CN1791422A - 凝聚素在治疗和/或预防周围神经疾病中的用途 - Google Patents

凝聚素在治疗和/或预防周围神经疾病中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及凝聚素(clusterin)或凝聚素活性激动剂在治疗或预防周围神经疾病中的用途。本发明还涉及凝聚素和肝素的组合在治疗或预防周围神经疾病中的用途。

Description

凝聚素在治疗和/或预防周围神经疾病中的用途
技术领域
本发明一般涉及周围神经系统的神经疾病。本发明与神经保护、神经髓鞘化及产生细胞的髓磷脂生成或再生有关。本发明特别涉及凝聚素或凝聚素活性激动剂在制备用于治疗和/或预防周围神经疾病的药物中的用途。
发明背景
周围神经疾病是与周围神经系统(PNS)或与支援周围神经系统的神经胶质有关的失调。周围神经病变是最常见的周围神经疾病。
周围神经病变是一种综合征，包括感觉丧失、肌无力和肌萎缩、深度腱反射减弱、血管舒张症状的一种或几种症状的综合。
这种疾病可以影响单个神经(单一神经病变)，两或多个分离区域的神经(多发性单一神经病变)，或者同时影响很多神经(多神经病变)。最初主要是轴突受影响(如糖尿病、莱姆病、或尿毒症或毒性药物引起的疾病)，或者是髓鞘或施万细胞(如急性或慢性感染性多神经病变、脑白质营养不良、或格-巴综合征)。对小的无髓或有髓神经纤维造成的损伤主要是导致温度及疼痛感觉丧失；对大的有髓神经纤维造成的损伤主要会导致运动或本体感觉障碍。某些神经障碍(如由于铅中毒，氨苯砜的应用，蜱叮咬，卟啉病或格-巴综合征)主要影响运动纤维；其它的神经障碍(如由于肿瘤引起的背根神经节炎，痳疯病，AIDS，糖尿病，或慢性吡哆醇中毒)主要影响背根神经节或感觉纤维，产生感觉症状。有时候颅侧神经也可能受到影响(如格-巴综合征、莱姆病、糖尿病、以及白喉)。确定那些神经受影响有助于判断病因。
创伤是导致单个神经纤维受到局部损伤的最常见原因。剧烈的肌肉运动或关节的强迫过度伸张可能会造成局部神经病变，重复的小创伤也可能造成局部神经病变(如紧握小的工具，来自汽锤的过度振荡)。压力或内陷麻痹通常影响骨隆突(如在深度睡眠时，瘦弱或恶质病人感觉缺失时，以及酒醉时)或狭窄管道(如腕管综合征)处的浅表神经(尺骨的、桡骨的、腓侧的)。压力造成的麻痹也可能是由于肿瘤、骨肥厚、投掷、拄拐杖、或长时间保持非正常姿势(如在花园工作时)而引起的。血液流出后进入神经以及暴露于寒冷或辐射中也可能引发神经病变。单一神经病变也可能是由于肿瘤的直接侵入造成的。
手术(如外科前列腺切除术)过程中可能引发周围神经系统的创伤性神经损伤。在保留神经前列腺切除术中，为了避免神经创伤，一般做法是在手术过程中刺激海绵体神经，鉴定海绵体神经路程并引导外科医生避免损害神经(Klotz和Herschorn，1998)。对根治性前列腺切除术后性无能进行评估的研究显示，503例以前性功能正常的男病人中有212例(42％)在切除部分或完全切除阴茎海绵体神经后失去性功能。当神经保持完好时，失去性功能的比例下降至24％(Quinlan等人，1991b；Quinlan等人，1991a)。
多发性单一神经病变通常是由胶原性血管病(如结节性多发性动脉炎、系统性红斑狼疮、斯耶格伦综合征(口眼干燥、关节炎综合征)、结节病、代谢性疾病(如糖尿病、淀粉样变性)、或感染性疾病(如莱姆病、HIV感染)引发的。微生物如果直接侵入神经(如痳疯病)也可以引起多发性单一神经病变。
由急性发热病引起的多神经病变通常都是由毒素(如白喉)或自身免疫反应(如格-巴综合征)造成的；有时伴随免疫接种而出现的多神经病变可能也是自身免疫疾病。
毒性药物通过造成的是多神经病变，但有时也会引发单一神经病变。这些药品包括吐根碱、环几巴比妥、巴比妥、三氯叔丁醇、磺胺类药物、苯妥英、硝基呋喃妥英、长春花生物碱、重金属、一氧化碳、三邻羟甲苯基磷酸、正二硝基苯酚、多种溶剂、其它工业毒物、以及某些抗AIDS药物(如扎西他宾、二脱氧肌苷)。
营养缺乏和代谢障碍也可能引发多神经病变。维生素B缺乏就是一种常见的原因(如酒精中毒、脚气病、恶性贫血、异烟肼诱导的吡哆醇缺乏、吸收不良综合征以及孕期呕吐)。多神经病变也可能发生于甲状腺功能减退症、卟啉病、结节病、淀粉样变性以及尿毒症时。糖尿病也可以引起感觉运动远端多神经病变(最常见)、多发性单一神经病变、以及局部单一神经病变(如动眼神经或外展脑神经所发生的局部单一神经病变)。
恶性肿瘤也可以引发多神经病变，主要通过单株性丙球蛋白病(多发性骨髓瘤、淋巴瘤)、淀粉样浸润、或营养缺失，或者肿瘤相关病症而引发。
特异性单一神经病变：单发的和多发的单一神经病变的特征是疼痛、虚弱、以及受影响神经分布区域内的感觉异常。多发性单一神经病变是不对称分布的；受影响的神经可以是起始就是全部，也可以是逐渐增多的。如果许多神经都受到影响，可能会引发多神经病变。
尺骨神经麻痹通常是由肘部尺骨沟内的神经创伤引起的，持续重复依靠肘部或儿童时期骨折后骨不对称生长(慢尺骨麻痹)都可以造成肘部尺骨沟内的神经创伤。尺骨神经在肘管处也容易受到挤压。第五手指或第四手指中间半截会出现感觉异常和感觉缺陷；拇指内收肌、第五手指外展肌以及骨间肌肉变弱和萎缩。严重的慢性尺骨麻痹会导致爪形手畸形。神经传导检查可以确定损伤的位置。在进行外科手术修复前应保守治疗。
腕管综合征是由于正中神经受压迫引起的，该神经位于横向浅表腕韧带和屈伸手掌的前臂肌肉的纵向肌腱之间的腕关节掌侧。可以是单侧或双侧。该神经受压迫会导致手掌的桡骨掌侧感觉异常以及腕和手掌疼痛；有时疼痛发生在靠近前臂和肩部的受压迫位置。疼痛可能在夜间更剧烈。然后前三个手指的掌侧可能会出现感觉缺陷；控制拇指外展和内屈的肌肉可能变弱和萎缩。这种综合征应该和颈神经根病导致的C-6神经根受压区别开来。
腓神经麻痹通常是由于靠腓骨颈侧面的神经受压迫而引起的。这种情况常见于瘦弱的长期卧床的病人或习惯性交叉双腿的瘦人。足的背屈及外翻能力减弱(足下垂)。偶尔会有小腿和足背的前面一侧或第一和第二跖骨之间的空隙出现感觉缺失。压迫性神经病变的治疗一般是保守的(如避免腿部交叉)。通常随后出现不完全临床神经病变，但一般都会自然消失。如果难以恢复可以考虑进行手术探察。
桡神经麻痹(周末晚麻痹)是由于压迫背靠肱骨的神经造成的，例如中毒或深度睡眠时将手臂靠在椅子背上。症状包括腕和手指的伸肌无力(腕下垂)，偶尔会有第一背骨间肌肉的背侧感觉消失。治疗方法与压迫性腓侧神经障碍一样。
多神经病变一般是相对对称的，通常同时影响感觉、运动和血管舒张神经纤维。可能影响轴突柱或髓鞘，或者同时受影响，可能是急性的(如格-巴综合征)，也可以是慢性的(如肾衰竭)。
由代谢障碍(如糖尿病)或肾衰竭造成的多神经病变进展缓慢，一般要经过数月或数年。通常首先出现下肢的感觉异常，一般来说远端比近端严重。外周麻刺感、麻木、烧灼感、关节本体感觉及震动感消失是比较突出的。夜间一般疼痛较严重，碰到受影响区域或温度改变会导致症状加重。严重的病人出现感觉丧失的信号，呈典型的长袜-手套(stocking-and-glove)分布。跟腱反射和其它深度腱反射减弱或消失。如果感觉缺失加重会导致指(跖)无痛溃疡或夏氏关节(Charcot′s joints)。感觉或本体感觉缺失会造成步态异常。运动神经受影响则会造成远端肌无力和萎缩。自主神经系统也可能包括在内，导致夜间腹泻、大小便失禁、阳痿或体位性低血压。血管舒张症状有多种多样。皮肤变得苍白干燥，有时甚至灰暗；极易出汗。严重的慢性病人常会出现与营养有关的症状(光滑而有光泽的皮肤，痘痕或脊状指甲、骨质疏松)。
营养性多神经病变通常出现于酒精中毒和营养不良的人中。最初的轴突病变会导致长大神经纤维脱髓鞘和轴突损坏。原因是缺乏维生素B1或其它维生素(如维生素B6、泛酸、叶酸)还不清楚。维生素B6缺乏导致的神经病变常常只发生在使用异烟肼治疗结核的病人身上；缺乏或依赖维生素B6的婴幼儿可能会出现惊厥。远端肢体残疾或对称性无力通常是隐袭的并且快速发展，有时会伴随感觉丧失、感觉异常和疼痛。触碰时腓及足的疼痛、痉挛、冷感、烧灼感以及麻木等感觉会加重。当病因不清时可以给予多种维生素，但其是否有效还未被证实。
很少的情况下，感觉神经多神经病变以周围疼痛和感觉异常开始，从中央到所有形式的感觉丧失。其发生与癌症的远期效应类似(特别是支气管的)，症状一般出现在过量摄入维生素B6(＞0.5克/天)，以及在淀粉样变性、甲状腺功能低下、骨髓瘤和尿毒症中。在停止摄入维生素B6时也可能出现维生素B6诱导的神经病变。
遗传性神经病变分为感觉运动神经病变和感觉神经病变。夏-马-图病(进行性神经性肌萎缩)是最常见的遗传性感觉运动神经病变。很少见感觉运动神经病变起始于出生时并导致严重的残疾。感觉神经病变是很罕见的，远端疼痛及温度感觉丧失出现的几率大于震动和位置感觉丧失的几率。主要的问题是由于对疼痛不敏感而造成的足部残疾，并且常常发生感染和骨髓炎。
遗传性运动和感觉神经病变I型和II型(夏-马-图病，腓侧肌肉萎缩)相对较常见，通常是常染色体显性遗传病，其症状是肌无力和萎缩，主要影响腓侧的和下肢肌肉。病人还可能患有其它退化性疾病(如弗氏共济失调(Friedreich′s ataxia))或具有家族史。I型病人一般出现在儿童中期，有足下垂，并且伴有缓慢的进行性远端肌肤萎缩，导致“鹳形腿”。稍后会出现手部的内在肌肉萎缩。出现长袜-手套模式的震动、疼痛及温度感觉减弱。深度腱反射缺失。高足弓或锤状趾可能只是患有该病的家族成员受影响轻微的标志。神经传导速度缓慢，远端潜伏期延长。出现节段性的脱髓鞘和髓鞘再生。II型神经病变进展更缓慢，在其生命晚期通常会出现肌无力。病人具有相对正常的神经传导速度，但其激发势能的幅度较低。活组织检查发现有瓦氏(wallerian)变性。
遗传性运动和感觉神经病变III型(肥大性间质性神经病变，代-索病(进行性肥大性间质性神经病变))是一种罕见的常染色体隐性遗传病，从儿童开始出现进行性肌无力、感觉丧失或深度腱反应缺乏。开始时类似于夏-马-图病，但其运动功能减弱速度很快。发生脱髓鞘和髓鞘再生现象，导致周围神经膨大，神经活组织检查可见洋葱泡。
根据运动性肌无力的特征性分布、足畸形、家族史及电生理异常可确诊此病。可以通过基因分析，但无特异的治疗措施。年轻病人通过专业咨询以了解病程进行情况可能会有帮助。安装矫形支架有助于矫正足下垂；通过矫形外科手术以稳定足部也有帮助。
脊髓损伤占因截瘫和四肢瘫痪而住院病人的大多数。80％以上由交通事故造成。临床上将损伤分为2大组：开放性损伤和闭合性损伤。
开放性损伤直接损坏脊髓和神经根。贯穿伤可引起大面积破裂和出血。大部分脊髓损伤是闭合性损伤，它通常与脊柱骨折脱位有关，一般以放射方式就可以得到证实。脊髓损伤取决于骨损伤程度，可分两个阶段考虑：受伤初级阶段，其损伤是挫伤、神经纤维横断和出血性坏死；受伤次级阶段，其损伤是脑膜外血肿、梗塞、感染和水肿。
脊髓损伤的晚期效应包括：受损神经纤维的上升和下降顺向变性、创伤后脊髓空洞症和截瘫全身性效应，如尿道和胸部感染、压力疼痛和肌肉萎缩。
脱髓鞘与神经冲动传导的功能减弱或阻断有关联。
在某些神经胶质细胞浆膜的某些特殊区域髓鞘是多层的，富含脂质而蛋白质较少。它主要是通过防止电荷进入周围组织来支持轴突和促进中枢神经系统内的电信号传导。神经纤维结是沿轴突髓鞘的位点，在该位点出现跳跃性传导。
髓鞘再生的过程可以与抗炎症策略一起使用，修复损伤和保护轴突以免断裂和死亡。
施万细胞是周围神经胶质细胞，在周围神经系统中起着支持作用，属于卫星细胞。施万细胞各自包围着周围轴突的轴，沿着轴突节段形成一层髓鞘。施万细胞主要由脂质或脂肪组成；脂肪起着绝缘体作用，从而加速动作电位(action potential)沿轴突的传输速度。
施万细胞对周围神经系统的神经元再生也是必不可少的。当轴突要死亡时，该轴突周围的施万细胞有助于它的消化。这会留下一条由连续施万细胞形成的空槽，通过此空槽新的轴突以每天3-4毫米的速度从切断端生长。
神经病变通常以受影响的周围神经系统神经元类型(如应觉与自主)，事实上也以神经元的亚型(例如小与大)来选择的。评价神经营养因子的神经保护作用最常用的动物模型是周围神经轴突横切术。创伤性神经损伤、神经丛损害和神经根损害都是意外所引致的严重并发症。此外，与脊柱矫形并发症相关的压力施加在周围神经，能造成髓磷脂损害，这在很多疾病例如腕管综合征中发现。轴突横切产生某些现象，例如受损神经元内细胞死亡、轴突传导速度下降、神经元传递素水平改变。压迫损伤可以再生，这是与神经病变状态有关的另一种令人感兴趣的过程(McMahon和Priestley，1995)。
细胞神经生物学的一个基本问题是受损或发病后神经再生的调节。功能性神经再生不仅要求轴突发芽和延长，而且要求有新的髓磷脂合成。髓鞘再生对正常神经传导恢复和保护轴突免受新的神经退化性免疫攻击是必要的。对神经退化性疾病进行研究的主要目的是最终研究出一些干预措施，防止神经元死亡，维持神经元表型以及修复神经元和髓磷脂损害。许多研究都着重于阐明负责横切的脊髓运动神经元完全再生的分子和细胞机制(Fawcett和Keynes，1990；Funakosh等人，1993)。受伤诱导的神经营养因子和相应受体的表达在神经再生能力中发挥重要作用。过去的研究表明，利用各种肽和非肽化合物，例如胰岛素样生长因子(IGF-1)、ACTH(Lewis等人，1993；Strand等人，1993)、睾丸激素、SR 57746A(Fournier等人，1993)以及4-甲基儿茶酚(Hanaoka等人，1992；Kaechi等人，1993)能明显改善神经再生。
凝聚素是一种胞外蛋白质，也称载脂蛋白J、SGP-2、TRPM-2和SP-40，40。它几乎遍布在组织中，根据纯化来源而命名，它有很多名称(综述见Trougakos和Gonos(Trougakos和Gonos，2002)，Jones和Jomary(Jones和Jomary，2002))。尽管它遍在表达，在血清中也相对多(100μg/ml)，但仍不知道凝聚素的真正功能。有人提出凝聚素的一些生物功能，其中包括通过与C9补体结合来抑制互补级联的能力(Tschopp等人，1993)，促编程性细胞死亡活性或抗编程性细胞死亡活性，视乎所研究的动物模型(Han等人，2001；Wehrli等人，2001)，限制进展，最近发现能够限制陪伴蛋白性质(Poon等人，1993)。也有人提出凝聚素在阿尔茨海默病中具有神经保护作用(Giannakopoulos等人1998)。它的主要形式是由单一转录产生的75-80kDa异二聚体。然后，通过蛋白水解切割多肽链，除去22-mer分泌信号肽，再在残基227/228之间产生两条链α和β，这两条链由每条链中央的5个半胱氨酸键装配。此多肽也含有糖基化位点和核定位信号序列。它的降解似乎受内吞受体gp330/megalin/LRP2介导，此受体是低密度脂蛋白质受体家族成员(Kounnas等人，1995)。
肝素指酸性高的粘多糖，由等份量的硫酸化D-葡糖胺和D-葡糖醛酸(其间为氨基磺酸桥)形成。分子量范围在6000至20000之间。肝素存在于脊椎动物的肝、肺、肥大细胞内，可从这些器官和细胞获得。它的功能尚未清楚，但可用于体内外防止血液凝结，以多种不同的盐形式存在(Medical SubiectHeadings(MESH)，http：//www.nlm.nih.gov/mesh/meshhome.html)。使用肝素钠(商品名为Lipo-Hepin和Liquaemin)来治疗血栓症。
也存在低分子量肝素(LMWH)、肝素片段。它们的分子量一般在4000至6000kD之间。这些低分子量片段是有效的抗血栓形成药物。给予它们可以减少出血风险，它们的半衰期长。而且，与未分化肝素相比，它们与血小板的相互作用减弱。它们也能有效地预防术后主要肺栓塞(Medical SubjectHeadings(MESH)，http：//www.nlm.nih.gov/mesh/meshhome.html)。LMWH可以是例如那屈肝素(nadroparin)、N-乙酰基肝素、阿地肝素(ardeparin)、、舍托肝素(certoparin)、达肝素(dalteparin)、依诺肝素(enoxaparin)、瑞肝素(reviparin)，亭扎肝素(tinzaparin)。
其它肝素包括类肝素。它们是天然存在的和合成的具有类似结构的高度硫酸化多糖。类肝素制剂，例如达那肝素钠，已经获得了广泛应用，包括抗凝血剂和抗炎剂，据称它们具有降血脂的性质(Martindale，The ExtraPharmacopoeia，30th，p232)。
干扰素是一类具有抗炎、抗病毒和抗增殖活性的细胞因子。根据其生物化学和免疫学特性，天然人干扰素可以分为三类：干扰素α(白细胞型)、干扰素β(成纤维细胞型)和干扰素γ(免疫型)。α干扰素现在在美国及其它国家已被批准用于治疗毛细胞白血病、性病疣、卡波西肉瘤(一种恶性肿瘤，常见于获得性免疫缺陷综合症(AIDS)病人)和慢性非A、非B型肝炎。
干扰素还是肌体应对病毒感染而产生的一种糖蛋白。可以抑制病毒在被保护细胞内的复制。干扰素是由低分子量组成的蛋白质，其作用是非特异性的，也就是一种病毒诱导产生的干扰素可以有效地对抗多种其它病毒的感染。但是干扰素也有特异性的，也就一个物种产生的干扰素只能在同种或近似物种的细胞内刺激产生抗病毒活性。干扰素是第一组被发现具有抗肿瘤和抗病毒活性的细胞因子。
三类主要的干扰素被称为干扰素α、干扰素β和干扰素γ。这些主要种类的划分最初是根据其细胞来源(白细胞、成纤维细胞或T细胞)。但是现在越来越清楚地显示一种细胞可以产生几种类型的干扰素。因此，白细胞干扰素现在被称为干扰素α，成纤维细胞干扰素被称为干扰素β，T细胞干扰素被称为干扰素γ。干扰素还有第四种类型，淋巴浆细胞型干扰素，是由“Namalwa”细胞系产生的(来源于Burkitt’s淋巴瘤)，该细胞好象能产生白细胞型干扰和成纤维细胞型干扰素的混合物。
据报导，干扰素的一个活性单位被定义为(有些武断的)为能保护50％的细胞免受病毒损害所需要的量。
每一类干扰素又包括几种不同的亚型。干扰素β和干扰素γ是单基因产物。每一类之间的差别主要在于其糖基化的不同。
干扰素α包括的亚类最多，大约有15个。9号染色体上有一簇干扰素α基因，至少含有23个成员，其中15个是有活性的，可以被转录。成熟的干扰素α是没有糖基化的。
干扰素α和干扰素β具有相同的长度(165或166个氨基酸)及相似的生物学活性。干扰素γ含有146个氨基酸，与干扰素α和干扰素β的相似程度较低。只有干扰素γ能活化巨噬细胞或诱导杀伤T细胞的成熟。效果上这些新的治疗药物被称为生物学反应调节剂(BRM)，因为它们在有机体内对肿瘤的反应过程中发挥效应，通过免疫调节影响肌体对肿瘤细胞的识别。
特别是人成纤维细胞型干扰素(干扰素β，即IFN-β)具有抗病毒活性，能够刺激天然杀伤细胞对抗恶性肿瘤细胞。它是一种由病毒和双链RNA诱导产生的分子量大约为20,000 Da的多肽。根据成纤维细胞型干扰素基因的核苷酸序列，通过重组DNA技术进行克隆，Derynck等人(Derynck等人，1980)推算出该蛋白的完整氨基酸序列。它是一个长166个氨基酸的蛋白质。
Shepard等人(Shepard等人，1981)描述了了一个在842位碱基突变的突变体(141位氨基酸由Cys变成Tyr)，该突变体的抗病毒活性消失，还描述了一个1119-1121位核苷酸缺失的突变克隆。
Mark等人(Mark等人，1984)通过将469位的T替换成A插入了一个人工突变，使17位的氨基酸由Cys变成Ser。所得到的IFN-β的活性与天然IFN-β一样，并且在-70℃条件下长期储存更稳定。
IFN发挥作用的机制还不是完全清楚。但是在大多数情况下它们是通过影响某些特定基因的诱导与表达进而调节免疫系统而发挥作用的。体外实验结果表明IFN能够诱导或抑制大约20种基因产物。
骨桥素(OPN)是一种高度磷酸化的唾液蛋白，是骨和牙齿矿化的细胞外基质的主要组成成分。OPN的特征是具有多聚天冬氨酸序列和介导羟磷灰石结合的Ser/Thr磷酸化位点，以及具有一个介导细胞粘附和信号传导的高度保守性RGD基序。骨桥素抑制剂据说可用于治疗感染、免疫失调和疾病、自身免疫疾病包括MS、各种免疫缺陷以及癌症(WO00/63241)。WO02/92122要求保护骨桥素或骨桥素活性激动剂在制备治疗或预备神经疾病的药物中的用途。
Bonnard A等人观察到大鼠坐骨神经压迫后受伤部位凝聚素mRNA表达上升(Bonnard等人，1997)。
迄今为止，本技术领域仍未有考虑用凝聚素治疗周围神经疾病。
发明内容
本发明的目的在于提供一种治疗和/或预防周围神经疾病的新方法。
本发明是基于这样的发现：蛋白质凝聚素在周围神经病变的动物模型中有积极的治疗效果。
因此，本发明涉及凝聚素或凝聚素活性激动剂用于周围神经疾病如周围神经疾病(PNS)的创伤性神经损伤，以及周围神经病变的用途。
利用核酸分子、含有凝聚素的表达载体以及表达凝聚素的细胞在治疗和/或预防周围神经疾病中的用途也在本发明范围之内。
本发明还提供含有凝聚素和肝素或干扰素或骨桥素，可选择地添加一或多种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
根据本发明第二方面，也可以利用凝聚素与肝素、干扰素或骨桥素的组合来治疗和/或预防周围神经疾病。
附图说明
图1用示意图描述了凝聚素的结构(根据Rosenberg和Silkensen，1995)。(A)是前体多肽，(B)代表成熟多肽，它是一个75-80kDa的异二聚糖蛋白，由α(34-36kDa)和β(36-39kDa)链形成，此两条链通过靠近它们中央的5个二硫键反平行方式连接，(C)显示人凝聚素前体的序列。
图2所示为腹腔给予载体(空心圆)、300μg/kg小鼠凝聚素(实心三角形)或1mg/kg小鼠凝聚素(实心棱形)处理坐骨神经压迫诱导的神经病变小鼠的体重，以克(g)计。对照：健康小鼠(实心方形)。
图3所示为腹腔给予载体、300μg/kg或1mg/kg小鼠凝聚素、皮下给予0.01μg/kg阳性对照化合物(4-甲基儿茶酚)或100μg/kg骨桥素处理的神经病变小鼠中复合肌肉动作电位的幅度，以毫伏(mV)计。对照：假手术小鼠。
图4所示为腹腔给予载体、300μg/kg或1mg/kg小鼠凝聚素、皮下给予0.01μg/kg阳性对照化合物(4-甲基儿茶酚)或100μg/kg骨桥素处理的神经病变小鼠中复合肌肉动作电位的潜伏期，以毫秒(ms)计。对照：假手术小鼠。
图5所示为腹腔给予载体、300μg/kg或1mg/kg小鼠凝聚素、皮下给予0.01μg/kg阳性对照化合物(4-甲基儿茶酚)或100μg/kg骨桥素处理的神经病变小鼠中复合肌肉动作电位的持续时间，以毫秒(ms)计。对照：假手术小鼠。
图6所示为腹腔给予载体、300μg/kg或1mg/kg小鼠凝聚素处理的神经病变小鼠中变性纤维的百分率。对照：假手术小鼠。
图7所示为腹腔给予载体、300μg/kg或1mg/kg小鼠凝聚素处理的神经病变小鼠中非变性纤维的百分率。对照：假手术小鼠。
图8所示为皮下给予载体、100μg/kg、300μg/kg或1000μg/kg重组人凝聚素以及皮下给予30μg/kg阳性对照化合物(重组人IL-6)处理的神经病变小鼠中复合肌肉动作电位的幅度，以毫伏(mV)计。在坐骨神经损伤后1、2、3或4周后进行记录。数据以平均总幅度(mV)±标准差表示；n＝6(每组)。#p＜0.01，*p＜0.05，**p＜0.01。
图9所示为皮下给予四周载体、30μg/kg重组人IL-6或100μg/kg、300μg/kg或1000μg/kg重组人凝聚素处理的神经病变小鼠中对侧(a)和同侧(b)腓肠肌的每毫克蛋白质的胆碱乙酰转移酶(ChAT)活性(cpm，每分钟计数)，以cpm/μg蛋白质计。n＝6(每组)。#p＜0.1。
图10所示为皮下给予载体、30μg/kg重组人IL-6或100μg/kg、300μg/kg或1000μg/kg重组人凝聚素后四周，(a)对侧坐骨神经、(b)同侧坐骨神经的近端部分(压迫上部)和(c)同侧坐骨神经的远端部分(压迫下部)的每毫克蛋白质所含神经细丝-高分子量形式(NF-H)的含量(纳克)，以ng NF-H/mg蛋白质计。n＝6只小鼠(每组)。**p＜0.01。
图11所示为在处理第3、6和10日(T3、T6和T10，对应于体外第10、13和17日(DIV))用1μg/ml重组小鼠凝聚素处理器官型海马趾切片，其每毫克蛋白质所含髓磷脂碱性蛋白(MBP)的含量(皮克)，以pg MBP/μg总蛋白质计。对照组接受正常培养基(50％MEM、25％HBSS、25％马血清)。使用由HEK或CHO细胞产生的重组人凝聚素获得相似的结果(数据未示出)。数据以平均总MBP±标准差表示；exp＝2，n＝6(每组)。n＝12只小鼠(每组)。p＜0.001***。
图12所示为以抗-MOG(抗髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白)抗体与补体(IgG抗-MOG+补体)联合或者以匹配免疫球蛋白IgG的不相关同种型与补体(IgG对照+补体)联合诱导特异性脱髓鞘后，用10、100和1000ng/ml重组小鼠凝聚素处理器官型海马趾切片，其每毫克蛋白质所含髓磷脂碱性蛋白(MBP)的含量(皮克)，以pg MBP/μg总蛋白质计。作为对照，未作任何处理的一组接受正常培养基(50％MEM、25％HBSS、25％马血清)。在第21日(DIV，体外第21日)给予小鼠凝聚素，即施加抗体之前24小时和处理时。exp＝3，n＝15(每组)。n＝6只小鼠(每组)。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
使用由HEK或CHO细胞产生的重组人凝聚素获得相似的结果(数据未示出)。
图13所示为在肝素存在(7500U/kg)或不存在下，静脉注射重组人凝聚素(300μg/kg)后5或30分钟，通过ELISA试验检测到的在血清中的人凝聚素浓度(ng/ml)。
A.先给予肝素，5分钟后再给予凝聚素(先注射肝素再注射凝聚素)或者同时给予肝素和凝聚素(凝聚素与肝素混合)。对照小鼠单独注射凝聚素，血液收集在试管+/-肝素内(凝聚素被收集在肝素内)。n＝每组3只小鼠。***p＜0.005。
B.收集血液之前给予肝素(7500U/kg)的作用。第1组：先给予肝素，5分钟后再给予凝聚素(1mg/kg)。第2组：给予凝聚素(1mg/kg)之后28分钟注射入肝素。第3组：单独给予凝聚素(1mg/kg)。a：针对第1组进行的Anova单因素检验。b：针对第2组进行的Anova单因素检验。N＝每组4只小鼠。#p＜0.1，*p＜0.05，**p＜0.01。给予N-乙酰基肝素获得相似的结果(数据未示出)。
具体实施方式
本发明的基础在于发现给予凝聚素在周围神经疾病的体内动物模型中有积极的治疗效果。在一个坐骨神经压迫诱导的神经病变小鼠模型中，凝聚素对与神经再生、完整性和生命力有关的全部生理和形态参数都有显著的疗效。
因此，本发明涉及凝聚素、其同种型、突变蛋白、融合蛋白、功能性衍生物、活性部分、循环变换衍生物或其盐，或者凝聚素活性激动剂在制备治疗和/或预防周围神经疾病的药物中的用途。
本文中的术语“凝聚素”是指全长成熟人凝聚素，或任何凝聚素亚型，或其片段。人凝聚素的序列在本文中用附加序列表中的SEQ ID NO：1和附图中的图1表示。本文中的术语“凝聚素”还表示任何动物来源的凝聚素，如小鼠、牛、猪、猫或绵羊凝聚素，只要其序列足以维持其凝聚素活性，以及得到的分子在人体内无免疫原性。
本文中的术语“凝聚素”还表示具有生物活性的突变蛋白和蛋白片段，如凝聚素的天然亚型α和β。
本文中的术语“凝聚素”还包括同种型、突变蛋白、融合蛋白、功能性衍生物、活性部分或片段、循环变换衍生物或其盐。这些同种型、突变蛋白、融合蛋白或功能性衍生物、活性部分或片段、或循环变换衍生物保持了凝聚素的生物活性。较好的是其生物活性与野生型凝聚素的一样。
本文中的术语“凝聚素活性激动剂”是指能刺激或模仿凝聚素活性的分子，如凝聚素受体的拮抗性抗体，或能通过凝聚素受体激活信号的小分子激动剂。凝聚素受体可以是例如gp330/megalin/LRP2(Kounnas等人，1995)。这些受体的任何激动剂、刺激因子或增强因子都包括在本文所用的术语“凝聚素活性激动剂”的范围之内。
本文中的术语“凝聚素活性激动剂”还指能增强凝聚素所介导活性的因子，如模仿凝聚素活性的小分子化合物。
本文所用的术语“预防”和“治疗”应该理解为阻止、抑制、减轻、改善或逆转周围神经疾病的一种或多种症状或病因，或者周围神经疾病所导致的症状、疾病或并发症。当“治疗”周围神经疾病时，在疾病开始后给予本发明的物质，而“预防”是指在病人出现症状前给予本发明的物质。
本文所用的术语“周围神经疾病”包括所有已知的周围神经疾病或障碍，或者周围神经系统的损伤，包括本发明背景部分所详细描述的那些疾病。
周围神经疾病包括与周围神经系统(PNS)障碍有关的疾病，如与神经传导有关的疾病、神经创伤、PNS感染、PNS脱髓鞘疾病或PNS神经病变。
较好地，本发明的周围神经疾病选自下列疾病：周围神经系统的创伤性神经损伤、周围神经系统的脱髓鞘疾病以及周围神经退化性疾病和周围神经病变。
创伤性神经损伤可以涉及上述本发明背景部分所详细描述的PNS。
周围神经病变可以是一种综合征，包括感觉丧失、肌无力和肌萎缩、深度腱反射减弱、血管舒张症状的一种或几种症状的综合。它们可能由酒精中毒、糖尿病或化疗所引致。
神经病变可以影响单个神经(单一神经病变)，两或多个分离区域的神经(多发性单一神经病变)或多个神经同时受影响(多神经病变)。受影响的可能主要是轴突(如糖尿病、莱姆病、或尿毒症或毒性药物引起的疾病)，或者是髓鞘或施万细胞(如急性或慢性感染性多神经病变、脑白质营养不良、或格-巴综合征)。按照本发明的方法还可以治疗由下列原因引起的神经病变：铅中毒、氨苯砜的使用、蜱咬、卟啉病或格-巴综合征，这些疾病可能主要影响运动纤维。其它的如由于肿瘤引起的背根神经节炎、痳疯病、AIDS、糖尿病、或慢性维生素B6中毒引起的疾病可能影响背根神经节或感觉纤维，导致感觉障碍。颅侧神经也可能受到影响，如格-巴综合征，莱姆病、糖尿病、以及白喉。
其它的周围神经疾病还有异常髓鞘化引起的神经病变，如上面发明背景中所列出的那种，以及腕管综合征。脊柱矫形并发症可能会伴有创伤性神经损伤，这些损伤也在本发明所包括的范围之内。
周围神经疾病还可以是由先天性代谢障碍引起的。因此，本发明的一个优选实施方式就描述了这种由先天性代谢缺损引起的周围神经疾病。
在另一个优选实施方式中，周围神经疾病是指周围神经病变，最优选的是糖尿病性神经病变。与化疗相关的神经病变也是本发明所优选的。
术语“糖尿病性神经病变”是指糖尿病性神经病变的任何形式，或者指糖尿病性神经病变伴随的或由其引起的一种或多种症状或障碍，或者指上述发明背景中所详细描述的影响神经的糖尿病并发症。糖尿病性神经病变可以是多神经病变。在糖尿病性多神经病变中，许多神经同时受损。糖尿病性神经病变也可以是单一神经病变。例如在局部单一神经病变中疾病只累及单个神经，如动眼神经或外展脑神经。如果是不同区域的两个或多个神经受损，也可以是多发性单一神经病变。
在另一优选实施方式中，周围神经疾病是指周围神经系统的脱髓鞘疾病。脱髓鞘疾病包括例如慢性炎症性脱髓鞘疾病多发性神经根性神经病变(CIDP)及急性单相疾病如炎症性脱髓鞘疾病多发性神经根性神经病变，也叫格-巴综合征(GBS)。
优选的凝聚素选自下列肽、多肽或蛋白：
a)含有SEQ ID NO：1的多肽；
b)含有SEQ ID NO：1的23到449氨基酸的多肽；
c)含有SEQ ID NO：1的35到449氨基酸的多肽；
d)含有SEQ ID NO：1的23到227氨基酸的多肽；
e)含有SEQ ID NO：1的35到227氨基酸的多肽；
f)含有SEQ ID NO：1的228到449氨基酸的多肽；
g)(a)到(f)的任何一个突变蛋白，其中的氨基酸序列与(a)到(f)中至少一个序列至少有40％、50％、60％、70％、80％或90％的同一性；
h)(a)到(f)的任何一个突变蛋白，该突变蛋白是由在温和严谨条件或高度严谨条件下能与编码(a)到(f)任何一个的天然DNA序列的互补序列杂交的DNA序列编码；
i)(a)到(f)的任何一个突变蛋白，其中，所述氨基酸序列的任何改变都是用保守性氨基酸取代(a)到(f)中任何一个的氨基酸；
j)(a)到(f)的任何一个盐或同种型、融合蛋白、功能性衍生物、活性部分或循环变换衍生物。
活性部分或片段可以指凝聚素的任一部分或区域，如分隔的但相互连接的α链和β链，连接手段可以是例如通过二硫键直接融合或通过适当接头融合。活性部分还包括不同形式糖基化或唾液酸化的凝聚素。
本领域的技术人员应当理解，即使凝聚素的一小部分或其两个亚型也能足以维持其功能，例如含有维持凝聚素功能所需的必须氨基酸残基的活性肽。
本领域的技术人员还应当理解，凝聚素的突变蛋白、盐、同种型、融合蛋白、功能性衍生物、活性部分、循环变换衍生物保留了与凝聚素相似、甚至更好的生物活性。凝聚素及其突变蛋白、同种型、融合蛋白、功能性衍生物、活性部分或片段、循环变换衍生物或盐可以用共培养分析方法检测。
优选的活性片段是具有与全长凝聚素一样或更好活性的片段，或者还有其它的优点，如更好的稳定性或更低的毒性或免疫原性，或者易于大量制备，或易于纯化。本领域的技术人员应该懂得，突变蛋白、活性部分和功能性衍生物可以通过在适当质粒中插入相应cDNA的克隆技术来制备，并且能用上述的共培养分析方法检测。
本发明所涉及的蛋白质可以糖基化或非糖基化，它们可来自天然资源如体液，或者它们最好是重组产生的。重组表达可以在原核生物表达系统如大肠杆菌中进行，或者在真核生物例如昆虫细胞中进行，优选在哺乳动物表达系统，如CHO细胞或HEK细胞。
本文所用的术语“突变蛋白”指凝聚素的同类物，其中天然凝聚素的一个或多个氨基酸残基被不同氨基酸残基所取代，或缺失，或者凝聚素的天然序列中加入了一个或多个氨基酸残基，但所产生的产物的活性与野生型凝聚素相比无显著降低。这些突变型蛋白可用已知的合成和/或定点诱变技术，或任何适合的其它已知技术制备。
按照本发明的方法能够使用的凝聚素突变蛋白或编码这些突变蛋白的核酸包括一组有限的基本上一致的序列作为替代多肽或多核苷酸，这些多肽或多核苷酸可以按照本文提供的指导不需过度的实验通过本领域的普通技术制备。
本发明的突变蛋白包括由核酸如DNA或RNA编码的蛋白质，所述的核酸在温和或高度严谨条件下能与编码本发明的凝聚素的DNA或RNA杂交。术语“严谨条件”指杂交和随后的洗涤条件，这些条件是本领域普通技术人员常规所指“严谨的”条件。参见上述文献Ausubel等人，Current Protocols inMolecular Biology，Interscience，N.Y，§§6.3和6.4(1987，1992)，以及Sambrook等人(Sambrook，J.C.，Fritsh，E.F.，和Maniatis，T.(1989)，MolecularCloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.)。
没有限制作用的严谨条件的例子包括以下洗涤条件：例如在比研究中计算的杂交温度Tm低12-20℃的温度下用2x SSC和0.5％SDS洗5分钟，用2x SSC和0.1％SDS洗15分钟；37℃用0.1x SSC和0.5％SDS洗30-60分钟，然后在68℃用0.1x SSC和0.5％SDS洗30-60分钟。本领域普通技术人员知道严谨条件还取决于DNA序列的长度、寡核苷酸探针(如10-40个碱基)或混合的寡核苷酸探针。如果采用混合的探针，最好用四甲基氯化铵(TMAC)代替SSC。参见上述引用的文献Ausubel，同上。
在一优选实施例中，任何这样一种突变蛋白与所附序列表的SEQ IDNO：1的序列具有至少40％同一性或同源性。更优选具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％，最优选至少90％同一性或同源性。
同一性反映两个或多个多肽序列或者两个或多个多核苷酸序列之间的关系，通过比较这些序列而确定。通常，同一性指在所比较的序列长度上两个多核苷酸或两个多肽序列，它们的核苷酸与核苷酸或者氨基酸与氨基酸之间的对应是完全一样的。
对于其对应不是完全一样的序列，可以确定“同一性百分比”。通常把待比较的两个序列进行序列对比，得出这两个序列之间的最大相关性。这可包括在其中一个或两个序列中插入“空格”以增加对比度。比较每一个序列的整个长度(所谓的全域性对比(global alignment))，或者比较它们的较短的限定长度(所谓的区域性对比(local alignment))，可确定同一性百分比，前者特别适合长度相等或长度差不多的序列，后者更适合长度不相等的序列。
两个或多个序列同一性和同源性的比较方法已为本领域技术人员所熟知。例如，Wisconsin序列分析软件包9.1版(Devereux J等人，1984)所提供的程序，又例如程序BESTFIT和GAP均可用于确定两个多核苷酸之间的同一性百分比与两个多肽序列之间的同一性百分比及同源性百分比。BESTFIT采用Smith和Waterman的“区域性同源性”算法(1981)，找出两个序列间最佳的单个相似区域。其它确定两个序列间同一性和/或相似性的程序也已为本领域所知，例如BLAST程序家族(Altschul SF等人，1990，Altschul SF等人，1997，登入NCBI主页www.ncbi.nlm.nih.gov可查询得到)与FASTA(Pearson WR，1990，Pearson 1988)。
本发明突变蛋白中的优选变化是称为“保守性”取代。凝聚素多肽的保守性氨基酸取代可包括一组内的同义氨基酸取代，同组氨基酸内的氨基酸具有足够相似的生理化学特性，该组成员之间的取代将保留该分子的生物功能(Grantham，1974)。显然，在上述序列中也可进行氨基酸的插入和缺失而不改变其功能，特别是如果这种插入或缺失只涉及少数氨基酸时，如30个以下，最好为10个以下，而且不除去或取代对功能性构型起关键作用的氨基酸，如半胱氨酸残基。这类缺失和/或插入所产生的蛋白质和突变蛋白属于本发明范围。
优选同义氨基酸组是表1列出的那些组；更好的同义氨基酸组是表2列出的那些组；最好的同义氨基酸组是表3列出的那些组。
表1优选同义氨基酸组
氨基酸       同义组
Ser          Ser，Thr，Gly，Asn
Arg          Arg，Gln，Lys，Glu，His
Leu          Ile，Phe，Tyr，Met，Val，Leu
Pro          Gly，Ala，Thr，Pro
Thr          Pro，Ser，Ala，Gly，His，Gln，Thr
Ala          Gly，Thr，Pro，Ala
Val          Met，Tyr，Phe，Ile，Leu，Val
Gly          Ala，Thr，Pro，Ser，Gly
Ile          Met，Tyr，Phe，Val，Leu，Ile
Phe          Trp，Met，Tyr，Ile，Val，Leu，Phe
Tyr          Trp，Met，Phe，Ile，Val，Leu，Tyr
Cys          Ser，Thr，Cys
His          Glu，Lys，Gln，Thr，Arg，His
Gln          Glu，Lys，Asn，His，Thr，Arg，Gln
Asn          Gln，Asp，Ser，Asn
Lys          Glu，Gln，His，Arg，Lys
Asp          Glu，Asn，Asp
Glu          Asp，Lys，Asn，Gln，His，Arg，Glu
Met          Phe，Ile，Val，Leu，Met
Trp          Trp
表2更好的同义氨基酸组
氨基酸       同义组
Ser          Ser
Arg          His，Lys，Arg
Leu          Leu，Ile，Phe，Met
Pro          Ala，Pro
Thr          Thr
Ala          Pro，Ala
Val          Val，Met，Ile
Gly          Gly
Ile          Ile，Met，Phe，Val，Leu
Phe          Met，Tyr，Ile，Leu，Phe
Tyr          Phe，Tyr
Cys          Cys，Ser
His          His，Gln，Arg
Gln          Glu，Gln，His
Asn          Asp，Asn
Lys          Lys，Arg
Asp          Asp，Asn
Glu          Glu，Gln
Met          Met，Phe，Ile，Val，Leu
Trp          Trp
表3最好的同义氨基酸组
氨基酸       同义组
Ser          Ser
Arg          Arg
Leu          Leu，Ile，Met
Pro          Pro
Thr          Thr
Ala          Ala
Val          Val
Gly          Gly
Ile          Ile，Met，Leu
Phe          Phe
Tyr          Tyr
Cys          Cys，Ser
His          His
Gln          Gln
Asn          Asn
Lys          Lys
Asp          Asp
Glu          Glu
Met          Met，Ile，Leu
Trp          Met
在蛋白质中产生氨基酸取代的例子可用来获得本发明中所用的凝聚素、多肽或蛋白质的突变蛋白，包括任何已知的方法步骤，如Mark等人的美国专利4,959,314、4,588,585和4,737,462；Koths等人的5,116,943；Namen等人的4,965,195；Chong等人的4,879,111和Lee等人的5,017,691专利中提出的方法，以及美国专利4,904,584(Shaw等人)中提出的赖氨酸取代蛋白质。
术语“融合蛋白”指由凝聚素或其突变蛋白或片段与其它蛋白质融合而成的多肽，这种融合蛋白在体液内的停留时间延长。故凝聚素可与另一蛋白质、多肽及其类似物如免疫球蛋白或其片段融合。免疫球蛋白Fc特别适用于产生二聚或多聚Ig融合蛋白。凝聚素的α和β链与免疫球蛋白某些部分相连，以此方式，凝聚素的α和β链与Ig Fc二聚化。
本文使用的“功能性衍生物”，包括凝聚素及其突变蛋白和融合蛋白的衍生物，它们可用本领域已知方法通过改变残基的侧链上的功能基团或N端或C端基团来制备。只要它们仍然在药学上可接受，即它们没有破坏与凝聚素活性基本上相似的蛋白质活性，并且不会使含它的组合物具有毒性，均包括在本发明中。
这些衍生物例如可以包括聚乙二醇侧链，其可遮蔽抗原位并延长凝聚素在体液中的停留时间。其它衍生物包括羧基脂肪酯，羧基与氨或伯胺或仲胺反应产生的酰胺、氨基酸残基的游离氨基与酰基部分分子(如烷酰基或碳环芳酰基)形成的N-酰基衍生物、或游离羟基(如丝氨酰或苏氨酰残基的游离羟基)与酰基部分分子形成的O-酰基衍生物。
本发明的凝聚素、突变蛋白和融合蛋白的“活性部分”包括蛋白分子或者蛋白分子与其相连的分子或残基如糖或磷酸基的多肽链的任何片段或前体，或者蛋白分子或糖残基自身的聚集物，只要所述部分具有与凝聚素基本上相似的活性。
本文所用的术语“盐”指羧基盐凝聚素分子或其类似物的氨基酸加成盐。羧基盐可通过本技术领域公知的方法形成，包括无机盐，例如钠盐、钙盐、铵盐、铁盐或锌盐等，以及有机碱盐，例如三乙醇胺等胺、精氨酸、赖氨酸、哌啶、普鲁卡因等形成的盐。酸加成盐包括例如无机酸盐，如盐酸盐或硫酸盐，有机酸盐，如乙酸盐或草酸盐。当然，任何这样的一种盐必须保留与本发明有关的凝聚素的生物活性，例如，在周围神经疾病中具有神经保护作用。
凝聚素的功能性衍生物可以共价连接到聚合物上以改进该蛋白质的性能，如稳定性、半衰期、生物利用度、人体耐受性、或免疫原性。为达到此目的，凝聚素可以连接到例如聚乙二醇(PEG)上。例如，可按WO92/13095所述的已知方法进行聚乙二醇化。
因此，在本发明的一个优选实施方式中，凝聚素是PEG化的。
在本发明另一优选实施方式中，融合蛋白包含一个免疫球蛋白。融合可以是直接的，也可以同一个短接头肽，可以短至1-3个氨基酸残基或更长，如13个氨基酸残基。所述的接头物可以是位于凝聚素序列和免疫球蛋白序列之间的具有E-F-M(Glu-Phe-Met)序列的三肽，或者是含有Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met的13个氨基酸的接头序列。所产生的融合蛋白具有改进的性能，如在体液的停留期(半衰期)延长，特异性增高，表达水平上升等。免疫球蛋白融合分子还有利于该融合蛋白的纯化。
在另外一个优选实施方式中，凝聚素与Ig分子的恒定区融合。优选与重链区如人IgG1的CH2和CH3区融合。Ig分子的其它同种型也适于按照本发明的方法制备融合蛋白，例如，IgG2或IgG4同种型，或其它Ig类如IgM。融合蛋白可以是单体或多聚体，异源或同源多聚体。融合蛋白中的免疫球蛋白部分可以进一步修饰以避免激活补体结合或补体级联反应，或者结合到Fc受体上。
本发明还涉及联合使用凝聚素和免疫抑制剂制备治疗和/或预防周围神经疾病的药物，二者可以同时、先后或分开使用。免疫抑制剂可以是类固醇、氨甲蝶呤、环磷酰胺、抗白细胞抗体(如CAMPATH-1)以及类似药物。
本发明还涉及联合使用凝聚素和IL-6。
已显示，给予肝素可以大大提高凝聚素的生物利用度，因此，本发明还涉及联合使用凝聚素和肝素制备治疗和/或预防周围神经疾病的药物，二者可以同时、先后或分开使用。
本文中使用的“肝素”是指本技术领域已知的全部肝素和类肝素，如上述“发明背景”中描述的那些，譬如低分子肝素(LMWH)。
本发明还涉及联合使用凝聚素和干扰素制备治疗和/或预防周围神经疾病的药物，二者可以同时、先后或分开使用。
本专利申请中使用的术语“干扰素”包括文献中所定义为干扰素(IFN)的任何分子，例如包括上述“发明背景”部分所提到的任何种类的IFN。优选的是人源干扰素，但其它物种来源的干扰素也可以，只要其生物学活性与人源干扰素一样，并且在人体内没有免疫原性。
特别是IFNα、IFN-β和IFN-γ都包括在上述定义中。其中IFN-β是本发明优选的干扰素。
本发明所用的术语“干扰素-β(IFN-β)”是指人成纤维细胞干扰素，通过从生物液体分离得到或通过DNA重组技术从原核或真核宿主细胞中获得。
也指干扰素的盐、功能性衍生物、突变体、类似物或片段。
也可以将干扰素与聚合物结合以改进该蛋白质的稳定性，例如，WO99/55377叙述了干扰素β和多元醇聚乙二醇(PEG)之间的共轭物。
在本发明另一优选实施方式中，干扰素是干扰素-β(IFN-β)，更优选是IFN-β1a。
凝聚素最好与干扰素同时、先后或分开使用。
本发明还涉及联合使用凝聚素和骨桥素制备治疗和/或预防周围神经疾病的药物，二者可以同时、先后或分开使用。
本发明所用的术语“骨桥素(osteopontin)”也包括骨桥素的突变蛋白、片段、活性部分和功能性衍生物。这些蛋白质的描述见WO02/092122。
在本发明的一个优选实施方式中，凝聚素的用量大约为每千克体重0.001-100毫克，或者大约每千克体重1-10毫克，或者大约每千克体重5毫克。
本发明还涉及利用核酸分子制备治疗和/或预防周围神经疾病的药物，其中核酸分子含有编码多肽的核酸序列，该多肽含有选自以下组的氨基酸序列之一：
a)含有SEQ ID NO：1的多肽；
b)含有SEQ ID NO：1的23到449氨基酸的多肽；
c)含有SEQ ID NO：1的35到449氨基酸的多肽；
d)含有SEQ ID NO：1的23到227氨基酸的多肽；
e)含有SEQ ID NO：1的35到227氨基酸的多肽；
f)含有SEQ ID NO：1的228到449氨基酸的多肽；
g)(a)到(f)的任何一个突变蛋白，其中的氨基酸序列与(a)到(f)中至少一个序列至少有40％、50％、60％、70％、80％或90％的同一性；
h)(a)到(f)的任何一个突变蛋白，该突变蛋白是由在温和严谨条件或高度严谨条件下能与编码(a)到(f)任何一个的天然DNA序列的互补序列杂交的DNA序列编码；
i)(a)到(f)的任何一个突变蛋白，其中，所述氨基酸序列的任何改变都是用保守性氨基酸取代(a)到(f)中任何一个的氨基酸；或者(a)到(f)的任何一个同种型、融合蛋白、功能性衍生物、活性部分或循环变换衍生物。
核酸分子可以裸核酸分子的形式通过肌肉注射给予。
它还可以包含载体序列，如病毒序列，以有利于核酸分子编码的基因在人体内表达，优选在适当细胞和组织内表达。
因此，在一个优选实施方式中，核酸分子还包括表达载体。表达载体序列是本领域熟知的，可以包含用作表达感兴趣基因的元件。它们也可以包含调节序列如启动子和增强子序列、选择标记物序列、复制起点以及类似序列。因此，基因治疗方法可用于疾病的治疗和/或预防。比较好的是凝聚素在原位表达。
在本发明的一个优选实施方式中，表达载体可以通过肌肉注射给予。
利用载体诱导和/或增加在正常情况下凝聚素表达停止或凝聚素表达量不足的细胞内内源性凝聚素的表达也是本发明所涉及的范围。载体可含有在希望表达凝聚素的细胞内起作用的调节序列。例如，这类调节序列可以是启动子或增强子。然后，可通过同源重组将该调节序列导入到基因组的正确基因座中，使调节序列与基因作可操作性相连，所需要的表达即被诱导或被增强。该技术通常称为“内源性基因激活”(EGA)，在WO91/09955中有所叙述。
本发明还涉及利用经过基因改造产生凝聚素的细胞制备治疗和/或预防周围神经疾病的药物。
本发明还涉及一种细胞，它经过基因改造能产生凝聚素，用于制备治疗和/或预防周围神经疾病的药物。因此，细胞治疗方法也可用于将药物运送到人体的适当位置。
本发明还涉及药物组合物，特别是用于预防和/或治疗周围神经疾病的药物组合物，该组合物含有治疗有效量的凝聚素和治疗有效量的肝素，还可以选择添加治疗有效量的免疫抑制剂。
本发明还涉及药物组合物，特别是用于预防和/或治疗周围神经疾病的药物组合物，该组合物含有治疗有效量的凝聚素和治疗有效量的干扰素，还可以选择添加治疗有效量的免疫抑制剂。
本发明还涉及药物组合物，特别是用于预防和/或治疗周围神经疾病的药物组合物，该组合物含有治疗有效量的凝聚素和治疗有效量的骨桥素，还可以选择添加治疗有效量的免疫抑制剂。
术语“药学上可接受的”的意思包括不会干扰活性成分的生物活性效果，并对给予的宿主无毒性的任何载体。例如，为了在肠胃外给药，活性蛋白可以制成注射用单位剂量形式，包含在载体如盐水，葡萄糖液，血清白蛋白和林格(Ringer)溶液中。
本发明药物组合物的活性成分可以以各种途径给予个体。给药途径包括皮内、透皮(如缓释形式)、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、口服、硬膜外、局部、鞘内、直肠内和鼻内等途径。也可采用其它有效治疗途径给药，例如通过上皮或内皮组织吸收或通过基因疗法将编码活性药物的DNA分子给予患者(如通过载体)，导致该活性药物在体内表达和分泌。此外，可将本发明的蛋白质与生物活性药物的其它组分，如药学上可接受的表面活性剂、赋形剂、载体、稀释剂和介质等，一起给予。
对于肠胃外(如静脉内、皮下、肌内)给药，可将活性蛋白质配制成溶液、悬浮液、乳液或冻干粉，这种冻干粉末能溶于药学上可接受的肠胃外介质(如水、盐水、葡萄糖液)以及能维持等渗性(如甘露糖醇)或化学稳定性(如防腐剂和缓冲液)的添加剂。以常规技术给制剂灭菌。
本发明的活性蛋白质也可用共轭方法增加分子在人体内的半衰期而改善其生物利用度。例如，如PCT专利申请WO92/13095所述那样，使分子与聚乙二醇连接。
活性蛋白的治疗有效量根据各种因素可以变化，包括蛋白质类型、蛋白质的亲和力、拮抗剂所表现的残留毒性、给药途径、病人的临床状态(包括希望所要维持的内源性凝聚素活性的非毒性水平)。
“治疗有效量”是给药后凝聚素能对周围神经疾病产生积极疗效的剂量。给药剂量，不论是单次剂量或重复给药剂量，都取决于各种因素，其中包括凝聚素的药物动力学性能、给药途径、病人的病情和身体特征(性别、年龄、体重、健康状况和身型大小)、症状轻重程度、当前的治疗措施、治疗频率和所要求的效果。
按照本发明，凝聚素的用量约为每千克体重0.001-10毫克，或约为每千克体重0.01-5毫克，或每千克体重0.1-3毫克，或每千克体重1-2毫克。更优选凝聚素的用量约为每千克体重0.1-1000微克，或每千克体重1-100微克，或每千克体重10-50微克。
本发明优选的给药途径是皮下注射，本发明更优选的是肌内注射。
在另一个优选实施方式中，凝聚素每日给药或隔日给药。
每日剂量通常分次给药或制成缓释剂型以有效地获得所希望的效果。第二次或随后给药可以与首次或原先给予该个体的相同剂量、小于或大于此剂量进行。可在发病时或发病前进行第二次或随后给药。
根据本发明，凝聚素可以在实施有效剂量的其它治疗方案或给予有效剂量的其它治疗药物(多种药物治疗方案)，特别是干扰素、同时或以后进行预防性或治疗性给药。与其它治疗药物同时给予的活性药物可以在一个组合物中，也可以在不同的组合物中。
本发明还涉及一种治疗周围神经疾病的方法，该方法包括给予需要的病人以有效剂量的凝聚素或凝聚素活性激动剂，可以选择性地添加药学上可接受的载体。
本发明还涉及一种治疗周围神经疾病的方法，该方法包括给予需要的病人以有效剂量的凝聚素或凝聚素活性激动剂，以及肝素，可以选择性地添加药学上可接受的载体。
本发明还涉及一种治疗周围神经疾病的方法，该方法包括给予需要的病人以有效剂量的凝聚素或凝聚素活性激动剂，以及干扰素，可以选择性地添加药学上可接受的载体。
本发明还涉及一种治疗周围神经疾病的方法，该方法包括给予需要的病人以有效剂量的凝聚素或凝聚素活性激动剂，以及骨桥素，可以选择性地添加药学上可接受的载体。
本文所引用的全部文献，包括期刊文章或摘要、公开或未公开的美国或外国专利申请、已授权的美国或外国专利或其它文献，均纳入本文参考文献中。包括引用文献中提供的全部数据、表格、图形及文字。此外，本文引用文献内所引用的内容也整体纳入作为参考。
总之，参考已知的方法步骤、常规的方法步骤、已知方法或常规方法并不是承认本发明的任何方面、叙述或实施方式均已在相关技术领域内被包括、被指导或被建议。
前面对特定实施方式的描述可以全面地揭示本发明的总体特征，其他人运用本领域的一般技术的常识(包括本文引用的参考文献的内容)可在无需过多的实验和不脱离本发明总体概念的条件下，不难对这些具体实施例的各种应用作出改变和/或调整。所以，根据本文的说明和指引可以在所描述的实施方式等效范围内进行这样一些应用和/或修改。很容易理解的是，本文的措辞或术语是为了描述而不具有限制性，因此本领域技术人员应按照本文的说明和指导，结合本领域普通技术人员所知道的常识来阐释本说明的措辞或术语。
根据到目前所描述的发明内容，可以很容易理解下面的实施例，这些实施例是以说明的方式来提供的，并不意味着对本发明进行限制。
实施例
实施例1：凝聚素的重组表达
按照以下方法在HEK细胞内表达带标记的重组小鼠或重组人凝聚素：
用1体积冷冻缓冲液A(50mM NaH2PO4；600mM NaCl；8.7％(w/v)甘油，pH 7.5)稀释含有带C端标记的重组蛋白质的培养基，配至终体积200ml。样品经0.22μm无菌过滤器(Millipore，500ml过滤单位)过滤，于4℃保持在无菌方形培养瓶(Nalgene)内。
纯化是在4℃进行，采用与自动样品加载器(Labomatic)连接的VISION工作站(Applied Biosystems)。纯化程序由两个连续步骤组成：第一步是对标记有特异性的亲和色谱法，第二步是用Sephadex G-25培养基(AmershamPharmacia)柱(1.0×10cm)进行凝胶过滤。
第一步色谱法得到洗脱蛋白质，收集到1.6ml馏分。
至于第二步色谱法，Sephadex G-25凝胶过滤柱用2ml缓冲液D(1.137MNaCl；2.7mM KCl；1.5mM KH2PO4；8mM Na2HPO4；pH7.2)再生，再用4柱体积缓冲液C(137mM NaCl；2.7mM KCl；1.5mM KH2PO4；8mMNa2HPO4；20％(w/v)甘油；pH7.4)平衡。从第一步骤亲和柱洗脱出来的峰值馏分自动通过与Sephadex G-25柱连接的VISION工作站上的整合样品加载器，蛋白质用缓冲液C洗脱，流速为2ml/min。脱盐后的样品回收得到2.2ml馏分。该馏分用0.22μm无菌离心过滤器(Millipore)过滤，冻干，冻存于-80℃。取样品的一等分试样作SDS-PAGE(4-12％NuPAGE凝胶；Novex)分析，方法是用考马斯染色和抗标记抗体的Western blot。
考马斯染色：NuPAGE凝胶在室温下用0.1％考马斯蓝R250染色溶液(30％甲醇，10％乙酸)染色1小时，再用20％甲醇，7.5％乙酸脱色，直至背景澄清，蛋白质带清晰可见。
Western blot：在电泳操作后，把蛋白质从凝胶电转移到硝基纤维素膜，电转移的条件是：290mA，1小时，4℃。硝基纤维素膜用在缓冲液E(137mMNaCl；2.7mM KCl；1.5mM KH2PO4；8mM Na2HPO4；0.1％Tween 20，pH7.4)中的5％奶粉室温封闭1小时，然后，在4℃下与2种兔多克隆抗标记抗体(G-18和H-15，各为0.2μg/ml，Santa Cruz)与在缓冲液E中的2.5％奶粉培育过夜。室温培养多1小时后，所述膜用缓冲液E(3×10分钟)洗涤，再与第二种HRP-连接的抗兔抗体(DAKO，HRP 0399)室温培育2小时，所述第二种抗兔抗体用含有2.5％奶粉的缓冲液E稀释至1/3000。用缓冲液E(3×10分钟)洗涤后，所述膜用ECL试剂盒(Amersham Pharmacia)显影1分钟。再将所述膜与超膜(Hyperfilm)(Amersham Pharmacia)接触，目测分析western blot影像。
蛋白质分析：用BCA蛋白质分析试剂盒(Pierce)测定蛋白质的浓度，以牛血清白蛋白为标准。平均蛋白质回收量是每100ml培养基回收到216μg纯化凝聚素。
在非还原的SDS PAGE上对纯化蛋白质进行分析，结果显示重组蛋白质具有天然凝聚素的异二聚结构(未示出)。
实施例2：凝聚素对小鼠坐骨神经压迫所诱导的神经病变的保护作用缩写
CMAP ：复合肌肉动作电位
DAC  ：坐骨神经压迫后的天数
DIV  ：体外天数
EMG  ：肌电描记法
IGF-1：胰岛素样生长因子
i.p.：腹腔内
i.v.：静脉内
s.c.：皮下
s.e.m.：均值的标准差
vs：对
前言
进行本研究以评价用不同剂量的凝聚素处理的小鼠内神经再生的情况。在此模型中，凝聚素对神经元和轴突(感觉和运动神经元)存活和再生，对髓鞘再生或巨噬细胞发炎有积极的作用，能导致运动功能恢复。根据感觉运动功能的恢复和形态学研究测定再生情况。所以，本研究平行进行电生理学记录和组织形态测量分析。
材料和方法
动物
采用72只8周龄的C57b1/6RJ雌性小鼠(Elevage Janvier，Le Genest-St-Isle，France)。它们共分为6组，每组12只：(a)载体假手术组；(b)载体处理的神经压迫组；(c)神经压迫/小鼠凝聚素(300μg/kg)组；(d)神经压迫/小鼠凝聚素(1000μg/kg)组；(e)神经压迫/4-甲基儿茶酚(10μg/kg)组；(f)神经压迫/骨桥素(100μg/kg)组。骨桥素(OPN)是一种高度磷酸化的唾液蛋白，是骨和牙齿矿化的细胞外基质的主要组成成分。WO02092122要求保护它及其活性激动剂在制备治疗和/或预防神经疾病的药物中的用途。
它们分组放在笼内饲养(每个笼12只动物)，置于恒温(21-22℃)的饲养室内，白天和黑夜颠峰(12h/12h)，随意进食和饮水。所有操作都按照研究指导手册进行。
坐骨神经的损伤
腹腔注射60mg/kg盐酸氨胺酮(Imalgène 500，Rhne Mérieux，Lyon，France)麻醉动物。在右大腿中部手术暴露右侧坐骨神经，在离其三根分叉部5mm压迫。用止血钳(宽1.5mm；Koenig；Strasbourg；France)夹住坐骨神经90度旋转压迫两次，每次30秒。
实验方案和药理治疗
在手术前记录一次肌电图(EMG)(作为基线)，手术后2周内每周再记录一次肌电图。
神经压迫手术的当天为0日(D)。手术后4天内不再进行实验。
每天记录动物体重和存活率。
从神经受损当天起直至实验结束，每日腹腔内(i.p)给予小鼠凝聚素(HEK细胞的重组小鼠凝聚素)或4-甲基儿茶酚，而骨桥素则通过皮下(s.c.)途径每日给予。
在第2周每组处死4只动物，分离坐骨神经作形态分析。
电生理记录
用Neuromatic 2000M电生理记录仪(EMG)(Dantec，Les Ulis，France)记录电生理信号。小鼠腹腔内注射100mg/kg盐酸氯胺酮(Imalgene 500，Rhne Mérieux，Lyon，France)使之麻醉。用加热灯加热使其维持正常的30℃体温，在尾巴上放置一个接触式温度计(Quick，Bioblock Scientific，Illkirch，France)控制温度。
以超极限强度(12.8mA)的电流给予坐骨神经一个0.2ms的刺激后测量腓肠肌的复合肌肉动作电位(CMAP)。记录动作电位的幅度(mV)、潜伏期(ms)和持续时间(去极化和复极化所需要的时间)。幅度是反映活性运动单位数目的指标，而远端潜伏期间接反映了运动神经传导和神经肌肉传递速率。
形态学分析
压迫神经后2周进行形态学分析。每组随机选取4只动物用于本实验。小鼠腹腔内注射100mg/kg Imalgène 500使之麻醉。取5mm的坐骨神经片段用于组织学分析。组织用溶于磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)中的4％戊二醛水溶液(Sigma，L’Isle d’Abeau-Chesnes，France)固定过夜，戊二醛水溶液使用前保存在30％蔗糖中，于4℃储存。神经在磷酸缓冲液溶解的2％四氧化锇(Sigma，L’Isle d’Abeau-Chesnes，France)固定2小时，然后用一系列乙醇溶液脱水，再用环氧树脂包被。包被的组织置于70℃使之聚合3天。用切片机切出1.5μm的横切面，用1％甲苯胺蓝(Sigma，L’Isle d’Abeau-Chesnes，France)染色2分钟，脱水后置于Eukitt上。在压迫位置中部获得横切面。用半自动数码影像分析软件(Biocom，France)进行形态学分析和计算纤维数量。分析变性和非变性有髓鞘纤维的比例。带有多小叶轴浆和/或不规则髓鞘的有髓鞘纤维是正经历变性过程的纤维。计算下列参数：轴突面积、髓磷脂面积以及纤维面积(轴突和髓磷脂面积)。
数据分析
对数据进行Global分析时用一种因素或重复测量方差的分析(ANOVA)以及用单向ANOVA和非-参数检验(Mann Whitney检验)。适当时可进一步进行Dunnett’s检验。显著性差异的水平设定为p＜0.05。结果以平均值±标准差(s.e.m.)来表示。
结果
经神经压迫处理后所有的动物都存活下来。整个实验过程中，有几只小鼠死亡：小鼠n°8(神经压迫/骨桥素组)和小鼠n°12(神经压迫/小鼠凝聚素(1mg/kg)组)死于第2天；小鼠n°9(神经压迫/载体组)和小鼠n°9(神经压迫/小鼠凝聚素(1mg/kg)组)死于第7天，死亡是由麻醉造成的。
动物体重
如图2所示，所有动物的体重在手术后2-3天内有轻微上升。动物体重的恢复是渐进的。以凝聚素作不同处理，不会导致坐骨神经受压迫的小鼠的体重与未处理小鼠有明显改变。
电生理学检测
复合肌肉动作电位的幅度(图3)：
整个实验中，假手术组动物的CMAP幅度无显著变化。相反，坐骨神经压迫诱导的CMAP幅度大大下降，在第7天和第14天，与假手术组动物各水平相比下降超过90％。当坐骨神经压迫小鼠用300μg/kg或1mg/kg凝聚素或者100μg/kg骨桥素处理后，它们的CMAP幅度与未处理小鼠的水平相比显著升高(约1.5倍)。类似地，用4-甲基儿茶酚处理也可使坐骨神经压迫小鼠的CMAP幅度升高，但与凝聚素或者骨桥素相比其升幅较小。
复合肌肉动作电位的潜伏期(图4)
整个实验中，假手术组动物的CMAP潜伏期没有变差。与之相反，坐骨神经压迫组小鼠的CMAP潜伏期比假手术组动物延长1.2倍。用凝聚素或者骨桥素处理坐骨神经压迫组的小鼠，它们的CMAP潜伏期与任一只未处理小鼠相比显著缩短。第7天，0.3mg/kg凝聚素和0.1mg/kg骨桥素处理后观察到动物表现出这种效果。第14天，凝聚素的两种浓度也表现出是有效的。
复合肌肉动作电位的持续时间(图5)：
假手术组动物的CMAP持续时间与基线值没有统计学差异。相反，坐骨神经压迫组小鼠的CMAP持续时间显著延长，特别是在第14天，CMAP持续时间比假手术组动物延长3倍。
当坐骨神经压迫组小鼠用300μg/kg凝聚素或者骨桥素处理后，它们的CMAP持续时间与用载体处理的坐骨神经压迫小鼠相比显著缩短。
形态学分析
在第14天实验结束后进行形态学分析。
变性(图6)和非变性纤维(图7)的百分率
如图6所示，假手术组动物(对照)坐骨神经的变性纤维百分率＜20％。当坐骨神经受到压迫，变性纤维的百分率显著增加至60％(神经压迫/载体)。小鼠用300μg/kg或1mg/kg凝聚素处理后，其变性纤维百分率与未处理组相比显著降低。
相反地，假手术组动物(对照)的非变性纤维百分率比未经处理的坐骨神经压迫组小鼠(神经压迫/载体)高2倍(图7)。小鼠用300μg/kg或1mg/kg凝聚素处理后，其非变性纤维的密度有明显增加。
结论
通过神经压迫可以造成很好的周围神经病变模型。神经被压迫后大多数大直径的神经纤维立刻就会失去功能，由于机械损伤其CMAP幅度显著下降。CMAP潜伏期不会立刻受到影响，但是在14天时会延长，这是由于受次级的免疫介导的变性作用(巨噬细胞、粒细胞)影响小直径纤维出现变性。CMAP持续时间在第7天时开始延长，14天达到高峰。第21天(未示出)，压迫所造成的损伤得以恢复，这是另一个与神经病变状态有关的感兴趣的过程。
凝聚素对神经压迫模型鼠的所有测量参数具有保护作用。压迫后2周的形态学分析表明变性纤维的百分率显著降低，总纤维数显著增加。凝聚素作为一个对照分子用在本实验中被证明是有效的，4-甲基儿茶酚对功能性或组织学指标无任何有显著意义的影响。这种对功能性或组织学指标的正效应是由于凝聚素具有以下效应：
-直接保护纤维免受次级免疫介导变性损伤的影响；
-加速髓鞘再生和保护轴突；
-加速受损轴突的再生/发芽；
-促进巨噬细胞清除髓磷脂碎片；
-调节巨噬细胞对轴突横切的应答。
实施例3：坐骨神经受压迫后皮下给予凝聚素加速功能恢复
前言
为了研究凝聚素处理对神经再生的长期影响，第2组动物连续4周每日(5次/周，皮下给予)被给予HEK细胞产生的重组人凝聚素进行处理。
材料和方法
将小鼠分为6组，每组6只动物，各组的处理方案如下：
(a)载体处理的神经压迫组；
(b)神经压迫/h-IL6(30μg/kg)；
(c)神经压迫/人凝聚素(0.1mg/kg)；
(d)神经压迫/人凝聚素(300μg/kg)；
(e)神经压迫/人凝聚素(1mg/kg)。
按照实施例2描述的程序进行，除了动物接受皮下注射(100μl/鼠)HEK细胞产生的重组人凝聚素而非通过腹腔注射重组小鼠凝聚素外。载体是NaCl0.9％、BSA 0.02％。阳性对照是重组人IL-6(30μg/kg，皮下)。如上所述，评价动物电生理和体重参数。
电生理记录
以超极限强度(12.8mA)的电流给予坐骨神经一个0.2ms的刺激后测量腓肠肌的复合肌肉动作电位(CMAP)。如上所述，在压迫侧(同侧)腓肠肌和相对侧(对侧)腓肠肌受压迫后第0、7、14、21和28天评价各个参数，即动作电位的幅度(mV)、潜伏期(ms)和持续时间。
胆碱乙酰转移酶(ChAT)活性
如实施3所述处理4周后，小鼠被麻醉并处死。收集对侧和同侧腓肠肌，对其分析胆碱乙酰转移酶(ChAT)活性，该种活性是神经元神经支配的指标。除了去掉冷冻乙酰辅酶A(acetyl-CoA)和加入对应于0.05μCi的0.25nmol of3H-acetyl-CoA之外，根据Contreras等人(Contreras等人，1995)描述的方案测定ChAT活性。
神经细丝-高分子量形式(NF-H)
NF-H及其磷酸化形式是轴突成熟的指标(Riederer等人，1996)。如实施3所述处理4周后，小鼠被麻醉并处死。收集神经并用三倍去污剂缓冲液提取，加工样品，通过蛋白质检测试剂盒(Pierce)分析它们的蛋白质含量，并通过夹心ELISA试验定量分析NF-H。
用ELISA分析NF-H时，采用下列方案：使捕获抗体即小鼠单克隆抗体SMI 31(抗-NF-H磷酸化形式，1/2500；Sternberger)与PBS在4℃培育过夜。培育板用含1％BSA的PBS封闭1小时。与样品培育2小时后，将检测抗体即兔多克隆N4142抗-NF抗体(1/1000；Sigma)用PBS-BSA稀释，培育2小时，与抗兔HRP连接的抗体(1/3000，Sigma；用PBS-BSA稀释，1小时)培育后通过过氧化物酶揭示。记录492nm处读取的每个光密度，绘制成牛NF-H(Sigma)的标准曲线，再得到每个样品的蛋白质含量。
结果
电生理测量
复合肌肉动作电位的幅度(图8)：
压迫后1周，在IL-6(30μg/kg)、人凝聚素(100、300或1000μg/kg)处理的动物或者载体处理组之间的CMAP幅度不存在显著性差异。从第15天至第28天，人凝聚素和IL-6处理的坐骨神经压迫组小鼠的CMAP幅度逐渐升高。4周后，凝聚素处理组小鼠的CMAP幅度与未处理小鼠相比有很显著的升高。
复合肌肉动作电位的潜伏期
测量载体、重组人IL-6(30μg/kg)或人凝聚素(100、300和1000μg/kg)处理的神经病变小鼠的CMAP潜伏期。在坐骨神经损伤后第1、2、3或4周对同侧和对侧进行测量。结果见下表(表1)：
表1
                潜伏期(ms)                      潜伏期(ms)
  对侧7DAC   对侧14DAC   对侧21DAC   对侧28DAC   同侧7DAC   同侧14DAC   同侧21DAC   同侧28DAC
载体h-IL630μg/kg凝聚素0.1mg/kg凝聚素0.3mg/kg凝聚素1mg/kg   0.790.04   0.850.03   0.870.04   0.790.06 载体h-IL630μg/kg凝聚素0.1mg/kg凝聚素0.3mg/kg凝聚素1mg/kg   0.97#a0.09#   0.970.07   1.32***a0.09***   1.08**a0.06**
  0.770.04   0.810.05   0.740.03   0.770.05   0.950.09   0.910.04   0.91*b0.10   0.91*b0.04
  0.90*b0.02   0.79005   0.740.06   0.690.01   0.930.06   0.890.01   1.04*b008   0.940.07
  0.830.04   0.880.02   0.870.02   0.700.04   0.920.09   0.900.04   0.89**b0.05   0.90#b006
  0.850.04   0.860.03   0.790.03   0.760.05   0.830.04   0.910.03   1.04*b006   0.97b0.06
a：针对对侧数值的Anova单因素检验
b：针对载体处理组数值的Anova单因素检验
斜体数字代表标准差(SD)
N＝6小鼠/组；#p＜0.1，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.005
整个实验中，对侧的CMAP潜伏期没有变差，除了在第7天0.1mg/kg凝聚素处理小鼠之外。与之相反，同侧的CMAP潜伏期在压迫后延长。IL-6和凝聚素处理小鼠的同侧CMAP潜伏期与任一只未处理的小鼠相比显著缩短。第21天和第28天(DAC)，给予重组IL-6和凝聚素(1和0.3mg/kg)能使潜伏期的恢复得到显著改善。
复合肌肉动作电位的持续时间
与上述潜伏期一样，测量各组动物同侧和对侧的CMAP持续时间，结果见表2：
表2
                  持续时间(ms)                  持续时间(ms)
  对侧7DAC   对侧14DAC   对侧21DAC   对侧28DAC   同侧7DAC   同侧14DAC   同侧21DAC   同侧28DAC
载体h-IL630μg/kg凝聚素0.1mg/kg凝聚素0.3mg/kg凝聚素1mg/kg   2.00.1   2.50.2   2.90.2   2.90.2 载体h-IL630μg/kg凝聚素0.1mg/kg凝聚素0.3mg/kg凝聚素1mg/kg   3.5#a0.7   4.4**a0.4   3.80 8   3.00.2
  2.5#b0.3   2.0*b0.2   3.00.2   2.90.1   2.60.2   3.60.3   3.40.1   3.00.1
  2.5*b02   2.0*b0.1   2.90.3   2.90.1   2.70.1   4.10.5   3.20.2   2.90.3
  2.3*b01   2.20.2   2.90.2   3.00.1   2.70.1   3.90.4   2.6***b01   3.40.2
  2.10.1   2.10.2   2.60.3   2.90.1   2.60.2   3.4#b04   3.0#b0.2   3.10.2
A：针对对侧数值的Anova单因素检验
b：针对载体处理组数值的Anova单因素检验
斜体数字代表标准差(SD)
N＝6小鼠/组；#p＜0.1，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.005
在载体处理组中，坐骨神经压迫后同侧CMAP持续时间延长，4周后恢复至对侧水平。凝聚素(1和0.3mg/kg)处理减少了CMAP持续时间的延长，并加速了它的恢复。
胆碱乙酰转移酶(ChAT)活性(图9)
压迫4周后，同侧腓肠肌的胆碱乙酰转移酶(ChAT)活性还未完全恢复(图9a)。凝聚素处理对腓肠肌的ChAT活性恢复稍微有利。人凝聚素处理小鼠的对侧腓肠肌的ChAT含量与载体处理动物相比有所增加(图9b)。
神经细丝-高分子量形式(NF-H)(图10)：
压迫4周后，载体处理组动物的坐骨神经近端部分(压迫位置以上，图10b)和远端部分(压迫位置以下，图10c)的NF-H水平与对侧神经(图10a)的NF-H水平是不同的。凝聚素处理使对侧和压迫神经近端部分的NF-H含量增加。
结论
处理15天后获得的这些结果(实施例2)表明，凝聚素在处理神经压迫模型鼠具有有益的效果。取决于处理时间，这种效果可反映在所有被研究的复合动作肌肉电位(CAMP)参数上，即潜伏期、持续时间和幅度。凝聚素处理也使压迫和对侧神经的ChAT和NF-H水平增加。观察不到对体重有任何不利影响(数据未示出)。
实施例4：凝聚素刺激成熟海马趾切片培养内髓磷脂碱性蛋白(MBP)形成前言
神经受损或发病后调节神经再生不仅需要轴突发芽和延长，而且要求有新的髓磷脂合成。髓鞘再生对正常神经传导和保护轴突免受例如兴奋毒性或免疫攻击是必要的。因为髓磷脂修复最主要是重复再生事件(Capello等人，1997；Kuhn等人，1993)，所以利用器官型海马趾切片培养模拟发育的髓鞘再生(developmental demyelination)。更准确地说，通过ELISA监测髓磷脂碱性蛋白(MBP)水平，MBP是一种代表成熟少突胶质细胞和施万细胞的蛋白质。
材料和方法
器官型海马趾切片培养
根据Stoppini等人描述的方法(Stoppini等人，1991)制备器官型海马趾切片培养。简言之，从五天龄的C57/B16小鼠获得海马。通过Mcillvain组织切片机切成500微米厚的切片。然后把切片置于Millicell-CM植入物上，后者放在含1ml培养基(50％MEM、25％HBSS、25％马血清)的6孔板内。在5％CO2、37℃条件下培养6天，再把温度调到33℃。每3天更换培养基。
发育的髓鞘再生
测试凝聚素提高髓鞘再生的能力，一般情况下髓鞘再生在体外发生于最初3周。
首先，第7天起直至第17天用在含马血清(25％)的培养基中的小鼠凝聚素(1μg/ml、100ng/ml和10ng/ml)处理切片。每2天重复处理。
处理结束时(即处理第3天、第6天和第10天，分别对应于体外第10天、第13天和第17天)，用三倍去污剂缓冲液溶解切片(每组6片)，并通过MBPELISA试验分析MBP含量。
此实验进行二次，结果示于图11。
当用HEK或CHO细胞产生的重组人凝聚素代替重组小鼠凝聚素，也获得类似结果(数据未示出)。
MBP ELISA
在不同时间点溶解样品后，加工样品，以蛋白质检测试剂盒(Pierce)分析蛋白质含量，以夹心ELISA试验定量分析MBP。
按照下列方案进行MBP-ELISA。使捕获抗体即小鼠单克隆抗体抗-MBP(1/5000；Chemicon)用PBS稀释，并在4℃培育过夜。培育板用含1％BSA的PBS封闭1小时。样品用PBS稀释后培育2小时。将检测抗体即兔多克隆抗-MBP(1/300；Zymed)用PBS-BSA稀释，培育2小时，与抗兔HRP连接的抗体(1/3000，Sigma；用PBS-BSA稀释，1小时)培育后通过过氧化物酶揭示。记录492nm处读取的每个光密度，绘制成MBP(InVitrogen)的标准曲线，再得到每个样品的蛋白质含量。
结果
在开始培养时，P4小鼠(出生后4天)的海马趾切片不表达可检测水平的MBP。随着海马趾切片成熟，ELISA检测的MBP水平逐渐增加，在体外21天(DIV)后达到稳定水平(数据未示出)。
在第7天、第10天和第14天(DIV)向培养基加入10、100和1000ng/ml重组人凝聚素，在加入蛋白质后3天实施MBP-ELISA进行评价，发现海马趾切片培养的MBP含量增加。图11所示为用1μg/ml小鼠凝聚素处理切片的MBP含量。当第21天(DIV)髓磷脂发育完成，发现MBP不再增加(数据未示出)。
用小鼠凝聚素的其他浓度(10和100ng/ml)以及用人凝聚素都获得相似的结果(数据未示出)。
结论
凝聚素刺激海马趾切片培养内MBP形成，而又不影响成熟海马趾切片可检测的总量。
实施例5：凝聚素通过抗-MOG抗体和幼田鼠补体保护海马趾切片免受脱髓鞘作用
前言
慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病变(CIDP)和格-巴综合征(GBS)的一个特征是髓磷脂(包括髓磷脂组成成分)分解，这种现象被认为是由于存在抗神经的自身免疫反应所引起(Ho等人，1998；Kwa等人，2003；Steck等人，1998)。为了模拟抗体诱导的脱髓鞘作用，建立一个体外系统，其中器官型海马趾切片培养用抗-MOG(髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白)抗体与幼田鼠补体联合处理2天。该处理导致产生特异性的脱髓鞘，这是因为与对照免疫球蛋白处理匹配的同种型不会诱导大量的脱髓鞘。利用此系统测试凝聚素的保护作用。在此示例中，凝聚素是在脱髓鞘处理前一天以及伴随脱髓鞘处理加入的。通过ELISA监测MBP水平(详细情况见实施例4)。
材料和方法
脱髓鞘方案
按照实施例4所述的方法制备切片(器官型海马趾切片培养横切面)，在体外第21天(DIV)后发育的脱髓鞘结束时对这些切片加以处理。
诱导切片脱髓鞘的处理方法是在含25％马血清的培养基中用幼兔补体相关的抗-MOG抗体(按批量为1/60-1/30；CL-3441，Cedarlane)处理切片2天。
作为对照，用不相关抗体IgG1(60μg/ml；M-7894，Sigma)处理切片，而且补体或切片未经处理。
处理结束时，用三倍去污剂缓冲液溶解切片(每组5片)，并用MBP ELISA分析髓磷脂含量。
先施加1μg/ml、100ng/ml或10ng/ml重组小鼠凝聚素，24小时后再进行脱髓鞘处理，以及在处理时加入上述重组小鼠凝聚素(总共3天)。
本实施进行三次，结果见图12。
当这些实验用HEK或CHO细胞产生的重组人凝聚素代替重组小鼠凝聚素进行，也获得类似结果(数据未示出)。
结果
本实验的结果示于图12。在抗-MOG/补体处理时向培养基加入低至10ng/ml凝聚素能产生显著的保护作用，免于脱髓鞘。
结论
在自身免疫介导的脱髓鞘模型中，凝聚素通过抗-MOG和补体诱导来保护免于发生脱髓鞘作用。
实施例6：共注射凝聚素和肝素
前言
已经知道，凝聚素在血清中可以与多种蛋白质结合(综述见Trougakos和Gonos(Trougakos and Gonos，2002)以及Jones和Jomary(Jones and Jomary，2002)，并且呈递多个推定位点(见图1，方案基于Rosenberg and Silkensen，1995)。在这些位点中有4个被认为是肝素结合域。为了研究这些肝素结合域与凝聚素生物利用度的关系，测试了肝素在此情况下Liquemine(Roche)对凝聚素药物动力学的影响。
材料和方法
第一实验
给3组C57B16雌性小鼠(8周龄，20g)静脉注射以下物质，每组6只：
-第1组：先注射在100μl 0.9％NaCl中的肝素(7500U/kg)，5分钟后注射在100μl 0.9％NaCl中的人凝聚素(300μg/kg)。
-第2组：注射在100μl 0.9％NaCl中的人凝聚素(300μg/kg)和肝素(7500U/kg)混合液。
-第3组：单独注射300μg/kg人凝聚素。
注射凝聚素后5分钟和30分钟把血液收集在试管内。属于第3组的小鼠血液收集在装有肝素或者无肝素的试管(+/-肝素)。然后，按照下文所述方法用ELISA试验研究凝聚素是否存在。
第二实验
给3组C57B16雌性小鼠(8周龄，20g)静脉注射以下物质，每组6只：
-第1组：先注射在100μl 0.9％NaCl中的肝素(7500U/kg)，5分钟后注射在100μl 0.9％NaCl中的人凝聚素(1mg/kg)。第1组接受在100μl 0.9％NaCl中的人凝聚素(1mg/kg)和肝素(7500U/kg)混合液。
-第2组：单独注射1mg/kg人凝聚素。在注射人凝聚素后28分钟注射肝素(7500U/kg)(即30分钟出血点之前2分钟)。
-第3组：单独注射1mg/kg人凝聚素。
注射凝聚素后5和30分钟收集血液。然后，按照下文所述方法用ELISA试验监测血清中凝聚素的水平。
凝聚素ELISA试验
以单克隆抗体41D(1/1000-50μl，Upstate N.05-354)为捕获抗体，设计夹心ELISA试验。室温下用封闭缓冲液(1％BSA(馏分V)/0.1％Tween-20，溶剂为0.5M NaCl)封闭剩余的结合位点。用在PBS中的一系列稀释液测试含有重组人凝聚素的血清样品。接着，用PBS/0.05％Tween-20洗4次。以标签生物素共轭物(1/1000，Qiagen N.34440)作为揭示抗体(revealing antibody)。室温下通过链亲和素连接的辣根过氧化物酶(Streptavidin-HRP，1/5000，用PBS稀释，DAKO P0397)监测揭示抗体是否存在，保持1小时，然后进行OPD反应(Sigma)。
结果
如图13A所示，先使凝聚素与肝素(凝聚素与肝素混合)预培育或者注射凝聚素之前先注射肝素(即先注射肝素再注射凝聚素)，大大提高了(p＜0.005)凝聚素的生物利用度。相反，在含肝素的试管内收集凝聚素不会改变被检测凝聚素的水平。
若第二次出血之前给予肝素(第二实验中第2组，见图13B)，在血清中检测到的凝聚素水平比共注射肝素与凝聚素的情况显著降低(p＜0.05)。不过，收集血液之前注射肝素与单独注射凝聚素相比，可检测凝聚素的水平稍微升高(p＜0.1)。
结论
给予肝素能显著提高凝聚素的生物利用度(图13A)。然而，要使肝素的功效充分发挥出来，需要在送入凝聚素之前注射肝素或者同时注射肝素与凝聚素(图13B)。
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序列表
<110>应用研究系统ARS股份公司
<120>凝聚素在治疗和/或预防周围神经疾病中的用途
<130>057538
<160>1
<170>PatentIn版本3.1
<210>1
<211>449
<212>PRT
<213>智人
<400>1
Met Met Lys Thr Leu Leu Leu Phe Val Gly Leu Leu Leu Thr Trp Glu
1               5                   10                  15
Ser Gly Gln Val Leu Gly Asp Gln Thr Val Ser Asp Asn Glu Leu Gln
            20                  25                  30
Glu Met Ser Asn Gln Gly Ser Lys Tyr Val Asn Lys Glu Ile Gln Asn
        35                  40                  45
Ala Val Asn Gly Val Lys Gln Ile Lys Thr Leu Ile Glu Lys Thr Asn
    50                  55                  60
Glu Glu Arg Lys Thr Leu Leu Ser Asn Leu Glu Glu Ala Lys Lys Lys
65                  70                  75                  80
Lys Glu Asp Ala Leu Asn Glu Thr Arg Glu Ser Glu Thr Lys Leu Lys
                85                  90                  95
Glu Leu Pro Gly Val Cys Asn Glu Thr Met Met Ala Leu Trp Glu Glu
            100                 105                 110
Cys Lys Pro Cys Leu Lys Gln Thr Cys Met Lys Phe Tyr Ala Arg Val
        115                 120                 125
Cys Arg Ser Gly Ser Gly Leu Val Gly Arg Gln Leu Glu Glu Phe Leu
    130                 135                 140
Asn Gln Ser Ser Pro Phe Tyr Phe Trp Met Asn Gly Asp Arg Ile Asp
145                 150                 155                 160
Ser Leu Leu Glu Asn Asp Arg Gln Gln Thr His Met Leu Asp Val Met
                165                 170                 175
Gln Asp His Phe Ser Arg Ala Ser Ser Ile Ile Asp Glu Leu Phe Gln
            180                 185                 190
Asp Arg Phe Phe Thr Arg Glu Pro Gln Asp Thr Tyr His Tyr Leu Pro
        195                 200                 205
Phe Ser Leu Pro His Arg Arg Pro His Phe Phe Phe Pro Lys Ser Arg
    210                 215                 220
Ile Val Arg Ser Leu Met Pro Phe Ser Pro Tyr Glu Pro Leu Asn Phe
225                 230                 235                 240
His Ala Met Phe Gln Pro Phe Leu Glu Met Ile His Glu Ala Gln Gln
                245                 250                 255
Ala Met Asp Ile His Phe His Ser Pro Ala Phe Gln His Pro Pro Thr
            260                 265                 270
Glu Phe Ile Arg Glu Gly Asp Asp Asp Arg Thr Val Cys Arg Glu Ile
        275                 280                 285
Arg His Asn Ser Thr Gly Cys Leu Arg Met Lys Asp Gln Cys Asp Lys
    290                 295                 300
Cys Arg Glu Ile Leu Ser Val Asp Cys Ser Thr Asn Asn Pro Ser Gln
305                 310                 315                 320
Ala Lys Leu Arg Arg Glu Leu Asp Glu Ser Leu Gln Val Ala Glu Arg
                325                 330                 335
Leu Thr Arg Lys Tyr Asn Glu Leu Leu Lys Ser Tyr Gln Trp Lys Met
            340                 345                 350
Leu Asn Thr Ser Ser Leu Leu Glu Gln Leu Asn Glu Gln Phe Asn Trp
        355                 360                 365
Val Ser Arg Leu Ala Asn Leu Thr Gln Gly Glu Asp Gln Tyr Tyr Leu
    370                 375                 380
Arg Val Thr Thr Val Ala Ser His Thr Ser Asp Ser Asp Val Pro Ser
385                 390                 395                 400
Gly Val Thr Glu Val Val Val Lys Leu Phe Asp Ser Asp Pro Ile Thr
                405                 410                 415
Val Thr Val Pro Val Glu Val Ser Arg Lys Ash Pro Lys Phe Met Glu
            420                 425                 430
Thr Val Ala Glu Lys Ala Leu Gln Glu Tyr Arg Lys Lys His Arg Glu
        435                 440                 445
Glu

Claims (25)

1.凝聚素、其同种型、突变蛋白、融合蛋白、功能性衍生物、活性部分、循环变换衍生物或其盐，或者凝聚素活性激动剂在制备治疗和/或预防周围神经疾病的药物中的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其中，所述周围神经疾病选自由周围神经系统的创伤性神经损伤、周围神经系统的脱髓鞘疾病、周围神经病变和周围神经退化性疾病组成的组。
3.如权利要求1或2所述的用途，其中，所述周围神经疾病由先天性代谢障碍引起。
4.如上述任一权利要求所述的用途，其中，所述周围神经疾病是周围神经病变。
5.如权利要求4所述的用途，其中，所述周围神经病变是糖尿病性神经病变。
6.如权利要求4所述的用途，其中，所述周围神经病变是化疗诱导的神经病变。
7.如上述任一权利要求所述的用途，其中，所述凝聚素选自以下组：
a)含有SEQ ID NO：1的多肽；
b)含有SEQ ID NO：1的23到449氨基酸的多肽；
c)含有SEQ ID NO：1的35到449氨基酸的多肽；
d)含有SEQ ID NO：1的23到227氨基酸的多肽；
e)含有SEQ ID NO：1的35到227氨基酸的多肽；
f)含有SEQ ID NO：1的228到449氨基酸的多肽；
g)(a)到(f)的任何一个突变蛋白，其中的氨基酸序列与(a)到(f)中至少一个序列至少有40％、50％、60％、70％、80％或90％的同一性；
h)(a)到(f)的任何一个突变蛋白，该突变蛋白是由在温和严谨条件或高度严谨条件下能与编码(a)到(f)任何一个的天然DNA序列的互补序列杂交的DNA序列编码；
i)(a)到(f)的任何一个突变蛋白，其中，所述氨基酸序列的任何改变都是用保守性氨基酸取代(a)到(f)中任何一个的氨基酸；
j)(a)到(f)的任何一个盐或同种型、融合蛋白、功能性衍生物、活性部分或循环变换衍生物。
8.如权利要求7所述的用途，其中，所述功能性衍生物包含一个PEG基团。
9.如权利要求7或8所述的用途，其中，所述融合蛋白含有一个免疫球蛋白(Ig)融合子。
10.如上述任一权利要求所述的用途，其中，所述药物还含有同时、先后或分开使用的肝素。
11.如上述任一权利要求所述的用途，其中，所述药物还含有同时、先后或分开使用的干扰素和/或骨桥素。
12.如权利要求11所述的用途，其中，所述干扰素是干扰素-β。
13.如上述任一权利要求所述的用途，其中，所述凝聚素的用量约为每千克体重0.001-100毫克，或者每千克体重1-10毫克，或每千克体重5毫克。
14.核酸分子在制备治疗和/或预防周围神经疾病的药物中的用途，其中，所述核酸分子含有编码多肽的核酸序列，该多肽含有选自以下组的氨基酸序列：
a)含有SEQ ID NO：1的多肽；
b)含有SEQ ID NO：1的23到449氨基酸的多肽；
c)含有SEQ ID NO：1的35到449氨基酸的多肽；
d)含有SEQ ID NO：1的23到227氨基酸的多肽；
e)含有SEQ ID NO：1的35到227氨基酸的多肽；
f)含有SEQ ID NO：1的228到449氨基酸的多肽；
g)(a)到(f)的任何一个突变蛋白，其中的氨基酸序列与(a)到(f)中至少一个序列至少有40％、50％、60％、70％、80％或90％的同一性；
h)(a)到(f)的任何一个突变蛋白，该突变蛋白是由在温和严谨条件或高度严谨条件下能与编码(a)到(f)任何一个的天然DNA序列的互补序列杂交的DNA序列编码；
i)(a)到(f)的任何一个突变蛋白，其中，所述氨基酸序列的任何改变都是用保守性氨基酸取代(a)到(f)中任何一个的氨基酸；或者(a)到(f)的任何一个同种型、融合蛋白、功能性衍生物、活性部分或循环变换衍生物。
15.如权利要求14所述的用途，其中，所述核酸分子还含有表达载体序列。
16.能诱导和/或增强内源性凝聚素或凝聚素活性激动剂产生的细胞内载体在制备治疗和/或预防周围神经疾病的药物中的用途。
17.如权利要求14至16中任一项所述的用途，用于基因治疗。
18.经过基因改造能产生凝聚素或凝聚素活性激动剂的细胞在制备治疗和/或预防周围神经疾病的药物中的用途。
19.含有凝聚素或凝聚素活性激动剂及肝素的药物组合物，可选择性添加一或多种药学上可接受的赋形剂，该组合物用于治疗和/或预防周围神经疾病。
20.含有凝聚素或凝聚素活性激动剂及干扰素的药物组合物，可选择性添加一或多种药学上可接受的赋形剂，该组合物用于治疗和/或预防周围神经疾病。
21.含有凝聚素或凝聚素活性激动剂及骨桥素的药物组合物，可选择性添加一或多种药学上可接受的赋形剂，该组合物用于治疗和/或预防周围神经疾病。
22.一种治疗周围神经疾病的方法，所述方法包括给予需要治疗的病人有效剂量的凝聚素或凝聚素活性激动剂，可选择性添加药学上可接受的载体。
23.一种治疗周围神经疾病的方法，所述方法包括给予需要治疗的病人有效剂量的凝聚素或凝聚素活性激动剂及肝素，可选择性添加药学上可接受的载体。
24.一种治疗周围神经疾病的方法，所述方法包括给予需要治疗的病人有效剂量的凝聚素或凝聚素活性激动剂及干扰素，可选择性添加药学上可接受的载体。
25.一种治疗周围神经疾病的方法，所述方法包括给予需要治疗的病人有效剂量的凝聚素或凝聚素活性激动剂及骨桥素，可选择性添加药学上可接受的载体。
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