CN101848934A - 使用nap样和sal样肽模拟物的神经保护 - Google Patents

Abstract

本发明涉及模拟神经保护性肽NAPVISPQ(NAP)和SALLRSIPA(SAL)的肽，以及它们在治疗神经元功能障碍、神经变性疾病、认知障碍、神经精神疾病和自体免疫疾病中的应用。

Description

使用NAP样和SAL样肽模拟物的神经保护

与相关申请的交叉参考

本申请要求2007年8月24日提交的美国临时申请No.60/957,790的权益；在此为所有目的将其引为参考。

发明领域

本发明涉及NAP样和SAL样肽模拟物、多肽或从它们衍生的小分子，以及它们在治疗神经元功能障碍、神经变性疾病、认知障碍、神经精神疾病和自体免疫疾病中的应用。

发明背景

NAP，一种8个氨基酸的肽(NAPVSIPQ，SEQ ID NO：1)，源自于活性依赖性神经保护蛋白ADNP(美国专利No.6,613,740；Bassan等，J.Neurochem.72：1283-1293(1999))。ADNP基因中的NAP序列，在啮齿动物和人类中是一致的(美国专利No.6,613,740；Zamostiano等，J.Biol.Chem.276：708-714(2001))。

在细胞培养物中，已经显示出飞摩尔(femtomolar)浓度的NAP具有针对多种多样毒素的神经保护活性(Bassan等，1999；Offen等，Brain Res.854：257-262(2000))。在模拟阿茨海默氏病部分病理学的动物模型中，NAP也是保护性的(Bassan等，1999；Gozes等，J.Pharmacol.Exp.Ther.293：1091-1098(2000)；也参见美国专利No.6,613,740)。在正常的衰老大鼠中，NAP鼻内给药改善了在Morris水迷宫(Morris watermaze)中的表现(Gozes等，J.Mol.Neurosci.19：175-178(2002))。此外，局部缺血损伤后，NAP通过减少凋亡(Leker等，Stroke 33：1085-1092(2002))和在小鼠中通过减少炎症而降低由闭合性头部外伤引起的损伤(Beni Adani等，J.Pharmacol.Exp.Ther.296：57-63(2001)；Romano等，J.Mol Neurosci.18：37-45(2002)；Zaltzman等，NeuroReport 14：481-484(2003))，降低了梗塞体积和运动机能缺损。在胎儿酒精综合征模型中，NAP处理抑制了腹膜内注射酒精后胎儿的死亡(Spong等，J.Pharmacol.Exp.Ther.297：774-779(2001)；也参见国际PCT申请公布No.WO00/53217)。利用放射性标记的肽，这些研究显示，NAP可以跨过血脑屏障，并在鼻内处理(Gozes等，2000)或静脉内注射(Leker等，2002)或腹膜内给药(Spong等，2001)后，可以在啮齿动物的脑中检测到。

SAL，一种9个氨基酸的肽(SALLRSIPA，SEQ ID NO：19)，也被称为ADNF-9或ADNF-1，被鉴定为ADNF的最短活性形式(参见美国专利No.6,174,862)。在体外分析和体内疾病模型中，已经显示SAL对各种不同攻击作出响应，保持中枢神经系统的神经元存活(例如Gozes等，2000；Brenneman等，J.Pharmacol.Exp.Ther.285：619-627(1998))。D-SAL是SAL的全D-氨基酸衍生物，它是稳定的，口服可利用(Brenneman等，J Pharmacol Exp Ther.309：1190-7(2004))，并且出人意料地在测试的系统中表现出与SAL相似的生物学活性(潜能和功效)。ADNF-1复合物描述在国际PCT申请公布No.WO03/022226中。

神经活性肽，例如NAP和SAL，对即使单个氨基酸的保守取代也表现出极端的敏感性。参见例如Brenneman等，J.Pharm.Ex.Ther.，285：619-627(1998)和Wilkemeyer等，Proc.Natl.Acad.Sci，USA，100：8543-8(2003)。因此，尽管NAP和SAL是模型神经活性肽，但即使是它们核心序列的保守肽变异，预计也将是无治疗效果的。因此，尽管在该领域已有进展，但对其他神经活性肽仍存在着需求。本发明解决了这种以及其他需求。

发明内容

本发明提供了生物活性的NAP样肽模拟物或SAL样肽模拟物，以及制造和使用这些肽的方法。NAP样肽模拟物或SAL样肽模拟物的分子式是(R¹)_a-(R²)-(R³)_b。R¹是含有1到大约40个氨基酸的氨基酸序列，其中每个氨基酸独立地选自天然存在的氨基酸和氨基酸类似物。R²是下列序列之一：NATLSIHQ(SEQ ID NO：4)，STPTAIPQ(SEQ ID NO：6)，NAVLSIHQ(SEQ ID NO：2)，NATLSVHQ(SEQ ID NO：3)，NATLSIVHQ(SEQ ID NO：5)，NTPVSIPQ(SEQ ID NO：7)，APVSIPQ(SEQ IDNO：8)，NTPISIPQ(SEQ ID NO：9)，NAPVSIP(SEQ ID NO：10)，NAPVAVPQ(SEQ ID NO：11)，NARVSIPQ(SEQ ID NO：12)，DAPVSVPQ(SEQ ID NO：13)，ALLRSIPA(SEQ ID NO：20)，ALLRSIP(SEQ ID NO：21)，AMLRSIPA(SEQ ID NO：22)，ALLRAIPA(SEQID NO：23)，SALLRSIP(SEQ ID NO：24)，SALLRAIP(SEQ ID NO：25)，ALLRTIPA(SEQ ID NO：26)和ALLRSVPA(SEQ ID NO：27)。R³是含有1到大约40个独立选择的氨基酸、例如天然存在的氨基酸或氨基酸类似物的氨基酸序列，a和b独立选择，并且等于0或1。该分子式明确除外序列NAPVSIPQ(SEQ ID NO：1)或SALLRSIPA(SEQ ID NO：19)。

在一个实施方案中，NAP样肽模拟物或SAL样肽模拟物包含核心序列，即选自NATLSIHQ(SEQ ID NO：4)和STPTAIPQ(SEQ ID NO：6)的R²。

在另一个实施方案中，NAP样肽模拟物或SAL样肽模拟物只包含核心氨基酸序列，即R²。也就是说，a和b都等于0。

在一个实施方案中，NAP样肽模拟物或SAL样肽在核心氨基酸序列、即R²中，包含至少一个D-氨基酸。

在一个实施方案中，NAP样肽模拟物或SAL样肽——即R²——的每个氨基酸都是D-氨基酸。

在另一个实施方案中，NAP样肽模拟物或SAL样肽模拟物包含至少一个保护基团。

在一个实施方案中，NAP样肽模拟物或SAL样肽模拟物包含核心氨基酸序列NATLSIHQ(SEQ ID NO：4)。在其他实施方案中，NAP样肽模拟物或SAL样肽模拟物由核心氨基酸序列NATLSIHQ(SEQ IDNO：4)构成。在其他实施方案中，核心氨基酸序列NATLSIHQ(SEQ IDNO：4)包含至少一个D-氨基酸。在另一个实施方案中，核心氨基酸序列NATLSIHQ(SEQ ID NO：4)的每个氨基酸都是D-氨基酸。

在一个实施方案中，NAP样肽模拟物或SAL样肽模拟物包含核心氨基酸序列STPTAIPQ(SEQ ID NO：6)。在其他实施方案中，NAP样肽模拟物或SAL样肽模拟物由核心氨基酸序列STPTAIPQ(SEQ IDNO：6)构成。在其他实施方案中，核心氨基酸序列STPTAIPQ(SEQ IDNO：6)包含至少一个D-氨基酸。在另一个实施方案中，核心氨基酸序列STPTAIPQ(SEQ ID NO：6)的每个氨基酸都是D-氨基酸。

另一方面，本发明提供了包含具有上述分子式的NAP样肽模拟物或SAL样肽模拟物的药物组合物。该药物组合物也可以包含第二种神经保护多肽，例如含有NAPVSIPQ(SEQ ID NO：1)或SALLRSIPA(SEQID NO：19)的神经保护多肽。

另一方面，本发明提供了在对象中治疗或预防神经变性疾病、认知障碍、自身免疫疾病、外周神经毒性、运动机能障碍、感觉机能障碍、焦虑、抑郁症、精神分裂症、精神病、与胎儿酒精综合征相关的病症、涉及视网膜变性的病症、影响学习和记忆的疾病或神经精神疾病的方法，方法是通过给需要治疗的对象施用治疗有效量的、具有上面列出的分子式的NAP样肽模拟物或SAL样肽模拟物，从而在该对象中治疗或预防神经变性疾病、认知障碍、自身免疫疾病、外周神经毒性、运动机能障碍、感觉机能障碍、焦虑、抑郁症、精神分裂症、精神病、与胎儿酒精综合征相关的病症、涉及视网膜变性的病症、影响学习和记忆的疾病或神经精神疾病。在优选实施方案中，施用的NAP样肽模拟物或SAL样肽模拟物包含下列氨基酸序列之一：NATLSIHQ(SEQ IDNO：4)和STPTAIPQ(SEQ ID NO：6)。

附图说明

图1：在与200mM ZnCl₂温育4小时后，肽对星形胶质细胞存活的影响。图显示了每个肽的至少3组实验，每组实验各进行5份。NATLSIHQ(SEQ ID NO：4)：*＝p＜0.05，**＝p＜0.005，***＝p＜0.0005；STPTAIPQ(SEQ ID NO：6)：#＝p＜0.05(与阴性对照——没有添加——相比)。

图2：在用β-淀粉样肽中毒后，肽对神经胶质培养物的存活的影响。图显示了每个肽的3组实验，每组实验各进行5份。NATLSIHQ(SEQ ID NO：4)：*＝p＜0.05，**＝p＜0.005；STPTAIPQ(SEQ IDNO：6)：#＝p＜0.05(与阴性对照——没有添加——相比)。

定义

词组“NAP样肽模拟物”和“NAP样肽”同样都是指与NAP(NAPVSIPQ)(SEQ ID NO：1)具有相似性的肽和模拟物。因此，这些词组是指含有具有下式序列的肽和模拟物：(R¹)_a-(R²)-(R³)_b-，其中R¹和R³独立选择并且是含有1到大约40个氨基酸的氨基酸序列，其中每个氨基酸独立地选自天然存在的氨基酸和氨基酸类似物；R²是NAP样肽，例如：NAVLSIHQ(SEQ ID NO：2)，NATLSVHQ(SEQ IDNO：3)，NATLSIHQ(SEQ ID NO：4)，NATLSIVHQ(SEQ ID NO.5)，STPTAIPQ(SEQ ID NO：6)，NTPVSIPQ(SEQ ID NO：7)，APVSIPQ(SEQ ID NO：8)，NTPISIPQ(SEQ ID NO：9)，NAPVSIP(SEQ ID NO：10)，NAPVAVPQ(SEQ ID NO：11)，NARVSIPQ(SEQ ID NO：12)，DAPVSVPQ(SEQ ID NO：13)，NXPVSIPQ(SEQ ID NO：14)，NXP+SIPQ(SEQ ID NO：15)，NAPV++PQ(SEQ ID NO：16)，NAXVSIPQ(SEQ ID NO：17)和+APVS+PQ(SEQ ID NO：18)，其中X是指任何氨基酸，+是指保守氨基酸；a和b独立地选择并且等于0或1，前提是NAP样肽模拟物不是NAP。该词组也指D-氨基酸类似物，例如其中少至1个或多至所有氨基酸是D构型的。

词组“SAL样肽模拟物”和“SAL样肽”同样都是指与SAL(SALLRSIPA)(SEQ ID NO：19)具有相似性的肽和模拟物。因此，这些词组是指含有具有下式序列的肽：(R¹)_a-(R²)-(R³)_b-，其中R¹和R³独立地选择，并且是含有1到大约40个氨基酸的氨基酸序列，其中每个氨基酸独立地选自天然存在的氨基酸和氨基酸类似物；R²是SAL样肽，例如：ALLRSIPA(SEQ ID NO：20)，ALLRSIP(SEQ ID NO：21)，AMLRSIPA(SEQ ID NO：22)，ALLRAIPA(SEQ ID NO：23)，SALLRSIP(SEQ ID NO：24)，SALLRAIP(SEQ ID NO：25)，ALLRTIPA(SEQID NO：26)，ALLRSVPA(SEQ ID NO：27)，A+LRSIPA(SEQ ID NO：28)，ALLR+IPA(SEQ ID NO：29)，SALLR+IP(SEQ ID NO：30)和ALLRS+PA(SEQ ID NO：31)，其中X是指任何氨基酸，+是指保守氨基酸；a和b独立地选择并且等于0或1，前提是SAL样肽模拟物不是SAL。该词组也指D-氨基酸类似物，例如其中少至1个或多至所有氨基酸是D构型的。

词组“ADNF多肽”是指一个或多个活性依赖性神经营养因子(ADNF)，它们具有包含氨基酸序列NAPVSIPQ(SEQ ID NO：1)(被称为“NAP”)或SALLRSIPA(SEQ ID NO：19)(被称为“SAL”)的活性核心位点，并且在使用由例如Hill等，Brain Res.603：222-233(1993)；Brenneman & Gozes，J.Clin.Invest.97：2299-2307(1996)；和Forsythe & Westbrook，J.Physiol.Lond.396：515(1988)描述的体外皮层神经元培养分析进行测量时，具有神经营养/神经保护活性。ADNF多肽可以是ADNF I多肽，ADNF III多肽，它们的等位基因、多态性变异体、类似物、种间同系物、其任何子序列(例如SALLRSIPA(SEQ IDNO：19)或NAPVSIPQ(SEQ ID NO：I))或亲脂性变异体，它们在体外或体内对例如在中枢神经系统中起源的神经元表现出神经保护/神经营养作用。“ADNF多肽”也可以是指ADNF I多肽和ADNF III多肽的混合物。

词组“ADNF III多肽”或“ADNF III”，也被称为活性依赖性神经保护蛋白(ADNP)，是指一个或多个活性依赖性神经营养因子(ADNF)，它们具有包含氨基酸序列NAPVSIPQ(SEQ ID NO：1)(被称为“NAP”)的活性核心位点，并且在使用由例如Hill等，Brain Res.603，222-233(1993)；和Gozes等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93，427-432(1996)描述的体外皮层神经元培养分析进行测量时，具有神经营养/神经保护活性。ADNF多肽可以是ADNF III多肽，等位基因或多态性变异体，类似物，种间同系物，或其任何子序列(例如NAPVSIPQ)(SEQID NO：1)，它们在体外或体内对例如在中枢神经系统中起源的神经元表现出神经保护/神经营养作用。ADNF III多肽的范围可以从大约8个氨基酸起，可以具有例如8-20个、8-50个、10-100个或大约1000个或以上的氨基酸。

全长人类ADNF III的预计分子量为123，562.8Da(＞1000个氨基酸残基)，理论pI为大约6.97。正如上面描述的，ADNF III多肽具有包含氨基酸序列Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln(SEQ ID NO：1)(也被称为“NAPVSIPQ”或“NAP”)的活性位点。参见Zamostiano等，J.Biol.Chem.276：708-714(2001)和Bassan等，J.Neurochem.72：1283-1293(1999)。除非另外指明，否则“NAP”是指具有氨基酸序列Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln(SEQ ID NO.1)的肽，而不是具有氨基酸序列Asn-Ala-Pro的肽。ADNF III的全长氨基酸和核酸序列，可以在国际PCT申请公布Nos.WO 98/35042、WO 00/27875、美国专利No′s 6,613,740和6,649,411中找到。人类序列的登记号是NP_852107，也参见Zamostiano等，同上。

术语“ADNF I”是指分子量为大约14,000道尔顿、pI为8.3±0.25的活性依赖性神经营养因子多肽。如上所述，ADNF I多肽具有包含氨基酸序列Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala(SEQ ID NO：19)(也被称为“SALLRSIPA”或“SAL”或“ADNF-9”)的活性位点。参见Brenneman & Gozes，J.Clin.Invest.97：2299-2307(1996)，Glazner等，Anat.Embryol.(Berl).200：65-71(1999)，Brenneman等，J.Pharm.Exp.Ther.，285：619-27(1998)，Gozes & Brenneman，J.Mol.Neurosci.7：235-244(1996)和Gozes等，Dev.Brain Res.99：167-175(1997)。除非另外指明，否则“SAL”是指具有氨基酸序列Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala(SEQ ID NO：19)的肽，而不是具有氨基酸序列Ser-Ala-Leu的肽。ADNF I的全长氨基酸序列可以在国际PCT申请公布No.WO 96/11948中查到。

术语“对象”是指处于生命任何阶段的任何哺乳动物，特别是人类。

术语“接触”在本文中可以与下列互换使用：与…组合，添加到…，与…混合，传给…，与…温育，流过…，等等。此外，本发明的多肽或核酸可以通过任何常规方法“给药”，例如肠胃外、口、表面、鼻和吸入途径。在某些实施方案中，使用肠胃外和鼻或吸入途径。

术语“生物活性的”是指肽序列将与天然存在的生物分子相互作用，在体外或体内激活或抑制那些分子的功能。术语“生物活性的”在本文中最通常用于指称在体外或体内都对源自于中枢神经系统的神经元表现出神经保护/神经营养作用的NAP样肽模拟物。因此，本发明提供了多肽子序列，其在测试、例如用神经毒素处理大脑皮层培养物时，具有与NAP相同或相似的活性(参见Gozes等，Proc.Natl Acad.Sci.USA 93：427-432(1996))。也可以按照本文的描述对肽进行测试，以确定它们与NAP-微管蛋白结合进行竞争的能力至少为2-10％，优选超过10％。

术语“神经变性疾病或认知障碍”包括但不限于下列病症：中枢运动系统的疾病包括影响基底神经节的变性病症(亨廷顿(Huntington’s)病，威尔森氏(Wilson’s)病，纹状体黑质变性，皮层基底神经节变性)，抽动秽语综合征，帕金森氏(Parkinson’s)病，进行性核上性麻痹，进行性延髓麻痹，家族性痉挛性截瘫，脊髓性肌萎缩，ALS及其变体，齿状核红核萎缩，橄榄体脑桥小脑萎缩，副肿瘤性小脑变性和多巴胺毒性；影响感觉神经元的疾病例如弗里德里希(Friedreich′s)共济失调，糖尿病，周围神经病和视网膜神经元变性；边缘和皮层系统的疾病例如大脑淀粉样变性，Pick′s萎缩和Retts综合征；涉及多个神经元系统和/或脑干的神经变性疾病，包括阿茨海默氏(Alzheimer’s)病，帕金森氏症，AIDS相关性痴呆，Leigh′s病，弥漫性Lewy小体病，癫痫，多系统萎缩症，Guillain-Barre综合征，溶酶体贮积症例如脂褐素沉积病，唐氏综合征的晚期变性阶段，Alper′s病，由CNS变性引起的眩晕，ALS，皮层基底节变性和进行性核上性麻痹；与发育迟缓和学习障碍有关的疾病，唐氏综合征和氧化应激诱导的神经元死亡；由衰老和慢性酒精或药物滥用引起的疾病，包括例如(i)伴随酒精中毒，蓝斑、小脑、胆碱能基底前脑中的神经元变性，(ii)随着衰老，小脑神经元和皮层神经元变性，导致认知和运动障碍，以及(iii)随着慢性安非他明滥用，基底节神经元变性，导致运动障碍；由病灶性创伤例如中风、病灶性局部缺血、血管机能不全、缺氧-缺血性脑病、高血糖症、低血糖症、闭合性头部创伤和直接外伤导致的病理性变化；由治疗性药物和疗法的不利副作用引起的疾病(例如对抗惊厥剂量的NMDA类型的谷氨酸受体拮抗剂作出响应，扣带与内嗅皮质神经元的变性)。

“外周神经毒性”可以在对象中通过各种不同技术来鉴定和诊断。它通常可以通过运动机能障碍、肌肉消瘦，或嗅觉、视觉或听觉感觉的变化，或深部腱反射、震颤感、皮肤感觉、步态和平衡、肌肉力量、直立血压的变化，以及慢性或间歇性疼痛来测量。在人类中，这些症状有时也证明了在PNS和CNS中的毒性效应。最终，有数百种可能的外周神经病变可能源自于神经毒性。根据反映PNA活性的范围，症状可以涉及感觉、运动或自主功能。它们可以按照受影响的神经的类型和症状的长短进行分类。外周神经毒性可以由化学治疗药剂(抗癌，抗微生物等)或由疾病过程诱导。(参见例如美国专利申请No.11/388,634)。

“涉及视网膜变性的病症”包括但不限于激光诱导的视网膜损伤和眼病，例如青光眼、视网膜色素变性、Usher综合征、动脉或静脉阻塞、糖尿病性视网膜病、晶状体后纤维增生症或早产儿视网膜病(R.L.F./R.O.P.)、视网膜先天性裂、格状变性和黄斑变性。

“精神障碍”或“精神疾患”或“精神病”或“精神或神经精神性疾病或疾患或障碍”是指情绪障碍(例如重性抑郁症，躁狂症和双相情感障碍)，精神疾病(例如精神分裂症，分裂情感性障碍，精神分裂症样精神障碍，妄想性精神障碍，短期性精神失常和共有型精神病)，人格障碍，焦虑性障碍(例如强迫症和注意力缺乏障碍)，以及其他精神障碍例如药物相关障碍，儿童期障碍，痴呆，自闭性障碍，顺应障碍，谵妄，多发梗死性痴呆和抽动秽语综合征，如《精神障碍的诊断和统计手册》(第四版)(Diagnostic and Statistical Manual ofMental Disorders，Fourth Edition，(DSM IV))中所描述(也参见Benitez-King G.等，Curr Drug Targets CNS Neurol Disord.2004Dec；3(6)：515-33，综述)，典型地，这样的障碍具有复杂的遗传和/或生物化学因素。

“情绪紊乱”是指个体在一段较长时期内的感觉基调或情绪状态的失常。情绪障碍包括重性抑郁症(即单相障碍)，躁狂症，烦躁不安，双相障碍，精神抑郁症，循环性精神病和许多其他病症。参见例如《精神障碍的诊断和统计手册》(第四版)(Diagnostic and StatisticalManual of Mental Disorders，Fourth Edition，(DSM IV))。

“重性抑郁症”、“重性抑郁性障碍”或“单极障碍”是指涉及任何下述症状的情绪障碍：持续悲伤，焦虑或“空白”情绪；感觉无望或悲观；感觉负疚、无价值或无助；对以前喜爱的嗜好或活动、包括性失去兴趣或满足；精力减退，疲劳，变得“迟钝”；难以专心、回忆或做决定；失眠，过早醒或睡过头；食欲和/或体重降低或过度饱食和体重增加；想到死亡或自杀或者试图自杀；坐立不安或易怒；或对治疗无响应的持续性身体症状，例如头痛、消化紊乱和慢性疼痛。抑郁症的各种不同亚型描述在例如DSM IV中。

“双相障碍”是一种情绪障碍，其特征为交替的极端情绪阶段。患有双相障碍的人经历的情绪周期通常从过度兴奋或易怒(躁狂症)变到忧虑和无望(抑郁症)，然后再次返回，中间是正常情绪的时期。双相障碍的诊断描述在例如DSM IV中。双相障碍包括I型双相情感障碍(躁狂症伴有或不伴有重性抑郁症)和II型双相情感障碍(轻躁狂伴有重性抑郁症)，参见例如DSM IV。

“焦虑”、“焦虑症”和“焦虑相关病症”是指精神综合征，其特征是主观感觉不安、恐惧或预兆感，例如恐慌症，广泛性焦虑症，注意力缺乏症，注意力缺乏多动症，强迫症，和应激障碍，例如急性和创伤后应激障碍。这些病症的诊断标准对于本技术领域的专业人员来说是公知的(参见例如《Harrison内科医学原理》(Harrison′sPrinciples of Internal Medicine)，2486-2490页(Wilson等主编，第12版，1991)和DSM IV)。

“自身免疫障碍”是指自身免疫疾病，例如多发性硬化症，重症肌无力，Guillan-Barre综合征(抗磷脂综合征)，全身性红斑狼疮，Behcet综合征，Sjogrens综合征，类风湿性关节炎，桥本氏病/甲状腺功能减低症，原发性胆汁性肝硬化，混合结缔组织病，慢性活动性肝炎，Grave病/甲状腺功能亢进，硬皮病，慢性特发性血小板减少性紫癜，糖尿病性神经病变和脓毒性休克(参见例如Schneider A.等，J BiolChem.279：55833-9(2004))。

“运动机能障碍”包括肌肉消瘦，步态、平衡和肌肉力量改变。“感觉机能障碍”可以通过嗅觉、视觉或听觉感觉的变化，或深部腱反射、震颤感、皮肤感觉的变化，或慢性或间歇性疼痛来度量。有时，感觉机能障碍与疾病相关，可能经历例如足部或小腿中的疼痛或针刺、烧灼、蠕动或刺痛感。在人类中，运动和感觉机能障碍均表明了可能由化学物质(例如化学治疗剂)或疾病状态引起的在PNS和CNS中的效应。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物。一般来说，肽是指短的多肽。这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的类似物或模拟物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物。

术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及作用方式与天然存在的氨基酸相似的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是指由遗传密码编码的氨基酸，以及随后被修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。出于本申请的目的，氨基酸类似物是指与天然存在的氨基酸具有相同的基本化学结构、即碳与氢、羧基、氨基和R基团相连的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基硫鎓。这样的类似物具有修饰的R基团(例如正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但是保持了与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。出于本申请的目的，氨基酸模拟物是指结构与氨基酸的通用化学结构不同，但是作用方式与天然存在的氨基酸相似的化学化合物。

氨基酸可以包含具有非天然存在的D-手性的氨基酸，如在国际PCT申请公布No.WO 01/12654中所公开的，它们可以改进化合物的口服利用度和其他药物样特征。在这样的实施方案中，NAP样或SAL样肽模拟物的一个或多个、以及可能所有的氨基酸，将具有D-手性。通过使用D-氨基酸以提供较长的半衰期和作用时间，可以增进肽的治疗性应用。但是，许多受体表现出对L-氨基酸的强烈偏好性，但与天然存在的L-肽具有等同活性的D-肽例子已有报道，例如成孔抗生素肽、β-淀粉样肽(毒性没有改变)和CXCR4受体的内源配体。就此而言，NAP样或SAL样肽模拟物在D-氨基酸形式下也保留了活性。

氨基酸可以用它们公知的三字母符号或用IUPAC-IUB生物化学命名委员会(IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)推荐的单字母符号指称。同样地，核苷酸可以用它们通常认可的单字母编码指称。

“保守修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列二者。对于具体的核酸序列来说，保守修饰的变体是指编码相同的或基本相同的氨基酸序列的那些核酸，或者当核酸不编码氨基酸序列时，是指基本相同的序列。具体来说，通过产生其中一个或多个选定的(或所有的)密码子的第三个位置被简并碱基(mixed-base)和/或脱氧次黄嘌呤核苷残基取代的序列，可以获得简并密码子取代(Batzer等，Nucleic Acid Res.19：5081(1991)；Ohtsuka等，J.Biol.Chem.260：2605-2608(1985)；Rossolini等，Mol.Cell.Probes 8：91-98(1994))。由于遗传密码的简并性，任何给定的蛋白由大量功能一致的核酸编码。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在由密码子指定的丙氨酸的每个位置上，密码子可以改变成所述相应密码子的任何一个，而不改变所编码的多肽。这样的核酸变异体是“沉默变异体”，是保守修饰变异体的一种。本文中编码多肽的每个核酸序列，也描述了核酸的每个可能的沉默变异体。专业技术人员将会认识到，核酸中的每个密码子(除了AUG和TGG之外，前者通常是甲硫氨酸的唯一密码子，后者通常是色氨酸的唯一密码子)都可以被修改，以产生功能一致的分子。因此，在每个描述的序列中蕴含了编码多肽的核酸的每个沉默变异体。

对于氨基酸序列来说，专业技术人员将会认识到，对核酸、肽、多肽或蛋白序列所进行的改变、添加或删除了编码序列中单个氨基酸或少部分氨基酸的各种取代、缺失或添加，当改变导致氨基酸被化学上相似的氨基酸取代时，是“保守修饰的变体”。提供功能相似的氨基酸的保守取代表在本技术领域中是公知的。这样的保守修饰变体是除本发明的多态性变体、种间同系物和等位基因之外还有的，并且不排除本发明的多态性变体、种间同系物和等位基因。

下面的组各包含了彼此保守取代的氨基酸：

1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；

2)丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；

3)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；

4)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；

5)半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)；

6)精氨酸(R)，赖氨酸(K)，组氨酸(H)；

7)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，缬氨酸(V)；和

8)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)(参见例如Creighton，《蛋白》(Proteins)(1984))。

本技术领域的专业人员将会认识到，本文提供的核酸和多肽序列的许多保守变异体产生了功能上一致的产物。例如，由于遗传密码的简并性，“沉默取代”(即核酸序列的取代不导致所编码的多肽的变化)是编码氨基酸的每个核酸序列的默认特点。同样地，在氨基酸序列中一个或几个氨基酸中的“保守氨基酸取代”，是用具有高度相似性质的不同氨基酸进行的取代(参见定义部分)，也容易被鉴定为与公开的氨基酸序列、或与编码氨基酸的公开的核酸序列高度相似。

此外，某些保护基团可以添加到本发明的肽上。保护基团可以添加到肽的N-末端或C-末端，或两者上。本文中使用的术语“保护基团”是指赋予功能基团不反应性、但是也可以被移除以便将功能基团恢复到其初始状态的化合物。这样的保护基团对于本技术领域的普通专业人员来说是公知的，并包括在《有机合成中的保护基团》(ProtectiveGroups in Organic Synthesis)，第4版，T.W.Greene和P.G.M.Wuts，John Wiley & Sons，New York，2006中公开的化合物。保护基团的例子包括但不限于：Fmoc(9-芴甲氧羰酰胺)，Boc，苄氧羰基(Z)，alloc(烯丙氧基羰基)和蚀刻保护基团。

术语“分离的”、“纯化的”或“生物纯的”是指材料实质上或基本上不含在其天然状态下发现的通常与其相伴的成分。

“足够量”或“有效量”或“治疗有效量”是指给定的NAP样或SAL样肽模拟物的量，其表现出所需活性或提供了主观的症状缓解、或被临床医生或其他有资格的观察者注意到的客观上可鉴定的改进。在治疗性应用中，本发明的NAP样或SAL样肽模拟物以足以减轻或消除症状的量给药于患者。足以达到此目的的量被定义为“治疗有效剂量”。剂量范围随着所用的NAP样或SAL样肽模拟物、给药途径和具体的NAP样或SAL样肽模拟物的潜力、以及在药物组合物中存在或不存在其他治疗性化合物而变化。

表达或活性的“抑制剂”、“激活剂”和“调节剂”，分别被用于指使用表达或活性的体外和体内分析方法鉴定到的抑制、激活或调节分子，例如配体、激动剂、拮抗剂以及它们的同系物和模拟物。术语“调节剂”包括抑制剂和激活剂。抑制剂是例如抑制本发明的多肽或多核苷酸的表达、或结合以部分或完全阻断刺激或酶活性，降低、阻止、延迟激活，失活、脱敏或下调本发明的多肽或多核苷酸的活性的药剂，例如拮抗剂。激活剂是例如诱导或激活本发明的多肽或多核苷酸的表达、或结合以刺激、增加、打开、激活、促进、增强激活或酶活性，致敏或上调本发明的多肽或多核苷酸的活性的药剂，例如激动剂。调节剂包括天然存在的和合成的配体、拮抗剂、激动剂、小的化学分子等。鉴定抑制剂和激活剂的分析方法包括，例如在存在或不存在本发明的多肽或多核苷酸的情况下，向细胞施加假定的调节剂化合物，然后测定对本发明的多肽或多核苷酸活性的功能影响。将含有用潜在的激活剂、抑制剂或调节剂处理过的本发明的多肽或多核苷酸的样品或分析，与不含抑制剂、激活剂或调节剂的对照样品进行比较，以检测作用的程度。对照样品(未用调节剂处理)被指定为相对活性值为100％。当本发明的多肽或多核苷酸的活性值相对于对照为大约80％、任选50％或25-1％时，达到抑制。当本发明的多肽或多核苷酸的活性值相对于对照为110％、任选150％、任选200-500％或1000-3000％以上时，达到激活。

本文中使用的术语“测试化合物”或“药物候选物”或“调节剂”或语法等价物，描述了任何天然存在的或合成的分子，例如蛋白，寡肽(例如从大约5到大约25个氨基酸长，优选为大约10到20个或12到18个氨基酸长，优选为12、15或18个氨基酸长)，小的有机分子，多糖，脂类，脂肪酸，多核苷酸，寡核苷酸等。测试化合物可以是测试化合物的文库的形式，例如提供了足够范围的多样性的组合或随机文库。测试化合物任选与融合配偶体连接，例如靶向化合物、援救化合物、二聚化化合物、稳定化合物、可寻址化合物和其他功能部分。通常，通过鉴定具有某些所需性质或活性、例如抑制活性的测试化合物(被称为“先导化合物”)，产生先导化合物的变体，以及评估那些变体化合物的性质和活性，来产生具有有用性质的新的化学实体。对于这样的分析往往使用高通量筛选(HTS)方法。

“小的有机分子”是指天然存在的或合成的有机分子，其分子量高于大约50道尔顿并低于大约2500道尔顿，低于大约2000道尔顿，在大约100到大约1000道尔顿之间，或在大约200到大约500道尔顿之间。

具体实施方式

I.简介

以前，我们已经显示NAP(NAPVSIPQ，SEQ ID NO：1)通过与脑微管蛋白的相互作用保护了神经元和神经胶质细胞(Divinski等，J.Biol.Chem.279，28531-28538(2004))，并刺激微管蛋白的组装以增加与微管组装相关的轴突突起(Gozes和Spivak-Pohis，Curr Alzheimer Res，3：197-199(2006))。通过亲和层析，也显示出NAP与βIII微管蛋白特异性相互作用(Divinski等，J.Neurochem，98，973-984(2006))。SAL也同样显示出提供了神经保护作用(例如Gozes等，2000；Brenneman等，1998)。以前认为，8个氨基酸的NAP核心序列和9个氨基酸的SAL核心序列不能被修饰而不丧失功能。本申请第一次证明了与NAP和SAL核心序列具有序列相似性的肽也具有生物学功能，例如促进神经元细胞的存活。鉴定了NAP样和SAL样肽模拟物，它们列于本文的表1和2中。在至少两种NAP样肽模拟物或SAL样肽模拟物中发现了生物学活性：NATLSIHQ(SEQ ID NO：4)和STPTAIPQ(SEQ ID NO：6)。这些化合物可以用作治疗分子，用于神经变性疾病或病症的治疗。

II.NAP样和SAL样肽模拟物的设计和合成

含有核心NAP样或SAL样肽模拟物活性位点的多肽和肽的修饰，可以通过例如本文所述的系统性地在活性核心位点的N-或C-末端一次添加一个氨基酸，和筛选获得的肽的生物学活性来进行。此外，在这样的肽中各种不同氨基酸残基的侧链作出的贡献，可以通过用特定氨基酸例如丙氨酸进行系统性扫描来探测。也可以制造源自于NAP样或SAL样肽的多肽。

具有NAP样和SAL样序列和性质的肽，可以源自于具有在例如公众可利用的数据库中发现的序列的已知蛋白。例子包括NCBI，OMIM，UniProtKB/Swiss-Prot，EMBOSS两两比对算法(PairwiseAlignment Algorithms)，ClustalW，Tcoffee，BLAST，RADAR，PROSITE，Phylogenetic Tree和Selection。

NCBI(国立生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation，USA))包括PubMed，一种美国国家医学图书馆(U.S.National Library of Medicine)的服务，包含了来自MEDLINE和追溯到1950s年代的其他生命科学杂志的生物医学文章的超过一千六百万条引用资料。PubMed包含了对全文文章和其他相关资料的链接。NCBI还开发了OMIM(在线人类孟德尔式遗传(Online Mendelian Inheritancein Man))，这是人类基因和遗传疾病的目录。OMIM包含文本信息、参考文献、对MEDLINE和Entrez系统中的序列记录的链接，以及对NCBI和别处的其他相关资源的链接。

UniProtKB/Swiss-Prot是人工注释的蛋白知识库，与其计算机注释增补UniProtKB/TrEMBL一起，允许访问所有公众可利用的蛋白序列。该数据库自身与其他蛋白序列数据库的差别在于三个独特的标准：与其他数据库的整合，最低冗余度和高度注释(例如蛋白的功能，翻译后修饰，结构域和位点，二级结构，四级结构，与蛋白序列中的缺陷相关的疾病，变体，等等)。

EMBOSS是“欧洲分子生物学公开软件套装”(The EuropeanMolecular Biology Open Software Suite)。EMBOSS两两比对工具被用于两个序列的比较。ClustalW是用于DNA或蛋白的通用目的的多序列比对程序。它产生趋异序列的生物学意义的多序列比对，为选定的序列计算最佳匹配，并将它们对齐，以便可以了解同一性、相似性和差异。T-coffee是类似于ClustalW的另一个选择。

基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool)(BLAST)发现序列之间局部相似性的区域。该程序将核苷酸或蛋白序列与序列数据库进行比较，并计算匹配的统计学显著性。BLAST可用于推测序列之间的功能和演化关系，并帮助鉴定基因家族的成员。

PROSITE是蛋白家族和结构域的数据库，根据它们序列中的相似性将蛋白分类成有限数量的家族。属于特定家族的蛋白或蛋白结构域一般共有功能属性，并源自于共同的祖先。目前，PROSITE含有特异性针对超过一千个蛋白家族或结构域的样式和情况。这些特征每个都有记录，提供了关于这些蛋白的结构和功能的背景信息。

系统进化树(Phylogenetic tree)依赖于Saitou和Nei的NJ(邻接(Neighbour Joining))方法，它首先计算来自多重比对的所有序列对之间的距离(趋异百分数)，然后将NJ方法用于距离矩阵。Selecton能够检测单个氨基酸位点处的选择力。不同义(氨基酸改变)与同义(沉默)取代的比率，称为Ka/Ks比率，被用于估算每个氨基酸位点处的正性和纯化选择。

专业技术人员将会认识到在给定核酸序列中产生改变的许多方式。这样的众所周知的方法包括位点定向诱变，使用简并寡核苷酸的PCR扩增，将含有核酸的细胞暴露于诱变剂或辐射，化学合成所需寡核苷酸(例如与连接和/或克隆相结合，以产生大的核酸)，以及其他众所周知的技术(参见Giliman & Smith，Gene 8：81-97(1979)；Roberts等，Nature 328：731-734(1987))。

最通常是通过改变相应的核酸序列并表达多肽，来改变多肽序列。但是，多肽序列也任选使用可商购的肽合成仪合成产生，以生产任何所需的多肽(参见Merrifield，Am.Chem.Soc.85：2149-2154(1963)；Stewart & Young，《固相肽合成》(第二版)(Solid Phase PeptideSynthesis)(2nd ed.1984))。

专业技术人员可以根据所提供的序列和本技术领域关于蛋白的通用知识，来选择本发明的所需核酸或多肽。关于蛋白和核酸的性质的知识，允许专业技术人员选择与本文公开的核酸和多肽具有相似或等同的活性的适合序列。上文的定义部分，描述了示例性的保守氨基酸取代。

在适合的分析方法中，通过筛选技术来评估多肽的所需特征。例如，多肽的免疫学特性的变化可以通过适合的免疫分析方法来检测。其他性质的改变，例如核酸与靶核酸的杂交，蛋白的氧化还原或热稳定性，疏水性，对蛋白水解作用的易感性或对聚集的倾向性，都按照标准技术进行分析。在本文中，评估了含有NAP样或SAL样模拟活性位点的多肽的生物学活性，例如减少或抑制神经元细胞的死亡。

更具体来说，可以通过使用本技术领域专业人员已知的适合的分析方法和动物模型来筛选本发明的小肽。

使用这些分析方法和模型，本技术领域的普通专业人员可以根据本发明的讲述，从大量NAP样和SAL样肽模拟物中筛选具有所需活性的模拟物。

本发明的肽可以通过广泛的各种公知技术来制备。尺寸相对短的肽，一般在固相支持物上或溶液中按照常规技术进行合成(参见例如Merrifield，Am.Chem.Soc.85：2149-2154(1963))。各种自动化合成仪和测序仪是可商购的，可以根据已知的方案来使用(参见例如Stewart &Young，《固相肽合成》(第二版)(Solid Phase Peptide Synthesis)(2nded.1984))。固相合成是用于本发明的肽的化学合成的优选方法，其中序列的C-末端氨基酸被连接到不溶性支持物上，然后相继添加序列中其余的氨基酸。用于固相合成的技术描述在《肽：分析，合成，生物学》，第二卷：肽合成中的特殊方法，A部分中Barany & Merrfield的“固相肽合成”，3-284页(Solid-Phase Peptide Synthesis，pp.3-284inThe Peptides：Analysis，Synthesis，Biology.Vol.2：Special Methods inPeptide Synthesis，Part A.)；Merrifield等，1963；Stewart等，1984中。NAP和相关肽使用标准Fmoc方案来合成(Wellings & Atherton，Methods Enzymol.289：44-67(1997))。

除了上述技术，用于本发明的肽还可以通过重组DNA方法来制备。一般来说，这包括产生编码蛋白的核酸序列，将核酸置于表达盒中特定的启动子控制之下，并在宿主细胞中表达蛋白。本技术领域的专业人员已知的重组工程细胞包括但不限于细菌、酵母、植物、丝状真菌、昆虫(特别是使用杆状病毒载体)和哺乳动物细胞。

重组核酸与用于在选定宿主中表达的适合的控制序列可操作地连接。对于大肠杆菌(E.coli)来说，控制序列的例子包括T7、trp或λ启动子，核糖体结合位点，并优选转录终止信号。对于真核细胞来说，控制序列典型地包括启动子，并优选源自于免疫球蛋白基因、SV40、巨细胞病毒等的增强子，以及多聚腺苷化序列，可以包含剪接供体和受体序列。

本发明的质粒可以通过众所周知的方法转移到选定的宿主细胞中。这样的方法包括例如用于大肠杆菌的氯化钙转化方法，和用于哺乳动物细胞的磷酸钙处理或电穿孔方法。质粒转化的细胞可以通过质粒上包含的基因所赋予的抗生素抗性来进行筛选，例如amp、gpt、neo和hyg基因。

表达后，重组肽可以按照本技术领域的标准步骤进行纯化，包括硫酸铵沉淀，亲和柱，柱层析，凝胶电泳等(参见例如Scopes，《多肽纯化》(Polypeptide Purification)(1982)；Deutscher，《酶学方法》第182卷(Methods in Enzymology Vol.182)：多肽纯化指南(Guide toPolypeptide Purification)(1990))。任选的其他步骤包括将表达的蛋白分离到较高程度，以及如果需要，剪切或修饰肽，包括任选的蛋白复性。

化学合成、生物表达或纯化后，肽可能具有与成分肽的天然构象明显不同的构象。在这种情况下，将肽变性和还原，然后使肽重新折叠成优选的构象，是有帮助的。还原和变性肽以及诱导重新折叠的方法，对于本技术领域的专业人员来说是公知的(参见Debinski等，J.Biol.Chem.268：14065-14070(1993)；Kreitman & Pastan，Bioconjug.Chem.4：581-585(1993)；以及Buchner等，Anal.Biochem.205：263-270(1992))。例如，Debinski等描述了在胍-DTE中变性和还原包含体肽。然后将肽在含有氧化型谷胱甘肽和L-精氨酸的氧化还原缓冲液中重新折叠。

专业人员将会认识到，可以对肽进行修饰而不降低它们的生物学活性。可以进行一些修饰以便于靶向分子克隆、表达或整合到融合蛋白中。这样的修饰对于本技术领域的专业人员来说是熟知的，包括例如在氨基末端添加甲硫氨酸以提供起始位点，或在任一末端放置附加的氨基酸(例如多聚组氨酸)以产生方便定位的限制性位点或终止密码子或纯化序列。

III.NAP样和SAL样肽模拟物的功能分析的治疗性应用

确定NAP样或SAL样肽模拟物的生物学活性的一种方法，是分析它们保护神经元细胞免于死亡的能力。一种这样的分析方法，是使用按照描述(Brenneman & Gozes，J.Clin.Invest.97：2299-2307(1996))制备的解离的大脑皮层培养物进行的。试验范例包括向用河豚毒素(TTX)进行协同处理的培养物中添加测试肽。TTX在这些培养物中产生了凋亡性死亡，因此被用作模型物质，以证明对抗这种“程序化细胞死亡“以及产生这种类型死亡机制的所有其他手段的功效。试验持续时间为5天，通过特征性形态学和通过用神经元的免疫细胞化学标志物、例如神经元特异性烯醇化酶进行证实，对神经元进行计数和鉴定。其他基于细胞的分析方法，包括分析NAP样或SAL样肽促进暴露于例如β-淀粉样蛋白或高水平ZnCl₂的神经元细胞存活的能力。这些分析方法在本文实施例2中进行了示范。也在存在神经毒素例如来自HIV的包膜蛋白gp120和N-甲基-D-天冬氨酸的情况下，测量了由NAP样和SAL样蛋白促进的神经元细胞存活。

另一方面，本发明提供了用于减少神经元细胞死亡的方法，方法包括将神经元细胞与足以减少神经元细胞死亡的量的NAP样或SAL样肽模拟物相接触。另一方面，NAP样或SAL样肽模拟物在其活性核心位点中包含至少一个D-氨基酸，优选位于活性核心位点的N-末端和/或C-末端。在另一个优选方面，核心NAP样或SAL样肽的每个氨基酸都是D-氨基酸。优选的NAP样或SAL样肽模拟物包括例如NATLSIHQ(SEQ ID NO：4)和STPTAIPQ(SEQ ID NO：6)。

本发明的NAP样和SAL样肽模拟物可用于治疗神经疾病和用于预防神经元细胞死亡。例如，本发明的NAP样肽模拟物可用于防止神经元细胞的死亡，神经元细胞包括但不限于脊髓神经元、海马神经元、大脑皮层神经元和胆碱能神经元。更具体来说，本发明的NAP样和SAL样肽模拟物可用于预防与下列物质相关的细胞死亡：(1)gp120，来自HIV的包膜蛋白；(2)N-甲基-D-天冬氨酸(兴奋毒性)；(3)河豚毒素(阻断电活动)；和(4)β-淀粉样肽，一种与阿茨海默氏病中神经元变性有关的物质。优选的NAP样或SAL样肽模拟物包括例如NATLSIHQ(SEQ ID NO：4)和STPTAIPQ(SEQ ID NO：6)。

同样地，通过向HIV病毒感染的患者给药有效量的本发明的NAP样肽模拟物，本发明的NAP样和SAL样肽模拟物可用于减少gp120诱导的神经元细胞死亡。本发明的NAP样和SAL样肽模拟物也可用于减少与N-甲基-D-天冬氨酸诱导的兴奋毒性有关的神经元细胞死亡，方法包括将神经元细胞与足以防止神经元细胞死亡的量的本发明的NAP样和SAL样肽模拟物相接触。本发明的NAP样和SAL样肽模拟物还可用于在患有阿茨海默氏病或受到阿茨海默氏病损害的患者中减少由β-淀粉样肽诱导的细胞死亡，方法包括向患者给药足以防止神经元细胞死亡的量的本发明的NAP样和SAL样肽模拟物。NAP样和SAL样肽模拟物还可用于在患有阿茨海默氏病或受到阿茨海默氏病损害的患者中缓解由胆碱能阻断所产生的学习障碍。例如，NAP样和SAL样肽模拟物可用于在阿茨海默氏病患者中提高短期和/或参照记忆。优选的NAP样或SAL样肽模拟物包括例如NATLSIHQ(SEQ ID NO：4)和STPTAIPQ(SEQ ID NO：6)。

同样地，对于本技术领域的专业人员来说，显然本发明的NAP样和SAL样肽模拟物可以以类似的方式用于防止与许多其他神经疾病和缺陷有关的神经元细胞死亡。将从本发明的治疗性和诊断性应用受益的病理状况，包括导致神经元细胞死亡的病症(疾病和损伤)和/或尚不致命的神经元病症，包括例如下列：中枢运动系统的疾病包括影响基底神经节的变性病症(亨廷顿病，威尔森氏病，纹状体黑质变性，皮层基底神经节变性)，抽动秽语综合征，帕金森氏病，进行性核上性麻痹，进行性延髓麻痹，家族性痉挛性截瘫，脊髓性肌萎缩，ALS及其变体，齿状核红核萎缩，橄榄体脑桥小脑萎缩，副肿瘤性小脑变性和多巴胺毒性；影响感觉神经元的疾病例如弗里德赖希共济失调，糖尿病，周围神经病和视网膜神经元变性；边缘和皮层系统的疾病例如大脑淀粉样变性，Pick′s萎缩，Retts综合征；涉及多个神经元系统和/或脑干的神经变性疾病，包括阿茨海默氏病，AIDS相关性痴呆，Leigh′s病，弥漫性Lewy小体病，癫痫，多系统萎缩症，Guillain-Barre综合征，溶酶体贮积症例如脂褐素沉积病，唐氏综合征的晚期变性阶段，Alper′s病，由CNS变性引起的眩晕；与发育迟缓和学习障碍有关的疾病，唐氏综合征和氧化应激诱导的神经元死亡；由衰老和慢性酒精或药物滥用引起的疾病，包括例如伴随酒精中毒，蓝斑、小脑、胆碱能基底前脑中的神经元变性；随着衰老，小脑神经元和皮层神经元变性，导致认知和运动障碍；以及随着慢性安非他明滥用，基底节神经元变性，导致运动障碍；由病灶性创伤例如中风、病灶性局部缺血、血管机能不全、缺氧缺血性脑病、高血糖症、低血糖症、闭合性头部创伤和直接外伤导致的病理性变化；由治疗性药物和疗法的不利副作用引起的疾病(例如对抗惊厥剂量的NMDA类型谷氨酸受体拮抗剂作出响应，扣带与内嗅皮质神经元的变性，源自于例如化疗治疗的周围神经病，以及来自激光眼部治疗的视网膜损伤)。本发明的NAP样和SAL样肽模拟物还可用于治疗自身免疫疾病例如多发性硬化症，以及精神疾病例如精神分裂症和抑郁症。优选的NAP样或SAL样肽模拟物包括例如NATLSIHQ(SEQ ID NO：4)和STPTAIPQ(SEQ ID NO：6)。

因此，可以使用在1997年2月7日提交的国际PCT申请公布No.WO98/35042和1998年11月6日提交的美国专利No.6613740中描述的各种不同方法，筛选减少神经元细胞死亡的NAP样和SAL样肽模拟物。例如，对于本技术领域的专业人员来说，很显然的是使用上面给出的关于NAP样和SAL样肽模拟物的设计和合成教导和本文描述的分析方法，本技术领域的普通专业人员可以鉴定在其活性核心位点中含有至少一个D-氨基酸的其他生物活性NAP样肽模拟物。例如，Brenneman等，Nature 335：639-642(1988)和Dibbern等，J.Clin.Invest.99：2837-2841(1997)讲述的分析方法，可用于筛选能够减少与来自HIV的包膜蛋白(gp120)相关的神经元细胞死亡的ADNF多肽。另外，Brenneman等，Dev.Brain Res.51：63-68(1990)和Brenneman & Gozes，J.Clin.Invest.97：2299-2307(1996)讲述的分析方法，可用于筛选能够减少与N-甲基-D天冬氨酸刺激所诱导的兴奋毒性有关的神经元细胞死亡的NAP样和SAL样肽模拟物。其他在例如国际PCT申请公布No.WO98/35042中描述的分析方法，也可用于鉴定其他生物活性NAP样和SAL样肽模拟物。

此外，可以在体内筛选减少神经元细胞死亡的NAP样和SAL样肽模拟物。例如，可以测试NAP样和SAL样肽模拟物能够针对与胆碱能阻断相关的学习和记忆缺损进行保护的能力。例如，在大鼠中通过给药胆碱毒素AF64A，可以获得胆碱能阻断，可以鼻内给药ADNF多肽，并可以进行水迷宫实验(Gozes等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93：427-432(1996))。使用有效的NAP样肽模拟物治疗的动物，与对照相比，将显示出它们学习和记忆能力的改善。

此外，可以在体内筛选NAP样和SAL样肽模拟物能够保护或减少与阿茨海默氏病相关的神经元细胞死亡的能力。对于这些实验来说，可以使用载脂蛋白E(ApoE)缺陷的纯合小鼠(Plump等，Cell71：343-353(1992)；Gordon等，Neuroscience Letters 199：1-4(1995)；Gozes等，J.Neurobiol.33：329-342(1997))。

NAP样和SAL样肽模拟物抑制免疫细胞增殖的能力，可以按照Offen等，J Mol Neurosci.15(3)：167-76(2000)和国际PCT申请公布No.WO04/060309中的描述进行分析，二者都描述了MOG诱导的慢性EAE小鼠模型，在此以所有目的引为参考。STOP蛋白缺陷小鼠是业内接受的精神分裂症模型，可用于评估NAP样和SAL样肽模拟物的抗精神分裂症活性。参见，例如Andrieux等，Genes & Develop.，16：2350-2364(2002)，在此以所有目的引为参考。NAP样和SAL样肽模拟物的抗焦虑活性可以使用小鼠模型和Morris水迷宫范式进行评估，它们公开在国际PCT申请公布No.WO04/080957中，在此以所有目的引为参考。通过NAP-样和SAL样肽模拟物对周围神经毒性的降低，可以使用大鼠模型和旋转棒以及爪痛测试进行评估。参见例如国际PCT申请公布WO06/099739，在此以所有目的引为参考。

IV.药物发现

鉴定微管蛋白为NAP相互作用蛋白以及发现微管蛋白中的NAP样序列，允许使用微管蛋白和微管蛋白衍生肽作为靶进行进一步的药物发现，用于例如治疗神经元疾病如神经变性疾病(例如阿茨海默氏病，AIDS相关的痴呆，亨廷顿病和帕金森氏病)，认知障碍，周围神经毒性，运动机能障碍，感觉机能障碍，焦虑症，抑郁症，精神病，与视网膜变性有关的病症，影响学习和记忆的疾病或神经精神疾病，与神经元细胞死亡和氧化应激有关的疾病，HIV相关的智力减退复合征，中风，头部创伤，脑性麻痹，与胎儿酒精综合征有关的病症，以及自身免疫疾病例如多发性硬化症。这样的治疗药物也可用于产前和产后增强学习和记忆的方法中。可以使用完整的微管蛋白结构以及NAP作为置换剂进行实验，以发现与NAP结合相同位点的药剂(参见，例如Katchalski-Katzir等，Biophys Chem.100(1-3)：293-305(2003)；Chang等，J Comput Chem.24(16)：1987-98(2003)的描述)。

初步筛选可以通过筛选能够结合本发明的多肽或微管蛋白的药剂来进行，因为至少一些这样鉴定到的药剂可能是结合活性的调节剂。结合分析方法通常包括将本发明的多肽与一种或多种测试药剂相接触，并允许蛋白和测试药剂有足够的时间形成结合复合物。任何形成的结合复合物，可以使用多种已建立的分析技术中的任何一种来检测。蛋白结合分析方法包括但不限于测量共沉淀、在非变性SDS聚丙烯酰胺凝胶上的共迁移和在Western印迹上的共迁移的方法(参见例如《神经递质受体结合》中Bennet和Yamamura，神经递质、激素或药物受体结合方法(Neurotransmitter，Hormone or Drug Receptor BindingMethods，in Neurotransmitter Receptor Binding)(Yamamura等主编)，pp.61-89(1985))。在这样的分析方法中使用的蛋白可以是天然表达的、克隆的或合成的。

通过任何上述筛选方法最初鉴定到的药剂，可以进行进一步测试以验证表观活性。优选这样的研究使用适合的动物模型来进行。这样的方法的基本格式包括向用作人类模型的动物给药在最初筛选过程中鉴定到的先导化合物，然后测定本发明的多核苷酸或多肽的表达或活性是否事实上上调了。在验证研究中使用的动物模型一般是任何种类的哺乳动物。适合的动物的具体例子包括但不限于灵长动物、小鼠和大鼠。

检验为本发明的多肽调节剂的药剂，可以是任何小的化学化合物，或生物学实体，例如蛋白、糖、核酸、RNAi或脂类。典型地，测试化合物是小的化学分子和肽。基本上任何化学化合物都可以在本发明的分析中用作潜在调节剂或配体，尽管最通常使用可以溶解在水性或有机(特别是基于DMSO的)溶液中的化合物。分析方法被设计成通过自动化分析步骤和向分析提供来自任何方便来源的化合物，来筛选大的化学文库，所述分析通常平行运行(例如在机械手分析方法中微量滴定板上的微量滴定格式)。应该理解，有许多化学化合物供应商，例如Sigma(St.Louis，MO)、Aldrich(St.Louis，MO)、Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)、Fluka Chemika-Biochemica Analytika(Buchs，Switzerland)等。调节剂也包括被设计用于降低本发明的mRNA水平的药剂(例如反义分子，核酶，DNA核酶等)或降低mRNA翻译水平的药剂。

在一个优选实施方案中，高通量筛选方法包括提供含有大量潜在治疗性化合物(可能的调节剂或配体化合物)的组合化学或肽文库。然后按照本文的描述在一个或多个分析方法中筛选这样的“组合化学文库”或“配体文库”，以鉴定文库中表现出所需的特征活性、例如微管蛋白结合的成员(特定的化学物类或亚类)。这样鉴定的化合物可用作常规的“先导化合物”，或它们本身可用作可能的或实际的治疗剂。可用的筛选小的活性分子的文库包括可用化学品目录(AvailableChemical Directory)(ACD，278,000种化合物)，ACD筛选文库(＞1，000,000种化合物)，CRC联合化学品名单(Combined ChemicalDictionary)(大约350,000种化合物)，Anisex(115,000种化合物)，Maybridge(62,000种化合物)，Derwent和NCI文库。

V.发现的化合物的活性分析方法

其他的药物发现方法包括筛选神经保护活性。这种活性可以按照例如Divinski等(2006)和Gozes等(2005)中的描述，在经典的神经元应激和存活的组织培养物模型中进行测试。这些分析方法在本技术领域是公知的，集中于待测化合物对微管重新组织、轴突突出和针对有毒因子的保护作用的影响。

在动物模型中测试神经保护作用的体内分析方法，在本技术领域中也是已知的。测量各种不同待测物质对运动活性的影响的测试，包括例如大鼠中的旋转棒测试。嗅觉能力可用于测量待测物质对感觉活性的影响。这样的分析方法描述在例如美国申请公布No.2006/0247168中。

公认的用于胎儿酒精综合征的模型，可用于对待测化合物的效能进行测试(Webster等，Neurobehav.Toxicol 2：227-234(1980))。该范式是针对酒精施用产生的严重氧化性应激的功效进行测试(Spong等，2001)。该模型允许对有效对抗严重氧化性应激以及胎儿酒精综合征的药剂进行快速和相关的评估。为了评估待测化合物的保护效应，可以测定胎儿死亡的数量。

测试待测化合物对例如激光外科手术中暴露于激光的视网膜细胞的保护效应的实验，描述在美国临时申请No.60,776,329中。简单来说，将大鼠暴露于激光光致凝结，并立即使用保护性化合物进行全身性或玻璃体内治疗。处死动物，观察视网膜组织切片的组织学和形态学异常。

正如上面讨论的，可以分析NAP样和SAL样肽模拟物的调节剂抑制免疫细胞增殖的能力、抗精神分裂活性、抗焦虑活性以及降低外周神经毒性的能力。

VI.药物给药

本发明提供了大量用于药物给药的神经保护性NAP样和SAL样肽模拟物和组合物。例如，药物组合物可以包含本文描述的NAP样或SAL样肽模拟物中的一种，或一种以上的组合。优选的NAP样或SAL样肽模拟物包括例如NATLSIHQ(SEQ ID NO：4)和STPTAIPQ(SEQID NO：6)。药物组合物可以包含其它的神经保护性化合物，例如ANDF多肽，与NAP样或SAL样肽模拟物相组合。神经保护性ADNF多肽包括含有NAP(SEQ ID NO：1)或SAL(SEQ ID NO：19)的多肽。NAP样肽模拟物可以包含至少一个D-氨基酸，并且多至全部的氨基酸都可以是D-手性的。在某些实施方案中，其它的神经保护性肽具有至少一个、以及多至全部的D-氨基酸。

本发明的药物组合物适合用于各种不同的药物投送系统中。具有跨过血脑屏障能力的肽，可以使用本技术领域的专业人员已知的方法进行例如全身、鼻部给药等。不能跨过血脑屏障的较大的肽，可以使用本技术领域的专业人员公知的技术，经脑室内(ICV)注射或经插管给药于哺乳动物脑部(参见，例如Motta & Martini，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.168：62-64(1981)；Peterson等，Biochem.Pharamacol.31：2807-2810(1982)；Rzepczynski等，Metab.Brain Dis.3：211-216(1988)；Leibowitz等，Brain Res.Bull.21：905-912(1988)；Sramka等，Stereotact.Fund.Neurosurg.58：79-83(1992)；Peng等，Brain Res.632：57-67(1993)；Chem等，Exp.Neurol.125：72-81(1994)；Nikkhah等，Neuroscience 63：57-72(1994)；Anderson等，J.Comp.Neurol 357：296-317(1995)；以及Brecknell& Fawcett，Exp.Neurol.138：338-344(1996))。

适合用于本发明的制剂在《Remington药物学》(第17版，1985年)(Remington′s Pharmaceutical Sciences(17th ed.1985))中查到。此外，对于药物投送方法的简要综述，参见Langer，Science 249：1527-1533(1990)。适合的剂量范围描述在本文提供的实施例以及国际PCT申请公布No.WO 9611948中。

同样地，本发明提供了治疗组合物或药物，含有上文描述的一种或多种多肽与可药用赋形剂的组合，其中多肽的量足以提供治疗效果。

在治疗性应用中，本发明的多肽体现为打算通过任何有效手段给药的药物组合物，这些给药手段包括肠胃外、表面、口、鼻、肺(例如通过吸入)、全身或局部给药。对于肠胃外给药来说，药物组合物通过例如静脉内、皮下、真皮内或肌肉内给药。也可以使用鼻泵、表面贴片和滴眼液。

因此，本发明提供了用于肠胃外给药的组合物，含有上面描述的多肽溶解或悬浮在可接受介质、优选为水性载体中的溶液。可以使用各种不同的水性载体，包括例如水、缓冲的水、0.4％盐水、0.3％甘氨酸、透明质酸等。这些组合物可以通过常规的、公知的灭菌技术灭菌，或者它们可以过滤除菌。获得的水性溶液可以就此包装使用或冷冻干燥，冷冻干燥的制剂在给药前与无菌溶液混合。如果需要，组合物可以含有可药用的辅助物质以接近生理条件，包括pH调节和缓冲剂、张力调节剂、润湿剂等，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、失水山梨糖醇单月桂酸酯、油酸三乙醇胺等。

对于固体组合物来说，可以使用常规的无毒固体载体，包括例如药品级甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。对于口服给药来说，通过掺入任何常用的赋形剂，例如上面列出的载体，和通常10-95％的活性成分，更优选浓度为25％-75％，来形成可药用的无毒组合物，。

对于气溶胶给药来说，优选将多肽以细分散的形式与表面活性剂和推进剂一起提供。当然，表面活性剂必须是无毒的，并优选可溶于推进剂中。这样的试剂的代表是含有6到22个碳原子的脂肪酸例如己酸、辛酸、月桂酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、油硬脂酸(olestericacid)和油酸与脂族多元醇或其环状酐的酯或偏酯。可以使用混合酯，例如混合的或天然的甘油酯。如果需要，也可以包含载体，例如与卵磷脂，用于鼻内投送。例子包括下述溶液：其中每毫升含有7.5mg NaCl，1.7mg单水柠檬酸，3mg二水磷酸氢二钠和0.2mg苯扎氯铵溶液(50％)(Gozes等，J Mol Neurosci.19(1-2)：167-70(2002))。

在治疗性应用中，本发明的多肽以足以减轻或消除神经变性疾病、认知障碍和其他病症的症状、或加强学习和记忆的量，给药于患者。足以实现该目的的量被定义为“治疗有效剂量”。对这种应用有效的量，依赖于例如所使用的具体多肽、要预防的疾病或障碍的类型、给药方式、患者的体重和总体健康状态以及处方医师的判断。

例如，每天一次(例如在晚上)鼻内给药100ng到10mg剂量范围内的多肽的量，将是治疗有效量。或者，剂量也可以在该范围之外，或采用不同的时间安排。例如，每剂剂量可以为0.0001mg/kg到10,000mg/kg，优选为大约0.001mg/kg、0.1mg/kg、1mg/kg、5mg/kg、50mg/kg或500mg/kg。药剂的给药可以每小时，每4、6或12小时，与进餐同时，每日，每2、3、4、5、6或7日，每周，每2、3、4周，每月或每2、3或4月，或其任何组合。根据要治疗的病症，用药时间可以是单剂(急性)给药，或经过数日、数周、数月、数年的时程。本技术领域的专业人员可以确定适合的剂量，可以借助于在下列文献中报道的初步数据：Gozes等，2000；Gozes等，2002；Bassan等，1999；Zemlyak等，Regul.Pept.96：39-43(2000)；Brenneman等，Biochem.Soc.Trans.28：452-455(2000)；Erratum Biochem Soc.Trans.28：983；Wilkemeyer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100：8543-8548(2003)；Alcalay等，Neurosci Lett.361：128-31(2004)；以及Gozes等，CNS Drug Rev.，11(4)：353-68(2005)。

实施例

实施例1：NAP样和SAL样序列的搜索

进行了生物信息学搜索，以寻找在提供神经保护作用(例如通过与微管相互作用)的其他蛋白中是否存在NAP样或SAL样序列，以及是否存在类似NAP并提供神经保护作用的微管蛋白特异性序列。

将NAP和SAL序列提交到许多不同的搜索引擎：NCBI，OMIM，UniProtKB/Swiss-Prot，EMBOSS两两比对算法，ClustalW，T-coffee，BLAST，RADAR，PPSearch，PROSITE，系统进化树和Selecton。

在人类微管蛋白的搜索中，在UniProtKB/Swiss-Prot中使用了智人(Homo sapiens)生物体微管蛋白的栏目描述和布尔算子。在EMBOSS中使用了带有water比对的Blosum62，以发现两个序列之间最佳的相似性区域。多重比对从ClustalW获得，其中进一步使用了Jalview编辑器。

对于BLAST以及类似的程序RADAR和PPSearch来说，使用人类β3微管蛋白及其直系同源物作为查询。对于Selecton来说，以FASTA格式提交了微管蛋白以及12个直系同源生物体的CDS作为输入文件。

结果概述在下面以及表1中。微管蛋白中对于蛋白-蛋白相互作用和GTP结合重要的结构元件，显示出与NAP的显著的同源性：

NAVLSIHQ(SEQ ID NO：2)-微管蛋白β1

NATLSVHQ(SEQ ID NO：3)-微管蛋白β2

NATLSIHQ(SEQ ID NO：4)-微管蛋白β3

各个不同的微管蛋白亚基的NCBI蛋白登记号如下：

微管蛋白β1     Q9H4B7

微管蛋白β2a    Q13885

微管蛋白β2b    Q9BVA1

微管蛋白β2c    P68371

微管蛋白β3     Q13509

微管蛋白β4     P04350

微管蛋白β5     P07437

微管蛋白β6     Q9BUF5

序列NAVLSIHQ(SEQ ID NO：2)、NATLSVHQ(SEQ ID NO：3)和NATLSIHQ(SEQ ID NO：4)，分别在微管蛋白β1、β2和β3中发现，而不是在α微管蛋白中。序列位于184-191位氨基酸。该序列与假设对于微管中β和α微管蛋白之间纵向接触来说重要的区域重叠，即它位于分子顶部相对暴露的区域中，在二聚体化之后变得隐蔽。该序列也靠近β-微管蛋白的GTP结合袋，特别是与核糖结合相关的区域(Nogales和Wang(2006)Curr Opin Cell Biol，18，179-184；Nogales和Wang(2006)Curr Opin Struct Biol，16，221-229)。

同源性大于50％，但是没有保留在NAP中发现的两个脯氨酸。由于脯氨酸通常与蛋白-蛋白相互作用有关，因此可能NAPVSIPQ(SEQID NO：1)具有另外的蛋白结合或蛋白相互作用/破坏活性，同时仍具有一些与微管的固有关联性。

与NAPVSIPQ(SEQ ID NO：1)具有增加的同源性的其他序列包括STPTAIPQ(SEQ ID NO：6)(登记号Q7KZS6)，它包含微管蛋白区段和与来自视紫红质家族的G蛋白偶联受体相关的区段。后者与色素沉着相关的黑皮素1受体具有相似性。

观察到了另外的与关键蛋白例如柠檬酸裂解酶的序列相似性。ATP柠檬酸裂解酶在许多组织中是负责合成胞质乙酰CoA的主要酶。它在脂类从头合成中发挥核心作用。在神经组织中，它可能参与了乙酰胆碱的生物合成(根据相似性)。

表1：NAP(NAPVSIPQ)序列同源性

查询 1   NAPVSIPQ 8(SEQ ID NO：1)NXPVSIPQ (SEQ ID NO：14)对象 3   NTPVSIPQ 10(SEQ ID NO：7)	DNA引发酶，食酸菌属(Acidovorax sp.)JS42
		查询 2   APVSIPQ 8(SEQ ID NO：8)APVSIPQ (SEQ ID NO：8)对象 217 APVSIPQ 223(SEQ ID NO：8)	柠檬酸裂解酶α亚基，Thermosinuscarboxydivorans Nor1
查询 1   NAPVSIPQ 8(SEQ ID NO：1)NXP+SIPQ (SEQ ID NO：15)对象 215 NTPISIPQ 222(SEQ ID NO：9)	推断的柠檬酸裂解酶α亚基，化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)Manfredo菌株
		查询 1   NAPVSIPQ 8(SEQ ID NO：1)NXP+SIPQ (SEQ ID NO：15)对象 158 NTPISIPQ 165(SEQ ID NO：9)	柠檬酸裂解酶α亚基，副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei)
查询 1   NAPVSIPQ 8(SEQ ID NO：1)NXP+SIPQ (SEQ ID NO：15)对象 215 NTPISIPQ 222(SEQ ID NO：9)	A链，推断的柠檬酸α亚基的晶体结构，B链，推断的柠檬酸裂解酶α亚基在与柠檬酸的复合物中的晶体结构，来自变异链球菌(Streptococcus Mutans)Northeast结构基因组靶位Smr12(Casp靶位)
		查询 1   NAPVSIPQ 8(SEQ ID NO：1)NXP+SIPQ (SEQ ID NO：15)对象 215 NTPISIPQ 222(SEQ ID NO：9)	柠檬酸裂解酶α链/柠檬酸Co-A转移酶，化脓性链球菌(Steptococcus pyogenes)MGAS10270
查询 1   NAPVSIPQ 8(SEQ ID NO：1)NXP+SIPQ (SEQ ID NO：15)对象 215 NTPISIPQ 222(SEQ ID NO：9)	柠檬酸裂解酶α亚基，粪肠球菌(Enterococcus faecalis)
		查询 1   NAPVSIP 7(SEQ ID NO：10)NAPVSIP (SEQ ID NO：10)对象 102 NAPVSIP 108(SEQ ID NO：10)	RING指结构域蛋白，费氏新萨托菌(Neosartorya fischeri)NRRL 181

查询 1   NAPVSIPQ 8(SEQ ID NO：1)NXPVSIPQ (SEQ ID NO：14)对象 3   NTPVSIPQ 10(SEQ ID NO：7)	DNA引发酶，食酸菌属(Acidovorax sp.)JS42
		查询 2   APVSIPQ 8(SEQ ID NO：8)APVSIPQ (SEQ ID NO：8)对象 453 APVSIPQ 459(SEQ ID NO：8)	线性短杆菌肽合成酶亚基D，鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)104
查询 2   APVSIPQ 8(SEQ ID NO：8)APVSIPQ (SEQ ID NO：8)对象 453 APVSIPQ 459(SEQ ID NO：8)	PstA，鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)
		查询 2   APVSIPQ 8(SEQ ID NO：8)APVSIPQ (SEQ ID NO：8)对象 461 APVSIPQ 467(SEQ ID NO：8)	PstA，鸟分枝杆菌副结核亚种(Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis)K-10
查询 1   NAPVSIPQ 8(SEQ ID NO：1)NXPV++PQ (SEQ ID NO：16)对象 760 NAPVAVPQ 767(SEQ ID NO：11)	葡萄糖阻遏调节蛋白，树干毕赤酵母(Pichiastipitis)CBS 6054
		查询 1   NAPVSIPQ 8(SEQ ID NO：1)NAXVSIPQ (SEQ ID NO：17)对象 73  NARVSIPQ 80(SEQ ID NO：12)	黏附素家族蛋白，Granulibacter bethesdensisCGDNIH1
查询 1   NAPVSIPQ 8(SEQ ID NO：1)+APVS+PQ (SEQ ID NO：18)对象 314 DAPVSVPQ 321(SEQ ID NO：13)	阳离子外排家族蛋白，荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)Pf-5

表2：SAL(SALLRSIPA)序列同源性

查询 2   ALLRSIPA 9(SEQ ID NO：20)ALLRSIPA (SEQ ID NO：20)对象 614 ALLRSIPA 621(SEQ ID NO：20)	磷脂酰肌醇聚糖，G类，斑马鱼(Danio rerio)
		查询 2   ALLRSIPA 9(SEQ ID NO：20)ALLRSIPA (SEQ ID NO：20)对象 53  ALLRSIPA 60(SEQ ID NO：20)	热休克蛋白60，大西洋鲑(Salmo salar)
查询 2   ALLRSIP 8(SEQ ID NO：21)ALLRSIP (SEQ ID NO：21)对象 259 ALLRSIP 265(SEQ ID NO：21)	寡肽/二肽ABC转运蛋白，ATPase亚基，嗜油热袍菌(Thermotoga petrophila)RKU-1
		查询 2   ALLRSIPA 9(SEQ ID NO：20)A+LRSIPA (SEQ ID NO：28)对象 346 AMLRSIPA 353(SEQ ID NO：22)	寡肽/二肽ABC转运蛋白，ATPase亚基，肿块伯克氏菌(Burkholderia phymatum)STM815

查询 2   ALLRSIPA 9(SEQ ID NO：20)ALLRSIPA (SEQ ID NO：20)对象 614 ALLRSIPA 621(SEQ ID NO：20)	磷脂酰肌醇聚糖，G类，斑马鱼(Danio rerio)
		查询 2   ALLRSIPA 9(SEQ ID NO：20)ALLR+IPA (SEQ ID NO：29)对象 254 ALLRAIPA 261(SEQ ID NO：23)	寡肽/二肽ABC转运蛋白，ATPase亚基，肿块伯克氏菌(Burkholderia phymatum)STM815
查询 2   ALLRSIP 8(SEQ ID NO：21)ALLRSIP (SEQ ID NO：21)对象 272 ALLRSIP 278(SEQ ID NO：21)	ABC肽转运蛋白，ATP结合组分，红球菌(Rhodococcus sp.)RHA1
		查询 1   SALLRSIP 8(SEQ ID NO：24)SALLR+IP (SEQ ID NO：30)对象 124 SALLRAIP 131(SEQ ID NO：25)	与ATPase类似，H+转运，V1亚基E样2同种型2，褐家鼠(Rattus norvegicus)
查询 2   ALLRSIPA 9(SEQ ID NO：20)A+LRSIPA (SEQ ID NO：28)对象 366 AMLRSIPA 373(SEQ ID NO：22)	葡萄糖抑制的分裂蛋白A，Roseiflexuscastenholzii DSM 13941
		查询 2   ALLRSIPA 9(SEQ ID NO：20)A+LRSIPA (SEQ ID NO：28)对象 346 AMLRSIPA 353(SEQ ID NO：22)	葡萄糖抑制分裂蛋白A，Chloroflexusaggregans DSM 9485
查询 2   ALLRSIPA 9(SEQ ID NO：20)A+LRSIPA (SEQ ID NO：28)对象 346 AMLRSIPA 353(SEQ ID NO：22)	葡萄糖抑制的分裂蛋白A，橙色滑柱菌(Herpetosiphon aurantiacus)ATCC 23779
		查询 2   ALLRSIPA 9(SEQ ID NO：20)A+LRSIPA (SEQ ID NO：28)对象 364 AMLRSIPA 371(SEQ ID NO：22)	葡萄糖抑制的分裂蛋白A，玫瑰弯菌(Roseiflexus sp.)RS-1，长度＝679
查询 1   SALLRSIP 8(SEQ ID NO：24)SALLR+IP (SEQ ID NO：30)对象 288 SALLRAIP 295(SEQ ID NO：25)	PAS/PAC传感器信号转导组氨酸激酶，橙色标桩菌(Stigmatella aurantiaca)DW4/3-1
		查询 2   ALLRSIP  8(SEQ ID NO：21)ALLRSIP  (SEQ ID NO：21)对象 312 ALLRSIP  318(SEQ ID NO：21)	调节蛋白LuxR，Mariprofundus ferrooxydansPV-I
查询 2   ALLRSIPA 9(SEQ ID NO：20)ALLR+IPA (SEQ ID NO：29)对象 189 ALLRTIPQ 196(SEQ ID NO：26)	三角四肽TPR 2，橙色滑柱菌(Herpetosiphonaurantiacus)ATCC 23779
		查询 2   ALLRSIPA 9(SEQ ID NO：20)ALLRS+PA (SEQ ID NO：31)对象 406 ALLRSVPA 413(SEQ ID NO：27)	辅酶F390合成酶/苯乙酰基CoA连接酶，黑海甲烷袋状菌(Methanoculleus marisnigri)JRl

查询 2   ALLRSIPA 9(SEQ ID NO：20)ALLRSIPA (SEQ ID NO：20)对象 614 ALLRSIPA 621(SEQ ID NO：20)	磷脂酰肌醇聚糖，G类，斑马鱼(Danio rerio)
		查询 2   ALLRSIP 8(SEQ ID NO：21)ALLRSIP (SEQ ID NO：21)对象 134 ALLRSIP 140(SEQ ID NO：21)	金属依赖性磷酸水解酶，酸杆菌(Acidobacteria)细菌Ellin345

实施例2：神经保护活性的分析方法

NATLSIHQ(SEQ ID NO：4)和STPTAIPQ(SEQ ID NO：6)是NAP样肽。测试了这些肽对星形胶质细胞和神经元在ZnCl₂和β-淀粉样肽中毒后存活的影响。

A.方法

1.大脑皮层星形胶质细胞

按照以前的描述制备细胞培养物(McCarthy KD，de Vellis J.，J.Cell Biol，85：890-902(1980)；Gozes I等，J.Pharmacol.Exp.Ther.，257：959-66(1991))。将新生小鼠(Harlan Biotech Israel Ltd.，Rehovot，Israel)通过断头术处死，取出大脑。切下皮层，除去脑膜。用剪刀将组织剪碎，放置在Hank′s平衡盐溶液X1(HBSS，Biological Industries，Beit Haemek，Israel)，15mM HEPES缓冲液pH 7.3(Biological Industries，Beit Haemek，Israel)和0.25％胰蛋白酶(Biological Industries，BeitHaemek，Israel)中，在温箱中在37℃和10％CO₂下放置20分钟。然后将细胞置于8ml溶液D1中，该溶液在Dulbecco′s修改的Eagle′s培养基(DMEM，Sigma，Rehovot，Israel)中含有10％热失活的胎牛血清(Biological Industries，Beit Haemek，Israel)，0.1％硫酸庆大霉素溶液(Biological Industries，Beit Haemek，Israel)和0.1％青霉素-链霉素-制霉菌素溶液(Biological Industries，Beit Haemek，Israel)。允许细胞沉降，然后转移到含有2.5ml D1的新管中，用巴氏滴管捣碎。该过程再重复两次。在所有细胞都悬浮后，使用血细胞计数器(Neubauerimproved，Germany)测定细胞密度，将1x10⁶个细胞/15ml D1接种到每个75em²细颈瓶中(Corning，Corning，NY，USA)。将细胞在37℃和10％CO₂下进行培养。24小时后更换培养基，将细胞生长至合生(一周)。

2.大脑皮层星形胶质细胞传代培养

摇动含有大脑皮层星形胶质细胞的细颈瓶，以排出可能存在的残余神经元和少突神经胶质细胞。然后将细颈瓶用10ml冷HBSSx1，15mM HEPES清洗。在每个细颈瓶中加入5ml维尔烯-胰蛋白酶溶液(BioLab，Jerusalem，Israel)，将细颈瓶在室温温育5分钟以除去星形胶质细胞。然后摇动细颈瓶以倒出细胞。用5ml D1中和维尔烯-胰蛋白酶溶液。收集细胞悬液，100g离心10分钟。除去上清液，将细胞重新悬浮在D1中。将细胞铺于96孔板中(Corning，Corning，NY，USA)(每个细颈瓶铺2块板)，在37℃和10％CO₂下培养直到合生。

3.混合的神经胶质培养物

使用新生大鼠，按照上面的描述制备大脑皮层星形胶质细胞培养物。在将细胞悬浮于D1中之后，以100g离心5分钟，丢弃上清液。将细胞沉淀重新悬浮在溶液D2中，该溶液在DMEM中含有5％热失活的马血清(Biological Industries，Beit Haemek，Israel)，0.1％庆大霉素，0.1％青霉素-链霉素-制霉菌素，1％N3(含有培养物中神经元发育所必需的确定的培养基成分(Romijn HJ，Brain Res.，254：583-9(1981)))，15μg/ml 5′-氟-2-脱氧尿苷(FUDR，Sigma，Rehovot，Israel)以及3μg/ml尿苷(Sigma，Rehovot，Israel)。将细胞在血细胞计数器中计数，在D2中稀释，将按照上述制备的8日龄星形胶质细胞以17,000个细胞/孔/96孔板进行接种。第二天将培养基更换为不含FUDR和尿苷的D2。在实验进行之前，允许细胞在37℃和10％CO₂下生长1周。

4.MAP2分析

使用神经元特异性抗体MAP2分析了在β-淀粉样肽中毒后神经胶质培养物中神经元的存活。在制备混合神经胶质培养物后一周，吸出细胞生长培养基，向细胞加入新鲜D2培养基。将溶解在水中并允许在37℃聚集至少两周的0.25μM β-淀粉样肽1-42(American PeptideCompany，Sunnyvale，CA，USA)，与浓度从10^-19到10^-5M增加的NATLSIHQ(SEQ ID NO：4)或STPTAIPQ(SEQ ID NO：6)一起加入到每个孔中。将细胞在37℃下在10％CO₂中培养。

在加入β-淀粉样肽和肽后5天，通过从每个孔除去培养基并加入冷甲醇将细胞固定。将细胞留在冰箱中过夜。按照以前的描述将细胞用抗MAP2抗体免疫染色(Brooke SM等，Neurosci.Lett.，267：21-4(1999))：移除甲醇，将细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗4次。通过将细胞在含有5％脱脂奶的PBS中、在4℃下温育过夜，进行非特异性抗体结合的阻断。然后除去阻断溶液，向每个孔加入抗MAP2抗体(1∶1000；Sigma，Rehovot，Israel)。将细胞在室温温育30分钟，然后用PBS清洗4次。然后向每个孔加入生物素化的抗小鼠IgG(1∶200，Vector Laboratories，Burlingame，CA，USA)，将细胞在室温温育30分钟，然后用PBS清洗4次。将细胞与按照制造商的方案制备的ABC试剂(Vector Laboratories，Burlingame，CA，USA)在室温温育30分钟，然后用PBS清洗4次。然后向每个孔加入按照制造商的方案制备的ABTS试剂(Vector Laboratories，Burlingame，CA，USA)，将细胞在暗处在室温温育20分钟。将板在ELISA读板器中在405nm读数。使用含有未处理的细胞和无第一抗体的孔作为空白。

5.MTS分析

使用MTS分析方法测试了星形胶质细胞在用ZnCl₂中毒后的存活。将星形胶质细胞在96孔板中传代培养后一周，吸出星形胶质细胞生长培养基，向细胞添加含有200μM ZnCl₂和浓度上升的NATLSIHQ(SEQ ID NO：4)或STPTAIPQ(SEQ ID NO：6)(浓度范围10^-16-10^-7M)的培养基。将细胞在37℃下在10％CO₂中温育4小时，然后使用Celltiter96水性非放射活性细胞增殖分析(Promega，Madison，WI，USA)，按照制造商的说明书进行MTS分析，在ELISA读板器中在490nm读数。

B.结果：

结果显示在图1和2以及下面的表2中。两种肽在神经保护分析中都有活性。在神经胶质细胞和星形胶质细胞二者的存活分析中，NATLSIHQ(SEQID NO：4)的功效高于STPTAIPQ(SEQ ID NO：6)的功效。

表3：测试的肽对星形胶质细胞和神经元存活的有效浓度的归纳

肽：	神经元(25μM β-淀粉样肽)	星形胶质细胞(200μM ZnCl2)
			STPTAIPQ(SEQ ID NO：6)	10-13，10-5(p＜0.05)	10-7(p＜0.05)
NATLSIHQ(SEQID NO：4)	10-17，10-13(p＜0.005)10-19，10-15，10-9(p＜0.05)	10-10(p＜0.05)10-12，10-8(p＜0.005)10-7(p＜0.0005)

应该认识到，本发明描述了一类新的微管蛋白结合肽模拟物，包括含有与NAP或SAL具有相似性的肽的模拟物，用于提供神经营养和神经保护活性，以及潜在的其他治疗活性。修饰包括常规的置换，添加40个氨基酸的N-或C-末端，亲脂化(lipophylization)，乙酰化等。

上面提出的实施例用于示例本发明的效果，而不打算限制本发明的实施方案或范围，它们由下面提出的权利要求书考虑。对于本技术领域的普通专业人员来说，本发明的其他变体是显而易见的，并被所附的权利要求书所涵盖。所有在本说明书中提到的出版物、数据库、Genbank序列、GO术语、专利和专利申请，以其全文引为参考，如同每个单独的出版物或专利申请被具体地、单独地指明引为参考。

Claims (18)

1.NAP样肽模拟物或SAL样肽模拟物，其中NAP样或SAL样肽模拟物具有式(R¹)_a-(R²)-(R³)_b-，其中：

R¹是含有1到大约40个氨基酸的氨基酸序列，其中每个氨基酸独立地选自天然存在的氨基酸和氨基酸类似物；

R²是选自下列的成员：

NATLSIHQ(SEQ ID NO：4)，STPTAIPQ(SEQ ID NO：6)，NAVLSIHQ(SEQ ID NO：2)，NATLSVHQ(SEQ ID NO：3)，NATLSIVHQ(SEQ IDNO：5)，NTPVSIPQ(SEQ ID NO：7)，APVSIPQ(SEQ ID NO：8)，NTPISIPQ(SEQ ID NO：9)，NAPVSIP(SEQ ID NO：10)，NAPVAVPQ(SEQ IDNO：11)，NARVSIPQ(SEQ ID NO：12)，DAPVSVPQ(SEQ ID NO：13)，ALLRSIPA(SEQ ID NO：20)，ALLRSIP(SEQ ID NO：21)，AMLRSIPA(SEQ ID NO：22)，ALLRAIPA(SEQ ID NO：23)，SALLRSIP(SEQ IDNO：24)，SALLRAIP(SEQ ID NO：25)，ALLRTIPA(SEQ ID NO：26)和ALLRSVPA(SEQ ID NO：27)；

R³是含有1到大约40个氨基酸的氨基酸序列，其中每个氨基酸独立地选自天然存在的氨基酸和氨基酸类似物；并且

a和b独立地选择，并且等于0或1，前提是NAP样或SAL样肽模拟物不包含序列NAPVSIPQ(SEQ ID NO：1)或SALLRSIPA(SEQ ID NO：19)。

2.权利要求1的NAP样肽模拟物或SAL样肽模拟物，其中R²是选自NATLSIHQ(SEQ ID NO：4)和STPTAIPQ(SEQ ID NO：6)的成员。

3.权利要求1的NAP样肽模拟物或SAL样肽模拟物，其中a和b等于0。

4.权利要求1的NAP样肽模拟物或SAL样肽模拟物，其中R²的至少一个氨基酸是D-氨基酸。

5.权利要求1的NAP样肽模拟物或SAL样肽模拟物，其中R²的每个氨基酸都是D-氨基酸。

6.权利要求1的NAP样肽模拟物或SAL样肽模拟物，其中NAP样肽模拟物或SAL样肽模拟物还含有至少一个保护基团。

7.权利要求1的NAP样肽模拟物或SAL样肽模拟物，其中肽模拟物是NATLSIHQ(SEQ ID NO：4)。

8.权利要求1的NAP样肽模拟物或SAL样肽模拟物，其中肽模拟物是STPTAIPQ(SEQ ID NO：6)。

9.权利要求7或8的NAP样肽模拟物或SAL样肽模拟物，其中至少一个氨基酸是D-氨基酸。

10.权利要求7或8的NAP样肽模拟物或SAL样肽模拟物，其中每个氨基酸都是D-氨基酸。

11.权利要求7或8的NAP样肽模拟物或SAL样肽模拟物，其中NAP样肽模拟物或SAL样肽模拟物还含有至少一个保护基团。

12.含有权利要求1的NAP样肽模拟物或SAL样肽模拟物的药物组合物。

13.权利要求12的药物组合物，还含有神经保护多肽，该神经保护多肽含有选自NAPVSIPQ(SEQ ID NO：1)和SALLRSIPA(SEQ ID NO：19)的氨基酸序列。

14.在对象中治疗或预防神经变性疾病、认知障碍、自身免疫疾病、外周神经毒性、运动机能障碍、感觉机能障碍、焦虑、抑郁症、精神分裂症、精神病、与胎儿酒精综合征相关的病症、涉及视网膜变性的病症、影响学习和记忆的疾病或神经精神疾病的方法，所述方法包括给需要的对象施用治疗有效量的、权利要求1的NAP样肽模拟物或SAL样肽模拟物的步骤，从而在对象中治疗或预防神经变性疾病、认知障碍、自身免疫疾病、外周神经毒性、运动机能障碍、感觉机能障碍、焦虑、抑郁症、精神分裂症、精神病、与胎儿酒精综合征相关的病症、涉及视网膜变性的病症、影响学习和记忆的疾病或神经精神疾病。

15.权利要求14的方法，其中NAP样肽模拟物或SAL样肽模拟物是选自NATLSIHQ(SEQ ID NO：4)和STPTAIPQ(SEQ ID NO：6)的成员。

16.权利要求14的方法，其中NAP样肽模拟物或SAL样肽模拟物通过鼻内给药。

17.权利要求14的方法，其中NAP样肽模拟物或SAL样肽模拟物口服给药。

18.权利要求14的方法，其中NAP样肽模拟物或SAL样肽模拟物通过静脉内或皮下给药。

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