JP4760378B2 - GPR103−like受容体蛋白質に対するリガンドの新規用途 - Google Patents
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Description
摂食障害は神経性食欲不振症(anorexia nervosa;AN)および神経性過食症(bulimia nervosa;BN)とに分類される。ANは身体像の障害、強いやせ願望や肥満恐怖などのため不食や摂食制限をきたす結果、著しいやせと種々の精神身体症状を生じる症候群である。一方、BNは強迫的に多量の食物を摂取し続け自制困難な過食のエピソードを繰り返しては、嘔吐や下剤の乱用により体重増加を防ぐという症候群である。その際、嘔吐や下剤の乱用ができずに肥満に至ることもある。
また、アメリカでは59%が臨床的に肥満症であるとされている(Institute of Medicine,1995)。
このように、抗肥満薬および摂食障害治療薬は非常に大きなマーケットとなっており、本症の好発年齢帯である思春期から青年期の女性では摂食障害は精神分裂病、神経症に次いで第3位となっている。
これらの障害の病因としてストレス、やせ礼賛などの社会的・心理的要因が挙げられる。例えば、肥満症患者にストレステストを施行してみると正常体重者の約2倍の異常者がいることが報告されている。また、絶食しているのにもかかわらず空腹感を感じなくなったり、大量の食物摂取後であるのにもかかわらず満腹感を感じなくなったりなど摂食行動の中枢性制御機構の機能異常が考えられている。
摂食行動の制御機構として視床下部を中心とした神経回路網の形成が示唆されている。視床下部は孤束核や背側迷走神経運動核の内臓機能調節系、前頭前野や扁桃体の認知−行動制御系および大脳基底核や運動野の運動調節−出力系と神経回路網を形成し、これらの情報を統合して、摂食行動制御において中心的役割を果たしている。すなわち、血中グルコース、レプチンなど末梢からの液性シグナル、消化管からの神経性シグナル(迷走神経)、さらに、上位中枢からの神経性シグナル(セロトニン、ドーパミン、ノルアドレナリンなど)は視床下部において統合され食行動として発現される。これまで、食行動における分子レベルでの検討はグルコース感受性ニューロンなど神経核の同定などが中心で物質レベルでの解明には至らなかった。近年、レプチンの発見により摂食行動の物質レベルでの解明が急速に進み、それに伴って、視床下部における神経ペプチドがその中心的役割を果たす調節因子として注目されてきている。
摂食に関与する神経ペプチド類として、agouti関連タンパク、NPY、ガラニンおよびオレキシン(食欲亢進)、レプチン、メラノコルチン、CRF、オキシトシンおよびコレシストキニンなど(食欲抑制)が知られている。これらの神経ペプチドは視床下部において生成・分泌され、視床下部摂食中枢に存在するそれらの受容体に結合することにより作用すると考えられている。さらに、最近、それぞれの神経ペプチドの摂食に関与する受容体サブタイプが同定・単離され創薬ターゲットとして台頭してきた。それらの代表的なものとしてY1およびY5受容体(NPY受容体)、GALR1、GALR2およびGALR3受容体(ガラニン受容体)、OX1およびOX2受容体(オレキシン受容体)、レプチン受容体、MC4受容体(agouti関連タンパク、メラノコルチン受容体)、CRF2受容体およびCRF結合タンパク質(CRF受容体)などが挙げられ、受容体作用薬および拮抗薬の開発が行われている。
ヒト脳由来の受容体蛋白質は、上記の他にも多数発見されている。しかし、これらの受容体の多くは、そのリガンドが同定されていないため、どのような生理作用に関与しているかは全く知られていない。そのような受容体蛋白質の一つとしてGPR103−like受容体が知られている(WO2001/16316号)。
近年、NPXがHEK293細胞に発現させたGPR103−like受容体蛋白質と高い結合親和性を有することが明らかとなり、NPXがGPR103−like受容体蛋白質のリガンドであることが示された。NPXはヒトゲノム配列から機能未知の蛋白質をコードすると予測された遺伝子から合成されたペプチドで、C末端がアミド化されたRFアミドファミリーに属する。NPX前駆体からプロセッシングされ、C末端のアルギニン−フェニルアラニンのモチーフから、C末端がアミド化されることが予測されている。脳内に多く分布し、視床下部にも多く分布しているペプチドであることが報告されている(The Journal of Biological Chemistry Vol.278,No.30,Issue of July 25,pp.27652−27657,2003)。
しかしながら、これまでNPXの摂食行動との関連については全く報告されていない。
また、これまで肥満症の治療には、本国においてはマジンドール(アミンポンプ阻害剤)のみが食欲抑制薬として承認されている。アメリカ合衆国においてはSSRIなどの抗うつ薬が処方されている(The Journal of Clinical Psychiatry Vol.59,Suppl 15,pp.28−34,1998)。現在、肥満症患者に対してレプチン投与する臨床試験が進行中である。さらに摂食障害患者には抗うつ薬および抗不安薬が処方されている。
これらの予防または治療薬はいずれも投与後1時間以内にその効果を発揮するものであるが、投与後3時間以上経過後にその効果を発揮し、長時間維持することができるものについての報告はない。さらに、摂食行動にターゲットを当て、これに特異的に作用する化合物についての報告は何もない。
本発明者等は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、NPXが投与後一定時間経過後に強力な食欲抑制作用を示すことを見出した。さらにNPXとNPX受容体であるGPR103−like受容体蛋白質の結合を調節する化合物が肥満症または摂食障害の予防・治療薬として有効であることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
すなわち本発明によれば、以下の発明が提供される。
(1) 配列番号:1又は3に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを含有する食欲抑制剤。
(2) 配列番号:1又は3に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを含有する肥満症または摂食障害の予防または治療剤。
(3) 配列番号:1又は3に記載のアミノ酸配列において1又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ食欲抑制活性を有するペプチドを含有する、食欲抑制剤。
(4) 配列番号:1又は3に記載のアミノ酸配列において1又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ食欲抑制活性を有するペプチドを含有する、肥満症または摂食障害の予防または治療剤。
(5) 配列番号:2又は4に記載の塩基配列からなるDNA、またはその相補配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされ、かつ食欲抑制活性を有するペプチドを含有する、食欲抑制剤。
(6) 配列番号:2又は4に記載の塩基配列からなるDNA、またはその相補配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされ、かつ食欲抑制活性を有するペプチドを含有する、肥満症または摂食障害の予防または治療剤。
(7) 一定時間経過後に食欲が抑制される、(1)から(6)の何れかに記載の薬剤。
(8) さらに速効性の食欲抑制薬を配合することにより長時間食欲抑制効果を維持することができる、(1)から(7)の何れかに記載の薬剤。
(9) 下記の(i)から(iii)の何れかのペプチドの有効量を投与することを含む、食欲抑制方法、並びに肥満症または摂食障害の予防または治療方法。
(i)配列番号:1又は3に記載のアミノ酸配列からなるペプチド;
(ii)配列番号:1又は3に記載のアミノ酸配列において1又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ食欲抑制活性を有するペプチド;または
(iii)配列番号:2又は4に記載の塩基配列からなるDNA、またはその相補配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされ、かつ食欲抑制活性を有するペプチド:
(10) 食欲抑制剤、あるいは肥満症または摂食障害の予防または治療剤を製造するための、下記の(i)から(iii)の何れかのペプチドの使用。
(i)配列番号:1又は3に記載のアミノ酸配列からなるペプチド;
(ii)配列番号:1又は3に記載のアミノ酸配列において1又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ食欲抑制活性を有するペプチド;または
(iii)配列番号:2又は4に記載の塩基配列からなるDNA、またはその相補配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされ、かつ食欲抑制活性を有するペプチド:
(11) 下記の(i)から(iii)の何れかのペプチドを用いることを特徴とする、該ペプチドの活性を促進または阻害することにより一定時間後に食欲を抑制または促進する物質をスクリーニングする方法。
(i)配列番号:1又は3に記載のアミノ酸配列からなるペプチド;
(ii)配列番号:1又は3に記載のアミノ酸配列において1又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ食欲抑制活性を有するペプチド;または
(iii)配列番号:2又は4に記載の塩基配列からなるDNA、またはその相補配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされ、かつ食欲抑制活性を有するペプチド:
(12) さらに、下記の(iv)から(vi)の何れかに記載の蛋白質または該蛋白質の部分ペプチドを用いる、(11)に記載のスクリーニング方法。
(iv)配列番号:5に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質。
(v)配列番号:5に記載のアミノ酸配列において1又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ、(11)に記載の(i)から(iii)の何れかのペプチドと結合活性を有する蛋白質;
(vi)配列番号:6に記載の塩基配列からなるDNA、またはその相補配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされ、かつ(11)に記載の(i)から(iii)の何れかのペプチドと結合活性を有する蛋白質:
(13) 配列番号:2又は4に記載の塩基配列からなるDNA、またはその相補配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAを用いることを特徴とする、下記の(i)から(iii)の何れかのペプチドの発現を促進または阻害することにより一定時間経過後に食欲を抑制または促進する物質をスクリーニングする方法。
(i)配列番号:1又は3に記載のアミノ酸配列からなるペプチド;
(ii)配列番号:1又は3に記載のアミノ酸配列において1又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ食欲抑制活性を有するペプチド;または
(iii)配列番号:2又は4に記載の塩基配列からなるDNA、またはその相補配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされ、かつ食欲抑制活性を有するペプチド:
(14) (11)から(13)の何れかに記載のスクリーニング方法により選択される物質を含有する、食欲抑制剤。
(15) (11)から(13)の何れかに記載のスクリーニング方法により選択される物質を含有する、肥満症または摂食障害の予防または治療剤。
(16) (11)から(13)の何れかに記載のスクリーニング方法により選択される物質の有効量を投与することを含む、食欲抑制方法、並びに肥満症または摂食障害の予防または治療方法。
(17) 食欲抑制剤、あるいは肥満症または摂食障害の予防または治療剤を製造するための、(11)から(13)の何れかに記載のスクリーニング方法により選択される物質の使用。
(18) 配列番号:1又は3に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに対するレセプターのアゴニストを含有する食欲抑制剤。
(19) 配列番号:1又は3に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに対するレセプターのアンタゴニストを含有する食欲促進剤。
本明細書でいう「NPX」、「NPX前駆体」及び「GPR103−like受容体蛋白質」は公知のペプチド又は蛋白質である。NPX、NPX前駆体及びGPR103−like受容体蛋白質のアミノ酸配列をそれぞれ配列表の配列番号:1、3及び5に、DNA配列をそれぞれ配列表の配列番号:2、4及び6に記載する。
(A)本発明の薬剤
本発明の食欲抑制剤、並びに肥満症または摂食障害の予防または治療剤においては、
(i)配列番号:1又は3に記載のアミノ酸配列からなるペプチド;
(ii)配列番号:1又は3に記載のアミノ酸配列において1又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ食欲抑制活性を有するペプチド;または
(iii)配列番号:2又は4に記載の塩基配列からなるDNA、またはその相補配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされ、かつ食欲抑制活性を有するペプチド:
の何れかを有効成分として使用する。
本発明で言う「配列番号:1又は3に記載のアミノ酸配列において1又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されたアミノ酸配列」におけるアミノ酸の変異数や変異部位は、配列番号:1又は3で表されるペプチドの機能が保持される限り制限はないが、通常、配列番号:1又は3で表されるペプチドと相同性が約80%以上、好ましくは約90%以上、さらに好ましくは約95%以上のペプチドである。アミノ酸の変異数は一般的には1〜10個であり、好ましくは1〜8個であり、より好ましくは1〜5個程度であり、特に好ましくは1〜3個である。
蛋白質の構成要素となるアミノ酸の側鎖は、疎水性、電荷、大きさなどにおいてそれぞれ異なるものであるが、実質的に蛋白質全体の3次元構造(立体構造とも言う)に影響を与えないという意味で保存性の高い幾つかの関係が、経験的にまた物理化学的な実測により知られている。例えば、アミノ酸残基の置換については、グリシン(Gly)とプロリン(Pro)、Glyとアラニン(Ala)またはバリン(Val)、ロイシン(Leu)とイソロイシン(Ile)、グルタミン酸(Glu)とグルタミン(Gln)、アスパラギン酸(Asp)とアスパラギン(Asn)、システイン(Cys)とスレオニン(Thr)、Thrとセリン(Ser)またはAla、リジン(Lys)とアルギニン(Arg)、等が挙げられる。本発明においてもこのような保存性の高いアミノ酸置換を有するペプチドを使用することができるが、これらに限定されるものではない。
配列番号:1又は3に記載のアミノ酸配列において1又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されたアミノ酸配列は、好ましくは、配列番号:1又は3に記載のアミノ酸配列からなるペプチドと機能的に同等なペプチドである。ここで機能的に同等なペプチドとは、受容体との結合活性や受容体発現細胞に対する細胞刺激性等の生物学的特性が同等であり、かつ、配列番号:1又は3に記載のアミノ酸配列からなるペプチドと同様な食欲抑制作用を有することを意味する。
本発明で言う「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、例えば塩濃度が約19mM〜40mMで、温度がホルムアミドを添加していない場合は65〜75℃、50%ホルムアミド存在下では35〜45℃の条件下、サザンハイプリダイゼーションを行った場合に、ハイブリダイズする程度をいう。
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAとしては、プローブとして使用するDNAの塩基配列と一定以上の相同性を有するDNAが挙げられ、例えば80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは93%以上、特に好ましくは95%以上、最も好ましくは98%以上の相同性を有するDNAが挙げられる。
本発明で言う「一定時間経過後」とは、投与対象、投与方法等により異なるが、通常、投与後2時間以上、より好ましくは5時間以上経過することを意味し、「速効性」とは、投与対象、投与方法等により異なるが、通常、投与後1時間以内、より好ましくは30分以内にその効果を発揮することを意味する。
本発明で言う「長時間食欲抑制効果を維持する」とは、速効性の食欲抑制薬および本発明の食欲抑制剤をそれぞれ単独で投与した場合に比べて食欲抑制効果がより長く持続していることを意味し、通常2時間以上、好ましくは5時間以上、さらには10時間以上持続することが好ましい。
本発明で言う「ペプチド」とは、未修飾のペプチドのみならず、機能的に同等な全てのペプチドも含むことを意味し、例えば、ペプチドの塩、並びにアミド化またはエステル化されたペプチドでもよい。
ペプチドの塩としては、生理学的に許容される無機酸(例えば、塩酸、リン酸)、有機酸(例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸)または塩基(例えば、アルカリ金属)等との塩が挙げられるが、特に生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。
本発明で用いるペプチドとしては、ヒトやそれ以外の哺乳動物(例えばラット、マウス、ウサギ、ニワトリ、ヒツジ、ウシ、サル等)に由来する天然のペプチドを使用することができる。本発明で用いるペプチドは、ヒト又はそれ以外の哺乳動物の細胞または組織から当業者であれば通常行いうる精製方法を用いることにより製造することができる。例えば、ヒトやそれ以外の哺乳動物の細胞または組織をホモジナイズし、酸などで抽出後、イオン交換クロマトグラフィー等を利用することにより調製することが可能である。
あるいは、本発明で用いるペプチドは、ペプチド合成に通常用いられる固相法および液相法などの化学的手法により合成することもできる。ペプチド合成におけるアミノ基等の保護基および縮合反応の縮合剤は公知のものを使用できる。固相法では市販の各種ペプチド合成装置を利用することができる。必要に応じて、官能基の保護及び脱保護を行うことにより効率的に合成を行うことができる。保護基の導入及び脱離方法についても当業者に公知である。固相合成や液相合成は、例えば、生化学実験講座1、蛋白質の化学IV、矢島治明および榊原俊平、205、(1977年)等に記載の方法に従って行うこともできる。
さらにまた、通常の遺伝子組み換え手法に従って、ペプチドをコードするDNA配列を含む組み換えベクターを作製した後、該ベクターにより宿主(例えば、哺乳細胞や昆虫細胞等の適当な宿主細胞)を形質転換して形質転換体を作製し、該形質転換体を培養した培養物から所望のペプチドを組み換えペプチドとして分離・精製することができる。組み換えペプチドの調製は、例えば、Current Protocols in Molecular Biology edit.Ausubel et al.(1987)Publish.John Wiley & Sons Section 16.1−16.9等に記載の方法に従って行うことができる。
本発明で用いるペプチドは、生体内に存在する内因性のリガンド若しくはそれと機能的に同等なペプチドであるので、安全で低毒性な食欲抑制剤、あるいは肥満症または摂食障害の予防または治療剤として使用することができる。特に投与後一定時間経過後にその効力を発揮することから、公知の速効性の食欲抑制剤(例えば、マジンドール、MTII(preclinical))と組み合わせることで、その効果を長時間維持することが可能である。
本発明においては、上記のペプチドをそのまま用いてもよいが、通常は、製剤学的に許容しうる1又は2種以上の製剤用添加物を用いて該ペプチドを有効成分として含む医薬組成物を製造して投与することが好ましい。ペプチドを医薬組成物として使用する場合は、通常行われる手段に従って、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして、あるいは無菌性溶液、懸濁液剤などの注射剤とすることができる。
ペプチドの投与方法は経口投与でも非経口投与でもよく、非経口投与の形態も特に限定されず、静脈投与、筋肉内投与、腹腔内投与、または皮下投与などを行うことができる。
ペプチドの投与量は、投与対象、投与方法等により異なるが、例えば経口投与の場合は、肥満患者(60kg)に対して、一日約0.1〜100mg、好ましくは約1.0〜50mg、より好ましくは約1.0〜20mgである。非経口投与する場合は、例えば、肥満患者(60kg)に対して、一日約0.01〜30mg、好ましくは約0.1〜20mg、より好ましくは約0.1〜10mgを静脈注射することができる。
さらに、本発明によれば、配列番号:1又は3に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに対するレセプターのアゴニストを含有する食欲抑制剤、並びに配列番号:1又は3に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに対するレセプターのアンタゴニストを含有する食欲促進剤が提供される。本明細書上記した通り、配列番号:1又は3に記載のアミノ酸配列からなるペプチドは食欲抑制効果を有することから食欲抑制剤として有用である。従って、同様の食欲抑制効果を有する、該ペプチドに対するレセプターのアゴニストもまた食欲抑制剤として有用である。さらに、該ペプチドに対するレセプターのアンタゴニストは、配列番号:1又は3に記載のアミノ酸配列からなるペプチドが有する食欲抑制効果とは反対の食欲促進効果を有するものであり、食欲促進剤として有用である。配列番号:1又は3に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに対するレセプターのアゴニストおよびアンタゴニストの種類は特に限定されず、例えば、ペプチド、ペプチド模倣体又は低分子化合物などでもよい。上記したアゴニストおよびアンタゴニストは、例えば、本明細書に記載のスクリーニング方法により選択することができる。なお、上記したアゴニスト又はアンタゴニストを食欲抑制剤又は食欲促進剤として使用する場合の投与形態、投与方法、投与量などは、ペプチドについて本明細書上記した場合に準じて選択することができる。
(B)本発明のスクリーニング方法
本発明のスクリーニング方法は、食欲を抑制または促進する物質をスクリーニングする方法に関するものであり、下記の(i)から(iii)の何れかのペプチドを用いることを特徴とする。
(i)配列番号:1又は3に記載のアミノ酸配列からなるペプチド;
(ii)配列番号:1又は3に記載のアミノ酸配列において1又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ食欲抑制活性を有するペプチド;または
(iii)配列番号:2又は4に記載の塩基配列からなるDNA、またはその相補配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされ、かつ食欲抑制活性を有するペプチド:
本発明のスクリーニング方法では、さらに、下記の(iv)から(vi)の何れかに記載の蛋白質または該蛋白質の部分ペプチドを用いることもできる。
(iv)配列番号:5に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質。
(v)配列番号:5に記載のアミノ酸配列において1又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ、上記の(i)から(iii)の何れかのペプチドと結合活性を有する蛋白質;
(vi)配列番号:6に記載の塩基配列からなるDNA、またはその相補配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされ、かつ上記の(i)から(iii)の何れかのペプチドと結合活性を有する蛋白質:
本発明で言う「配列番号:5に記載のアミノ酸配列において1又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されたアミノ酸配列」におけるアミノ酸の変異数や変異部位は、配列番号:5で表されるペプチドの機能が保持される限り制限はないが、通常、配列番号:5で表されるペプチドと相同性が約80%以上、好ましくは約90%以上、さらに好ましくは約95%以上、特に好ましくは99%以上のペプチドである。アミノ酸の変異数は一般的には1〜20個であり、好ましくは1〜10個であり、より好ましくは1〜7個程度であり、特に好ましくは1〜5個である。また、アミノ酸置換の具体例としては、本明細書中上記した保存性の高い置換が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
配列番号:5に記載のアミノ酸配列において1又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されたアミノ酸配列は、好ましくは、配列番号:5に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質である。ここで機能的に同等な蛋白質とは、リガンドとの結合活性やシグナル情報伝達作用等の生物学的特性が同等であることを意味する。
本発明で言う「結合活性を有する蛋白質」とは、測定方法や測定条件等により異なるが、例えば、上記ペプチドとの結合活性をFDSS6000(浜松ホトニクス)を用いて測定した場合のEC50値が1.0〜15.0nMとなるような蛋白質を意味する。
本発明で言う「蛋白質」とは、天然型の蛋白質のみならず、機能的に同等な全ての蛋白質も含まれることを意味し、さらにそれらの塩やアミド化またはエステル化されたものであってもよい。
また、本発明で言う「部分ペプチド」としては、上記の蛋白質のうち、何れかの蛋白質の部分ペプチドであればよいが、特に本発明の蛋白質の細胞膜外部分であって、かつ、受容体結合活性を有するものが好ましい。
本発明で用いる上記した蛋白質または該蛋白質の部分ペプチドとしては、ヒトやそれ以外の哺乳動物(例えばラット、マウス、ウサギ、ニワトリ、ヒツジ、ウシ、サル等)に由来する天然の蛋白質を使用してもよいが、本明細書中上記した通り、ペプチド合成に通常用いられる固相法および液相法などの化学的手法により合成してもよいし、遺伝子組み換え手法に従って作製してもよい。
本発明のスクリーニング方法の具体例としては、[1]本発明のペプチドと受容体蛋白質又はその部分ペプチドとの結合活性を向上させる化合物のスクリーニング方法、並びに[2]本発明のペプチド又はその前駆体の発現量を向上させる化合物のスクリーニング方法を挙げることができる。このようなスクリーニング方法によって、食欲を抑制または促進する物質を選択することができる。
本発明のペプチドと受容体蛋白質との結合活性を向上させる物質のスクリーニング方法の具体例としては、以下の(a)又は(b)の方法が挙げられる。
(a)(i)試験物質の存在下で本発明のペプチドとその受容体蛋白質を接触させ、該ペプチドと受容体蛋白質の結合活性を測定し、(ii)試験物質の非存在下での結合活性と比較して、(i)での結合活性を向上または低下させる物質を選択する工程を含むスクリーニング方法。このとき結合活性を向上させる物質であれば、食欲抑制効果を有する候補物質とすることができ、低下させる物質であれば、食欲促進効果を有するの候補物質とすることができる。
(b)(i)試験物質の存在下で本発明のペプチドとその受容体蛋白質を接触させ、該受容体蛋白質を介した細胞刺激活性(例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ca2+遊離、細胞内cAMP生成、細胞内cGMP生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、c−fosの活性化、pHの低下などを侭進する活性または抑制する活性など)の結合活性を測定し、(ii)試験物質の非存在下での細胞刺激活性と比較して、(i)での結合活性を向上または低下させる物質を選択する工程を含むスクリーニング方法。このとき細胞刺激活性を向上させる物質であれば、食欲抑制効果を有する候補物質とすることができ、低下させる物質であれば、食欲促進効果を有する候補物質とすることができる。
本発明のペプチド又はその前駆体の発現量を向上させる化合物のスクリーニング方法として、具体的には、(i)試験物質の存在下で本発明のペプチド発現細胞又は組織を培養し、本発明のペプチドをコードするmRNA量を測定し、(ii)試験物質の非存在下でのmRNA量と比較して、(i)でのmRNA量を向上または低下させる物質を選択する工程を含むスクリーニング方法が挙げられる。このときmRNA量を向上させる物質であれば、食欲抑制効果を有する候補物質とすることができ、低下させる物質であれば、食欲促進効果を有する候補物質とすることができる。
上記の通り、本発明で得られた知見を利用することにより、食欲を抑制又は促進する物質、特に投与後一定時間経過後にその効力を発揮する物質のスクリーニングを行うことが可能である。
本発明のスクリーニング方法に供される試験物質としては、例えば、ペプチド、蛋白質、非ペプチド化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液等が用いられ、これらの化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。またペプチドライブラリーや化合物ライブラリー等を用いることもできる。
被験物質による食欲を抑制又は促進させる効果は、公知の方法を用いて確認することができる。例えば肥満症又は摂食障害モデル動物(例えば、マウス)にスクリーニングで得られた物質を経口的に又は非経口的に投与し、該モデル動物の摂餌量を測定することにより確認することができる。
本発明のスクリーニング方法によって得られる物質は、食欲を抑制又は促進する効果を有するので、安全で低毒性な治療・予防などの医薬として使用することができる。特に投与後一定時間経過後にその効力を発揮することができるものあるので、公知の速効性の治療・予防薬(例えば、マジンドール、MTII(preclinical))と組み合わせることで肥満症や摂食障害の予防又は治療薬として、その効果を長時間維持することが可能である。
得られた物質が塩を形成する場合には、その塩を医薬として使用することもできる。塩としては、生理学的に許容される無機酸(例えば、塩酸、リン酸)、有機酸(例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸)または塩基(例えば、アルカリ金属)等との塩が挙げられるが、特に生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。
上記した食欲を抑制する効果を有する物質は、そのまま用いてもよいが、通常は、製剤学的に許容しうる1又は2種以上の製剤用添加物を用いて該物質を有効成分として含む医薬組成物を製造して投与することが好ましい。該物質を医薬組成物として使用する場合は、通常行われる手段に従って、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして、あるいは無菌性溶液、懸濁液剤などの注射剤とすることができる。
該物質の投与方法は経口投与でも非経口投与でもよく、非経口投与の形態も特に限定されず、静脈投与、筋肉内投与、腹腔内投与、または皮下投与などを行うことができる。
該物質の投与量は、投与対象、投与方法等により異なるが、例えば経口投与の場合は、肥満患者(60kg)に対して、一日約0.1〜100mg、好ましくは約1.0〜50mg、より好ましくは約1.0〜20mgである。非経口投与する場合は、例えば、肥満患者(60kg)に対して、一日約0.01〜30mg、好ましくは約0.1〜20mg、より好ましくは約0.1〜10mgを静脈注射することができる。
次に、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
ICR系マウス雄(汎用系統である当マウスは日本チャールスリバーより購入した)を3匹/ケージで飼育し、各群5ケージづつに分けて、披検物質投与群のマウスには、所定量のNPX(固相合成法により合成)あるいは陽性対照薬としてメラノコルチン−4受容体作動薬のMTIIを0.1%ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝化生理食塩水に溶かして調製した被検物質を、また、被検物質無投与対象群のマウスには0.1%ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝化生理食塩水をそれぞれ脳室内に投与した。投与の際、マウスをhalothaneで軽麻酔し、ハミルトン注射器に27ゲージの針を付け、注射針を正中線から2mm外側部と、耳の基部の前方を通って引かれた線の交点に頭蓋骨から垂直に突き刺し、脳室内に薬液を注入した。投与用量は5μlとした。マウスは12時間の明期/暗期サイクル(午前7時ライト点灯)で飼育し、投与は午後7時前後に行った。投与15分後から、マウスには餌と水を自由に摂取させ、餌供給後、1、2、5、12、23、25および26時間後の摂食量を測定した。なお、被検物質投与による絶食誘発摂食亢進抑制作用に有無は被検物質無投与対照群のマウスの摂食量との比較により行った。餌供与開始直後から1、2、5、12、23、25および26時間後の各群のマウスの摂餌量は、図1に示した。
図1中の記号*はDunnett検定(母平均について対照群と処理群の対比較のみを同時に検定するための多重比較法)により有意差検定を行った時、P<0.05でリン酸緩衝化生理食塩水群と比較して有意な差があることを示す。記号**はDunnett検定により有意差検定を行った時、P<0.01でリン酸緩衝化生理食塩水群と比較して有意な差があることを示す。
図1に示した結果から明らかな通り、MTIIを投与した場合、投与1時間以内に摂餌量が有意に抑制され、5時間経過後にその効果が徐々に減少していることがわかる。NPXの3nmol、10nmolを投与した場合は、投与後2時間まででは、摂餌量を抑制する効果は見られず、5時間経過後には摂餌量が有意に抑制され、12時間後もその効果が持続していることがわかる。
Claims (8)
- 配列番号:1に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを含有する食欲抑制剤。
- 配列番号:1に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを含有する肥満症または摂食障害の予防または治療剤。
- 配列番号:1に記載のアミノ酸配列において1又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ食欲抑制活性を有するペプチドを含有する、食欲抑制剤。
- 配列番号:1に記載のアミノ酸配列において1又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ食欲抑制活性を有するペプチドを含有する、肥満症または摂食障害の予防または治療剤。
- 配列番号:2に記載の塩基配列からなるDNA、またはその相補配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされ、かつ食欲抑制活性を有するペプチドを含有する、食欲抑制剤。
- 配列番号:2に記載の塩基配列からなるDNA、またはその相補配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされ、かつ食欲抑制活性を有するペプチドを含有する、肥満症または摂食障害の予防または治療剤。
- 一定時間経過後に食欲が抑制される、請求項1から6の何れかに記載の薬剤。
- さらに速効性の食欲抑制薬を配合することにより長時間食欲抑制効果を維持することができる、請求項1から7の何れかに記載の薬剤。
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