JP2013511288A - 抗クラステリン抗体及び抗原結合フラグメント並びに腫瘍容積を低減するためのそれらの使用 - Google Patents

Abstract

クラステリンと特異的に結合する新規抗体及び抗原結合フラグメントを記載する。いくつかの実施形態において、本抗体は、クラステリンの生物学的活性をブロックし、ある種のがん、さらに詳細には、子宮内膜がん、乳がん、肝細胞がん、前立腺がん、腎細胞がん、卵巣がん、膵臓がん腫、及び結腸直腸がんなどのがんにおいて、組成物で有用である。本発明は更に、ヒト化又はハイブリッド抗体を発現する細胞にも関する。さらに、本抗体及びフラグメントを用いてがんを検出し、治療する方法も開示する。

Description

本発明は、抗クラステリン抗体及び腫瘍容積を低減するためのそれらの使用に関する。本発明は、さらに詳細には、クラステリンと結合するヒト化抗体、ハイブリッド抗体及び抗原結合フラグメント、並びに腫瘍容積を低減するため、腫瘍成長及び転移を阻害するためのそれらの使用に関する。

最も一般的なヒト悪性腫瘍であるがん腫は、上皮細胞から生じる。上皮がんの進行は、細胞と細胞との接触の中断並びに遊走性（間葉様）表現型の獲得から始まる。上皮間葉移行（ＥＭＴ）と呼ばれるこの現象は、後期腫瘍進行及び転移における重要な事象であると考えられる。

分泌されたタンパク質ＴＧＦ−βは、最初は主に、上皮起源の腫瘍細胞に対するその成長阻害作用により腫瘍成長を抑制し、その後、後期では、腫瘍細胞進行及び転移を促進する。ＴＧＦ−βが腫瘍進行を促進できる１つの機構は、ＥＭＴの誘導による。

ＴＧＦ−βが発がんにおいて果たす二重の役割のために、ＴＧＦ−βの直接的阻害剤は、後期腫瘍に有益であり得る一方、前新生物病巣も促進し得るので、危険である可能性がある。さらに良好な治療薬は、ＴＧＦ−βの腫瘍抑制剤成長阻害作用は影響を受けないまま残しつつ、ＴＧＦ−βの発がん促進性ＥＭＴ促進作用を阻害するものであり得る。そのような阻害剤を開発するためには、経路の１つの分岐におけるメディエータがＥＭＴ応答に関与するが、ＴＧＦ−βに対する成長阻害応答には関与しないような、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路の分岐点がある地点を特定することが必要であろう。ＴＧＦ−βシグナル伝達経路のＥＭＴ促進分岐にのみにあるメディエータを阻害する治療法は、前がん病変部の加速に対してはほとんど又は全く影響を及ぼさず、転移を減少させるであろう。

ＴＧＦ−βＥＭＴ促進作用を促進又は媒介するが、ＴＧＦ−βの成長阻害作用には関与しないＴＧＦ−βシグナル経路特異的成分は、一般的には特定されていない。

対照的に、腫瘍抑制作用（成長阻害）は損なわれないまま、ＴＧＦ−βの腫瘍形成促進性ＥＭＴ作用に干渉（促進に対立するものとして）することができる内因性タンパク質（ＹＹ１核因子）は特定されている（Kurisaki et al., 2004）。

ＴＧＦ−βリガンド、受容体及びＳｍａｄシグナル伝達タンパク質を標的とする阻害剤は公知である。具体的には、可溶性受容体外部ドメイン、抗体及び他の結合タンパク質は、ＴＧＦ−βリガンドと相互作用し、それらを細胞表面受容体から隔離することによって、アンタゴニストとして作用することができる。Ｉ型ＴＧＦ−β受容体のキナーゼ活性を阻害する小分子が利用可能であり、Ｓｍａｄシグナル伝達タンパク質の内因性阻害剤も知られている。これらのシグナル伝達経路成分はすべて、ＴＧＦ−βの発がん促進作用及び抗発がん作用の両方に関与するので、それらを標的とするこれらの阻害剤は、後期腫瘍に有効であり得るが、前がん病変部を促進する可能性もある。
２００６年９月１３日に出願され、２００７年３月２２日に国際公開第２００７／０３０９３０号で公開された国際特許出願第ＰＣＴ／ＣＡ２００６／００１５０５号は、クラステリンの特異的エピトープに対するものであり、がん細胞の上皮間葉移行を阻害することができる抗クラステリン抗体及び抗原結合フラグメントを記載している。この特許出願は、さらに詳細には、前立腺がん及び乳がんでのＥＭＴの阻害における抗クラステリン抗体の能力を示す。

国際公開第２００７／０３０９３０号

本発明は、その一態様では、クラステリンに対して特異的に結合することができ、ヒト化軽鎖可変領域及び／又はヒト化重鎖可変領域を含む抗体に関する。

さらに詳細には、本発明は、クラステリンと特異的に結合できる非ヒト親抗体のヒト化抗体並びにそのハイブリッド抗体及び抗原結合フラグメントを提供する。

本発明のヒト化又はハイブリッド抗体は、非ヒト相補性決定領域アミノ酸残基及び天然ヒト抗体のヒトフレームワーク領域アミノ酸残基を含み得る軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含む。

本発明はまた、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含む抗原結合フラグメントに関し、これは非ヒト相補性決定領域アミノ酸残基及びヒトフレームワーク領域アミノ酸残基を含み得る。

本発明の抗体及び抗原結合フラグメントを用いて、クラステリンにより誘導される上皮間葉移行を阻害することができる。

別の態様では、本発明は、腫瘍容積を低減する際に使用される抗クラステリン抗体（ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、単離されたヒト抗体、ハイブリッド抗体又はそのフラグメント）及びそれを行うための方法に関する。

ヒト化抗体の軽鎖可変領域及び／又は重鎖可変領域をコード化する単離された核酸、本明細書中に記載するハイブリッド抗体若しくは抗原結合フラグメント又は本明細書中に記載される単離された抗体も、本発明に含まれる。

本明細書中に記載される核酸を含むベクター又は構築物も含まれる。本発明によれば、ベクターは、例えば制限されることなく、ほ乳類発現ベクター、細菌発現ベクターなどであり得る。

本発明は更に、本発明の抗体若しくは抗原結合フラグメントを含むか又は発現するか、或いは本発明の核酸又はベクターを含む細胞にも関する。

さらなる態様では、本発明は、例えば、本明細書中に記載するヒト化抗体、本明細書中に記載するハイブリッド抗体、本明細書中に記載する抗原結合フラグメント、本明細書中に記載する単離された抗体、本明細書中に記載する単離された核酸又は本明細書中に記載するベクターを含み得るバイアル（複数可）を含むキットを提供する。

別の態様では、本発明は、例えば、本明細書中に記載するヒト化抗体、本明細書中に記載するハイブリッド抗体、本明細書中に記載する抗原結合フラグメント又は本明細書中に記載する単離された抗体及び薬剤的に許容される担体を含み得る医薬組成物に関する。

本発明のさらに別の態様は、本明細書中に記載する医薬組成物及び化学療法剤を含む併用療法に関する。

ヒト化若しくはハイブリッド抗クラステリン抗体又は抗原結合フラグメントを産生する方法並びにヒト化若しくはハイブリッド抗クラステリン抗体又は抗原結合フラグメントを用いてクラステリン発現又は分泌に関連する疾患を治療する方法も含まれる。

本発明のさらなる範囲、適用性及び利点は、以下に記載する非限定的な詳細な説明から明らかになるであろう。しかし、この詳細な説明は、本発明の例示的実施形態を示すが、添付の図面を参照して、例としてのみ記載されると理解されるべきである。

マウス１６Ｂ５抗クラステリン抗体の可変領域の相同性３Ｄモデル。ＣＤＲに名称が付されている（軽鎖ではＬ１、Ｌ２、Ｌ３、そして重鎖ではＨ１、Ｈ２、Ｈ３）。ヒトフレームワーク残基で置換されたマウスフレームワーク残基を球体モデルとして表示する。 マウス１６Ｂ５、ヒト化１６Ｂ５及び選択されたヒトフレームワークの配列アラインメント（ＮＣＢＩデータベースリンクを記載）。Ｋａｂａｔ付番を最上部に示す。ＣＤＲを強調する。復帰突然変異の候補残基を、ＣＤＲに対する近接性（５：５オングストローム以内）、表面露出（Ｂ：埋没）、及び対形成する可変ドメインとの接触にしたがって配列アラインメントの下で反転表示する。 １６Ｂ５ネズミ及びヒト化抗クラステリン抗体の動態分析。 ｈ１６Ｂ５はがん細胞系の遊走をブロックする。ｈ１６Ｂ５は、マウス乳がん細胞に対するスクラッチアッセイでマウス１６Ｂ６と少なくとも同程度に活性である。この図面は、種々の構造の抗体がインビトロで細胞の遊走をブロックする能力を示す。 ｈ１６Ｂ５の阻害はヒト前立腺がん細胞の浸潤性を低下させる。１２ウェルプレートの底部を２００μＬのＧｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｄｕｃｅｄ ｍａｔｒｉｇｅｌ（ベクトン・ジキンソン）で覆った。細胞（２．５×１０^４）を、２００μＬのマトリゲル中に再懸濁させ、それをこの上に重ね、最終的に５００μＬの細胞特異的成長培地をマトリゲルの上部に添加した。ｈ１６Ｂ５をマトリゲルの各層並びに培地に８μｇ／ｍＬの濃度で添加した。プレートを３７℃で３週間までインキュベートし、この間に成長培地（＋／−ｈ１６Ｂ５）を毎週補充した。矢印は上皮様細胞の部分を示す。 ｈ１６Ｂ５での前立腺がん腫瘍の治療は、腫瘍の成長を低減し、化学療法に対する応答を増大させる。ＤＵ１４５前立腺がん細胞（２×１０^６）をＳＣＩＤマウスに皮下移植し、腫瘍サイズが約１００ｍｍ^３になるまで、成長させた。デジタルノギスを用いて腫瘍を隔週で測定し、腫瘍容積をＬ×Ｗ×Ｈとして算出した。各群には、治療を開始する前に無作為化した８匹の動物が含まれた。結果をｍｍ^３±標準誤差として表した。スチューデントＴ試験を用いてＰ値を算出した。 マウス２１Ｂ１２抗クラステリン抗体の可変領域の相同性３Ｄモデル。ＣＤＲに名称が付されている（軽鎖ではＬ１、Ｌ２、Ｌ３、そして重鎖ではＨ１、Ｈ２、Ｈ３）。ヒトフレームワーク残基で置換されたマウスフレームワーク残基を球体モデルとして表示する。 マウス１６Ｂ５、ヒト化２１Ｂ１２及び選択されたヒトフレームワークの配列アラインメント（ＮＣＢＩデータベースリンクを提供）。Ｋａｂａｔ付番を上部に示す。ＣＤＲを強調する。復帰突然変異の候補残基を、ＣＤＲに対する近接性（５：５オングストローム以内）、表面露出（Ｂ：埋没）、及び対形成する可変ドメインとの接触にしたがって配列アラインメントの下で反転表示する。 ２１Ｂ１２ネズミ及びヒト化抗クラステリン抗体の動態分析。 ｈ１６Ｂ５はＰＣ−３前立腺腫瘍の成長を阻害する。ＰＣ−３前立腺がん細胞（２×１０^６）をＳＣＩＤマウスに皮下移植し、腫瘍サイズが約１００ｍｍ^３になるまで、成長させた。デジタルノギスを用いて腫瘍を隔週で測定し、腫瘍容積をＬ×Ｗ×Ｈとして算出した。各群には、治療を開始する前に無作為化された８匹の動物が含まれた。結果をｍｍ^３±標準誤差として表した。 クラステリンはヒト膵臓腫瘍において発現される。膵臓がん細胞系由来の腫瘍（図に示すとおり）をＳＣＩＤマウスにおいて成長させ、収集し、ホルマリン中で固定し、切片にし、そしてｈ１６Ｂ５を用いた免疫組織化学を使用して試験した。ＨＲＰ結合二次抗体を使用する標準的方法により陽性染色を可視化した。アイソタイプ対照抗体を用いて同じ条件下で負の対照を実施した。 Ｈ１６Ｂ５は膵臓がん細胞系の遊走を阻害する。ＰＡＮＣ−１細胞を、マトリゲルバリヤを含む２４ウェルＴｒａｎｓｗｅｌｌプレートの上側チャンバー中の無血清培地中に播種した。下側ウェルを、化学誘引物質として１０％のＦＢＳを含む培地で満たした。ＴＧＦβ及び／又はｈ１６Ｂ５（図に示すとおり）の存在下又は非存在下で２４時間インキュベーションした後、マトリゲル層中の細胞の数を染色し、計数した。 分泌されたクラステリンは、がん細胞において内在化される。組換えヒトクラステリンを２９３−６Ｅ細胞において発現させ、精製し、そして市販のラベリングキット（インビトロゲン）を用いてＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８で標識した。ＢＲＩ−ＪＭ０１マウス乳がん細胞をカバーガラス上に播種し、２５０ｎｇ／ｍｌの標識された分泌クラステリンで処理した。表示された時間で、細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄し、２％のパラホルムアルデヒド中で固定した。スライドにＡｎｔｉｆａｄｅ Ｇｏｌｄをマウントし、蛍光顕微鏡で画像を作成した。 Ｈ１６Ｂ５は、がん細胞における分泌されたクラステリンの内在化を阻害する。図１３について記載するようにして実験を実施した。Ｈ１６Ｂ５を１０μｇ／ｍｌで添加した。 ヒトクラステリン（ＮＰ＿００１８２２）とネズミクラステリン（ＮＰ＿０３８５２０）との間の相同性の領域を示す。 ４Ｔ１マウス乳房腫瘍から生成させた固定凍結切片において発現させたｈ１６Ｂ５（この図中ではＡＢ−１６Ｂ５として表示）のネズミクラステリンに対する結合を示す。免疫組織化学を用いて実験を実施し、ＨＲＰ結合二次抗体を用いて検出を行った。

本発明は、その一態様では、クラステリンに特異的に結合することができ、ヒト化軽鎖可変領域及び／又はヒト化重鎖可変領域を含む抗体に関する。

ヒトクラステリンの配列は、ＲｅｆＳｅｑ受入番号；ＮＭ＿００１８３１．２（タンパク質ｉｄ．＝ＮＰ＿００１８２２）で見いだすことができ、一方、ネズミクラステリンの配列は、ＲｅｆＳｅｑ受入番号；ＮＭ＿０１３４９２．２（タンパク質ｉｄ．＝ＮＰ＿０３８５２０）で見いだすことができる。

本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、クラステリンのネズミ及び／又はヒト形に結合することができる。本発明の抗体又は抗原結合フラグメントはまた、ヒト又はネズミクラステリンと、例えば少なくとも７５％（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％）のアミノ酸同一性を有するクラステリンの天然に存在する変異体並びに合成変異体と結合することもできる。

本発明はしたがって、クラステリンと特異的に結合できる非ヒト親抗体のヒト化抗体又はその抗原結合フラグメント並びにハイブリッド抗体及びその抗原結合フラグメントを提供する。

本発明の実施形態によれば、ヒト化又はハイブリッド抗体は、クラステリンを発現又は分泌する腫瘍細胞の成長を阻害（低減）することができる。

本発明のさらなる実施形態によれば、ヒト化又はハイブリッド抗体は、クラステリンを発現又は分泌する細胞を含む腫瘍の容積を低減することができる。

本発明の別の実施形態によれば、ヒト化又はハイブリッド抗体は、クラステリンを発現若しくは分泌する腫瘍細胞の遊走又は浸潤を阻害（低減）することができる。

したがって、本発明のさらに別の実施形態によれば、ヒト化又はハイブリッド抗体は、クラステリンを発現又は分泌する腫瘍細胞から起こる転移を阻害（低減）することができる。

別の態様では、本発明は、クラステリン発現細胞を含む腫瘍の容積を低減するための方法であって、必要とするほ乳類に、抗クラステリン抗体（ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、単離されたヒト抗体、ハイブリッド抗体又はそのフラグメント）を投与することを含み得る方法に関する。当該方法は、さらに詳細には、キメラ、ヒト化又はハイブリッド抗体を投与することを想定する。

一実施形態では、ハイブリッド抗体又はそのフラグメントは、例えば、非ヒト抗体の軽鎖可変領域及びヒト化抗体の重鎖可変領域を含み得る。

別の実施形態では、ハイブリッド抗体又はそのフラグメントは、例えば、非ヒト抗体の軽鎖可変領域及びヒト化抗体の重鎖可変領域を含み得る。

「抗体」という用語は、無傷抗体、モノクローナル、（完全若しくは部分）ヒト化、ハイブリッド、キメラ又はポリクローナル抗体並びに単離されたヒト抗体を指す。「抗体」という用語はまた、二重特異的抗体などの多特異的抗体も含み得る。ヒト抗体は、通常、それぞれが可変領域及び定常領域を含む２つの軽鎖及び２つの重鎖から構成される。軽鎖可変領域は、フレームワーク領域に並んで配置されているＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３として本明細書中では特定される３つのＣＤＲを含む。重鎖可変領域は、フレームワーク領域に並んで配置されているＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３として本明細書中では特定される３つのＣＤＲを含む。

「ヒト化抗体」という用語は、非ヒトＣＤＲアミノ酸残基並びにヒト抗体レパートリー由来であるその重鎖及び／又は軽鎖フレームワーク領域のかなりの部分を含む１〜６個のＣＤＲを含む抗体を指す。いくつかの例では、ヒト化抗体の重鎖及び／又は軽鎖フレームワーク領域の全体が、ヒト抗体レパートリー（天然ヒト抗体）によりコード化される（コード化可能な）抗体と同一であり得る。他の例では、ヒト化抗体の重鎖及び／又は軽鎖フレームワーク領域は、ヒト化されようとする非ヒト抗体由来の１〜３０個のアミノ酸を含み得、残りの部分は天然ヒト抗体由来である。さらなる例では、ヒト化抗体は、１〜６個の完全非ヒトＣＤＲを含み得、多くの場合、６個のＣＤＲは完全に非ヒトである。さらに別の例では、「ヒト化抗体」は、ヒト又は他の起源（ほ乳類由来）の定常領域を含み得る。

「ハイブリッド抗体」という用語は、ヒト化されているか又は天然ヒト抗体（クラステリンについて親和性を有する）由来のその重鎖若しくは軽鎖可変領域（その重鎖若しくは軽鎖）のうちの１つを含む抗体を指し、重鎖若しくは軽鎖可変領域（重鎖若しくは軽鎖）の残りは非ヒトのままである。

「キメラ抗体」という用語は、非ヒト可変領域（複数可）及びヒト定常領域を有する抗体を指す。

「天然ヒト抗体」という用語は、ヒト抗体レパートリー、すなわち生殖細胞系配列によってコード化される（コード化可能な）抗体を指す。

本明細書中で用いられる場合、単離されたヒト抗体は、この抗体が、例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニックマウスを免疫化することによるか、又はヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリをスクリーニングすることにより、ヒト免疫グロブリン配列を有する系から得られる場合、特定の生殖細胞系配列から「誘導」される。ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列から「誘導」される単離されたヒト抗体は、ヒト抗体のアミノ酸配列をヒト生殖細胞系免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較することにより、そのようなものとして同定することができる。選択されたヒト抗体は、典型的には、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子によりコード化されるアミノ酸配列に対してアミノ酸配列において少なくとも９０％同一であり、他の種の生殖細胞系免疫グロブリンアミノ酸配列（例えば、ネズミ生殖細胞系配列）と比較した場合に、そのヒト抗体をヒトであるとして特定するアミノ酸残基を含む。ある場合では、ヒト抗体は、生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子によってコード化されるアミノ酸配列に対してアミノ酸において少なくとも９５％、又はさらには少なくとも９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であり得る。典型的には、特定のヒト生殖細胞系配列から誘導されるヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子によってコード化されるアミノ酸配列と１０より多くのアミノ酸相違を示すことはない。ある場合では、ヒト抗体は、生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子によってコード化されるアミノ酸配列と５、又はさらには４、３、２、若しくは１より多くのアミノ酸相違を示すことはない。

「抗原結合フラグメント」という用語は、本明細書中で用いられる場合、抗原と結合する能力を保持する抗体の１以上のフラグメントを指す。抗体の抗原結合機能は、無傷抗体のフラグメントによって発揮され得ることが示されている。抗体の「抗原結合フラグメント」という用語に含まれる結合フラグメントの例としては、（ｉ）Ｖ_Ｌ、Ｖ_Ｈ、Ｃ_Ｌ及びＣ_Ｈ１ドメインから構成される一価フラグメントであるＦａｂフラグメント；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって結合した２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントであるＦ（ａｂ’）_２フラグメント；（ｉｉｉ）Ｖ_Ｈ及びＣ_Ｈ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶ_Ｌ及びＶ_ＨドメインからなるＦｖフラグメント、並びに（ｖ）Ｖ_Ｈドメインから構成されるｄＡｂフラグメント（Ward et al.,(1989) Nature 341:544-546）が挙げられる。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメインであるＶ_Ｌ及びＶ_Ｈは、別々の遺伝子によってコードされるが、組換え法を用い、Ｖ_Ｌ及びＶ_Ｈ領域が対合して一価分子（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えば、Bird et al.(1988) Science 242:423-426;及びHuston et al.(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883を参照）を形成する、ポリペプチド一本鎖として作製されることを可能にする合成リンカーによって、これらを結合させることができる。そのような一本鎖抗体もまた、抗体の「抗原結合フラグメント」という用語に含まれることが意図される。さらに、抗原結合フラグメントは、（ｉ）免疫グロブリンヒンジ領域ポリペプチドと融合した結合ドメインポリペプチド（例えば、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、又はリンカーペプチドにより軽鎖可変領域に融合した重鎖可変領域）、（ｉｉ）ヒンジ領域と融合した免疫グロブリン重鎖ＣＨ２定常領域、及び（ｉｉｉ）ＣＨ２定常領域と融合した免疫グロブリン重鎖ＣＨ３定常領域を含む結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質を含む。ヒンジ領域は、二量化を防止するように、１以上のシステイン残基をセリン残基と置換することにより修飾することができる。そのような結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質は、米国特許第２００３／０１１８５９２号及び米国特許第２００３／０１３３９３９号でさらに開示されている。これらの抗体フラグメントは、当業者に公知の通常の技術を用いて得られ、当該フラグメントは、無傷抗体と同じ方法で有用性についてスクリーニングされる。

典型的な抗原結合部位は、軽鎖免疫グロブリン及び重鎖免疫グロブリンの対合によって形成される可変領域から構成される。抗体可変領域の構造は、非常に一貫し、非常に類似した構造を示す。これらの可変領域は、典型的には、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる３個の超可変領域を間に挟んだ比較的相同性のフレームワーク領域（ＦＲ）から構成される。抗原結合フラグメントの全体的な結合活性は、多くの場合、ＣＤＲの配列によって決定される。しかしながら、ＦＲは、多くの場合、最適の抗原結合のためのＣＤＲの適切な位置決め及び三次元のアラインメントに関与する。

本発明のヒト化又はハイブリッド抗体は、非ヒト相補性決定領域アミノ酸残基及び天然ヒト抗体のヒトフレームワーク領域アミノ酸残基を含み得る重鎖可変領域並びに相補性軽鎖を含み得る。

本発明のヒト化又はハイブリッド抗体は、非ヒト相補性決定領域アミノ酸残基及び天然ヒト抗体のヒトフレームワーク領域アミノ酸残基並びに相補性重鎖を含み得る軽鎖可変領域を含み得る。

本発明のヒト化又はハイブリッド抗体は、転移、腫瘍細胞遊走若しくは浸潤を阻害し得るか、又は、例えばがん細胞をはじめとするクラステリン発現細胞の成長を阻害し得る。実際に、本出願者は、本発明のヒト化又はハイブリッド抗体をはじめとする抗クラステリン抗体がインビボで腫瘍容積を減少させるという予想外の発見にたどり着いた。或いは、本発明のヒト化又はハイブリッド抗体を用いてクラステリン発現細胞を検出することができる。

非ヒト親抗体のヒト化のために選択される天然ヒト抗体は、非ヒト親抗体の（モデル化された）可変領域に類似した（重ねあわせることができる）三次元構造を有する可変領域を含み得る。したがって、ヒト化又はハイブリッド抗体は、非ヒト親抗体と類似した三次元構造を有する可能性がより高い。

本発明のヒト化抗体は、クラステリンに対して高い親和性を有する。実際に、ヒト化抗体は、組換えモノマークラステリンと４．４９×１０^−９Ｍ±８．５×１０^−１０又はそれより良好な親和性で結合することが本明細書で示されている。

本発明によれば、ヒト化又はハイブリッド抗体軽鎖のヒトフレームワーク領域アミノ酸残基は天然ヒト抗体軽鎖フレームワーク領域由来である。ヒト化目的で選択される天然ヒト抗体の軽鎖フレームワーク領域は、例えば、非ヒト親抗体の軽鎖フレームワーク領域と少なくとも７０％の同一性を有する。好ましくは、ヒト化目的のために選択される天然ヒト抗体は、非ヒト親抗体の軽鎖相補性決定領域とその軽鎖相補性決定領域において同じか又は実質的に同じ数のアミノ酸を有し得る。

本発明の他の実施形態では、ヒト化又はハイブリッド抗体軽鎖のヒトフレームワーク領域アミノ酸残基は、非ヒト親抗体の軽鎖フレームワーク領域と少なくとも７５、８０、８３％（又はそれ以上）の同一性を有する天然ヒト抗体軽鎖フレームワーク領域由来である。

また本発明によれば、ヒト化又はハイブリッド抗体重鎖のヒトフレームワーク領域アミノ酸残基は、非ヒト親抗体の重鎖フレームワーク領域と少なくとも７０％の同一性を有する天然ヒト抗体重鎖フレームワーク領域由来である。好ましくは、ヒト化目的のために選択される天然ヒト抗体は、非ヒト親抗体の重鎖相補性決定領域とその重鎖相補性決定領域において同じか又は実質的に同じ数のアミノ酸を有し得る。

本発明の他の実施形態では、ヒト化又はハイブリッド抗体重鎖のヒトフレームワーク領域アミノ酸残基は、非ヒト親抗体の重鎖フレームワーク領域と少なくとも７３、７５、８０％の同一性を有する天然ヒト抗体重鎖フレームワーク領域由来である。

本発明の実施形態では、ヒト化又はハイブリッド抗体の重鎖可変領域は、したがって少なくとも１つの非ヒト相補性決定領域を含み得る。

或いは、本発明の他の実施形態では、ヒト化又はハイブリッド抗体の重鎖可変領域は、少なくとも２つの非ヒト相補性決定領域又はさらには３つの非ヒト相補性決定領域を含み得る。

本発明のさらなる実施形態では、軽鎖可変領域は少なくとも１つの非ヒト相補性決定領域を含み得る。

或いは、本発明のさらなる実施形態では、軽鎖可変領域は、少なくとも２つの非ヒト相補性決定領域又はさらには３つの非ヒト相補性決定領域を含む。

ヒト化抗体はしたがって、非ヒト抗体の６つのＣＤＲ全てを含み得る。二価ヒト化抗体の場合、１２のＣＤＲは全て非ヒト抗体由来であり得る。

ヒト化又はハイブリッド抗体により検出され得るクラステリン発現細胞は、がん細胞を含む。ヒト化又はハイブリッド抗体を用いて、クラステリン発現がん細胞、特にヒトがん細胞の成長を阻害することもできる。

数種のヒトがん細胞、なかでも子宮内膜がん、乳がん、肝細胞がん、前立腺がん、腎細胞がん、卵巣がん、結腸直腸がん、膵臓がん腫などの細胞は、クラステリンを発現又は分泌することが示されている。

本発明の実施形態の一例には、例えば、本明細書中で記載される天然ヒト抗体重鎖のヒトフレームワーク領域アミノ酸残基と、配列番号１のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２及び配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ並びにそれらの組み合わせ又は配列番号１１のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２及び配列番号１３のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ並びにそれらの組み合わせとを含むヒト化若しくはハイブリッド抗体が含まれる。

別の例示的実施形態では、ヒト化又はハイブリッド抗体は、本明細書中で記載される天然ヒト抗体重鎖のヒトフレームワーク領域アミノ酸残基と、配列番号１のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２及び配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３からなる群から選択される少なくとも２つの重鎖ＣＤＲ又は配列番号１１のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２及び配列番号１３のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３からなる群から選択される少なくとも２つの重鎖ＣＤＲ並びにそれらの組み合わせとを含み得る。

或いは、別の例示的実施形態では、本発明のヒト化又はハイブリッド抗体は、本明細書中で記載される天然ヒト抗体重鎖のヒトフレームワーク領域アミノ酸残基と、配列番号１のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２及び配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３又は配列番号１１のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２及び配列番号１３のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３とを含み得る。

本発明のさらに具体的な実施形態では、ヒト化又はハイブリッド抗体（又はそれから誘導される任意の抗原結合フラグメント）は、配列番号２６（ｈ１６Ｂ５ＶＬコンセンサス１）を含む軽鎖可変領域を含み得る：
ここで、Ｘにより特定される少なくとも１つのアミノ酸は、配列番号２５で記載されるポリペプチド中の対応するアミノ酸（ネズミ１６Ｂ５ＶＬ）と比較すると１つのアミノ酸置換である。このアミノ酸置換は、例えば、保存的であり得るか、又は非保存的であり得る。本発明によれば、アミノ酸置換は保存的であり得る。

ヒト化若しくはハイブリッド抗体（又はそれから誘導される任意の抗原結合フラグメント）は、配列番号２７を含む軽鎖可変領域（１６Ｂ５ＶＬコンセンサス２）を含み得る：
ここで、Ｘ_ａ１は、Ｔ又はＳなどの中性親水性アミノ酸であり得；
ここで、Ｘ_ａ２は、例えばＤ又はＳであり得；
ここで、Ｘ_ａ３は、Ｌ又はＡなどの疎水性アミノ酸であり得；
ここで、Ｘ_ａ４は、Ｒ又はＫなどの塩基性アミノ酸であり得；
ここで、Ｘ_ａ５は、Ａ又はＶなどの疎水性アミノ酸であり得；
ここで、Ｘ_ａ６は、Ｉ又はＭなどの疎水性アミノ酸であり得；
ここで、Ｘ_ａ７は、例えばＮ又はＳであり得；
ここで、Ｘ_ａ８は、例えばＰ又はＳであり得；
ここで、Ｘ_ａ９は、Ｓ又はＴなどの中性親水性アミノ酸であり得；
ここで、Ｘ_ａ１０は、Ｌ又はＶなどの疎水性アミノ酸であり得；
ここで、Ｘ_ａ１１は、Ｖ又はＬなどの疎水性アミノ酸であり得；
ここで、Ｘ_ａ１２は、例えばＱ又はＧであり得；
ここで、Ｘ_ａ１３は、例えばＩ又はＦであり得、そして；
ここで、軽鎖可変領域は、配列番号２５と比べて、前記アミノ酸置換のうちの少なくとも１つを含み得る。

ヒト化若しくはハイブリッド抗体（又はそれから誘導される任意の抗原結合フラグメント）は、配列番号２８を含む軽鎖可変領域（１６Ｂ５ＶＬコンセンサス３）を含み得る：
ここで、Ｘ_ａ１は、例えばＴ又はＳであり得；
ここで、Ｘ_ａ２は、Ｄ又はＳであり得；
ここで、Ｘ_ａ３は、例えばＬ又はＡであり得；
ここで、Ｘ_ａ４は、例えばＲ又はＫであり得；
ここで、Ｘ_ａ５は、例えばＡ又はＶであり得；
ここで、Ｘ_ａ６は、例えばＩ又はＭであり得；
ここで、Ｘ_ａ７は、例えばＮ又はＳであり得；
ここで、Ｘ_ａ８は、例えばＰ又はＳであり得；
ここで、Ｘ_ａ９は、例えばＳ又はＴであり得；
ここで、Ｘ_ａ１０は、例えばＬ又はＶであり得；
ここで、Ｘ_ａ１１は、例えばＶ又はＬであり得；
ここで、Ｘ_ａ１２は、例えばＱ又はＧであり得；
ここで、Ｘ_ａ１３は、例えばＩ又はＦであり得、そして；
ここで、軽鎖可変領域は、配列番号２５と比較して前記アミノ酸置換のうちの少なくとも１つを含み得る。

本発明の更に具体的な実施形態において、ヒト化又はハイブリッド抗体（又はそれから誘導される任意の抗原結合フラグメント）は、配列番号３０を含む重鎖可変領域（１６Ｂ５ＶＨコンセンサス１）を含み得る；
ここで、Ｘにより特定されるアミノ酸の少なくとも１つは、配列番号２９で記載されるポリペプチド（ネズミ１６Ｂ５ＶＨ）における対応するアミノ酸と比較すると１つのアミノ酸置換である。アミノ酸置換は、例えば保存的であっても、又は非保存的であってもよい。本発明によれば、アミノ酸置換は保存的であってよい。

ヒト化若しくはハイブリッド抗体（又はそれから誘導される任意の抗原結合フラグメント）は、配列番号３１を含む重鎖可変領域（１６Ｂ５ＶＨコンセンサス２）を含み得る：
ここで、Ｘ_ｂ１は、例えばＱ又はＥであり得；
ここで、Ｘ_ｂ２は、例えばＶ又はＱであり得；
ここで、Ｘ_ｂ３は、Ｖ又はＬなどの疎水性アミノ酸であり得；
ここで、Ｘ_ｂ４は、例えばＫ又はＶであり得；
ここで、Ｘ_ｂ５は、Ｔ又はＳなどの中性親水性アミノ酸であり得；
ここで、Ｘ_ｂ６は、Ｋ又はＲなどの塩基性アミノ酸であり得；
ここで、Ｘ_ｂ７は、Ｉ又はＬなどの疎水性アミノ酸であり得；
ここで、Ｘ_ｂ８は、例えばＫ又はＴであり得；
ここで、Ｘ_ｂ９は、例えばＶ又はＴであり得；
ここで、Ｘ_ｂ１０は、Ｑ又はＫなどの塩基性アミノ酸であり得；
ここで、Ｘ_ｂ１１は、例えばＡ又はＲであり得；
ここで、Ｘ_ｂ１２は、例えばＧ又はＥであり得；
ここで、Ｘ_ｂ１３は、Ｋ又はＱなどの塩基性アミノ酸であり得；
ここで、Ｘ_ｂ１４は、Ｍ又はＩなどの疎水性アミノ酸であり得；
ここで、Ｘ_ｂ１５は、Ｒ又はＫなどの塩基性アミノ酸であり得；
ここで、Ｘ_ｂ１６は、Ｖ又はＡなどの疎水性アミノ酸であり得；
ここで、Ｘ_ｂ１７は、Ｔ又はＳなどの中性親水性アミノ酸であり得；
ここで、Ｘ_ｂ１８は、例えばＤ又はＮであり得；
ここで、Ｘ_ｂ１９は、Ｍ又はＬなどの疎水性アミノ酸であり得；
ここで、Ｘ_ｂ２０は、例えばＥ又はＱであり得；
ここで、Ｘ_ｂ２１は、例えばＲ又はＴであり得；
ここで、Ｘ_ｂ２２は、例えばＬ又はＳであり得、そして；
ここで、重鎖可変領域は、配列番号２９と比較して少なくとも１つの前記アミノ酸置換を含み得る。

ヒト化若しくはハイブリッド抗体（又はそれから誘導される任意の抗原結合フラグメント）は、配列番号３２を含む重鎖可変領域を含み得る（１６Ｂ５ＶＨコンセンサス３）：
ここで、Ｘ_ｂ１は、例えばＱ又はＥであり得；
ここで、Ｘ_ｂ２は、例えばＶ又はＱであり得；
ここで、Ｘ_ｂ３は、例えばＶ又はＬであり得；
ここで、Ｘ_ｂ４は、例えばＫ又はＶであり得；
ここで、Ｘ_ｂ５は、例えばＴ又はＳであり得；
ここで、Ｘ_ｂ６は、例えばＫ又はＲであり得；
ここで、Ｘ_ｂ７は、例えばＩ又はＬであり得；
ここで、Ｘ_ｂ８は、例えばＫ又はＴであり得；
ここで、Ｘ_ｂ９は、例えばＶ又はＴであり得；
ここで、Ｘ_ｂ１０は、例えばＱ又はＫであり得；
ここで、Ｘ_ｂ１１は、例えばＡ又はＲであり得；
ここで、Ｘ_ｂ１２は、例えばＧ又はＥであり得；
ここで、Ｘ_ｂ１３は、例えばＫ又はＱであり得；
ここで、Ｘ_ｂ１４は、例えばＭ又はＩであり得；
ここで、Ｘ_ｂ１５は、例えばＲ又はＫであり得；
ここで、Ｘ_ｂ１６は、例えばＶ又はＡであり得；
ここで、Ｘ_ｂ１７は、例えばＴ又はＳであり得；
ここで、Ｘ_ｂ１８は、例えばＤ又はＮであり得；
ここで、Ｘ_ｂ１９は、例えばＭ又はＬであり得；
ここで、Ｘ_ｂ２０は、例えばＥ又はＱであり得；
ここで、Ｘ_ｂ２１は、例えばＲ又はＴであり得；
ここで、Ｘ_ｂ２２は、例えばＬ又はＳであり得、そして；
ここで、重鎖可変領域は、配列番号２９と比較して少なくとも１つの前記アミノ酸置換を含み得る。

本発明のさらなる具体的な実施形態では、ヒト化若しくはハイブリッド抗体（又はそれから誘導される任意の抗原結合フラグメント）は、配列番号３４を含む軽鎖可変領域（２１Ｂ１２ＶＬコンセンサス１）を含み得る：
ここで、Ｘにより特定されるアミノ酸の少なくとも１つは、配列番号３３で記載されるポリペプチドにおける対応するアミノ酸（ネズミ２１Ｂ１２ＶＬ）と比較すると１つのアミノ酸置換である。アミノ酸置換は、例えば保存的であってもよいし、又は非保存的であってもよい。本発明によれば、アミノ酸置換は保存的であり得る。

ヒト化若しくはハイブリッド抗体（又はそれから誘導される任意の抗原結合フラグメント）は、配列番号３５を含む軽鎖可変領域（２１Ｂ１２ＶＬコンセンサス２）を含み得る：
ここで、Ｘ_ｃ１は、Ｔ又はＳなどの中性親水性アミノ酸であり得；
ここで、Ｘ_ｃ２は、例えばＤ又はＳであり得；
ここで、Ｘ_ｃ３は、Ｌ又はＶなどの疎水性アミノ酸であり得；
ここで、Ｘ_ｃ４は、Ｒ又はＫなどの塩基性アミノ酸であり得；
ここで、Ｘ_ｃ５は、Ａ又はＶなどの疎水性アミノ酸であり得；
ここで、Ｘ_ｃ６は、Ｉ又はＭなどの疎水性アミノ酸であり得；
ここで、Ｘ_ｃ７は、例えばＮ又はＳであり得；
ここで、Ｘ_ｃ８は、Ｋ又はＲなどの塩基性アミノ酸であり得；
ここで、Ｘ_ｃ９は、例えばＰ又はＳであり得；
ここで、Ｘ_ｃ１０は、Ｓ又はＴなどの中性親水性アミノ酸であり得；
ここで、Ｘ_ｃ１１は、Ｌ又はＶなどの疎水性アミノ酸であり得；
ここで、Ｘ_ｃ１２は、例えばＱ又はＫなどの塩基性アミノ酸であり得；
ここで、Ｘ_ｃ１３は、Ｖ又はＬなどの疎水性アミノ酸であり得；
ここで、Ｘ_ｃ１４は、例えばＱ又はＧであり得、そして；
ここで、軽鎖可変領域は、配列番号３３と比較して少なくとも１つの前記アミノ酸置換を含み得る。

ヒト化若しくはハイブリッド抗体（又はそれから誘導される任意の抗原結合フラグメント）は、配列番号３６を含む軽鎖可変領域（２１Ｂ１２ＶＬコンセンサス３）を含み得る：
ここで、Ｘ_ｃ１は、Ｔ又はＳであり得；
ここで、Ｘ_ｃ２は、Ｄ又はＳであり得；
ここで、Ｘ_ｃ３は、Ｌ又はＶであり得；
ここで、Ｘ_ｃ４は、Ｒ又はＫであり得；
ここで、Ｘ_ｃ５は、例えばＡ又はＶであり得；
ここで、Ｘ_ｃ６は、例えばＩ又はＭであり得；
ここで、Ｘ_ｃ７は、例えばＮ又はＳであり得；
ここで、Ｘ_ｃ８は、例えばＫ又はＲであり得；
ここで、Ｘ_ｃ９は、例えばＰ又はＳであり得；
ここで、Ｘ_ｃ１０は、例えばＳ又はＴであり得；
ここで、Ｘ_ｃ１１は、例えばＬ又はＶであり得；
ここで、Ｘ_ｃ１２は、例えばＱ又はＫであり得；
ここで、Ｘ_ｃ１３は、例えばＶ又はＬであり得；
ここで、Ｘ_ｃ１４は、例えばＱ又はＧであり得、そして；
ここで、軽鎖可変領域は、配列番号３３と比較して少なくとも１つの前記アミノ酸置換を含み得る。

本発明のさらなる例示的な実施形態では、ヒト化若しくはハイブリッド抗体（又はそれから誘導される任意の抗原結合フラグメント）は、配列番号３８を含む重鎖可変領域（２１Ｂ１２ＶＨコンセンサス１）を含み得る：
ここで、Ｘにより特定されるアミノ酸の少なくとも１つは、配列番号３７で記載されるポリペプチドにおける対応するアミノ酸（ネズミ２１Ｂ１２ＶＨ）と比較すると１つのアミノ酸置換である。アミノ酸置換は、例えば保存的であってもよいし、又は非保存的であってもよい。本発明によれば、アミノ酸置換は保存的であり得る。

ヒト化若しくはハイブリッド抗体（又はそれから誘導される任意の抗原結合フラグメント）は、配列番号３９を含む重鎖可変領域（２１Ｂ１２ＶＨコンセンサス２）を含み得る：
ここで、Ｘ_ｄ１は、Ｖ又はＩなどの疎水性アミノ酸であり得；
ここで、Ｘ_ｄ２は、例えばＳ又はＰであり得；
ここで、Ｘ_ｄ３は、例えばＡ又はＥであり得；
ここで、Ｘ_ｄ４は、Ｓ又はＴなどの中性親水性アミノ酸であり得；
ここで、Ｘ_ｄ５は、Ｖ又はＩなどの疎水性アミノ酸であり得；
ここで、Ｘ_ｄ６は、Ｒ又はＫなどの塩基性アミノ酸であり得；
ここで、Ｘ_ｄ７は、例えばＱ又はＫなどの塩基性アミノ酸であり得；
ここで、Ｘ_ｄ８は、例えばＥ又はＫであり得；
ここで、Ｘ_ｄ９は、Ｖ又はＡなどの疎水性アミノ酸であり得；
ここで、Ｘ_ｄ１０は、Ｄ又はＥなどの酸性アミノ酸であり得；
ここで、Ｘ_ｄ１１は、Ｖ又はＡなどの疎水性アミノ酸であり得；
ここで、Ｘ_ｄ１２は、例えばＳ又はＮであり得；
ここで、Ｘ_ｄ１３は、例えばＳ又はＮであり得；
ここで、Ｘ_ｄ１４は、例えばＡ又はＮであり得；
ここで、Ｘ_ｄ１５は、例えばＶ又はＴであり得；
ここで、Ｘ_ｄ１６は、Ｙ又はＦなどの芳香族アミノ酸であり得；
ここで、Ｘ_ｄ１７は、例えばＬ又はＴであり得；
ここで、Ｘ_ｄ１８は、Ｖ又はＬなどの疎水性アミノ酸であり得、そして；
ここで、重鎖可変領域は、配列番号３７と比較して少なくとも１つの前記アミノ酸置換を含み得る。

ヒト化若しくはハイブリッド抗体（又はそれから誘導される任意の抗原結合フラグメント）は、配列番号４０を含む重鎖可変領域（２１Ｂ１２ＶＨコンセンサス３）を含み得る：
ここで、Ｘ_ｄ１は、例えばＶ又はＩであり得；
ここで、Ｘ_ｄ２は、例えばＳ又はＰであり得；
ここで、Ｘ_ｄ３は、例えばＡ又はＥであり得；
ここで、Ｘ_ｄ４は、例えばＳ又はＴであり得；
ここで、Ｘ_ｄ５は、例えばＶ又はＩであり得；
ここで、Ｘ_ｄ６は、例えばＲ又はＫであり得；
ここで、Ｘ_ｄ７は、例えばＱ又はＫであり得；
ここで、Ｘ_ｄ８は、例えばＥ又はＫであり得；
ここで、Ｘ_ｄ９は、例えばＶ又はＡであり得；
ここで、Ｘ_ｄ１０は、例えばＤ又はＥであり得；
ここで、Ｘ_ｄ１１は、例えばＶ又はＡであり得；
ここで、Ｘ_ｄ１２は、例えばＳ又はＮであり得；
ここで、Ｘ_ｄ１３は、例えばＳ又はＮであり得；
ここで、Ｘ_ｄ１４は、例えばＡ又はＮであり得；
ここで、Ｘ_ｄ１５は、例えばＶ又はＴであり得；
ここで、Ｘ_ｄ１６は、例えばＶ又はＦであり得；
ここで、Ｘ_ｄ１７は、例えばＬ又はＴであり得；
ここで、Ｘ_ｄ１８は、例えばＶ又はＬであり得、そして；
ここで、重鎖可変領域は、配列番号３７と比較して少なくとも１つの前記アミノ酸置換を含み得る。

更に具体的な実施形態では、ヒト化又はハイブリッド抗体は、配列番号７又は配列番号１７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含み得る。

さらに、本発明のより具体的な実施形態は、配列番号９又は配列番号１９のアミノ酸配列を有する重鎖を含み得るヒト化又はハイブリッド抗体を含む。

本発明のヒト化又はハイブリッド抗体は、本明細書中で明記される重鎖又は重鎖可変領域及び相補性軽鎖又は軽鎖可変領域を有し得る。

一方では、本発明のヒト化又はハイブリッド抗体は、本明細書中で明記される軽鎖又は軽鎖可変領域及び相補性重鎖又は重鎖可変領域を有し得る。

本発明のヒト化又はハイブリッド抗体は、したがって、本明細書中で記載される天然ヒト抗体軽鎖のヒトフレームワーク領域アミノ酸残基と、配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２及び配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ又は配列番号１４のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号１５のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２及び配列番号１６のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ並びにそれらの組み合わせとを含み得る。

さらなる実施形態では、ヒト化又はハイブリッド抗体は、本明細書中で記載される天然ヒト抗体軽鎖のヒトフレームワーク領域アミノ酸残基と、配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２及び配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３からなる群から選択される少なくとも２つの軽鎖ＣＤＲ又は配列番号１４のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号１５のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２及び配列番号１６のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３からなる群から選択される少なくとも２つの重鎖ＣＤＲ並びにそれらの組み合わせとを含み得る。

さらなる実施形態では、ヒト化又はハイブリッド抗体は、本明細書中で記載される天然ヒト抗体軽鎖のヒトフレームワーク領域アミノ酸残基並びに配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２及び配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３又は配列番号１４のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号１５のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２及び配列番号１６のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３及びそれらの組み合わせを含み得る。

さらに詳細な実施形態では、ヒト化又はハイブリッド抗体は、配列番号８又は配列番号１８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含み得る。

なお一層詳細な実施形態では、本発明のヒト化又はハイブリッド抗体は、配列番号１０又は配列番号２０のアミノ酸配列を有する軽鎖を含み得る。

本発明の他の具体的な実施形態は、配列番号７又は配列番号１７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び配列番号８又は配列番号１８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有するヒト化抗体を含む。

本発明のさらなる具体的な実施形態は、配列番号９のアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号１０のアミノ酸配列を有する軽鎖を有するヒト化抗体を含む。

さらに、本発明のさらなる具体的な実施形態は、配列番号１９のアミノ酸配列を有する重鎖及び軽鎖配列番号２０のアミノ酸配列を有する軽鎖を有するヒト化抗体を含む。

本発明は、さらなる態様において、クラステリンに対して特異的に結合することができ、そして：
配列番号２５と少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９９％）同一である軽鎖可変領域及び／又は配列番号２９と少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９９％）同一である重鎖可変領域を有し得る抗体又はその抗原結合フラグメント（ここで、抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号２５又は配列番号２９と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含み得、そしてアミノ酸置換が、例えば、相補性決定領域（ＣＤＲ）の外側であり得る）；
配列番号３３と少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９９％）同一である軽鎖可変領域及び／又は配列番号３７と少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９９％）同一である重鎖可変領域を有し得る抗体又はその抗原結合フラグメント（ここで、抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号３３又は配列番号３７と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含み得、そしてアミノ酸置換は、例えば、相補性決定領域（ＣＤＲ）の外側であり得る）
からなる群から選択することができる、抗体又はその抗原結合フラグメントに関する。

本発明によれば、少なくとも１つのアミノ酸置換は、例えば、軽鎖可変領域中であり得る。

本発明によれば、少なくとも１つのアミノ酸置換は、例えば、重鎖可変領域中であり得る。

アミノ酸置換は、保存的であってもよいし、又は非保存的であってもよい。更に具体的な実施形態では、アミノ酸置換は保存的であり得る。

本発明の実施形態によれば、本発明の抗体及び抗原結合フラグメントはヒトクラステリンと結合する。本発明の別の実施形態によれば、本発明の抗体及び抗原結合フラグメントはネズミクラステリンと結合する。本発明の抗体及び抗原結合フラグメントはまた、ヒトクラステリンのネズミの天然に存在する変異体又は合成変異体とも結合する。そのような変異体は、例えば、ヒトクラステリン又はネズミクラステリンと少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有する。

Kabat及びChothiaの定義を用いて、配列番号２９のＣＤＲ（配列番号３０、３１、３２及び７のＣＤＲと同一）を同定した。対応するＣＤＲ配列は本明細書中では次のように特定される；重鎖可変領域のＣＤＲ１は配列番号１に対応し、重鎖可変領域のＣＤＲ２は配列番号２に対応し、重鎖可変領域のＣＤＲ３は配列番号３に対応する。

配列番号１、２及び３の短いバージョンは、２００６年９月１３日に出願され、国際公開第２００７／０３０９３０号で公開された、国際出願第ＰＣＴ／ＣＡ２００６／００１５０５号（すなわち、１５０５出願）で示されている。この特許出願では、配列番号２９のＣＤＲ（１５０５出願における配列番号２３に相当する）を、ＩＭＧＴ定義を実行するＩＭＧＴ／Ｖ探索ソフトウェアで同定した。対応する配列は本明細書中では次のように特定される；重鎖可変領域のＣＤＲ１は配列番号４４に対応し、重鎖可変領域のＣＤＲ２は配列番号４５に対応し、そして重鎖可変領域のＣＤＲ３は配列番号４６に対応する。

本明細書中で用いられる場合、配列番号２９に関して、「相補性決定領域（ＣＤＲ）の外側のアミノ酸置換〜」という用語は、一般に、配列番号１、２及び３の周りの（外側の）アミノ酸を指す。或いは、いくつかの実施形態では、この用語は、配列番号４４、４５及び４６の周りの（外側の）アミノ酸を指す場合もある。

配列番号２５のＣＤＲ（配列番号２６、２７、２８及び８のＣＤＲと同一）を、Kabat及びChothiaの定義を用いて同定した。対応するＣＤＲ配列は本明細書中では次のように特定される；軽鎖可変領域のＣＤＲ１は配列番号４に対応し、軽鎖可変領域のＣＤＲ２は配列番号５に対応し、そして軽鎖可変領域のＣＤＲ３は配列番号６に対応する。

配列番号４、５及び６の短いバージョンは、２００６年９月１３日に出願され、そして国際公開第２００７／０３０９３０号で公開された、国際出願第ＰＣＴ／ＣＡ２００６／００１５０５号（すなわち、１５０５出願）で示されている。この特許出願では、配列番号２５のＣＤＲ（１５０５出願における配列番号１２に相当する）を、ＩＭＧＴ定義を実施するＩＭＧＴ／Ｖ探索ソフトウェアで同定した。対応する配列は本明細書中では次のように特定される；軽鎖可変領域のＣＤＲ１は配列番号４７に対応し、軽鎖可変領域のＣＤＲ２は「ＷＡＳ」のアミノ酸配列に対応し、そして軽鎖可変領域のＣＤＲ３は配列番号４９に対応する。

本明細書中で用いられる場合、配列番号２５に関して、「相補性決定領域（ＣＤＲ）の外側のアミノ酸置換〜」という用語は、一般に、配列番号４、５及び６の周りの（外側の）アミノ酸を指す。或いは、いくつかの実施形態では、この用語は、配列番号４７、軽鎖可変領域のＣＤＲ２及び４９の周りの（外側の）アミノ酸を指す場合もある。

配列番号３７のＣＤＲ（配列番号３８、３９、４０及び１７のＣＤＲと同一）を、Kabat及びChothiaの定義を用いて同定した。対応するＣＤＲ配列は本明細書中では次のように特定される；重鎖可変領域のＣＤＲ１は配列番号１１に対応し、重鎖可変領域のＣＤＲ２は配列番号１２に対応し、そして重鎖可変領域のＣＤＲ３は配列番号１３に対応する。

配列番号１１、１２及び１３の短いバージョンは、２００６年９月１３日に出願され、国際公開第２００７／０３０９３０号で公開された、国際出願第ＰＣＴ／ＣＡ２００６／００１５０５号（すなわち、１５０５出願）で示された。この特許出願では、配列番号３７のＣＤＲ（’１５０５出願での配列番号２２に相当する）を、ＩＭＧＴ定義を実施するＩＭＧＴ／Ｖ探索ソフトウェアで同定した。対応する配列は本明細書中では次のように特定される；重鎖可変領域のＣＤＲ１は、配列番号５０に対応し、重鎖可変領域のＣＤＲ２は配列番号５１に対応し、重鎖可変領域のＣＤＲ３は配列番号５２に対応する。

配列番号３７に関して本明細書中で用いられる場合「相補性決定領域（ＣＤＲ）の外側のアミノ酸置換〜」という用語は、一般に、配列番号１１、１２及び１３の周りの（外側の）アミノ酸を指す。或いは、いくつかの実施形態では、この用語は、配列番号５０、５１及び５２の周りの（外側の）アミノ酸を指す場合もある。

配列番号３３のＣＤＲ（配列番号３４、３５、３６及び１８のＣＤＲと同一）を、Kabat及びChothiaの定義を用いて同定した。対応するＣＤＲ配列は本明細書中では次のように特定される；軽鎖可変領域のＣＤＲ１は配列番号１４に対応し、軽鎖可変領域のＣＤＲ２は配列番号１５に対応し、軽鎖可変領域のＣＤＲ３は配列番号１６に対応する。

配列番号１４、１５及び１６の短いバージョンは、２００６年９月１３日に出願され、国際公開第２００７／０３０９３０号で公開された国際出願第ＰＣＴ／ＣＡ２００６／００１５０５号（すなわち、１５０５出願）で示された。この特許出願では、配列番号３３のＣＤＲ（’１５０５出願での配列番号１１に相当する）を、ＩＭＧＴ定義を実施するＩＭＧＴ／Ｖ探索ソフトウェアで同定した。対応する配列は本明細書中では次のように特定される；軽鎖可変領域のＣＤＲ１は配列番号５３に対応し、軽鎖可変領域のＣＤＲ２は「ＷＡＳ」のアミノ酸配列に対応し、軽鎖可変領域のＣＤＲ３は配列番号５５に対応する。

本明細書中で用いられる場合、配列番号３３に関して「相補性決定領域（ＣＤＲ）の外側のアミノ酸置換〜」という用語は、一般に、配列番号１４、１５及び１６の周りの（外側の）アミノ酸を指す。或いは、いくつかの実施形態では、この用語は、配列番号５３、軽鎖可変領域のＣＤＲ２及び５５周辺の（外側の）アミノ酸を指す場合もある。

本発明のヒト化抗体（又はそれから誘導される任意の抗原結合フラグメント）は、配列番号７、配列番号２６又は配列番号２７からなる群から選択される軽鎖可変領域及び配列番号８、配列番号２９又は配列番号３０からなる群から選択される重鎖可変領域を含み得る。

本発明のハイブリッド抗体（又はそれから誘導される任意の抗原結合フラグメント）は、配列番号７、配列番号２６又は配列番号２７からなる群から選択される軽鎖可変領域及び配列番号２８を含む重鎖可変領域を含み得る。

或いは、本発明のハイブリッド抗体（又はそれから誘導される任意の抗原結合フラグメント）は、配列番号２５を含む軽鎖可変領域及び配列番号８、配列番号２９又は配列番号３０からなる群から選択される重鎖可変領域を含み得る。

本発明のヒト化抗体（又はそれから誘導される任意の抗原結合フラグメント）は、配列番号１８、配列番号３２又は配列番号３３からなる群から選択される軽鎖可変領域及び配列番号１７、配列番号３５又は配列番号３６からなる群から選択される重鎖可変領域を含み得る。

本発明のハイブリッド抗体（又はそれから誘導される任意の抗原結合フラグメント）は、配列番号１８、配列番号３２又は配列番号３３からなる群から選択される軽鎖可変領域及び配列番号３４を含む重鎖可変領域を含み得る。

或いは、本発明のハイブリッド抗体（又はそれから誘導される任意の抗原結合フラグメント）は、配列番号３１を含む軽鎖可変領域及び配列番号１７、配列番号３５又は配列番号３６からなる群から選択される重鎖可変領域を含み得る。

本発明のヒト化抗体又は抗原結合フラグメントの別の例示的実施形態には、例えば、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８又は配列番号８のいずれかの少なくとも９０の連続したアミノ酸を含み得る軽鎖可変領域を有する抗体又は抗原結合フラグメントが含まれる。

本明細書中で用いられる場合「配列番号２６の少なくとも９０の連続したアミノ酸」という用語には、「少なくとも９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１又は少なくとも１１２の連続したアミノ酸」という用語も含まれる。「配列番号２６の少なくとも９０の連続したアミノ酸」という用語は、配列番号２６で見出される少なくとも９０の連続したアミノ酸の任意の可能な配列及び特に配列番号２６の３つのＣＤＲを含む配列、例えば、配列番号２６のアミノ酸６〜１０８、５〜１０９、１３〜１０３、９〜１１１を含む配列などを含む。

本明細書中で用いられる場合、「配列番号２７の少なくとも９０の連続したアミノ酸」という用語は、「少なくとも９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１又は少なくとも１１２の連続したアミノ酸」という用語も含む。「配列番号２７の少なくとも９０の連続したアミノ酸」という用語は、配列番号２７で見出される少なくとも９０の連続したアミノ酸の任意の可能な配列及び特に配列番号２７の３つのＣＤＲを含む配列、例えば、配列番号２７のアミノ酸７〜１０９、１２〜１０４、２２〜１１３、１８〜１１２などを含む配列を含む。

「配列番号２８の少なくとも９０の連続したアミノ酸」又は「配列番号８の少なくとも９０の連続したアミノ酸」という用語は、類似した意味を有する。

本発明によれば、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、例えば、配列番号８で記載されるような軽鎖可変領域を有し得る。

また本発明によれば、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、例えば、配列番号１０で記載されるような軽鎖を有し得る。

本発明のヒト化抗体又は抗原結合フラグメントは、例えば、配列番号３０、３１、３２又は７のいずれかの少なくとも９０の連続したアミノ酸を含み得る重鎖可変領域を含む（又はさらに含む）。

本明細書中で用いられる場合、「配列番号３０の少なくとも９０の連続したアミノ酸」という用語はまた、「少なくとも９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６又は少なくとも１１７の連続したアミノ酸」という用語も含む。「配列番号３０の少なくとも９０の連続したアミノ酸」という用語は、配列番号３０で見出される少なくとも９０の連続したアミノ酸の任意の可能な配列及び特に配列番号３０の３つのＣＤＲを含む配列、例えば、配列番号３０のアミノ酸１〜１０８、２〜１１２、１１〜１１３、７〜１０９を含む配列などを含む。

本明細書中で用いられる場合、「配列番号３１の少なくとも９０の連続したアミノ酸」という用語はまた、「少なくとも９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６又は少なくとも１１７の連続したアミノ酸」という用語も含む。「配列番号３１の少なくとも９０の連続したアミノ酸」という用語は、配列番号３１で見出される少なくとも９０の連続したアミノ酸の任意の可能な配列及び特に配列番号３１の３つのＣＤＲを含む配列、例えば、配列番号３１のアミノ酸６〜１０９、８〜１１３、１〜１０８、２〜１１５を含む配列などを含む。

「配列番号３２の少なくとも９０の連続したアミノ酸」又は「配列番号７の少なくとも９０の連続したアミノ酸」という用語は、類似した意味を有する。

本発明によれば、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、例えば、配列番号７で記載される重鎖可変領域を有し得る。

また本発明によれば、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、例えば、配列番号９で記載される重鎖を有し得る。

本発明によれば、抗体又は抗原結合フラグメントは、例えば、
ａ）配列番号２６の少なくとも９０の連続したアミノ酸を含み得る軽鎖可変領域及び配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２若しくは配列番号７のいずれかの少なくとも９０の連続したアミノ酸を含み得る重鎖可変領域；
ｂ）配列番号２７の少なくとも９０の連続したアミノ酸を含み得る軽鎖可変領域及び配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２若しくは配列番号７のいずれかの少なくとも９０の連続したアミノ酸を含み得る重鎖可変領域；
ｃ）配列番号２８の少なくとも９０の連続したアミノ酸を含み得る軽鎖可変領域及び配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２若しくは配列番号７のいずれかの少なくとも９０の連続したアミノ酸を含み得る重鎖可変領域；又は
ｄ）配列番号８の少なくとも９０の連続したアミノ酸を含み得る軽鎖可変領域及び配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２若しくは配列番号７のいずれかの少なくとも９０の連続したアミノ酸を含み得る重鎖可変領域
を含み得る。

本発明のさらに具体的な実施形態によれば、軽鎖可変領域は、配列番号８の少なくとも９０の連続したアミノ酸を含み得、重鎖可変領域は、配列番号７の少なくとも９０の連続したアミノ酸を含み得る。

本発明のなお一層具体的な実施形態によれば、軽鎖可変領域は、配列番号８で記載されるとおりであり得、重鎖可変領域は、配列番号７で記載されるとおりであり得る。

本発明のヒト化抗体又は抗原結合フラグメントの他の例示的実施例は、配列番号３４、３５、３６又は１８のいずれかの少なくとも９０の連続したアミノ酸を含み得る軽鎖可変領域を含み得るものである。

本明細書中で用いられる場合、「配列番号３４の少なくとも９０の連続したアミノ酸」という用語は、「少なくとも９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２又は少なくとも１１３の連続したアミノ酸」という用語も含む。「配列番号３４の少なくとも９０の連続したアミノ酸」という用語は、配列番号３４で見出される少なくとも９０の連続したアミノ酸の任意の可能な配列及び特に配列番号３４の３つのＣＤＲを含む配列、例えば、配列番号３４のアミノ酸６〜１０３、１１〜１０６、１〜１０６、３〜１１０、５〜１０７を含む配列などを含む。

本明細書中で用いられる場合、「配列番号３５の少なくとも９０の連続したアミノ酸」という用語は、「少なくとも９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２又は少なくとも１１３の連続したアミノ酸」という用語も含む。「配列番号３５の少なくとも９０の連続したアミノ酸」という用語は、配列番号３５で見出される少なくとも９０の連続したアミノ酸の任意の可能な配列及び特に配列番号３５の３つのＣＤＲを含む配列、例えば配列番号３５のアミノ酸９〜１０６、１０〜１１３、１〜１０９、２０〜１１０、７〜１０７を含む配列などを含む。

「配列番号３６の少なくとも９０の連続したアミノ酸」又は「配列番号１８の少なくとも９０の連続したアミノ酸」という用語は類似した意味を有する。

本発明によれば、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、例えば、配列番号１８で記載される軽鎖可変領域を有し得る。

また本発明によれば、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、例えば、配列番号２０で記載される軽鎖を有し得る。

本発明のヒト化抗体又は抗原結合フラグメントは、例えば、配列番号３８、３９、４０又は１７のいずれかの少なくとも９０の連続したアミノ酸を含み得る重鎖可変領域を含む（又は更に含む）。

本明細書中で用いられる場合、「配列番号３８の少なくとも９０の連続したアミノ酸」という用語は、「少なくとも９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７又は少なくとも１１８の連続したアミノ酸」という用語も含む。「配列番号３８の少なくとも９０の連続したアミノ酸」という用語は、配列番号３８で見出される少なくとも９０の連続したアミノ酸の任意の可能な配列及び特に配列番号３８の３つのＣＤＲを含む配列、例えば配列番号３８のアミノ酸６〜１１１、１〜１１４、１２〜１０９、５〜１１３、１０〜１０７を含む配列などを含む。

本明細書中で用いられる場合、「配列番号３９の少なくとも９０の連続したアミノ酸」という用語は、「少なくとも９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７又は少なくとも１１８の連続したアミノ酸という用語も含む。「配列番号３９の少なくとも９０の連続したアミノ酸」という用語は、配列番号３９で見出される少なくとも９０の連続したアミノ酸の任意の可能な配列及び特に配列番号３９の３つのＣＤＲを含む配列、例えば配列番号３９のアミノ酸３〜１０９、１〜１１５、１〜１１０、２２〜１１６、２０〜１１５を含む配列などを含む。

「配列番号４０の少なくとも９０の連続したアミノ酸」又は「配列番号１７の少なくとも９０の連続したアミノ酸」という用語は類似した意味を有する。

本発明によれば、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、例えば、配列番号１７で記載される重鎖可変領域を有し得る。

また、本発明によれば、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、例えば、配列番号１９で記載される重鎖を有し得る。本発明によれば、抗体又は抗原結合フラグメントは、例えば、
ａ）配列番号３４の少なくとも９０の連続したアミノ酸を含み得る軽鎖可変領域及び配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０若しくは配列番号１７のいずれかの少なくとも９０の連続したアミノ酸を含み得る重鎖可変領域；
ｂ）配列番号３５の少なくとも９０の連続したアミノ酸を含み得る軽鎖可変領域及び配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０若しくは配列番号１７のいずれかの少なくとも９０の連続したアミノ酸を含み得る重鎖可変領域；
ｃ）アミノ酸配列番号３６の少なくとも９０の連続したアミノ酸を含み得る軽鎖可変領域及び配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０若しくは配列番号１７のいずれかの少なくとも９０の連続したアミノ酸を含み得る重鎖可変領域；又は
ｄ）配列番号１８の少なくとも９０の連続したアミノ酸を含み得る軽鎖可変領域及び配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０若しくは配列番号１７のいずれかの少なくとも９０の連続したアミノ酸を含み得る重鎖可変領域
を含み得る。

本発明のさらに具体的な実施形態によれば、軽鎖可変領域は、配列番号１８の少なくとも９０の連続したアミノ酸を有し得、重鎖可変領域は、配列番号１７の少なくとも９０の連続したアミノ酸を有し得る。

本発明のなおいっそう具体的な実施形態によれば、軽鎖可変領域は配列番号１８で記載されるとおりであり得、重鎖可変領域は配列番号１７で記載されるとおりであり得る。

もちろん、本明細書中で記載される軽鎖若しくは重鎖又はそれらの可変領域は、シグナルペプチドも含み得る。そのようなシグナルペプチドは、元の配列由来であり得るか、又はポリペプチドの特定の細胞局在を最適化するように設計され得る。もちろん、望ましいシグナルペプチドは、ポリペプチドの分泌を可能にするもの（例えば、切断可能）である。

本発明のヒト化又はハイブリッド抗体は、定常領域、好ましくはヒト定常領域を有し得る。他のサブタイプを選択することができるが、ヒト化又はハイブリッド抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ３サブタイプの免疫グロブリンの定常領域のアミノ酸残基を含み得る。

本発明はまた、別の態様では、軽鎖可変領域（又はそのフラグメント）及び重鎖可変領域（又はそのフラグメント）を含む抗原結合フラグメントにも関し、これは非ヒト相補性決定領域アミノ酸残基及びヒトフレームワーク領域アミノ酸残基を含み得る。

本発明の抗原結合フラグメントはクラステリンと結合することができ、有利には非ヒト親抗体の抗原結合フラグメントよりも良好な親和性を有し得る。

実際、抗原結合フラグメントは組換えモノマークラステリンと１．７×１０^−８Ｍ±２．９７×１０^−９又はそれより良好な親和性で結合することが本明細書中で示されている。

例示的な実施形態では、抗原結合フラグメントは、本明細書中で記載される天然ヒト抗体重鎖のヒトフレームワーク領域アミノ酸残基と、配列番号１のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２及び配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ又は配列番号１１のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２及び配列番号１３のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３からなる群から選択される重鎖ＣＤＲとを含み得る。

別の例示的実施形態では、抗原結合フラグメントは、本明細書中で記載される天然ヒト抗体重鎖のヒトフレームワーク領域アミノ酸残基と、配列番号１のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２及び配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３からなる群から選択される少なくとも２つの重鎖ＣＤＲ又は配列番号１１のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２及び配列番号１３のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３からなる群から選択される少なくとも２つの重鎖ＣＤＲとを含み得る。

更に別の実施形態では、抗原結合フラグメントは、本明細書中で記載される天然ヒト抗体重鎖のヒトフレームワーク領域アミノ酸残基と、配列番号１のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２及び配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３又は配列番号１１のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２及び配列番号１３のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３とを含み得る。

さらに詳細な実施形態では、抗原結合フラグメントは、配列番号７若しくは配列番号１７のアミノ酸配列（又はそのフラグメント）を有する重鎖可変領域を含み得る。

さらなる例示的実施形態では、抗原結合フラグメントは、本明細書中で記載される天然ヒト抗体軽鎖のヒトフレームワーク領域アミノ酸残基と、配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２及び配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ又は配列番号１４のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号１５のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２及び配列番号１６のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲとを含み得る。

更に別の例示的実施形態では、抗原結合フラグメントは、本明細書中で記載される天然ヒト抗体軽鎖のヒトフレームワーク領域アミノ酸残基と、配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２及び配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３からなる群から選択される少なくとも２つの軽鎖ＣＤＲ又は配列番号１４のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号１５のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２及び配列番号１６のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３からなる群から選択される少なくとも２つの軽鎖ＣＤＲとを含み得る。

更に別の例示的実施形態では、抗原結合フラグメントは、本明細書中で記載される天然ヒト抗体軽鎖のヒトフレームワーク領域アミノ酸残基と、配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２及び配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３又は配列番号１４のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号１５のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２及び配列番号１６のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３とを含み得る。

更に具体的な実施形態では、抗原結合フラグメントは、配列番号８若しくは配列番号１８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域又はそのフラグメントを含み得る。

本発明によれば、抗原結合フラグメントは、例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆｖフラグメント又はｄＡｂフラグメントであり得る。

好ましくは、抗原結合フラグメントは、例えば、Ｆａｂフラグメント又はＦ（ａｂ’）_２フラグメントであり得る。

本発明はさらに、本明細書中に記載する抗原結合フラグメントのアミノ酸配列を含む単離された抗体も含む。単離された抗体は定常領域も含み得る。

変異体抗体及び抗原結合フラグメント
齧歯類抗体由来のＣＤＲをヒトフレームワーク中のヒトＣＤＲと置換することは、高い抗原結合親和性を移すのに十分である場合があるが（Jones, P.T. et al., Nature 321:522-525(1986);Verhoeyen, M. et al., Science 239:1534-1536(1988)）、別の場合では、１つ（Riechmann, L. et al., Nature 332:323-327(1988)）又は複数（Queen, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033(1989)）のフレームワーク領域残基を更に置換する必要がある。抗体ヒト化の技術分野では依然として実質的に予測不可能である。例えば、米国特許第７，５３７，９３１号では、ネズミ抗体のＣＤＲをヒト抗体中に移すことを試みた結果、抗原に対する結合が失われた。

ヒト化プロセスの結果、所望の特性（すなわち、特異性、親和性など）を有するヒト化又はハイブリッド抗体が得られないならば、非ヒトアミノ酸フレームワーク残基をヒトアミノ酸フレームワーク残基の代わりに用いることが可能である。

本発明は、したがって、本明細書中に記載されるヒト化若しくはハイブリッド抗体又は抗原結合フラグメントの変異体を含む。含まれる変異体抗体又は抗原結合フラグメントは、本明細書中に記載されるヒト化若しくはハイブリッド抗体又は抗原結合フラグメントのアミノ酸配列において変動を有するものである。例えば、本発明に含まれる変異体抗体又は抗原結合フラグメントは、非ヒト相補性決定領域アミノ酸残基を含み得る軽鎖可変領域及び重鎖可変領域並びに及び天然ヒト抗体のヒトフレームワーク領域アミノ酸残基を有し、（好ましくはフレームワーク領域において）少なくとも１つのアミノ酸変動を更に含むものである。

本発明に含まれる変異体抗体又は抗原結合フラグメントは、例えば、ヒト化若しくはハイブリッド抗体又は抗原結合フラグメントと比較して同様又は改善された特性を有するが、本明細書中に記載するヒト化又はハイブリッド抗体と比較して少なくとも１つのアミノ酸変動を有するものである。

本発明に含まれる変異体抗体又は抗原結合フラグメントは、挿入、欠失又はアミノ酸置換（保存的若しくは非保存的）を含み得るものである。いくつかの変異体は、したがって、そのアミノ酸配列中の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、その場所に異なる残基が挿入されている可能性がある。

置換型突然変異誘発について興味深い部位は、超可変領域（ＣＤＲ）、フレームワーク領域又はさらには定常領域も含み得る。保存的置換は、以下に記載する群（１〜６群）のうちの１つからのアミノを、同じ群の別のアミノ酸と交換することによっておこなうことができる。

保存的置換の他の例示的実施形態を表１Ａ中、「好ましい置換」の見出しの下に記載する。そのような置換の結果、望ましくない特性が生じるならば、表１Ａ中で「例示的置換」と表示されているか、又はアミノ酸クラスに関して以下でさらに記載するようなさらに実質的な変化を導入することができ、生成物をスクリーニングすることができる。

「保存的置換」として特定される置換の例を表１Ａに示す。そのような置換の結果、望ましくない変化が生じるならば、表１Ａ中で「例示的置換」と表示されているか、又はアミノ酸クラスに関して以下でさらに記載するような他の種類の置換を導入し、生成物をスクリーニングする。

機能又は免疫学的同一性における大幅な修飾は、（ａ）例えばシート若しくはらせん状立体配座としての置換の領域におけるポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷若しくは疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩の維持に対するそれらの効果が著しく異なる置換を選択することにより、達成することができる。天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいて分類される：
（１群） 疎水性：ノルロイシン、メチオニン（Ｍｅｔ）、アラニン（Ａｌａ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）
（２群） 中性親水性：システイン（Ｃｙｓ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）
（３群） 酸性：アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）
（４群） 塩基性：アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、リシン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）
（５群）鎖配向に影響を及ぼす残基：グリシン（Ｇｌｙ）、プロリン（Ｐｒｏ）；及び
（６群） 芳香族：トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）
非保存的置換は、これらのクラスの成員を別のものと交換することを伴う。

変異体抗体又は抗原結合フラグメントのアミノ酸配列における変動は、アミノ酸の付加、欠失、挿入、置換など、１以上のアミノ酸の骨格若しくは側鎖における１以上の修飾、又は１以上のアミノ酸（側鎖若しくは骨格）に対する基若しくは別の分子の付加を含み得る。

変異体抗体又は抗原結合フラグメントは、元の抗体又は抗原結合フラグメントアミノ酸配列と比較して、そのアミノ酸配列において相当な配列類似性及び／又は配列同一性を有し得る。２つの配列間の類似性の程度は、同一性（同じアミノ酸）のパーセンテージ及び保存的置換のパーセンテージに基づく。

別のフレームワーク領域と比較して、フレームワーク領域の同一性（％）を決定する場合、ＣＤＲアミノ酸配列は、好ましくは考慮すべきではない。別のものと比較してのフレームワーク領域の同一性（％）は、好ましくは、フレームワークごとではなく、全フレームワーク領域にわたって決定される。

一般的に、可変鎖間の類似性及び同一性の程度は、本明細書中では、Ｂｌａｓｔ２配列プログラム（Tatiana A. Tatusova, Thomas L. Madden(1999), “Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences”, FEMS Microbiol Lett. 174:247-250）を用い、デフォルトのセッティング、すなわちｂｌａｓｔｐプログラム、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス（オープンギャップ１１及びエクステンションギャップペナルティー１；ｇａｐｘ ｄｒｏｐｏｆｆ ５０、期待値１０．０、ワードサイズ３）及び活性化フィルターを使用して決定した。

同一性（％）は、したがって元のペプチドと比較して同一であり、同じか又は類似した位置を占める可能性があるアミノ酸を表す。

類似性（％）は、同一であるアミノ酸及び元のペプチドと比較して同じか又は類似した位置にて保存的アミノ酸置換で置換されたものを示す。

本発明の変異体は、したがって元の配列又は元の配列の一部と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有し得るものを含む。

変異体の例示的実施形態は、本明細書中に記載する配列に対して少なくとも８１％の配列同一性を有し、元の配列又は元の配列の一部と８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列類似性を有するものである。

変異体の他の例示的実施形態は、本明細書中に記載する配列に対して少なくとも８２％の配列同一性を有し、元の配列又は元の配列の一部と８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列類似性を有するものである。

変異体のさらなる例示的実施形態は、本明細書中に記載する配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有し、元の配列又は元の配列の一部と８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列類似性を有するものである。

変異体の他の例示的実施形態は、本明細書中に記載する配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、元の配列又は元の配列の一部と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列類似性を有するものである。

変異体のさらなる例示的実施形態は、本明細書中に記載する配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、元の配列又は元の配列の一部と９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列類似性を有するものである。

変異体のさらに別の例示的実施形態は、本明細書中に記載する配列に対して少なくとも９７％の配列同一性を有し、元の配列又は元の配列の一部と９７％、９８％、９９％又は１００％の配列類似性を有するものである。

簡潔にするために、本出願者は、本発明により含まれる個々の変異体の例示的実施形態を説明し、特定された配列同一性（％）及び配列類似性（％）を含む表１Ｂを本明細書中で記載する。各「Ｘ」は、所与の変異体を示すものと解釈される。

本発明は、したがって、非ヒトアミノ酸フレームワーク残基が再導入されているか、又は他の種類のアミノ酸修飾がなされているヒト化又はハイブリッド抗体を含む。抗体の特性を最適化するために特に選択されるこれらのアミノ酸には、抗原結合に関与するものが含まれる。そのようなアミノ酸の例を図２に示す。

例示的な実施形態において、本発明のヒト化又はハイブリッド抗体は、したがって、重鎖可変領域中に１〜２１の非ヒトフレームワーク領域アミノ酸残基を含み得る（復帰突然変異）。

別の例示的実施形態において、ヒト化又はハイブリッド抗体は、軽鎖可変領域中に１〜１２の非ヒトフレームワーク領域アミノ酸残基を含み得る（復帰突然変異）。

本明細書中で用いられる場合、「１〜２０」という用語は、個々の値を含み、例えば、１、２、３及び２０まで；１〜２０；１〜１９；１〜１８；１〜１７；１〜１６；１〜１５など；２〜２０；２〜１９；２〜１８；２〜１７など；３〜２０；３〜１９；３〜１８など；４〜２０；４〜１９；４〜１８；４〜１７；４〜１６など；５〜２０；５〜１９；５〜１８；５〜１７などの範囲である。

同様に、「１〜１２」という用語は、個々の値を含み、例えば、１、２、３、及び１２まで；１〜１２；１〜１１；１〜１０など；２〜１２；２〜１１、２〜１０；２〜９；２〜８など；３〜１２；３〜１１；３〜１０；３〜９など；４〜１２；４〜１１など；５〜１２；５〜１１；５〜１０；５〜９；５〜８；５〜７；などの範囲である。

同様の用語は、同じように解釈されるものとする。

本発明は、別のアミノ酸配列と所望の同一性（％）を有するアミノ酸配列、例えば、「非ヒト親抗体の軽鎖フレームワーク領域と少なくとも７０％の同一性を有する天然ヒト抗体軽鎖フレームワーク領域」又は「非ヒト親抗体の重鎖フレームワーク領域と少なくとも７０％の同一性を有する天然ヒト抗体重鎖フレームワーク領域」を含むか又は使用する。

「非ヒト親抗体の軽鎖フレームワーク領域と少なくとも７０％の同一性を有する天然ヒト抗体軽鎖フレームワーク領域」という用語は、非ヒト親抗体の軽鎖フレームワーク領域と７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する天然ヒト抗体軽鎖フレームワーク領域を含む。同一性（％）は、好ましくは、全フレームワーク領域（すなわち、ＣＤＲを除く）にわたって決定される。

変異体について前述するように、「非ヒト親抗体の軽鎖フレームワーク領域と少なくとも７０％の同一性を有する軽鎖フレームワーク領域」という用語は、非ヒト親抗体の軽鎖フレームワーク領域と７０％の同一性を有し、また非ヒト親抗体の軽鎖フレームワーク領域と７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列類似性も有し得る軽鎖フレームワーク領域を含む。

「非ヒト親抗体の重鎖フレームワーク領域と少なくとも７０％の同一性を有する天然ヒト抗体重鎖フレームワーク領域」という用語は、非ヒト親抗体の重鎖フレームワーク領域と７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する天然ヒト抗体重鎖フレームワーク領域を含む。

変異体に関して前述するように、「非ヒト親抗体の重鎖フレームワーク領域と少なくとも７０％の同一性を有する重鎖フレームワーク領域」という用語は、非ヒト親抗体の重鎖フレームワーク領域と７０％の同一性を有し、非ヒト親抗体の重鎖フレームワーク領域と７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列類似性も有し得る重鎖フレームワーク領域を含む。

細胞における抗体の産生
本明細書中で開示される抗体は、当業者によく知られている種々の方法（組換えＤＮＡ法、化学合成など）により作製することができる。

抗体を発現するために、本明細書中に記載する免疫グロブリン軽鎖及び重鎖のいずれか１つをコード化できるヌクレオチド配列を、特定の宿主において挿入されたコーディング配列の転写及び翻訳制御のための要素を含むベクター中に挿入することができる。これらの要素としては、調節配列、例えばエンハンサー、構成的及び誘導プロモータ、並びに５’及び３’非翻訳領域を挙げることができる。当業者に周知の方法を用いてそのような発現ベクターを構築することができる。これらの方法としては、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、及びインビボ遺伝子組換えが挙げられる。

当業者に公知の種々の発現ベクター／宿主細胞系を用いて、本明細書中で記載する免疫グロブリン軽鎖及び重鎖のいずれか１つをコード化できるヌクレオチド配列から誘導されるポリペプチド又はＲＮＡを発現することができる。これらとしては、組換えバクテリオファージ、プラスミド、又はコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌などの微生物；酵母発現ベクターで形質転換された酵母；バキュロウイルスベクターに感染した昆虫細胞系；ウイルス若しくは細菌発現ベクターで形質転換された植物細胞系；又は動物細胞系が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ほ乳類系における組換えタンパク質の長期産生のために、細胞系において安定な発現を実施することができる。例えば、本明細書中で記載する免疫グロブリン軽鎖及び重鎖のいずれか１つをコード化できるヌクレオチド配列を、ウイルス性複製開始点及び／又は内因性発現要素並びに選択可能又は可視マーカー遺伝子を同じか又は別個のベクター上に含み得る発現ベクターを用いて、細胞系に形質転換することができる。本発明は、用いられるベクター又は宿主細胞により限定されない。本発明のある実施形態では、本明細書中で記載する免疫グロブリン軽鎖及び重鎖のいずれか１つをコード化できるヌクレオチド配列をそれぞれ別個の発現ベクター中にライゲートし、各鎖を別々に発現させることができる。別の実施形態では、本明細書中で記載する免疫グロブリン軽鎖及び重鎖のいずれか１つをコード化することができる軽鎖及び重鎖はどちらも１つの発現ベクター中にライゲートすることができ、同時に発現させることができる。

或いは、ＲＮＡ及び／又はポリペプチドは、本明細書中で記載する免疫グロブリン軽鎖及び重鎖のいずれか１つをコード化できるヌクレオチド配列を含むベクターから、インビトロ転写系又は結合型インビトロ転写／翻訳系を用いて、発現することができる。

一般的に、本明細書中で記載する免疫グロブリン軽鎖及び重鎖のいずれか１つをコード化できるヌクレオチド配列を含み、及び／又は本明細書中で記載する免疫グロブリン軽鎖及び重鎖のいずれか１つをコード化できるヌクレオチド配列によりコード化されるポリペプチドを発現する宿主細胞、又はその一部を、当業者に公知の種々の手順によって同定することができる。これらの手順としては、ＤＮＡ／ＤＮＡ又はＤＮＡ／ＲＮＡハイブリダイゼーション、ＰＣＲ増幅、及び核酸若しくはアミノ酸配列の検出及び／又は定量化のための膜、溶液若しくはチップベースの技術を含むタンパク質バイオアッセイ又はイムノアッセイ技術が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ポリペプチドの発現を、特異的ポリクローナル又はモノクローナル抗体のいずれかを用いて検出又は測定するための免疫学的方法は、当該技術分野で公知である。そのような技術の例としては、酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、及び蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）が挙げられる。当業者は、これらの方法を本発明に容易に適応させることができる。

本明細書中で記載する免疫グロブリン軽鎖及び重鎖のいずれか１つをコード化できるヌクレオチド配列を含む宿主細胞を、したがって、対応するＲＮＡの転写及び／又は細胞培養からのポリペプチドの発現のための条件下で培養することができる。細胞によって産生されるポリペプチドは、使用する配列及び／又はベクターに応じて、分泌される可能性があるか、又は細胞内に保持される可能性がある。例示的な実施形態では、本明細書中で記載する免疫グロブリン軽鎖及び重鎖のいずれか１つをコード化できるヌクレオチド配列を含む発現ベクターは、原核生物又は真核生物細胞膜を通してポリペプチドを分泌させるシグナル配列を含むように設計することができる。

重鎖可変領域をコード化する核酸の例示的実施形態を配列番号２１及び配列番号２２で提供する。

軽鎖可変領域をコード化する核酸の例示的実施形態を配列番号２３及び配列番号２４で提供する。

遺伝コードの生来の縮重のために、これをコード化する他のＤＮＡ配列、実質的に同じであるか又は機能的に等価なアミノ酸配列を産生し、使用して、例えば、本明細書中で記載する免疫グロブリン軽鎖及び重鎖のいずれか１つをコード化できるヌクレオチド配列によりコード化されるポリペプチドを発現することができる。本発明のヌクレオチド配列は、これらに限定されるものではないが、遺伝子産物のクローニング、プロセッシング、及び／又は発現の修飾をはじめとする種々の目的のためにヌクレオチド配列を変更するために、当該技術分野で一般的に公知の方法を用いて操作することができる。遺伝子フラグメント及び合成オリゴヌクレオチドのランダムフラグメンテーション及びＰＣＲリアセンブリによるＤＮＡシャッフリングを用いて、ヌクレオチド配列を操作することができる。例えば、オリゴヌクレオチド介在性部位定方向突然変異を用いて、新しい制限部位を作製し、グリコシル化パターンを改変し、コドン選好を変更し、スプライス変異体を産生するなどの突然変異を導入することができる。

加えて、宿主細胞株を、挿入された配列の発現を調節するか、又は望ましい方法で発現されたポリペプチドを処理するその能力について選択することができる。ポリペプチドのそのような修飾としては、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、及びアシル化が挙げられるが、これらに限定されるものではない。例示的な実施形態では、特定のグリコシル化構造又はパターンを含む抗体が望ましい可能性がある。ポリペプチドの「プレプロ」形態を切断する翻訳後プロセッシングを用いて、タンパク質ターゲティング、フォールディング、及び／又は活性を規定することもできる。翻訳後活性について特異的な細胞機構及び特徴的な機構を有する種々の宿主細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、及びＷ１３８）は、商業的に入手可能であり、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から入手可能であり、発現されたポリペプチドの正しい修飾及びプロセッシングを確実にするために選択することができる。

当業者は、天然、修飾、又は組換え核酸配列を非相同配列にライゲートして、その結果、前記宿主系のいずれにおいても非相同ポリペプチド部分を含む融合ポリペプチドの翻訳をもたらすことができることを、容易に理解するであろう。そのような非相同ポリペプチド部分は、市販の親和性マトリックスを用いる融合ポリペプチドの精製を促進することができる。そのような部分としては、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質、チオレドキシン、カルモジュリン結合ペプチド、６−Ｈｉｓ（Ｈｉｓ）、ＦＬＡＧ、ｃ−ｍｙｃ、ヘマグルチニン（ＨＡ）、及び抗体エピトープ、例えばモノクローナル抗体エピトープが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

さらなる態様では、本発明は、融合タンパク質をコード化するヌクレオチド配列を含み得るポリヌクレオチドに関する。融合タンパク質は、本明細書中で記載するポリペプチド（例えば、完全軽鎖、完全重鎖、可変領域、ＣＤＲなど）と融合した融合パートナー（例えば、ＨＡ、Ｆｃなど）を含み得る。

当業者はさらに、核酸及びポリペプチド配列を、全部又は一部において、当該技術分野で周知の化学又は酵素法を用いて合成することができることを容易に認識するであろう。例えば、ペプチド合成は、種々の固相技術を用いて実施することができ、ＡＢＩ ４３１Ａペプチドシンセサイザー（ＰＥバイオシステムズ）などの機械を用いて合成を自動化することができる。所望により、アミノ酸配列を合成中に改変することができ、及び／又は他のタンパク質からの配列と組み合わせて、変異体タンパク質を産生することができる。

軽鎖可変ドメイン又は重鎖可変ドメインのうちの１つだけが利用可能である場合、当該技術分野で公知の方法を用いて相補性可変ドメインのライブラリをスクリーニングすることにより、抗体又は抗原結合フラグメントを再構成することができる（Portolano et al. The Journal of Immunology(1993) 150:880-887, Clarkson et al., Nature(1991) 352:624-628)。このように、所望の抗原結合特異性を有する無傷抗体を再構成するためには、可変領域アミノ酸配列（重鎖可変領域又は軽鎖可変領域）の１つだけがわかっていることで十分であることが多い。したがって、抗体の軽鎖可変領域又は重鎖可変領域をコード化する核酸は、互いに組み合わせた場合に、十分な抗原結合特異性を有する抗原結合フラグメント又は抗体を形成する相補性鎖の同定に有用であり得る。一本鎖核酸（例えば、オリゴ）又は抗体の軽鎖可変領域若しくは重鎖可変領域をコード化する核酸と高レベルの配列同一性を有するその補体は、後者を検出するために、又は高レベルの配列同一性を共有する任意の他の核酸配列を検出するために、有用であり得る。

したがって、さらなる態様において、本発明はさらに、本明細書中に記載するヒト化又はハイブリッド抗体の軽鎖可変領域及び／又は重鎖可変領域をコード化し、本明細書中に記載する抗原結合フラグメント又は本明細書中に記載する単離された抗体をコード化する、単離された核酸も提供する。

さらなる態様では、本発明は、本明細書中で記載する（単離された）核酸を含むベクター又は構築物を提供する。本発明によれば、ベクターは、例えば、ほ乳類発現ベクター、細菌発現ベクターなどであり得る。

本発明はさらに、本明細書中に記載する単離された核酸又は本明細書中に記載するベクターを含む単離された細胞も含む。本発明の抗体又は抗原結合フラグメントを発現する単離された細胞も本発明に含まれる。好適な細胞としては、例えば、ほ乳類細胞、細菌細胞などが挙げられる。

本発明のさらに別の態様は、ヒト化又はハイブリッド抗クラステリン抗体を作製する方法であって、クラステリンに対して特異的結合が可能な非ヒト抗体の非ヒト重鎖ＣＤＲアミノ酸残基を天然ヒト抗体重鎖可変領域のフレームワーク領域中に導入することを含み得る方法に関する。

本発明のさらなる態様は、ヒト化又はハイブリッド抗クラステリン抗体を作製する方法であって、クラステリンに対して特異的結合が可能な非ヒト抗体の非ヒト重鎖ＣＤＲアミノ酸残基及び天然ヒト抗体重鎖可変領域のフレームワーク領域アミノ酸を含む重鎖可変領域（又は完全重鎖）をコード化する核酸で細胞を形質転換することを含み得る方法に関する。この方法はさらに、相補性軽鎖可変領域（又は完全軽鎖）をコード化する核酸で細胞を形質転換することも含み得る。

別の態様では、本発明は、ヒト化又はハイブリッド抗クラステリン抗体を作製する方法であって、クラステリンに対して特異的結合が可能な非ヒト抗体の非ヒト重鎖ＣＤＲアミノ酸残基及び天然ヒト抗体重鎖可変領域のフレームワーク領域アミノ酸を含む重鎖可変領域（又は完全重鎖）を発現することを含み得る方法に関する。この方法はまた、相補性軽鎖可変領域（又は完全軽鎖）を発現することも含み得る。

ヒト化目的のために選択することができる天然ヒト抗体重鎖可変領域は以下の特性を有し得る：ａ）非ヒト抗体の重鎖に類似しているか、又は同一である（重ね合わせることができる）三次元構造、ｂ）非ヒト抗体の重鎖フレームワーク領域に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するフレームワーク領域、及び／又は；ｃ）非ヒト重鎖ＣＤＲアミノ酸残基と同じであるか又は実質的に同じである重鎖ＣＤＲ（例えば、３つすべてのＣＤＲ）中の（多数の）アミノ酸残基。

方法は、したがって例えば、非ヒト抗体の少なくとも２つのＣＤＲの非ヒト重鎖ＣＤＲアミノ酸残基を導入することを含み得る。ヒト化又はハイブリッド抗体を作製する方法で使用される核酸は、したがって、非ヒト抗体の少なくとも２つのＣＤＲをコード化することができる。ヒト化又はハイブリッド抗体を作製する方法で発現される重鎖可変領域は、したがって、非ヒト抗体の少なくとも２つのＣＤＲを含み得る。

方法は、好ましくは、３つすべてのＣＤＲの非ヒト重鎖ＣＤＲアミノ酸残基を導入することを含み得る。ヒト化又はハイブリッド抗体を作製する方法で使用される核酸は、したがって、非ヒト抗体の３つのＣＤＲをコード化することができる。ヒト化又はハイブリッド抗体を作製する方法で発現される重鎖可変領域は、したがって、非ヒト抗体の３つのＣＤＲを含み得る。

方法は、したがって配列番号１、配列番号２及び配列番号３のアミノ酸配列を含む非ヒトＣＤＲを導入することを含む。ヒト化又はハイブリッド抗体を作製する方法で使用される核酸は、したがって、配列番号１、配列番号２及び配列番号３をコード化することができる。ヒト化又はハイブリッド抗体を作製する方法で発現される重鎖可変領域は、したがって、配列番号１、配列番号２及び配列番号３を含み得る。

方法は、したがって、配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３のアミノ酸配列を含む非ヒトＣＤＲを導入することも含む。ヒト化又はハイブリッド抗体を作製する方法で使用される核酸は、したがって、配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３をコード化することができる。ヒト化又はハイブリッド抗体を作製する方法で発現される重鎖可変領域は、したがって、配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３を含み得る。

或いは、前記ＣＤＲの短いバージョンを天然ヒト抗体重鎖可変領域のフレームワーク領域に導入することができる。

本発明の方法は、クラステリンに対して特異的結合が可能な非ヒト抗体の非ヒト軽鎖ＣＤＲアミノ酸残基を天然ヒト抗体軽鎖可変領域のフレームワーク領域中に導入することをさらに含み得る。

本発明の方法は、クラステリンに対して特異的結合が可能な非ヒト抗体の非ヒト軽鎖ＣＤＲアミノ酸残基及び天然ヒト抗体軽鎖可変領域のフレームワーク領域アミノ酸を含む軽鎖可変領域（又は完全軽鎖）をコード化する核酸の発現を可能にすることを含み得る。この方法は、相補性重鎖可変領域（又は完全重鎖）をコード化する核酸で細胞を形質転換することも含み得る。

別の態様では、本発明は、ヒト化又はハイブリッド抗クラステリン抗体を作製する方法であって、クラステリンに対して特異的結合が可能な非ヒト抗体の非ヒト軽鎖ＣＤＲアミノ酸残基及び天然ヒト抗体軽鎖可変領域のフレームワーク領域アミノ酸を含む軽鎖可変領域（又は完全重鎖）を発現することを含み得る方法に関する。この方法は、相補性重鎖可変領域（又は完全重鎖）を発現することも含み得る。

ヒト化の目的で選択することができる天然ヒト抗体軽鎖可変領域は、次の特徴を有し得る：ａ）非ヒト抗体の軽鎖と類似しているか又は同一（重ね合わせが可能）である三次元構造、ｂ）非ヒト抗体の軽鎖フレームワーク領域と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するフレームワーク領域、及び／又は；ｃ）非ヒト軽鎖ＣＤＲアミノ酸残基と同じか又は実質的に同じである軽鎖ＣＤＲ（例えば、３つのＣＤＲ全て）中の（多数の）アミノ酸残基。

方法は、したがって、例えば、非ヒト抗体の少なくとも２つのＣＤＲの非ヒト軽鎖ＣＤＲアミノ酸残基を導入することを含み得る。ヒト化又はハイブリッド抗体を作製する方法で使用される核酸は、したがって、非ヒト抗体の少なくとも２つのＣＤＲをコード化することができる。ヒト化又はハイブリッド抗体を作製する方法で発現される軽鎖可変領域は、したがって、非ヒト抗体の少なくとも２つのＣＤＲを含み得る。

方法は、好ましくは、３つのＣＤＲ全ての非ヒト軽鎖ＣＤＲアミノ酸残基を導入することを含み得る。ヒト化又はハイブリッド抗体を作製する方法で使用される核酸は、したがって、非ヒト抗体の３つのＣＤＲをコード化することができる。ヒト化又はハイブリッド抗体を作製する方法で発現される軽鎖可変領域は、したがって、非ヒト抗体の３つのＣＤＲを含み得る。

方法は、したがって、配列番号４、配列番号５及び配列番号６のアミノ酸配列を含む非ヒトＣＤＲを導入することを含む。ヒト化又はハイブリッド抗体を作製する方法で使用される核酸は、したがって、配列番号４、配列番号５及び配列番号６をコード化することができる。ヒト化又はハイブリッド抗体を作製する方法で発現される軽鎖可変領域は、したがって、配列番号４、配列番号５及び配列番号６を含み得る。

方法は、したがって、配列番号１４、配列番号１５及び配列番号１６のアミノ酸配列を含む非ヒトＣＤＲを導入することも含む。ヒト化又はハイブリッド抗体を作製する方法で使用される核酸は、したがって、配列番号１４、配列番号１５及び配列番号１６をコード化することができる。ヒト化又はハイブリッド抗体を作製する方法で発現される軽鎖可変領域は、したがって、配列番号１４、配列番号１５及び配列番号１６を含み得る。

或いは、前記ＣＤＲの短いバージョンを天然ヒト抗体重鎖可変領域のフレームワーク領域中に導入することができる。

本発明のさらなる態様は、ヒト化抗クラステリン抗体を作製する方法であって、クラステリンに対して特異的結合が可能な非ヒト抗体の非ヒト重鎖ＣＤＲアミノ酸残基を天然ヒト抗体重鎖可変領域のフレームワーク領域中に導入し、そしてクラステリンに対して特異的結合が可能な非ヒト抗体の非ヒト軽鎖ＣＤＲアミノ酸残基を天然ヒト抗体軽鎖可変領域のフレームワーク領域中に導入することを含み得る方法に関する。

さらに、本発明のさらなる態様は、クラステリンに対して特異的結合が可能な非ヒト抗体の非ヒト重鎖ＣＤＲアミノ酸残基及び天然ヒト抗体重鎖可変領域のフレームワーク領域をコード化する核酸を発現させ、そしてクラステリンに対して特異的結合が可能な非ヒト抗体の非ヒト軽鎖ＣＤＲアミノ酸残基及び天然ヒト抗体軽鎖可変領域のフレームワーク領域をコード化する核酸を発現させることを含み得る、ヒト化抗クラステリン抗体を作製する方法に関する。

ヒト化の目的で選択することができる天然ヒト抗体重鎖可変領域は、次の特性：ａ）非ヒト抗体の重鎖フレームワーク領域に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するフレームワーク領域を含むこと、及び；ｂ）非ヒト重鎖ＣＤＲアミノ酸残基と同じであるか又は実質的に同じである重鎖ＣＤＲ（例えば、３つのＣＤＲ全て）中に（多数の）アミノ酸残基を有すること、を有し得、一方、ヒト化の目的で選択することができる天然ヒト抗体軽鎖可変領域は、次の特性：ａ）非ヒト抗体の軽鎖フレームワーク領域と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するフレームワーク領域を含むこと、及び；ｂ）非ヒト軽鎖ＣＤＲアミノ酸残基と同じか又は実質的に同じである軽鎖ＣＤＲ（例えば、３つのＣＤＲ全て）中に（多数の）アミノ酸残基を有すること、を有し得る。天然ヒト抗体可変領域（複数可）は、好ましくは、非ヒト抗体可変領域（複数可）と類似しているか又は同一（重ね合わせ可能）である三次元構造を有する。

本発明によれば、方法は、非ヒト抗体の少なくとも２つのＣＤＲの非ヒト重鎖ＣＤＲアミノ酸残基を導入することを含み得る。ヒト化又はハイブリッド抗体を作製する方法で使用される核酸は、したがって、非ヒト抗体の少なくとも２つのＣＤＲをコード化することができる。ヒト化又はハイブリッド抗体を作製する方法で発現される重鎖可変領域は、したがって、非ヒト抗体の少なくとも２つのＣＤＲを含み得る。

或いは、方法は、３つのＣＤＲ全ての非ヒト重鎖ＣＤＲアミノ酸残基を導入することを含み得る。ヒト化又はハイブリッド抗体を作製する方法で使用される核酸は、したがって、非ヒト抗体の３つのＣＤＲをコード化することができる。ヒト化又はハイブリッド抗体を作製する方法で発現される重鎖可変領域は、したがって、非ヒト抗体の３つのＣＤＲを含み得る。

また、本発明によれば、方法は、非ヒト抗体の少なくとも２つのＣＤＲの非ヒト軽鎖ＣＤＲアミノ酸残基を導入することを含み得る。ヒト化又はハイブリッド抗体を作製する方法で使用される核酸は、したがって、非ヒト抗体の少なくとも２つのＣＤＲをコード化することができる。ヒト化又はハイブリッド抗体を作製する方法で発現される軽鎖可変領域は、したがって、非ヒト抗体の少なくとも２つのＣＤＲを含み得る。

或いは、方法は、３つのＣＤＲ全ての非ヒト軽鎖ＣＤＲアミノ酸残基を導入することを含み得る。ヒト化又はハイブリッド抗体を作製する方法で使用される核酸は、したがって、非ヒト抗体の３つのＣＤＲをコード化することができる。ヒト化又はハイブリッド抗体を作製する方法で発現される軽鎖可変領域は、したがって、非ヒト抗体の３つのＣＤＲを含み得る。

本明細書中に記載する方法を使用して、配列番号１、配列番号２及び配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲを、有利には、天然ヒト抗体重鎖可変領域中に移入する。ヒト化又はハイブリッド抗体を作製する方法で使用される核酸は、したがって、配列番号１、配列番号２及び配列番号３をコード化することができる。ヒト化又はハイブリッド抗体を作製する方法で発現される軽鎖可変領域は、したがって、配列番号１、配列番号２及び配列番号３を含み得る。

本明細書中に記載する方法を使用して、配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲを、有利には、天然ヒト抗体重鎖可変領域中に移入する。ヒト化又はハイブリッド抗体を作製する方法で使用される核酸は、したがって、配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３をコード化することができる。ヒト化又はハイブリッド抗体を作製する方法で発現される軽鎖可変領域は、したがって、配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３を含み得る。

本明細書中に記載する方法を使用して、配列番号４、配列番号５及び配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲを、有利には天然ヒト抗体軽鎖可変領域中に移入する。ヒト化又はハイブリッド抗体を作製する方法で使用される核酸は、したがって、配列番号４、配列番号５及び配列番号６をコード化することができる。ヒト化又はハイブリッド抗体を作製する方法で発現される軽鎖可変領域は、したがって、配列番号４、配列番号５及び配列番号６を含み得る。

本明細書中に記載する方法を使用して、配列番号１４、配列番号１５及び配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲを、有利には天然ヒト抗体軽鎖可変領域中に移入する。ヒト化又はハイブリッド抗体を作製する方法で使用される核酸は、したがって、配列番号１４、配列番号１５及び配列番号１６をコード化することができる。ヒト化又はハイブリッド抗体を作製する方法で発現される軽鎖可変領域は、したがって、配列番号１４、配列番号１１５及び配列番号１６を含み得る。

別の態様では、本発明は、ヒト化又はハイブリッド抗クラステリン抗体を作製するための方法であって、本明細書中で記載される重鎖可変領域をコード化する核酸で宿主細胞を形質転換することを含む方法に関する。

好適な重鎖可変領域の例示的実施形態は、配列番号１、配列番号２及び配列番号３のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲ及び非ヒト抗体の重鎖フレームワーク領域に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有する天然ヒト抗体重鎖フレームワーク領域を含み得る非ヒト抗体の重鎖可変領域である。好ましくは、天然ヒト抗体は、非ヒト重鎖のＣＤＲ（例えば、３つのＣＤＲ全て）と同じであるか又は実質的に同じである（多数の）重鎖ＣＤＲアミノ酸残基を含み得る。

好適な重鎖可変領域の例示的実施形態は、配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲ及び非ヒト抗体の重鎖フレームワーク領域に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有する天然ヒト抗体重鎖フレームワーク領域を含み得る非ヒト抗体の重鎖可変領域である。好ましくは、天然ヒト抗体は、非ヒト重鎖のＣＤＲ（例えば、３つのＣＤＲ全て）と同じであるか又は実質的に同じである（多数の）重鎖ＣＤＲアミノ酸残基を含み得る。

本発明の方法は、相補性軽鎖をコード化する核酸で宿主細胞を形質転換することをさらに含み得る。

望ましいならば、相補性軽鎖は、重鎖をコード化するのと同じ核酸によってコード化され得る。

そのような相補性軽鎖は、配列番号４、配列番号５及び配列番号６のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲ及び非ヒト抗体の軽鎖フレームワーク領域と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有する天然ヒト抗体軽鎖フレームワーク領域を含み得る非ヒト抗体の軽鎖可変領域を含み得る。好ましくは、天然ヒト抗体は、非ヒト軽鎖のＣＤＲ（例えば、３つのＣＤＲ全て）と同じか又は実質的に同じである（多数の）軽鎖ＣＤＲアミノ酸残基を含み得る。

そのような相補性軽鎖は、配列番号１４、配列番号１５及び配列番号１６のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲ及び非ヒト抗体の軽鎖フレームワーク領域と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有する天然ヒト抗体軽鎖フレームワーク領域を含み得る非ヒト抗体の軽鎖可変領域を含み得る。好ましくは、天然ヒト抗体は、非ヒト軽鎖のＣＤＲ（例えば、３つのＣＤＲ全て）と同じか又は実質的に同じである（多数の）軽鎖ＣＤＲアミノ酸残基を含み得る。

更に別の態様では、本発明は、ヒト化又はハイブリッド抗クラステリン抗体を作製する方法であって、軽鎖可変領域をコード化する核酸で宿主細胞を形質転換することを含み得る方法に関する。

好適な軽鎖可変領域の例示的実施形態は、配列番号４、配列番号５及び配列番号６のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲ及び非ヒト抗体の軽鎖フレームワーク領域と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有する天然ヒト抗体軽鎖フレームワーク領域を含み得る非ヒト抗体の軽鎖可変領域である。好ましくは、天然ヒト抗体は、非ヒト軽鎖のＣＤＲ（例えば、３つのＣＤＲ全て）と同じか又は実質的に同じである（多数の）軽鎖ＣＤＲアミノ酸残基を含む。

好適な軽鎖可変領域の例示的実施形態は、配列番号１４、配列番号１５及び配列番号１６のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲ及び非ヒト抗体の軽鎖フレームワーク領域と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有する天然ヒト抗体軽鎖フレームワーク領域を含み得る非ヒト抗体の軽鎖可変領域である。好ましくは、天然ヒト抗体は、非ヒト軽鎖のＣＤＲ（例えば、３つのＣＤＲ全て）と同じか又は実質的に同じである（多数の）軽鎖ＣＤＲアミノ酸残基を含む。

本発明の方法は、相補性重鎖をコード化する核酸で宿主細胞を形質転換することをさらに含み得る。

望ましいならば、相補性重鎖は、軽鎖をコード化するのと同じ核酸によりコード化することができる。

抗体の医薬組成物及びそれらの使用
別の態様では、本発明は、例えば、本明細書中で記載するヒト化又はハイブリッド抗体、本明細書中に記載する抗原結合フラグメント又は本明細書中に記載する単離された抗体及び薬剤的に許容される担体を含み得る医薬組成物に関する。

本発明の更に別の態様は、本明細書中に記載する単離された抗体又は抗原結合フラグメントの、疾患の治療又は診断における使用に関する。

本発明のさらに別の態様は、本明細書中に記載する医薬組成物及び化学療法剤を含む併用療法に関する。

本発明によれば、医薬組成物は、化学療法剤と同時に投与され得る（投与可能である）。

また本発明によれば、医薬組成物及び化学療法剤は、異なる時間間隔で投与され得る（投与可能である）。

さらに本発明によれば、化学療法剤を抗体又は抗原結合フラグメントに共役させることができる。

活性成分に加えて、医薬組成物は、水、ＰＢＳ、塩溶液、ゼラチン、油、アルコール、並びに活性化合物を薬剤的に用いることができる製剤に加工するのを促進する他の賦形剤及び助剤を含む、薬剤的に許容される担体を含み得る。他の例では、そのような製剤を滅菌することができる。

本明細書中で用いられる場合、「医薬組成物」とは、薬剤的に許容される希釈剤、防腐剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント及び／又は担体とあわせた治療有効量の薬剤を意味する。「治療有効量」とは、本明細書中で用いられる場合、所定の状態及び投与法に対して治療効果を提供する量を指す。そのような組成物は、液体又は凍結乾燥若しくは他の方法で乾燥させた処方であり、種々の緩衝液内容物（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、ｐＨ及びイオン強度の希釈液、表面への吸収を防止するアルブミン又はゼラチンなどの添加剤、界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｔｗｅｅｎ ８０、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８、胆汁酸塩）を含む。可溶化剤（例えば、グリセロール、ポリエチレングリセロール）、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、防腐剤（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール、パラベン）、増量物質又は張性修飾剤（例えば、ラクトース、マンニトール）、ポリエチレングリコールなどのポリマーのタンパク質に対する共有結合、金属イオンとの錯体形成、或いはポリ乳酸、ポリグリコール酸、ヒドロゲルなどのポリマー化合物の粒子状製剤中若しくは上へ、或いはリポソーム、ミクロエマルジョン、ミセル、単層若しくは多重層ベシクル、赤血球ゴースト、又はスフェロプラスト上への物質の組み入れ。そのような組成物は、物理的状態、溶解度、安定性、インビボの放出速度、及びインビボのクリアランス速度に影響を及ぼすであろう。制御放出又は持続放出性組成物には、親油性デポー（例えば、脂肪酸、ワックス、油）中処方が含まれる。ポリマー（例えば、ポロキサマー又はポロキサミン）でコーティングされた粒子状組成物も本発明に含まれる。本発明の組成物の他の実施形態は、粒子状保護コーティング、プロテアーゼ阻害剤又は非経口、肺、鼻、経口、膣、直腸経路をはじめとする種々の投与経路のための浸透エンハンサーを組み入れる。一実施形態では、医薬組成物は、非経口、がん近傍（paracancerally）、経粘膜、経皮、筋肉内、静脈内、皮内、皮下、腹腔内、心室内、頭蓋内及び腫瘍内投与される。

さらに、本明細書中で用いられる場合、「薬剤的に許容される担体」又は「医薬担体」は、当該技術分野で公知であり、０．０１〜０．１Ｍ若しくは０．０５Ｍのリン酸塩緩衝液又は０．８％の食塩水が挙げられるが、これらに限定されるものではない。さらに、そのような薬剤的に許容される担体は、水性又は非水性溶液、懸濁液、及びエマルジョンであり得る。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、及びオレイン酸エチルなどの注入可能な有機エステルである。水性担体としては、水、アルコール性／水性溶液、エマルジョン又は懸濁液（食塩水及び緩衝化媒体を含む）が挙げられる。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル又は不揮発性油が挙げられる。静脈内ビヒクルには、流体及び栄養補給剤、電解質補給剤、例えばリンゲルデキストロースをベースとするものなどが含まれる。防腐剤及び他の添加剤、例えば、抗菌剤、酸化防止剤、照合剤（collating agent）、不活性ガスなども存在し得る。

本発明で利用される医薬組成物は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、鞘内、心室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻内、腸内、局所、舌下、又は直腸手段をはじめとするが、これらに限定されない様々な経路により投与することができる。

本開示のための「治療」という用語は、治療的処置及び予防的又は防止的手段の両方を指し、この場合、目的は、標的とされる病的状態又は障害を防止又は減速（低減）することである。治療を必要とする者としては、障害にすでに罹っている者並びに障害に罹りやすい者又は障害が予防されるべき者が挙げられる。

抗体及び抗原結合フラグメントは、種々の疾患の治療において治療的に有用であり得る。ある例では、抗体又は抗原結合フラグメントは、対象の抗原を発現する細胞と相互作用し、ＡＤＣＣを媒介することにより免疫学的反応を誘発することができる。他の例では、抗体又はフラグメントは、抗原とそのタンパク質パートナーとの相互作用をブロックすることができる。さらに別の例では、抗体又はフラグメントは抗原を隔離することができる。

「化学療法剤」は、がんの治療で有用な化合物である。化学療法剤の例としては、アルキル化剤、例えばチオテパ及びシクロホスファミド；スルホン酸アルキル、例えばブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファン；アジリジン、例えばベンゾドーパ、カルボコン、メツレドパ（meturedopa）及びウレドパ（uredopa）；エチレンイミン（ethylenimine）及びメチルメラミン（methylamelamine）例えば、アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド（trietylenephosphoramide）、トリエチレンチオホスホルアミド（triethylenethiophosphaoramide）及びトリメチロロメラミン（trimethylolomelamine）；窒素マスタード、例えばクロランブシル、クロマファジン（chlomaphazine）、コロホスファミド（cholophosphamide）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、酸化メクロレタミン塩酸塩、メルファラン、ノブエンビキン（novembichin）、フェネステリン、プレドニマスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソウレア（nitrosurea）、例えばカルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン；抗生物質、例えばアクラシノマイシン（aclacinomysin）、アクチノマイシン、オースラマイシン（authramycin）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアマイシン、カラビシン（carabicin）、カルミノマイシン、カルチノフィリン（carzinophilin）、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（potfiromycin）、ピューロマイシン、クエラマイシン（quelamycin）、ロドルビシン（rodorubicin）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；抗代謝剤、例えば例えばメトトレキサート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸類似体、例えばデノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート；プリン類似体、例えばフルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジン類似体、例えばアンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロキシウリジン；アンドロゲン、例えばカルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎皮質剤（anti-adrenals）、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補給剤、例えばフォリン酸（frolinic acid）；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトレキサート（edatraxate）；デフォファミン（defofamine）；デメコルチン；ジアジクオン；エルフォミチン（elfomithine）；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィドリン酸（podophyllinic acid）；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ７；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２’＝−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（gacytosine）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキサン、例えばパクリタキセル及びドセタキセル（doxetaxel）；クロランブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金類似体、例えばシスプラチン及びカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；エスペラミシン；カペシタビン；及び前記のいずれかの薬剤的に許容される塩、酸又は誘導体が挙げられる。腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように作用する抗ホルモン剤、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼを阻害する４（５）−イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、及びトレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）をはじめとする抗エストロゲン剤；並びに抗アンドロゲン剤、例えばフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド及びゴセレリン；並びに前記のいずれかの薬剤的に許容される塩、酸又は誘導体もこの定義に含まれる。

抗体共役体
本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、検出可能な部分と（すなわち、検出又は診断目的のために）又は治療的部分と（例えば、化学療法剤など、治療目的のために）共役させることができる。

「検出可能な部分」は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的及び／又は他の物理的手段により検出可能な部分である。検出可能な部分は、直接的及び／又は間接的（例えば、これらに限定されるものではないが、ＤＯＴＡ又はＮＨＳ結合などの結合により）のいずれかで本発明の抗体及びそれらの抗原結合フラグメントと、当該技術分野で周知の方法を用いてカップリングさせることができる。様々な検出可能部分を、必要とされる感受性、結合の容易さ、安定性要件及び利用可能な器具類に応じて選択して、使用することができる。好適な検出可能な部分としては、これらに限定されるものではないが、蛍光標識、放射性標識（例えば、限定されないが、^１２５Ｉ、Ｉｎ^１１１、Ｔｃ^９９、Ｉ^１３１であり、ＰＥＴスキャナー用のポジトロン発光同位体等を含む）、核磁気共鳴活性標識、発光標識、化学発光標識、発色団標識、酵素標識（例えば、これらに限定されないが、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）、量子ドット及び／又はナノ粒子が挙げられる。検出可能な部分は、検出可能なシグナルを生成及び／又は産生させることができ、それにより、検出可能な部分からのシグナルが検出されるのを可能にする。

本発明の別の例示的実施形態では、抗体又はその抗原結合フラグメントは、治療部分（例えば、薬剤、細胞毒性部分）をカップリング（修飾）させることができる。

例示的な実施形態では、抗体及び抗原結合フラグメントは、化学療法剤又は細胞毒性剤を含み得る。例えば、抗体及び抗原結合フラグメントを化学療法剤又は細胞毒性剤と結合させることができる。本出願の別の箇所で記載されているものに加えて、そのような化学療法薬又は細胞毒性剤としては、これらに限定されないが、イットリウム−９０、スカンジウム−４７、レニウム−１８６、ヨウ素−１３１、ヨウ素−１２５、及び当業者により認識されている他の多くのもの（例えば、ルテチウム（例えば、Ｌｕ^１７７）、ビスマス（例えば、Ｂｉ^２１３）、銅（例えば、Ｃｕ^６７））が挙げられる。他の例では、化学療法薬又は細胞毒性剤は、当業者に知られているものの中でも、５−フルオロウラシル、アドリアマイシン、イリノテカン、タキサン、シュードモナスエンドトキシン、リシン、及び他の毒素から構成されていてもよい。

或いは、本発明の方法を実施するために、また当該技術分野で公知のように、本発明の抗体又は抗原結合フラグメント（結合しているかどうかにかかわらず）と、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントと特異的に結合することができ、所望の検出可能部分、診断的部分又は治療的部分を有していてもよい第２の分子（例えば、二次抗体など）とを組み合わせて用いることができる。

治療法
本発明のさらなる態様は、クラステリンを発現するがん細胞の成長を低減するか、又はクラステリン発現細胞を含む腫瘍の容積を低減する方法に関する。この方法は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、単離されたヒト抗体、ハイブリッド抗体及びそのフラグメントなどの抗クラステリン抗体を、必要とするほ乳類に投与することを含み得る。

この方法は、化学療法剤を投与することをさらに含み得る。

本発明はまた、そのさらなる態様において、増大したクラステリン発現又は分泌と関連する疾患の治療法にも関する。この方法は、本明細書中で記載するヒト化若しくはハイブリッド抗体、本明細書中に記載する抗原結合フラグメント又は本明細書中に記載する単離された抗体を、必要とするほ乳類に投与することを含み得る。

そのような治療法から恩恵を受ける、必要とするほ乳類としては、例えば、がん腫を有するほ乳類、クラステリンレベルが上昇したほ乳類、血漿又は血液クラステリンレベルが上昇したほ乳類、上皮間葉移行が可能な細胞を有しているか又は有することが可能なほ乳類、クラステリン（プレクラステリン若しくは分泌されたクラステリン）又はクラステリン発現若しくは分泌（血液若しくは血漿クラステリンを含む）の増加したレベルに関連する疾患を有するほ乳類などを挙げることができる。

本発明の別の態様は、本明細書中で記載するヒト化又はハイブリッド抗体、本明細書中に記載する抗原結合フラグメント又は本明細書中に記載する単離された抗体の、クラステリン発現若しくは分泌に関連する疾患の治療用医薬の製造における使用に関する。

キット及びアッセイ
さらなる態様では、本発明は、例えば、本明細書中で記載するヒト化又はハイブリッド抗体、本明細書中に記載する抗原結合フラグメント又は記載される単離された抗体を含み得るバイアル（複数可）を含むキットを提供する。このキットは、検出目的又は治療目的で用いることができる。

別の例示的実施形態では、キットは、本明細書中に記載する単離された核酸又は本明細書中に記載するベクターを含み得る。そのようなキットは、相補性核酸の検出、或いはコード化するタンパク質の発現に有用であり得る。

本発明は、したがって、クラステリンを含むか又は含むことが疑われる試料を、本明細書中で記載するヒト化若しくはハイブリッド抗体、本明細書中に記載する抗原結合フラグメント又は記載される単離された抗体と接触させることにより、クラステリン（プレクラステリン及び分泌されたクラステリン）を検出する方法にも関する。検出は、抗原の抗体に対する結合を検出できる適切なセンサーを有する装置（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）、マイクロプレートリーダー、分光光度計など）で実施される。そのような装置は、コンピュータシステムを備えていてもよい。

本明細書中で用いられる場合、可変領域に関して「類似しているか、重ね合わせが可能な三次元構造」という用語は、コンピュータ処理されたモデルを使用すると、指定された可変領域が別の可変領域と類似した方法で抗原結合部位が暴露されるのを可能にする立体配座を有することを意味する。可変領域は、可変領域アミノ酸のコンピュータ処理された表示が別の可変領域の対応するアミノ酸と類似した空間での位置を占める場合、重ね合わせが可能であるとされる。

本明細書中で用いられる場合、「モデル化された可変領域」という用語は、密接に関連する抗体可変領域の既知三次元構造から得られる可変領域のコンピュータ処理された表示を意味する。

本明細書中で用いられる場合、「非ヒト」という用語は、齧歯類（例えば、マウス、ラットなど）、ウサギ又は非ヒト霊長類等を包含するが、これらに限定されるものではない。

本明細書中で用いられる場合、「非ヒト相補性決定領域アミノ酸残基」という用語は、したがって、相補性決定領域のアミノ酸残基が、非ヒト、典型的にはマウスなどの齧歯類に由来することを意味する。

本明細書中で用いられる場合、「非ヒト親抗体」という用語は、したがって、ヒト化手順の出発物質として用いられるヒト以外から得られる抗体を包含する。

「宿主細胞を形質転換する」という用語は、所望の核酸を宿主細胞中に移すか又は導入するための当該技術分野で公知のいくつかの技術を含む。そのような技術としては、感染、リポフェクション、注入、形質導入、ヌクレオフェクション（nucleofection）、エレクトロポレーション、ソノポレーション（sonoporation）、熱ショック、マグネトフェクション（magnetofection）などが挙げられるが、これらに限定されない。

非ヒト重鎖又は軽鎖ＣＤＲアミノ酸残基に関して「移入する」という用語は、物理的及びコンピュータ処理された方法、例えば、クローニング技術、核酸又はタンパク質の化学合成、コンピュータで生成させたヒト化抗体等を包含する。本明細書中で用いられる場合、アミノ酸の数に関して「実質的に同じ」という用語は、±３アミノ酸、又は好ましくは±２アミノ酸、又はなおいっそう好ましくは±１アミノ酸の変動が許容され得ることを意味する。

実施例１
抗クラステリンマウスモノクローナル抗体の設計によるヒト化
マウス１６Ｂ５モノクローナル抗体の可変領域の３Ｄモデリング
この作業は、２つの異なるマウス抗体（Protein Data Bank(PDB)コードはそれぞれ１Ｑ９Ｑ及び１ＴＹ７）の利用可能な結晶構造において３つの軽鎖残基及び７つの重鎖残基を突然変異させ、続いてテンプレート構造を重ね合わせることにより軽鎖及び重鎖をアセンブリすることによって、容易に達成された。ＣＤＲ−Ｈ３ループの一部は、１６Ｂ５の重鎖とも高い配列類似性を有するが、マウステンプレート構造とは異なり、ＣＤＲ−Ｈ３ループに関して同じ長さを示す、別の抗体構造（ＰＤＢコードＵＪ３、ヒト化抗体）に基づいていた。結果として得られる構造をＡＭＢＥＲ力場でのエネルギーの最小化により精製し、次いでその後の分析で使用した。この場合、利用可能な構造テンプレートに対してマウス１６Ｂ５配列の高い相同性が与えられるならば、結果として得られる相同性モデルは良好な品質であることが期待される。それにもかかわらず、本発明者等は、Ｍｏｄｅｌｌｅｒ又はＣｏｍｐｏｓｅｒなどの一般的な３Ｄ相同性モデリングプログラム又はＷＡＭソフトウェアで実施されるような抗体専門の３Ｄ相同性モデリングを用いることにより、マウス１６Ｂ５可変領域をモデル化した平行対照相同性モデリング実験で、匹敵する結果が得られた。マウス１６Ｂ５抗体のモデル化された可変領域を図１に示す。

１６Ｂ５源ドナー（マウス）アミノ酸配列及びモデル化構造の特性化
このステップを実施して、ヒト性指数を推定し、ＣＤＲ、カノニカル残基、鎖間充填（ＶＨ／ＶＬ界面残基）、可変領域／定常領域充填（ＶＨ／ＣＨ及びＶＬ／ＣＬ界面残基）、異常なフレームワーク残基、潜在的なＮ及びＯ−グリコシル化部位、埋没残基、バーニアーゾーン残基、並びにＣＤＲに対する近接性を表した。インターネットで利用可能な資料及びローカルソフトウェアを使用して、これらの特性を評価した。

マウスＣＤＲに対する最良のヒト軽鎖及び重鎖フレームワークの選択
最良のヒト軽鎖及び重鎖フレームワークの選択は、ヒト生殖細胞系データベース（ＶＢＡＳＥ）の局所コピー、他の配列ライブラリ（Ｇｅｎｂａｎｋ及びＳｗｉｓｓＰｒｏｔ）、並びにヒトフレームワークコンセンサス配列の組に対する標準配列相同性比較によっておこなった。ＢＬＡＳＴ検索を実施して、ＣＤＲループの長さが一致している一方で、フレームワーク領域のみ（したがって、ＣＤＲを除外する）で最高の相同性での配列一致を読み出した。ＰＤＢから同定された１６Ｂ５可変配列と最も類似したヒト又はヒト化可変配列の構造を、構造比較のために、１６Ｂ５可変領域のモデル化構造上に重ね合わせた。突然変異の候補位置でのアミノ酸のばらつきを評価するために、またヒト化に際して万一親和性消失の場合のバックアップとして好適なフレームワーク配列のプールを提供するために、いくつかの最も類似したヒトフレームワーク配列をまず保持した。最も近いヒトフレームワーク配列を図２でネズミ１６Ｂ５配列と整列させる。

立体配座及び抗原結合に影響を及ぼし得るマウスフレームワーク残基の同定
立体配座及び抗原結合に影響を及ぼし得るマウスフレームワーク残基の同定は、特に注意して対応するヒト配列に変異させなければならないアミノ酸を標識する重要なステップである。これらの残基は、親和性消失の場合に備えてマウス配列に対する復帰突然変異の第１候補である。これは、特に抗体−抗原複合体の実験的構造の非存在下での設計によるヒト化ステップの最も困難で予測不可能なステップである。このステップは、以下の１以上のカテゴリーでの残基の同定に依存する：カノニカル、ＣＤＲ−Ｈ３、バーニアーゾーン、異常、ＣＤＲ近接性（５Å以内）、鎖間充填、及びグリコシル化部位残基。これらの残基は、抗原結合部位及び親和性に直接的又は間接的に影響を及ぼす可能性がある。１６Ｂ５抗クラステリンｍＡｂの最終ヒト化配列は、ＣＤＲ領域を改変することなく、ネズミ配列に対して、軽鎖において１３のフレームワーク突然変異、及び重鎖において２２のフレームワーク突然変異を必要とする。驚くべきことに、慎重に構造及び比較配列分析すると、これら全ての突然変異を導入し、したがってＣＤＲグラフト技術により可能な最高のヒト化の程度（すなわち１００％、ＣＤＲを除外する）に達することを目的とすることにより、高い抗原結合親和性を保持する可能性が高いことが示された。デザインされたヒト化抗体の三次元モデリングは、この予測を支持する。それにもかかわらず、本発明者等は、ＣＤＲ近接残基（ＣＤＲから５Å以内に、軽鎖では３、重鎖では９）、重鎖と接触した１つの軽鎖残基，並びにマウス配列に戻る可能性がある複数の埋没残基（したがって、免疫原性である可能性が低い）（軽鎖では４、重鎖では６）をはじめとする復帰突然変異の候補残基を特定した。変異残基及び復帰突然変異の候補残基を図１及び図２に示す。

さらなる構造分析
ヒト化配列を組換え発現に付す前に、さらなる構造分析には、シグナルペプチドの選択、アイソタイプの選択、及び可変領域／定常領域接合点での構造適合性の分析が含まれていた。加えて、マウスとヒト化抗体との間の鎖間充填及び可変／定常領域充填の比較分析により、１６Ｂ５ヒト化の場合、ヒト化及びキメラ（マウス可変領域）鎖、すなわち、マウス／マウス（Ｍ／Ｍ）、マウス／ヒト化（Ｍ／Ｈ）、ヒト化／マウス（Ｈ／Ｍ）及びヒト化／ヒト化（Ｈ／Ｈ）を軽鎖／重鎖対形成として組み合わせがハイブリッド抗体の生成が可能であることが示された。抗クラステリン抗体について選択されたアイソタイプはヒトＩｇＧ２であった。ヒトＩｇＧ２は、本明細書中で開示するような阻止抗体の特質である強力なエフェクター機能を有さない。加えて、ヒトＩｇＧ２は、タンパク質分解により切断されにくく、これによりこのアイソタイプの抗体はインビボでより安定になる。

マウス２１Ｂ１２モノクローナル抗体の可変領域の３Ｄモデリング
２１Ｂ１２マウス抗クラステリン抗体のモデリングは、１６Ｂ５について前述した教唆にしたがって実施した。結果として得られるヒト化２１Ｂ１２は１００のヒト化であり、重鎖で１８の突然変異そして軽鎖で１４の突然変異を必要とした。変異した残基及び復帰突然変異の候補残基を図７及び図８に示す。

実施例２
抗クラステリン抗体の動態分析
これらの研究の目的は、抗クラステリン抗体の動態学的パラメータを決定することである。特に、１６Ｂ５及び２１Ｂ１２抗クラステリンモノクローナル抗体のヒト化がヒトクラステリンに対するその結合の動態学的パラメータに影響を及ぼすかどうかを判定することである。この目的のために、ＢＩＡｃｏｒｅ ３０００を用いた動態分析法を開発した。ヒトクラステリンをセンサーチップ上に固定した。完全長抗体又はＦａｂフラグメントを注入し、固定されたクラステリンと相互作用させた。この実施例は例示的抗体１６Ｂ５を記載したが、２１Ｂ１２例示的抗体を同様の方法で調製し、試験した。

クラステリンの固定化
ＨＢＳＴ（１０ｍＭのＨｅｐｅｓ ｐＨ７．４、１３５ｍＭのＮａＣｌ、３．４ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％のＴｗｅｅｎ２０）を全てのＢＩＡｃｏｒｅ実験についてランニングバッファーとして使用した。組換えモノマークラステリンをＣＭ３チップ上に通常のアミンカップリング法で５μｌ／分の流速にて固定した。表面を５０ｍＭのＮＨＳ／０．２ＭのＥＤＣの混合物３５μｌで活性化した。１０ｍＭの酢酸ナトリウムｐＨ４．５中クラステリンを、所望の量が捕捉されるまで注入した（６０ＲＵ未満）。未反応エステルを３５μｌの１Ｍエタノールアミン塩酸塩−ＮａＯＨ ｐＨ８．５で不活性化した。ＮＨＳ／ＥＤＣ及びエタノールアミンを同じ方法で注入することにより、対照表面を調製した。

ヒト化抗クラステリンＩｇＧ２抗体の調製
軽鎖及び重鎖免疫グロブリンをコード化するｃＤＮＡを含む発現ベクターを、当業者によく知られている一時的トランスフェクション法を用いて２９３細胞で発現させた。両方の免疫グロブリン鎖のアミノ末端で組み込まれたシグナルペプチドにより、成熟ＩｇＧ２を細胞の無血清培地から収集した。細胞の成長はトランスフェクション後５日間続き、その後、ＩｇＧ２キメラモノクローナル抗体の精製のために培地を収集した。タンパク質Ａアガロースを製造業者（シグマ・アルドリッチ・カナダ社（オンタリオ州オークビル））による指示どおりに使用して、タンパク質を精製した。

マウス１６Ｂ５及びＨＨ１６Ｂ５Ｆａｂの調製
パパインを１：１００のモル比で用いて、４時間、室温にてマウス１６Ｂ５ＩｇＧを処理した。４：１モル比のパパイン阻害剤Ｅ６４を添加することにより、消化を停止させた。１ｍｌのＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇカラム上クロマトグラフィーによりＦｃフラグメントからＦａｂフラグメントを分離した。Ｆａｂフラグメントを０．１Ｍのグリシン、ｐＨ２．７でカラムから溶出させた。１００μｌの２Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ９を含む管中に１ｍｌのフラクションを集めることにより、ｐＨを直ちに中和した。Ｆａｂ含有画分をプールし、３０ｋＤａのＭＷカットオフのＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ４遠心濃縮器で濃縮した。試料を、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ １２サイズ排除カラム（１０×３００ｍｍ）を通して、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、２００ｍＭのＮａＣｌ中で通過させて、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２の画分を分離した。Ｆａｂ含有フラクションをプールし、３０ｋＤａのＭＷカットオフのＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ４遠心濃縮器で濃縮した。

ＨＨ１６Ｂ５Ｆａｂの調製に関して、プロトコルは、消化時間が室温で２０時間であり、Ｆａｂ及びＦｃフラグメントをＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇカラムの代わりにＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａカラム上で分離する以外は、マウスＦａｂのプロトコルと非常に類似していた。Ｆ（ａｂ’）２の存在を除く目的で小規模の試験から得られた結果に基づいて消化時間を増加させた。サイズ排除プロフィールから、より長時間の消化によりＦ（ａｂ’）２フラグメントの存在は減少したが、完全には除去されなかったことが示された。タンパク質Ｇではなくむしろタンパク質Ａに切り替えて、Ｆａｂフラグメントをタンパク質Ｇから溶出るために必要な低いｐＨにＦａｂフラグメントが暴露されるのを回避した。Ｆａｂフラグメントはタンパク質Ａカラムを通って流れ、Ｆｃフラグメントはタンパク質Ａにより保持された。サイズ排除分離をＨＥＰＥＳ緩衝液の代わりにＰＢＳ中で実施した。同じ方法を用いて、２１Ｂ１２Ｆａｂフラグメントを調製した。

マウス１６Ｂ５及びＨＨ１６Ｂ５並びにＦａｂの動態学的分析
５０μｌ／分の流速で動態学的分析を実施した。完全長抗体（マウス若しくはヒト化）又はＦａｂをＨＢＳＴ中で希釈した。濃度範囲は、完全長抗体については１．９５３〜３１．２５ｎＭの範囲であり、Ｆａｂについては１５．６２５〜２５０ｎＭの範囲であった。各濃度をクラステリン及び対照表面上に５分間注入し、続いて５分間分離洗浄した。クラステリン表面は各抗体注入間で、５０μｌの２０ｍＭ ＨＣｌで再生した。

クラステリンに対する抗体結合の動態学的分析
図３は、１６Ｂ５完全長及びＦａｂ抗クラステリン抗体の動態学的パラメータの決定について得られた結果をまとめる。
完全長ヒト化１６Ｂ５（ＨＨ１６Ｂ５）の動態学的パラメータは、完全長マウス抗体（１６Ｂ５）の動態学的パラメータと非常に類似し、このことは、クラステリンに対する抗体の結合にヒト化が影響を及ぼさなかったことを示唆する。しかし、ヒト化１６Ｂ５Ｆａｂ（ＨＨ１６Ｂ５Ｆａｂ）の動態学的パラメータはＦａｂマウス抗体（１６Ｂ５Ｆａｂ）の動態学的パラメータよりも若干良好であり、このこともクラステリンに対する抗体の結合にヒト化が影響を及ぼさなかったことを示唆する。固定化ヒトクラステリンとマウス１６Ｂ５又はヒト化１６Ｂ５との間の相互作用のＫ_Ｄは低いｎＭ範囲にある。開発された方法を用いて抗クラステリン抗体のヒト化プロセス中の動態学的パラメータを比較することができる。

図９は、２１Ｂ１２完全長及びＦａｂ抗クラステリン抗体の動態学的パラメータを決定するために得られた結果をまとめる。１６Ｂ５について記載したように、２１Ｂ１２（ＨＨ２１Ｂ１２）のヒト化の結果、親マウス２１Ｂ１２抗体と類似した結合パラメータが得られた。固定化ヒトクラステリンとマウス２１Ｂ１２又はヒト化２１Ｂ１２との間の相互作用のＫ_Ｄは低ｎＭ範囲にある。開発された方法を用いて、抗クラステリン抗体のヒト化プロセス中の動態学的パラメータを比較することができる。

実施例３
細胞ベースのアッセイにおけるｈ１６Ｂ５の生物学的活性
これらの研究を実施して、ｈ１６Ｂ５の生物学的活性をマウス１６Ｂ５の生物学的活性と比較した。ｈ１６Ｂ５を試験するために、クラステリンをモノクローナル抗体でブロックすることによりがん細胞系の遊走及び浸潤を軽減できることを以前に示した２つのアッセイを用いた。

がん細胞遊走に対する抗クラステリン抗体の活性を試験するために、標準的創傷治癒、又はスクラッチアッセイを使用した。このアッセイでは、ＥＭＴ６細胞（マウス乳がん細胞系）を高密度で蒔き、細胞層に擦過傷を形成することにより傷つけた。０時で、広い露出した領域が明らかであり、これは細胞を３７℃で１５時間インキュベーションした後に直ちに埋まった（図４中、上の左側の図を参照）。市販の抗クラステリンポリクローナル（Ｃ−１８、サンタクルーズバイオテック（カリフォルニア州サンタクルーズ））又は元のハイブリドーマから精製されたマウス１６Ｂ５のいずれかの存在下で細胞をインキュベーションすると、露出した領域中の細胞数が減少した（図４中の上の右側の図を参照、市販及びハイブリドーマ１６Ｂ５と表示）。創傷ＥＭＴ６細胞を、キメラ１６Ｂ５（図４下側のパネルＭＭを参照）、キメラ軽鎖とヒト化重鎖を含むハイブリッド抗体（図４下側のパネルＭＨを参照）、キメラ重鎖とヒト化軽鎖を含むハイブリッド抗体（図４下側のパネルＨＭを参照）、又は完全ヒト化１６Ｂ５（図４下側のパネルＨＨを参照）とともにインキュベーションすることにより、細胞の露出した領域中への遊走もブロックされた。実際、ヒト化１６Ｂ５は最も有効な阻害剤であるように見えた。さらに、キメラ及びマウス−ヒトハイブリッド抗体が遊走を阻害する能力は、どの免疫グロブリン鎖が１６Ｂ５抗体中に含まれるかに関係なくクラステリンとの相互作用は同じであったことを示す。

本発明者らは次に、種々のレベルの内因性クラステリンを分泌する、ヒト前立腺ＰＣ３及びＤＵ１４５細胞系などの他の細胞系が、それらの浸潤行動及び増殖においてｈ１６Ｂ５により影響を受け得るかどうかを判定した。マトリゲル中に蒔いた場合（図５、上側左手のパネル）、ＰＣ３腫瘍細胞系は、マトリゲル中に伸びる突起を有する星状形態を示し、これは浸潤性の増大と相関づけられている特性である（Thompson et al., 1992）。ｈ１６Ｂ５での処理（図５、上側右手のパネル）は、この星状形態を著しく低減し、このことは、クラステリン分泌がＰＣ３細胞の浸潤性の表現型に寄与することを強く示唆する。ＤＵ１４５細胞は、ＰＣ３細胞で観察される星状形態を示さず、むしろマトリゲル中で球状構造を形成し（図５、下側左手のパネル）、これはｈ１６Ｂ５の存在下で小さく、数も少ないようであった（図５、下側右手のパネル）。これらの結果は、ｈ１６Ｂ５ががん細胞系の浸潤性を低減する能力は、元のマウス１６Ｂ５に匹敵することを示し、またヒト化プロセスは、抗体が分泌されたクラステリンの活性と相互作用し、ブロックする能力を改変しなかったことを示す。

４つの異なるヒト膵臓細胞系由来の腫瘍を得、これをホルマリン中で固定し、パラフィン中に埋め、そしてスライドガラス上に切片を載せた。免疫組織化学をｈ１６Ｂ５抗体で実施して、このがん徴候由来の腫瘍がクラステリンを発現したかどうかを判定した。腫瘍は、Ａｓｐｃ−１、ＢｘＰＣ−３、ＰＡＮＣ−１、及びＭｉａＰａＣａ−２由来であり、これらはすべて膵臓がん患者由来であった（ＡＴＣＣ（バージニア州マナッサス））。パラフィン包埋上皮膵臓腫瘍試料をスライドガラス上に置き、１５分間５０℃で固定した。２回キシレンで処理することによりパラフィン除去を実施し、続いて連続して５分間、１００％、８０％、及び７０％エタノール中で洗浄して脱水した。スライドをＰＢＳ中で２回、５分間洗浄し、抗原回復溶液（クエン酸−ＥＤＴＡ）で処理して、抗原を曝露（ｕｎｍａｓｋ）した。スライドをＨ_２Ｏ_２とともにメタノール中でインキュベートすることにより内因性過酸化物反応性種を除去し、スライドを無血清ブロッキング溶液（ダコサイトメーション）とともに２０分間室温でインキュベートすることによってブロッキングを実施した。一次ｍＡｂ（対照ＩｇＧ又はｈ１６Ｂ５）を５μｇ／ｍｌで１時間、室温にて添加した。ビオチン結合ヒト抗カッパと、続いてストレプトアビジン−ＨＲＰ３次抗体とともにインキュベートすることによって、Ｈ１６Ｂ５反応性クラステリンを検出した。スライドをＤＡＢ−過酸化水素基質で５分未満処理し、その後、ヘマトキシリンで対比染色することによって、陽性染色が明らかになった。図１１で示すように、４つの腫瘍すべてがクラステリン発現について陽性染色された（図１１の右手パネルを参照）。興味深いことに、化学療法に対して耐性であることが知られている腫瘍（ＰＡＮＣ−１及びＭｉｓＰａＣａ−２）は最高レベルの分泌されたクラステリンを含んでいた。ＰＡＮＣ−１細胞系を前立腺がん細胞系について記載したようにして、マトリゲル中で培養し、成長させた（前記参照）。細胞をＴＧＦβ、並びに上皮間葉移行のインデューサー及び成長因子で刺激し、それにより細胞は膜を越えてマトリゲル中に遊走する（図１２、上側の右手パネルを参照）。刺激された細胞をｈ１６Ｂ５で処理すると、遊走は高度に阻害された（図１２、下側右手パネル）。この結果は、ｈ１６Ｂ５が膵臓がん細胞の遊走をブロックすることができることを示し、抗体はこのがん徴候でも治療活性である可能性を有することを示す。

実施例４
がんの動物モデルにおけるｈ１６Ｂ５の生物学的活性
これらの研究を実施して、ヒトがんのモデルにおいてｈ１６Ｂ５のインビボ有効性を測定した。アンチセンスオリゴヌクレオチド及び低分子干渉ＲＮＡターゲティングクラステリンは、前立腺がん異種移植片において、アポトーシス及びインビトロ化学受容性を誘導することが報告されている［１−４］。使用したモデル系は、アンドロゲン非感受性であり、この疾患の最もよく特性化されたモデルのうちの１つであるＤＵ１４５ヒト前立腺がん細胞系を含んでいた。したがって、２００万個の細胞をＳＣＩＤマウスの脇腹に皮下移植し、腫瘍を約１００ｍｍ^３まで増殖させた。第１日に始めて、ｈ１６Ｂ５を５ｍｇ／ｋｇの投与量で腹腔内（ｉ．ｐ．）注射し、そして第４日から、タキソテレ（ＴｘＴ）を１０ｍｇ／ｋｇの投与量でｉ．ｐ．注射した。ｈ１６Ｂ５注入を１週間に２回続け、その間、ＴｘＴを毎週投与した。図６で表すように、（原発）腫瘍の成長は、ｈ１６Ｂ５治療を受けた動物では対照と比較して有意に減少した。この効果は、単独療法群（対照をｈ１６Ｂ５と比較、Ｐ＝０．０１０４）及びＴｘＴとの併用群（ＴｘＴをｈ１６Ｂ５＋ＴｘＴと比較、Ｐ＝０．０３９５）の両方で起こった。この結果は、ｈ１６Ｂ５でのクラステリンのブロッキングは、腫瘍成長減少を引き起こし、ＴｘＴに関する腫瘍の化学受容性を増大させることを示す。

ＰＣ−３前立腺がん細胞を移植することにより、異なる腫瘍モデルにおいて、第２の前立腺がんモデル研究を実施した。ＰＣ−３細胞はホルモン非感受性でもあるが、ＤＵ１４５細胞よりも若干侵入性が高いことが文書に記載されている。上述のように、細胞をＳＣＩＤマウスに皮下移植し、腫瘍が約１００ｍｍ^３の容積に達した時点で（第１日と指定する）、治療を開始した。ｈ１６Ｂ５注射を第１日に５ｍｇ／ｋｇでｉ．ｐ．投与し、その後、１週間に２回続け、一方、１０ｍｇ／ｋｇの１回のＴｘＴ注射を第５日にｉ．ｐ．投与した。ＴｘＴスケジュールでこの変更を実施した。なぜなら、ＰＣ−３細胞はＤＵ１４５腫瘍と比較してこの化学療法薬に対して著しく感受性が高いことが判明したからである。

この研究の結果を図１０に示す。前述のように、ｈ１６Ｂ５のみを受けた動物における腫瘍は未治療の動物と比較してほぼ即時の応答を有することが観察された。ｈ１６Ｂ５治療群において平均腫瘍サイズが有意に減少し、その結果、第４３日で対照群と比較して、３７％減少することが判明した。生存もモニタリングし、対照群で動物が残っていない日（第４３日）に、ＡＢ−１６Ｂ５治療群では６０％を越えるマウスが生き残っていることが観察された。全体的な生存率におけるこの増加は、ｈ１６Ｂ５を受けた動物における４７％増加に変換できた。

前立腺がん細胞に対するＴｘＴの細胞毒性効果が観察されたが、腫瘍は注射後約１８日でこの治療から回復するように見えた。ＴｘＴ群における腫瘍の成長は、ＡＢ−１６Ｂ５を受けた群の腫瘍を上回ってさえいた（第５０日、図１０を参照）。しかし、ｈ１６Ｂ５とＴｘＴとの組み合わせは、腫瘍の成長を有意に遅らせ、その結果、腫瘍はＴｘＴ単独群と比較して４１％小さくなった。ここでも、ｈ１６Ｂ５の存在は動物の生存を延長した。まとめると、これらのインビボ研究から得られた結果は、腫瘍における分泌されたクラステリンの機能を阻害するｈ１６Ｂ５ヒト化抗体は、固形腫瘍の成長を有意に遅らせることができることを示す。

実施例５
Ｈ１６Ｂ５はがん細胞における分泌されたクラステリンの内在化を阻害する
前記開示の結果は、上皮間葉移行（ＥＭＴ）の誘導が、がん細胞によるクラステリンの分泌に至ることを示す。さらに、本発明者等のデータは、これらのがん細胞によって分泌されるクラステリンがＥＭＴの強力なインデューサーであることも示す。これらの発見は、分泌されたクラステリンが細胞外マトリックスにおける他の腫瘍関連因子との相互作用により間接的に、又はがん細胞の細胞表面上の受容体との相互作用により直接的に、のいずれかでこの効果を媒介することを意味する。正常な血清中に存在する分泌されたクラステリンは、補体カスケードの成員、レプチン、種々のアポリポタンパク質などの多くの異なるタンパク質に伴うすることが知られているが、がん細胞中又は腫瘍微環境中の分泌されたクラステリンのタンパク質パートナーの存在は、まだ比較的明らかになっていない。数例には、Ｊｏ及び共同研究者らにおる公開された報告（Jo et al., 2008）があり、血清除去により誘導されるストレス条件下で腫瘍が分泌するクラステリンはＩＧＦ−１に伴ったことが示された。加えて、前立腺がん細胞系中に含まれるクラステリンは、ＣＯＭＭＤ１と呼ばれるタンパク質と相互作用することが見出された（Zoubeidi et al., 2010）。この相互作用の結果、ＮＦ−カッパＢ関連経路の活性化が増大し、これにより次に前立腺がん細胞生存が促進された。これらの知見により、分泌されたクラステリンが腫瘍形成に寄与し得る方法のいくつかを解明され始めているが、それがどのようにＥＭＴを促進するかについての分子機構は知られていない。

この問題に取り組み始めるために、細胞ベースの実験を実施して、分泌されたクラステリンが、がん細胞と直接相互作用するか、細胞培地中の他の分泌された因子を介してであるかを判定した。これを測定するために、分泌されたクラステリンを蛍光標識し、ＢＲＩ−ＪＭ０１マウス乳がん細胞とともにインキュベートした。処理に２４時間後に、蛍光シグナルが細胞の内部に含まれているのが見出された。短い時点にわたるこれらの細胞の分析により、蛍光標識され、分泌されたクラステリンが細胞により内在化されたことが明らかになった（図１３を参照）。示されるように、内在化は、受容体依存性エンドサイトーシス経路と一致して時間と共に増加する。さらに、２４時間後に生じる染色の斑点状及び核周辺パターン（図１３中の白色矢印を参照）が、エンドソーム経路に沿って内在化されるタンパク質中でしばしば観察される。類似の結果がＤＵ１４５ヒト前立腺がん細胞で観察された。

ｈ１６Ｂ５がこの活性をブロックできるかどうかを試験することにより、この分泌されたクラステリン内在化をさらに調べた。ｈ１６Ｂ５又はアイソタイプ対照ＩｇＧの存在下で分泌されたクラステリン−Ａｌｅｘａ４８０で細胞を処理した。図１４で示されるように、分泌されたクラステリンのＪＭ０１細胞中への内在化は、ｈ１６Ｂ５の添加によりブロックされた。分泌されたクラステリンの内部核周囲染色が、対照ＩｇＧで処理された細胞において依然として観察された（図１４中の白色矢印を参照）。

まとめると、分泌されたクラステリンの内在化がｈ１６Ｂ５の添加によって阻害され得ることを示すこれらの結果から、これは、抗体が分泌されたクラステリンにがん細胞におけるＥＭＴを媒介させない機構の一つであり得ることが示唆される。

本明細書中で記載する実験は、（例えば、可変領域（複数可）、定常領域、フレームワーク領域又はＣＤＲ（複数可）における）抗体のアミノ酸配列における特異的突然変異がどのように抗体の生物学的活性に影響を及ぼすかを判定するために実施することができる。例えば、１以上の突然変異がｈ１６Ｂ５の可変軽鎖又は可変重鎖のフレームワーク領域（又はネズミ１６Ｂ５）中に導入され得、そして腫瘍成長を本明細書中で記載するようにして評価することができる。

変異体抗体及び抗原結合フラグメントのヒト又はネズミクラステリンに対する結合は、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、表面プラズモン共鳴などのいくつか当該技術分野で公知の方法によって試験することができる。

実施例６
抗クラステリン抗体はクラステリン変異体と結合することができる
本発明の抗体及び抗原結合フラグメントは、クラステリンのヒト及びネズミ形態の両方と結合する。これらの２つのタンパク質は、７７％のアミノ酸配列同一性及び８９％の類似性を共有する（図１５を参照）。ネズミ及びヒト形態のアミノ酸配列を比較することにより、抗体がおそらくは両タンパク質において保存される線状又は立体構造エピトープと結合することを理解できる。抗体及び抗原結合フラグメントは、ヒト又はネズミクラステリンと少なくとも７５％のアミノ酸同一性（８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、１００％を包含する）を有する他の天然に存在する変異体並びに合成変異体（組換えタンパク質を含む）と結合することができると予想される。例えば、抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号５６（ここで、＋は例えば保存的アミノ酸置換などのアミノ酸置換を表す）又は配列番号５７を含むアミノ酸配列を有するクラステリン変異体と結合することができる。

本発明は、抗クラステリン抗体がヒト腫瘍において発現されるクラステリンを標的とすることを示す。抗クラステリン抗体、例えばｈ１６Ｂ５の、ネズミ腫瘍クラステリンとの相互作用を示すために、４Ｔ１マウス乳房腫瘍から調製した凍結切片をｈ１６Ｂ５とともにインキュベートした。手短に言うと、凍結切片を氷冷アセトンで１０分間固定し、非特異的結合を市販のキット（ダコ・カナダ社（Dako Canada, Inc.）、オンタリオ州バーリントン）中で供給される試薬でブロックした。Ｈ１６Ｂ５をマウス腫瘍切片とともに１時間、５μｇ／ｍｌの濃度でインキュベートした。洗浄後、特異的染色を、ＨＲＰ共役抗ヒトＩｇＧとともにインキュベートすることによって明らかにした。対照試料をヒトアイソタイプ対照ＩｇＧと同じ方法で処理した。図１６で示すように、ホースラディッシュペルオキシダーゼ着色から生じる褐色の着色により明らかなように、ｈ１６Ｂ５は４Ｔ１腫瘍においてネズミクラステリンを検出した（右パネルを参照、４Ｔ１−ＡＢ−１６Ｂ５として表示）。対照抗体は抗原を明らかにしなかった（左のパネルを参照、４Ｔ１−ｃｔｌとして表示）。この結果は、ｈ１６Ｂ５により例示されるような抗クラステリン抗体が、マウス腫瘍で発現されるネズミクラステリンと相互作用することを示す。加えて、免疫蛍光法を用いた他の研究により、ｈ１６Ｂ５が、別のマウス乳がん細胞系であるＢＲＩ−ＪＭ０１細胞で発現されたネズミクラステリンを検出したことが示された。

本発明の抗体及び抗原結合フラグメントの、天然に存在する変異体又はクラステリンの合成変異体に対する結合は、例えば、前記方法をはじめとする当該技術分野で公知の方法により試験することもできる。

ＣＬＵ遺伝子は、ヒト、チンパンジー、イヌ、ウシ、マウス、ラット、ニワトリ及びゼブラフィッシュで保存されている。これらのモデルにおける抗体及び抗原結合フラグメントの試験は、本発明に含まれる。

［参考文献］

Claims (111)

1. クラステリンを発現又は分泌している細胞を含む腫瘍の体積を縮小するための抗クラステリン抗体の使用。
2. 前記抗クラステリン抗体が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、単離されたヒト抗体、ハイブリッド抗体及びそれらの断片からなる群から選択される、請求項１に記載の使用。
3. 前記ハイブリッド抗体又はその断片が、非ヒト抗体の軽鎖可変領域及びヒト化抗体の重鎖可変領域を含む、請求項２に記載の使用。
4. 前記ハイブリッド抗体又はその断片が、非ヒト抗体の重鎖可変領域及びヒト化抗体の軽鎖可変領域を含む、請求項２に記載の使用。
5. 前記腫瘍が子宮内膜癌、乳癌、肝細胞癌、前立腺癌、腎細胞癌、卵巣癌、膵癌、結腸直腸癌からなる群から選択される癌腫である、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の使用。
6. 前記癌腫が前立腺癌腫である、請求項５に記載の使用。
7. 前記癌腫が乳癌である、請求項５に記載の使用。
8. 非ヒト親抗体由来のヒト化抗体又はハイブリッド抗体であって、前記ヒト化抗体が、非ヒト相補性決定領域アミノ酸残基及び天然ヒト抗体のヒトフレームワーク領域アミノ酸残基を含む重鎖可変領域並びに相補的軽鎖を含み、前記ヒト化抗体又はハイブリッド抗体がクラステリンに特異的に結合する、抗体。
9. 前記天然ヒト抗体が非ヒト親抗体の可変領域と同様の三次元構造を有する可変領域を含む、請求項８に記載のヒト化抗体又はハイブリッド抗体。
10. 前記ヒト化抗体がクラステリン発現細胞又はクラステリン分泌細胞の遊走、浸潤又は増殖を阻害する、請求項８に記載のヒト化抗体又はハイブリッド抗体。
11. ４．４９ｘ１０^−９Ｍ±８．５ｘ１０^−１０又はそれより良好な親和性を特徴とする、請求項８ないし１０のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はハイブリッド抗体。
12. 前記相補的軽鎖が，非ヒト親抗体の軽鎖フレームワーク領域と少なくとも７０％の同一性を有し，軽鎖相補性決定領域中に非ヒト親抗体の対応する軽鎖相補性決定領域のアミノ酸と同一又は実質的に同一であるアミノ酸を有する天然ヒト抗体軽鎖フレームワーク領域由来のヒトフレームワーク領域アミノ酸を含む、請求項８ないし１１のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はハイブリッド抗体。
13. 前記ヒトフレームワーク領域アミノ酸残基が、非ヒト親抗体の軽鎖フレームワーク領域と少なくとも８０％の同一性を有する天然ヒト抗体軽鎖フレームワーク領域に由来する、請求項１２に記載のヒト化抗体又はハイブリッド抗体。
14. 前記ヒトフレームワーク領域アミノ酸残基が、非ヒト親抗体の軽鎖フレームワーク領域と少なくとも８３％の同一性を有する天然ヒト抗体軽鎖フレームワーク領域に由来する、請求項１３に記載のヒト化抗体又はハイブリッド抗体。
15. 前記ヒト化抗体Ｈ鎖のヒトフレームワーク領域アミノ酸残基が，非ヒト親抗体のＨ鎖フレームワーク領域と少なくとも７０％の同一性を有し，非ヒト親抗体の対応するＨ鎖相補性決定領域のアミノ酸と同一又は実質的に同一であるいくつかのアミノ酸をＨ鎖相補性決定領域中に有する，天然ヒト抗体Ｈ鎖フレームワーク領域に由来する，請求項８ないし１４のいずれかに記載のヒト化抗体又はハイブリッド抗体。
16. 前記ヒト化抗体重鎖のヒトフレームワーク領域アミノ酸残基が、非ヒト親抗体の重鎖フレームワーク領域と少なくとも７３％の同一性を有する天然ヒト抗体重鎖フレームワーク領域に由来する、請求項１５に記載のヒト化抗体又はハイブリッド抗体。
17. 前記ヒト化抗体重鎖のヒトフレームワーク領域アミノ酸残基が、非ヒト親抗体の重鎖フレームワーク領域と少なくとも８０％の同一性を有する天然ヒト抗体重鎖フレームワーク領域に由来する、請求項１６に記載のヒト化抗体又はハイブリッド抗体。
18. 前記重鎖可変領域が少なくとも１つの非ヒト相補性決定領域を含む、請求項８ないし１７のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はハイブリッド抗体。
19. 前記重鎖可変領域が少なくとも２つの非ヒト相補性決定領域を含む、請求項１８に記載のヒト化抗体又はハイブリッド抗体。
20. 前記重鎖可変領域が３つの非ヒト相補性決定領域を含む、請求項１９に記載のヒト化抗体又はハイブリッド抗体。
21. 前記軽鎖可変領域が少なくとも１つの非ヒト相補性決定領域を含む、請求項８ないし２０のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はハイブリッド抗体。
22. 前記軽鎖可変領域が少なくとも２つの非ヒト相補性決定領域を含む、請求項２１に記載のヒト化抗体又はハイブリッド抗体。
23. 前記軽鎖可変領域が３つの非ヒト相補性決定領域を含む、請求項２２に記載のヒト化抗体又はハイブリッド抗体。
24. 前記クラステリン発現細胞が癌細胞である、請求項８に記載のヒト化抗体又はハイブリッド抗体。
25. 前記癌細胞がヒト癌細胞である、請求項２４に記載のヒト化抗体又はハイブリッド抗体。
26. 前記ヒト癌細胞が、子宮内膜癌、乳癌、肝細胞癌、前立腺癌、腎細胞癌、卵巣癌、メラノーマ、膵癌、肺癌、膀胱癌及び結腸直腸がんからなる群から選択される癌腫に由来する、請求項２５に記載のヒト化抗体又はハイブリッド抗体。
27. 前記癌腫が前立腺癌である、請求項２６に記載のヒト化抗体又はハイブリッド抗体。
28. 前記癌腫が乳癌である、請求項２６に記載のヒト化抗体又はハイブリッド抗体。
29. ａ．配列番号２５に対して少なくとも８０％同一である軽鎖可変領域及び／又は配列番号２９に対して少なくとも８０％同一である重鎖可変領域を有し、配列番号２５又は配列番号２９と比べて少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、ここで前記アミノ酸置換が相補性決定領域（ＣＤＲ）の外側にある、抗体又は抗原結合性フラグメント；並びに
    ｂ．配列番号３３に対して少なくとも８０％同一である軽鎖可変領域及び／又は配列番号３７に対して少なくとも８０％の同一である重鎖可変領域を有し、配列番号３３又は配列番号３７と比べて少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、ここで前記アミノ酸置換が相補性決定領域（ＣＤＲ）の外側にある、抗体又は抗原結合性フラグメント、
    からなる群から選択される、クラステリンに特異的に結合できる抗体又は抗原結合性フラグメント。
30. 前記少なくとも１つのアミノ酸置換が軽鎖可変領域の中に存在する、請求項２９に記載の抗体又は抗原結合性フラグメント。
31. 前記アミノ酸置換が重鎖可変領域の中に存在する、請求項２９又は３０に記載の抗体又は抗原結合性フラグメント。
32. 前記アミノ酸置換が保存的である、請求項２９ないし３１のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合性フラグメント。
33. 前記軽鎖可変領域が配列番号２６の少なくとも９０個の連続するアミノ酸を含む、請求項２９ないし３２のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合性フラグメント。
34. 前記軽鎖可変領域が配列番号２７の少なくとも９０個の連続するアミノ酸を含む、請求項３３に記載の抗体又は抗原結合性フラグメント。
35. 前記軽鎖可変領域が配列番号２８の少なくとも９０個の連続するアミノ酸を含む、請求項３４に記載の抗体又は抗原結合性フラグメント。
36. 前記軽鎖可変領域が配列番号８の少なくとも９０個の連続するアミノ酸を含む、請求項３５に記載の抗体又は抗原結合性フラグメント。
37. 前記軽鎖可変領域が配列番号８に記載されている、請求項３６に記載の抗体又は抗原結合性フラグメント。
38. 前記重鎖可変領域が配列番号３０の少なくとも９０個の連続するアミノ酸を含む、請求項２９ないし３７のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合性フラグメント。
39. 前記重鎖可変領域が配列番号３１の少なくとも９０個の連続するアミノ酸を含む、請求項３８に記載の抗体又は抗原結合性フラグメント。
40. 前記重鎖可変領域が配列番号３２の少なくとも９０個の連続するアミノ酸を含む、請求項３９に記載の抗体又は抗原結合性フラグメント。
41. 前記重鎖可変領域が配列番号７の少なくとも９０個の連続するアミノ酸を含む、請求項４０に記載の抗体又は抗原結合性フラグメント。
42. 前記重鎖可変領域が配列番号７に記載されている、請求項４１に記載の抗体又は抗原結合性フラグメント。
43. 前記軽鎖可変領域が配列番号２６の少なくとも９０個の連続するアミノ酸配列を含み、前記重鎖可変領域が配列番号３０の少なくとも９０個の連続するアミノ酸配列を含む、請求項２９に記載の抗体又は抗原結合性フラグメント。
44. 前記軽鎖可変領域が配列番号２７の少なくとも９０個の連続するアミノ酸配列を含み、前記重鎖可変領域が配列番号３１の少なくとも９０個の連続するアミノ酸配列を含む、請求項４３に記載の抗体又は抗原結合性フラグメント。
45. 前記軽鎖可変領域が配列番号２８の少なくとも９０個の連続するアミノ酸配列を含み、前記重鎖可変領域が配列番号３２の少なくとも９０個の連続するアミノ酸配列を含む、請求項４４に記載の抗体又は抗原結合性フラグメント。
46. 前記軽鎖可変領域が配列番号８の少なくとも９０個の連続するアミノ酸配列を含み、前記重鎖可変領域が配列番号７の少なくとも９０個の連続するアミノ酸配列を含む、請求項４５に記載の抗体又は抗原結合性フラグメント。
47. 前記軽鎖可変領域が配列番号８に記載されており、前記重鎖可変領域が配列番号７に記載されている、請求項４６に記載の抗体又は抗原結合性フラグメント。
48. 前記軽鎖可変領域が配列番号３４の少なくとも９０個の連続するアミノ酸を含む、請求項２９ないし３２のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合性フラグメント。
49. 前記軽鎖可変領域が配列番号３５の少なくとも９０個の連続するアミノ酸を含む、請求項４８に記載の抗体又は抗原結合性フラグメント。
50. 前記軽鎖可変領域が配列番号３６の少なくとも９０個の連続するアミノ酸を含む、請求項４９に記載の抗体又は抗原結合性フラグメント。
51. 前記軽鎖可変領域が配列番号１８の少なくとも９０個の連続するアミノ酸を含む、請求項５０に記載の抗体又は抗原結合性フラグメント。
52. 前記軽鎖可変領域が配列番号１８に記載される、請求項５１に記載の抗体又は抗原結合性フラグメント。
53. 前記重鎖可変領域が配列番号３８の少なくとも９０個の連続するアミノ酸を含む、請求項２９ないし３２又は４８ないし５２のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合性フラグメント。
54. 前記軽鎖可変領域が配列番号３９の少なくとも９０個の連続するアミノ酸を含む、請求項５３に記載の抗体又は抗原結合性フラグメント。
55. 前記軽鎖可変領域が配列番号４０の少なくとも９０個の連続するアミノ酸を含む、請求項５４に記載の抗体又は抗原結合性フラグメント。
56. 前記軽鎖可変領域が配列番号１７の少なくとも９０個の連続するアミノ酸を含む、請求項５５に記載の抗体又は抗原結合性フラグメント。
57. 前記軽鎖可変領域が配列番号１７に記載される、請求項５６に記載の抗体又は抗原結合性フラグメント。
58. 前記軽鎖可変領域が配列番号３４の少なくとも９０個の連続するアミノ酸配列を含み、前記重鎖可変領域が配列番号３８の少なくとも９０個の連続するアミノ酸配列を含む、請求項２９に記載の抗体又は抗原結合性フラグメント。
59. 前記軽鎖可変領域が配列番号３５の少なくとも９０個の連続するアミノ酸配列を含み、前記重鎖可変領域が配列番号３９の少なくとも９０個の連続するアミノ酸配列を含む、請求項５８に記載の抗体又は抗原結合性フラグメント。
60. 前記軽鎖可変領域が配列番号３６の少なくとも９０個の連続するアミノ酸配列を含み、前記重鎖可変領域が配列番号４０の少なくとも９０個の連続するアミノ酸配列を含む、請求項５９に記載の抗体又は抗原結合性フラグメント。
61. 前記軽鎖可変領域が配列番号１８の少なくとも９０個の連続するアミノ酸配列を含み、前記重鎖可変領域が配列番号１７の少なくとも９０個の連続するアミノ酸配列を含む、請求項６０に記載の抗体又は抗原結合性フラグメント。
62. 前記軽鎖可変領域が配列番号１８に記載され、前記重鎖可変領域が配列番号１７に記載される、請求項６１に記載の抗体又は抗原結合性フラグメント。
63. 前記抗体が定常領域のアミノ酸を含む、請求項８ないし６２のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合性フラグメント。
64. 前記定常領域のアミノ酸がヒト抗体に由来する、請求項６３に記載の抗体又は抗原結合性フラグメント。
65. ヒトＩｇＧ２定常領域を含む、請求項８ないし６４のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合性フラグメント。
66. 前記抗原結合性フラグメントがｓｃＦｖ、ａＦａｂ、ａＦａｂ’又は（Ｆａｂ’）_２である、請求項８ないし６５のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合性フラグメント。
67. 細胞毒性部分と共役している、請求項８ないし６６のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合性フラグメント。
68. 検出可能部分と共役している、請求項８ないし６６のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合性フラグメント。
69. クラステリン又はクラステリン変異体を発現する腫瘍細胞を含むがんの治療に用いる、請求項８ないし６７のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合性フラグメント。
70. クラステリン又はクラステリン変異体を発現する腫瘍細胞を含むがんの検出に用いる、請求項８ないし６８のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合性フラグメント。
71. 転移の予防又は治療に用いる、請求項１ないし６８のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合性フラグメント。
72. 請求項１ないし６８のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合性フラグメントと競合することができる、単離された抗体又は抗原結合性フラグメント。
73. 軽鎖可変領域及び重鎖可変領域に非ヒト相補性決定領域アミノ酸残基及びヒトフレームワーク領域アミノ酸残基を含み、クラステリンに特異的に結合し、非ヒト親抗体の抗原結合性フラグメントより良好な親和性を有する、抗原結合性フラグメント。
74. 前記抗原結合性フラグメントが請求項８ないし２８のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はハイブリッド抗体に由来する、請求項７３に記載の抗原結合性フラグメント。
75. １７ｘ１０^−８Ｍ±２．９７ｘ１０^９又はそれより良好である親和性を特徴とする、請求項７３又は７４に記載の抗原結合性フラグメント。
76. 請求項７３又は７５のいずれか１項に記載の抗原結合性フラグメントのアミノ酸配列を含む、単離された抗体。
77. 請求項８ないし７２のいずれか１項に記載の抗体、請求項７３ないし７５のいずれか１項に記載の抗原結合性フラグメント又は請求項７６に記載の単離された抗体の軽鎖可変領域及び／又は重鎖可変領域をコードする、単離された抗体。
78. 請求項７７に記載の単離された抗体を含む、ベクター。
79. 前記ベクターが哺乳類発現ベクターである、請求項７８に記載のベクター。
80. 請求項７７に記載の単離された抗体若しくは請求項７８又は７９に記載のベクター含む、若しくは請求項８ないし７２のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はハイブリッド抗体、請求項７３ないし７５のいずれか１項に記載の抗原結合性フラグメント又は請求項７６に記載の単離された抗体を発現する、単離された細胞。
81. 前記細胞が哺乳類細胞である、請求項８０に記載の単離された細胞。
82. 請求項８ないし７２のいずれか１項に記載の抗体、請求項７３ないし７５のいずれか１項に記載の抗原結合性フラグメント又は請求項７６に記載の単離された抗体及び薬理学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
83. 請求項８２に記載の医薬組成物及び化学療法剤を含む併用療法。
84. 前記化学療法剤がタキサンを含む、請求項８３に記載の併用療法。
85. 前記タキサンがパクリタキセル又はドセタキセルである、請求項８４に記載の併用療法。
86. 前記医薬組成物が化学療法剤と同時に投与される、請求項８３ないし８５のいずれか１項に記載の併用療法。
87. 前記医薬組成物が化学療法剤と異なる時間間隔で投与される、請求項８３ないし８６のいずれか１項に記載の併用療法。
88. クラステリンを発現するがん細胞の増殖を減少させる方法であり、抗クラステリン抗体を必要とする哺乳動物に投与することを含む、方法。
89. 請求項８ないし７２のいずれか１項に記載の抗体、請求項７３ないし７５のいずれか１項に記載の抗原結合性フラグメント又は請求項７６に記載の単離された抗体を投与することを含む、請求項８８に記載の方法。
90. 化学療法剤を投与することを更に含む、請求項８８又は８９に記載の方法。
91. 前記必要とする哺乳動物が高レベルのクラステリンを有する、請求項８８ないし９０のいずれか１項に記載の方法。
92. 前記必要とする哺乳動物が高レベルのクラステリンに関連する疾患を有する、請求項８８ないし９０のいずれか１項に記載の方法。
93. 前記必要とする哺乳動物が上皮間葉転換可能な細胞を保有しやすい、請求項８８ないし９０のいずれか１項に記載の方法。
94. 前記必要とする哺乳動物がクラステリンを発現又は分泌する腫瘍を有する、請求項８８ないし９０のいずれか１項に記載の方法。
95. 前記必要とする哺乳動物が癌腫を有する、８８ないし９４のいずれか１項に記載の方法。
96. 前記癌腫が前立腺癌である、請求項９５に記載の方法。
97. 前記癌腫が乳癌である、請求項９５に記載の方法。
98. クラステリン発現に関連する疾患を治療するための方法であり、請求項８ないし７２のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はハイブリッド抗体、請求項７３ないし７５のいずれか１項に記載の抗原結合性フラグメント又は請求項７６に記載の単離された抗体を必要とする哺乳動物に投与することを含む、方法。
99. クラステリン発現に関連する疾患を治療するための薬物の製造における、請求項８ないし７２のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はハイブリッド抗体、請求項７３ないし７５のいずれか１項に記載の抗原結合性フラグメント又は請求項７６に記載の単離された抗体の使用。
100. クラステリンに特異的に結合できる非ヒト抗体の非ヒト重鎖ＣＤＲアミノ酸残基及び天然ヒト抗体重鎖可変領域のフレームワーク領域アミノ酸を含む重鎖可変領域を発現すること、並びに相補的軽鎖可変領域を発現すること、を含むヒト化又はハイブリッドの抗クラステリン抗体を製造する方法。
101. 前記天然ヒト抗体重鎖可変領域が、ａ）非ヒト抗体の重鎖と同様又は同一の三次元構造、ｂ）非ヒト抗体の重鎖フレームワーク領域と少なくとも７０％同一なアミノ酸配列を有するフレームワーク領域及び／又はｃ）非ヒト重鎖ＣＤＲアミノ酸残基と同一又は実質的に同一な重鎖ＣＤＲ中のいくつかのアミノ酸残基を有する、請求項１００に記載の方法。
102. クラステリンに特異的に結合できる非ヒト抗体の非ヒト軽鎖ＣＤＲアミノ酸残基及び天然ヒト抗体軽鎖可変領域のフレームワーク領域アミノ酸を含む軽鎖可変領域を発現すること、並びに相補的な重鎖可変領域を発現すること、を含むヒト化又はハイブリッドの抗クラステリン抗体を製造する方法。
103. 前記天然ヒト抗体軽鎖可変領域が、ａ）非ヒト抗体の軽鎖と同様又は同一の三次元構造、ｂ）非ヒト抗体の軽鎖フレームワーク領域と少なくとも７０％同一なアミノ酸配列を有するフレームワーク領域及び／又はｃ）非ヒト軽鎖ＣＤＲアミノ酸残基と同一又は実質的に同一な軽鎖ＣＤＲ中のいくつかのアミノ酸残基を有する、請求項１０２に記載の方法。
104. 請求項８ないし７２のいずれか１項に記載の抗体、請求項７３ないし７５のいずれか１項に記載の抗原結合性フラグメント、請求項７６に記載の単離された抗体、請求項７７に記載の単離された核酸又は請求項７８又は７９に記載のベクターを含む、１つまたは複数のバイアルを含むキット。
105. 必要とする個体におけるクラステリンを発現又は分泌する細胞を含む腫瘍の体積を縮小させる方法であり、抗クラステリン抗体を投与することを含む方法。
106. 前記抗クラステリン抗体が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、単離されたヒト抗体、ハイブリッド抗体及びそれらの断片からなる群から選択される、請求項１０５に記載の方法。
107. 前記ハイブリッド抗体又はその断片が、非ヒト抗体の軽鎖可変領域及びヒト化抗体又はヒト抗体の重鎖可変領域を含む、請求項１０６に記載の方法。
108. 前記ハイブリッド抗体又はその断片が、非ヒト抗体の重鎖可変領域及びヒト化抗体又はヒト抗体の軽鎖可変領域を含む、請求項１０６に記載の方法。
109. 前記腫瘍が、子宮内膜癌、乳癌、肝細胞癌、前立腺癌、腎細胞癌、卵巣癌、膵癌及び結腸直腸癌からなる群から選択される、請求項１０５ないし１０８のいずれか１項に記載の方法。
110. 前記癌腫が前立腺癌である、請求項１０９に記載の方法。
111. 前記癌腫が乳癌である、請求項１０９に記載の方法。