的抗体或片段。

48.一种通过权利要求47所述的方法制备的抗C35抗体或其抗原结合片段。

49.一种包含免疫球蛋白重链可变区(VH)的分离的多肽，其中除了少于10个氨基酸的取代以外，所述的VH的CDR1、CDR2和CDR3区域分别与由SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64和SEQ ID NO：65构成的参照重链CDR1、CDR2和CDR3序列相同，并且其中包含所述的VH的抗体或其抗原结合片段特异性结合C35。

50.一种包含VH的分离的多肽，其中除了少于20个氨基酸的取代以外，所述的VH与由SEQ ID NO：62构成的参照VH序列相同，并且其中包含所述的VH的抗体或其抗原结合片段特异性结合C35。

51.一种包含免疫球蛋白轻链可变区(VL)的分离的多肽，其中除了少于10个氨基酸的取代以外，所述的VL的CDR1、CDR2和CDR3区域分别与由SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68和SEQ ID NO：69构成的参照轻链CDR1、CDR2和CDR3序列相同，并且其中包含所述的VL的抗体或其抗原结合片段特异性结合C35。

52.一种包含VL的分离的多肽，其中除了少于20个氨基酸的取代以外，所述的VL与由SEQ ID NO：66构成的参照VL序列相同，并且其中包含所述的VL的抗体或其抗原结合片段特异性结合C35。

53.权利要求49-52的任何一项中所述的多肽，其进一步包含与之融合的异源多肽。

54.一种包含权利要求49-52的任何一项中所述的多肽的分离的抗体或其抗原结合片段。

55.一种用于治疗癌症的方法，其包括：向患有癌症的动物施用有效量的试剂，其中所述的试剂选自：权利要求26-31的任何一项中所述的分离的MAb 163抗体或其片段；权利要求34-44的任何一项中所述的分离的多核苷酸；或者权利要求49-53的任何一项中所述的分离的多肽。

56.权利要求55所述的方法，其中所述的动物是哺乳动物。

57.权利要求56所述的方法，其中所述的哺乳动物是人。

58.一种组合物，其包含：(a)特异性结合C35的第一种C35抗体；(b)特异性结合C35的第二种C35抗体；以及(c)治疗性试剂。

59.权利要求58所述的组合物，其中所述的治疗性试剂是化疗试剂。

60.权利要求59所述的组合物，其中所述的化疗试剂是紫杉醇或阿霉素。

61.权利要求58所述的组合物，其中所述的第一种C35抗体或所述的第二种C35抗体中的至少一种选自：1F2、1B3、MAbc0009、MAb 163、MAb 165、MAb 171以及其变体或衍生物。

62.权利要求61所述的组合物，其中所述的第一种C35抗体是MAb 163。

63.一种检测C35的存在情况的方法，其包括：(a)使样品或细胞与权利要求26-31或64-69的任何一项中所述的抗体或其抗原结合片段接触；以及(b)检测所述的抗体或其抗原结合片段与C35的结合。

64.一种分离的抗体或其抗原结合片段，其包含MAb 163单克隆抗体的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR，其中所述的抗体或片段特异性结合C35。

65.权利要求64所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体或片段包含所述MAb 163单克隆抗体的至少一个CDR。

66.权利要求64所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述的至少一个CDR为MAb 163的重链CDR3。

67.权利要求64所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体或片段包含所述MAb 163单克隆抗体的至少三个CDR。

68.权利要求64所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述的至少三个CDR包含SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64和SEQ ID NO：65。

69.权利要求64所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述的至少三个CDR包含SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68和SEQ ID NO：69。

70.第一种C35抗体和第二种C35抗体在制备用于治疗癌症的药物中的用途，其中所述的用途进一步包括施用化疗试剂。

71.权利要求70所述的用途，其中所述的第一种C35抗体和所述的第二种C35抗体同时施用。

72.权利要求70所述的用途，其中所述的化疗试剂是紫杉醇或阿霉素。

73.权利要求70所述的用途，其中所述的第一种C35抗体或所述的第二种C35抗体中的至少一种选自：1F2、1B3、MAbc0009、MAb 163、MAb 165、MAb 171、以及其变体或衍生物。

74.权利要求73所述的用途，其中所述的1F2和1B3的变体或衍生物为人源化的抗体。