CN107843732B - 检测肺栓塞的血清标志物及其应用 - Google Patents
检测肺栓塞的血清标志物及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及检测肺栓塞的血清标志物及其应用,可用于区分肺栓塞患者和正常人,所述的血清标志物为蛋白因子,所述的蛋白因子为:TRAIL:肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体。
Description
技术领域
本发明属于医药生物技术领域,具体而言,涉及检测肺栓塞的血清标志物及其应用
背景技术
急性肺栓塞(APE)是临床上一种相对比较常见、潜在威胁生命的血管疾病,是常见的三大致死性心血管疾病之一。APE的诊断目前主要依靠影像学检查,包括肺动脉CT、肺通气血流灌注扫描及肺动脉造影等,但费用高,尤其肺动脉造影具有侵入性。因此,其临床应用受到限制。所以,近年来广泛应用于临床的生物标记物,如D-二聚体,脑利钠尿肽,肌钙蛋白等,展现出良好的应用前景。
目前,D-二聚体常用来辅助诊断APE。急性血栓形成时,凝血和纤溶同时激活,可引起血浆D-二聚体水平升高。D二聚体检测的阴性预测价值很高,水平正常多可排除急性肺栓塞,但其阳性预测价值很低。许多生物标记物如BNP(NT-proBNP)、肌钙蛋白、肌红蛋白以及H-FABP等都已经被证实可以用于APE的诊断和预后,其原因主要在于APE与心肌损伤本身是相关联的。因此,不少心肌生物标记物正逐渐应用到APE的诊断和预后分层中。但不难看出,这些生物学标记物敏感性虽高,但均缺乏特异性,因此,未来期望能找出一种可靠的生物标记物以及联合检测多种生物标记物及影像学检查,以期能够提高APE的早期诊断和准确评估预后,从而降低APE的误诊率、漏诊率,提高APE的治疗效果和预后。
急性肺栓塞的病理生理过程主要为肺栓塞导致肺动脉管腔阻塞,血流减少或中断,引起不同程度的血流动力学和气体交换障碍。轻者几乎无任何症状,重者因肺血管阻力突然增加,肺动脉压升高,压力超负荷导致右心室衰竭。大量研究表明,很多炎症因子参与了APE的病理过程。但还不清楚如何利用这些炎症因子快速准确诊断肺栓塞,及其在APE发生中的预测作用。
因此,从临床快速诊断的角度出发,对APE病理过程的炎症因子的变化进行分析和检测,是有可能及时的对APE的发生进行更为准确的预测的。
发明内容
本发明首先涉及一组单独或组合后用于区分肺栓塞患者和正常人的血清学诊断标志物,所述的血清标志物为蛋白因子,所述的蛋白因子为:TRAIL:肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体。
本发明还涉及所述的血清学诊断标志物在制备检测肺栓塞的检测试剂盒中的应用。
本发明还涉及由所述的血清学诊断标志物制备而成的用于诊断肺栓塞患者的诊断试剂盒。
所述的诊断肺栓塞患者的方法为:
(1)收集待测患者的血清样本;
(2)将所述血清样本稀释1.5倍;
(3)使用ELISA方法检测样本中的血清学诊断标志物的含量,和标准数据和/或健康人群的标准统计数据进行对比,判断是否患有肺栓塞;
所述的判断肺栓塞的方法为,检测所述血清学标志物在血清中的浓度,当:相比健康人群的含量降低时,判断目标人员患有肺栓塞。
优选的,所述的判断肺栓塞的方法为,检测所述的血清学标志物的在血清中的浓度,当,TRAIL<39.73pg/ml时,判断待测人员患有肺栓塞。
优选的,所述的诊断试剂盒为利用ELISA原理进行诊断的诊断试剂盒。
优选的,所述的试剂盒还包括,样品稀释液,针对所述的诊断标志物的抗体,显色剂。
本发明还涉及使用所述血清学诊断标志物诊断肺栓塞患者的方法,所述方法包括如下步骤:
(1)收集待测患者的血清样本;
(2)将所述血清样本稀释1.5倍;
(3)使用ELISA方法检测样本中的血清学诊断标志物的含量,和标准数据进行统计对比,得出患者患病信息。
本发明所述的诊断试剂盒为利用ELISA原理进行诊断的诊断试剂盒。
本发明所述的试剂盒还包括,样品稀释液,针对所述的诊断标志物的抗体,显色剂。
附图说明
图1、9个因子在主动脉瘤/主动脉夹层组、肺栓塞组、健康人组中表达水平的柱状图。
图2、9个因子在主动脉瘤/主动脉夹层组和健康人组中进行对比分析ROC联合曲线。
图3、9个因子在肺栓塞组和健康人组中进行对比分析ROC联合曲线。
图4、9个因子在主动脉瘤/主动脉夹层组和肺栓塞组中进行对比分析ROC联合曲线。
图5、区分肺栓塞组和健康人组的最佳因子(TRAIL)ROC曲线。
图6、区分肺栓塞组和健康人组的最佳因子(TRAIL)的血清学检测结果。
具体实施方式
实施例1、血清学标记物的差异验证
根据性别和年龄随机分组,挑选32例健康人做对照,主动脉瘤/主动脉夹层患者31例,使用QAH-CUST芯片,检测抽取的血清样本中的蛋白因子的表达水平。
实验步骤:
1、玻片芯片的完全干燥:将玻片芯片从盒子中取出来,在室温平衡20-30min后,将包装袋打开,揭开密封条,然后将芯片放在真空干燥器或者室温干燥1-2小时。
2、标准品的配置:
(1)添加500μL的样品稀释液到细胞因子标准混合物的小管中,重新溶解标准品。打开小管前,先快速的离心,轻轻的上下吹打溶解粉末,标记这个小管为Std 1。
(2)分别标记6个干净的离心管为Std2、Std3到Std7,添加200μl的样品稀释液到每个小管中。
(3)抽取100μL的Std 1加入到Std2中轻轻混合,然后从Std 2中抽取100μL加入到Std 3中,如此梯度稀释至Std7。
(4)抽取100μL的样品稀释液到另一个新的离心管中,标记为CNTRL,作为阴性对照。
3、芯片操作流程
(1)每个孔中加100μL的样品稀释液,室温摇床上孵育1h,封闭定量抗体芯片;
(2)抽去每个孔中的缓冲液,添加100μL的标准液和样品到孔中,在摇床上4℃过夜孵育;(注:样品按照合适稀释倍数上样)
(3)清洗:
使用Thermo Scientific Wellwash Versa芯片洗板机清洗玻片,分为两步,
首先,用1×洗液I进行清洗,每孔250μL的1×洗液I,清洗10次,每次震荡10s,震荡强度选择高,用去离子水稀释20×洗液I;
其次,换用1×洗液II通道进行清洗,每孔250μL的1×洗液II,清洗6次,每次震荡10s,震荡强度选择高,用去离子水稀释20×洗液II;
(4)检测抗体混合物的孵育:
离心检测抗体混合物小管,然后加入1.4ml的样品稀释液,混合均匀后再次快速离心,添加80μL的检测抗体到每个孔中,37℃摇床上孵育2小时;
(5)清洗,同步骤(3)
(6)Cy3-链霉亲和素的孵育:
离心Cy3-链霉亲和素小管,然后加入1.4ml的样品稀释液,混合均匀后再次快速离心,添加80μL的Cy3-链霉亲和素到每个孔中,用铝箔纸包住玻片避光孵育,37℃摇床上孵育1个小时。
(7)清洗,同步骤(3)
(8)荧光检测:
1)将玻片框架拆掉,小心不要用手接触到玻片印制抗体的一面;
2)采用激光扫描仪InnoScan 300扫描信号,采用Cy3或者绿色通道(激发频率=532nm):
仪器型号:InnoScan 300Microarray Scanner(厂家:Innopsys)
扫描参数:WaveLengh:532nm;Resolution:10μm
(9)采用QAH-CUST的数据分析软件来进行数据分析。
统计结果:QAH-CUST芯片筛选后,待测血清中的蛋白因子表达水平差异较大的蛋白因子见下表1。
表1、QAH-CUST芯片筛选血清样本的结果
LCN2:Lipocalin-2、脂质运载蛋白2
LOX-1:血凝素样氧化低密度脂蛋白受体1
TRAIL:肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体、TNF-related apoptosis inducingligand
FN1:fibronectin、纤维连接蛋白
PF4:platlet factor 4、CXCL4、血小板因子4
SAA:Serum Amyloid A、血清淀粉样蛋白A
OPG:osteoprotegerin、骨保护素、肿瘤坏死因子受体超家族,成员11b(TNFRSF11B)
PLG:Plasminogen、血纤维蛋白溶酶原
ANG:angiopoietin、血管形成因子。
实施例2、肺栓塞血清学标记物的大样本验证
根据性别和年龄随机分组,挑选101例健康人做对照,主动脉瘤/主动脉夹层患者234例,肺栓塞患者203例。进行血清蛋白标记物的ELISA实验,使用相应的RayBiotechHuman ELISA Kit,检测实施例1获得的9种蛋白因子的表达水平,验证该组蛋白因子能否有效区分主动脉瘤/主动脉夹层患者。
实验步骤如下:
1、试剂准备
(1)将试剂盒以及样品平衡至室温(18-25℃);
(2)样品根据预实验结果,按照下表2所示的倍数对待测人员的血清样品进行稀释。
表2、检测不同诊断标识物时的稀释倍数
检测目标 | 稀释倍数 |
TRAIL | 1.5 |
FN1 | 20000 |
LCN2 | 200 |
PLG | 50000 |
OPG | 5 |
ANG | 30 |
LOX-1 | 10 |
SAA | 50 |
PF4 | 4000 |
(3)Assay Diluent(Item E)使用去离子水稀释5倍备用;
(4)标准品准备:
离心Item C小管,然后加入400μL Assay Diluent(Item E)到标准品小管中,混合均匀后即为50ng/ml的标准品贮存液;
准备8个1.5ml小离心管,往第一个管加入475μL Assay Diluent缓冲液,然后抽取50ng/ml的标准品贮存液25μL加入到第一个管中,混合均匀后为2500pg/ml,标记为STD1;
往余下7个管分别加入300μL Assay Diluent缓冲液,之后依次标记为STD2、STD3、STD4、STD5、STD6、STD7;
然后用50ng/ml的STD1梯度稀释标准品,抽取200μL 50ng/ml标准溶液(即STD1)加入STD2小管中,混匀后抽取该管中200μL溶液加入到STD3小管中后混匀,依次方法直到配制好STD7,STD 8只是300μL Assay Diluent即标准品0pg/ml;
(5)洗液稀释:用去离子水将浓缩洗液稀释20倍备用;
(6)离心检测抗体小管(tem F),加入100μL稀释液1x Assay Diluent(Item E)充分溶解,用移液器上下轻轻吹打,然后用稀释液1x Assay Diluent稀释80倍后使用;
7)离心HRP-链霉亲和素(Item G),然后用稀释液1x Assay Diluent稀释200倍后使用;
2、操作步骤
(1)将试剂盒以及样品平衡至室温(18-25℃);标准品以及部分样品使用复孔检测,部分样品单孔检测;
(2)已经包被抗体的ELISA板平衡至室温后,在对应的孔加入100μL配制好的标准品及样品,用封板膜封住整块板条,4℃孵育过夜;
(3)将配制好的1x洗液添加到洗板机上,用洗板机清洗板条4次,每孔加入300μL洗液;
(4)洗板干净后,每孔加入100μL配制好的检测抗体(生物素标记抗体),室温孵育1h;
(5)清洗,步骤同(3);
(6)每孔加入100μL配制好的HRP-链霉亲和素室温孵育45min;
(7)清洗,步骤同(3);
(8)加入100μL TMB显色液至每孔中,室温避光孵育30min;
(9)加入50μL终止液至每孔中,立即在酶标仪450nm读数。
(10)采用sigmaplot 12.0软件计算浓度值。
实验结果如下:
(1)9个因子在主动脉瘤患者(A组)、肺栓塞患者(PE组)、健康人(H组)中表达水平浓度数值见图1所示;
结果可见:所述的9个因子能够很好的区分主动脉瘤患者、肺栓塞患者和健康人群。
(2)9个因子在区分主动脉瘤/主动脉夹层(A组)VS健康人(H组)、肺栓塞(PE组)VS健康人(H组)、主动脉瘤/主动脉夹层(A组)VS肺栓塞(PE组)时的ROC结果;
对上述9个因子用于区分主动脉瘤/主动脉夹层(A组)和健康人(H组)时的ROC统计结果见表3联合ROC曲线见图2,对上述9个因子用于区分肺栓塞(PE组)和健康人(H组)时的ROC统计结果见表4联合ROC曲线见图3,对上述9个因子用于区分主动脉瘤/主动脉夹层(A组)和肺栓塞(PE组)时的ROC统计结果见表5联合ROC曲线见图4。
表3、9个因子用于区分主动脉瘤/主动脉夹层(A组)和健康人(H组)时的ROC统计结果
表4、9个因子用于区分肺栓塞(PE组)和健康人(H组)时的ROC统计结果
表5、9个因子用于区分主动脉瘤/主动脉夹层(A组)和肺栓塞(PE组)时的ROC统计结果
实施例3、最佳诊断组合蛋白因子分析
通过各个因子的联合作用的ROC统计分析,确定区分主动脉瘤/主动脉夹层(A)和健康人(H)、肺栓塞(PE)和健康人(H)、主动脉瘤/主动脉夹层(A)和肺栓塞(PE)的最佳的诊断组合。
经过进一步分析,确定最佳的区分肺栓塞(PE)和健康人(H)的诊断因子为TRAIL,再次选取423例健康人的血清和298例肺栓塞患者的血清,按照实施例1-2的方法进行血清学标记物检测,结果如下表6或图6所示。
表6、健康人和主动脉瘤/夹层患者的血清标志物TRAIL的浓度
健康人(H) | 肺栓塞(PE) | |
入组例数 | 423例 | 298例 |
血清标准物浓度平均数(pg/ml) | 60.110 | 29.957 |
标准差(pg/ml) | 27.579 | 17.799 |
中位数(pg/ml) | 56.683 | 26.739 |
25%位数(pg/ml) | 42.292 | 18.231 |
75%位数(pg/ml) | 70.507 | 37.485 |
(1)对肺栓塞组和健康人组进行分析,9个因子的各种组合都进行了分析,找到最佳的因子是TRAIL,ROC联合曲线下面积0.858(见图5)。
因子 | 曲线下面积 | P value | 95%CI | Sensitivity | Specificity |
TRAIL | 0.858 | 0.000 | 0.830-0.886 | 79.53% | 80.61% |
最后需要说明的是,以上实施例仅帮助本领域技术人员理解本发明的实质,不用做对本发明保护范围的限定。
Claims (3)
1.血清学诊断标志物在制备区分肺栓塞患者和正常人的检测试剂盒中的应用,所述的血清学诊断标志物为蛋白因子,所述的蛋白因子是:
TRAIL:肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,
所述的区分肺栓塞患者和正常人的方法为:
(1)收集待测患者的血清样本;
(2)将所述血清样本稀释1.5倍;
(3)使用ELISA方法检测样本中的血清学诊断标志物的含量,和健康人群的标准统计数据进行对比,判断是否患有肺栓塞;
所述的判断是否患有肺栓塞的方法为,检测所述的血清学诊断标志物在血清中的浓度,当:相比健康人群的标准统计数据浓度降低时,判断待测患者患有肺栓塞。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述的判断是否患有肺栓塞的方法为,检测所述的血清学诊断标志物在血清中的浓度,当:TRAIL浓度<39.73pg/ml时,判断待测患者患有肺栓塞。
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