CN1444600A - 用于增强学习和记忆的活性依赖性神经营养因子衍生的多肽的使用:出生前后的给药 - Google Patents

Abstract

本发明提供使用ADNF多肽改善表现(如学习和/或记忆)的方法，该方法包括用足够量的话性依赖性神经营养因子(ADNF)多肽治疗出生前或出生后的对象，以改善其出生后的学习和/或记忆。

Description

用于增强学习和记忆的活性依赖性神经营养 因子衍生的多肽的使用：出生前后的给药

ADNF I多肽具有一个活性核心位点，该位点含有如下的氨基酸序列：Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala(“SALLRSIPA”或简称为“SAL”或“ADNF-9”)。ADNF III多肽也具有一个活性核心位点，该位点含有几个氨基酸残基，即Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln(“NAPVSIPQ”或简称为“NAP”)。以前已知这些ADNF多肽，它们各自在涉及神经退化的动物模型中具有显著的效力和活性。

在本发明的一个实施例中发现，在患有如神经病理学、阿尔茨海默氏病、唐氏综合症、衰老或精神障碍(如脆性X染色体综合症)的动物模型以及正常的动物中，在出生后给药，ADNF多肽也增强性能，如学习和记忆方面的性能。本发明的多肽还可用于改善短期的记忆和参比记忆(reference memory)。

因此，本发明ADNF多肽的应用包括：改善患有例如神经病理学、感觉-运动问题的对象的表现；改善认知工作受到削弱的对象的表现；改善患有记忆缺陷的对象的表现；改善正常对象的表现；等等。因此，成适当制剂形式的本发明实施例，可用于减少学习一种认知、运动或知觉工作所需的时间。或者，成适当制剂形式的本发明的化合物可用于增加保留认知、运动或知觉工作所需的时间。作为另一选择，成适当制剂形式的本发明实施例，可用于减少回忆一种认知、运动或知觉工作中出现的错误的量和/或严重性。这种治疗在神经系统有损伤或者已患有神经系统疾病的个体中证明是特别有利的。将ADNF多肽给予受影响的个体，之后，使该个体进行认知、运动或知觉方面的工作。此外，可对正常的对象给予ADNF多肽，以改善它们的表现(如学习和记忆)。ADNF多肽特别可用于其记忆能力(如短期)通常下降的老龄人群中。

在另一实施例中，本发明部分是以以下的发现为基础：当在子宫内用活性依赖性神经营养因子(ADNF)多肽动物进行治疗时，该ADNF多肽改善动物出生后的学习和记忆，尤其是空间学习。令人惊讶的是，即使在开始妊娠时以出生前给药的方式给予单剂量的ADNF多肽，也还是可以观察到ADNF多肽的长期效果。令人相当惊讶的是，ADNF多肽的这种增强的学习和记忆效果即使在智能正常的动物(如没有任何智力削弱的正常小鼠)中也可以发现。因此，ADNF多肽可促进正常动物超越其天然的学习和记忆能力，并可改善它们的认知技能。

如上所述，这些ADNF多肽先前已在动物模型，尤其在那些涉及神经退化的动物模型中有显著的效力和活性。但是，当在动物出生后给予ADNF多肽时，可观察到这些多肽的效果。现在第一次发现使用ADNF多肽进行出生前的治疗可增强动物出生后的学习和记忆，这对于正常的动物和智力减退的动物都一样。

本发现在改善人的学习、记忆和相关的智力过程中具有显著的应用。甚至正常的人也可受益于ADNF多肽的出生前治疗。此外，本发现可用于智力损伤的对象。例如，如果胎儿被诊断为具有精神障碍或唐氏综合症，则可用ADNF多肽治疗子宫内的胎儿，以改善其出生后的学习和记忆技能。即使没有特别诊断出精神障碍或唐氏综合症，也可以在某些环境中对胎儿预防性地给予ADNF多肽。例如，如果存在精神障碍(如脆性X染色体综合症)的家族史，则可以预防性地将ADNF多肽给予子宫内的胎儿。在另一例子中，如果母亲年纪大(35岁或以上)，因此而存在婴儿患有唐氏综合症或其它遗传缺陷的较高风险，则可预防性地向子宫内的胎儿给予ADNF多肽。

可测量各种参数，以确定ADNF多肽或ADNF多肽的组合是否在体内改善了表现(如学习和记忆)。例如，可使用下面的材料和方法章节中所述的可使用的Morris水迷宫的隐藏平台试验。通常，通过训练用ADNF多肽治疗的小鼠和对照小鼠(没有用ADNF治疗)，以使它们认识隐藏平台的位置并爬到该平台上面，从而逃避游泳任务。完成这项任务所花费的时间称为逃避等待时间(latency)。每天可进行一次或多次这种试验，并进行多天。指示学习和记忆改善的一个参数是爬到隐藏平台上而逃避游泳任务的等待时间减少。还可参见Gozes等〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93：427-432(1996)〕所述的方法，本文将其纳入作为参考。用合适的ADNF多肽治疗的动物与没用ADNF多肽治疗的动物相比，其学习和记忆能力得到改善。本发明的实施例并不限于用来测量表现的试验例子。任何合适的试验方法都可用于测量表现(如学习和记忆)。

可采用本领域中已知的其它方法来确定ADNF多肽或ADNF多肽的组合是否在体内改善表现(如学习和记忆)。例如，这些方法包括采用以下试验对随时间而变的记忆或学习的进行评估：Randt记忆试验〔Randt等，Clin.Neuropsychol.，2：184(1980)〕、Wechsler记忆量表〔J.Psych.，19：87-95(1945)〕、Forward指距(Forward Digit Span)试验〔Craik，《人记忆中的年龄差别》，Handbook of thePsychology of Aging，Birren和Schaie(编辑)，纽约，Van Nostrand(1977)〕、简短精神状态(Mini-Mental State)检查(Folstein等，J.of Psych.Res.，12：189-192(1975)〕、或加州言语学习(California Verbal Learning)测验(CVLT)。还可以参见美国专利第6030968号。在这些测试中，与ADNF多肽的效果无关的因素(如焦急、疲乏、愤怒、压抑、混乱或精力旺盛)得以控制。参见美国专利第5063209号。评估和控制客观因素的方法在本领域中是已知的，并可采用标准的临床试验，例如：BECK抑郁量表、Spielberger特征性状态(Spielberger Trait State)焦虑试验和POMS(Profileof Mood State，心情状态图)测验。

一方面，本发明提供一种改进表现(如学习和/或记忆)的方法，该方法包括在对象出生前或出生后，催其给予其量足以改善出生后表现(如学习和/或记忆)的活性依赖性神经营养因子(ADNF)多肽。本发明方法可用于任何年轻的或年老的对象，如患有神经病理学、阿尔茨海默氏病、唐氏综合症等的对象，或者正常的对象，或者子宫中的胎儿。在一个实施例中，ADNF多肽在出生前给予智能正常的对象。在另一实施例中，对象具有精神障碍(如脆性X染色体综合症)、精神障碍家族史、唐氏综合症或者其母亲在怀有该对象时年龄至少为35岁。如果对象患有精神障碍，这种障碍较佳不是由于怀孕期间母亲过量消费酒精所致(即，精神障碍不属于胎儿酒精综合症这一类)。

在一个实施例中，通过如腹膜内给药或口服给药在出生前对怀孕的母亲给予ADNF多肽。在另一实施例中，通过如腹膜内给药或口服给药在出生后给予ADNF多肽。在一个实施例中，在神经管发育和/或神经管闭合时给予ADNF多肽。

在一个实施例中，该方法包括给予ADNF多肽，该多肽是含有活性核心位点的ADNF I多肽，该位点的氨基酸序列是Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala(SEQID NO：1)。在另一实施例中，所述方法包括给予全长的ADNF I多肽。在又一实施例中，该方法包括给予ADNF I多肽，该多肽由氨基酸序列Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala(SEQ ID NO：1)组成。在又一实施例中，该方法包括给予ADNF I多肽，其中该ADNF I多肽选自：Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala(SEQ ID NO：14)、Val-Glu-Glu-Gly-Ile-Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala(SEQ ID NO：15)、Leu-Gly-G1y-Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala(SEQ ID NO：16)、Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala(SEQ ID NO：17)、Gly-Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (SEQ IDNO：18)和Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala(SEQ ID NO：19)。在又一实施例中，所述方法包括给予在其活性核心位点的N末端或C末端中至少一个末端具有多达约20个氨基酸的ADNF I多肽。在某些实施例中，ADNF I多肽在其N末端和C末端上都具有多达20个氨基酸的序列。

在另一实施例中，所述方法包括给予ADNF多肽，其中所述ADNF多肽是含有活性核心位点的ADNF III多肽，该核心位点的氨基酸序列为Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln(SEQ ID NO：2)。在又一实施例中，所述方法包括给予全长的ADNF III多肽。在又一实施例中，所述方法包括给予ADNF I多肽，该多肽由氨基酸序列Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln(SEQ ID NO：2)组成。在又一实施例中，所述方法包括给予ADNF III多肽，其中，所述ADNF III多肽选自：Gly-Gly-Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln(SEQ ID NO：20)、Leu-Gly-Gly-Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln-Gln-Ser(SEQ ID NO：21)、Leu-Gly-Leu-Gly-Gly-Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln-Gln-Ser(SEQ ID NO：22)和Ser-Val-Arg-Leu-Gly-Leu-Gly-Gly-Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln-Gln-Ser(SEQ ID NO：23)。在又一实施例中，所述方法包括给予在其活性核心位点的N末端或C末端中至少一个末端具有多达约20个氨基酸的ADNF III多肽。在某些实施例中，ADNF III多肽在其N末端和C末端上都具有多达20个氨基酸的序列。

在又一实施例中，所述方法包括给予ADNF I多肽和ADNF III多肽的混合物。可将本文所述的任何一种或多种ADNF I多肽与本发明这方面或其它方面所述的任何一种或多种ADNF III多肽混合。

在另一实施例中，ADNF多肽的活性核心位点包含至少一个D-氨基酸。在另一实施例中，ADNF多肽的活性核心位点全都是D-氨基酸。

在又一实施例中，至少一个ADNF多肽由给予对象的核酸编码。

在又一实施例中，该ADNF多肽改善了短期记忆。在又一实施例中，该ADNF多肽改善了参比记忆。在又一实施例中，该ADNF多肽鼻内或口服给予。

从本发明下面的详细描述、附图和附带的权利要求，本领域熟练的技术人员将容易地理解本发明的这些和其它方面。

                     附图的简要描述

图1：学习和记忆削弱的AF64A处理的大鼠在用ADNF-9鼻内给药后病情得到改善。对成年大鼠每天进行两次水迷宫试验(分别为A和B)。测试组是：1.用载体处理的对照动物(20只动物，空心圆圈)；2.鼻内给予载体的AF64A处理的动物(27只动物，空心方形)；3.鼻内给予ADNF-9治疗的对照动物(黑色圆圈，12只动物)；4.鼻内给予ADNF-9治疗的AF64A处理的动物(19只动物，黑色方形)。图(A)描述在其新的日常位置中到达隐藏平台〔表明完整的参比记忆，Gordon等，Neurosci.Lett.，199：1-4(1995)〕所花费的等待时间(秒，平均值±平均值的标准偏差)。连续四天进行测试。图(B)是到达隐藏平台之上0.5分钟后的等待时间(秒)〔表明完整的工作记忆过程，Gordon等，Neurosci.Lett.，199：1-4(1995)；Gozes等，J.Neurobiol.，33：329-342(1997a)〕，连续四天进行该测试。在用载体处理的动物和未处理动物之间没有差别(数据未给)。图(C)：在测试的第5天，移去平台，进行空间探测试验。使动物游泳120秒，记录动物停留在平台象限上的时间。

图2：学习和记忆削弱的AF64A处理的大鼠在用NAP鼻内给药后病情得到改善。重复图1(分别是A、B和C)所报道的相同试验，除使用的肽是NAP，每个试验组的动物数量是10-20只，AF64A处理的组为27只。

图3：鼻内给予的〔³H〕-NAP到达身体和大脑。图(A)：给药后，在指定时间处死动物，称重组织样品，在β计数器中检测放射性(双份试验)，图中描述了从4只动物获得的平均值。图(B)：在指定时间点解剖大脑，并检测放射性。图(C、D)：在鼻内给药后完整的〔³H〕-NAP到达大脑。均浆放射性组织样品，将其低速离心。对〔³H〕-NAP原液(空白圆圈)进行HPLC分级分离，分析上清液(应用后30分钟，黑色圆圈，C；应用后60分钟，黑色三角形，D)。在β计数器中监测样品的放射性(dpm)。计算所有的结果，以fmole的NAP/g组织描述放射性。图(E)：使用另外3只动物重复该试验，这里的动物重200g，用其替换A-D中的250-300g重动物，使用watchmaker镊子(5号)取出小的可见血管。

图4(A)：鼻内应用NAP阻止了AF64A处理的大鼠中乙酰胆碱转移酶活性的下降。显示了将放射性标记的胆碱掺入乙酰胆碱中。根据对照(100％)对结果进行校正。每组(每组三个试验)使用3只动物进行试验，并如文中所述进行分析。图(B)：AF64A处理的大鼠学习记忆削弱、长时间持续的NAP而非ADNF-9治疗的效果。每个试验组使用10只雄性大鼠(如方法部分所述)。使用4组，3组用AF64A处理，一组用盐水处理(对照)。给大鼠一周的时间恢复，然后用ADNF-9或NAP处理两个AF64A组。在5个治疗日之后，使这些动物恢复两天，然后进行日常水迷宫试验(如图1和2)。这个试验和图1和2中的试验之间的差别是，这个试验中的动物在进行行为试验前不接每天鼻内应用肽。该图描述了表明短期记忆的第二次日常试验。

图5阐述在动物出生前使用L-NAP和L-SAL的混合物对其进行的治疗(腹膜内注射)对学习的影响，由Morris水迷宫试验评估。

图6阐述在动物出生前使用D-NAP和D-SAL的混合物对其进行的治疗(口服给药)对学习的影响，由Morris水迷宫试验评估。

图7阐述在动物出生前使用D-SAL对其进行的治疗(口服给药)对学习的影响，由Morris水迷宫试验评估。

图8阐述在动物出生前使用D-NAP对其进行的治疗(口服给药)对学习的影响，由Morris水迷宫试验评估。

图9阐述在动物出生前使用两倍剂量的D-SAL对其进行的治疗(口服给药)对学习的影响，由Morris水迷宫试验评估。

图10阐述在动物出生前使用D-NAP和D-SAL的混合物对其进行的治疗(口服给药)对学习的影响，由Morris水迷宫试验评估。

                           定义

词语“ADNF多肽”指具有一个活性核心位点的一种或多种活性依赖性神经营养因子(ADNF)，该位点包含氨基酸序列SALLRSIPA(称为“SAL”)或NAPVSIPQ(称为“NAP”)，或者该位点的具有如下述文献所述进行体外皮层神经元培养物试验测得的神经营养性/神经保护性活性的保守修饰的变体：如Hill等，Brain Res.，603，222-223(1993)；Venner & Gupta，Nucleic Acid Res.，18，5309(1990)；和Peralta等，Nucleic Acid Res.，18，7162(1990)；Brenneman等，Nature，335，636(1998)；或者Brenneman等，Dev.Brain Res.，51：63(1990)；Forsythe & Westbrook，J.Physiol.Lond.，396：515(1988)。ADNF多肽可以是ADNF I多肽、ADNF III多肽、它们的等位基因、多态变体、类似物、种间同系物，或者其任何在体外或体内对中枢神经系统中产生的神经元具有神经营养性/神经保护性作用的亚序列(如SALLRSIPA或NAPVSIPQ)。“ADNF多肽”还指ADNF I多肽和ADNF III多肽的混合物。

术语“ADNF I”指分子量约为14000道尔顿、pI为8.3±0.25的活性依赖性神经营养因子多肽。如上所述，ADNF I多肽有一个包含氨基酸序列Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala(也称为“SALLRSIPA”或“SAL”或“ADNF-9”)的活性位点。参见Brenneman等，J.Clin.Invest.，97：2299-2307(1996)；Glazner等，Anat.Embryol.(在出版中)；Brenneman等，J.Pharm.Exp.Ther.，285：619-27(1998)；Gozes & Brenneman，J.Mol.Neurosci.，7：235-244(1996)和Gozes等，Dev.BrainRes.，99：167-175(1997)，本文将所有这些文献纳入作为参考。除非另有说明，否则“SAL”指具有氨基酸序列Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala的肽，而不是具有氨基酸序列Ser-Ala-Leu的肽。ADNF I的全长氨基酸序列可在WO 96/11949中发现，本文将该文全部内容纳入作为参考。

术语“ADNF III”和“ADNP”指具有预计的分子量约95kDa(约828个氨基酸残基)和pI约为5.99的活性依赖性神经营养因子多肽。如上所述，ADNF III多肽具有包含氨基酸序列为Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln(也称为“NAPVSIPQ”或“NAP”)的活性位点。参见Bassan等，J.Neurochem.，72：1283-1293(1999)，本文将其纳入作为参考。除非另有说明，否则“NAP”指具有氨基酸序列为Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln的肽，而不是氨基酸序列为Asn-Ala-Pro的肽。ADNF III的全长序列可在WO 98/35042和WO 00/27875中发现。

词语“改善学习和/或记忆”指表示学习和记忆的至少一个参数得到改善或增强。改善或增强是参数至少有10％的变化，任选地至少约为20％、至少约为30％、至少约为40％、至少约为50％、至少约为60％、至少约为70％、至少约为80％、至少约为90％、至少约为100％、至少约为150％、至少约为200％等。采用本领域已知的任何方法可测量学习和记忆的改善。例如，进行Morris水迷宫可筛选出改善学习和记忆的ADNF多肽(例如可参见材料和方法部分)。还可参见Gozes等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93：427-432(1996)。还可采用本文所述的方法和本领域熟练的技术人员已知的其它方法测试记忆和学习，如Randt记忆试验、Wechsler记忆量表、Forward指距试验、或加州言语学习测验。

术语“记忆”包括记忆的所有医学分类，如感官的、即时的、最近的和遥远的记忆，以及在心理学中使用的术语，如参比记忆，参比记忆指从先前的经历(最近的或遥远的)中获得的信息〔例如可参见《Harrison每科学原理》(Harrison′sPrinciples of Internal Medicine)，第1卷，第142-150页，Fauci等编辑，1988〕。

可能受益于本发明的治疗和诊断应用的病理学或神经病理学包括以下方面，如：

中枢运动系统疾病，包括影响基底神经节的退化性病症(亨廷顿疾病、肝豆状核变性、纹状体黑质退化、皮层基底神经节退化)、图雷特综合症、帕金森病、进行性超核(supranuclear)中风、进行性延髓麻痹、家族痉挛性截瘫、脊肌萎缩、ALS及其变体、齿状脑红核萎缩、橄榄体脑桥小脑萎缩、副肿瘤性小脑退化和多巴胺毒性；

影响感官神经元的疾病，如弗里德赖希共济失调、糖尿病、外周神经病、视网膜神经元退化；

边缘和皮层系统的疾病，如大脑淀粉样变性病、脑叶萎缩、雷特综合症；

涉及多个神经系统和/或脑干的神经退化病理学，包括阿尔茨海默氏病、AIDS相关的痴呆、利氏病、弥漫性雷维小体病、癫痫、多系统萎缩、急性感染性多神经炎、溶酶体贮存疾病如脂褐质沉积症、唐氏综合症的晚退化期、阿尔帕病、导致中枢神经系统(CNS)神经退化的眩晕；

与发育延迟和学习削弱相关的病理学、唐氏综合症和诱导神经元死亡的氧化压力；

由于老化和长期酒精或药物滥用引起的病理学，包括如由蓝斑、大脑、胆碱能基底前脑的酒精中毒性神经元退化产生的病理学；由导致认知和运动削弱的大脑神经元和皮层神经元的衰老退化产生的病理学；由导致运动削弱的基底神经元的长期苯丙胺滥用性退化产生的病理学；

由病灶性外伤产生的病理变化，如中风、病灶性局部缺血、血管供应不足、氧过少-局部缺血性脑病、高血糖、低血糖、闭合头部外伤或者直接外伤；

作为治疗药物和治疗的负性副作用而产生的病理学〔如对NMDA类谷氨酸受体的拮抗剂的抗惊阙药剂量反应的带束状的和内嗅(entorhinal)皮层神经元退化〕。

术语“空间学习”指学习一个环境并获取在该处的目标是什么的知识。它还涉及学习并使用有关环境中多个暗示之间的关系的信息。可使动物认识获得奖赏的位置，并使用空间暗示来记住该位置，从而可测试动物的空间学习。例如，可使用辐射形臂迷宫(即学习哪个臂中有食物)、Morris水迷宫(即学习平台在哪里)来测试空间学习。为了实施这些任务，动物使用从测试室中获得的提示(目标、气味的位置等)。也可对人进行空间学习。例如，可要求对象画一幅图，然后将图拿走。然后要求该对象凭记忆再画一幅相同的图。这后一幅图反应了该对象的空间学习程度。

术语“对象”指处于任何生命阶段的任何哺乳动物，尤其是人。例如，对象可指胚胎、胎儿、婴儿、小孩子、青少年或成人。

“正常”的对象或具有“正常的智能”的对象指其智能水平在平均水平左右或高于平均水平的对象(如IQ大于75)。“正常”的对象也可指没有任何智力削弱(如根据羊膜穿刺试验)和/或没有危险因子(如精神障碍的家族史或母亲在怀孕期间过量消费酒精，导致胎中的胎儿酒精综合症)的对象，如胎儿。

根据下述三个标准可认为对象患有“精神障碍”：智能水平(IQ)低于70-75；在两个或多个适应性技能区域中存在明显的局限性；从童年时期(18岁或以下)就存在该病症(AAMR，1992)。适应性技能区域是在社区中生存、工作和游玩所需的日常生活技能。它们包括通讯、自我照顾、家庭生活、社会交往、休闲、健康和安全、自我导向、实用性学院(阅读、书写、基础数学)、社区用途和工作。参见http：//www.thearc.org/faqs/mrqa.html。

术语“唐氏综合症”是染色体疾病，当所存在的不是染色体21的2个拷贝的正常补体，而是完整的、或者有时是部分的附加染色体21时会发生这种综合症。

术语“接触”在本文中与下述术语交替使用：与…组合、加到…、与…混合、通入、与…培育、流过等等。此外，本发明ADNF多肽或编码该多肽的核酸可以采用任何常规的方法给予，如肠胃外、口腔、局部和吸入途径。在本优选实施例中，采用的是肠胃外和鼻吸入途径。

“足够量”或“有效量”是给定的ADNF多肽改善表现(如学习和/或记忆)的量。例如，在改善学习和记忆的内容中，“足够量”或“有效量”是给定的ADNF多肽减少在第一次日常测试中(参比记忆的指示)或第二次日常测试中(短期记忆的指示)，在水迷宫测试中找到平台的等待时间的量。剂量范围可根据所使用的ADNF多肽、给药途径和具体的ADNF多肽的效力而改变，但是采用前述试验可容易地测定。

术语“分离的”、“纯化的”或者“生物学纯”指材料基本上或实质上不含有在其天然状态一起出现的成分。通常使用分析化学技术如聚丙烯酰胺凝胶电压或高效液相层析测定纯度和均一性。在制品中是优势种类的蛋白质是基本上纯化的。尤其是，分离的ADNF核酸从侧接该ADNF基因并编码ADNF以外的蛋白质的开放读框中分离得到。术语“纯化的”指基本上从电泳凝胶中的一个条带中获得的核酸或蛋白质。具体而言，它指至少有80％纯度、更佳纯度至少为95％、最佳纯度至少为99％的核酸或蛋白质。

“核酸”指单链或双链形式的脱氧核糖核酸或核糖核酸和聚合物。该术语包括含有已知核苷酸类似物或修饰的骨架残基或连锁(linkage)的核酸，这些核酸是合成的、天然产生的或非天然产生的，它们具有与参考核酸类似的结合特性，并以与参考核酸类似的方式被代谢。这类类似物的例子包括但不限于硫代磷酸、氨基磷酸盐、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。

除非另有说明，否则具体的核酸序列还隐含地包括其保守修饰的变体(如简并密码子取代)和互补的序列，以及明显指示的序列。术语核酸与基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸交替使用。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中交替使用，指氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于其一个或多个氨基酸残基是相应的天然氨基酸的类似物或模拟物的氨基酸聚合物，以及天然产生的氨基酸聚合物。

术语“氨基酸”指天然产生的氨基酸、氨基酸类似物和以与天然产生的和类似的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸模拟物。天然产生的氨基酸是被遗传密码编码的那些氨基酸，以及那些被后期修饰的氨基酸，如羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物指其基本化学结构与天然产产生的氨基酸相同的合成氨基酸，即α碳与氢、羧基、氨基和R基团结合的氨基酸(如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍(methionine methyl sulfonium)。这种类似物具有修饰的R基(如正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但保留了与天然产生的氨基酸相同的基本化学结构。天然产生的和类似的氨基酸都可合成制得。氨基酸模拟物指其结构与氨基酸的一般化学结构不同、但以与天然产生的氨基酸类似的方式起作用的化学化合物。

在本文中，可使用它们的通常已知的三个字母符号表示氨基酸，或者使用IUPAC-IUB生物化学命名委员会建议的单字母符号表示。同样地，核苷酸也可使用通常接受的单字母代码表示。

“保守修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列。对于具体的氨基酸序列，保守修饰的变体指那些编码相同的或基本上相同的氨基酸序列的核苷酸，或者在核酸不编码氨基酸序列的情况下，该变体指基本上相同的序列。具体而言，通过产生其一个或多个(或者全部)选择的密码子的第三位被混合的碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列，从而可获得简并密码子取代〔Batzer等，Nucleic Acid Res.，19：5081(1991)；Ohtsuka等，J.Biol.Chem.，260：2605-2608(1985)；Rossolini等，Mol.Cell.Probes，8：91-98(1994)〕。由于遗传密码的简并性的缘故，大量的功能相同的核酸编码任何给定的蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在丙氨酸被密码子指定的每一个位置上，该密码子可改变成所述的任何相应的密码子，而不改变其所编码的多肽。这种核酸变体是“沉默变异”，属于保守修饰变异的一种。本文中编码多肽的每一种核酸序列也描述了该核酸的每一种可能的沉默变异。熟练的技术人员将认识到，可修饰核酸中的每一个密码子(除了通常为甲硫氨酸仅有的密码子AUG和通常为色氨酸仅有的密码子TGG外)，以产生功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每种沉默变异都隐含在所描述的每个序列中。

至于氨基酸序列，熟练的技术人员将认识到，对核酸、肽、多肽或蛋白质序列进行的改变、添加或删除所编码的序列中的单个氨基酸或小百分比氨基酸的单个取代、删除或添加是“保守修饰的变体”，其改变导致一个氨基酸被具有化学上类似的氨基酸取代。提供功能类似的氨基酸的保守取代的表在本领域中是已知的。这种保守修饰的变体是除了本发明的多态型变体、种间同系物以及等位基因以外的变体，但并不排除这些变体。

下面的组中各含有相互为保守取代的氨基酸：

(1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；

(2)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；

(3)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；

(4)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；

(5)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)；

(6)精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)；

(7)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、缬氨酸(V)；

(8)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。

〔例如可参见Creighton，Proteins(1984)〕。

用在关于两个或多个核酸或多肽序列的内容中的术语“相同的”或百分比“同一性”指如使用下述序列比较算法之一或者采用人工排列和肉眼观察进行测量，当在比较窗口内比较和校正，以获得最大对应性时，相同的或者指定百分比的氨基酸残基或核苷酸(即70％同一性)是相同的两个或多个序列或亚序列。可认为这种序列“基本上相同”。这个定义还指测试序列的互补。较佳的是，百分比同一性在至少约25个氨基酸长度的序列区域内存在，更佳是在50或100个氨基酸长度的区域内存在。

对于序列比较，通常将一条序列作为所要比较的测试序列的参比序列。当使用序列比较算法时，将测试序列和参比序列输入计算机中，如果需要可指定亚序列配位，并指定序列算法程序参数。可使用默认的程序参数，或者指定作为另一种选择的参数。然后在程序参数的基础上，使用序列比较算法计算测试序列相对于参比序列的百分比序列同一性。

“比较窗口”在本文中包括在20-600个、一般约为50-200个、更一般约为100-150个连续的位置中任一数量的片段，其中，在序列与具有相同数量的连续位置的参比序列以最佳方式排列后，可对它们进行比较。排列要比较的序列的方法在本领域中是已知的。可采用以下文献中所述的算法处理要比较的序列的最佳排列方式：如Smith & Waterman，〔Adv.Appl.Math.，2：482(1981)〕的局部同源性算法、Needleman & Wunsch〔J.Mol.Biol.，48：443(1970)〕的同源性排列算法、Pearson & Lipman〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：2444(1988)〕的相似性方法的研究、这些算法的计算机化处理〔Wisconsin遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，遗传学计算机工作组，575，Science Dr.，Madison，WI〕，或者采用人工排列和肉眼观察〔例如可参见《新编分子生物学试验指南》(Current protocols in molecular biology)，Ausubel等编辑，1995年增刊〕。

适合用于测定百分比序列同一性和序列相似性的算法的优选例子是BLAST和BLAST 2.0算法，它们分别在Altschul等〔Nuc.Acids Res.，25：3389-3402(1977)〕和Altschul等〔J.Mol.Biol.，215：403-410(1990)〕中描述。使用BALST和BALST2.0测定本发明的核酸和蛋白质的百分比序列同一性，参数如本文所述。执行BALST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得。这个算法涉及通过鉴别询问序列(query sequence)中长度为W的短字节而首先鉴别出高记分序列对(HSP)，该序列对在与数据库序列中相同长度的字节排列时，匹配或满足一些正值的阈记分T。T是指邻近字节的记分阈(Altschul等，同上)。用这些原始的邻近字符串作为寻找含有它们的更长的HSP的起始检索的开端。这些字符串沿着各序列的两个方向延伸，直到可增加累积的排列记分。使用参数M(一对匹配残基的奖分，总是大于0)和N(错配残基的罚分，总是小于0)来计算核苷酸序列的累积记分。对于氨基酸序列，使用记分矩阵来计算累积的记分。字符串在各个方向上的延伸在遇到以下情况时停止：累积的排列记分从其最大获取的记分被数量X减去；由于一个或多个负记分残基排列的累积的缘故，累积的记分为0或以下；或者到达序列的任一端。BLAST算法参数的W、T和X测定排列的敏知觉和速率。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用字长(W)为11、期望值(E)为10、M＝5、N＝4和两条链的比较为默认值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长为3和期望值为10作为默认值，BLOSUM62记分矩阵〔参见Henikoff & Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：10915(1989)〕使用排列(B)为50、期望值(E)为10、M＝5、N＝4和两条链的比较为默认值。

BLAST算法还执行两条序列间的相似性的统计学分析〔例如可参见Karlin &Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：5873-5787(1993)〕。BLAST算法提供的一个相似性测量是最小总和概率〔P(N)〕，这个概率提供了一种指示，即两条核苷酸或氨基酸序列间可能偶然发生的匹配的概率。例如，如果在测试核酸与参考核酸的比较中，最小总和概率小于约0.2，则认为该核酸与参考序列类似，更佳的是该概率小于约0.01，最佳是小于约0.001。

两条核酸序列或多肽基本上相同的指示是，由第一核酸编码的多肽与针对第二核酸编码的多肽产生的抗体发生免疫学上的交叉反应，如下文所述。因此，多肽通常与第二多肽基本上相同，例如，在两条肽仅仅被保守取代不同的情况中。两条核酸序列基本上相同的另一指示是，两个分子或它们的互补物在严格条件下相互杂交，如下文所述。两条核酸序列基本上相同的又一指示是可使用相同的引物扩增该序列。

词语“选择性(或特异性地)杂交”指当序列出现在复杂混合物(如总新编或文库DNA或RNA)中时，分子在严格杂交的条件下仅仅结合、复制或杂交到特定的核苷酸序列上。

词语“严格杂交条件”指通常在核酸的复杂混合物中，探针杂交到其靶亚序列而非其它序列上的条件。严格条件是序列依赖性的，在不同的环境中不同。较长的序列在较高的温度下特异性地杂交。Tijssen在《生物化学和分子生物学技术——核酸探针杂交》(Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridizationwith Nucleic Probes)(1993)撰文“杂交原则和核酸检测的策略的综述”描述了核酸杂交的广泛指南。通常，严格条件为：低于特定序列热熔点(T_m)约5-10℃的温度和定义的离子强度pH。Tm是在平衡条件下，与靶标互补的探针有50％与靶序列杂交的温度(由于靶序列过量，在Tm时，在平衡时50％的探针被占据)。严格条件是：盐浓度在pH7.0-8.3时小于约1.0M钠离子、一般约为0.0l-1.0M钠离子浓度(或其它盐)，对于短探针(如长10-50个核苷酸)温度至少约为30℃，对于长探针(如大于50个核苷酸)温度至少约为60℃。还可通过加入去稳定剂如甲酰胺而获得严格条件。对于选择性或特异性杂交，正信号至少是背景的两倍，较佳是背景杂交的10倍。示范性的严格杂交条件如下：50％甲酰胺、5x SSC和1％SDS，在42℃培育；或5x SSC，1％SDS，在65℃培育；在65℃使用0.2x SSC和0.1％SDS洗涤。

在严格条件下不相互杂交的核酸，如果它们编码的多肽基本上相同，则它们也基本上相同。例如，当使用遗传密码允许的最大密码子简并度产生核酸的拷贝时，会发生这种情况。在这些例子中，核酸通常在温和的严格杂交条件下杂交。示范性的“温和的严格杂交条件”包括：于37℃在40％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS的缓冲液中杂交，于45℃在1x SSC中洗涤。正杂交至少是背景的两倍。熟练的技术人员将易于认识到，可使用另外的杂交和洗涤条件来提供类似的严格条件。

           本发明和优选实施例的详细描述改善表现的方法

本发明提供一种改善对象的表现(如学习和/或记忆)的方法。该方法包括在对象出生前或出生后，向其给予其量足以改善出生后的表现的ADNF多肽。具体而言，出生前给药可改善对象的空间学习。下面详细描述了可从这种出生后或出生前的治疗中受益的候选对象、可给予的ADNF多肽、给药的时间和模式、评估学习和记忆改善的测试和生产ADNF多肽的方法。

使用ADNF多肽治疗的候选对象

可在许多类型的对象中使用ADNF多肽进行出生前和出生后治疗。例如，正常对象可从ADNF多肽的出生前治疗中受益，它们的学习和记忆得到改善。正常的对象或智能正常的对象指即时没有使用ADNF多肽进行出生前治疗，其智能水平在平均值左右或至少(如IQ大于75)的对象。在关于胎儿方面的内容中，正常的对象可以指没有表现出任何智力削弱(如，根据羊膜穿刺试验)和/或精神障碍风险因素(如有精神障碍家族史或母亲在怀孕期间消耗足够的酒精，导致对象患胎儿酒精综合症)的胎儿。希望其未出生的胚胎或胎儿的学习和记忆能力增强的母亲，可在胚胎或胎儿还在子宫内的时候就使用ADNF多肽。

此外，本方法可使其智商能力削弱的对象受益。例如，如果胎儿被诊断为有可能患有精神障碍或唐氏综合症，则可在子宫内用ADNF多肽治疗该胎儿，以便改善出生后的学习和记忆。在优选的实施例中，精神障碍不是由怀孕期间母亲消耗酒精引起的。换言之，具有精神障碍的候选对象不一定是胎儿酒精综合症患者(它可包括通常轻微到中度，但有时严重的精神障碍或学习无能的病症)。

严重的精神障碍(定义为IQ为50或以下)常常源于遗传疾病。这些包括例如唐氏综合症、脆性X染色体综合症、克兰费尔特综合症、普-威综合症和猫叫综合症。可使用出生前遗传测试诊断许多这类病症。例如，通过羊膜穿刺试验可测试遗传疾病，该诊断通常在怀孕14-18周之间进行，或者在怀孕的第9-12周之间进行绒毛膜取样。使用ADNF多肽对胎儿进行出生前治疗，有益于他们出生后的学习和记忆。

即时在出生前没有诊断出导致精神障碍的遗传病，在某些环境中也可以预防性的方式向胎儿给予ADNF多肽。例如，如果对象具有精神障碍家族史，则可在该对象出生前对其进行ADNF多肽治疗。在另一实施例中，如果对象由于传染病如风疹、脑膜炎、CMV等缘故而处于出生后患有精神障碍的高危状态，则可在该胎儿出生前用ADNF多肽治疗。在另一实施例中，当其母亲年纪较大时(如35岁或更大)，对象处于出生后患有某种遗传病(如唐氏综合症)的高危状态。使用ADNF多肽进行的预防性的出生前治疗可改善对象的学习和记忆能力。

在另外一些实施例中，对象可在其生命的晚期进行治疗，例如，为了改善短期的学习和记忆。例如，某些记忆和学习方面的疾病，如阿尔茨海默氏病，可能直到生命晚期才变为明显。可在出生后给予ADNF多肽治疗的其它病症包括：神经病理学；感觉-运动问题；改善认知工作削弱的对象的表现；改善记忆缺陷的对象的表现；改善正常对象的表现；等等。因此，成适当制剂形式的本发明的实施例可用于减少学习一种认知、运动或者知觉工作所需的时间。或者，成适当制剂形式的本发明的化合物可用于增加维持认知、运动或知觉工作的时间。作为另一种选择，成适当的制剂形式的本发明的实施例可用于减少回忆一种认知、运动或知觉工作中所产生的误差的量和/或严重性。这种治疗证明对于神经系统受到损伤的个体或者忍受着神经系统疾病的个体非常有利。此外，可将ADNF多肽给予正常的对象，以改善他们的表现(如学习和记忆)。ADNF多肽对记忆能力(如短期记忆)通常下降的老龄人群特别有用。

ADNF多肽

在本发明的实施例中可给予任何合适的ADNF多肽。例如，ADNF多肽可以是ADNF I多肽、ADNF III多肽或它们的混合物。在一些实施例中，ADNF多肽可包含所有的L-氨基酸、所有的D-氨基酸或它们的混合物。当ADNF多肽口服时，较佳的是它在其活性核心位点中至少包含一个D-氨基酸，更佳是在该活性核心位点的N末端和/或C末端至少包含一个D-氨基酸，还更佳是在整个活性核心位点中包含至少一个D-氨基酸，或者整个分子都是D-氨基酸。或者，D-氨基酸可存在于该多肽序列中的任何合适位置上。由于多肽的D-对映体比它们的L-对映体具有更强的酶稳定性，尤其是在胃肠道中，所以含有D-氨基酸的ADNF多肽特别可用于口服给药。

一方面，本方法包括给予含有活性核心位点的ADNF I多肽，该活性核心位点的氨基酸序列为Ser-Ala＝Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala。在一个实施例中，ADNF I多肽由其氨基酸序列为Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala的活性核心位点组成。在另一个实施例中，ADNF I多肽可在其活性核心位点的N末端和/或C末端包含附加的氨基酸。例如，ADNF I多肽可在其活性核心位点的N末端和/或C末端包含多达40个的氨基酸。在另一实施例中，ADNF I多肽可在其活性核心位点的N末端和/或C末端包含多达20个的氨基酸。在又一实施例中，ADNF I多肽可在其活性核心位点的N末端和/或C末端包含多达10个的氨基酸。在又一实施例中，ADNF I多肽可是全长的ADNF I多肽。

另一方面，本方法包括向对象给予ADNF III多肽，该多肽包含其氨基酸序列为Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln的活性核心位点。在一个实施例中，ADNF I多肽由其氨基酸序列为Asn-Val-Ser-Ile-Pro-Gln的活性核心位点组成。在另一实施例中，ADNF III多肽可在其活性核心位点的N末端和/或C末端包含附加的氨基酸。例如，ADNF III多肽可在其活性核心位点的N末端和/或C末端包含多达40个的氨基酸。在另一实施例中，ADNF III多肽可在其活性核心位点的N末端和/或C末端包含多达20个的氨基酸。在又一实施例中，ADNF III多肽可在其活性核心位点的N末端和/或C末端包含多达10个的氨基酸。在又一实施例中，ADNFIII多肽可是全长的ADNF III多肽。

在一个优选的实施例中，ADNF I多肽包含(R¹)_x-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-(R²)_y的氨基酸序列，ADNF III多肽包含(R³)_w-Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln-(R⁴)_z的氨基酸序列。

在上述式子中，R¹、R²、R³和R⁴如果存在，则是含有长1-40个氨基酸的氨基酸序列，这些氨基酸中每一个都是独立选择的。术语“独立选择的”在本文中指构成如氨基酸序列R¹的氨基酸可以相同或不同(如，氨基酸序列中所有的氨基酸可以都是苏氨酸等)。此外，如先前所述，构成氨基酸序列R¹的氨基酸可以是天然产生的氨基酸，或者是其功能与天然产生的氨基酸类似的天然氨基酸的已知的类似物(即氨基酸模拟物)。关于R¹的这个讨论也适用于R²、R³和R⁴。

在ADNF I多肽的上述式子中，x和y被独立选择，并且等于0或1。术语独立选择在本文中指x和y可以相同或不同。例如，x和y都可以是0，或者x和y都可以是1。此外，x可以是0，y可以是1，或者x可以是1，而y可以是0。此外，如果x和y都是1，氨基酸序列R¹和R²可以相同或不同。这样，氨基酸序列R¹和R²是独立选择的。如果R¹和R²相同，则它们在链长度和氨基酸组成方面是相同的。例如，R¹和R²都可以是Val-Leu-Gly-Gly-Gly。如果R¹和R²不同，它们可在链长度和/或氨基酸组成和/或氨基酸序列中的氨基酸顺序互不相同。例如，R¹可以是Val-Leu-Gly-Gly-Gly，而R²可以是Val-Leu-Gly-Gly。或者，R¹可以是Val-Leu-Gly-Gly-Gly，而R²可以是Val-Leu-Gly-Gly-Val。或者，R¹可以是Val-Leu-Gly-Gly-Gly，而R²可以是Gly-Val-Leu-Gly-Gly。

类似地，在ADNF III多肽的以上式子中，w和z是独立选择的，并且等于0或1。术语独立选择在本文中指w和z可以相同或不同。例如，w和z都可以是0，或者w和z都可以是1。此外，w可以是0，z可以是1，或者w可以是1，而z可以是0。此外，如果w和z都是1，氨基酸序列R³和R⁴可以相同或不同。这样，氨基酸序列R³和R⁴是独立选择的。如果R³和R⁴相同，则它们在链长度和氨基酸组成方面是相同的。例如，R³和R⁴都可以是Leu-Gly-Leu-Gly-Gly。如果R³和R⁴不同，它们可在链长度和/或氨基酸组成和/或氨基酸序列中的氨基酸顺序互不相同。例如，R³可以是Leu-Gly-Leu-Gly-Gly，而R⁴可以是Leu-Gly-Leu-Gly。或者，R³可以是Leu-Gly-Leu-Gly-Gly，而R⁴可以是Leu-Gly-Leu-Gly-Leu。

在该范围内，某些ADNF I和ADNF III多肽是优选的，即x、y、w和z都是0的那些(即，分别是SALLRSIPA和NAPVSIPQ)。同样优选的是x是1、R¹是Val-Leu-Gly-Gly-Gly、y是0的ADNF I多肽。还同样优选的是x是1、R¹是Val-Glu-Glu-Gly-Ile-Val-Leu-Gly-Gly-Gly以及y是0的ADNF I多肽。同样地，w是1、R³是Gly-Gly以及z是0的ADNF III多肽也是优选的。同样地，w是1、R³是Leu-Gly-Gly、z是1以及R⁴是Gln-Ser的ADNF III多肽也是优选的。同样地，w是1、R³是Leu-Gly-Leu-Gly-Gly、z是1、R⁴是Gln-Ser的ADNF III多肽也是优选的。同样地，w是1、R³是Ser-Val-Arg-Leu-Gly-Leu-Gly-Gly、z是1、R⁴是Gln-Ser的ADNF III多肽也是优选的。附加的氨基酸可加到这些活性位点(SALLRSIPA或者NAPVSIPQ)的N末端和C末端，不会使其生物学活性丧失，这可由完整的ADNFI或ADNF III生长因子具有异常的生物学活性的事实得以证明。参见1994年10月14日提交的描述ADNF I多肽的U.S.S.N.08/324297(国际公开号为WO96/11948)；1997年2月27日提交的U.S.S.N.60/037404；1997年9月23日提交的描述ADNF III多肽的U.S.S.N.60/059621(国际公开号为WO98/35042)，本文将所有这些文献纳入作为参考。

又一方面，本方法包括向对象给予ADNF I多肽和ADNF III多肽的混合物。本文所述的任何一种或多种ADNF I多肽可与本文所述的任何一种或多种ADNFIII多肽混合。ADNF I多肽和ADNF III多肽的混合物可以是两种或多种这些多肽的混合物。ADNF I多肽和ADNF III的混合物还可以指与一种或多种ADNF III多肽(直接或间接)偶联的一种或多种ADNF I多肽。例如，ADNF I可共价连接于ADNFIII多肽。可将ADNF I多肽和ADNF III多肽的混合物制成单一的组合物，然后将其给予对象。或者，可将ADNF I多肽和ADNF III多肽制成分离的组合物。然后同时或依次给予对象分离的组合物。此外，可给予对象不同比例的ADNF I多肽和ADNF III多肽。例如，可给予对象ADNF I多肽与ADNF III多肽的比例为1∶100到100∶1、1∶10到10∶1或者1∶2到2∶1的ADNF多肽。

又一方面，可使用其它ADNF多肽(包括它们的等位基因、多态变体、种类同系物或其亚序列)来增强表现。

可测量各种参数，以确定ADNF多肽或ADNF多肽的混合物是否改善对象的表现。例如，可在对照组(如未用ADNF多肽处理)与预先用ADNF多肽处理的组之间比较学习能力不足的程度。可使用例如Morris水迷宫(例如可参见实施例部分)评估学习能力不足。如果与对照相比，经ADNF多肽处理的组，其任何一个或多个这些参数改变了例如约10％、任选地至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约80％、至少约100％、至少约150％、至少约200％等，那么这些ADNF多肽可有利地用在本发明中。

给药和药物组合物

可采用本领域已知的任何合适的方法在出生前或出生后向对象给予ADNF多肽和编码ADNF多肽的核酸。例如，可将ADNF多肽或核酸配制成具有药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂的药物组合物。用于本发明的适当的制剂可在《Remingto氏药学科学》(Remington′s Pharmaceutical Science，第17版，1985)中发现，本文将其纳入作为参考。药物传送方法的简短综述可以在如Langer，Science，249：1527-1633(1990)中找到，本文将其纳入作为参考。此外，含有肽和蛋白质的药物组合物在如《治疗性肽和蛋白质制剂、加工和传送系统》(Therapeutic Peptideand Proteins Formulations，Processing，and Delivery Systems)，Banga著，Technomic出版公司，Landaster，PA(1995)中描述。

在一个实施例中，ADNF多肽被配制成口服给药，如给予对象，或者配制成出生前给药，如给予对象的母亲。在这个实施例中，较佳的是使用都是D-氨基酸的ADNF多肽。通过掺入任何一种通常使用的赋形剂可形成药学上可接受的无毒性组合物，通常活性成分为10-95％，更佳为25-75％。此外，为了改善ADNF多肽的口服吸附，可使用各种载体系统，如毫微颗粒、微粒、脂质体、磷脂、乳化液、红细胞等。含有本发明的ADNF多肽的口服制剂可以口服给药的任何适当形式，如液体、片剂、胶囊等。还可包衣或处理口服制剂，以阻止或减少其在胃中溶解。例如可参见《治疗性肽和蛋白质制剂、加工和传送系统》，A.K.Banga著，Technomic出版公司，Landaster，1995。

此外，可将ADNF多肽配制成肠胃外、局部、鼻、舌下、管饲或局部给药的形式。例如，可经肠胃外给予药物组合物，如静脉内、皮下、皮内或肌内或鼻内给药。因此，本发明提供用于肠胃外给药的组合物，该组合物含有ADNF多肽的混合物的溶液，这些多肽溶解或悬浮在可接受的载体中，载体优选是水性载体。可使用各种水性载体，包括如水、缓冲的水、0.4％盐水、0.3％甘氨酸、透明质酸等。可采用常规的、周知的无菌技术给这些组合物灭菌，或者将它们无菌过滤。可将所得的水性溶液包装起来即可使用，或者将其冻干，冻干的制品在给药前要先与无菌的溶液混合。根据近似的生理条件，这些组合物可含有药学上可接受的辅助物质，包括pH调节和缓冲剂、毒性调节剂、增湿剂等，如醋酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、失水山梨糖醇单月桂酸酯、油酸合三乙醇胺等。在一个实施例中，编码ADNF多肽的核酸以裸DNA的形式给予。

对于气溶胶给药，较佳使ADNF多肽以细微分离的形式与表面活性剂和推进剂一起给予。当然，表面活性剂必须是无毒的，优选是溶解在推进剂中。这类制剂的代表性例子是含有6-22个碳原子的脂肪酸的酯或部分酯，如己酸、辛酸、月桂酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、olesteric酸和油酸与脂族多烃基醇或其环状酐的酯或部分酯。可使用混合的酯，如混合的或天然的甘油。如果需要，还可包含有载体，如用于鼻内传送的卵磷脂。

对于固体组合物，可使用常规的无毒性固体载体。固体载体包括如药用级甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。

本发明还提供治疗性组合物或药剂，它们包含本文上述一种或多种ADNF I和ADNF III多肽的混合物与药学上可接受的赋形剂混合，其中ADNF I和ADNF III多肽的混合物的量足以提供所需的治疗效果。

包括SALLRSIPA和NAPVSIPQ的小多肽可通过血脑屏障。对于不通过血脑屏障的较长的多肽，向大脑给予蛋白质的方法是周知的。例如，可通过脑室内(ICV)注射或套管将蛋白质、多肽、其它化合物传送到哺乳动物的大脑中〔例如可参见Motta & Martini，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，168：62-64(1981)；Peterson等，Biochem.Pharamacol.，31：2807-2810(1982)；Rzepczynski等，Metab.Brain Dis.，3：211-216(1988)；Leibowitz等，Brain Res.Bull.，21：905-912(1988)；Sramka等，Stereotact.Funct.Neurosurg.，58：79-83(1992)；Peng等，Brain Res.，632：57-67(1993)；Chem等，Exp.Neurol.，125：72-81(1994)；Nikkhah等，Neuroscience，63：57-72(1994)；Anderson等，J.Comp.Neurol.，357：296-317(1995)；和Brecknell & Fawcett，Exp.Neurol.，138：338-344(1996)〕。尤其是，可使用套管向哺乳动物给予神经营养因子〔例如可参见Motta & Martini，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，168：62-64(1981)(神经降压素)；Peng等，Brain Res.，632：57-67(1993)(NGF)；Anderson等，J.Comp.Neurol.，357：296-317(1995)(BDNF、NFG、神经营养蛋白-3)〕。

或者，可使不通过血脑屏障的较长ADNF多肽与帮助其跨过血脑屏障并跨过细胞的原生质膜或者细胞内的隔室如核的膜的物质偶联。细胞膜由脂质-蛋白质双层构成，小的、非离子型脂质化合物可自由地透过该双层，极性化合物、大分子和治疗剂或诊断剂本质上不能透过。但是，具有将多肽如ADNF多肽移位的能力的蛋白质和其它化合物，如已经描述的脂质体可跨过细胞膜。

例如，“膜移位多肽”具有两性的或疏水性的氨基酸亚序列，具有作为膜移位载体的能力。在一个实施例中，同源域蛋白质具有转运跨过细胞膜的能力。同源域蛋白质的最短的可内化肽——触足肽(Antennapedia)出现在蛋白质的第三螺旋上，从第43位的氨基酸到第58位的氨基酸〔例如可参见Prochiantz，Current Opinionin Neurobiology，6：629-634(1996)〕。另一条亚序列——信号肽的疏水结构域，发现其也具有类似的细胞膜移位特性〔例如可参见Lin等，J.Biol.Chem.，270：14255-14258(1995)〕。

可连接于本发明的ADNF多肽，用于促进ADNF多肽被摄入细胞中的肽序列的例子包括但不限于：HIV的tat蛋白的11个氨基酸肽〔参见Schwarze等，Science，285：1569-1572(1999)〕；对应于p16蛋白的第84-103位上的氨基酸的20个残基肽序列〔参见Fahraeus等，Current Biology，6：84(1996)〕；触足肽的60个氨基酸长同源域的第三螺旋〔Derossi等，J.Biol.Chem.，269：10444(1994)〕；信号肽的h区域，如Kaposi成纤维细胞生长因子(K-FGF)h区域〔Lin等，同上〕；或者HSV的VP22移位结构域〔Elliot & O′Hare，Cell，88：223-233(1997)〕。提供增强的细胞摄取的其它合适的化学部分也可用化学方法连接于ADNF多肽。

毒素分子也具有运输多肽通过细胞膜的能力。通常，这类分子由至少两个部分构成(称为“双重毒素”)：移位或结合结构域或多肽，和分离的毒素结构域或多肽。通常，该移位结构域或多肽与细胞受体结合，然后毒素被转运到细胞中。已在将肽传送到细胞胞液的尝试中使用几种细菌毒素作为内在的或氨基末端融合蛋白，这些毒素包括产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)微小毒素、白喉毒素(DT)、假单胞菌属(Pseudomonas)外毒素A(PE)、百日咳毒素(PT)、炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)毒素和百日咳腺苷酸环化酶(CYA)〔Arora等，J.Biol.Chem.，268：3334-3341(1993)；Perelle等，Infect.Immun.，61：5147-5156(1993)；Stenmark等，J.Cell Biol.，113：1025-1032(1991)；Donnelly等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：3530-3534(1993)；Carbonetti等，Abstr.Annu.Meet.Am.Soc.Microbiol.，95：295(1995)；Sebo等，Infect.Immun.，63：3851-3857(1995)；Klimpel等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：10277-10281(1992)；和Novak等，J.Biol.Chem.，267：17186-17193(1992)〕。

这些亚序列可用于转运ADNF多肽跨过细胞膜。ADNF多肽可方便地与这些序列融合，或者用这些序列衍生。通常，以融合蛋白的一部分的形式提供移位序列。任选地，可使用接头连接ADNF多肽和移位序列。可使用任何合适的接头，如肽接头。

也可使用脂质体和脂质体衍生物，如免疫脂质体和脂质：核酸复合物，将ADNF多肽和编码ADNF多肽的核酸引入动物细胞中，优选是哺乳动物细胞。术语“脂质体”指由灌封水相的一个或多个同心的有序脂质双层构成的囊。水相通常含有要传送给细胞的化合物，如ADNF多肽。

脂质体与原生质膜融合，从而将ADNF释放到胞液中。或者，脂质体以运输囊的形式被细胞吞噬或摄取。一旦进入内涵体中或吞噬体中，脂质体要么被降解，要么与该运输囊的膜融合，然后释放出其内容物。

在目前的通过脂质体传送药物的方法中，脂质体最终成为可渗透，并在靶组织或细胞中释放出包囊的化合物(在这个例子中是ADNF多肽)。对于全身性的传送或组织特异性传送，可采用如被动的方式实现这种传送，其中脂质体双层随着时间在体内各种制剂的作用下降解。或者，活性药物的释放涉及使用一种制剂来诱导脂质体囊中的渗透性改变。可构建脂质体膜，以使它们在其环境变为酸性接近脂质体膜时去稳定〔例如可参见Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84：7851(1987)；Biochemistry，28：908(1989)〕。例如，当脂质体被靶细胞胞吞时，它们变为去稳定，并释放出它们的内含物。这种去稳定化作用被称为融合发生(fusogenesis)。二油酰基磷脂酰基乙醇胺(DOPE)是许多“融合源性”系统的基础。

这类脂质体通常含有ADNF多肽和脂质成分，如中性的和/或阳离子性脂质，任选地包含受体识别的分子，如与预定的细胞表面受体或配体(如抗原)结合的抗体。在以下文献中描述了制备脂质体的各种方法：如Szoka等，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.，9：467(1980)；美国专利4186183、4217344、4235871、4261975、4485054、4501728、4774085、4837028、4235871、4261975、4485054、4501728、4774085、4837028、4946787；PCT出版物WO91/17424；Deamer & Bangham，Biochim.Biophys.Acta，443：629-634(1976)；Fraley等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76：3348-3352(1979)；Hope等，Biochim.Biophys.Acta，812：55-65(1985)；Mayer等，Biochim.Biophys.Acta，858：161-168(1986)；Williams等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：242-246(1988)；Liposomes(Ostro编辑，1983，第1章)；Hope等，Chem.Phys.Lip.，40：89(1986)；Gregoriadis，Liposome Technology(1984)和Lasic，Liposomes：from Physics to Applications(1993)。

合适的方法包括如超声波、挤出、高压/匀浆、微流化、去污剂透析、小脂质体囊的钙诱导融合和醚融合方法，所有这些在本领域中都是已知的。

在本发明的某些实施例中，需要使用对具体的细胞类型、组织等特异的靶向部分靶向本发明的脂质体。先前已经描述了使用各种靶向部分(如配体、受体和单克隆抗体)靶向脂质体〔例如可参见美国专利4957773和4603044〕。可采用将靶向制剂偶联到脂质体的标准方法。这些方法通常涉及将脂质体掺入脂质成分如膦脂酰乙醇胺中，这些成分可被靶向制剂的接合所激活；或者将其掺入衍生化的脂质化合物中，如脂质衍生的博来霉素。可使用如掺杂了蛋白A的脂质体构建抗体靶向的脂质体〔参见Renneisen等，J.Biol.Chem.，265：16337-16342(1990)和Leonetti等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：2448-2451(1990)〕。

或者，可使用编码ADNF的核酸提供治疗剂量的ADNF多肽。可将这些核酸插入任何数量的已知载体中，以用于转染靶细胞和生物体。例如，以DNA质粒、裸核酸和核酸与传送囊如脂质体的复合的形式传送核酸。病毒载体传送系统包括DNA和RNA病毒，这类病毒在传送到细胞中后具有游离体或整合的基因组。对于基因治疗方法的综述，可参见Anderson，Science，256：808-813(1992)；Nabel& Felgner，TIBTECH，11：211-217(1993)；Mitani & Caskey，TIBTECH，11：162-166(1993)；Dillon，TIBTECH，11：167-175(1993)；Miller，Nature，357：455-460(1992)；Van Brunt，Biotechnology，6(10)：1149-1154(1988)；Vigne，RestorativeNeurology and Neuroscience，8：35-36(1995)；Kremer & Perricaudet，British MedicalBulletin，51(1)：31-44(1995)；Haddada等，Current Topics in Microbiology andImmunology，Doerfler和Bohm编辑，1995；和Yu等，Gene Therapy，1：13-26，1994。

核酸的非病毒传送方法包括脂质转染、微注射、生物鉴定(biolistics)、病毒体、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质：核酸共轭物、裸DNA、人工病毒粒子和DNA的制剂增强性摄取。脂转染在如美国专利5049386、美国专利4946787和美国专利4897355中描述，脂转染试剂可从市售获得(如Transfectam^TM和Lipofectin^TM)。适合用于多核苷酸的有效的受体识别的脂转染的阳离子性和中性脂质包括Felgner、WO91/17424、WO91/16024中所述的那些。可传送到细胞(离体给药)或靶组织中(体内给药)。

在治疗应用中，本发明的ADNF I和ADNF III多肽以足以改善对象的表现(如学习和/或记忆)的量给予患者。适合实现这种改善的量称为“治疗有效量”。有效用于此用途的量取决于例如所使用的具体ADNF I或ADNF III多肽、给药方式、患者的重量和一般的健康状况及医生的判断。例如，对于表现(如学习和/或记忆)的改善，每只小鼠每天鼻内给予(如在晚上)1-50μg、优选1-10μg范围内的ADNF I或ADNF III多肽是治疗有效的量。这个剂量是以小鼠的平均体重为基础。因此，由此类推可得出用于人体的适当剂量。

可在对象出生前，直接或间接给予对象母亲以ADNF多肽。可在怀孕期间的任何时间给予ADNF多肽。较佳的是，在怀孕的前三个月(即前12周)给予ADNF多肽，此时对象的器官和神经系统正活跃地发育。更佳的是，在神经管开始发育(大约怀孕后22天左右开始)到其闭合之前这段时间内给予ADNF多肽。可以单剂量的形式给予ADNF多肽，较佳是在神经管发育的关键时期给予，或者可在整个怀孕期给予多剂量。

测量改善的学习和/或记忆的试验

可测量各种参数，以确定ADNF多肽是否在体内改善表现(如，学习和记忆)。例如，可使用下面实施例部分描述的Morris水迷宫的隐藏平台试验来测试空间学习和记忆。通常，使经ADNF多肽处理的小鼠和对照小鼠(未经ADNF多肽处理)知道隐藏平台的位置并爬到平台的上面，训练它们逃避游泳任务。小鼠完成这项任务所花费的时间定义为逃避等待时间。每天可进行这个试验一次或多次，并进行多天。指示学习和记忆改善的一个参数是爬到隐藏平台上从而逃避游泳任务的等待时间减少〔参见下面的实施例部分〕。还可参见Gozes等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93：427-432(1996)所述的方法，本文将其纳入作为参考。经适当的ADNF多肽处理的动物，与未经ADNF多肽处理的对照动物相比，它们的学习和记忆能力得到改善。本发明的实施例并不限于测量表现的试验例子。任何适当的测试方法都可用来测量表现，如学习和记忆。

可对人体使用本领域已知的其它方法来测定ADNF多肽或ADNF多肽的组合是否在体内改善表现(如学习和记忆)。例如，这些方法包括采用以下试验对随时间而变的记忆或学习进行评估：Randt记忆试验〔Randt等，Clin.Neuropsychol.，2：184(1980)〕、Wechsler记忆量表〔J.Psych.，19：87-95(1945)〕、Forward指距试验〔Craik，《人记忆中的年龄差别》，Handbook of the Psychology of Aging，Birren和Schaie(编辑)，纽约，Van Nostrand(1977)〕、简短精神状态检查(Folstein等，J.of Psych.Res.，12：189-192(1975)〕、或加州言语学习测验(CVLT)。还可以参见美国专利第6030968号。在这些试验中，与ADNF多肽的效果无关的因素(如焦急、疲乏、愤怒、压抑、混乱或精力旺盛)得以控制。参见美国专利第5063206号。评估和控制主观因素的方法在本领域中是已知的，并可采用如以下的标准临床试验确定：BECK抑郁量表、Spielberger特征性状态焦虑试验和POMS(Profile ofMood State，心情状态图)测验。

还可对人进行空间学习测试。例如，可要求对象画一幅图，然后将该幅图拿走。然后要求该对象凭记再忆画出一幅一样的图。对象后画的那幅图反映了其空间学习的程度。

可测量各种参数，以确定ADNF多肽是否改善了对象的学习和记忆。例如，通过比较对照(如未接受ADNF多肽治疗)和预先接受ADNF多肽治疗的组可获得学习和记忆改善的程度。可采用测试啮齿动物(如参见实施例部分)的Morris水迷宫或者上述测试人用的任何适当的试验来评估学习和记忆的改善。如果与对照相比，经ADNF多肽处理的组，这些参数中的任何一个或多个改变了例如约10％、任选地至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约150％、至少约200％等，则可认为该ADNF多肽改善了对象的学习和记忆。或者，采用用于连续变量的ANOVA、用于非参数数据的Mann-Whtiney U、用于无条件变量的Chi平方或者Fisher精确测试进行统计学分析，p＜0.05被认为是显著的。ADNF多肽的生产方法

生产ADNF多肽的重组方法

ADNF核酸的克隆和分离

本文描述了编码ADNF多肽的几种特殊核酸。例如，还可参见Brenneman &Gozes，J.Clin.Invest.，97：2299-2307(1996)；Brenneman，J.Pharm.Exp.Ther.，285：619-627(1998)；和Bassan等，J.Neurochem，72：1283-1293(1999)；本文将这些文献的全部内容纳入作为参考。可采用标准的重组或合成的技术制备这些核酸。对于本发明的核酸，熟练的技术人员可构建含有功能等价的核酸(如编码相同的ADNF多肽的核酸)的各种克隆。获得这些终端产物的克隆方法以及证明核酸序列的测序方法在本领域中是周知的。适当的克隆和测序的技术的例子，和足以指导熟练的技术人员进行许多克隆练习的建议可在如下文献中找到：Sambrook等，《分子克隆实验手册)》(第2版，1989)和《新编分子生物学实验指南》(Ausubel等编辑，1994)。

此外，来自生物试剂和实验设备制造商的产品信息也提供了用于已知的生物学方法中的信息。这些制造商包括SIGMA化学公司(Saint Louis，MO)、R&D系统公司(Minneapolis，MN)、Pharmacia LKB Biotechnology(Piscataway，NJ)、CLONTECH实验室公司(Palo Alto，CA)、Chem Genes公司、Aldrich化学公司(Milwaulee，WI)、Glen研究公司、GIBCO BRL生物技术股份有限公司(Gaithersberg，MD)、Fluka Chemica-Biochemika Analytika(Fluka Chemie AG，Buchs，Switzerland)，Invitrogen(San Diego，CA)和应用生物系统公司(Foster City，CA)，以及熟练的技术人员已知的其它许多商业来源。

本发明的核酸组合物，无论是RNA、cDNA、基因组DAN或者各种混合物的杂交物，都是从生物来源中分离得到，如星形细胞、成神经细胞瘤细胞或者成纤维细胞；或者在体外合成这些核酸组合物。本发明的核酸存在于转化或转染细胞中，成转化的或转染的细胞裂解物的形式，或者部分纯化或基本纯的形式。

适合用于扩增用作分子探针的序列或者产生用于接着的亚克隆的核酸片段的体外扩增技术是已知的。足以指导熟练的技术人员进行这些体外扩增的方法〔包括聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、QB-复制酶扩增和其它RNA聚合酶介导的技术(如NASBA)〕的技术的例子可在以下文献中发现：Berger，Sambrook等和Ausubel等，同上；美国专利4683202；《PCR方案——方法和应用指南》(PCRProtocols A Guide to Methods and Applications)(Innis等编辑，1990)；Arnheim &Levinson(1990年10月1日)，C &EN 36-47；The Journal Of NIH Research，3：81-94(1991)；Kwoh等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：1173(1989)；Guatelli等，Proc.Natl.Acad.Sci. USA，87：1874(1990)；Lomell等，J.Clin.Chem，35：1826(1989)；Landegren等，Science，241：1077-1080(1988)；Van Brunt，Biotechnology，8：291-294(1990)；Wu & Wallace，Gene，4：560(1989)；Barringer等，Gene，89：117(1990)；和Sooknanan & Malek，Biotechnology，13：563-564(1995)。在美国专利第5426039号中描述了体外克隆扩增核酸的改进方法。在Cheng等〔Nature，369：684-685(1994)〕和本文在此引用的文献中总结了扩增大核酸的改进方法。熟练的技术人员将理解，可以将任何RNA转化成适合使用反相转录酶和聚合酶进行限制消化、PCR延伸和测序的双链DNA。

通常根据Beaucage & Caruthers〔Tetrahedron Letts.，22(20)：1859-1862(1981)〕所述的固相亚磷酰胺三酯法，使用如Needham-VanDevanter等〔Nucleic Acids Res.，12：6159-6168(1984)〕所述的自动合成仪，化学合成用作如体外ADNF核酸扩增方法中的探针、或者用作检测ADNF核酸的核酸探针的寡核苷酸。还可从本领域熟练的技术人员已知的各种商业来源定制寡核苷酸。需要纯化寡核苷酸时，通常是采用天然的丙烯酰胺凝胶电泳或者阴离子交换HPLC进行，如Pearson &Regnier，J.Chrom.，255：137-149(1983)所述。采用Maxam & Gilbert〔《酶学方法》，65：499-560(Grossman & Moldave编辑，1980)〕所述的化学降解法证明合成的寡核苷酸的序列。

熟练的技术人员将认识到在给定核酸序列中产生改变的许多方法。这些已知的方法包括定点诱变、使用简并寡核苷酸进行的PCR扩增、将含有该核酸的细胞暴露于突变剂或辐照中、所需寡核苷酸的化学合成(如与连接和/或克隆一起进行，以产生大的核酸)或者其它已知的技术〔参见Giliman & Simth，Gene，8：81-97(1979)；Roberts等，Nature，328：731-734(1987)；和Sambrook等，《分子克隆实验手册》(第2版，1989)〕。

ADNF多肽的重组表达

在一个实施例中，采用重组核酸方法合成多肽或其序列。通常，这涉及产生编码蛋白质的核酸序列，将该核酸放到处于特定的启动子控制之下的表达盒中，在宿主细胞中表达该蛋白质，分离出表达的蛋白质，如果需要，还可使该蛋白质复性。

一旦编码本发明的ADNF多肽的核酸被分离和克隆，即可使该核酸任选地在本领域熟练技术人员已知的重组的工程细胞中表达。这些细胞的例子包括但不限于细菌、酵母、植物、丝状真菌、昆虫(尤其是使用杆状病毒载体的)以及哺乳动物细胞。将重组核酸可操作性地连接于适当的控制序列上，以用于在选择的宿主中表达。对于大肠杆菌，控制序列的例子包括T7、trp或λ启动子、核糖体结合位点，较佳的是转录终止信号。对于真核细胞，控制序列一般包括启动子，较佳是衍生自免疫球蛋白基因、SV40、巨细胞病毒等的增强子，以及多腺苷酸化序列，还可包括剪接供体和受体序列。

如果需要，可构建重组核酸，以编码含有ADNF多肽的融合多肽。例如，编码ADNF I多肽的核酸可连接于编码ADNF III多肽的核酸，以提供ADNF多肽的混合物。在另一例子中，编码ADNF多肽(如ADNF I多肽、ANDF III多肽或ADNFI/ADNF III多肽的融合物)的核酸可与另一种核酸连接，如HIV tat核酸的一部分，该部分促进ADNF III多肽传送到组织中。在又一例子中，编码ADNF多肽的核酸可连接于编码亲和标记物的核酸，以促进蛋白质纯化。可修饰ADNF核酸和异源多核苷酸序列，以促进它们的融合和接着的融合多肽的表达。例如，可用读框接头序列取代ADNF多核苷酸序列的3′终止密码子，这可提供限制位点和/或切割位点。

可采用已知的方法将本发明的质粒转移到选择的宿主细胞中。这些方法包括，例如用于大肠杆菌的氯化钙转化法和用于哺乳动物细胞的磷酸钙处理和电穿孔法。根据质粒上所含有的基因如amp、gpt、neo和hyg基因产生的抗生素抗性选择被质粒转化的细胞。

一旦被表达，可采用本领域的标准方法纯化重组的或天然产生的ADNF多肽，这些方法包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱层析、凝胶电泳等〔例如，参见Scopes，Polypeptide Purification(1982)；Deutscher，Methods in Enzymology Vol.，182：Guideto Polypeptide Purification(1990)〕。一旦被纯化(部分地或者根据需要达到同质性)，就可以使用ADNF多肽来改善对象的学习和记忆。例如，还可参见Brenneman &Gozes，J.Clin.Invest.，97：2299-2307(1996)；Brenneman等，J.Pharm.Exp.Ther.，285：619-627(1998)；和Bassan等，J.Neurochem，72：1283-1293(1999)，本文将这些文献的全部内容纳入作为参考。

ADNF多肽的合成

除了前面所述的重组技术外，可采用各种已知的方法任选地通过合成的方法制备本发明的ADNF多肽。通常根据常规的技术，在溶液中或者固相载体上合成较短的多肽〔例如，可参见Merrifield，Am.Chem.Soc.，85：2149-2154(1963)〕。可从市售途径获得各种自动合成仪和测序仪，并可根据已知的方案使用〔例如，可参见Stewart & Young，《固相肽合成》(Solid Phase Peptide Synthesis)(第2版，1984)〕。化学合成本发明的多肽的优选方法是固相合成法，在该方法中，序列的C末端氨基酸连接于不溶的载体上，接着在该序列上依次添加剩余的氨基酸。下面的文献中描述了固相合成的技术：Barany & Merrifield，《固相肽合成》；《肽：分析、合成、生物学》第2卷《肽合成中的特殊方法》A部分的第3-284页；Merrifield等，J.Am.Chem.Soc.，85：2149-2156(1963)；Stewart等，《固相肽合成》(第2版，1984)。

在化学合成、生物表达或纯化后，多肽可具有基本上不同于组成型多肽的天然构型的构型。在这个例子中，有助于多肽变性和还原然后引起该多肽重新折叠成优选的构型。使多肽还原和变性以及诱导重折叠的方法对于本领域熟练的技术人员来说是已知的〔参见Debinski等，J.Biol.Chem.，268：14065-14070(1993)；Kreitman & Pastan，Bioconjug.Chem.，4：581-585(1993)；Buchner等，Anal.Biochem.，205：263-270(1992)〕。例如，Debinski等描述了胍-DTE中的包涵体多肽的变性和还原。然后，在含有氧化型谷胱甘肽和L-精氨酸的氧化还原缓冲液中使该多肽重新折叠。

熟练的技术人员将认识到，可对这些多肽进行修饰而不消除它们的生物活性。可进行一些修饰，以促进克隆。表达或将靶分子掺入融合多肽中。这些修饰对于本领域熟练的技术人员是已知的，包括如在氨基末端加入甲硫氨酸，以提供一个起始位点，或者在任一端上放置附加的氨基酸(如多组氨酸)，以产生方便地定位的限制位点或终止密码子或纯化序列。

ADNF核酸和多肽的保守修饰

熟练的技术人员将理解，本文提供的ADNF核酸和多肽序列的许多保守改变可产生功能相同的产物。例如，由于遗传密码子的简并性，“沉默取代”(即不在编码的多肽中产生改变的核酸序列的取代)是编码一种氨基酸的每一个核酸序列暗含的特征。类似地，在氨基酸序列的一个或几个氨基酸中的“保守的氨基酸取代”是用具有高度相似特性的不同氨基酸进行的取代(参见定义部分，同上)，这种取代由于与公开的氨基酸序列、或者与编码氨基酸的公开核酸序列高度相似而易于被鉴别。各清楚地列出的核酸和氨基酸序列的这些保守取代的变体是本发明的一个特征。

熟练的技术人员将认识到在给定的核酸序列中产生改变的许多方法。这些已知的方法包括定点诱变、使用简并寡核苷酸进行的PCR扩增、将含有该核酸的细胞暴露于突变剂或辐照中、所需寡核苷酸的化学合成(如与连接和/或克隆一起进行，以产生大的核酸)以及其它已知的技术〔参见Gliliman & Smith，Gene，8：81-97(1979)；Roberts等，Nature，328：731-734(1987)〕。例如，可采用丙氨酸扫描来确定SALLRSIPA或NAPVSIPQ的保守修饰变体(即如本文所述，通过使用丙氨酸或其它小的中性氨基酸一个一个地取代每一个氨基酸，并检测其活性)。

通过改变相应的核酸序列并使多肽表达，也可改变多肽序列。也可使用市售获得的肽合成仪，采用合成的方法任选地产生多肽序列，以产生任何所需的多肽(参见Merrifield，同上，Stewart & Young，同上)。

更具体而言，本领域普通的技术人员将明白，采用各种检测(如Morris水迷宫检测)，根据其表现增强效果可容易地筛选本发明的ADNF多肽。

采用这些检测，本领域普通的技术人员根据本发明的这些教授将易于制备大量的ADNF多肽，然后使用先前所述的检测，依次筛选这些多肽，以找出除了本文前面所述的多肽以外的具有神经保护/神经营养活性的完整ADNF生长因子的多肽。例如，使用ADNF III-8(即，Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln作为位点，技术人员可系统地将如Gly-、Gly-Gly-、Leu-Gly-Gly-加到ADNF III-8的N末端上，然后，在前述检测中依次筛选这些ADNF III多肽中的每一种，以确定它们是否具有神经保护/神经营养活性。进行这样的操作时，将发现可在新发现的活性位点即Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln的N末端和C末端中加入附加的氨基酸，并且由完整的ADNF III生长因子具有异常的生物活性的事实证明了这种加入并没有导致生物学活性的丧失。这个讨论也适用于ADNF I多肽。

                            实施例实施例I：出生后给予ADNF多肽增强了学习和/或记忆

实施例I描述对照动物或暴露于胆碱毒素、乙酰胆碱吖丙啶(aziridium)(AF64A)(一种胆碱摄取的阻断物)〔Fisher等，Neurosci.Lett.，102：325-331(1989)〕的动物中的ADNF多肽的特性，这些多肽如衍生自ADNF I的SALLRSIPA(“ADNF-9”)、和衍生自ADNF-III或ADNP的NAPVSIPQ(“NAP”)。正常的脑功能需要完整的胆碱能系统，而阿尔茨海默氏病则与胆碱能细胞的死亡相关(Brumback和Leech，1994)。因此，经AF64A处理的大鼠提供一种用于测试保护认知不被削弱的药物在体内的药效的可接受的模型，该削弱可能产生自胆碱毒性〔Fisher等，Neurosci.Lett.，102：325-331(1989)；Gozes等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93：427-432(1996)；Gozes等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96：4143-4148(1999)〕。下面所述的试验显示，出生后鼻内给予ADNF多肽(如ADNF-9和NAP)，提供了针对与AF64A胆碱毒性相关的短期记忆丧失的神经保护。这些试验还描述ADNF多肽怎样增强对照动物的学习和记忆。

材料和方法

动物

使用雄性Wistar大鼠(300-350g，Harlan实验室，Jerusalem，Israel)进行胆碱毒性试验。

肽合成

采用固相技术合成肽，然后采用高效液相色谱〔HPLC；Gozes等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96：4143-4348(1999)〕纯化至均一性。采用氨基酸分析和电喷雾离子质谱法确定纯度和同一性(Micromass，Manchester，U.K.)。从肽技术公司(Peptide Technologies，Bethesda，MD，USA)购得额外的肽。

大鼠中的胆碱毒性和水迷宫中短期空间记忆的评估

在包括隐藏平台的水迷宫中对大鼠进行两组日常的测试〔Morris，R.，J.Neurosci.Methods，11：47-60(1984)；Gordon等，Neurosci.Lett.，199：1-4(1995)；Gozes等，J Neurobiol.，33：329-342(1997a)〕。对于第一组测试，平台和动物每天都处于池中新的位置上(池是固定不动的)。

如下进行试验：将动物放在平台上0.5分钟，然后将其放到水中。测量动物到达平台所需的时间(表明学习和完整的参比记忆)(第一测试)。动物在平台上0.5分钟后，再将它们放到水中(在先前的位置上)，进行寻找隐藏平台(仍在原先的位置上)第二试验。记录第二次试验中达到平台所需的时间，这个时间表明短期(工作)记忆。对动物进行4天的测试，以淘汰随机记忆缺陷的动物。

以0.21μ/分钟给表现最佳的动物i.c.v.注射AF64A(Sigma RBI，Saint Louis，Missouri，USA，3nmol/2μl/侧)；对照动物注射盐水〔Gozes等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93：427-432(1996)〕。使动物恢复一周，接着每天鼻内给予40μl的5％Sefsol(Sigma，Rehovot，Israel)与20％异丙醇(对照组)或含有1μg肽的5％Sefsol(试验组)〔Gozes等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93：427-432(1996)〕。

经肽处理一周后，在水迷宫中对动物进行两组日常测试。在测试期间，在日常测试之前1个小时，还给动物鼻内给予肽或载体。为了避免涉及各处理组中运动活性变化的偏差，还如下进行了评估空间记忆的探测试验测试。在4天的训练和测试后，移走平台，在第5天，使动物在没有平台的池中游泳(120秒)；在这些试验中，记录下动物位于平台之前所处池中的象限中所花的时间。使用HVS录像跟踪系统进行测量(HVS Image Ltd.，Hampton，UK)。

鼻内给药后的生物分布

合成包含氢脯氨酸的NAP(分子量为824.9)，交换这些NAP，以产生〔³H〕标记的肽〔NAP，丙基-3-3，4-[³H]，美国放射性标记化学公司，St.Louis，MO，USA〕。比活性是50Ci/mmol。采用高效液相色谱法(HPLC)确定NAP的纯度和同一性，使用5μm的Zorbax SB-C18(250×4.6mm)，用0.1％三氟乙酸中的5-25％的甲醇梯度洗脱20分钟，然后用220nm的UV和〔³H〕检测器β-Ram检测。给雄性Wistar大鼠(200-300g)的每个鼻孔施用含有1mCi/ml的溶液2.5μl。在指定的时间点处死大鼠，在55℃将组织增溶(100mg于1ml Luma Solve中Lumac bv.，Landgraaf，Netherlands，Netherlands)12小时。在加入Optiflour(10ml/100mg，Packard，Groningen，Netherlands)后，在β闪烁计数器中测定放射性。

对于大脑中完整的NAP的测定，在4℃用磷酸缓冲盐溶液(PBS)均浆皮层组织(100ml/1ml)，然后在4℃以10,000g离心该均浆夜。将所得的上清液于-80℃冷冻，再次进行HPLC(RP-18，Merck，250×4mm，5μm)，使用含有0.1％三氟乙酸的35-75％乙腈水溶液进行线性梯度洗脱〔Gozes等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96：4143-4148(1999)〕。

胆碱毒性活性的测量

如先前所述〔Gozes等，J Neurobiol.，33：329-342(1997a)〕，根据公开的方法(Fonnum，1975)测量乙酰胆碱转移酶(ChAT)活性。在行为试验结束时，将动物处死，解剖出大脑(大脑皮层)，然后如先前所述处理〔Gozes等，J Neurobiol.，33：329-342(1997a)〕。在对照组、AF64A处理和AF64A+肽处理组动物之间进行比较。

统计学分析

采用变量的ANOVA单途径分析(ANOVA one way analysis)和所有的成对的多次比较方法(Student-Newman-Leuls方法)进行统计学测试。

结果

鼻内给予ADNF-9以防体内AF64A治疗相关的短期记忆丧失

由于ADNF-9是短的疏水肽，所以通过鼻内给药测试了它影响大脑功能的可能性。在水迷宫中测量找到隐藏平台所需的时间，从而评估空间学习和记忆。进行两组日常测试。每两组日常测试中的平台位置和动物的起点保持不变，但每天平台位置和动物的起点都发生变化。

在表明参比记忆的第一组日常测试中，AF64A处理的动物与对照动物相比被延迟了，这在第二个测试天尤为明显(p＜0.016)。用ADNF-9处理的组产生表观不明显的改善(图1A)。相反，在第二组日常试验中〔表明完整的短期记忆(Gordon等，1995)〕，AF64A处理的动物明显地被延迟(在所有的测试日中p＜0.001)，而ADNF-9-AF64A处理的动物则在整个试验中表现出明显的改善，且等待时间减少(图1B，p＜0.001)。

图1C描述评估空间记忆的探测试验的结果。在4天的训练和测试之后，移走平台，在第5天，将动物放在没有平台的池中游泳。从探测试验可明显地看出，在给予ADNF-9的AF64A处理动物组中，动物处于平台先前在池中所处的象限中所花的时间明显增加(p＜0.001)。

鼻内给予NAP以防与体内AF64A处理相关的短期记忆丧失

在对照动物和AF64A处理的动物中使用NAP进行了与所述的ADNF-9类似的试验。在此，鼻内给予该肽。在第一天，在第一组日常测试(测试参比记忆)中，在放到隐藏平台上后，与载体处理的对照组动物相比，NAP处理动物立即显示出明显的改善(图2A，p＜0.001)。如上所述，AF64A处理组动物在水迷宫范例中产生减退的表现，在此，在测试的第4天，NAP处理的AF64A削弱的动物与载体处理的AF64A削弱的动物有明显不同(图2A，p＜0.041)。在表明短期记忆的第二组日常测试中，NAP处理的AF64A削弱的动物，在整个试验都得到改善，并在测试的第2天就已经达到对照水平(图2B，p＜0.001)。在4天的训练和测试后，在第5天移走平台，让动物在没有平台的池中游泳(如上)。结果显示，与AF64A-载体处理的动物相比，给予NAP的AF64A处理的动物处于平台先前在池中所处的象限中所花的时间明显地增加(图2C，p＜0.001)。此外，肽处理组(对照-假损害，或者AF64A损害)与对照(假损害)动物并没有明显的不同，与对照(假损害)动物相比，NAP处理组动物有表观非显著性改善(图2C)。

鼻内给予NAP体内保护对照动物的记忆

在对照动物中使用NAP进行与先前所述类似的试验。在此，鼻内给予肽。如图2A所示，在第一组日常测试(测试参比记忆)中，在将NAP处理的对照动物放到隐藏平台上后，与未用NAP处理的对照动物相比，这些动物立即显示出明显的改善(图2A)。

NAP的生物利用率和稳定性

在上述水迷宫测试中，NAP给药与ADNF-9给药相比，前者产生的行为改善明显增强(图1与图2)。之前，ADNF-9在改善载脂蛋白E缺陷小鼠的记忆缺乏方面比不上NAP有效〔Bassan等，J.Neurochem.，72：1283-1293(1999)〕，ADNF-9的PBS溶液在＜4℃的温度下储藏后丧失了生物活性〔Brenneman等，J.Pharmacol.Exp.Therap.，285：619-627(1998)〕。因此决定评估NAP作为将来的治疗剂的生物利用率和稳定性。

在躯体的各个器官中测量鼻内给予的〔³H〕-NAP的分布的时间过程。结果(图3A)证明在肠和肝中有高水平的总放射性(以fmol NAP/g组织计算)，最高水平出现在给药后30分钟的肠中。在给药后60分钟大脑(皮层)中的总放射性最高(图3B)。每只动物接受5微升〔³H〕-NAP，浓度为2.5百万dpm(22.75pmol)。如果在这些NAP在250g大鼠中均匀地分布，则认为每克组织有91fmol(300克大鼠则为75.5fmol/克组织)。这些结果表明45fmol/克组织。反相高效液相色谱(RP-HPLC)表明在施用后30分钟该肽在大脑中是完整的(图3C)。在从柱上洗脱下来的808.8fmol/克组织中，98fmol/克组织与完整NAP共迁移，这表明在施用后30分钟，在大脑中至少有12％的物质是完整的。施用后60分钟，在从柱上洗脱下来的1198.9fmol/克组织中，仅有2％与完整的放射性NAP共洗脱(图3D)。

这些结果表明NAP在皮层中的半衰期大约为15分钟。对图3A和3B进行的精密检测表明，血液中的放射性NAP比皮层中的要高，尤其是在给药后3小时，这个时间是肽可能完全被破坏的时间(图3D)。因此，在给予肽后较晚的时间里血液中放射性的增加水平反映了肽断裂和消散。

为了检测肽是否存在于大脑组织而不是在大脑血管内，进行了一个附加的试验。在这个试验中，如上述处理200g的雌大鼠，在给予肽后30分钟(肽仍保持完整的时间，图3C)，解剖大脑，仔细地取出小的可见的血管。结果证明，虽然一些放射性是由小的可见血管产生的，但是大多数的放射性明显地出现在大脑组织中，可见血管的影响不显著(图3E)。此外，离嗅球比离皮层更远的小脑(没有小的可见血管)具有明显较少的放射性肽聚积。但是，大脑皮层和小脑之间的差异并不明显，这表明了快速的肽分布(图3B和3E)。

AF64A处理的动物显示乙酰胆碱转移酶活性减少，受到NAP的保护

对衍生自AF64A处理的动物和假处理的动物(每组3只动物，各进行三组试验)的大脑抽提物进行酶检测，结果揭示在试验终止时乙酰胆碱转移酶活性有非常小的减少(11+2.6％)(图4A)。AF64A动物的NAP处理产生增加的胆碱能活性与对照(假操作的)值难以区别(图4A，100％的乙酰胆碱转移酶活性表明130pmol/mg蛋白质/分钟)。

在4组动物中，3组用AF64A处理，使它们恢复1周，然后用ADNF-9或NAP处理其中的两组(鼻内)。在5个处理日后，使动物恢复2天，然后进行日常的水迷宫测试(如图1和2所示)。这个试验与上述试验(图1和2)之间的差别在于，动物在进行行为测试之前没有接受日常鼻内给予的肽。NAP处理的AF64A动物与对照大鼠并没有明显的差别，但与ADNF-9处理的AF64A大鼠相比，在水迷宫中能更快地找到隐藏的平台(p＜0.022)。

讨论

本研究已证明ADNF神经保护的体内效果。鼻内给予ADNF-9或NAP以防与AF64A处理相关的短期记忆丧失。NAP给药还改善了对照动物的参比记忆。此外，NAP使乙酰胆碱转移酶活性不下降，如先前对载脂蛋白E缺陷小鼠进行的试验所证明〔Bassan等，J.Neurochem.，72：1283-1293(1999)〕。NAP在大脑和体内分布是迅速的。鼻内给药后大脑中的NAP的计算半衰期大约为15分钟。HPLC分析表明NAP在体内被代谢成多个片段，这表明活性代谢物的可能性。

ADNF-9和NAP对胆碱能活性的作用(图4A)以及在行为试验中的结果(图4B)表明了两种肽通过不同的机制起到改善认知功能的可能性，而ADNF-9具有即时的短期效果。此外，经鼻内给予NAP处理的动物与ADNF-9处理的动物相比，在水迷宫测试中具有增加的学习和记忆能力(图1和图2)。类似地，将NAP注射给(不注射ADNF-9)新生的载脂蛋白E缺陷幼犬结果在三周龄的小鼠中阻止了短期记忆缺陷〔Bassan等，J.Neurochem.，72：1283-1293(1999)〕。

这些研究表明了NAP的大范围的神经保护活性。实际上，NAP(在大范围的浓度内)保护成神经细胞瘤细胞生存不因S-(3-氨基-3-羧丙基)-S-丁基硫氧亚氨(buthionine sulfoximine)诱导而下降(70-90％)〔Offen等，Brain Research，854：257-262(2000)〕。S-(3-氨基-3-羧丙基)-S-丁基硫氧亚氨是谷胱甘肽合成的一种选择性抑制剂，它引起神经元细胞模型中还原型谷胱甘肽显著地下降，导致该细胞的存活下降〔Offen等，Brain Research，854：257-262(2000)〕。因此，NAP的神经保护机制通过提高针对氧化应力(一种影响细胞生存的普通机制)的细胞抗性而介导。此外，初步的毒性学研究显示，这种肽没有毒性效果。

总之，NAP已证明的体内效力及其生物利用率和表观稳定性确定了它是一种用于开发针对神经退化疾病的治疗剂的具有吸引力的前导化合物。目前可获得的用于阿尔茨海默氏病的症状治疗的药物直接以胆碱能系统的功能为目标。一个例子是他克林，这是一种乙酰胆碱酯酶的抑制剂〔Van Reekum等，Can.J.Psychiatry42 suppi.，1：35S-50S(1997)〕。但是，生长因子治疗可提供一个较宽范围的神经保护，因此，对神经营养因子的体内作用的研究提供了重要的基本信息，并开辟了药物设计的新前景。实施例II：出生前给予ADNF多肽提供了出生后增强的学习和/或记忆

材料和方法

动物和治疗

将C57-B16J雌性小鼠(Jackson实验室)置于12小时的光下和12小时的暗处，食物和水随时可获得。根据《实验动物的饲养和使用指南》，对这些小鼠实施人道的动物照料。使6周龄雌性小鼠(21-24g)与C57-B16J雄性小鼠共处4小时，使其交配。阴道中插入物的存在即认为是怀孕的第0天。

在怀孕的第8天，给动物腹膜内注射ADNF多肽，或者在怀孕的第8天，在绝食1小时后给动物服用管饲剂量的ADNF多肽。将NAP稀释在50μl DMSO和稀释在过滤的Dulbecco磷酸缓冲盐溶液(DPBS)中。将SAL溶解并稀释在过滤的DPBS中。对照动物用载体(如DPBS)处理。所有的治疗都编号。

在第20天进行传送，在生命的第20天断奶。移去系上所有治疗编号的鉴别标记的耳标的雄性子代。

Morris水迷宫测试

仅使用雄性小鼠进行水迷宫试验。在第35-50天开始测试小鼠，通常在第38天，每天2次(两组试验)，测试7天。

所采用的Morris水迷宫测试是根据《小鼠中空间导航任务的重复获取：空间试验和单侧中间大脑动脉阻塞的影响》改编的〔Klapdor & Van der Staay，Physiology& Behav.，63(5)：903-909(1998)〕。试验由试图从4个设定点寻找隐藏的平台组成。具体而言，在早晨开始测试小鼠，通常在9点到9点半之间。统一的时间对于任何行为研究是重要的。以随机的顺序进行小鼠的测试，以防止研究者的按时间顺序的偏见。迷宫在试验开始前的一天设立起来，以使有足够的时间将迷宫中的水温调节到室温。加入100-150ml非毒性的白面拖油炸鱼虾并混合。在每天开始测试之前，将水搅拌均匀，并加入额外的水，以确保在蒸发的情况下仍维持着高于平台7-10ml的一致的水水平。设立软件措施，以便使伪装最适宜，两组试验中的每一组时间都以60秒计时。可活动的平台放在第1象限。

第1天，使小鼠坐在平台上1分钟，以使它们适应环境，并获得逃离平台所处位置的原始感觉。在这个原始阶段，小鼠跳离平台并在四周游泳以进行探查的行为都是正常的。可允许这种情况短暂发生，但是小鼠在游泳结束后几秒钟内应回到平台上。

使小鼠面对迷宫的外面从中线分离的象限2和3(西)中释放到迷宫中。让它们游泳60秒钟，或者直到它们到达自己的平台。如果它们没能成功地找到平台，人工将它们放回平台上。所有的小鼠在第一次试验后都允许回到平台上呆15秒钟。

然后以第一组相同的方式进行第二组试验(相同的释放位置，相同的平台位置等等)，在让小鼠回到它们的干燥笼子(装备有chix抹布，以吸走多余的水)前也先让它们在平台上呆15秒钟。

在第2-7天，在进行初始试验前仅让小鼠在平台上呆15秒钟。这对于它们调整自己适应水温已经是足够的。从第1天起，它们在此阶段跳离平台的倾向有明显的减少，大多数的小鼠停留在平台上而没有试图离开平台。计算每天的平均逃离等待时间，并绘出7天期间测试给药的曲线图。空间学习和记忆下降的许多小鼠显示出行为上的反常，包括趋触性(紧靠墙壁)和不停地移动。这已经由Minichiello等〔Neuron，24(2)：401-414(1999)〕证明。

采用两组试验的平均值，将其用于统计学分析。使用用于多份分析的Bonferroni校正的ANOVA(总P＜0.007认为是显著的)和用于测定显著差异对的Fisher post hoc进行统计学分析。

统计学

统计学分析包括用于连续变量的ANOVA、用于非参数数据的Mann-WhitneyU、用于范畴变量的Chi平方或者Fisher精确测试，其中p＜0.05被适当地认为是显著的〔Statview 4.5(Abacus Concepts公司，Berkeley，CA)〕。除非另有说明，否则结果以平均值±标准误差表示。

结果

出生前L-NAP+SAL治疗的效果

在怀孕的第8天给怀孕的母亲腹膜内注射L-NAP(NAPVSIPQ，得自ADNF III)(0.2ml；20μg)和L-SAL(SALLRSIPA，得自ADNF I)(0.2ml，20μg)(n＝8)或仅注射载体(n＝50)。

使用如材料和方法部分所述的Morris水迷宫对学习进行评估。在第38天开始进行测试，每天在Morris水迷宫中进行两组测试，共进行7天，一组试验结束之后立即进行另一组试验。记录下找到隐藏平台所需的等待时间。每天以随机的顺序测试所有的动物。将两组试验的平均值用于分析。

如图5所示，这些在出生前用1-NAP+L-SAL处理的小动物，其学习比那些对照同窝仔的小动物要开始得早(P＜0.03)。

口服给予D-NAP+D-SAL的效果

在怀孕的第8天，在怀孕母亲禁食1小时后，给予其管饲剂量(0.2ml)的D-NAP(40μg)和D-SAL(40μg)(n＝27)或仅给予载体(n＝34)。使用如材料和方法部分所述的Morris水迷宫对学习进行评估。在第38天开始进行测试，每天在Morris水迷宫中进行两组测试，共进行7天，一组试验结束之后立即进行另一组试验。记录下找到隐藏平台所需的等待时间。如果动物没能在60秒钟内找到平台，人工将其放到平台上。每天以随机的顺序测试所有的动物。将两种试验的平均值用于分析。如图6所示，在怀孕期间暴露于口服的D-NAP+D-SAL的动物的学习明显快于对照组的动物，它们的学习要比对照组开始得早，而且在学习结束后总的等待时间减少。

口服给予D-SAL的效果

在怀孕的第8天，在怀孕母亲禁食1小时后，给予其管饲剂量(0.2ml)的D-SAL(40μg)(n＝14)或仅给予载体(n＝16)。使用如材料和方法部分所述的Morris水迷宫来对学习进行评估。每天在Morris水迷宫中进行两组测试，共进行7天，一组试验结束之后立即进行另一组试验。记录下找到隐藏平台所需的等待时间。如果动物没能在60秒钟内找到平台，人工将其放到平台上。每天以随机的顺序测试所有的动物。将两种试验的平均值用于分析。如图7所示，暴露于口服的D-SAL的动物似乎显示较短的等待时间的趋向。

口服给予D-NAP的效果

在怀孕的第8天，在怀孕母亲禁食1小时后，给予其管饲剂量(0.2ml)的D-NAP(40μg)(n＝13)或仅给予载体(n＝14)。使用如材料和方法部分所述的Morris水迷宫对学习进行评估。每天在Morris水迷宫中进行两组测试，共进行7天，一组试验结束之后立即进行另一组试验。记录下找到隐藏平台所需的等待时间。如果动物没能在60秒钟内找到平台，人工将其放到平台上。以随机的顺序测试所有的动物。将两种试验的平均值用于分析。如图8所示，暴露于口服的D-NAP的动物似乎显示较短的等待时间的趋向。

口服给予D-SAL(双倍剂量，80g)的效果

在怀孕的第8天，在怀孕母亲禁食1小时后，给予其管饲剂量(0.2ml)的D-SAL(80μg)(n＝19)或仅给予载体(n＝19)。使用如材料和方法部分所述的Morris水迷宫对学习进行评估。每天在Morris水迷宫中进行两组测试，共进行7天，一组试验结束之后立即进行另一组试验。记录下找到隐藏平台所需的等待时间。如果动物没能在60秒钟内找到平台，人工将其放到平台上。以随机的顺序测试所有的动物。将两种试验的平均值用于分析。如图9所示，暴露于双倍剂量的口服的D-SAL的动物，其表现似乎类似于对照动物。

探测试验中给予D-NAP+D-SAL的效果

在怀孕的第8天，怀孕的母亲在禁食1小时后，给予其管饲剂量(0.2ml)的D-NAP(40μg)和D-SAL(40μg)(n＝27)或仅给予载体(n＝34)。对于在是迷宫试验中测试的那些动物，采用探测试验进一步评估小鼠的学习。在探测试验中，改变上述水迷宫测试，即将平台移走。测量动物处于平台之前所处的象限中所花的时间。如图10所示，暴露于D-NAP+D-SAL的动物花费在该象限(之前平台处于其中)中的时间与对照相比明显地要多得多。

本发明提供使用ADNF多肽改善表现(如学习和/或记忆)的方法。虽然已提供了特殊的实施例，但是上述描述是阐述性的而非限制性的。先前所述的实施例中的任何一个或多个特征可以任何方式与本发明的任何其它实施例的一个或多个特征组合。此外，在回顾本说明书后，本领域熟练的技术人员将理解本发明的许多变动。因此，本发明的范围不应由上述描述确定，而应由附带的权利要求以及它们的等效形式的全部范围来确定。

出于所有的目的，本文在相同程度上将所引用的所有出版物和专利文献的全部内容纳入作为参考，正如各单独的出版物或专利文献被单独指出那样。对于本文件中所引用的各种文献，申请人并不认为任何具体的参考文献就是它们的发明的“现有技术”。

Claims (59)

1.一种改善对象的学习和/或记忆的方法，该方法包括在对象出生后向其给予其量足以改善其出生后的学习和/或记忆的活性依赖性神经营养因子(ADNF)多肽，其中，所述ADNF多肽选自：

(a)含有活性核心位点的ADNF I多肽，该位点具有下述氨基酸序列：

Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala(SEQ ID NO：1)；

(b)含有活性核心位点的ADNF III多肽，该位点具有下述氨基酸序列：

Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln(SEQ ID NO：2)；和

(c)(a)部分的ADNF I多肽和(b)部分的ADNF III多肽的混合物。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述ADNF多肽选自全长的ADNFI多肽、全长的ADNF III多肽、以及全长的ADNF I多肽和全长的ADNF III多肽的混合物。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述ADNF多肽是ADNF I多肽。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述ADNF I多肽的活性核心位点包含至少一个D-氨基酸。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述ADNF I多肽的活性核心位点的所有氨基酸都是D-氨基酸。

6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述ADNF I多肽是Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala(SEQ ID NO：1)。

7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述ADNF I多肽选自：

Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala(SEQ ID NO：14)；

Val-Glu-Glu-Gly-Ile-Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala(SEQ ID NO：15)；

Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala(SEQ ID NO：16)；

Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala(SEQ ID NO：17)；

Gly-Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala(SEQ ID NO：18)；

Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala(SEQ ID NO：19)；和

Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala(SEQ ID NO：1)。

8.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述ADNF I多肽在其活性核心位点的N末端和C末端中的至少一端包含约20个以内的氨基酸。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述ADNF多肽是ADNF III多肽。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述ADNF III多肽是Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln(SEQ ID NO：2)。

11.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述ADNF III多肽的活性核心位点包含至少一个D-氨基酸。

12.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述ADNF III多肽的活性核心位点的所有氨基酸都是D-氨基酸。

13.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述ADNF III多肽选自：

Gly-Gly-Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln(SEQ ID NO：20)；

Leu-Gly-Gly-Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln-Gln-Ser(SEQ ID NO：21)；

Leu-Gly-Leu-Gly-Gly-Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln-Gln-Ser(SEQ IDNO：22)；

Ser-Val-Arg-Leu-Gly-Leu-Gly-Gly-Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln-Gln-Ser(SEQ ID NO：23)；和

Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln(SEQ ID NO：2)。

14.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述ADNF III多肽在其活性核心位点的N末端和C末端中的至少一端包含约20个以内的氨基酸。

15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述ADNF多肽是(a)部分的ADNFI多肽和(b)部分的ADNF III多肽的混合物。

16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，ADNF I多肽和ADNF III多肽的任一或两个活性核心位点包含至少一个D-氨基酸。

17.如权利要求15所述的方法，其特征在于，ADNF I多肽和ADNF III多肽的任一或两个活性核心位点的所有氨基酸都是D-氨基酸。

18.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述ADNF I多肽是Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala(SEQ ID NO：1)，ANDF III多肽是Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln(SEQ ID NO：2)。

19.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述ADNF I多肽选自：

Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala(SEQ ID NO：14)；

Val-Glu-Glu-Gly-Ile-Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala(SEQ ID NO：15)；

Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala(SEQ ID NO：16)；

Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala(SEQ ID NO：17)；

Gly-Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala(SEQ ID NO：18)；

Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala(SEQ ID NO：19)；和

Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala(SEQ ID NO：1)；和所述ADNF III多肽选自：

Gly-Gly-Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln(SEQ ID NO：20)；

Leu-Gly-Gly-Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln-Gln-Ser(SEQ ID NO：21)；

Leu-Gly-Leu-Gly-Gly-Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln-Gln-Ser(SEQ IDNO：22)；

Ser-Val-Arg-Leu-Gly-Leu-Gly-Gly-Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln-Gln-Ser(SEQ ID NO：23)；和

Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln(SEQ ID NO：2)。

20.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述ADNF I多肽在其活性核心位点的N末端和C末端中的至少一端包含约20个以内的氨基酸，所述ADNF III多肽在其活性核心位点的N末端和C末端中的至少一端包含约20个以内的氨基酸。

21.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述至少一个ADNF多肽由给予对象的核酸编码。

22.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述对象患有神经病理学方面的疾病。

23.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述对象患有阿尔茨海默氏病。

24.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述对象患有唐氏综合症。

25.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述对象是正常的。

26.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述对象是老人。

27.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法改善短期记忆。

28.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法改善参比记忆。

29.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述ADNF多肽经鼻内或口腔给予。

30.一种改善对象的学习和/或记忆的方法，该方法包括在该对象出生前给予其活性依赖性神经营养因子(ADNF)多肽，给予的该多肽的量足以改善该对象出生后的学习和/或记忆，其中该ADNF多肽是选自：

(a)含有活性核心位点的ADNF I多肽，该位点具有下述氨基酸序列：

Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala(SEQ ID NO：1)；

(b)含有活性核心位点的ADNF III多肽，该位点具有下述氨基酸序列：

Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln(SEQ ID NO：2)；

(c)(a)部分的ADNF I多肽和(b)部分的ADNF III多肽的混合物。

31.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述对象具有正常的智能。

32.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述对象患有精神障碍、精神障碍的家族史、唐氏综合症，或者母亲在怀有该对象时至少为35岁。

33.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述精神障碍不是由对象的母亲在怀孕期间饮酒引起的。

34.如权利要求30所述的方法，其特征在于，大约在神经管发育和/或闭合时给予所述ADNF多肽。

35.如权利要求30所述的方法，其特征在于，在母亲怀孕期间向该母亲腹膜内给予所述ADNF多肽。

36.如权利要求30所述的方法，其特征在于，在母亲怀孕期间口服给予其ADNF多肽。

37.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述ADNF多肽选自全长的ADNF I多肽、全长的ADNF III多肽、全长的ADNF I多肽和全长的ADNF III多肽的混合物。

38.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述ADNF多肽是ADNF I多肽。

39.如权利要求38所述的方法，其特征在于，所述ADNF I多肽的活性核心位点包含至少一个D-氨基酸。

40.如权利要求38所述的方法，其特征在于，所述ADNF I多肽的活性核心位点的所有氨基酸是D-氨基酸。

41.如权利要求38所述的方法，其特征在于，所述ADNF I多肽是Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala(SEQ ID NO：1)。

42.如权利要求41所述的方法，其特征在于，所述ADNF I多肽的所有氨基酸都是D-氨基酸。

43.如权利要求38所述的方法，其特征在于，所述ADNF I多肽选自：

Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala(SEQ ID NO：14)；

Val-Glu-Glu-Gly-Ile-Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala(SEQ ID NO：15)；

Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala(SEQ ID NO：16)；

Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala(SEQ ID NO：17)；

Gly-Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala(SEQ ID NO：18)；

Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala(SEQ ID NO：19)；和

Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala(SEQ ID NO：1)。

44.如权利要求38所述的方法，其特征在于，所述ADNF I多肽在其活性核心位点的N末端和C末端中的至少一端包含约20个以内的氨基酸。

45.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述ADNF多肽是ADNF III多肽。

46.如权利要求45所述的方法，其特征在于，所述ADNF III多肽的活性核心位点包含至少一个D-氨基酸。

47.如权利要求45所述的方法，其特征在于，所述ADNF III多肽的活性核心位点的所有氨基酸都是D-氨基酸。

48.如权利要求45所述的方法，其特征在于，所述ADNF III多肽是Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln(SEQ ID NO：2)。

49.如权利要求48所述的方法，其特征在于，所述ADNF III多肽的所有氨基酸都是D-氨基酸。

50.如权利要求45所述的方法，其特征在于，所述ADNF III多肽选自：

Gly-Gly-Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln(SEQ ID NO：20)；

Leu-Gly-Gly-Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln-Gln-Ser(SEQ ID NO：21)；

Leu-Gly-Leu-Gly-Gly-Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln-Gln-Ser(SEQ IDNO：22)；

Ser-Val-Arg-Leu-Gly-Leu-Gly-Gly-Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln-Gln-Ser(SEQ ID NO：23)；和

Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln(SEQ ID NO：2)。

51.如权利要求45所述的方法，其特征在于，所述ADNF III多肽在其活性核心位点的N末端和C末端中的至少一端包含约20个以内的氨基酸。

52.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述ADNF多肽是(a)部分的ADNF I多肽和(b)部分的ADNF III多肽的混合物。

53.如权利要求52所述的方法，其特征在于，所述ADNF I多肽和ADNF III多肽的任一或两个活性核心位点包含至少一个D-氨基酸。

54.如权利要求52所述的方法，其特征在于，所述ADNF I多肽和ADNF III多肽的任一或两个活性核心位点的所有氨基酸都是D-氨基酸。

55.如权利要求52所述的方法，其特征在于，所述ADNF I多肽是Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala(SEQ ID NO：1)，ANDF III多肽是Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln(SEQ ID NO：2)。

56.如权利要求55所述的方法，其特征在于，所述ADNF I多肽和ADNF III多肽之一或两者包含的所有氨基酸都是D-氨基酸。

57.如权利要求52所述的方法，其特征在于，所述ADNF I多肽选自：

Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala(SEQ ID NO：14)；

Val-Glu-Glu-Gly-Ile-Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala(SEQ ID NO：15)；

Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala(SEQ ID NO：16)；

Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala(SEQ ID NO：17)；

Gly-Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala(SEQ ID NO：18)；

Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala(SEQ ID NO：19)；和

Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala(SEQ ID NO：1)；所述ADNF III多肽选自：

Gly-Gly-Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln(SEQ ID NO：20)；

Leu-Gly-Gly-Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln-Gln-Ser(SEQ ID NO：21)；

Leu-Gly-Leu-Gly-Gly-Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln-Gln-Ser(SEQ IDNO：22)；

Ser-Val-Arg-Leu-Gly-Leu-Gly-Gly-Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln-Gln-Ser(SEQ ID NO：23)；和

Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln(SEQ ID NO：2)。

58.如权利要求52所述的方法，其特征在于，所述ADNF I多肽在其活性核心位点的N末端和C末端中的至少一端包含约20个以内的氨基酸，所述ADNF III多肽在其活性核心位点的N末端和C末端中的至少一端包含约20个以内的氨基酸。

59.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述ADNF至少有一个由给予对象的核酸编码。

Images