EA015716B1 - Применение sdf-1 для лечения и/или профилактики неврологических заболеваний - Google Patents

Применение sdf-1 для лечения и/или профилактики неврологических заболеваний Download PDF

Info

Publication number
EA015716B1
EA015716B1 EA200801244A EA200801244A EA015716B1 EA 015716 B1 EA015716 B1 EA 015716B1 EA 200801244 A EA200801244 A EA 200801244A EA 200801244 A EA200801244 A EA 200801244A EA 015716 B1 EA015716 B1 EA 015716B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
disease
amino acid
use according
nerve
amino acids
Prior art date
Application number
EA200801244A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200801244A1 (ru
Inventor
Урсула Бошерт
Аманда Праудфут
Линда Кади
Пьер Ален Витте
Жером Войцик
Original Assignee
Мерк Сероно С.А.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Мерк Сероно С.А. filed Critical Мерк Сероно С.А.
Publication of EA200801244A1 publication Critical patent/EA200801244A1/ru
Publication of EA015716B1 publication Critical patent/EA015716B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A61K38/215—IFN-beta
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/195—Chemokines, e.g. RANTES
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/20—Hypnotics; Sedatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Anesthesiology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Изобретение относится к применению SDF-1 или агониста активности SDF-1 для лечения и/или профилактики неврологического заболевания.

Description

Настоящее изобретение, главным образом, относится к области неврологических заболеваний, обусловленных нейровоспалением. Более конкретно, настоящее изобретение относится к применению 8ΌΡ-1 для изготовления лекарственного средства для лечения и/или профилактики неврологического заболевания.
Предпосылки изобретения
Неврологические заболевания, обусловленные нейровоспалением.
Нейровоспаление является общим признаком большинства неврологических заболеваний. Нейровоспаление, которое может быть индуцировано нейрональным или олигодендроглиальным нарушением, запускается множеством стимулов или оно может быть следствием травмы, повреждения центрального или периферического нерва или вирусной или бактериальной инфекции. Основными следствиями нейровоспаления являются: (ί) секреция различных воспалительных хемокинов астроцитами, клетками микроглии и (ίί) привлечение дополнительных лейкоцитов, которые далее стимулируют астроциты или микроглию. Полагают, что при хронических нейродегенеративных заболеваниях, таких как рассеянный склероз (М8), болезнь Альцгеймера (АО) или боковой амиотрофический склероз (АЕ8), наличие постоянного нейровоспаления участвует в прогрессировании заболевания. Неврологические заболевания, обусловленные нейровоспалением, также могут называться неврологическими воспалительными заболеваниями.
Хронические нейродегенеративные заболевания.
При хронических нейродегенеративных заболеваниях патология ассоциирована с воспалительным ответом. Последние данные позволяют предположить, что системное воспаление может влиять на местное воспаление в головном мозге при заболевании, что приводит к повышенному синтезу воспалительных цитокинов и других медиаторов в головном мозге, которые, в свою очередь, влияют на поведение (Репу, 2004). Хронические нейродегенеративные заболевания включают в себя, помимо прочих, рассеянный склероз (М8), болезнь Альцгеймера (АО), болезнь Паркинсона (РЭ). болезнь Гентингтона (ΗΌ), боковой амиотрофический склероз (АБ8), множественную системную атрофию (М8А), прионное заболевание и синдром Дауна.
Болезнь Альцгеймера (АО) представляет собой нарушение, вовлекающее нарушение психических функций вследствие изменений в ткани головного мозга. Оно ассоциировано с сокращением объема тканей головного мозга, не вызванным нарушениями кровеносных сосудов, первичной дегенеративной деменцией и диффузной атрофией головного мозга. Болезнь Альцгеймера также называют старческим слабоумием по типу болезни Альцгеймера (8ОАТ). Большое количество данных, полученных за последнее десятилетие, подтвердило вывод, что с патологией при болезни Альцгеймера (АО) ассоциировано нейровоспаление (Тирро ап' Апак, 2005).
Болезнь Паркинсона (РЭ) представляет собой нарушение головного мозга, характеризующееся дрожанием и проблемами с хождением, движениями и координацией. Заболевание обусловлено повреждением части головного мозга, которая контролирует движение мышц. Также его называют рата1у818 адйаик, или дрожательным параличом. Накапливающиеся данные из исследований на животных и у человека позволяют предположить, что нейровоспаление является важным участником потери нейронов при ΡΌ (Сао е! а1., 2003).
Болезнь Гентингтона (ΗΌ) представляет собой наследственное аутосомно-доминантное неврологическое заболевание. Обычно заболевание клинически не выявляется до пятого десятилетия жизни и приводит к психиатрическому нарушению, связанному с непроизвольными движениями и когнитивному отклонению, обусловленному неизбежным прогрессированием до самой смерти, которая наступает, как правило, через 17 лет после начала.
Боковой амиотрофический склероз (АТ8) представляет собой нарушение, вызывающее прогрессирующую потерю нервного контроля произвольных мышц вследствие разрушения нервных клеток в головном и спинном мозге. Боковой амиотрофический склероз, также называемый болезнью Лу Геринга, представляет собой нарушение со снижением контроля мышц и их использованием. Нервы, контролирующие эти мышцы, уменьшаются в размере и исчезают, что приводит к уменьшению мышечной ткани вследствие отсутствия нервной стимуляции. Несмотря на то что основная причина АТ8 остается неизвестной, нейровоспаление при АТ8 может играть ключевую роль (СопыМо е! а1., 2004).
Множественная системная атрофия (М8А) представляет собой спорадическое нейродегенеративное заболевание неизвестной этиологии с началом во взрослом возрасте. Состояние может быть уникальным среди хронических нейродегенеративных заболеваний вследствие основной, если не главной роли, которую играют олигодендроглиальные клетки в патогенетическом процессе. Данные подтверждают роль связанных с воспалением генов в риске М8А (1пГап1е е! а1., 2005). Основное отличие от болезни Паркинсона состоит в том, что пациенты с М8А не отвечают на лечение посредством Ь-допа.
Рассеянный склероз (РС) представляет собой воспалительное демиелинизирующее заболевание центральной нервной системы (ЦНС), которое имеет ремитирующее или прогрессирующее течение. РС является не единственным демиелинизирующим заболеванием. Его аналогом в периферической нервной системе (ПНС) является хроническая воспалительная демиелинизирующая полирадикулоневропатия (СЮР). Кроме того, существуют острые монофазные нарушения, такие как воспалительная демиелини
- 1 015716 зирующая полирадикулоневропатия, называемая синдромом Гийена-Барре (ОВ8), в ПНС и острый диссеминированный энцефаломиелит (ΆΌΕΜ) в ЦНС. Как РС, так и ОВ8 являются гетерогенными синдромами. При РС различные экзогенные влияния совместно с генетическими факторами могут приводить к течению заболевания, которое в итоге соответствует диагностическим критериям. При обоих заболеваниях к первичному демиелинизирующему очагу может добавляться аксональное повреждение и вызывать длительный неврологический дефицит. РС представляет собой аутоиммунное нарушение, при котором лейкоциты иммунной системы атакуют белое вещество центральной нервной системы (ЦНС). Серое вещество также может быть вовлечено. Несмотря на то что точная этиология РС не известна, способствующие ему факторы могут включать генетику, бактериальную и вирусную инфекцию. В своих классических проявлениях (85% от всех случаев) он характеризуется чередующимися фазами обострения/ремиссии, которые соответствуют эпизодам неврологической дисфункции, длящейся несколько недель, за которыми следует значительное или полное восстановление (Νθ5θ\\ΌΗ1ιν. 1999). С течением времени периоды ремиссии укорачиваются. Затем у многих пациентов начитается конечная стадия заболевания, характеризующаяся постепенным снижением неврологической функции с частичным восстановлением или без восстановления. Ее называют вторичным прогрессирующим РС. Небольшая доля (~15% от всех пациентов с РС) страдает постепенным и непрерывным снижением неврологической функции после начала заболевания (первично-прогрессирующий РС).
Также было показано, что нейровоспаление вовлечено в прионное заболевание и синдром Дауна (Е1ке1еиЬоош е! а1., 2002; Нии1ег е! а1., 2004).
Неврологические воспалительные заболевания после инфекции.
Некоторые невропатии, например, такие как острый диссеминированный энцефаломиелит, как правило, возникают после вирусной инфекции или противовирусной вакцинации (или, очень редко, противобактериальной вакцинации), подтверждая иммунологическую этиологию заболевания. Острые воспалительные невропатии после противовирусной вакцинации или синдрома Гийена-Барре сходны с демиелинизирующими нарушениями с одинаковым предполагаемым иммунопатогенезом, однако они поражают только периферические структуры.
Обусловленная НТЬУ миелопатия, медленно прогрессирующее заболевание спинного мозга, обусловленное инфекцией Т-клеточного лимфотропного вируса, характеризуется спастической слабостью в обеих ногах.
Инфекции центральной нервной системы представляют собой крайне тяжелые инфекции; менингит поражает мембраны, окружающие головной и спинной мозг; энцефалит поражает непосредственно головной мозг. Вирусы, которые инфицируют центральную нервную систему (головной и спинной мозг) включают вирусы герпеса, арбовирусы, вирусы коксаки, еейо-вирусы и энтеровирусы. Некоторые из этих инфекций, главным образом, поражают менингеальные оболочки (ткани, покрывающие головной мозг) и приводят к менингиту; другие инфекции в основном поражают головной мозг и приводят к энцефалиту; многие инфекции поражают как менингеальные оболочки, так и головной мозг и приводят к менингоэнцефалиту. Менингит значительно более распространен у детей, чем энцефалит. Вирусы поражают центральную нервную систему двумя способами. Они прямо инфицируют и разрушают клетки в ходе острого заболевания. После выздоровления от инфекции иммунный ответ организма на инфекцию иногда приводит к вторичному повреждению клеток вокруг нервов. Это вторичное повреждение (постинфекционный энцефаломиелит) приводит к симптомам у детей через несколько недель после выздоровления от острого заболевания.
Неврологические заболевания после повреждений.
Повреждение в ЦНС, индуцируемое острыми повреждениями, включая травму, гипоксию и ишемию, может поражать как серое, так и белое вещество. В повреждение ЦНС вовлечено нейровоспаление. Например, лейкоцитарная инфильтрация в ЦНС после травмы или воспаления запускается частично посредством активации хемокина МСР-1 в астроцитах (Раиеика е! а1., 2001).
Травма представляет собой повреждение или дефект нерва. Она может представлять собой травму спинного мозга, которая представляет собой повреждение спинного мозга, поражающее все нервные функции, которые контролируются на уровне повреждения и ниже его, включая мышечный контроль и чувствительность, или травму головного мозга, такую как травма, вызываемая закрытым повреждением головного мозга.
Гипоксия головного мозга представляет собой нехватку кислорода, конкретно, в полушариях головного мозга, и более конкретно, этот термин используют для обозначения нехватки кислорода во всем головном мозге. В зависимости от тяжести гипоксии симптомы могут варьировать от помрачнения сознания до необратимого повреждения головного мозга, комы и смерти.
Инсульт, как правило, является следствием сниженного кровотока (ишемии) в головном мозге. Также его называют церебро-сосудистым заболеванием или повреждением. Он представляет собой группу нарушений головного мозга, вовлекающих снижение функций головного мозга, которое происходит при прекращении кровоснабжения любой части головного мозга. Головной мозг требует приблизительно 20% от кровотока организма. Основное кровоснабжение головного мозга происходит через 2 артерии в шее (сонные артерии), которые затем разветвляются в головном мозге на множество артерий, каждая из
- 2 015716 которых снабжает кровью конкретную область головного мозга. Даже кратковременная остановка кровотока может вызывать снижение функций головной мозга (неврологический дефицит). Симптомы варьируют в зависимости от площади поражения головного мозга и обычно включают такие проблемы, как изменение зрения, изменение речи, снижение подвижности или чувствительности в части тела или изменение уровня сознания. Если кровоток снижается более чем на несколько секунд, клетки головного мозга в этой области разрушаются (подвергаются инфаркту), вызывающему постоянное повреждение этой области головного мозга или даже смерть.
Травматическое повреждение нерва может охватывать как ЦНС, так и ПНС. Травматическое повреждение головного мозга, также называемое просто травмой головы или закрытой травмой головы, относится к повреждению, когда происходит поражение головного мозга вследствие удара по голове снаружи. Наиболее часто оно происходит в ходе автомобильных аварий или аварий на велосипедах, однако также оно может происходить в результате состояния, близкого к утоплению, сердечного приступа, инсульта и инфекций. Этот тип травматического повреждения головного мозга, как правило, происходит вследствие нехватки кислорода или кровоснабжения головного мозга, и, таким образом, он может быть обозначен как аноксическое повреждение. Травма головного мозга или закрытая травма головы происходят при ударе по голове, например, в случае дорожно-транспортного происшествия или падения. Сразу после травмы может происходить период бессознательного состояния, который может длиться минуты, недели или месяцы. Первичное повреждение головного мозга происходит во время повреждения, главным образом в областях воздействия, в частности при наличии перелома черепа. Крупные ушибы могут быть ассоциированы с интрацеребральным кровотечением или они могут сопровождаться разрывами коры. Диффузные аксональные повреждения происходят в результате срезывающего усилия и растягивающего усилия нейрональных отростков, вызываемых вращательными движениями головного мозга в черепе. Могут происходить небольшие геморрагические повреждения или диффузное повреждение аксонов, которые можно выявить только микроскопически. Вторичное повреждение головного мозга происходит в результате осложнений, развивающихся после момента травмы. Они включают внутричерепное кровотечение, травматическое повреждение экстрацеребральных артерий, внутричерепное образование грыжи, гипоксическое повреждение головного мозга или менингит.
Повреждения спинного мозга составляют большую часть случаев поступления людей в лечебные заведения с параплегией и тетраплегией. Свыше 80% случаев происходит в результате дорожнотранспортных происшествий. Клинически выделяют две основные группы повреждений: открытые повреждения и закрытые повреждения. Открытые повреждения вызывают прямую травму спинного мозга и корешков нервов. Перфорирующие повреждения могут вызывать обширное разрушение и кровотечение. Закрытые повреждения составляют большинство повреждений спинного мозга, и, как правило, они ассоциированы с переломом/смещением в позвоночнике, которые обычно выявляют радиологическими способами. Повреждение спинного мозга зависит от выраженности костных повреждений, и в них можно рассматривать две основные стадии: первичные повреждения, которые представляют собой ушибы, рассечения нервного волокна и геморрагический некроз, и вторичные повреждения, которые представляют собой экстрадуральную гематому, инфаркт, инфекцию и отек.
Травма является наиболее распространенной причиной локализованного повреждения одного нерва. Резкая мышечная активность или принудительное чрезмерное растяжение в суставе может приводить к фокальной невропатии, которая может повторяться при небольших травмах (например, сильное сжатие небольших инструментов, чрезмерная вибрация от пневматического молотка). Паралич вследствие сдавления или ущемления обычно поражает поверхностные нервы (локтевой, лучевой, малоберцовый) на костных выступах (например, в процессе крепкого сна или в процессе анестезии у худых или истощенных лиц и часто у алкоголиков) или в узких каналах (например, при туннельном синдроме запястья). Паралич вследствие сдавления также может быть следствием опухолей, гиперостоза кости, повязок, костылей или длительных стесненных поз (например, при садоводстве). Травматические повреждения также могут происходить в процессе хирургических операций.
Периферическая невропатия.
Периферическая невропатия представляет собой синдром с потерей чувствительности, мышечной слабостью и атрофией, сниженным глубоким сухожильным рефлексом и вазомоторными симптомами, отдельно или в любом сочетании. Периферическая невропатия ассоциирована с аксональной дегенерацией, процессом, также называемым уоллеровским перерождением. В уоллеровском перерождении участвует нейровоспаление (8ΐο11 е! а1., 2002).
Заболевание может поражать один нерв (мононевропатия), два или более нервов в отдельных областях (множественная мононевропатия) или множество нервов одновременно (полиневропатия). Могут поражаться, главным образом, аксон (например, при сахарном диабете, болезни Лайма, уремии или посредством токсических агентов), или миелиновая оболочка, или шванновская клетка (например, при острой или хронической воспалительной полиневропатии, лейкодистрофиях или синдроме Гийена-Барре). Повреждение немиелинизированных и миелинизированных волокон приводит, главным образом, к снижению температурной и болевой чувствительности; повреждение крупных миелинизированных волокон приводит к двигательным или проприоцептивным дефектам. Некоторые невропатии (например, вследст
- 3 015716 вие вызванной свинцом токсичности, применения дапзона, болезни Лайма (вызываемой укусом клеща), порфирии или синдрома Гийена-Барре) в основном поражают двигательные волокна; другие невропатии (например, вследствие ганглионита заднего корешка при злокачественной опухоли, лепре, СПИД, сахарном диабете или хронической интоксикации пиридоксином) в основном поражают ганглии задних корешков, вызывая сенсорные симптомы. Иногда также вовлекаются черепные нервы (например, при синдроме Гийена-Барре, болезни Лайма, сахарном диабете и дифтерии). Идентификация механизмов помогает определить причину.
Множественная мононевропатия обычно является вторичной при связанных с коллагеном сосудистых нарушениях (например, узелковом полиартериите, 8ЬЕ, синдроме Шегрена, ЯЛ), саркоидозе, метаболических заболеваниях (например, диабете, амилоидозе) или инфекционных заболеваниях (например, болезни Лайма, ВИЧ-инфекции). Микроорганизмы могут вызывать множественную мононевропатию прямой инвазией в нерв (например, при лепре).
Полиневропатия вследствие острых лихорадочных заболеваний может быть следствием токсина (например, при дифтерии) или аутоиммунной реакции (например, при синдроме Гийена-Барре); полиневропатия, которая иногда следует после иммунизации, также, вероятно, является аутоиммунной.
Токсические агенты, как правило, вызывают полиневропатию, однако иногда они вызывают мононевропатию. Они включают эметин, гексобарбитал, барбитал, хлорбутанол, сульфонамиды, фенитоин, нитрофурантоин, алкалоиды барвинка, тяжелые металлы, монооксид углерода, триортокрезила фосфат, ортодинитрофенол, многие растворители, другие промышленные яды и определенные лекарственные средства против СПИД (например, зальцитабин, диданозин).
Индуцируемая химиотерапией невропатия представляет собой значительный и тяжелый побочный эффект нескольких часто применяемых химиотерапевтических лекарственных средств, включая алкалоиды барвинка (винбластин, винкристин и виндезин), содержащие платину лекарственные средства (цисплатин) и таксаны (паклитаксел). Индукция периферической невропатии является частым фактором ограничения терапии химиотерапевтическими лекарственными средствами.
К полиневропатии могут приводить недостаточность питательных веществ и метаболические нарушения. Часто причиной является дефицит витаминов В (например, при алкоголизме, болезни берибери, пернициозной анемии, индуцируемом изониазидом дефиците пиридоксина, синдромах мальабсорбции и неукротимой рвоте беременных). Также полиневропатия встречается при гипотиреозе, порфирии, саркоидозе, амилоидозе и уремии. Сахарный диабет может вызывать сенсомоторную дистальную полиневропатию (наиболее часто), множественную мононевропатию и фокальную мононевропатию (например, глазодвигательного или отводящего черепно-мозговых нервов).
Полиневропатия вследствие метаболических нарушений (например, сахарного диабета) или почечной недостаточности развивается медленно, часто в течение месяцев или лет. Часто она начинается с чувствительных нарушений в нижних конечностях, которые часто являются более тяжелыми дистально, чем проксимально. Часто преобладают периферическое покалывание, онемение, жгучая боль или дефицит проприорецепции в суставе и вибрационной чувствительности. Боль часто усиливается ночью, и она может отягощаться при прикосновении к пораженной области или при изменениях температуры. В тяжелых случаях имеются объективные признаки потери чувствительности, как правило, с распределением по типу чулок и перчаток. Ахиллов и другие глубокие сухожильные рефлексы снижаются или отсутствуют. Когда потеря чувствительности является выраженной, могут развиваться безболезненные язвы на пальцах или суставы Шарко. Чувствительный или проприоцептивный дефицит может приводить к нарушению походки. Двигательное вовлечение приводит к слабости дистальных мышц и атрофии. Дополнительно или селективно может вовлекаться автономная нервная система, что приводит к ночной диарее, недержанию мочи или кала, импотенции или постуральной гипотензии. Вазодвигательные симптомы варьируют. Кожа может быть более бледной и более сухой, чем в норме, иногда с темноватой нарушенной окраской кожи; потение может быть избыточным. Трофические изменения (гладкая и блестящая кожа, изъязвленные или образующие борозды ногти, остеопороз) являются частыми при тяжелых длительных случаях.
Алиментарная полиневропатия является частой среди алкоголиков и у лиц с недостаточным питанием. Первичная аксонопатия может приводить к вторичной демиелинизации и разрушению аксонов в наиболее длинных и наиболее крупных нервах. Остается неясным, является ли ее причиной дефицит тиамина или дефицит другого витамина (например, пиридоксина, пантотеновой кислоты, фолиевой кислоты). Невропатия вследствие дефицита пиридоксина обычно происходит только у лиц, принимающих изониазид от туберкулеза; у детей, дефицитных по пиридоксину или зависимых от пиридоксина, могут быть судороги. Истощение и симметричная слабость в дистальных конечностях обычно развиваются без явных симптомов, однако они могут быстро прогрессировать, иногда сопровождаясь потерей чувствительности, парестезиями и болью. Боль, спазмы, похолодание, жжение и онемение в икроножных мышцах и ступнях могут усиливаться при прикосновении. Когда этиология неясна, может быть назначено множество витаминов, однако они не приводят к улучшениям.
- 4 015716
Наследственные невропатии классифицируют как сенсомоторные невропатии или сенсорные невропатии. Болезнь Шарко-Мари-Тута является наиболее распространенной наследственной сенсомоторной невропатией. Менее распространенные сенсомоторные невропатии начинаются при рождении и приводят к более значительной нетрудоспособности. При сенсорных невропатиях, которые являются редкими, снижения дистальной болевой и температурной чувствительности являются более выраженными, чем потеря вибрационной чувствительности и чувствительности положения. Основной проблемой является повреждение ног вследствие отсутствия болевой чувствительности, с частыми инфекциями и остеомиелитом. Наследственные невропатии также включают гипертрофическую интерстициальную невропатию и болезнь Дежерина-Сотта.
Также полиневропатию может вызывать злокачественная опухоль посредством моноклональной гаммапатии (при множественной миеломе, лимфоме), амилоидной инвазии или дефицитах питательных веществ или в виде паранеопластического синдрома.
Несмотря на различную этиологию, такую как инфекционные патогены или аутоиммунные атаки, все неврологические воспалительные заболевания вызывают снижение неврологической функции и могут приводить к параличу и смерти. Несмотря на то что доступно несколько лекарственных средств, снижающих воспалительные атаки при некоторых воспалительных заболеваниях, существует необходимость в разработке новых лекарственных средств, которые могут приводить к восстановлению неврологической функции.
8ΌΡ-1.
Хемокины (хемотаксические цитокины) составляют суперсемейство небольших (8-10 кДа) цитокинов, которые активируют семикратно трансмембранные сопряженные с О-белком рецепторы, которые вовлечены как в направленную миграцию через базальную мембрану, так и в воспалительные ответы, действуя, главным образом, в качестве хемоаттрактантов и активаторов лейкоцитов.
Фактор стромальных клеток-ία, 8ΌΡ-1α и его 2 изоформы (β, γ) представляют собой небольшие хемотаксические цитокины, которые относятся к семейству интеркринов, члены которого активируют лейкоциты и часто индуцируются провоспалительными стимулами, такими как липополисахарид, ΤΝΡ или ББ-1. Интеркрины характеризуются наличием 4 консервативных цистеинов, которые образуют 2 дисульфидные связи. Их можно подразделить на 2 подсемейства. В СС-подсемействе, которое включает бета-хемокин, остатки цистеина являются соседними между собой. В СХС-подсемействе, которое включает альфа-хемокин, они разделены находящейся между ними аминокислотой. Белки 8ΌΡ-1 относятся к последней группе. 8ΌΡ-1 представляет собой природный лиганд рецептора для хемокинов СХСК.4 (БЕ8ТВ/фузин). Изоформы α, β и γ являются следствием альтернативного сплайсинга общего гена. αформа образована из экзонов 1-3, в то время как β-форма содержит дополнительную последовательность из экзона 4. Первые три экзона 8ΌΕ-1γ являются идентичными экзонам 8ΌΕ-1α и 8ΌΕ-1β. Четвертый экзон 8ΌΕ-1γ расположен на 3200 п.н. ниже третьего экзона на локусе 8ΌΕ-1 и находится между третьим экзоном и четвертым экзоном 8ΌΕ-1β.
Недавно было описано три новые изоформы 8ΌΕ-1: 8ΌΕ-15, 8ΌΕ-1ε и 8ΌΕ-1φ (Уи е! а1., 2006). Изоформа 8ΌΕ-15 является альтернативно сплайсированной по последнему кодону открытой рамки считывания 8ΌΕ-1α, что приводит к интрону из 731 пар оснований с терминальным экзоном 8ΌΕ-1α, расщепленным на две части. Первые три экзона 8ΌΕ-1ε и 8ΌΕ-1φ на 100% идентичны первым трем экзонам изоформ 8ΌΕ-1β и 8ΌΕ-1γ.
Ген 8ΌΕ-1 экспрессируется повсеместно, за исключением клеток крови, он действует на лимфоциты и моноциты, но не на нейтрофилы ίη νίίτο и является очень мощным хемоаттрактантом для мононуклеарных клеток ίη νίνο. Ιη νίίτο и ίη νίνο, 8ΌΕ также действует в качестве хемоаттрактанта для гемопоэтических клеток-предшественников человека, экспрессирующих СО34.
8ΌΕ-1 и его рецептор СХСК.4 выполняют важные функции в гемопоэтической системе и нервной системе, поскольку удаление либо лиганда, либо рецептора является летальным у эмбриона вследствие аномального развития ЦНС (Ма е! а1., 1998; Ζου е! а1., 1998).
8ΌΕ-1α через взаимодействия с его рецептором СХСК.4 может прямо индуцировать гибель клетки посредством апоптоза в нейрональной клеточной линии человека 11ΝΤ. которая сходна с незрелыми постмитотическими холинергическими нейронами и обладает множеством нейрональных признаков (Не88е1де88ег е! а1., 1998).
Роль 8ΌΕ-1 в развитии и созревании центральной нервной системы рассмотрена Бахапш е! а1. (Бахапш е! а1., 2003).
Хемокины, несомненно, вовлечены в нейровоспаление в ЦНС, однако их активность сводится к их роли в качестве биологически важных пептидов непосредственно в нейроэпителиальных клетках (включая нейроны, астроциты и олигодендроциты). В частности, хемокины влияют на пролиферацию предшественников олигодендроцитов (ОБР), как проиллюстрировано посредством ОКО-а/СХСШ (Βοϋίηκοη е! а1., 1998), образование лаброцитов в мозжечке, в случае 8ΌΕ-1α (ΖΙπ.ι е! а1., 2002), и состояние активации микроглии, как проиллюстрировано посредством фракталкин/СХ3СБ1 (Ζιρονίο е! а1., 2000), чтобы назвать некоторые из них. Таким образом, в случае как иммунной системы, так и нервной системы хемоки
- 5 015716 ны могут выполнять широкий диапазон сходных видов активности, включая регуляцию пролиферации, миграции, активации и дифференцировки.
Множество хемокинов и рецепторов хемокинов экспрессируется в ЦНС либо конститутивно, либо посредством индукции медиаторами воспаления. Они вовлечены во множество нейропатологических процессов, включая рассеянный склероз (РС) (Ва)е11о с1 а1., 2001; Зогепкеп е1 а1., 2002).
Было показано, что экспрессия 3ΌΡ-1 в эндотелиальных клетках головного мозга способствует привлечению иммунных клеток в ишемизированную ЦНС (З1итт е1 а1., 2002), подтверждая неблагоприятную роль 3ΌΡ-1 при нейровоспалении. В отношении СПИД-деменции было описано, что 8ΌΡ-1 индуцирует нейротоксичность посредством стимуляции продукции ΤΝΡ-α активированной микроглией и высвобождение глутамата астроцитами в модели индуцированного др120 нейровоспаления ίη νίίτο (Ве/ζί е1 а1., 2001; Зогепкеп е1 а1., 2002). В недавней публикации описана экспрессия 8ΌΡ-1α в астроцитах в очагах повреждения при РС (ЛтЬго81ш е1 а1., 2005).
Индукция экспериментального аллергического энцефаломиелита (ЕАЕ) у крыс сопровождалась повышением уровней различных рецепторов для хемокинов, включая СХСК4 (Дапд е1 а1., 1998).
В \УО 00/09152 описано, что антагонисты СХСК.4 пригодны для лечения аутоиммунного заболевания, лечения рассеянного склероза, лечения злокачественной опухоли и ингибирования ангиогенеза.
В \УО 99/50461 описаны способы лечения нарушений, в которые вовлечена аберрантная пролиферация или недостаточная клеточная пролиферация посредством введения соединений, которые стимулируют или ингибируют активность СХСК4. Ингибиторы функции СХСК4 были заявлены для лечения злокачественных опухолей и применение агонистов рецепторов было заявлено для лечения нарушений, в которых клеточная пролиферация является недостаточной или желательной. Нарушения, в которых клеточная пролиферация является недостаточной, включают демиелинизирующие повреждения нервной системы, при которых часть нервной системы разрушается или повреждается демиелинизирующим заболеванием, включая, например, рассеянный склероз и очаги повреждения в периферической нервной системе.
Также было предложено терапевтическое применение антагонистов СХСК4/8ЭР-1 при неврологических заболеваниях. В ЕР 657468 В1 предложено применение 8ΌΡ-1 для лечения заболеваний, связанных с недостаточным ростом или аномальной пролиферацией кроветворных клеток, нейрональным усилением или подавлением, профилактикой или лечением нейронального повреждения.
В \УО 03/062273 описан ингибитор каскада передачи сигнала 8ΌΡ-1 для лечения воспаления. Описанные способы терапевтического применения включают воспаление, обусловленное аутоиммунными заболеваниями, или состояниями, или нарушениями, где может быть благоприятным подавление иммунной системы и/или воспаления либо в ЦНС, либо в любом другом органе, хроническую невропатию или синдром Гийена-Барре.
С1е1сйтапп е1 а1. описали небольшое временное повышение экспрессии мРНК 8ΌΡ-1β после повреждения периферического нерва. Они заключили, что их открытие впервые показывает дифференциальный характер экспрессии изоформы 8ΌΡ-1 в различных физиологических условиях, таких как развитие и повреждение нервной системы (С1еюйтапп е1 а1., 2000).
8ΌΡ-1 может взаимодействовать с гликозаминогликанами (ОАО), высоковариабельными, разветвленными группами сахаров, добавляемыми посттрансляционно к некоторым белкам, в общем называемым протеогликанами (РС). Такие белки находятся на клеточной мембране, во внеклеточном матриксе и в кровотоке, где также могут быть представлены изолированные САС. РС, или изолированные САС, могут образовывать комплекс с растворимыми молекулами, вероятно, для защиты этой молекулы от протеолиза во внеклеточном окружении. Также было предположено, что САС могут способствовать правильному представлению молекул клеточной передачи сигнала специфичному для них рецептору и, в итоге, также к модулированию активации клетки-мишени.
В случае хемокинов концентрирование в фиксированные градиенты в области воспаления и, таким образом, взаимодействие с клеточными рецепторами и их состояние активации, по-видимому, модулируются различными формами САС (НоодецегГ е1 а1., 1997). Таким образом, было предположено, что модулирование таких взаимодействий может представлять собой терапевтический подход при воспалительном заболевании (Зс11\\щу ап' ХУеПк, 1999).
Модифицированный 8ΌΡ-1α, 8ΌΡ-1 3/6, был получен комбинированной заменой основного кластера остатков Ьу824, Н1к25 и Ьук27 на Зег (Атага е1 а1., 1999). Эта мутантная форма неспособна связывать гепарансульфат, однако в ней сохранена способность связывать и активировать СХСК4. В другом исследовании изучали эффект единичных мутаций в том же домене и охарактеризованном комплексе 3ΌΡ-1α и гепарина (За'1г е1 а1., 2001). За'1г е1 а1. также сделали предположение о вовлечении остатков Агд41 и Ьук43 в связывание гликозаминогликана.
- 6 015716
Сущность изобретения
Целью настоящего изобретения является предоставление новых способов лечения и/или профилактики неврологического заболевания.
В рамках настоящего изобретения было обнаружено, что введение 8ΌΡ-1α, Ме1-8ЭР-1а или варианта 8ΌΡ-1α оказывает благоприятный эффект в моделях периферических неврологических заболеваний на животных ίη νίνο. Также было показано, что 8ΌΡ-1α и его вариант ингибирует ΤΝΡ-α и 1Ь-6 в модели индуцируемого ЬР8 высвобождения ΤΝΡ-α на животных, которая представляет собой модель воспаления.
Экспериментальные данные, представленные в настоящем описании, таким образом, предусматривают новую возможность лечения неврологических заболеваний, в частности заболеваний, связанных с функцией нейрональных и глиальных клеток и нейровоспалением.
Таким образом, настоящее изобретение относится к применению 8ΌΡ-1 или агониста активности 8ΌΡ-1 для изготовления лекарственного средства для лечения и/или профилактики неврологического заболевания.
В соответствии с настоящим изобретением 8ΌΡ-1 также можно применять для лечения и/или профилактики неврологических заболеваний в сочетании с интерфероном, или остеопонтином, или кластерином. Применение молекул нуклеиновых кислот, экспрессирующих векторов, содержащих 8ΌΡ-1, и клеток, экспрессирующих 8ΌΡ-1, для лечения и/или профилактики неврологического заболевания также относится к настоящему изобретению.
Кроме того, это изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим 8ΌΡ-1 и интерферон, или остеопонтин, или кластерин необязательно совместно с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми эксципиентами.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 представлено содержание ΤΝΡ-α и 1Ь-6 (в пг/мл) в смешанных кортикальных культурах, преинкубированных на 14 сутки культивирования клеток с 0,001, 0,1 и 10 нг/мл 8ΌΡ-1α (фиг. 1А) или варианта 8ΌΡ-1α (фиг. 1В) в течение 3 ч при 37°С, с последующим добавлением 5 нг/мл ЬР8 на 48 ч. Супернатанты собирали на 16 сутки и уровни ΤΝΡ-α и 1Ь-6 определяли посредством специфичных ЕЫ8А. В качестве положительных контролей культуры обрабатывали 25 пМ дексаметазоном (Эсха). 10 нг/мл 1Ь-10 или не обрабатывали. В качестве отрицательного контроля культуры обрабатывали только ЬР8.
На фиг. 2 представлено среднее общее количество клеток х106 ± в.е., привлеченных в брюшную полость через 4 ч после внутрибрюшинной инъекции 200 мкл №1С1 (0,9%, без ЬР8; исходный уровень) или 4 мкг 8ΌΡ-1α или варианта 8ΌΡ-1α, разбавленных в 200 мкл №1С1 (0,9%, без ЬР8).
На фиг. 3 представлено содержание 8ΌΡ-1α (пг/мг общего белка) в экстрактах спинного мозга, извлеченного из мышей, пораженных ЕАЕ в хронической фазе, по сравнению с не подвергавшимися воздействию мышами (контроль).
На фиг. 4 представлены электрофизиологические записи от мышей после повреждения седалищного нерва сдавлением, которым вводили носитель (физиологический раствор/0,02% В8А), 3, 10, 30 или 100 мкг/кг 8ΌΡ-1α подкожно и 30 мкг/кг соединения эталонного (положительного) контроля (1Ь-6). Исходный уровень: значения, зарегистрированные на противоположной стороне животных, которым вводили носитель. Регистрацию проводили на 7, 15 и 22 сутки после повреждения (άρΐ).
На фиг. 4А представлена амплитуда (в мВ) смешанного потенциала мышечного действия.
На фиг. 4В представлена латентность (в мс) смешанного потенциала мышечного действия.
На фиг. 5 представлены электрофизиологические записи от мышей после повреждения седалищного нерва сдавлением, которым вводили носитель (физиологический раствор/0,02% В8А) или 30 мкг/кг варианта 8ΌΡ-1α подкожно. Исходный уровень: значения, зарегистрированные на противоположной стороне животных, которым вводили носитель. Регистрацию проводили на 7 и 22 сутки после повреждения (άρΐ).
На фиг. 5А представлена амплитуда (в мВ) смешанного потенциала мышечного действия.
На фиг. 5В представлена латентность (в мс) смешанного потенциала мышечного действия.
На фиг. 5С представлена длительность (в мс) смешанного потенциала мышечного действия.
На фиг. 6 представлены электрофизиологические записи от мышей после повреждения седалищного нерва сдавлением, которым вводили носитель (физиологический раствор/0,02% В8А) или 100, 30, 10 мкг/кг Ме1-8ИР-1а подкожно. Исходный уровень: значения, зарегистрированные на противоположной стороне животных, которым вводили носитель. Регистрацию проводили на 7 и 14 сутки после повреждения (άρΐ).
На фиг. 6А представлена латентность (в мс) смешанного потенциала мышечного действия.
На фиг. 7 представлены результаты введения 100, 30, 10 мкг/кг 8ΌΡ-1α подкожно в модели диабетической невропатии со стрептозотоцином (8ΤΖ). Молекула положительного контроля представляет собой 1Ь-6 в количестве 10 мкг/кг подкожно.
На фиг. 7А представлены показатели массы тела начиная с 11 до 40 суток.
- 7 015716
На фиг. 7В представлены уровни гликемии на 7 сутки после 8ΤΖ.
На фиг. 7С представлена латентность смешанного потенциала мышечного действия, определенная на 24 и 40 сутки после 8ΤΖ.
На фиг. 7Ό представлен эффект 8ΌΡ-1α на скорость проведения по чувствительному нерву.
На фиг. 7Е представлена относительная толщина миелина на 40 сутки после 8ΤΖ с введением 8ΌΡ-1α и без него, выраженная в качестве ^-соотношения.
На фиг. 7Р представлено количество подвергшихся дегенерации волокон в седалищном нерве на 40 сутки после 8ΤΖ.
На фиг. 7С представлена плотность интраэпидермальных нервных волокон на 40 сутки после 8ΤΖ.
На фиг. 8 представлены результаты введения 100, 30, 10 мкг/кг 8ΌΡ-1α подкожно на механические и термические данные аллодинии в модели диабетической невропатии со стрептозотоцином (8ΤΖ).
На фиг. 8А представлено пороговое давление, измеренное в тесте с нитью Уоп Ргеу на 20 сутки после 8ΤΖ
На фиг. 8В представлены показатели латентности в анализе с нагретым до 52°С планшетом на 40 сутки после 8ΤΖ.
На фиг. 9 представлен оцененный показатель ложных результатов в коллекции первичнопрогрессирующего РС у итальянцев в зависимости от количества положительных маркеров В для В<100.
На фиг. 10 представлен 8ΝΡ_Α-2185631 в гене 8ΌΡ-1.
На фиг. 11 представлены предсказанные аминокислотные последовательности вариантов по сплайсингу 8ΌΡ-1 человека.
На фиг. 12 представлено, что 8ΝΡ_Α-2185631 находится в гене 8ΌΡ-1, в последнем интроне 8ΌΡ-1ε и 8ΌΡ-1φ.
Подробное описание изобретения
В рамках настоящего изобретения было выявлено, что введение 8ΌΡ-1 оказывает благоприятный эффект ίη νίνο в модели периферических неврологических заболеваний на животных. В модели, индуцированной повреждением посредством сдавления седалищного нерва невропатии у мышей, введение 8ΌΡ-1α, Μπΐ-8ΌΡ-1α или варианта 8ΌΡ-1α оказывало положительное влияние на все физиологические параметры, связанные с регенерацией нервов, целостностью и жизнеспособностью.
Было показано, что 8ΌΡ-1α и вариант 8ΌΡ-1α ингибируют ΤΝΡ-α и 1Ь-6 в модели индуцируемого ЬР8 высвобождения ΤΝΡ-α на животных, которая представляет собой типичную модель нейровоспаления.
В настоящем изобретении показан защитный эффект 8ΌΡ-1α при диабетической невропатии и невропатической боли.
Кроме того, была выявлена генетическая ассоциация между геном 8ΌΡ-1 и первичнопрогрессирующим РС.
Таким образом, экспериментальные данные, представленные в настоящем описании, обеспечивают новую возможность лечения неврологических заболеваний, в частности заболеваний, связанных с функцией нейрональных и глиальных клеток и нейровоспалением.
Таким образом, это изобретение относится к применению 8ΌΡ-1 или агониста активности 8ΌΡ-1 для изготовления лекарственного средства для лечения и/или профилактики неврологического заболевания.
Как используют в настоящем документе, термин 8ΌΡ-1 относится к полноразмерному зрелому 8ΌΡ-1α человека или его фрагменту, обладающему активностью 8ΌΡ-1, например, такой как его связывание с рецептором СХСВ4. Аминокислотная последовательность 8ΌΡ-1α человека приведена в настоящем описании в качестве 8ЕО ΙΌ N0:1 в прилагаемом списке последовательностей. Как используют в настоящем документе, термин 8ΌΡ-1 далее относится к любому 8ΌΡ-1, источником которого являются животные, такому как мышиный, бычий или крысиный 8ΌΡ-1, при условии наличия идентичности, достаточной для сохранения активности 8ΌΡ-1.
Как используют в настоящем документе, термин 8ΌΡ-1 далее относится к биологически активным мутеинам и фрагментам, таким как встречающиеся в природе изоформы 8ΌΡ-1. Описано шесть альтернативно сплайсированных вариантов транскриптов гена, кодирующего различные изоформы 8ΌΡ-1 (изоформы 8ΌΡ-1α, β, γ, δ, ε и φ). Последовательности 8ΌΡ-1α, 8ΌΡ-1β, 8ΌΡ-1γ, 8ΌΡ-1δ, 8ΌΡ-1ε и 8ΌΡ-1φ человека описаны в настоящем документе в качестве 8ЕО ΙΌ N0:1, 8Е0 ΙΌ N0:2, 8Е0 ΙΌ N0:3, 8Е0 ΙΌ N0:14, 8Е0 ΙΌ N0:15 и 8Е0 ΙΌ N0:16 соответственно прилагаемого списка последовательностей.
Как используют в настоящем документе, термин 8ΌΡ-1 далее включает изоформы, мутеины, слитые белки, функциональные производные, активные фракции, фрагменты или их соли. Эти изоформы, мутеины, слитые белки или функциональные производные, активные фракции или фрагменты сохраняют биологическую активность 8ΌΡ-1. Предпочтительно они обладают биологической активностью, которая является улучшенной по сравнению с 8ΌΡ-1 дикого типа.
- 8 015716
Термин 8ΌΕ-1, в частности, включает изоформу зрелого 8ΌΕ-1α человека, определяемого 8ЕО ΙΌ N0:1, зрелого 8ΌΕ-1β человека, определяемого 8Е0 ΙΌ N0:2, зрелого 8ΌΕ-1γ человека, определяемого 8Е0 ΙΌ N0:3, зрелого 8ΌΕ-15 человека, определяемого 8Е0 ΙΌ N0:14, зрелого 8ΌΕ-1ε человека, определяемого 8Е0 ΙΌ N0:15, и зрелого 8ΌΕ-1φ человека, определяемого 8Е0 ΙΌ N0:16; изоформу зрелого 8ΌΕ-1α человека, имеющего дополнительный ^концевой метионин и определяемого 8Е0 ΙΌ N0:7; укороченные формы 8ΌΕ-1α, такие как форма, соответствующая аминокислотным остаткам 4-68 зрелого 8ΌΕ-1α человека и определяемая 8Е0 ΙΌ N0:8, форма, соответствующая аминокислотным остаткам 3-68 зрелого 8ΌΕ-1α человека и определяемая 8Е0 ΙΌ N0:9, и форма, соответствующая аминокислотным остаткам 3-68 зрелого 8ΌΕ-1α человека, имеющая дополнительный ^концевой метионин и определяемая 8Е0 ΙΌ N0:10.
Также термин 8ΌΕ-1 охватывает слитые белки, содержащие полипептид 8ΌΕ-1, как определено выше, функционально связанный с гетерологичным доменом, например одной или несколькими аминокислотными последовательностями, которые можно выбирать среди следующих: внеклеточный домен мембрано-связанного белка, константные участки иммуноглобулинов (Ее-участок), домены мультимеризации, сигналы на экспорт и маркерные последовательности (такие как последовательности, упрощающие аффинную очистку: НА-маркер, гистидиновый маркер, О8Т, ЕЬААО-пептиды или МВР). Предпочтительными являются слитые с Ес белки 8ΌΡ-1α, определяемые 8Е0 ΙΌ N0:13.
Как используют в настоящем документе, термин вариант 8ΌΕ-1α относится к мутантной форме 8ΌΕ-1, имеющей сниженную активность в отношении связывания ОАО. Выражение сниженная активность в отношении связывания ОАО или дефектный по связыванию ОАО означает, что мутантные СС-хемокины обладают сниженной способностью связываться с ОАО, т.е. сниженной процентной долей каждой из этих мутантных форм, связывающихся с ОАО (таким как гепаринсульфат) относительно соответствующей молекулы дикого типа, как определяют с помощью анализов в цитированных ниже более ранних описаниях таких мутантных форм. В частности, такая мутантная форма представляет собой форму, которая уже описана ранее, с заменами Ьу824 Ηί§25 и Ьу827 на 8ет (Атага с1 а1. 1. ΒίοΙ. Сйет. 1999 Аид 20; 274 (34):23916-25) или на А1а (8Е0 ΙΌ N0:4). Другие дефектные по связыванию ОАО мутантные формы можно получать комбинированной заменой в основном кластере из остатков Ьу824, Ηί§25 и Ьу827 и заменой любых других остатков, вовлеченных в связывание гликозаминогликана, например Агд41 и Ьу843 на 8ет и/или А1а. Возможные сочетания могут представлять собой, например, Ьу824 Ьу827, Ьу824 Ηί§25, Ηί§25 1x820 Ьу824 Агд 41, Ηί§25 Агд41, Ьу827 Агд41, Ьу824 Ьу843, Ηί§25 Ьу843, Ьу827 Ьу843 и Агд41 Ьу843.
Термин вариант 8ΌΕ-1α, в частности, охватывает мутантную форму 8ΌΕ-1α, имеющую сниженную активность связывания ОАО и определяемую 8Е0 ΙΌ N0:4 (тройная мутантная форма 8ΌΕ-1α, имеющая Ьу824А1а, Ηί525Λ1η. Ьу827А1а); мутантную форму 8ΌΕ-1α, имеющую дополнительный начальный остаток метионина и имеющую тройную мутацию Ьу825А1а, Ьу528А1а, определяемую
8Е0 ΙΌ N0:11; и мутантную форму 8ΌΕ-1α со сниженной активностью в отношении связывания ОАО, имеющую одну мутацию Ьу827Су8 и определяемую 8Е0 ΙΌ N0:12. Варианты 8ΌΕ-1α, как определено в настоящем документе, в частности вариант 8ΌΕ-1α, определяемый 8Е0 ΙΌ N0:12, могут быть модифицированы посредством РЕО (полиэтиленгликоля), с помощью процесса, известного как пегилирование. Пегилирование можно проводить посредством любой из реакций пегилирования, известных в данной области (см., например, ЕР 0154316).
8ΌΕ-1 и варианты 8ΌΕ-1α, которые определены в настоящем документе и которые имеют делецию С-концевой аминокислоты, также относятся к этому изобретению.
Особенно предпочтительные формы 8ΌΕ-1, имеющие делецию С-концевой аминокислоты, представляют собой укороченные формы 8ΌΕ-1α, такие как форма, соответствующая аминокислотным остаткам 3-67 зрелого 8ΌΕ-1α человека и определяемая 8Е0 ΙΌ N0:17, и форма, соответствующая аминокислотным остаткам 3-67 зрелого 8ΌΕ-1α человека, имеющая дополнительный ^концевой метионин и определяемая 8Е0 ΙΌ N0:18.
Как используют в настоящем документе, термин агонист активности 8ΌΕ-1 относится к молекуле, стимулирующей или имитирующей активность 8ΌΕ-1, такой как антитела-агонисты к рецептору для 8ΌΕ-1 или низкомолекулярные агонисты, активирующие передачу сигнала через рецептор для 8ΌΕ-1, например рецептор СХСК.4.
Как используют в настоящем документе, термин агонист активности 8ΌΕ-1 также относится к средствам, усиливающим опосредуемую 8ΌΕ-1 активность, такую как обеспечение прикрепления клеток к компонентам внеклеточного матрикса, морфогенез клеток ростка олигоденроцитов в продуцирующие миелин клетки, обеспечение привлечения, пролиферации, дифференцировки или созревания клеток ростка олигодендроцитов (таких как клетки-предшественники или родительские клетки) или обеспечение защиты клеток ростка олигодендроцитов от апоптоза и повреждения клеток. Сходные виды активности 8ΌΕ-1 также обеспечиваются для шванновских клеток.
- 9 015716
В предпочтительном варианте осуществления этого изобретения 8ΏΡ-1 представляет собой 8ϋΡ-1α.
В следующем предпочтительном варианте осуществления этого изобретения 8ΌΡ-1 представляет собой вариант 8ΌΡ-1α.
Как используют в настоящем документе, термины лечение и профилактика следует понимать как предотвращение, ингибирование, ослабление, смягчение или обращение одного или нескольких симптомов или причины (причин) неврологического заболевания, а также симптомов, заболеваний или осложнений, сопровождающих неврологическое заболевание. При лечении неврологического заболевания вещество в соответствии с этим изобретением вводят после начала заболевания, профилактика относится к введению вещества до того, как у пациента могут быть выявлены признаки заболевания.
Как используют в настоящем документе, термин неврологические заболевания охватывает все известные неврологические заболевания или нарушения либо повреждения ЦНС или ПНС, включая повреждения, подробно описанные в разделе Предпосылки изобретения.
Неврологические заболевания включают нарушения, связанные с дисфункцией ЦНС или ПНС, такие как заболевания, связанные с нейротрансмиссией, головной болью, травмой головы, инфекциями ЦНС, нейроофтальмологическими нарушениями и нарушениями черепно-мозговых нервов, функцией и дисфункцией долей головного мозга, нарушениями движений, ступором и комой, демиелинизирующими заболеваниями, делирием и деменцией, аномалиями кранио-цервикального сочленения, нарушениями сознания, нарушениями спинного мозга, нарушениями сна, нарушениями периферической нервной системы, цереброваскулярным заболеванием или мышечными нарушениями. Для определений этих нарушений см., например, ТПе Мегск Мапиа1 £ог Ωίαβηοδίδ аиб Тйегару, 8сусп1ссп111 Εάίΐίοη, риЫщйеб Ьу Мегск Рс5саге11 ЬаЬога!опе8, 1999.
Нейровоспаление происходит при различных неврологических заболеваниях. Нейровоспаление, которое может быть индуцировано нейрональным или олигодендроглиальным нарушением, запускается множеством стимулов или оно может быть следствием травмы, повреждения центрального или периферического нерва или вирусной или бактериальной инфекции. Основными следствиями нейровоспаления являются: (ί) секреция различных воспалительных хемокинов астроцитами, клетками микроглии и (п) привлечение дополнительных лейкоцитов, которые далее стимулируют астроциты или микроглию. Полагают, что при хронических нейродегенеративных заболеваниях, таких как рассеянный склероз (РС), болезнь Альцгеймера (АО) или боковой амиотрофический склероз (АЬ8), наличие постоянного нейровоспаления участвует в прогрессировании заболевания. Неврологические заболевания, обусловленные нейровоспалением, также могут называться неврологическими воспалительными заболеваниями.
В предпочтительном варианте осуществления этого изобретения неврологическое заболевание ассоциировано с воспалением, в частности нейровоспалением.
Предпочтительно неврологические заболевания по этому изобретению выбирают из группы, состоящей из травматического повреждения нерва, инсульта, демиелинизирующих заболеваний ЦНС или ПНС, невропатий и нейродегенеративных заболеваний.
Травматическое повреждение нерва может быть связано с ПНС или ЦНС, оно может представлять собой травму головного мозга или спинного мозга, включая параплегию, как описано выше в разделе Предпосылки изобретения.
В предпочтительных вариантах осуществления этого изобретения травматическое повреждение нерва включает травму периферического нерва или травму спинного мозга.
Инсульт может быть вызван гипоксией или ишемией головного мозга. Также его называют церебро-васкулярным заболеванием или повреждением. Инсульт может вовлекать снижение функций головного мозга (неврологический дефицит), вызываемое снижением кровотока в областях головного мозга. Снижение кровотока может быть следствием сгустков крови, которые могут образовываться в головном мозге (тромб), или фрагментов атеросклеротической бляшки или другого материала, которые переносятся в головной мозг из другой области (эмболы). Кровотечение (геморрагия) в головном мозге может вызывать симптомы, которые имитируют инсульт. Наиболее частой причиной инсульта является вторичный инсульт после атеросклероза (церебрального тромбоза), и, таким образом, это изобретение также относится к лечению атеросклероза.
Периферическая невропатия может быть связана с синдромом потери чувствительности, мышечной слабостью и атрофией, сниженным глубоким сухожильным рефлексом и вазомоторными симптомами, отдельно или в любом сочетании. Периферическая невропатия может поражать один нерв (мононевропатия), два или более нервов в отдельных областях (множественная мононевропатия) или множество нервов одновременно (полиневропатия). Могут поражаться, главным образом, аксон (например, при сахарном диабете, болезни Лайма, уремии или посредством токсических агентов), или миелиновая оболочка, или шванновская клетка (например, при острой или хронической воспалительной полиневропатии, лейкодистрофиях или синдроме Гийена-Барре). Следующие невропатии, которые можно лечить в соответствии с настоящим изобретением, могут возникать вследствие вызванной свинцом токсичности, применения дапзона, укуса клеща, порфирии или синдрома Гийена-Барре, и они могут поражать в основном дви
- 10 015716 гательные волокна. Другие невропатии, такие как невропатии вследствие ганглионита заднего корешка при злокачественной опухоли, лепре, СПИД, сахарном диабете или хронической интоксикации пиридоксином, могут поражать в основном ганглии задних корешков или чувствительные волокна, вызывая сенсорные симптомы. Также могут быть вовлечены черепные нервы, например, как в случае синдрома Гийена-Барре, болезни Лайма, сахарного диабета и дифтерии.
Болезнь Альцгеймера представляет собой нарушение, вовлекающее ухудшение психических функций вследствие изменений в ткани головного мозга. Оно может включать сокращение объема тканей головного мозга, вызываемое не нарушениями кровеносных сосудов, первичную дегенеративную деменцию и диффузную атрофию головного мозга. Болезнь Альцгеймера также называют старческим слабоумием по типу болезни Альцгеймера (8ΌΑΤ).
Болезнь Паркинсона представляет собой нарушение головного мозга, характеризующееся дрожанием и проблемами с хождением, движениями и координацией. Заболевание обусловлено повреждением части головного мозга, которая контролирует движение мышц, и его также называют рага1у818 адйаиб, или дрожательным параличом.
Болезнь Гентингтона (ΗΌ) представляет собой наследственное аутосомно-доминантное неврологическое заболевание. Генетическое нарушение состоит в избытке количества тандемно повторяющихся нуклеотидных последовательностей САС. Другие заболевания с повторами САС включают, например, спинальные мышечные атрофии (8МА), такие как болезнь Кеннеди, и большинство аутосомнодоминантных мозжечковых атаксий (АЭСА), которые известны в генетической номенклатуре как спинально-церебеллярные атаксии (8СА).
Боковой амиотрофический склероз (АЬ8) представляет собой нарушение, вызывающее прогрессирующую потерю нервного контроля произвольных мышц, включающую разрушение нервных клеток в головном и спинном мозге. Боковой амиотрофический склероз, также называемый болезнью Лу Геринга, представляет собой нарушение, вовлекающее снижение использования и контроля мышц.
Рассеянный склероз (РС) представляет собой воспалительное демиелинизирующее заболевание центральной нервной системы (ЦНС), которое принимает ремитирующее или прогрессирующее течение. РС является не единственным демиелинизирующим заболеванием. Его аналогом в периферической нервной системе (ПНС) является хроническая воспалительная демиелинизирующая полирадикулоневропатия (СГОР). Кроме того, существуют острые монофазные нарушения, такие как воспалительная демиелинизирующая полирадикулоневропатия, называемая синдромом Гийена-Барре (СВ8) в ПНС, и острый диссеминированный энцефаломиелит (АЭЕМ) в ЦНС. Следующие неврологические нарушения включают невропатии с аномальной миелинизацией, такие как нарушения, представленные выше в разделе Предпосылки изобретения, а также туннельный синдром запястья. Травматическое повреждение нерва может сопровождаться ортопедическими осложнениями в позвоночнике, и они также относятся к заболеваниям в соответствии с настоящим изобретением.
Также в объеме настоящего изобретения находятся менее известные неврологические заболевания, такие как нейрофиброматоз или множественная системная атрофия (М8А). Следующие нарушения, которые можно лечить в соответствии с настоящим изобретением, подробно описаны выше в разделе Предпосылки изобретения.
В следующем предпочтительном варианте осуществления неврологическое заболевание представляет собой периферическую невропатию, наиболее предпочтительно диабетическую невропатию. Также предпочтительными в соответствии с настоящим изобретением являются ассоциированные с химиотерапией/индуцированные химиотерапией невропатии.
Термин диабетическая невропатия относится к любой форме диабетической невропатии или к одному или нескольким симптому(ам) или нарушению(ям), сопровождающим диабетическую невропатию или вызываемым диабетической невропатией, или к осложнениям диабета, поражающим нервы, как подробно описано выше в разделе Предпосылки изобретения. Диабетическая невропатия может представлять собой полиневропатию. При диабетической полиневропатии одновременно поражается множество нервов. Диабетическая невропатия также может представлять собой мононевропатию. При фокальной мононевропатии, например, заболевание поражает один нерв, такой как глазодвигательный или отводящий черепно-мозговой нерв. Также это заболевание может представлять собой множественную мононевропатию, когда два или более нервов поражаются в отельных областях.
В следующем предпочтительном варианте осуществления неврологическое нарушение представляет собой демиелинизирующее заболевание. Демиелинизирующие заболевания предпочтительно включают демиелинизирующие состояния ЦНС, такие как острый диссеминированный энцефаломиелит (АЭЕМ) и рассеянный склероз (РС), а также демиелинизирующие заболевания периферической нервной системы (ПНС). Последние включают заболевания, такие как хроническая воспалительная демиелинизирующая полирадикулоневропатия (СГОР), и острые монофазные нарушения, такие как воспалительная демиелинизирующая полирадикулоневропатия, называемая синдромом Гийена-Барре (СВ8).
В следующем предпочтительном варианте осуществления демиелинизирующее заболевание представляет собой рассеянный склероз.
- 11 015716
В особенно предпочтительном варианте осуществления этого изобретения демиелинизирующее заболевание представляет собой первично-прогрессирующий рассеянный склероз.
В другом особенно предпочтительном варианте осуществления этого изобретения демиелинизирующее заболевание представляет собой вторично-прогрессирующий рассеянный склероз. В следующем предпочтительном варианте осуществления демиелинизирующее заболевание выбрано из хронического воспалительного рассеянного склероза, демиелинизирующей полиневропатии (СГОР) и синдрома Гийена-Барре (ОВ8).
Следующий предпочтительный вариант осуществления этого изобретения относится к лечению и/или профилактике нейродегенеративного заболевания. Нейродегенеративное заболевание выбрано из группы, состоящей из болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, болезни Гентингтона и АЬ8.
Предпочтительно 8ΌΡ-1 выбирают из пептида, полипептида или белка, выбранного из группы, состоящей из:
(a) полипептида, содержащего аминокислоты 8ЕО ГО N0:1;
(b) полипептида, содержащего аминокислоты 8Е0 ГО N0:4;
(c) полипептида, содержащего аминокислоты 8Е0 ГО N0:7;
(б) полипептида согласно (а)-(с), дополнительно содержащего сигнальную последовательность предпочтительно аминокислоты 8Е0 ГО N0:5;
(е) мутеина согласно любому из (а)-(б), где аминокислотная последовательность обладает по меньшей мере 40, или 50, или 60, или 70, или 80, или 90%-ной идентичностью по меньшей мере одной из последовательностей согласно (а)-(б);
(ί) мутеина согласно любому из (а)-(б), который кодируется последовательностью ДНК, которая в условиях высокой жесткости гибридизуется с последовательностью, комплементарной нативной последовательности ДНК, кодирующей любой из (а)-(б);
(д) мутеина согласно любому из (а)-(б), где любые замены в аминокислотной последовательности представляют собой консервативные аминокислотные замены в аминокислотных последовательностях согласно (а)-(б);
(к) соли или изоформы, слитого белка, функционального производного или активной фракции согласно любому из (а)-(б).
Активные фракции или фрагменты могут включать любую часть или домен любой из изоформ 8ΌΡ-1, такие как ^концевая часть или С-концевая часть, или любую из изоформ 8ΌΡ-1.
Специалист в данной области поймет, что даже части 8ΌΡ-1 меньших размеров могут быть достаточными для осуществления его функции, такие как активный пептид, содержащий незаменимые аминокислотные остатки, требуемые для функции 8ΌΡ-1, например, такой как связывание с рецептором СХСК4-. Связывание рецептора, например, можно определять, подвергая иммобилизованный рецептор воздействию его меченого лиганда и немеченого тестируемого белка, в результате которого снижение связывания меченого лиганда по сравнению с контролем указывает на рецепторсвязывающую активность тестируемого белка. В другом анализе поверхностной плазмонной резонансной спектроскопии, рецептор или белок, подлежащие анализу, иммобилизуют на плоском сенсорном чипе в проточной камере, после чего раствор, содержащий предполагаемый взаимодействующий партнер, пропускают через первый белок в виде постоянного потока, свет направляют через чип под определенным углом и измеряют резонансный угол отраженного света; формирование белок-белкового взаимодействия приводит к изменению угла (например, В1АСоге®, В1асоге 1и!егиа!юиа1 АВ). Другие способы, пригодные для анализа белок-белковых взаимодействий (например, аффинная хроматография, аффинный блоттинг и коиммунопреципитация) или для оценки аффинности связывания (например, белковая аффинная хроматография, осаждение, гель-фильтрация, флуоресцентные способы, твердофазный отбор образцов равновесных растворов и поверхностный плазмонный резонанс), рассмотрены Р1и/1ску Е.М. и Р1е1б§ 8. (Р1и/1ску аиб Ие1б8, 1995; 8аб1г е! а1., 2001).
Далее, специалист в данной области поймет, что мутеины, соли, изоформы, слитые белки, функциональные производные или активные фракции 8ΌΡ-1 будут сохранять сходную биологическую активность или даже проявлять улучшенную биологическую активность 8ΌΡ-1. Биологическую активность 8ΌΡ-1 и его мутеинов, изоформ, слитых белков или функциональных производных, активных фракций или фрагментов или солей можно определять в биологическом анализе с использованием клеточной системы.
Предпочтительные активные фракции обладают активностью, равной активности полноразмерного 8ΌΡ-1 или лучшей, чем эта активность, или активностью, которая обладает дополнительными преимуществами, такими как улучшенная стабильность или более низкая токсичность или иммуногенность, или их проще получать в больших количествах, или их проще очищать. Специалист в данной области поймет, что мутеины, активные фрагменты и функциональные производные можно получать посредством клонирования соответствующей кДНК в пригодные плазмиды и тестирования их в клеточном анализе, как упомянуто выше.
- 12 015716
Белки в соответствии с настоящим изобретением могут быть гликозилированными или негликозилированными, они могут быть получены из природных источников, таких как жидкости организма, или предпочтительно они могут быть продуцированы рекомбинантно. Рекомбинантную экспрессию можно проводить в прокариотических экспрессирующих системах, таких как Е.со11, или в эукариотических системах, таких как клетки насекомых, и предпочтительно в экспрессирующих системах млекопитающих, таких как клетки СНО или клетки НЕК. Более того, белки по этому изобретению могут быть модифицированными, удлиненными или укороченными, посредством удаления или вставки Ν-концевого а метионина (Ме1) или аминооксипентана (АОР) при условии сохранения нейропротективных эффектов.
Как используют в настоящем документе, термин мутеины относится к аналогам 8ΌΡ-1, в которых один или несколько аминокислотных остатков природного 8ΌΡ-1 заменены отличающимися аминокислотными остатками или удалены или один или несколько аминокислотных остатков вставлены в природную последовательность 8ΌΡ-1 без значительного изменения активности полученных продуктов по сравнению с 8ΌΡ-1 дикого типа. Эти мутеины получают известным способом синтеза и/или способами сайт-направленного мутагенеза или любым другим способом, пригодным для этого.
Мутеины 8ΌΡ-1, которые можно использовать в соответствии с настоящим изобретением, или кодирующие их нуклеиновые кислоты включают конечный набор, по существу, аналогичных последовательностей в виде пептидов или полинуклеотидов с заменами, которые специалист в данной области может получать общепринятыми способами без излишнего экспериментирования, исходя из указаний и рекомендаций, представленных в настоящем описании.
Мутеины в соответствии с настоящим изобретением включают белки, кодируемые нуклеиновой кислотой, такой как ДНК или РНК, которая гибридизуется с ДНК или РНК, которые кодируют 8ΌΡ-1, в соответствии с настоящим изобретением, в условиях умеренной или высокой жесткости. кДНК, кодирующая 8ΌΡ-1α, описана в качестве 8Е0 ΙΌ N0:6.
Термин жесткие условия относится к условиям гибридизации и последующего промывания, которые специалисты в данной области обычно называют жесткими. См. Лн5иЬе1 с1 а1., СиггеШ РгоЮсоЕ ίη Мо1еси1аг Вю1оду, выше, 1п1ег8С1епсе, Ν.Υ., § 6.3 и 6.4 (1987, 1992) и 8атЬгоок й а1. (8атЬгоок, 1.С., Нп18с11„ Ε.Ρ., апб Машабз, Т. (1989). Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬогаФгу Мапиа1, Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога1огу Рге88, Со1б 8рппд НагЬог, ΝΥ).
Не ограничиваясь этим, примеры жестких условий включают условия промывания на 12-20°С ниже вычисленной Тт гибрида при исследовании, например, в 2х88С и 0,5% 8Ό8 в течение 5 мин, 2х88С и 0,1% 8Ό8 в течение 15 мин; 0,1х88С и 0,5% 8Ό8 при 37°С в течение 30-60 мин, а затем 0,1х88С и 0,5% 8Ό8 при 68°С в течение 30-60 мин. Специалисты в данной области понимают, что жесткость условий также зависит от длины последовательностей ДНК, олигонуклеотидных зондов (такой как 10-40 оснований) или смешанных олигонуклеотидных зондов. Если используют смешанные зонды, предпочтительным является применение хлорида тетраметиламмония (ТМАС) вместо 88С. См. Аи8иЬе1, выше.
В предпочтительном варианте осуществления любой такой мутеин обладает по меньшей мере 40% идентичностью или гомологией с последовательностями 8Е0 ΙΌ N0:1-4 прилагаемого списка последовательностей. Более предпочтительно он обладает по меньшей мере 50, по меньшей мере 60, по меньшей мере 70, по меньшей мере 80 или наиболее предпочтительно по меньшей мере 90%-ной идентичностью или гомологией с ним.
Идентичность отражает взаимосвязь между двумя или более полипептидными последовательностями или двумя или более полинуклеотидными последовательностями, определенную посредством сравнения последовательностей. Как правило, идентичность относится к точному соответствию нуклеотида нуклеотиду или аминокислоты аминокислоте в двух полинуклеотидных или двух полипептидных последовательностях соответственно на протяжении длины сравниваемых последовательностей.
В случае последовательностей, где соответствие является неполным, можно определять % идентичность. Как правило, две последовательности, подлежащие сравнению, выравнивают для обеспечения максимальной корреляции между последовательностями. Выравнивание может включать встраивание разрывов в любую одну или обе последовательности для повышения степени выравнивания. % идентичность можно определять на протяжении всей длины каждой из сравниваемых последовательностей (так называемое глобальное выравнивание), что является особенно пригодным для последовательностей одинаковой или сходной длины, или на протяжении более коротких определенных длин (так называемое локальное выравнивание), что является более пригодным для последовательностей с неравной длиной.
Способы сравнения идентичности и гомологии двух или более последовательностей хорошо известны в данной области. Таким образом, для определения % идентичности между двумя полинуклеотидами и % идентичности и % гомологии между двумя полипептидными последовательностями можно использовать, например, программы, доступные в ХУЬсоппп 8ес.|иепсе Апа1у818 Раскаде, уегпоп 9,1 (Эеуегеих й а1., 1984), например программы ΒΕ8ΤΡΙΤ и САР. ΒΕ8ΤΡΙΤ использует алгоритм локальной гомологии 8ιηί11ι и \Уа1егтап (8тбй апб ^а1егтап, 1981) и находит один участок наибольшего сходства между двумя последовательностями. Также в данной области известны другие программы для определения идентичности и/или сходства между последовательностями, например семейство программ ВЬА8Т
- 13 015716 (Λΐίδοίιιιΐ с1 а1., 1990; Л118с1ш1 с1 а1., 1997), доступное через домашнюю страницу ΝΟ’ΒΙ на \\л\л\'.псЫ.п1т.ш11.доу) и РЛ8ТЛ (Реагкоп, 1990; Реагкоп апб Ыртап, 1988).
Предпочтительные изменения для мутеинов в соответствии с настоящим изобретением представляют собой замены, известные как консервативные замены. Консервативные аминокислотные замены полипептидов 8ΌΡ-1 могут включать синонимические аминокислоты в группе, которые обладают достаточно сходными физико-химическими свойствами, чтобы замена между членами группы сохраняла биологическую функцию молекулы (ОгапФат, 1974). Очевидно, что вставки и делеции аминокислот также можно проводить в указанных выше последовательностях без изменения их функции, в частности, если вставки и делеции вовлекают только несколько аминокислот, например менее 30 и предпочтительно менее 10, и не удаляют или не вытесняют аминокислоты, которые являются важными для функциональной конформации, например остатки цистеина. Белки и мутеины, получаемые посредством таких делеций и/или вставок, находятся в рамках настоящего изобретения.
Предпочтительно группы синонимических аминокислот представляют собой группы, определенные в табл. Ι. Более предпочтительно группы синонимических аминокислот представляют собой группы, определенные в табл. ΙΙ; и наиболее предпочтительно группы синонимических аминокислот представляют собой группы, определенные в табл. ΙΙΙ.
Таблица I
Предпочтительные группы синонимических аминокислот Аминокислота Синонимическая группа
Зег Зег, ТЬг, Е1у, Азп
Агд Агд, С1п, Ъуз, 6111, Н1з
Ьеи Не, РЬе, Туг, МеЬ, Уа1, Ъеи
Рго С1у, А1а, ТЬг, Рго
ТЬг Рго, Зег, А1а, 01у, ΗΪ3 , 61п, ТЬг
А1а Е1у, ТЬг, Рго, А1а
Уа1 МеЪ, Туг, РЬе, 11е, Ъеи, Уа1
С1у А1а, ТЬг, Рго, Зег, 61у
Не МеЪ, Туг, РЬе, Уа1, Ъеи, Не
РЬе Тгр, Ме5, Туг, Не, Уа1, Ьеи, РЬе
Туг Тгр, МеТ, РЬе, 11е, Уа1, Ъеи, Туг
Суз Зег, ТЬг, Суз
Н15 61и, Ъуз, С1п, ТЬг, Агд, Η13
61п 61и, Ъуз, Азп, Н13, ТЬг, Агд, 61п
Азп 61п, Азр, Зег, АЗП
Ьуз 61и, 61п, ΗΪ3, Агд, Ъуз
Азр С1и, Азп, Азр
С1и Азр, Ъуз, Азп, 61п, Н18, Агд, 61и
МеТ РЬе, Не, Уа1, Ьеи, МеС
Тгр Тгр
Таблица II
Более предпочтительные группы синонимических аминокислот
Аминокислота
Синонимическая группа
Зег Зег
Агд Н1з, Ьуз, Агд
Ьеи Ьеи, Не, РЬе, Ме!
Рго А1а, Рго
ТЬг ТЬг
А1а Рго, А1а
Уа1 Уа1, МеЬ, Не
С1у 61у
Не Не, МеЬ, РЬе, Уа1,
РЬе МеЬ, Туг, Не, Ьеи,
Туг РЬе, Туг
Суз Суз, Зег
Н1з Н13, 61п, Агд
С1п 61п, Н18
Азп Азр, Азп
Ьуз Ьуз, Агд
Азр Азр, Азп
61и С1и, С1п
Не! Ме!, РЬе, Не, Уа1,
Тгр Тгр
Таблица III
Наиболее предпочтительные группы синонимических аминокислот
Амино кислота Синонимическая группа
Зег Зег
Агд Агд
Ьеи Ьеи, Не, МеЬ
Рго Рго
ТЬг ТЬг
А1а А1а
УаЬ Уа1
С1у С1у
11е Не, МеЬ, Ьеи
РЬе РЬе
Туг Туг
Суз Суз, Зег
ΗΪ3 Ηί3
С1п С1п
Азп Азп
Ьуз Ьуз
Азр Азр
С1и С1и
МеЕ МеЬ, Не, Ьеи
Тгр МеЕ
- 15 015716
Примеры внесения аминокислотных замен в белки, которые могут приводить к получению мутеинов 8ΌΕ-1, полипептидов или белков, для применения в настоящем изобретении включают любые известные стадии способов, такие как представлено в патентах США 4959314, 4588585 и 4737462, выданных Магк е! а1.; 5116943, выданном Ко!115 е! а1.; 4965195, выданном Матеи е! а1.; 4879111, выданном Сйоид е! а1.; и 5017691, выданном Ьее е! а1.; и замещенные лизином белки представлены в патенте США № 4 904584 (8йате е! а1.).
Термин слитый белок относится к полипептиду, содержащему 8ΌΕ-1, или его мутеину или фрагменту, слитому с другим белком, который, например, обладает увеличенным временем нахождения в жидкостях организма. Таким образом, 8ΌΕ-1 может быть слитым с другим белком, полипептидом или сходными с ними, например иммуноглобулином или его фрагментом.
Как используют в настоящем документе, функциональные производные охватывают производные 8ΌΕ-1 и их мутеины и слитые белки, которые можно получать из функциональных групп, встречающихся в качестве боковых цепей на остатках Ν- или С-концевых групп, способами, известными в данной области, и они относятся к этому изобретению при условии, что они остаются фармацевтически приемлемыми, т.е. они не нарушают активность белка, которая, по существу, сходна с активностью 8ΌΕ-1, и не придают токсичных свойств содержащим им композициям.
Эти производные, например, могут включать боковые цепи полиэтиленгликоля, которые могут скрывать антигенные участки и повышать время нахождения 8ΌΕ-1 в жидкостях организма. Другие производные включают алифатические сложные эфиры карбоксильных групп, амиды карбоксильных групп, полученные посредством реакции с аммиаком или с первичными или вторичными аминами, Ν-ацильные производные свободных аминогрупп аминокислотных остатков, образованные с ацильными группами (например, алканоильной или карбоциклической ароильной группами), или О-ацильные производные свободных гидроксильных групп (например, гидроксильных групп остатков серила или треонила), образованные с ацильными группами.
В качестве активных фракций 8ΌΡ-1, мутеинов и слитых белков настоящее изобретение охватывает любой фрагмент или предшественников полипептидных цепей молекулы белка отдельно или совместно с ассоциированными ней молекулами или связанными с ней остатками, например остатками сахара или фосфата, или агрегатами самой молекулы белка или остатков сахаров, при условии, что указанная фракция обладает активностью, по существу, сходной с 8ΌΡ-1.
Термин соли в настоящем документе относится как к солям карбоксильных групп, так и к кислотно-аддитивным солям аминогрупп молекулы 8ΌΡ-1 или ее аналогов. Соли карбоксильной группы могут быть образованы способами, известными в данной области, и они включают неорганические соли, например соли натрия, кальция, аммония, железа или цинка и т.п., и соли с органическими основаниями, такие как соли, образованные, например, с аминами, такими как триэтаноламин, аргинин или лизин, пиперидин, прокаин и т.п. Кислотно-аддитивные соли включают, например, соли с минеральными кислотами, например, такими как хлористо-водородная кислота или серная кислота, и соли с органическими кислотами, например, такими как уксусная кислота или щавелевая кислота. Безусловно, любые такие соли должны сохранять биологическую активность 8ΌΡ-1, относящуюся к настоящему изобретению, т.е. нейропротективный эффект при неврологическом заболевании.
В предпочтительном варианте осуществления этого изобретения 8ΌΡ-1 является слитым с молекулой носителя, пептидом или белком, которые обеспечивают прохождение через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ). Эта молекула носителя служит для надлежащего нацеливания молекулы в область действия в тех случаях, когда в заболевание вовлечена ЦНС. Способы доставки лекарственного средства через ГЭБ вовлекают нарушение ГЭБ либо осмотическими способами, либо биохимически посредством применения вазоактивных веществ, таких как брадикинин. Другие стратегии для проникновения через ГЭБ могут вовлекать применение эндогенных транспортных систем, включая опосредуемые переносчиком транспортеры, такие как переносчики глюкозы и аминокислот; рецептор-опосредуемый трансцитоз для инсулина или трансферрина; и активные транспортеры для выхода, такие как р-гликопротеин; пенетратин, 16-мерный пептид (рАп!р), образованный из третьего спирального домена гомеопротеина Ап1еппаре'1а, и его производные. Стратегии для доставки лекарственных средств через ГЭБ далее включают имплантацию внутрь головного мозга.
В целях улучшения свойств белка, таких как стабильность, время полужизни, биодоступность, переносимость организмом человека или иммуногенность, функциональные производные 8ΌΡ-1 могут быть конъюгированы с полимерами. Для достижения этой цели 8ΌΡ-1 может быть связан, например, с полиэтиленгликолем (РЕС). Пегилирование можно проводить любыми способами, описанными в \УО 92/13095. Например, 8ΌΕ-1α может быть пегилированным по остаткам, вовлеченным в связывание гликозаминогликана, например Ьу824, Ηί§25, Ьу827, Агд41 или Ьу843.
Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения 8ΌΕ-1 является пегилированным.
- 16 015716
В следующем предпочтительном варианте осуществления этого изобретения слитый белок содержит слитый иммуноглобулин (1д). Слияние может быть прямым или через короткий линкерный пептид, который может обладать длиной от 1 до 3 аминокислотных остатков или более, например он может обладать длиной 13 аминокислотных остатков. Указанный линкер может представлять собой, например, трипептид с последовательностью Ε-Ε-М (С1и-Рйе-Ме1) или линкерную последовательность из 13 аминокислот, содержащую С1и-Рйе-С1у-А1а-С1у-Ееи-Уа1-Ееи-С1у-С1у-С1п-Рйе-Ме1, например, встроенную между последовательностью 8ΌΕ-1 и последовательностью иммуноглобулина. Полученный слитый белок обладает улучшенными свойствами, такими как увеличенное время нахождения в жидкостях организма (время полужизни) или повышенная специфичная активность, повышенный уровень экспрессии. Слияние с 1д также может упрощать очистку слитого белка.
В другом предпочтительном варианте осуществления 8БЕ-1 является слитым с константным участком молекулы 1д. Предпочтительно он является слитым с участками тяжелых цепей, например, такими как домены СН2 и СН3 1дС1 человека. Другие изоформы молекул 1д также пригодны для получения слитых белков в соответствии с настоящим изобретением, такие как изоформы 1дС2 или 1дС4, или другие классы 1д, например, такие как 1дМ. Слитые белки могут быть мономерными или мультимерными, гетеро- или гомомультимерными. Часть иммуноглобулина в слитом белке может быть далее модифицирована таким образом, чтобы не она активировала связывание комплемента или каскад комплемента или чтобы она не связывалась с Ес-рецепторами.
Следующие слитые белки 8БЕ-1 можно получать посредством слияния доменов, выделенных из других белков, обеспечивающих образование димеров, тримеров и т.д. Примеры белковых последовательностей, обеспечивающих мультимеризацию полипептидов по этому изобретению, представляют собой домены, выделенные из белков, таких как 11СС (XVО 97/30161), коллаген X (XVО 04/33486), С4ВР (ХХО 04/20639), белки ЕтЬ (ХХО 98/02540) или двухспиральные пептиды (ХХО 01/00814).
Далее, это изобретение относится к применению сочетания 8БЕ-1 и иммунодепрессанта в целях изготовления лекарственного средства для лечения и/или профилактики неврологических нарушений для одновременного, последовательного или раздельного применения. Иммунодепрессанты могут представлять собой стероиды, метотрексат, циклофосфамид, антилейкоцитарные антитела (такие как САМРАТН-1) и т.п.
Далее, это изобретение относится к применению сочетания 8БЕ-1 и интерферона, и/или остеопонтина, и/или кластерина в целях изготовления лекарственного средства для лечения и/или профилактики неврологических нарушений для одновременного, последовательного или отдельного применения.
Подразумевают, что термин интерферон, как используют в настоящем изобретении, включает любую молекулу, определенную таким образом в литературе, включающую, например, ΙΕΝ любого типа, упомянутого выше в разделе Предпосылки изобретения. Интерферон предпочтительно может быть человеческим, а также полученным из других видов при условии, что его биологическая активность является сходной с интерферонами человека, и молекула не является иммуногенной у человека.
В частности, к приведенному выше определению относятся любые типы ΙΕΝ-α, ΙΕΝ-β и ΙΕΝ-γ. ΙΕΝ-α представляет собой предпочтительный ΙΕΝ в соответствии с настоящим изобретением.
Подразумевают, что термин интерферон-бета (ΙΕΝ-β), как используют для настоящего изобретения, включает интерферон фибробластов человека, получаемый выделением из биологических жидкостей или получаемый способами рекомбинантных ДНК из прокариотических или эукариотических клеток-хозяев, а также его соли, функциональные производные, варианты, аналоги и фрагменты.
Особую важность представляет белок, который преобразован или комбинирован с образующим комплексы соединением для длительного действия. Например, в соответствии с настоящим изобретением можно использовать пегилированные варианты, как упомянуто выше, или белки, полученные способами генетической инженерии, чтобы они проявляли активность в отношении длительности действия в организме.
Подразумевают, что термин производные включает только те производные, которые не заменяют одну аминокислоту другой из двадцати обычно встречающихся природных аминокислот.
В целях повышения стабильности белков интерфероны также могут быть конъюгированы с полимерами. Конъюгат между интерфероном β и полиолем полиэтиленгликоля (РЕС) описан, например, в ХХ'О 99/55377.
В другом предпочтительном варианте осуществления этого изобретения интерферон представляет собой интерферон-β (ΙΕΝ-β) и более предпочтительно ΙΕΝ-β 1а.
8ΌΕ-1 предпочтительно применяют одновременно, последовательно или раздельно с интерфероном.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения 8ΌΕ-1 применяют в количестве приблизительно от 0,001 до 1 мг/кг массы тела, или приблизительно от 0,01 до 10 мг/кг массы тела или приблизительно 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 мг/кг массы тела, или приблизительно от 0,1 до 1 мг/кг массы тела.
- 17 015716
Далее, это изобретение относится к применению молекулы нуклеиновой кислоты для изготовления лекарственного средства для лечения и/или профилактики неврологического заболевания, где молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты 8ЕО ΙΌ N0:6 или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
(a) полипептида, содержащего аминокислоты 8Е0 ΙΌ N0:1;
(b) полипептида, содержащего аминокислоты 8Е0 ΙΌ N0:4;
(c) полипептида, содержащего аминокислоты 8Е0 ΙΌ N0:7;
(6) полипептида согласно (а)-(с), дополнительно содержащего сигнальную последовательность предпочтительно аминокислоты 8Е0 ΙΌ N0:5;
(е) мутеина согласно любому из (а)-(6), где аминокислотная последовательность обладает по меньшей мере 40, или 50, или 60, или 70, или 80, или 90%-ной идентичностью по меньшей мере одной из последовательностей согласно (а)-(с);
(1) мутеина согласно любому из (а)-(6), который кодируется последовательностью ДНК, которая в условиях высокой жесткости гибридизуется с последовательностью, комплементарной нативной последовательности ДНК, кодирующей любой из (а)-(с);
(д) мутеина согласно любому из (а)-(6), где любые замены в аминокислотной последовательности представляют собой консервативные аминокислотные замены в аминокислотных последовательностях согласно (а)-(с);
(Ь) соли или изоформы, слитого белка, функционального производного или активной фракции согласно любому из (а)-(6).
Например, нуклеиновую кислоту можно вводить в качестве голой молекулы нуклеиновой кислоты, например, посредством внутримышечной инъекции.
Кроме того, она может включать последовательности векторов, такие как вирусная последовательность, пригодная для экспрессии гена, кодируемого молекулой нуклеиновой кислоты в организме человека, предпочтительно в пригодных клетках или тканях.
Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты далее содержит последовательность экспрессирующего вектора. Последовательности экспрессирующих векторов хорошо известны в данной области, они содержат дополнительные элементы, служащие для экспрессии представляющего интерес гена. Они могут содержать регуляторную последовательность, такую как последовательности промоторов и энхансеров, последовательности селективных маркеров, ориджины для многократной репликации и т.п. Таким образом, для лечения и/или профилактики заболевания используют подход генной терапии. Предпочтительно экспрессия 8ЭЕ-1 затем будет происходить ίη κίΐι,ι.
В предпочтительном варианте осуществления экспрессирующий вектор представляет собой образованный из лентивируса вектор. Было показано, что лентивирусные векторы являются очень эффективными в отношении переноса генов, особенно в ЦНС. Другие общепринятые вирусные векторы, такие как образованные из аденовируса векторы, также можно использовать в соответствии с этим изобретением.
В целях усиления прохождения 8ЭЕ-1 через гематоэнцефалический барьер можно использовать нацеленный вектор. Такие векторы могут быть нацелены, например, на рецептор трансферрина или другие механизмы эндотелиального транспорта.
В предпочтительном варианте осуществления этого изобретения экспрессирующий вектор можно вводить внутримышечной инъекцией.
Применение вектора для индукции и/или усиления эндогенной продукции 8ΌΡ-1 в клетке, в которой в норме подавлена экспрессия 8ЭЕ-1 или которая экспрессирует недостаточные количества 8ΌΡ-1, также предусмотрено в соответствии с этим изобретением. Вектор может содержать регуляторные последовательности, функциональные в клетках, в которых желательна экспрессия 8ΌΡ-1. Такие регуляторные последовательности могут представлять собой, например, промоторы или энхансеры. Затем посредством гомологичной рекомбинацией регуляторную последовательность можно встраивать в соответствующий локус генома, таким образом функционально связывая регуляторную последовательность с геном, экспрессию которого необходимо индуцировать или усилить. Эту технологию обычно называют эндогенной активацией гена (ЕОЛ), и она описана, например, в ЭД0 91/09955.
Кроме того, это изобретение относится к применению клетки, которая является генетически модифицированной в целях продукции 8ΌΡ-1, для изготовления лекарственного средства для лечения и/или профилактики неврологических заболеваний.
Кроме того, это изобретение относится к клетке, генетически модифицированной в целях продукции 8ΌΡ-1, для изготовления лекарственного средства для лечения и/или профилактики неврологических заболеваний. Таким образом, в целях доставки лекарственного средства в соответствующие области организма человека можно использовать подход клеточной терапии.
- 18 015716
Кроме того, это изобретение относится к фармацевтическим композициям, особенно пригодным для профилактики и/или лечения неврологических заболеваний, которые содержат терапевтически эффективное количество 3ΌΡ-1 и терапевтически эффективное количество интерферона, и/или остеопонтина, и/или кластерина и, кроме того, необязательно терапевтически эффективное количество иммунодепрессанта.
Подразумевают, что определение фармацевтически приемлемый охватывает любой носитель, который не препятствует эффективности биологической активности активного ингредиента и который не является токсичным для хозяина, которому его вводят, или который может повышать активность. Например, для парентерального введения активный белок (белки) может быть изготовлен в единичной дозированной форме для инъекции в носителях, таких как физиологический раствор, раствор декстрозы, сывороточный альбумин и раствор Рингера.
Активные ингредиенты фармацевтической композиции в соответствии с этим изобретением можно вводить индивиду множеством способов. Способы введения включают внутрикожный, чрескожный (например, в составах с замедленным высвобождением), внутримышечный, внутрибрюшинный, внутривенный, подкожный, пероральный, эпидуральный, местный, интратекальный, ректальный и интраназальный способы. Можно использовать любой другой эффективный способ введения, например всасывание через эпителиальные или эндотелиальные ткани или введение посредством генной терапии, где пациенту вводят молекулу ДНК, кодирующую активное средство (например, через вектор), что приводит к экспрессии и секреции активного средства ш νί\Ό.
Кроме того, белок (белки) в соответствии с этим изобретением можно вводить совместно с другими компонентами биологически активных средств, такими как фармацевтически приемлемые поверхностноактивные вещества, эксципиенты, носители, разбавители и носители.
Для парентерального (например, внутривенного, подкожного, внутримышечного) введения активный белок (белки) можно изготавливать в виде раствора, суспензии, эмульсии или лиофилизированного порошка совместно с фармацевтически приемлемым парентеральным носителем (например, водой, физиологическим раствором, раствором декстрозы) и добавками, которые поддерживают изотоничность (например, маннит) или химическую стабильность (например, консерванты и буферы). Состав стерилизуют широко используемыми способами.
Биодоступность активного белка(белков) в соответствии с этим изобретением также можно повышать с использованием способов конъюгации, которые повышают время полужизни молекулы в организме человека, например, посредством связывания молекулы с полиэтиленгликолем (РЕС), как описано в патентной заявке РСТ νθ 92/13095.
Терапевтически эффективные количества активного белка(ов) будут зависеть от многих факторов, включая тип белка, аффинность белка, любую остаточную цитотоксическую активность, проявляемую антагонистами, способ введения, клиническое состояние пациента (включая желательность поддержания нетоксичного уровня эндогенной активности 3ΌΡ-1).
Терапевтически эффективное количество является таким, что при введении 3ΌΡ-1 оказывает благоприятный эффект на неврологическое заболевание. Вводимые индивиду дозировки, в качестве однократных или многократных доз, будут варьировать в зависимости от множества факторов, включая фармакокинетические свойства 3ΌΡ-1, способ введения, состояние и характеристики пациента (пол, возраст, масса тела, здоровье, размер тела), выраженность симптомов, сопутствующее лечение, частота введения и требуемый эффект.
Как упоминалось выше, 3ΌΡ-1 предпочтительно можно применять в количестве приблизительно от 0,001 до 1 мг/кг массы тела, или приблизительно от 0,01 до 10 мг/кг массы тела или приблизительно 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 мг/кг массы тела, или приблизительно от 0,1 до 1 мг/кг массы тела.
Способ введения, который является предпочтительным в соответствии с этим изобретением, представляет собой введение подкожным способом. Кроме того, в соответствии с этим изобретением внутримышечное введение является предпочтительным.
В следующих предпочтительных вариантах осуществления 3ΌΡ-1 вводят один раз в сутки или один раз в двое суток.
Суточные дозы, как правило, вводят в виде разделенных доз или в форме с замедленным высвобождением, эффективной для достижения требуемых результатов. Второе или последующие введения можно проводить в дозировках, которые являются такими же, более низкими или превышающими первоначальную или предшествующую дозу, вводимую индивиду.
В соответствии с этим изобретением 3ΌΡ-1 можно вводить индивиду профилактически или терапевтически до, одновременно или после других терапевтических схем или средств (например, схем с несколькими лекарственными средствами) в терапевтически эффективном количестве, в частности с интерфероном. Активные средства, которые вводят одновременно с другими лекарственными средствами, можно вводить в одной композиции или в различных композициях.
Кроме того, это изобретение относится к способу лечения неврологического заболевания, включающему введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества 3ΌΡ-1 или агониста активности 3ΌΡ-1, необязательно совместно с фармацевтически приемлемым носителем.
- 19 015716
Способ лечения неврологического заболевания, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества 8ΌΡ-1 или агониста активности 8ΌΡ-1 и интерферона, необязательно совместно с фармацевтически приемлемым носителем, также относится к настоящему изобретению.
Способ лечения неврологического заболевания, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества 8ΌΡ-1 или агониста активности 8ΌΡ-1 и остеопонтина, необязательно совместно с фармацевтически приемлемым носителем, также относится к настоящему изобретению.
Способ лечения неврологического заболевания, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества 8ΌΡ-1 или агониста активности 8ΌΡ-1 и кластерина, необязательно совместно с фармацевтически приемлемым носителем, также относится к настоящему изобретению.
Все цитированные в настоящем описании ссылки, включая статьи или рефераты в журналах, опубликованные или неопубликованные патентные заявки США или других стран, выданные патенты США или других стран или любые другие ссылки, включены в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме, включая все данные, таблицы, фигуры и текст, представленный в цитированных ссылках. Кроме того, полное содержание ссылок, цитированных в ссылках, приведенных в настоящем документе, также включено в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме.
Указание на стадии известных способов, стадии общепринятых способов, известные способы или общепринятые способы никоим обрезом не является допущением, что любой аспект, описание или вариант осуществления настоящего изобретения описан, указан или предложен в данной области.
Предшествующее описание конкретных вариантов осуществления настолько полностью раскрывает общий характер этого изобретения, что с использованием знаний данной области (включая содержание ссылок, цитированных в настоящем документе) можно легко модифицировать и/или адаптировать для различных применений такие конкретные варианты осуществления, без излишнего экспериментирования, без отклонения от основных принципов настоящего изобретения. Таким образом, подразумевают, что такие адаптации и модификации охватываются значением диапазона эквивалентов описанных вариантов осуществления, исходя из указаний и рекомендаций, представленных в настоящем документе. Следует понимать, что формулировки или терминология в настоящем документе предназначены для целей описания, а не для ограничения, так что специалисту в данной области следует интерпретировать терминологию и формулировки настоящего описания с учетом указаний и рекомендаций, представленных в настоящем описании, в сочетании со знанием специалиста в данной области.
После описания этого изобретения оно будет более понятным с учетом следующих примеров, которые представлены в качестве иллюстрации и не предназначены для ограничения настоящего изобретения.
Примеры
Рекомбинантные человеческие хемокины 8ΌΡ-1α и вариант 8ΌΡ-1α получали в собственной лаборатории. Кодирующие последовательности (8Εβ ΙΌ N0:1 для 8ΌΡ-1α и 8Εβ ΙΌ N0:4 для варианта 8ΌΡ-1α) клонировали в участок Ше1/ВашН1 вектора ρΕΤ20ϋ+ и экспрессировали в клетках Ε.αοΐί.
Пример 1. Активность 8ΌΡ-1 и варианта 8ΌΡ-1 в смешанных кортикальных культурах, обработанных посредством ЬР8.
Введение.
Несмотря на то что ЦНС считают иммунологически привилегированной областью, ЦНС может проявлять значительные воспалительные ответы, которые могут участвовать во множестве неврологических заболеваний. Микроглия, по-видимому, является особенно важной для инициации и поддержания воспаления в ЦНС. В нормальной ЦНС эти клетки существуют в покоящейся форме, однако после стимуляции посредством инфекции или Τ-клеток они приобретают подобные макрофагам свойства (включая активный фагоцитоз, активацию белков, необходимых для представления антигена и продукции провоспалительных цитокинов).
Это воспалительное окружение ίη νίίτο и ίη νίνο может быть имитировано липополисахаридом (ЬР8), компонентом наружных мембран грамотрицательных бактерий. ЬР8 представляет собой наиболее охарактеризованный пример врожденного распознавания, которое приводит к сильному воспалительному ответу фагоцитирующих клеток через Τοΐΐ-рецептор 4. ЬР8 широко использовали в данной области для активации микроглии в чистых культурах, кокультурах или смешанных культурах. Низкие уровни ЬР8 индуцируют высвобождение цитокинов без индукции клеточной гибели, более высокие дозы могут индуцировать дегенерацию олигодендроцитов или нейронов ίη νίίτο (ЬеНнатШ еί а1., 2002; 8аб1т еί а1., 2001) и ίη νίνο (ЬеНнатШ еί а1., 2003; 8айп еί а1., 2001).
Материалы и способы.
Получение первичных смешанных кортикальных культур.
Культивирование первичных клеток проводили, как описано (ЪиЬе1хк| еί а1., 1993), с использованием ткани головного мозга из эмбрионов, полученных от мышей ΝΜΚΙ на 16 сутки после спаривания. Полушария головного мозга извлекали из головного мозга эмбрионов, подвергали диссоциации с помощью расщепления трипсином и суспензию отдельных клеток высевали в количестве 5х104 клеток в 50 мкл миелинизирующей среды на лунку в покрытых поли-Ь-лизином 96-луночных планшетах Βίοί.'ο;·ιΙ®
- 20 015716 (356516, ВсеЮп ΩίοΚιηδοη). Миелинизирующая среда состояла из среды ВоЦспйст-ЗаЮ (ВоИспйст апб 8а1о, 1979; 8аб1г с1 а1., 2001), дополненной 1% ЕС8, 1% раствором пенициллина-стрептомицина (8сготсб) и рекомбинантным тромбоцитарным фактором роста АА (РЭСЕ-АА, Κ&Ό 8у81ст8) в концентрации 10 нг/мл.
Обработка первичных смешанных кортикальных культур посредством ЬР8: схема анализа.
Для обеспечения высвобождения цитокинов из первичных смешанных кортикальных культур, стимулированных ЬР8, культуры выращивали при 37°С и 10% СО2 в течение 14 суток, а затем стимулировали в течение 48 ч возрастающими концентрациями ЬР8 (0, 0,5, 1, 2,5, 5 нг/мл).
Через 48 ч после стимуляции ЬР8 80 мкл супернатантов собирали и замораживали при -80°С до анализа содержания в отношении:
высвобождения цитокинов (ΤΝΕ-α и 1Ь-6), анализированного посредством набора для воспаления у мышей СВА (ΒΌ Вюксшпсск 552364) 8ΌΡ-1;
8ΌΕ-1α с использованием сэндвич''-ЕЫ8А, проводимого в собственной лаборатории и описанного в настоящем описании ниже;
жизнеспособности клеток, оцениваемой с использованием анализа МТ8 (Рготсда С5421; №п-Яабюасбус Сс11 РгоНГсгаОоп Аккау, который измеряет митохондриальную активность через образование нерастворимой соли формазана, которая, как было показано, коррелирует с клеточной плотностью).
ЕЫ8А 8ϋΡ-1α.
Сэндвич''-ЕЫ8А для количественного определения уровней 8ΌΡ-1α в смешанных кортикальных культурах проводили в собственной лаборатории. Для покрытия использовали 100 мкл/лунка моноклональных антител против 8ΌΡ-1 мыши (1:500 Κ&Ό 8у81стк 1пс, Мшпсаробк, И8А), 100 мкл/лунка биотинилированного поликлонального противомышиного 1дС (1:400 Κ&Ό 8у81стк 1пс, М1ппсаро118, И8А) использовали в качестве вторичного антитела и 100 мкл/лунка конъюгированной с экстравидином пероксидазы хрена (1:5000 81дта, 8ΐ. Ьошк, МО, И8А). Рекомбинантный 8ΌΡ-1 мыши (от 2000 до 10 нг/мл Β&Ό 8у81стк 1пс, М1ппсаро118, И8А) использовали для получения стандартной кривой. Для визуализации использовали 100 мкл/лунка смеси стабилизированного пероксида водорода и тетраметилбензидина из упаковки с реагентом субстрата (Κ&Ό 8у81стк 1пс, М1ппсаро118, И8А). Оптическую плотность определяли с использованием флуоресцентного устройства для считывания планшетов (ЬаЬкукйтк МиШккап ЕХ) при 450 нм.
Эффекты 8ΌΡ-1α и варианта 8ΌΡ-1α на экспрессию цитокинов в стимулированных посредством ЬР8 культурах.
Для тестирования эффектов 8ΌΡ-1α и варианта 8ΌΡ-1α (как определено в 8ЕО ГО N0:4) на стимулированные посредством ЬР8 культуры клеткам позволяли расти в течение 2 недель. На 14 сутки клетки преинкубировали с возрастающими концентрациями (0,001, 0,1 и 10 нг/мл) соответствующих белков в 25 мкл среды в течение 3 ч при 37°С и 10% СО2. Затем к клеткам добавляли ЬР8 в концентрации 5 нг/мл в 25 мкл среды с получением конечного объема 100 мкл и инкубировали в течение 48 ч. Супернатанты собирали на 16 сутки и уровни ΤΝΕ-α и 1Ь-6 (основных цитокинов, высвобождаемых микроглией) определяли посредством специфичных ЕЫ8А, приобретенных от Р&Э (Эио8с1 ЕЫ8А ΌΥ410 для ΤΝΕ-α мыши, ЕЬ18А ΌΥ406 для 1Ь-6 мыши).
Использовали две контрольные молекулы, дексаметазон и ΣΠ-10 мыши, для которого было показано, что он ингибирует высвобождение цитокинов из активированной микроглии.
Анализ данных.
Глобальный анализ данных проводили с использованием одностороннего ΑNОVΑ. Далее использовали тест Эиппсй и данные сравнивали с данными для необработанных клеток. Был установлен следующий уровень значимости: р<0,001; Ь или **: р<0,01; с или *: р<0,05; б: р<0,1. Результаты выражали в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (к.с.т.).
Результаты.
Схема анализа.
Секрецию ΤΝΕ-α, 1Ь-6 индуцировали посредством ЬР8 в концентрации 2,5 и 5 нг/мл, и обе дозы были нетоксичными в комплексных культурах. Кроме того, различные концентрации ЬР8 (0, 0,5, 1, 2,5, 5 нг/мл) не влияли на уровни эндогенного 8ΌΕ-1α (результаты не представлены).
8ΌΕ-1α и вариант 8ΌΕ-1α.
Результаты показали, что 16-10 в концентрации 10 нг/мл и дексаметазон (25 пМ) подавляет ΤΝΕ-α и 1Ь-6 по сравнению с необработанными клетками. Как 8ΌΕ-1α, так и вариант 8ΌΕ-1α значительно снижали уровни секреции ΤΝΕ-α и 1Ь-6 в смешанных кортикальных культурах после стимуляции посредством ЕР8 по сравнению с необработанными клетками и с наибольшей концентрацией 10 нг/мл (фиг. 1А и 1В).
- 21 015716
Заключение.
Смешанные кортикальные культуры представляют собой комплексную систему, которая включает несколько типов нейроэпителиальных клеток, включая астроциты, микроглию, нейроны и олигодендроциты. Не связывающая ОАО мутантная форма 8ΌΕ-1α, вариант 8ΌΕ-1-α, приводила к снижению ТИЕ-а и 1Ь-6 аналогично 8ΌΕ-1α, что указывает на то, что мутация ОАО не влияет на связывание 8ΌΕ-1α с его рецептором СХСВ4.
Ингибирование цитокинов, наблюдаемое для 8ΌΕ-1α и варианта 8ΌΕ-1α в обработанных ЬР8 смешанных кортикальных культурах, может быть следствием прямого действия 8ΌΕ-1 на микроглию или непрямого эффекта на рецептор СХСВ4, экспрессирующий астроциты или нейроны.
В соответствии с его клиническим течением РС можно классифицировать на несколько категорий, стратифицирующих пациентов РС с различным характером активности заболевания. Пациентов с редкими обострениями, за которыми следует восстановление после их заболевания, считают имеющими доброкачественный РС. Ремитирующий РС (ВКМ8), наиболее распространенную форму РС, выявляют у 8590% пациентов с РС, и он характеризуется повторяющимися обострениями, за которыми следуют фазы восстановления с остаточными нарушениями. Атаки, вероятно, вызываются движением реактивных к миелину Т-клеток в ЦНС, вызывающих острое воспаление. С течением времени степень восстановления после обострений снижается и повышается базовая неврологическая нетрудоспособность. В конечном итоге, приблизительно у 40% пациентов с ККМ8 более не происходит атак, а развивается прогрессирующее нейродегенеративное вторичное нарушение, связанное с хроническим воспалением в ЦНС, известное как вторично-прогрессирующий РС (8РМ8) (Соийугеих е! а1., 2000). Развитие в эту вторичнопрогрессирующую форму заболевания ассоциировано со значительно менее активными очагами повреждения и снижением объема паренхимы головного мозга. Несмотря на то что ранний ККМ8 является чувствительным к иммуносупрессии, способность отвечать на иммунотерапию снижается при 8РМ8 и может даже исчезать при поздних формах. Таким образом, можно предположить, что ККМ8 и 8РМ8 являются последовательными, а не представляют собой два заболевания, где процессы острого воспаления на раннем этапе приводят к вторичной индукции нейродегенеративного процесса.
Первично-прогрессирующая форма РС (РРМ8) характеризуется отсутствием с самого начала острых атак, а вместо этого вовлекает постепенное клиническое ухудшение. Клинически, эта форма заболевания ассоциирована с отсутствием ответа на любую форму иммунотерапии. О патологии первичнопрогрессирующего рассеянного склероза известно мало, однако посмертные исследования позволяют предположить, что у этих пациентов нейродегенерация преобладает над воспалением. Интересно, что повреждение серого вещества предсказывает развитие первично-прогрессирующего РС, являясь наиболее значительным параклиническим прогнозирующим фактором для последующего ухудшения нетрудоспособности (Воуапк 2006). Активация микроглии в сером веществе может приводить к ускоренной нейрональной потере и развитию атрофии головного мозга. Таким образом, 8ΌΕ-1α и варианты 8ΌΕ-1 могут обладать потенциалом для лечения первично-прогрессирующего РС вследствие их потенциала в отношении регуляции активации микроглии и выживания нейронов. Некоторые из патофизиологических механизмов, ведущих к нейрональной потере, могут совпадать при первичной и вторичных формах РС.
Пример 2. Эффект варианта 8ΌΕ-1α на привлечение лейкоцитов в модели привлечения перитонеальных клеток 1и у1уо.
Основной ролью хемокинов является контроль миграции определенных популяций лейкоцитов в процессе воспалительных ответов и иммунного надзора. Хемокины оказывают их биологические эффекты посредством связывания с семикратно трансмембранными сопряженными с О белком рецепторами. Также они могут связывать на клеточных поверхностях как растворимые гликозаминогликаны (ОАО), так и ОАО, которые повышают локальные концентрации хемокинов, обеспечивая их олигомеризацию и способствуя их представлению рецепторам. Недавно было показано, что взаимодействие хемокинов с ОАО требуется для их хемотаксической функции ίη у1уо.
Материалы и способы.
Самкам мышей Ва1Ь/С в возрасте 8-12 недель (1аиу1ег, Егаисе) инъецировали внутриперитонеально (ί.ρ.) 200 мкл №1С1 (0,9%, без ЬР8) или хемокин 4 мкг (8ΌΕ-1α \УТ или вариант 8ΌΕ-1α в соответствии с 8ЕО ГО N0:4, разбавленные в 200 мкл №1С1 (0,9%, без ЬР8). На 4 сутки после инъекции \УТ или мутантного 8ΌΕ-1α мышей умерщвляли посредством удушения с помощью С02, брюшную полость промывали 3x5 мл ледяного РВ8 и общий лаваж объединяли для отдельных мышей. Общее количество полученных клеток подсчитывали посредством гемоцитометра (№иЬаиег, Оегтаиу).
Результаты.
8ΌΕ-1α, инъецированный внутрибрюшинно, привлекает лейкоциты. Вариант 8ΌΕ-1α не привлекает лейкоциты, указывая на то, что активность связывания ОАО ш у1уо утрачивается посредством мутации в варианте 8ΌΕ-1α (см. фиг. 2).
Заключение.
Вариант 8ΌΕ-1α (дефектная по связыванию ОАО мутантная форма 8ΌΕ-1) не показывает активности привлечения лейкоцитов ш утуо.
- 22 015716
Пример 3. Количественное определение 8ΌΕ-1α в спинном мозге при ЕАЕ (хроническом).
Введение.
Экспрессию 8ΌΕ-1α количественно определяли в спинном мозге, извлеченном из мышей, пораженных ЕАЕ, индуцированном пептидом МОО в хронической фазе. Модель экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЕАЕ) представляет собой хроническую модель демиелинизации у мышей и общепризнанную модель рассеянного склероза (РС) на животных. Используемый способ для индукции ЕАЕ у мыши адаптирован из протокола, опубликованного 8абгЬасбег е! а1. (8абгЬасбег е! а1., 1998).
Материалы и способы.
Получение образцов спинного мозга.
Спинной мозг извлекали из мышей, пораженных ЕАЕ через 4 недели после начала заболевания, т.е. появления паралича хвоста в качестве клинического признака. Мышам проводили перфузию холодным РВ8 и спинной мозг извлекали в буфер с тремя детергентами (50 мМ Тгщ, рН 8,0, 150 мМ №С1, 0,02% NаNз, 0,1% 8Ό8, 1% №шбе! Р-40, 0,5% дезоксихолат натрия), содержащий коктейль из ингибиторов протеаз (Βο^ ΜοΚαιΡίΓ Вюскеткак, 1836170, 1 таблетка на 10 мл буфера). Использовали 100 мкл буфера на 1 мг полученной ткани. Перед получением препарата посредством гомогенизации и последующим анализом образцы ткани хранили в пластмассовых пробирках ерреηбο^Γ при -20°С.
Анализ содержания 8ΌΡ-1α в спинном мозге.
Спинной мозг размораживали и гомогенизировали в буфере с тремя детергентами с использованием ρο1ν!ΐΌη. Уровни белка в образцах количественно определяли посредством анализа содержания белка ВСА (Р1егсе Βίο!^Ηηο1ο§γ, КοскΓο^б 1Ь61 105, И8А) перед анализом содержания 8ΌΡ-1α с использованием ЕЬ18А, описанным в разделе Материалы и способы примера 1, выше.
Результаты.
На фиг. 3 представлена активация 8ΌΡ-1α в ткани спинного мозга животных с ЕАЕ при хронической фазе ЕАЕ.
Заключение.
Активация белка 8ΌΡ-1α в экстрактах спинного мозга при ЕАЕ из МОО ЕАЕ в хронической фазе подтверждает роль 8ΌΡ-1α в нейровоспалении, отличную от привлечения воспалительных клеток.
Пример 4. Защитный эффект 8ΌΡ-1α на невропатию, индуцируемую повреждением седалищного нерва сдавлением.
Введение.
Настоящее исследование проводили для оценки регенерации и ремиелинизации нерва у мышей, которым вводили 8ΌΡ-1α в различных дозах. Положительный эффект 8ΌΡ-1α на выживание и регенерацию нейронов и аксонов (чувствительных и двигательных нейронов) или на миелинизацию или макрофагальное воспаление может приводить к восстановлению двигательной функции. Регенерацию можно определять по восстановлению сенсорно-моторных функций, которые можно оценивать посредством электрофизиологической регистрации.
Материалы и способы.
Животные.
Использовали 30 самок мышей С57Ь1/6 КЗ в возрасте 8 недель (Е1еуаде .Та№1ег, Ье 6еηе8ί-8ί-I81е, Егаисе). Их разделяли на 6 групп (η=6):
(a) сдавление нерва/носитель (физиологический раствор/0,02% В8А);
(b) сдавление нерва 8ΌΕ-1α (3 мкг/кг);
(c) сдавление нерва/8ОЕ-1а (10 мкг/кг);
(б) сдавление нерва/8ОЕ-1а (30 мкг/кг);
(е) сдавление нерва/8ОЕ-1а (100 мкг/кг);
(ί) сдавление нерва/ББ-6 (30 мкг/кг).
Животных содержали по группам (6 животных в клетке) и их содержали в комнате с контролируемой температурой (21-22°С) и при обратном цикле свет-темнота (12ч/12ч) с едой и водой, доступными без ограничений. Все эксперименты проводили в соответствии с установленными правилами.
Повреждение седалищного нерва.
Животным проводили анестезию посредством ингаляции 3% ΙδοΠιιηη® (Вах!ег). Правый седалищный нерв хирургически обнажали на уровне середины бедра и повреждали на 5 мм выше трифуркации седалищного нерва. Нерв сдавливали два раза в течение 30 с посредством гемостатических щипцов (толщина 1,5 мм; ^еш^; 8ί^а8Ьου^д; Бгансе) с вращением на 90° при каждом сдавлении.
Планирование экспериментов и фармакологического лечения.
Электрографическое (ЕМО) тестирование проводили один раз перед днем операции и каждую неделю в течение 3 недель после операции.
Сутки хирургической операции по сдавлению нерва считали как бр1 0 (бр1 = сутки после сдавления). В течение 4 суток после сдавления никаких тестов не проводили.
- 23 015716
Начиная со дня сдавления нерва до конца исследования 8ΌΡ-1α, 1Ь-6 или носитель вводили каждые сутки способом подкожных (з.с.) инъекций, 5 дней в неделю.
Электрофизиологическая регистрация.
Электрофизиологическую регистрацию проводили с использованием электромиографа №иготакс 2000Μ (ЕМС) (Эап1ес. Ьез И№, Ρ^аηсе). Мышам проводили анестезию посредством ингаляции 3% ЕоПигап® (Вах1ег). Нормальную температуру тела поддерживали с использованием нагретого операционного стола (Мше^е, Е81егпау, Ρ^аηсе).
Потенциал смешанного мышечного действия (СМАР) определяли в икроножной мышце после однократной стимуляции в течение 0,2 мс седалищного нерва с супрамаксимальной интенсивностью (12,8 мА). Амплитуду (мВ) и латентность (мс) потенциала действия измеряли на оперируемой лапе. Также измерение проводили на противоположной (неповрежденной) лапе у животных, которым вводили носитель (исходный уровень). Амплитуда указывает на количество активных двигательных единиц, в то время как дистальная латентность косвенно отражает проводимость по двигательному нерву и скорость нервно-мышечной передачи, которые частично зависят от степени миелинизации.
Анализ данных.
Глобальный анализ данных проводили с использованием одностороннего ΑN0VΑ. Кроме того, использовали тест Оиппей и данные сравнивали с контролем в виде носителя. Уровень значимости был установлен как а: р<0,001; Ь или **: р<0,01; с или *: р<0,05; 6: р<0,1. Результаты выражали в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (з.е.т.).
Получение электрофизиологических данных.
Амплитуда смешанного потенциала мышечного действия (фиг. 4А).
Не было выявлено значимых отличий амплитуды СМАР на протяжении исследования на противоположных (не поврежденных) лапах животных, которым вводили носитель (исходный уровень). В противоположность этому, сдавление седалищного нерва индуцировало значительно снижение амплитуды СМАР, снижающееся в группе носителя приблизительно на 80% на 6р17 и 6р115, по сравнению с соответствующими исходными уровнями. Когда мышам вводили 8ΌΡ-1α в количестве 30 мкг/кг или мкг/кг, или 1Ь-6 в количестве 30 мкг/кг, они демонстрировали повышение (приблизительно в 1,5 раза) амплитуды СМАР, по сравнению с уровнями у мышей, которым не проводили введения, и этот эффект был значимым на 15 6р1 и 22 6р1.
Латентность смешанного потенциала мышечного действия (фиг. 4В).
На протяжении исследования не происходило ухудшения латентности СМАР на противоположных (неповрежденных) лапах у животных, которым на протяжении исследования вводили носитель. В противоположность этому, в мышцах на поврежденной стороне была показана большая латентность СМАР, чем на исходном уровне. У мышей, которым вводили 8ΌΡ-1α, показатель латентности СМАР был значительно снижен по сравнению с показателем у мышей, которым вводили носитель. На 7 сутки этот эффект мог наблюдаться после введения 30 и 100 мкг/кг 8ΌΡ-1α, но не 30 мкг/кг 1Ь-6. На 15 и 22 6р1 значительный эффект все еще наблюдали при 30 и 100 мкг/кг (но не при 3 или 10 мкг/кг) 8ΌΡ-1α. 8ΌΡ-1α (30 мкг/кг) является более эффективным, чем 1Ь-6 (30 мкг/кг).
Заключение.
Модель сдавления нервов является очень эффективной моделью травматического повреждения нерва и периферической невропатии. Непосредственно после сдавления нерва большинство волокон, имеющих большой диаметр, утрачивается вследствие механического повреждения, что приводит к устойчивому снижению амплитуды СМАР. Латентность СМАР не сразу нарушается, однако снижается через 15 суток вследствие дополнительной дегенерации волокон небольшого диаметра посредством вторичной опосредуемой иммунной системы дегенерации (макрофаги, гранулоциты). Длительность СМАР повышается на 7 6р1 и достигает пика на 15 6р1.
8ΌΡ-1α сохраняет функцию после сдавления периферического нерва (латентность СМАР). Также он показал защитный эффект в модели сдавления нерва у мышей по всем определяемым параметрам. В заключение, 8ΌΡ-1α был настолько же эффективен, как и эталонная молекула, используемая в этом исследовании, 1Ь-6.
Пример 5. Защитный эффект варианта 8ΌΡ-1α на невропатию, индуцируемую сдавлением седалищного нерва.
Модель сдавления седалищного нерва, описанную в примере 4, проводили для тестирования варианта 8ΌΡ-1α, как определено в 8ЕО ΙΌ N0:4, и мышей разделяли на следующие 2 группы (п=6):
(a) сдавление нерва, оперированные/носитель (физиологический раствор/0,02% В8А);
(b) сдавление нерва/вариант 8ΌΡ-1α в количестве 30 мкг/кг подкожно.
Показатели, зарегистрированные на противоположной лапе животных, которым вводили носитель, рассматривали как исходные показатели.
Вариант 8ΌΡ-1α, используемый в этом примере и кодируемый 8ЕО ΙΌ N0:4, экспрессировался с дополнительным ^концевым метионином. Также регистрировали длительность СМАР (время, требуемое для деполяризации и реполяризации).
- 24 015716
Результаты.
Получение электрофизиологических данных.
Амплитуда смешанного потенциала мышечного действия (фиг. 5А).
Значительное повышение амплитуды СМАР было показано на 22 бр1, когда мышам вводили вариант 8ΌΡ-1α.
Латентность смешанного потенциала мышечного действия (фиг. 5В).
У мышей, которым вводили вариант 8ΌΡ-1α, величина латентности СМАР была значительно снижена по сравнению с одной из мышей, которым вводили носитель, особенно на 7 бр1. Положительный эффект все еще получали на 22 бр1.
Длительность смешанного потенциала мышечного действия (фиг. 5С).
У мышей, которым вводили вариант 8ΌΡ-1α, величина длительности СМАР была снижена по сравнению с одной из мышей, которым вводили носитель, на 7 бр1 и 22 бр1.
Заключение.
Было показано, что вариант 8ΌΡ-1α восстанавливает функцию после сдавления периферического нерва (латентность СМАР). Также он показал защитный эффект в модели сдавления нерва на мышах по всем измеряемым параметрам.
Пример 6. Защитный эффект Ме(-8ОР-1 α на невропатию, индуцированную сдавлением седалищного нерва.
Модель сдавления седалищного нерва, описанную в примере 4, проводили для тестирования Ме1-8ОР-1 α (как определено в 8Ε0 Ш N0:7) и мышей разделяли на следующие 2 группы (и=6):
(a) сдавление нерва, оперированные/носитель (физиологический раствор/0,02% В8А);
(b) сдавление нерва/вариант Меΐ-8^Ρ-1α в количестве 100, 30 и 10 мкг/кг подкожно.
Показатели, зарегистрированные на противоположной лапе животных, которым вводили носитель, рассматривали в качестве исходных показателей.
Также регистрировали длительность СМАР (время, требуемое для деполяризации и реполяризации).
Результаты.
Регистрация электрофизиологических данных.
Латентность смешанного потенциала мышечного действия (фиг. 6).
У мышей, которым вводили Меΐ-8^Ρ-1α, показатель латентности СМАР был значительно снижен на 7 сутки и 14 сутки после сдавления по сравнению с одной из мышей, которой вводили носитель.
Заключение.
Было показано, что Ме1-80Р-1 α восстанавливает функцию после сдавления периферического нерва (латентность СМАР), а также 8ΌΡ-1α.
Пример 7. Защитный эффект 8ΌΡ-1α при диабетической невропатии.
Введение.
Диабетическая невропатия представляет собой наиболее распространенное хроническое осложнение диабета. В ее основе лежит множество механизмов, и, по-видимому, они вовлекают несколько взаимосвязанных метаболических нарушений, являющихся следствием гипергликемии и дефицита инсулина и С-пептида. Наиболее распространенным ранним нарушением, указывающим на диабетическую невропатию является бессимптомная дисфункция нерва, отражаемая сниженной скоростью проведения по нерву (Эуск аиб Эуск. 1999). После этих изменений, как правило, происходит снижение вибрационной чувствительности в ногах и снижение ахиллова рефлекса. Регистрация электрофизиологических данных часто очень точно отражает исходную патологию, и изменения проводимости нерва коррелируют с миелинизацией нервных волокон (для обзора, см. 81та, 1994).
Крысы с диабетом вследствие стрептозотоцина (8ΤΖ) представляют собой наиболее широко изученную модель диабетической невропатии на животных. Она приводит к острому снижению кровоснабжения нерва (40%) и замедлению скорости проведения по нерву (20%) (Сатегои е! а1., 1991), с последующей аксональной атрофией нервных волокон (1акоЬ8еи, 1976). При длительном диабете выявляют демиелинизированные и подвергшиеся дегенерации миелинизированные волокна, а также аксоглиальную дисфункцию (81та е! а1., 1988).
Главной целью настоящего исследования является изучение потенциального нейропротективного и гиального защитного эффекта 8ΌΡ-1α на развитие диабетической невропатии у крыс 8ΤΖ.
Материалы и способы.
Животные.
Самцов крыс 8ргадие Эа^1еу в возрасте 8 недель (1аиу1ег, Ье Семей 8айИ Ые, Ρ^аηсе) случайным образом распределяли на 6 экспериментальных групп (и=10), как показано ниже.
- 25 015716
Таблица IV
Группа (п=10) Лекарственные средства Способы введения Период введения (сутки после 3ΤΖ)
Контроль/Носитель Носитель раз в сутки подкожно с 11 по 40
3ΤΖ/Носитель Носитель раз в сутки подкожно с 11 по 40
ΞΤΖ/50Ε-1α (10 мкг/кг) 50Е-1И раз в сутки подкожно с 11 по 40
3ΤΖ/3ΟΓ-1α (30 мкг/кг) ΞΏΕ-Ια раз в сутки подкожно с 11 по 40
5ΤΖ/8ϋΕ-1α (100 мкг/кг) ΞΟΓ-Ιοί раз в сутки подкожно с 11 по 40
5ΤΖ/ΙΕ-6 (10 мкт/кг) ΙΙ1-6 раз в сутки подкожно с 11 по 40
Их содержали по группам (3 животных на клетку) и содержали в комнате с контролируемой температурой при обратном цикле свет-темнота (12 ч/12 ч) с едой и водой, доступными без ограничений. Все эксперименты проводили в соответствии с установленными правилами.
Индукция диабета и фармакологическое лечение.
Диабет индуцировали внутривенной инъекцией буферного раствора стрептозотоцина (81дта, Ь'Ые б'АЬеаи Сйезпез, Егапсе) в дозе 55 мг/кг. 8ΤΖ изготавливали в цитратном буфере с концентрацией 0,1 моль/л, рН 4,5. В контрольной группе вводили эквивалентный объем цитратного буфера. Сутки инъекции 8ΤΖ рассматривали как Ό0.
На Ό10 после 8ΤΖ проводили мониторинг гликемии для каждого животного отдельно. Животных, у которых было показано значение ниже 260 мг/дл, исключали из исследования.
Введение 8ΌΕ-1α, 1Ь-6 или соответствующего им носителя проводили каждые сутки от Ό11 до Ό40. 8ΌΕ-1α и 1Ь-6 изготавливали в физиологическом растворе (0,9% ЫаС1), содержащем 0,02% В8Л. Планирование экспериментов: сутки -7: исходный уровень (ЕМС);
сутки 0: индукция стрептозотоцином;
сутки 7: мониторинг гликемии;
сутки 11: начало введения;
сутки 20: тест νοη Егеу;
сутки 25: мониторинг посредством ЕМС;
сутки 40: мониторинг посредством ЕМС и теста НР 52°С;
сутки 41: забор образцов биоптатов седалищных нервов и кожи для гистоморфометрического анализа.
Электромиография.
Электрофизиологическую регистрацию проводили с использованием электромиографа (Кеурош!, МеЛгошс, Вои1одпе-ВШапсоиг1, Егапсе). Крысам проводили анестезию посредством внутрибрюшинной инъекции (1Р) 60 мг/кг кетамина хлоргидрата (1та1депе 500®, В1юпе Мепеих, Ьуоп. Егапсе) и 4 мг/кг ксилазина (Вотрит 2%, Вауег Р1агта, К1е1, Сегтапу). Нормальную температуру организма поддерживали при 30°С с помощью нагревательной лампы и контролировали посредством контактного термометра (Ошск. ВюЫоск ЗаепйДс, П1к1гсН, Егапсе), помещенного на поверхность хвоста.
Смешанный потенциал мышечного действия (СМАР) регистрировали в икроножной мышце после стимуляции седалищного нерва. Контрольный электрод и активную иглу помещали на заднюю лапу. Заземленную иглу вводили в нижнюю часть спины крысы. Седалищный нерв стимулировали однократным импульсом в течение 0,2 мс с супрамаксмиальной интенсивностью. Регистрировали скорость двигательной волны.
Регистрировали скорость проведения по чувствительному нерву (8Νθν). Электроды на коже хвоста помещали следующим образом: контрольную иглу вводили в основании хвоста и иглу анода вводили на расстоянии 30 мм от контрольной иглы в направлении конца хвоста. Заземленный игольчатый электрод помещали между анодом и контрольными иглами. Хвостовой нерв стимулировали серией из 20 импульсов (по 0,2 мс) с интенсивностью 12,8 мА. Скорость выражали в м/с.
- 26 015716
Морфометрический анализ.
Морфометрический анализ проводили в конце исследования. Животным проводили анестезию посредством внутрибрюшинной инъекции 60 мг/кг [та1деие 500®. Для гистологического исследования вырезали 5-мм сегмент седалищного нерва. Ткань фиксировали в течение ночи 4% раствором глутаральдегида (81дта, Ь'Ые й'ЛЬеаи-СЬекиеБ, Егаисе) в растворе фосфатного буфера (рН 7,4) и содержали в 30% сахарозе при 4°С до применения. Образец нерва фиксировали в 2% растворе тетроксида осмия (81дта) в растворе фосфатного буфера в течение 2 ч, дегидратировали в серийном растворе спирта и погружали в Ероп. Затем погруженные ткани помещали на 70°С в течение 3 суток для полимеризации. Поперечные срезы толщиной 1,5 мкм получали с использованием микротома. Их окрашивали 1% раствором толуидина синего (81дта) в течение 2 мин, дегидратировали и помещали в ЕикФ.
Анализ проводили по всей поверхности среза нерва с использованием программного обеспечения для полуавтоматического цифрового анализа изображения (Вюсот, Егаисе). После удаления посторонних объектов программное обеспечение выдает данные об общем количестве миелинизированных волокон. Затем лаборант вручную подсчитывал количество подвергшихся дегенерации волокон. Миелинизированные волокна без аксонов, избыточный миелин и волокна, обладающие оболочками со слишком большой толщиной относительно их аксонального диаметра, рассматривали как волокна, подвергшиеся процессам дегенерации. Количество не подвергшихся дегенерации волокон получали вычитанием количества подвергшихся дегенерации волокон.
Морфологический анализ проводили только для волокон, считающихся не подвергшимися дегенерации. Для каждого волокна размеры аксонов и миелина были представлены в виде площади поверхности (мкм2). Эти два параметра использовали для вычисления эквивалентной площади в виде д-соотношения (аксональный диаметр/диаметр волокна) для каждого волокна (т.е. [А/(А+М)]0,5, А - площадь аксонов, Μ - площадь миелина), указывающего на относительную толщину миелиновой оболочки.
Кроме того, с помощью щипцов получали биопсию участка кожи из задней лапы диаметром 5-10 мм. Образцы кожи сразу фиксировали в течение ночи в параформальдегиде при 4°С, инкубировали (в течение ночи) в 30% сахарозе в 0,1 М РВ8 для криопротекции, погружали в ОСТ и замораживали при -80°С до разрезания на криотоме.
Затем делали криосрезы толщиной 50 мкм перпендикулярно поверхности кожи с помощью криостата. Свободно плавающие срезы инкубировали в течение 7 суток в бане с антителом кролика против белкового продукта гена 9.5 (1:10000; и1!гас1оие, Ые оГ Маи, ИК) при 4°С. Затем срезы обрабатывали для выявления иммунореактивности в соответствии со способом с АВС-пероксидазой. В кратком изложении, их инкубировали в течение 1 ч с биотинилированным антителом против антител козы (1:200), а затем в течение 30 мин в биотинилированном комплексе авидина при комнатной температуре. Активность пероксидазы визуализировали с использованием системы ΌΑΕ. Срезы контрастно окрашивали эозином и гематоксилином. Срезы подвергали дегидратации, очищали посредством Ыос1еаг и помещали на еикШ. Фотографии микроскопических полей получали при 20 х увеличении с использованием цифровой камеры №кои с фокусным расстоянием 12,9 мм. Количество интраэпидермальных нервов в 3 микроскопических полях с размером каждого 0,22 мкм2 (544x408 мкм) подсчитывались экспериментатором на экране компьютера.
Анализ данных.
Глобальный анализ данных проводили с использованием однофакторного дисперсионного анализа или дисперсионного анализа с повторяющимися измерениями (ΑΝΟνΑ) и одностороннего ΑΝΟνΑ. Когда ΑΝΟνΑ показывал значимые различия, использовали защищенный критерий наименьших статистических различий Фишера в качестве последующего теста для сравнения экспериментальных групп в группе диабетических крыс, которым вводили носитель. Уровень значимости был установлен как р<0,05. Результаты выражают в качестве среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения (к.е.т.).
Результаты.
Масса тела.
В противоположность недиабетическим крысам, демонстрирующим прогрессирующий рост, диабетические крысы демонстрируют значимую остановку роста (фиг. 7Α).
Введение 8ΌΡ-1α или ГЬ-б было ассоциировано с небольшим, но значимым повышением массы тела у диабетических крыс, которым вводили носитель.
Гликемия.
На 7 сутки после 8ΤΖ у всех крыс, которым вводили 8ΤΖ, была показана гликемия, в 5 раз превышающая гликемию контрольных крыс (фиг. 7В).
- 27 015716
Регистрация электрофизиологических данных.
1. Латентность смешанного потенциала мышечного действия.
Латентность СМАР была значимо увеличена по сравнению с диабетическими крысами на Ό25 по сравнению с латентностью у недиабетических крыс (фиг. 7С). Введение δΌΡ-1α или ГБ-6 индуцировало значимое снижение латентности СМАР диабетических крыс по сравнению с латентностью у крыс, которым вводили носитель.
Сходный профиль результатов наблюдали на Ό40 после δΤΖ.
2. Скорость проведения по чувствительному нерву.
На Ό25 диабетические крысы, которым вводили носитель, демонстрировали значимо сниженный 8NСV по сравнению с недиабетическими крысами (фиг. 7Ό). Введение δΌΡ-1α или ГБ-6 значимо повышает показатели 8NСV у диабетических крыс. Наилучший эффект наблюдали при введении доз 10 и 30 мкг/кг, и он был сравним с эффектом, обусловленным введением ΙΕ-6.
Сходный профиль результатов наблюдали на Ό40 после 8ΤΖ.
Морфометрический анализ
1. д-соотношение (относительная толщина миелина).
д-соотношение для диабетических крыс, которым вводили носитель, было значимо повышено по сравнению с соотношением для недиабетических крыс (фиг. 7Е), что подтверждает уменьшение толщины миелиновой оболочки у диабетических крыс. Введение диабетическим крысам δΌΡ-1α значимо снижало д-соотношение по сравнению с группой δΤΖΑ/носитель, особенно в дозах 10 или 30 мкг/кг. В дозе 100 мкг/кг снижение величины д-соотношения не достигало значимого уровня.
Введение ΙΕ-6 также индуцировало значимое снижение величины д-соотношения.
2. Количество подвергшихся дегенерации волокон.
Диабетические крысы, которым вводили носитель, показывали значимо более высокую долю подвергшихся дегенерации волокон по сравнению с недиабетическими крысами (фиг. 7Р). Напротив, доля не подвергшихся дегенерации волокон у диабетических крыс была значимо снижена по сравнению с долей у недиабетических крыс (фиг. 7Р). Введение диабетическим крысам δΌΡ-1α показало снижение совокупности подвергшихся дегенерации волокон. Наилучший эффект был ассоциирован с наименьшей применяемой дозой (10 мкг/кг) и достигал уровня значимости.
Значимо сниженную совокупность подвергшихся дегенерации волокон также наблюдали у диабетических крыс, которым вводили ΙΕ-6.
Как представлено на фиг. 7С, диабетические крысы, которым вводили носитель, показывали значимо сниженную плотность интраэпидермальных нервных волокон по сравнению с недиабетическими крысами. Введение диабетическим крысам δΌΡ-1α было ассоциировано со значимо большей плотностью нервных волокон кожи по сравнению с введением носителя. Выявленный эффект был сравним с эффектом, индуцированным введением ΙΕ-6.
Заключение.
В настоящем исследовании авторы изобретения хотели оценить нейральный и глиальный защитный эффекты δΌΡ-1α на связанную с диабетом невропатию. Исследования проводили на индуцированной δΤΖ невропатии, сходной с диабетической невропатией, у крыс. Аналогично клиническим условиям диабетической невропатии, проводимость по поврежденному чувствительному нерву, выявляемая уже на 7 сутки после δΤΖ, является первым признаком, указывающим на начало невропатии в этой модели, что согласуется с данными о демиелинизации и/или аксональной дегенерации, выявляемыми в более поздние моменты времени (Ап6патЬе1о5оп е1 а1., 2006).
В предшествующем исследовании было показано, что введение δΤΖ-крысам низкой дозы ΙΕ-6 препятствовало прогрессированию невропатии в этой модели, не препятствуя развитию гликемии (Ап61татЬе1о5Оп е1 а1., 2006). В настоящем исследовании авторы выявили, что длительное введение 8ΌΡ1α (10, 30 и 100 мкг/кг) повышает сенсорно-моторные показатели у диабетических крыс (показатели латентности δNСV и СМАР) в течение приблизительно 2 недель введения. Наилучший эффект получали в случае дозы для введения 10 или 30 мкг/кг, показывая сравнимую эффективность с 10 мкг/кг ΙΕ-6. Кроме того, было выявлено, что введение δΌΡ-1α в этих дозах значительно препятствует потере миелина, ассоциированной с этой моделью. Поскольку качество миелиновой оболочки является важным для оптимального проведения по нерву, сохранение размера миелиновой оболочки может, фактически, частично объяснить улучшения функции нервов у диабетических крыс, которым вводили δΌΡ-1α. Более того, также было выявлено, что δΌΡ-1α снижает количество волокон, подвергшихся аксональной дегенерации в седалищном нерве.
Аналогично клиническим параметрам диабетической невропатии, показывающим корреляцию между наличием и тяжестью невропатии и дегенерацией интраэпидермальных нервных волокон из биоптата кожи (Неггтапп е1 а1., 1999; διηίΐΐι е1 а1., 2001), индуцированная посредством δΤΖ диабетическая невропатия у крыс также показывает, что клинические признаки невропатии в этой модели на животных строго коррелируют со снижением плотности интраэпидермальных нервных волокон. В соответствии с представленными выше открытиями настоящее исследование показало, что диабетические крысы, кото
- 28 015716 рым вводили носитель, показывают значительное снижение интраэпидермальной плотности нервных волокон. Этому эффекту заметно препятствовало введение 3ΌΡ-1α или 1Ь-6 и, таким образом, далее подтверждался нейропротективный эффект 3ΌΡ-1α относительно индуцируемого диабетом повреждения нерва.
Взятые вместе, описанные выше открытия указывают на нейропротективный эффект введения 3ΌΡ-1α в модели диабетической невропатии у крыс. 3ΌΡ-1α является интересным кандидатом для разработки терапии клинической диабетической невропатии.
Пример 8. Защитный эффект 3ΌΡ-1α при невропатической боли.
Введение.
Наиболее частым отягчающим фактором невропатической боли является диабет, особенно когда контроль глюкозы в крови является слабым. Приблизительно 2-24% пациентов с диабетом испытывают невропатическую боль. Диабетическая невропатическая боль может происходить либо спонтанно, в результате воздействия в норме умеренно болезненных стимулов (т.е. гиперальгезии), или в результате стимулов, которые в норме не воспринимаются как болезненные (т.е. аллодинии). Множество аномалий восприятия боли было показано в модели со стрептозотоцином (Ноипкот ап' Тотйпкоп, 1997) на ранней стадии диабета. Например, вызываемое формалином вздрагивание усиливается у ЗТ2-крыс по сравнению с контрольными животными. Кроме того, для этой модели диабета на животных описано развитие тактильной аллодинии (Са1си11 е! а1., 1995, 1996). На более поздней стадии, когда гипергликемия продолжается (В1апсЫ е! а1., 2004), в качестве аномалии поведения у диабетических крыс описано удлинение порога на нагретой плите.
Материалы и способы.
Животные.
Самцов крыс Зргадие Оа\\'1еу в возрасте 8 недель (1а№1ег, Ье Сепек! ЗайИ 1к1е, Ргапсе) случайным образом распределяли в 6 экспериментальных групп (п=10), как представлено ниже.
Таблица V
Группа (п=10) Лекарственные средства Способы введения Период введения (сутки после 3ΤΖ)
Контроль/Носитель Носитель раз в сутки подкожно с 11 по 40
ЗТг/Носитель Носитель раз в сутки подкожно с 11 по 40
3ΤΖ/30Γ-1α (10 мкг/кг) 50Г-1а раз в сутки подкожно с 11 по 40
8ΤΖ/3ΟΓ-1α (30 мкг/кг) 5ΌΙΓ-Ια раз в сутки подкожно с 11 по 40
зтг/зог-га (100 мкг/кг) ΞΟΗ’-Ιο раз в сутки подкожно с 11 по 40
3ΤΖ/Ι1-6 (10 мкг/кг) 1Ъ-6 раз в сутки подкожно с 11 по 40
Их содержали по группам (3 животных на клетку) и содержали в комнате с контролируемой температурой (21-22°С) и обратным циклом свет-темнота (12 ч/12 ч), с едой и водой, доступными без ограничений. Все эксперименты проводили в соответствии с установленными правилами.
Индукция диабета и фармакологическое лечение.
Диабет индуцировали посредством внутривенной инъекции буферного раствора стрептозотоцина (З1дта, Ь’1к1е '’АЬеаи Сйекпек, Ргапсе) в дозе 55 мг/кг. 3ΤΖ получали в цитратном буфере в концентрации 0,1 моль/л, рН 4,5. В контрольной группе вводили эквивалентный объем цитратного буфера. Сутки инъекции 3ΤΖ рассматривали как Ό0.
На Ό10 после 3ΤΖ проводили мониторинг гликемии для каждого животного отдельно. Животных, показывающих значение ниже 260 мг/дл, исключали из исследования.
Введение 3ΌΡ-1α, 1Ь-6 или соответствующего им носителя проводили один раз в сутки с Ό11 по Ό40.
3ΌΡ-1α и 1Ь-6 получали в физиологическом растворе (0,9% ЫаС1), содержащем 0,02% ВЗА.
Планирование экспериментов:
сутки 0: индукция стрептозотоцином;
сутки 7: мониторинг гликемии;
- 29 015716 сутки 11: начало лечения;
сутки 20: тест νοη Егеу;
сутки 40: ЕМО-мониторинг и тест ΗΡ 52°С.
Тест с нитью νοη Егеу.
Крысу помещали на поверхность металлической сетки. Ноцицептивное тестирование проводили, вставляя нить νοη Егеу (ВюкеЬ, Егапсе) через поверхность сетки и прикладывая ее к подошвенной поверхности задней лапы. Исследование состояло из нескольких прикладываний различных нитей νοη Егеу (с частотой 1-1,5 с). Использовали нити νοη Егеу массой от 10 до 180 г. Давление, которое приводит к отрывистому отдергиванию задней лапы, рассматривали как пороговое значение. Предельное значение было установлено как 180 г.
Тест с нагретой до 52°С плитой.
Животное помещали в стеклянный цилиндр на горячей плите, нагретой до 52°С. Регистрировали латентность первой реакции (облизывание, оживленное движение лап, небольшие скачки или прыжки для избегания тепла) с предельным временем 30 с.
Результаты.
Нить νοη Егеу.
На 20 сутки после 8ΤΖ диабетические крысы, которым вводили носитель, показывали значительно более низкий порог в тесте νοη Егеу, чем недиабетические крысы (фиг. 8А).
Введение 8ЭЕ-1а или ΙΕ-6 индуцировало значимое повышение порогового значения у диабетических крыс по сравнению с показателем у диабетических крыс, которым вводили носитель. Пороговые значения у крыс, которым вводили 8ЭЕ-1а или ΙΕ-6, статистически не отличались от значений у недиабетических крыс.
Тест с нагретой до 52°С плитой.
На Ό40 после 8ΤΖ диабетические крысы, которым вводили носитель, демонстрировали значительно более высокую пороговую латентность в тесте с нагретой плитой по сравнению с недиабетическими крысами (фиг. 8В).
Введение диабетическим крысам 8ЭЕ-1а или ΙΕ-6 значимо снижало пороговую латентность диабетических крыс до уровня, статистически сравнимого с уровнем у недиабетических крыс.
Заключение.
Поведение крыс в ответ на нить νοη Егеу (механическую стимуляцию) и нагревание (52°С) оценивали на Ό20 и Ό40 соответственно. В этих двух тестах у диабетических крыс, которым вводили 8ЭЕ-1а, было отчетливо показано отличие в поведении по сравнению с крысами, которым вводили носитель, и их показатели были сравнимы с показателями у недиабетических крыс.
Эти результаты, по-видимому, согласуются с электрофизиологическими и гистологическими данными и подтверждают, что 8ЭЕ-1 α может оказывать также защитное действие при невропатической боли.
Пример 9. Генетическая ассоциация между геном 8ЭЕ-1 и первичным прогрессирующим РС.
Материалы и способы.
Коллекции пациентов и контролей.
Исследование содержало одну коллекцию от неродственных пациентов с первичным прогрессирующим РС (М8РР). Все субъекты в исследовании представляли собой европеоидов из Италии. Пациенты и контроли из Сардинии были исключены.
Авторы настоящего изобретения включили в исследование 197 пациентов с прогрессирующим течением. У 141 пациента неврологические симптомы прогрессировали с начала заболевания, без обострений (первично-прогрессирующая форма); у 39 пациентов было прогрессирующее течение с сопутствующими обострениями (прогрессирующая ремитирующая форма); у 17 пациентов было прогрессирующее течение, начинающееся через много лет после отдельной атаки (прогрессирующая форма с одной атакой). Контрольная группа включала 234 неродственных здоровых контролей той же этнической принадлежности, что и популяция больных.
В группе больных соотношение полов составляло 1,05 (101 женщина и 96 мужчин), а средний возраст в начале исследования - 39,2 [19-65] лет. Группа контролей включала 234 индивидов с соотношением полов 1,03 (119 женщин и 115 мужчин) и средним возрастом 40,4 [19-70] лет.
Генотипирование.
Способы полного геномного анализа: способ ΛΓΓутеι^^x.
250 нг (5 мкл) ДНК из каждого образца расщепляли параллельно 10 единицами ферментов рестрикции №р Ι и 81у Ι (№\ν Е^Ипй ВюЫЬ^ Веует1у, МА) в течение 2 ч при 37°С. Затем с расщепленными концами лигировали специфичные к ферменту адапторные олигонуклеотиды посредством ДНК-лигазы Т4 в течение 3 ч при 16°С. После разбавления водой 5 мкл разбавленных реакционных смесей для лигирования подвергали ПЦР. ПЦР проводили с помощью ДНК-полимеразы Тйашит Тад (ΒΌ Вю8С1спсс8, 8ηη 1ο^, СА) в присутствии 25 мкМ праймера для ПЦР 002 (МАтейях), 350 мкМ каждого й№ТР, 1 М бетаина (И8В, С1сус1эпй, 0Η) и 1Х буфера для ПЦР Тйашит Тад (ВЭ Вю5С1спсс5).
- 30 015716
Параметры цикла были следующими: первоначальная денатурация при 94°С в течение 3 мин, амплификация при 94°С в течение 30 с, при 60°С в течение 30 с и удлинение при 68°С в течение 15 с, повторяющиеся 30 раз, конечное удлинение при 68°С в течение 7 мин. Продукты ПЦР из трех реакционных смесей объединяли и очищали с помощью 96-луночных ИЕ-планшетов для очистки после ПЦР М1иЕ1и1е (Р1адеп, Уа1епс1а, СА) в соответствии с рекомендациями изготовителя. Образцы собирали в пробирки для микроцентрифуги и центрифугировали при 16000/д в течение 10 мин. Очищенный продукт выделяли из пробирки, обращая особое внимание на то, чтобы не повредить белый гелеобразный осадок фосфата магния. Затем продукты ПЦР проверяли по миграции со. средним размером между 200-800 п.н. с использованием гель-электрофореза с 2% ТАЕ. Затем 60 мкг очищенных продуктов ПЦР фрагментировали с использованием 0,25 единиц ДНКазы I при 37°С в течение 35 мин. Полную фрагментацию продуктов до среднего размера менее чем 180 п.н. проверяли с использованием гель-электрофореза с 2% ТАЕ. После фрагментации ДНК метили на конце 105 единицами терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы при 37°С в течение 2 ч. Затем меченую ДНК гибридизовали на соответствующей матрице Меп'е1 при 49°С в течение 18 ч при 60 об/мин. Гибридизованную матрицу промывали, окрашивали и сканировали в соответствии с инструкциями изготовителя (АГГутеГлх).
Данные о генотипах получали с использованием алгоритма ΌΜ со значением р.33, с последующим анализом партий с использованием алгоритма ВКЕММ, в соответствии с описаниями АГГуте!пх.
8№-фильтрация.
8ΝΓ фильтровали с помощью следующих критериев:
показатель пропущенных генотипов должен составлять <5%; минимальная аллельная частота (МАЕ) должна составлять 1% в контролях; вероятность несоответствия равновесию Харди-Вайнберга должна составлять <2% в контролях; 8ΝΓ должен быть полиморфным у больных.
Только 8ΝΓ из аутосомных хромосом оставляли для анализа.
Статистический анализ.
Способ.
ΕΌΒ (показатель ложных результатов) оценивали с помощью 10000 перестановок с последующими одномерными тестами (с использованием точных тестов со статистикой Пирсона) для каждой популяции:
аллельный тест;
генотипический тест;
минимум аллельного и генотипического теста (сокращаемый как тш); максимум аллельного и генотипического теста (сокращаемый как тах). Результаты.
8МР-фильтрация и охват генома.
Применение фильтров, определенных выше, снижало количество оставшихся 8ΝΓ, как представлено в табл. VI.
Таблица VI
Сканирование общее # 3ΝΡ #5Ы₽ после фильтрации % оставшихся
Больные МЗРР 497,641 323,664 65%
против
Контролем для
РС
ΕΌΒ.
Результаты ΕΌΒ представлены на фиг. 9.
При пороге ΕΌΒ 10% 8ΝΓ и гены выбирали, как представлено в табл. VII.
Таблица VII
Сканирование #5ΝΡ #ΒΙΝ # генов # пустот
МБРР против контролем 78 72 62 10
В гене 8ΏΕ-1 (СХСЬ12) выбрали один 8ΝΤ (8ΝΓ _А-2185631) (см. фиг. 10).
Рассматривая таблицы сопряжения, можно видеть, что ассоциация является следствием дифференциального распределения аллеля С в группах больных и контролей.
- 31 015716
Таблица УШ
МЗРР против контролей
Генотипы Больные Контроли
СС 2,2% 0,0%
С6 22,8% 7,4%
ОС 75,0% 92,6%
Детальный биологический анализ участка в области этого 8Ν6 показывает, что он расположен в интроне недавно открытых новых изоформ 8ΌΕ-1, как описано ниже.
В соответствии с ЕпкетЬ1, где идентифицированы только две изоформы 8ΌΕ-1α и 8ΌΕ-1β, 8ΝΓ-Λ-2185631 расположен на 25 т.п.н. ниже гена 8ΌΕ-1 (также известного как СХСБ12). Нет генов, расположенных ближе к 8ИР_А-2185631.
8ΌΕ-1 расположен на 10-й хромосоме (44192517-44200551, конструкция NСВI 35), и он охватывает 8 т. п. н.
Аннотация геномной последовательности представлена для того, чтобы знать, может ли 8№_А-2185631 быть связан с геном 8ΌΕ-1 или с другим соседним геном.
В базах данных последовательностей были открыты варианты по сплайсингу, не описанные в ЕпкетЬ1: 8ΌΕ-1γ, 8ΌΕ-15, 8ΌΕ-1ε и 8ΌΕ-1φ. Все варианты по сплайсингу обладают одинаковыми первыми 3 экзонами. Последний экзон 8ΌΕ-1ε и 8ΌΕ-1φ расположен на 72 т.п.н. ниже (см. фиг. 11). Эти новые последовательности были представлены в NСВI в июне 2006 г. Ь111у ВекеагсН ЬаЬога1опек, Сатбюуакси1аг Όίνίδίοη, Сапсег Όίνίδίοη апб НйедгаНуе Вю1оду, ЕИ Ы11у и Сотрапу, ШФапароШ, ΙΝ 46285, И8А. кДНК (БО345520 и БО345519), кодирующая эти две изоформы, содержит канонические точки сплайсинга, сигнал полиаденилирования и поли-А-хвост (не встречающийся в геномной последовательности).
Вследствие того что все варианты по сплайсингу обладают одинаковыми первыми тремя экзонами, 6 изоформ обладают одинаковой Ν-концевой частью (88 аминокислот).
Таким образом, детальный биологический анализ области вокруг 8NР_А-2185631 показалследующее:
ген 8ΏΕ-1 является более длинным, чем ожидалось: 87 т.п.н. вместо 8 т.п.н;
представляющий интерес 8Ν6 (8№_А-2185631) расположен в гене 8ΏΕ-1, в последнем интроне 8ΏΕ-1ε и 8ΏΕ-1φ (см. фиг. 12).
Таким образом, можно сделать вывод, что ген 8ΏΕ-1 ассоциирован с первично-прогрессирующим РС.
Ссылки
1. Апбг1атЬе1окоп, Е., ВаШе1, С., У1йе, Р.А., Сатойа, С., Бтеапо, М., СаШхок Ν. (2006). ΙπΝΓΒιι1<ίι·ι-6 айепиакек (Не беуе1ортепк о£ ехрептеп(а1 б1аЬе(ек-ге1а(еб пеигораШу. №игора(Но1оду. 26, 32-42.
2. Айксйи1, 8.Ε., С18Ь, V., МШет, Х., Муегк, Е.Х., апб Ыртап, БЭ. (1990). Вакю 1оса1 аНдптеп( кеагсН 1оо1. 1. Мо1. Вю1. 215, 403-410.
3. Айксйи1, 8.Ε., Маббеп, Т.Ь, 8сйаЕГег, А.А., 2йапд, 1., 2йапд, Ζ., МШет, Х., апб Ыртап, Б.Т (1997). Сарреб ВБА8Т апб 68^^8^ а пе\у депетайоп о£ рго(ет бакаЬаке кеагсН ргодгатк. №1с1ею. Ас1бк Век. 25, 3389-3402.
4. Атага, А., Ьогйюи·, О., Уа1епхие1а, А., Мадегик, А., ТНе1еп, М., Мопкек, М., УпеШкег, 1.Б., Ое1ер1етте, М., Ва1еих, Ε., Ьойак-1асоЬ, Н., апб Атепхапа-8е1кбебок, Ε. (1999). 8йота1 се11-бепуеб Гас(ог-1а1рНа аккошакек \\ЙН Нерагап ки1Га(ек (НгоидН (Не Пгк1 Ье)а-кйапб о£ (Не сНетокте. 1. Вю1. СНет. 274, 23916-23925.
5. АтЬгоыш, Е., ВетоН, М.Е., С1асотш1, Е., ВокюатеШ, В., 8егаГ1ш, В., Ьапбе, В., А1о1К1, Ε., апб Сосаа, Е.М. (2005). Акктосукек ргобисе бепбгШс се11-айгасбпд сНетоктек т уйго апб ш ти1йр1е кс1егок1к 1екюпк. 1. №игора(Но1. Ехр. Ыеиго1. 64, 706-715.
6. Ва.)ейо, А., Вопау1а, В., ВагЬего, 8., Ε^τώ, Т., апб 8сйей1ш, С. (2001). СНетоктек апб (Ней гесерЮгк ш (Не сеп(га1 пегуоик кук(ет. Ε^οηΐ №игоепбосгто1. 22, 147-184.
7. Веххк Р., Ботегсц, М., ВтатЬШа, Ь., СаШ, В., 8сНо1к, О., Ое С1етсд, Е., УексотН А., Вадейа, С., КоШак, С., Ме1бо1ек1, 1., апб Уойетга, А. (2001). СХСВ4-асйуа1еб ак(госу(е д1и(ата(е ге1еаке у1а ТОТа^На: атрйДсакюп Ьу тюгодйа кпддетк пеитокохюйу. №1(. Ыеигокск 4, 702-710.
8. В1апсЫ, В., Виуикакйй, В., Вппек, М., 8ауто, С., Сауа1ей1, С., Оддюш, Ν., Ьашта, С., Вогдпа, М., ЬотЬатб1, В., С1теп, В., Соте1екод1и, и., Катк, А., Такагод1и, С., Сегат1, А., СНеххк Р. (2004). Егу(Нгоро1е(т Ьо(Н рго(ес(к Ггот апб геуегкек ехрептеп(а1 б1аЬейс пеигора(Ну. Ргос. ИаИ. Асаб. 8с1. И8А. 101, 823-828.
9. Войепккет, ЕЕ. апб 8а(о, С.Н. (1979). Сго\\кН оГ а га! пеигоЫаккота се11 йпе ш кегит-Ггее кирр1етепкеб тебшт. Ргос. №1(1. Асаб. 8ск И8А. 76, 514-517.
10. Са1сий, КА., 1огде, М.С., УаккН, 1.Б., СНар1ап, 8.В. (1996). Таскйе айобуша апб ГогтаНп Нурепйдеба ш к(гер(охо(ост-б1аЬеНс га(к: еГГес(к оГ ткийп, а1боке гебис(аке шЫЬйюп апб йбосаше Раш. 68,
- 32 015716
293-9.
11. Са1сий, КА., Ы Я., Уаккй, Т.Я., Ма1тЬегд, А.В. (1995). 01ГГегеп1 еГГесй оГ !тео а1боке гебиааке шШЬйогк оп посюерйоп апб ргок1ад1апбш Е. Еиг. 1. Рйагтасо1. 285, 189-197.
12. Сатегоп ΝΈ., Сойег М.А., Яоте Р.А. (1991). №гуе Ь1ооб йоте т еаг1у ехрептеп!а1 б1аЬе1ек т гай: ге1абоп 1о сопбисбоп бейсйк. Ат. 1. Рйукю1. 261, Е1-8.
13. Сопкбую, С., Утсеп!, А.М., апб Ρе1бтаη, Е.Я. (2004). №игошПаттайоп, СОХ-2, апб АЯ8-а биа1 го1е? Ехр. №иго1. 187, 1-10.
14. Пеуегеих, 1., НаеЬегй, Р., апб 8тйй1ек, О. (1984). А сотргейепыуе ке1 оГ кес.|иепсе апа1ук1к ргодгатк Гог 1йе УАХ. №.1с1е1с Ас1бк Яек. 12, 387-395.
15. Яуск, РД.В., Яуск, РД. (1999). П1аЬейс ро1упеигора!йу. 1п П1аЬейс №игора1йу, Яуск РД. Тйотак Р.К. (ебк). 8аипбегк \У.В.: РЫ1абе1рЫа, РА, 255-278.
16. Е1ке1епЬоот, Р., Ва!е, С., Уап Соо1, У .А., Ноохетапк, И, Яо/етийег, 1.М., Уеегйшк, Я., апб Убйатк, А. (2002). №игошйаттайоп т Акйетег'к б1кеаке апб рпоп б1кеаке Сйа. 40, 232-239.
17. Сао, Н.М., Яш, В., 2йапд, У., апб Нопд, 1.8. (2003). №ус1 апй-тПаттаЮгу 1йегару Гог Рагкшкоп'к бЬеаке. Тгепбк Рйагтасо1. 8сГ 24, 395-401.
18. 61еюйтапп, М., 6111еп, С., Схагбуйоп, М., Вокке, Ρ., бгетег-Рейег, Я., Аиег, 1., апб Ми11ег, Н.\У. (2000). С1ошпд апб сйагааепхаРоп оГ 8ΌΡ-1 датта, а поуе1 8ΌΡ-1 сйетокте 1гапкспр1 тейй беуе1ортеп!а11у гедик-Иеб ехргеккюп ш 1йе пегуоик кук1ет. Еиг. 1. №игока. 12, 1857-1866.
19. 6гап1йат, Я. (1974). Атшо ааб бГГегепсе Гогти1а 1о йе1р ехр1ат рго1ет еуо1ийоп. 8аепсе. 185, 862-864.
20. Некке1деккег, 1., ТаиЬ, Ό., Ваккаг, Р., СгеепЬегд, М., Нох1е, 1., Ко1коп, О.Я, апб Ногик, Я. (1998). №игопа1 арорЮк!к шбисеб Ьу Н1У-1 др120 апб 1йе сйетокте 8ΌΡ-1 а1рйа 1к теб1а1еб Ьу 1йе сйетокте гесерЮг СХСЯ4. Сигг. Вю1. 8, 595-598.
21. НоодетеегГ, АД., КиксйеД, С.8., РгоибГоо!, А.Е., Вог1а!, Ρ., С1агк-Яете1к, I., Ротеег, С.А., апб Уе11к, ΈΝ. (1997). С1усокаттод1усапк теб1а1е се11 кигГасе ойдотеп/абоп оГ сйетокшек. Вюсйет1кйу. 36, 1357013578.
22. Нип1ег, С.Ь, Васйтап, Ό., апб Сгапйо1т, А.С. (2004). Мтосус1ше ргеуеШк сйойпегдю 1окк т а тоике тобе1 оГ Яотеп'к купбготе. Апп. №иго1. 56, 675-688.
23. 1пГап1е, 1., Ь1огса, 1., Вегаапо, 1., апб СотЬаггок, О. (2005). 1п1ег1еикш-8, Ш1егсе11и1аг абйекюп то1еси1е-1 апб Штоиг песгок1к Гас1ог-а1рйа депе ро1утогрЫктк апб 1йе пкк Гог тиЙ1р1е кук1ет а1горйу. 1. №иго1. 8сГ 228, 11-13.
24. 1акоЬкеп, 1. (1976). Ахопа1 бтешбйпд ш еаг1у ехрептеп!а1 б1айе1ек. II. А кШбу оГ 1ко1а1еб пегуе Г1Ьгек. О1айе1о1од1а. 12, 547-553.
25. Дапд, Υ., 8а1аГгапса, М.К, АбЫкап, 8., Х1а, Υ., Ρеηд, Я., 8опп1ад, М.К., беΡ^еЬ^е, С.М., Реппе11, Ν.Ά., 8йей, ХУД., апб Наткоп, 1.К. (1998). Сйетокте гесерЮг ехргеккюп ш сийигеб дПа апб га! ехрептеп1а1 а11егдю епсерйа1отуе11йк. 1. №иго1ттипо1. 86, 1-12.
26. Яа/апиГ Ρ., Тйат, Т.К, Сакапоуа, Р., Агеп7апа-8е1кбебок, Ρ., апб ПиЬо1к-Па1сд, М. (2003). Яо1е оГ !йе а1рйа-сйетокше к!гота1 се11-бепуеб Гас1ог (8ΌΡ-1) ш !йе беуе1оршд апб таШге сеп!га1 пегуоик кук!ет. Сйа. 42, 139-148.
27. Яейпагб!, 8., Яасйапсе, С., Ра(г1хл, 8., ЯеГеЬуге, 8., Ρо11ей, Р.Я, 1епкеп, Р.Е., ЯокепЬегд, Р.А., Уо1ре, ЯЯ, апб Уайатап, Т. (2002). Тйе 1о11-11ке гесерЮг ТЯЯ4 1к песеккагу Гог йроро1укассйапбе-тбисеб ойдобепбгосу1е тщгу т !йе ΟΝ8. 1. №игока. 22, 2478-2486.
28. ЯейпагбЯ 8., МаккШоп, Я., Ρо11ей, Р., 1еп8еп, Р.Е., Яа!ап, Я., ЯокепЬегд, Р.А., Уо1ре, ЯЯ, апб Уайатап, Т. (2003). Асбуайоп оГ шпа1е 1ттипйу ш !йе ΟΝ8 Паддегк пеигобедепегайоп 1йгоидй а То11-йке гесерЮг 4-берепбеп! ра!йтеау. Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А. 100, 8514-8519.
29. Ма, р., 1опек, Ό., Вогдйекаш, Р.Я., 8еда1, Я.А., №дакатеа, Т., К1кй1то1о, Т., Вгопкоп, Я.Т., апб 8рппдег, Т.А. (1998). 1трайеб В-1утрйоро1ек1к, туе1оро1ек1к, апб бегабеб сегеЬе11аг пеигоп т1дгайоп ш С. Ргос. Асаб. 8а. И8А. 95, 9448-9453.
30. №кетеоййу, ЯН. (1999). Ргодгекк ш бе1егтттд !йе саикек апб 1геа1теп1 оГ ти1йр1е кс1егок1к. №11иге. 399, А40-А47.
31. Рапепка, У., 1уоп, Н., Негх, Я.М., Агткйопд, Ι.Ν., Ρе^дйаη, Ό., Уе1, Т., Υоηд, У.У., ЯапкойоГ, Я.М., апб МасУюаг, В.А. (2001). Р2Х7-йке гесерЮг асйуабоп т ак1госу1ек тсгеакек сйетокте топосу!е сйетоа11гас1ап1 рго!е1п-1 ехргеккюп У1а тйодеп-ас11уа1еб рго1ет ктаке. 1. №игока. 21, 71357142.
32. Реагкоп, У.Я. (1990). Яар1б апб кепкШуе кедиепсе сотрапкоп тейй ΡА8ΤР апб ΡА8ΤА. Ме!йобк ЕпхугпоГ 183, 63-98.
33. Реагкоп, У.Я. апб Я1ртап, ЭД. (1988). 1тргоуеб 1оо1к Гог Ью1одюа1 кедиепсе сотрапкоп. Ргос. Νίώ. Асаб. 8сГ И8А. 85, 2444-2448.
34. Репу, У.Н. (2004). Тйе 1пйиепсе оГ кукЮпйс 1пйатта1юп оп тПаттайоп т !йе Ьгат: 1тр11са1юпк Гог сйгошс пеигобедепегабуе б1кеаке. Вгаш Вейау. 1ттип. 18, 407-413.
35. РЫ/юку, Е.М. апб Я1е1бк, 8. (1995). Рго1ет-рго1ет Ыегасйопк: те!йобк Гог беЮсйоп апб апа1ук1к. МюгоЬю1. Яеу. 59, 94-123.
- 33 015716
36. КоЬшзои, 8., Таш, М., 81г1е1ег. К.М, КаизокоГГ, К.М., аиб МШег, К.Н. (1998). Тке скетокте дготеГк-геди1аГеб оисодеие-а1рка рготоГез зрта1 согб окдобеибгосуГе ргесигзог ргокГегайои. 1. №игозск 18, 10457-10463.
37. Коуапз, М., .Гибка, Е., Оа11о, А., ВеиебеГкт, В,, 8огтат, М.Р., СариГо, Б., Океххг А., МоиГаиап, Е., ВегГоо1оГГо, А., Маисагб1, О., ВегдатазсЫ, К., МйшеШ, V., Сот1, О., ЕШррр М. (2006). Огеу таГГег батаде ргебкГз Гке еуо1икои оГ рптагу ргодгезз1уе тиШр1е зс1егоз1з а! 5 уеагз. Втат, АидизГ 18, 1-7.
38. 8аб1г, К., Ва1еих, Е., Огозб1бкг, А., ГтЬегГу А., аиб ЬогГа!-1асоЬ, Н. (2001). СкагасГеп/акои оГ Гке зГгота1 се11-бепуеб Гас!ог-а1рка-керапи сотр1ех. 1. Вк1. Скет. 276, 8288-8296.
39. 8акгЬаскег, и.С., Ьескиег, Е., ЕидзГег, Н.Р., Еге1, К., Еа^таии, Н., аиб ЕоиГаиа, А. (1998). Мке текк аи таскуаГки оГ Гке тбитЫе шГпс ох1бе зуиГказе деие аге зизсеркЫе !о ехрептеи!а1 аиГо1ттиие еисерка1отуе11Г1з. Еиг. 1. 1ттиио1. 28, 1332-1338.
40. 8сктеаг/, М.К. аиб \Уе11з, Т.К (1999). ГиГегГепид текк скетокте иеГтеогкз-Гке коре Гог иете ГкегареиГкз. Сигг. 0рш. Скет. Вю1. 3, 407-417.
41. 81та, А.А., НаБитек V., Вп1 V., МсЕтееи Т.А., Огееие, Б.А. (1988). Н1зГораГко1одка1 кеГегодеиеку оГ иеигораГку ш тзи1т-береибеиГ аиб иои-тзи1т-береибеиГ ФаЬеГез, аиб бетоизГгаГки оГ ахо-дка1 буз_)иискои ш китаи б1аЬекс иеигораГку. 1. Ски. ГиуезГ. 81, 349-364.
42. 81та А.А. (1994). РаГко1одка1 бейшкои аиб еуа1иакои оГ б1аЬекс иеигораГку аиб с1тка1 согге1акоиз. Саи. 1. №иго1. 8ск 21, 813-17.
43. 8ткк, Т.Е. аиб ^аГегтаи, М.8. (1981). Гбеикйсакои оГ соттои то1еси1аг зиЬзедиеисез. 1. Мо1. Вю1. 147, 195-197.
44. 8огеизеи, Т.Ь., ТгеЬзГ, С., К1У1закк, Р., К1аеде, К.Ь., Ма_)тибаг, А., Кау1б, К., Ба^таии, Н., 01зеи, Б.В., 8ГпеГег, К.М., КаизокоГГ, К.М., аиб 8е11ек)егд, Е. (2002). Ми1кр1е зс1егоз1з: а зГибу оГ СХСБ10 аиб СХСК3 со-ксаН/акои ш Гке тПатеб сеиГга1 иегуоиз зузГет. 1. №иго1ттиио1. 127, 59-68.
45. 8Го11, О., 1аибег, 8., аиб Муегз, К.К. (2002). БедеиегаГки аиб гедеиегакои оГ Гке репркега1 иегуоиз зузГет: йот АидизГиз \Уа11ег'з оЬзегуакоиз Го иеигошйаттаГки. 1. Репркег. №гу. 8узГ. 7, 13-27.
46. 8Гитт, К.К., Китте1, 1., Гиикег, V., Си1тзее, С., РГеШег, М., Кпед1зГеш, 1., Но11Г, V., аиб 8скик, 8. (2002). А биа1 го1е Гог Гке 8БЕ-1/СХСК4 скетокте гесерГог зузГет т аби1Г Ьгат: 1зоГогт-зе1есйуе геди1акои оГ 8БЕ-1 ехргеззки тоби1аГез СХСК4-береибеиГ иеигоиа1 р1азГкйу аиб сегеЬга1 1еикосуГе гесгшГтеиГ айег Госа1 1зскет1а. 1. №игозск 22, 5865-5878.
47. Тирро, Е.Е. аиб Апаз, Н.К. (2005). Тке го1е оГ Гийаттакои ш А1хкеппег'з б1зеазе. ГиГ. 1. Вкскет. Се11. Вю1. 37, 289-305.
48. Уи, Ь. еГ а1. (2006). Гбеикйсакои аиб ехргеззки оГ иоуе1 1зоГогтз оГ китаи зГгота1 се11-бепуеб ГасГог 1.
49. 2ки, Υ., Уи, Т., 2каид, Х.С., №дазатеа, Т., ^и, ΙΥ., аиб Као, Υ. (2002). Ко1е оГ Гке скетокте 8БЕ-1 аз Гке тешидеа1 акгасГаиГ Гог еткгуошс сегеЬе11аг иеигоиз. №11. №игозск 5, 719-720.
50. 2ои, У.К., Коктаии, А.Н., Кигоба, М., ТашисЫ, Г., аиб ЬйГтаи, Б.К. (1998). Еиискои оГ Гке скетокте гесерГог СХСК4 ш каетаГорокз1з аиб т сегеЬе11аг беуе1ортеиГ. №11иге. 393, 595-599.
51. 2и)оук, V., Веиау1без, 1., У1де, Х., СагГег, С., аиб Таирт.У. (2000). ЕгасГа1кте тоби1аГез ТЫЕа1рка зесгеГки аиб иеигоГохкйу тбисеб Ьу ткгодка1 аскуаГки. Ока. 29, 305-315.

Claims (24)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Применение 8БЕ-1 для изготовления лекарственного средства для лечения и/или профилактики неврологического заболевания, где указанный 8БЕ-1 выбран из 8БЕ-1а или варианта 8БЕ-1а или 8БЕ1а, имеющего дополнительный №концевой метионин.
  2. 2. Применение по п.1, где неврологическое заболевание ассоциировано с воспалением.
  3. 3. Применение по п.2, где воспаление представляет собой нейровоспаление.
  4. 4. Применение по любому из предшествующих пунктов, где неврологическое заболевание выбрано из группы, состоящей из травматического повреждения нерва, инсульта, демиелинизирующих заболеваний ЦНС или ПНС, невропатий.
  5. 5. Применение по любому из предшествующих пунктов, где неврологическое заболевание представляет собой периферическую невропатию.
  6. 6. Применение по п.5, где периферическая невропатия представляет собой диабетическую невропатию или невропатическую боль.
  7. 7. Применение по п.4, где травматическое повреждение нерва включает травму периферического нерва.
  8. 8. Применение по п.4, где травматическое повреждение нерва включает травму спинного мозга.
  9. 9. Применение по п.4, где демиелинизирующее заболевание представляет собой рассеянный склероз (РС).
  10. 10. Применение по п.9, где демиелинизирующее заболевание представляет собой первичнопрогрессирующий рассеянный склероз (РС) или вторично-прогрессирующий рассеянный склероз (РС).
  11. 11. Применение по п.4, где демиелинизирующее заболевание выбрано из хронического воспали
    - 34 015716 тельного рассеянного склероза, демиелинизирующей полиневропатии (СГОР) и синдрома Гийена-Барре (ОВ8).
  12. 12. Применение по любому из предшествующих пунктов, где 8ΌΡ-1 выбран из группы, состоящей из:
    (a) полипептида, содержащего аминокислоты 8Εβ ΙΌ N0:1;
    (b) полипептида, содержащего аминокислоты 8Εβ ΙΌ N0:4;
    (c) полипептида, содержащего аминокислоты 8Εβ ΙΌ N0:7;
    (ά) полипептида согласно (а)-(с), дополнительно содержащего сигнальную последовательность предпочтительно аминокислоты 8Εβ Ш N0:5;
    (е) мутеина согласно любому из (а)-(ф, где аминокислотная последовательность обладает по меньшей мере 80 или 90%-ной идентичностью по меньшей мере одной из последовательностей согласно (а)-(с);
    (ί) мутеина согласно любому из (а)-(ф, который кодируется последовательностью ДНК, которая в условиях высокой жесткости гибридизуется с последовательностью, комплементарной нативной последовательности ДНК, кодирующей любой из (а)-(с);
    (д) мутеина согласно любому из (а)-(ф, где любые замены в аминокислотной последовательности представляют собой консервативные аминокислотные замены в аминокислотных последовательностях согласно (а)-(с);
    (Б) соли, слитого белка, функционального производного или активной фракции согласно любому из (а)-(ф.
  13. 13. Применение по любому из предшествующих пунктов, где 8ΌΡ-1 слит с молекулой носителя, пептидом или белком, которые способствуют преодолению гематоэнцефалического барьера.
  14. 14. Применение по любому из предшествующих пунктов, где 8ΌΡ-1 является пегилированным.
  15. 15. Применение по п.13, где слитый белок включает слитую молекулу иммуноглобулина (Ιβ).
  16. 16. Применение по любому из предшествующих пунктов, где лекарственное средство дополнительно содержит интерферон, и/или остеопонтин, и/или кластерин для одновременного, последовательного или раздельного применения.
  17. 17. Применение по п.16, где интерферон представляет собой интерферон-β.
  18. 18. Применение по любому из предшествующих пунктов, где 8ΌΡ-1 используют в количестве приблизительно от 0,001 до 1 мг/кг массы тела, или приблизительно от 0,01 до 10 мг/кг массы тела, или приблизительно 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 мг/кг массы тела, или приблизительно от 0,1 до 1 мг/кг массы тела.
  19. 19. Применение молекулы нуклеиновой кислоты для изготовления лекарственного средства для лечения и/или профилактики неврологического заболевания, где молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты 8Εβ ΙΌ N0:6 или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
    (a) полипептида, содержащего аминокислоты 8Εβ ΙΌ N0:1;
    (b) полипептида, содержащего аминокислоты 8Εβ ΙΌ N0:4;
    (c) полипептида, содержащего аминокислоты 8Εβ ΙΌ N0:7;
    (ά) полипептида согласно (а)-(с), дополнительно содержащего сигнальную последовательность предпочтительно аминокислоты 8Εβ Ш N0:5;
    (е) мутеина согласно любому из (а)-^), где аминокислотная последовательность обладает по меньшей мере 80 или 90%-ной идентичностью по меньшей мере одной из последовательностей (а)-(с);
    (ί) мутеина согласно любому из (а)-^), который кодируется последовательностью ДНК, которая в условиях высокой жесткости гибридизуется с последовательностью, комплементарной нативной последовательности ДНК, кодирующей любой из (а)-(с);
    (д) мутеина согласно любому из (а)-^), где любые замены в аминокислотной последовательности представляют собой консервативные аминокислотные замены в аминокислотных последовательностях (а)-(с);
    (Б) слитого белка, функционального производного или активной фракции любого из (η)-(ά).
  20. 20. Применение по п.19, где молекула нуклеиновой кислоты дополнительно содержит последовательность экспрессирующего вектора.
  21. 21. Применение по любому из пп.19, 20 для генной терапии.
  22. 22. Фармацевтическая композиция, содержащая 8ΌΡ-1 и интерферон, необязательно совместно с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми эксципиентами, для лечения и/или профилактики неврологического заболевания, где указанный 8ΌΡ-1 представляет собой 8ΌΡ-1α или вариант 8ΌΡ-1α или 8ΌΡ-1α, имеющий дополнительный ^концевой метионин.
  23. 23. Фармацевтическая композиция, содержащая 8ΌΡ-1 и остеопонтин, необязательно совместно с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми эксципиентами, для лечения и/или профилактики неврологического заболевания, где указанный 8ΌΡ-1 представляет собой 8ΌΡ-1α или вариант 8ΌΡ-1α или 8ΌΡ-1α, имеющий дополнительный ^концевой метионин.
    - 35 015716
  24. 24. Фармацевтическая композиция, содержащая 8ΌΡ-1 и кластерин, необязательно совместно с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми эксципиентами, для лечения и/или профилактики неврологического заболевания, где указанный 8ΌΡ-1 представляет собой 8ΌΡ-1α или вариант 8ΌΡ-1α или 8ΌΡ-1α, имеющий дополнительный Ν-концевой метионин.
EA200801244A 2005-10-31 2006-10-30 Применение sdf-1 для лечения и/или профилактики неврологических заболеваний EA015716B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP05110206 2005-10-31
US73414205P 2005-11-07 2005-11-07
PCT/EP2006/067949 WO2007051785A2 (en) 2005-10-31 2006-10-30 Use of sdf-1 for the treatment and/or prevention of neurological diseases

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200801244A1 EA200801244A1 (ru) 2009-02-27
EA015716B1 true EA015716B1 (ru) 2011-10-31

Family

ID=35967039

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200801244A EA015716B1 (ru) 2005-10-31 2006-10-30 Применение sdf-1 для лечения и/или профилактики неврологических заболеваний

Country Status (14)

Country Link
US (1) US20080253996A1 (ru)
EP (1) EP1942940A2 (ru)
JP (1) JP2009513689A (ru)
KR (1) KR20080060226A (ru)
CN (1) CN101300031A (ru)
AR (1) AR058173A1 (ru)
AU (1) AU2006310577B2 (ru)
BR (1) BRPI0617823A2 (ru)
CA (1) CA2617598A1 (ru)
EA (1) EA015716B1 (ru)
NZ (1) NZ565639A (ru)
UA (1) UA96926C2 (ru)
WO (1) WO2007051785A2 (ru)
ZA (1) ZA200800981B (ru)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7696309B2 (en) * 2006-10-23 2010-04-13 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Protease resistant mutants of stromal cell derived factor-1 in the repair of tissue damage
WO2011106234A1 (en) 2010-02-25 2011-09-01 Provasculon, Inc. Protease-resistant mutants of stromal cell derived factor-1 in the repair of tissue damage
US9249204B2 (en) * 2011-06-01 2016-02-02 Jyant Technologies, Inc. Chemokine-immunoglobulin fusion polypeptides, compositions, method of making and use thereof
EP2717894B1 (en) * 2011-06-07 2018-01-24 Mesoblast International Sàrl Methods for repairing tissue damage using protease-resistant mutants of stromal cell derived factor-1
US11419916B2 (en) * 2012-09-11 2022-08-23 Energesis Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for inducing differentiation of human brown adipocyte progenitors
WO2014204795A1 (en) * 2013-06-19 2014-12-24 Merck Sharp & Dohme Corp. Assay for determining endogenous levels of analyte in vivo
EP3191991B1 (en) * 2014-09-10 2021-01-13 Koninklijke Philips N.V. Image report annotation identification
ITUA20161364A1 (it) 2016-03-04 2017-09-04 Antonino Cattaneo Inibitore di tnf alpha astrocitario per l’uso nel trattamento di malattie neurologiche.
WO2018144817A1 (en) * 2017-02-03 2018-08-09 Vicapsys, Inc. Modified cxcl12 polypeptides and uses thereof
CN107325187B (zh) * 2017-07-19 2021-11-09 黄子为 一种具有cxcr4蛋白激动活性的多肽及其应用和药物组合物
US11553871B2 (en) 2019-06-04 2023-01-17 Lab NINE, Inc. System and apparatus for non-invasive measurement of transcranial electrical signals, and method of calibrating and/or using same for various applications

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0657468A1 (en) * 1993-10-14 1995-06-14 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Human stromae derived factor
WO2001092530A1 (de) * 2000-06-02 2001-12-06 Rhein Biotech Proz & Prod Gmbh Nukleinsäure-molekül umfassend eine für ein sdf-1 gamma chemokin, einen neuropeptid-präkursor oder mindestens ein neuropeptid kodierende nukleinsäuresequenz
WO2004017978A1 (en) * 2002-08-22 2004-03-04 The Cleveland Clinic Foundation Stromal cell-derived factor-1 mediates stem cell homing and tissue regeneration in ischemic cardiomyopathy
EP1493438A1 (en) * 2003-07-03 2005-01-05 Bayer HealthCare AG Vanilloid receptor (VR) inhibitors for treatment of Human Immunodeficiency Virus (HIV)-mediated pain states
WO2005042561A2 (en) * 2003-10-31 2005-05-12 Neuren Pharmaceuticals Limited Neural regeneration peptides and methods of use
US6946445B1 (en) * 1998-03-13 2005-09-20 The University Of British Columbia Therapeutic chemokine receptor antagonists

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK0567566T4 (da) 1991-01-18 2007-10-22 Amgen Inc Fremgangsmåder til behandling af tumornekrosefaktor-medierede sygdomme
CA2245224A1 (en) * 1998-08-14 2000-02-14 Jiang-Hong Giong Chemokine receptor antagonists and chemotherapeutics
US7157418B1 (en) * 1998-07-22 2007-01-02 Osprey Pharmaceuticals, Ltd. Methods and compositions for treating secondary tissue damage and other inflammatory conditions and disorders

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0657468A1 (en) * 1993-10-14 1995-06-14 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Human stromae derived factor
US6946445B1 (en) * 1998-03-13 2005-09-20 The University Of British Columbia Therapeutic chemokine receptor antagonists
WO2001092530A1 (de) * 2000-06-02 2001-12-06 Rhein Biotech Proz & Prod Gmbh Nukleinsäure-molekül umfassend eine für ein sdf-1 gamma chemokin, einen neuropeptid-präkursor oder mindestens ein neuropeptid kodierende nukleinsäuresequenz
WO2004017978A1 (en) * 2002-08-22 2004-03-04 The Cleveland Clinic Foundation Stromal cell-derived factor-1 mediates stem cell homing and tissue regeneration in ischemic cardiomyopathy
EP1493438A1 (en) * 2003-07-03 2005-01-05 Bayer HealthCare AG Vanilloid receptor (VR) inhibitors for treatment of Human Immunodeficiency Virus (HIV)-mediated pain states
WO2005042561A2 (en) * 2003-10-31 2005-05-12 Neuren Pharmaceuticals Limited Neural regeneration peptides and methods of use

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHALASANI S.H.; BARIBAUD F.; COUGHLAN S.M.; SUNSHINE M.J.; LEE V.M.Y.; DOMS R.W.; LITTMAN D.R.; RAPER J.A.: "The chemokine Stromai Cell-Derived Factor-1 promotes the survival of embryonic retinal ganglion cells". THE JOURNAL OF NEUROSCIENCE, vol. 23, no. 11, 1 June, 2003 (2003-06-01), pages 4601-4612, XP002372365, the whole document *

Also Published As

Publication number Publication date
CN101300031A (zh) 2008-11-05
ZA200800981B (en) 2009-04-29
CA2617598A1 (en) 2007-05-10
KR20080060226A (ko) 2008-07-01
WO2007051785A3 (en) 2007-09-07
EP1942940A2 (en) 2008-07-16
UA96926C2 (ru) 2011-12-26
BRPI0617823A2 (pt) 2011-08-09
US20080253996A1 (en) 2008-10-16
AU2006310577A1 (en) 2007-05-10
NZ565639A (en) 2012-03-30
JP2009513689A (ja) 2009-04-02
WO2007051785A2 (en) 2007-05-10
AR058173A1 (es) 2008-01-23
EA200801244A1 (ru) 2009-02-27
AU2006310577B2 (en) 2012-04-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA015716B1 (ru) Применение sdf-1 для лечения и/или профилактики неврологических заболеваний
KR102240347B1 (ko) 노화와 연관된 질환을 치료하기 위한 방법 및 조성물
EP2250193B1 (en) Postsynaptically targeted chemodenervation agents and their methods of use
US10808018B2 (en) Erythropoietin-derived peptides and methods of protecting cells from oxidative damage induced by reactive oxygen species
JP2004536058A (ja) 神経疾患の治療及び／又は予防のためのオステオポンチンの使用
JP2010536801A (ja) Ｎａｐ様ペプチド擬似体およびｓａｌ様ペプチド擬似体を用いた神経保護法
EP2212349B1 (en) Synthetic analogues of neural regeneration peptides
KR20050119149A (ko) 말초 신경 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 클루스테린의용도
JP5048658B2 (ja) 神経性炎症性疾患の治療、及び／又は予防のためのｉｌ−１８ｂｐアイソフォームの使用
EP1799248B1 (en) Use of il-17f for the treatment and/or prevention of neurologic diseases
JP4760378B2 (ja) ＧＰＲ１０３−ｌｉｋｅ受容体蛋白質に対するリガンドの新規用途
HK1123210A (en) Use of sdf-1 for the treatment and/or prevention of neurological diseases

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU