JP2002541770A - アルツハイマー病についてのα−２−マクログロブリン治療および薬物スクリーニング法 - Google Patents
アルツハイマー病についてのα−２−マクログロブリン治療および薬物スクリーニング法Info
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Abstract
(57)【要約】
開示された発明は、Ａ２Ｍ−２欠失変異が、改変α2Ｍ ＲＮＡ転写物およびタンパク質の産生を導くという発見に関し、この変異は、アルツハイマー病の素因である。この発見に基づいて、本発明は、アルツハイマー病についての新規な治療剤を提供する。この治療剤としては、Ａβ結合ドメインおよび低密度リポタンパク質レセプター関連タンパク質（ＬＲＰ）結合ドメインを有する分子、ペプチド、核酸分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ならびに遺伝子療法のためのウイルスベクターが挙げられる。さらに、本発明は、これらの治療剤を含む薬学的組成物、アルツハイマー病と闘うためにこれらの治療剤を使用する方法、およびアルツハイマー病と闘い得る治療剤をスクリーニングする方法に関する。
Description
【０００１】 （発明の背景） （発明の分野） 本発明は、医学遺伝学の分野に関する。より詳細には、本発明は、α−２−マ
クログロブリンの機能および発現に影響を与えることに基づく、アルツハイマー
病についての治療剤およびアルツハイマー病についての治療剤をスクリーニング
する方法を提供する。
クログロブリンの機能および発現に影響を与えることに基づく、アルツハイマー
病についての治療剤およびアルツハイマー病についての治療剤をスクリーニング
する方法を提供する。
【０００２】 （関連分野） アルツハイマー病（ＡＤ）は、米国において年間４００万人を超える人々が罹
患する、破壊的神経変性障害である（Ｄｏｅｂｅｌｉ，Ｈ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔ
ｅｃｈ．１５：２２３−２４（１９９７））。これは、生涯の中期から後期にお
いて生じる主要な形態の痴呆である：６５歳を超える個体の約１０％および８０
歳を超える個体の約４０％が、ＡＤの症候を示す（Ｐｒｉｃｅ，Ｄ．Ｌ．および
Ｓｉｓｏｄｉａ，Ｓ．Ｓ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２１：４７９
−５０５（１９９８））。
患する、破壊的神経変性障害である（Ｄｏｅｂｅｌｉ，Ｈ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔ
ｅｃｈ．１５：２２３−２４（１９９７））。これは、生涯の中期から後期にお
いて生じる主要な形態の痴呆である：６５歳を超える個体の約１０％および８０
歳を超える個体の約４０％が、ＡＤの症候を示す（Ｐｒｉｃｅ，Ｄ．Ｌ．および
Ｓｉｓｏｄｉａ，Ｓ．Ｓ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２１：４７９
−５０５（１９９８））。
【０００３】 ＡＤの最初に認識される臨床症状は通常、短期記憶の喪失である（Ｓｃｈｅｌ
ｌｅｎｂｅｒｇ，Ｇ．Ｄ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
９２．８５５２−５５９（１９９５））。他の通常の症状としては、異常な判断
および挙動、ならびに言語、見当識、問題解決、計算および視覚空間知覚の困難
が挙げられる（Ｐｒｉｃｅ，Ｄ．Ｌ．およびＳｉｓｏｄｉａ，Ｓ．Ｓ．，Ａｎｎ
．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２１：４７９−５０５（１９９８）；Ｓｃｈｅｌ
ｌｅｎｂｅｒｇ，Ｇ．Ｄ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
９２．８５５２−５５９（１９９５））。これらの症状はしばしば、認知機能が
ほぼ完全に失われるまで悪化し、そしてこの患者は独立して機能することができ
ない（Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇ，Ｇ．Ｄ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：８５５２−５５９（１９９５）；Ｐｒｉｃｅ，Ｄ．Ｌ．
およびＳｉｓｏｄｉａ，Ｓ．Ｓ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２１：
４７９−５０５（１９９８））。この疾患の後期段階までに、患者は代表的に、
言語能力を無くし、人を認識できず、そして失禁および寝たきりになる（Ｐｒｉ
ｃｅ，Ｄ．Ｌ．およびＳｉｓｏｄｉａ，Ｓ．Ｓ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏ
ｓｃｉ．２１．４７９−５０５（１９９８）；Ｓｌｏａｎｅ，Ｐ．Ｄ．，Ａｍ．
Ｆａｍｉｌｙ Ｐｈｙｓ．５８：１５７７−８６（１９９８））。
ｌｅｎｂｅｒｇ，Ｇ．Ｄ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
９２．８５５２−５５９（１９９５））。他の通常の症状としては、異常な判断
および挙動、ならびに言語、見当識、問題解決、計算および視覚空間知覚の困難
が挙げられる（Ｐｒｉｃｅ，Ｄ．Ｌ．およびＳｉｓｏｄｉａ，Ｓ．Ｓ．，Ａｎｎ
．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２１：４７９−５０５（１９９８）；Ｓｃｈｅｌ
ｌｅｎｂｅｒｇ，Ｇ．Ｄ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
９２．８５５２−５５９（１９９５））。これらの症状はしばしば、認知機能が
ほぼ完全に失われるまで悪化し、そしてこの患者は独立して機能することができ
ない（Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇ，Ｇ．Ｄ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：８５５２−５５９（１９９５）；Ｐｒｉｃｅ，Ｄ．Ｌ．
およびＳｉｓｏｄｉａ，Ｓ．Ｓ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２１：
４７９−５０５（１９９８））。この疾患の後期段階までに、患者は代表的に、
言語能力を無くし、人を認識できず、そして失禁および寝たきりになる（Ｐｒｉ
ｃｅ，Ｄ．Ｌ．およびＳｉｓｏｄｉａ，Ｓ．Ｓ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏ
ｓｃｉ．２１．４７９−５０５（１９９８）；Ｓｌｏａｎｅ，Ｐ．Ｄ．，Ａｍ．
Ｆａｍｉｌｙ Ｐｈｙｓ．５８：１５７７−８６（１９９８））。
【０００４】 ＡＤについての公知の危険因子としては、年齢、遺伝的素因、脳における異常
なタンパク質（β−アミロイド）沈着、ならびに特定の環境因子（例えば、頭部
傷害、甲状腺機能低下および鬱病歴が挙げられる。大多数のＡＤ患者は、７０歳
代になるまで症状を示さない（Ｐｒｉｃｅ，Ｄ．Ｌ．およびＳｉｓｏｄｉａ，Ｓ
．Ｓ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２１：４７９−５０５（１９９８
））。しかし、特定の遺伝的欠損を遺伝した個体はしばしば、中年において症状
を示す（Ｐｒｉｃｅ，Ｄ．Ｌ．およびＳｉｓｏｄｉａ，Ｓ．Ｓ．，Ａｎｎ．Ｒｅ
ｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２１：４７９−５０５（１９９８））。初期発症家族性
ＡＤ（ＦＡＤ）と呼ばれる、ＡＤのこの後者の型は、ＡＤの症例の５％〜１０％
を占め、そして３つの異なる遺伝子（ＡＰＰ、ＰＳＥＮ１、ＰＳＥＮ２）におけ
る欠損と結び付けられてきた（Ｂｌａｃｋｅｒ，Ｄ．およびＴａｎｚｉ，Ｒ．Ｅ
．，Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ５５：２９４−２９６（１
９９８））。これらの遺伝子における変異は、アミロイド産生性β−アミロイド
ペプチド（Ａβ）の産生の増加をもたらす（Ｃｉｔｒｏｎ，Ｍ．ら，Ｎａｔｕｒ
ｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３：６７−７２（１９９７）；Ｓｕｚｕｋｉ，Ｎ．ら，
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４：１３３６−１３４０（１９９４））。
なタンパク質（β−アミロイド）沈着、ならびに特定の環境因子（例えば、頭部
傷害、甲状腺機能低下および鬱病歴が挙げられる。大多数のＡＤ患者は、７０歳
代になるまで症状を示さない（Ｐｒｉｃｅ，Ｄ．Ｌ．およびＳｉｓｏｄｉａ，Ｓ
．Ｓ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２１：４７９−５０５（１９９８
））。しかし、特定の遺伝的欠損を遺伝した個体はしばしば、中年において症状
を示す（Ｐｒｉｃｅ，Ｄ．Ｌ．およびＳｉｓｏｄｉａ，Ｓ．Ｓ．，Ａｎｎ．Ｒｅ
ｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２１：４７９−５０５（１９９８））。初期発症家族性
ＡＤ（ＦＡＤ）と呼ばれる、ＡＤのこの後者の型は、ＡＤの症例の５％〜１０％
を占め、そして３つの異なる遺伝子（ＡＰＰ、ＰＳＥＮ１、ＰＳＥＮ２）におけ
る欠損と結び付けられてきた（Ｂｌａｃｋｅｒ，Ｄ．およびＴａｎｚｉ，Ｒ．Ｅ
．，Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ５５：２９４−２９６（１
９９８））。これらの遺伝子における変異は、アミロイド産生性β−アミロイド
ペプチド（Ａβ）の産生の増加をもたらす（Ｃｉｔｒｏｎ，Ｍ．ら，Ｎａｔｕｒ
ｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３：６７−７２（１９９７）；Ｓｕｚｕｋｉ，Ｎ．ら，
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４：１３３６−１３４０（１９９４））。
【０００５】 後期発症ＡＤ（ＬＯＡＤ）と呼ばれる、ＡＤの最も一般的な形態は、ＡＤの症
例の約９０％を占め、そしてＡＰＯＥおよびＬＲＰに遺伝的に関連付られている
（Ｋａｎｇ，Ｄ．Ｅ．ら，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ４９：５６−６１（１９９７）
；Ｋｏｕｎｎａｓ，Ｍ．Ｚ．ら，Ｃｅｌｌ ８２：３３１−３４０（１９９５）
）。近年、別の遺伝子であるα−２−マクログロブリン遺伝子（Ａ２Ｍ）が、Ｌ
ＯＡＤに関連することが見出された（Ｂｌａｃｋｅｒ，Ｄ．ら，Ｎａｔｕｒｅ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １９：３５７−３６０（１９９８））。Ａ２Ｍにおける特定
の変異を有するキャリアは、ＡＤの危険性が増加していることが見出された。こ
の変異は、α−２−マクログロブリン（ａ2Ｍ）のベイト（ｂａｉｔ）領域をコ
ードする第２エキソンの５’スプライス部位での５ヌクレオチド欠失であり、そ
してＡ２Ｍ−２遺伝子型と呼ばれる。Ａ２Ｍ−２遺伝子型は、集団の３０％に存
在する（Ｂｌａｃｋｅｒ，Ｄ．ら，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １９：３
５７−３６０（１９９８））。Ａ２Ｍ−２の５ヌクレオチド欠失は、ＡＤについ
ての素因である。
例の約９０％を占め、そしてＡＰＯＥおよびＬＲＰに遺伝的に関連付られている
（Ｋａｎｇ，Ｄ．Ｅ．ら，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ４９：５６−６１（１９９７）
；Ｋｏｕｎｎａｓ，Ｍ．Ｚ．ら，Ｃｅｌｌ ８２：３３１−３４０（１９９５）
）。近年、別の遺伝子であるα−２−マクログロブリン遺伝子（Ａ２Ｍ）が、Ｌ
ＯＡＤに関連することが見出された（Ｂｌａｃｋｅｒ，Ｄ．ら，Ｎａｔｕｒｅ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １９：３５７−３６０（１９９８））。Ａ２Ｍにおける特定
の変異を有するキャリアは、ＡＤの危険性が増加していることが見出された。こ
の変異は、α−２−マクログロブリン（ａ2Ｍ）のベイト（ｂａｉｔ）領域をコ
ードする第２エキソンの５’スプライス部位での５ヌクレオチド欠失であり、そ
してＡ２Ｍ−２遺伝子型と呼ばれる。Ａ２Ｍ−２遺伝子型は、集団の３０％に存
在する（Ｂｌａｃｋｅｒ，Ｄ．ら，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １９：３
５７−３６０（１９９８））。Ａ２Ｍ−２の５ヌクレオチド欠失は、ＡＤについ
ての素因である。
【０００６】 現在、兆しが見える、ＡＤについての治療は存在せず、その発症数は、集団の
齢に伴って増加している（Ｐｒｉｃｅ，Ｄ．Ｌ．およびＳｉｓｏｄｉａ，Ｓ．Ｓ
．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２１．４７９−５０５（１９９８））
。生涯においてＡＤ症状の発症が遅いことに起因して、わずか５年程度発症を遅
らせる能力は、５０％程度もの多くのＡＤ患者の数を減少させ得る（Ｍａｒｘ，
Ｊ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３：５０−５３（１９９６））。多数の人々が既に
ＡＤに罹患しており、そしてＡＤに罹患すると予測されているので、ＡＤの発症
を単に遅らせ得る薬物は非常に有益である。
齢に伴って増加している（Ｐｒｉｃｅ，Ｄ．Ｌ．およびＳｉｓｏｄｉａ，Ｓ．Ｓ
．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２１．４７９−５０５（１９９８））
。生涯においてＡＤ症状の発症が遅いことに起因して、わずか５年程度発症を遅
らせる能力は、５０％程度もの多くのＡＤ患者の数を減少させ得る（Ｍａｒｘ，
Ｊ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３：５０−５３（１９９６））。多数の人々が既に
ＡＤに罹患しており、そしてＡＤに罹患すると予測されているので、ＡＤの発症
を単に遅らせ得る薬物は非常に有益である。
【０００７】 ＡＤの素因に基づく治療剤は、この疾患の進行を予防、遅延または緩慢化し得
る。しかし、現在利用可能な処置は、主にこの疾患の症状の処置を目的とする（
Ｅｎｚ，Ａ．，「Ｃｌａｓｓｅｓ ｏｆ ｄｒｕｇｓ」，Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈ
ｅｒａｐｙ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｇａｕｔｈｉｅ
ｒ，Ｓ．編，Ｍａｒｔｉｎ Ｄｕｎｉｔｚ発行，Ｍａｌｄｅｎ，ＭＡ（１９９８
））。これらのＡＤ薬物は、中程度の成功およびせいぜい、単にこの疾患の進行
の緩慢化しか提供しない（Ｄｅｌａｇａｒｚａ，Ｖ．Ｗ．，Ａｍ．Ｆａｍｉｌｙ
Ｐｈｙｓ．５８：１１７５−１１８２（１９９８）；Ｅｎｚ，Ａ．，「Ｃｌａ
ｓｓｅｓ ｏｆ ｄｒｕｇｓ」，Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ａｌ
ｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｇａｕｔｈｉｅｒ，Ｓ．編，Ｍａｒｔｉ
ｎ Ｄｕｎｉｔｚ発行，Ｍａｌｄｅｎ，ＭＡ（１９９８））。ＡＤを処置するた
めに現在認可および調査されている薬物は、その作用が神経伝達物質の効果を増
強する薬物、またはその作用がニューロンを防御すると考えられる薬物と特徴付
られ得る（Ｄｅｌａｇａｒｚａ，Ｖ．，Ａｍ．Ｆａｍｉｌｙ Ｐｈｙｓ．５８：
１１７５−１１８２（１９９８））。第１の範疇における最も周知の薬物は、コ
リンエステラーゼインヒビター（例えば、タクリン（ＣｏｇｎｅｘTM）およびド
ネプレジル（ｄｏｎｅｐｒｅｚｉｌ）（ＡｒｉｃｅｐｔTM）（これらの両方とも
、ＦＤＡによって認可されている）である（Ｄｅｌａｇａｒｚａ，Ｖ．，Ａｍ．
Ｆａｍｉｌｙ Ｐｈｙｓ．５８：１１７５−１１８２（１９９８）；Ｓｌｏａｎ
，Ｐ．，Ａｍ．Ｆａｍｉｌｙ Ｐｈｙｓ．５８：１５７７−１５８６（１９９８
））。タクリンおよびドネプレジルは、中程度にしか効果的でなく（Ｓｌｏａｎ
，Ｐ．，Ａｍ．Ｆａｍｉｌｙ Ｐｈｙｓ．５８．１５７７−１５８６（１９９８
））、そして望ましくない副作用（悪心および嘔吐を含む）と関連している（Ｄ
ｅｌａｇａｒｚａ，Ｖ．，Ａｍ．Ｆａｍｉｌｙ Ｐｈｙｓ．５８：１１７５−１
１８２（１９９８））。エストロゲン、ビタミンＥ、セレジリンおよび非ステロ
イド性抗炎症薬物（ＮＳＡＩＤ）を含むいくつかのニューロン防御薬物は、ＡＤ
の処置について調査されている（Ｓｌｏａｎ，Ｐ．，Ａｍ．Ｆａｍｉｌｙ Ｐｈ
ｙｓ．５８：１５７７−１５８６（１９９８）；Ｄｅｌａｇａｒｚａ，Ｖ．，Ａ
ｍ．Ｆａｍｉｌｙ Ｐｈｙｓ．５８．１１７５−１１８２（１９９８））。これ
らの薬物のいずれも、ＡＤの処置について未だ認可されておらず、そして各々は
、重大な欠点（負の副作用または他の疾患の危険性の増加との関連を含む）を有
する（Ｓｌｏａｎ，Ｐ．，Ａｍ．Ｆａｍｉｌｙ Ｐｈｙｓ．５８．１５７７−１
５８６（１９９８）；Ｄｅｌａｇａｒｚａ，Ｖ．，Ａｍ．Ｆａｍｉｌｙ Ｐｈｙ
ｓ．５８：１１７５−１１８２（１９９８）；Ｅｎｚ，Ａ．，「Ｃｌａｓｓｅｓ
ｏｆ ｄｒｕｇｓ」，Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉ
ｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｇａｕｔｈｉｅｒ，Ｓ．編，Ｍａｒｔｉｎ Ｄｕ
ｎｉｔｚ発行，Ｍａｌｄｅｎ，ＭＡ（１９９８））。
る。しかし、現在利用可能な処置は、主にこの疾患の症状の処置を目的とする（
Ｅｎｚ，Ａ．，「Ｃｌａｓｓｅｓ ｏｆ ｄｒｕｇｓ」，Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈ
ｅｒａｐｙ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｇａｕｔｈｉｅ
ｒ，Ｓ．編，Ｍａｒｔｉｎ Ｄｕｎｉｔｚ発行，Ｍａｌｄｅｎ，ＭＡ（１９９８
））。これらのＡＤ薬物は、中程度の成功およびせいぜい、単にこの疾患の進行
の緩慢化しか提供しない（Ｄｅｌａｇａｒｚａ，Ｖ．Ｗ．，Ａｍ．Ｆａｍｉｌｙ
Ｐｈｙｓ．５８：１１７５−１１８２（１９９８）；Ｅｎｚ，Ａ．，「Ｃｌａ
ｓｓｅｓ ｏｆ ｄｒｕｇｓ」，Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ａｌ
ｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｇａｕｔｈｉｅｒ，Ｓ．編，Ｍａｒｔｉ
ｎ Ｄｕｎｉｔｚ発行，Ｍａｌｄｅｎ，ＭＡ（１９９８））。ＡＤを処置するた
めに現在認可および調査されている薬物は、その作用が神経伝達物質の効果を増
強する薬物、またはその作用がニューロンを防御すると考えられる薬物と特徴付
られ得る（Ｄｅｌａｇａｒｚａ，Ｖ．，Ａｍ．Ｆａｍｉｌｙ Ｐｈｙｓ．５８：
１１７５−１１８２（１９９８））。第１の範疇における最も周知の薬物は、コ
リンエステラーゼインヒビター（例えば、タクリン（ＣｏｇｎｅｘTM）およびド
ネプレジル（ｄｏｎｅｐｒｅｚｉｌ）（ＡｒｉｃｅｐｔTM）（これらの両方とも
、ＦＤＡによって認可されている）である（Ｄｅｌａｇａｒｚａ，Ｖ．，Ａｍ．
Ｆａｍｉｌｙ Ｐｈｙｓ．５８：１１７５−１１８２（１９９８）；Ｓｌｏａｎ
，Ｐ．，Ａｍ．Ｆａｍｉｌｙ Ｐｈｙｓ．５８：１５７７−１５８６（１９９８
））。タクリンおよびドネプレジルは、中程度にしか効果的でなく（Ｓｌｏａｎ
，Ｐ．，Ａｍ．Ｆａｍｉｌｙ Ｐｈｙｓ．５８．１５７７−１５８６（１９９８
））、そして望ましくない副作用（悪心および嘔吐を含む）と関連している（Ｄ
ｅｌａｇａｒｚａ，Ｖ．，Ａｍ．Ｆａｍｉｌｙ Ｐｈｙｓ．５８：１１７５−１
１８２（１９９８））。エストロゲン、ビタミンＥ、セレジリンおよび非ステロ
イド性抗炎症薬物（ＮＳＡＩＤ）を含むいくつかのニューロン防御薬物は、ＡＤ
の処置について調査されている（Ｓｌｏａｎ，Ｐ．，Ａｍ．Ｆａｍｉｌｙ Ｐｈ
ｙｓ．５８：１５７７−１５８６（１９９８）；Ｄｅｌａｇａｒｚａ，Ｖ．，Ａ
ｍ．Ｆａｍｉｌｙ Ｐｈｙｓ．５８．１１７５−１１８２（１９９８））。これ
らの薬物のいずれも、ＡＤの処置について未だ認可されておらず、そして各々は
、重大な欠点（負の副作用または他の疾患の危険性の増加との関連を含む）を有
する（Ｓｌｏａｎ，Ｐ．，Ａｍ．Ｆａｍｉｌｙ Ｐｈｙｓ．５８．１５７７−１
５８６（１９９８）；Ｄｅｌａｇａｒｚａ，Ｖ．，Ａｍ．Ｆａｍｉｌｙ Ｐｈｙ
ｓ．５８：１１７５−１１８２（１９９８）；Ｅｎｚ，Ａ．，「Ｃｌａｓｓｅｓ
ｏｆ ｄｒｕｇｓ」，Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉ
ｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｇａｕｔｈｉｅｒ，Ｓ．編，Ｍａｒｔｉｎ Ｄｕ
ｎｉｔｚ発行，Ｍａｌｄｅｎ，ＭＡ（１９９８））。
【０００８】 従って、新規なＡＤ治療剤、特にＡＤの素因に基づく新たなＡＤ治療剤につい
ての必要性が存在する。さらに、これらの治療剤の開発を補助する薬物スクリー
ニング系についての必要性が存在する。
ての必要性が存在する。さらに、これらの治療剤の開発を補助する薬物スクリー
ニング系についての必要性が存在する。
【０００９】 （発明の要旨） Ａ２Ｍ−２欠失が、変化したα2Ｍ ＲＮＡ転写物およびタンパク質の産生を
もたらすという、本明細書中に記載されるこの知見に基づき、脳において、正常
なα2Ｍの機能および活性を置換もしくは補充すること、ならびに／または欠損
ａ2Ｍの機能を抑制することを目的としたストラテジーは、ＡＤ神経病因を治療
的に予防、処置または逆転さえさせるための手段として役立ち得る。さらに、こ
れらのストラテジーは、欠損したα２Ｍ機能に関連した他の病理を処置するため
に有用であり得る。さらに、本明細書中に記載される方法は、これらの治療剤を
スクリーニングするために用いられ得る。従って、本発明は、ＡＤについての新
規な治療剤、これらの治療剤を含む薬学的組成物、これらの治療剤の使用方法、
およびこれらの治療剤についてのスクリーニング方法を提供する。
もたらすという、本明細書中に記載されるこの知見に基づき、脳において、正常
なα2Ｍの機能および活性を置換もしくは補充すること、ならびに／または欠損
ａ2Ｍの機能を抑制することを目的としたストラテジーは、ＡＤ神経病因を治療
的に予防、処置または逆転さえさせるための手段として役立ち得る。さらに、こ
れらのストラテジーは、欠損したα２Ｍ機能に関連した他の病理を処置するため
に有用であり得る。さらに、本明細書中に記載される方法は、これらの治療剤を
スクリーニングするために用いられ得る。従って、本発明は、ＡＤについての新
規な治療剤、これらの治療剤を含む薬学的組成物、これらの治療剤の使用方法、
およびこれらの治療剤についてのスクリーニング方法を提供する。
【００１０】 本発明の第１の局面は、アルツハイマー病についての治療剤を提供することで
あり、ここで、この薬剤は、α２Ｍの機能を置換もしくは補充し得るか、または
Ａ２Ｍ−２の発現を抑制し得る。ＡβおよびＬＲＰに結合し得る分子は、ＬＲＰ
媒介性エンドサイトーシスを通してのＡβのクリアランスを促進し得る。従って
、本発明の１つの実施形態は、Ａβ結合ドメインおよびＬＲＰ結合ドメインを有
する抗ＬＲＰ−Ａβ分子である。本発明の好ましい実施形態では、この分子はペ
プチドである。
あり、ここで、この薬剤は、α２Ｍの機能を置換もしくは補充し得るか、または
Ａ２Ｍ−２の発現を抑制し得る。ＡβおよびＬＲＰに結合し得る分子は、ＬＲＰ
媒介性エンドサイトーシスを通してのＡβのクリアランスを促進し得る。従って
、本発明の１つの実施形態は、Ａβ結合ドメインおよびＬＲＰ結合ドメインを有
する抗ＬＲＰ−Ａβ分子である。本発明の好ましい実施形態では、この分子はペ
プチドである。
【００１１】 本発明の１つの実施形態では、このペプチドは、配列番号６の１０〜５０個の
連続する残基から構成されるＡβ結合ドメイン、および配列番号８の残基１３６
６〜１３９２を含む、配列番号８の１０〜５０個の連続する残基を含むＬＲＰ結
合ドメインを有する抗ＬＲＰ−Ａβペプチドである。本発明の別の実施形態では
、この抗ＬＲＰ−Ａβペプチドは、配列番号６、配列番号１２、配列番号１６、
配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４および配列番号２６
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＡβ結合ドメイン；ならびに配
列番号１０のアミノ酸配列から構成されるＬＲＰ結合ドメインを有する。本発明
のなお別の実施形態では、この抗ＬＲＰ−Ａβペプチドは、配列番号１２、配列
番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４および配
列番号２６からなる群より選択されるアミノ酸を有する配列Ａβ結合ドメイン；
ならびに配列番号８の１０〜５０個の連続する残基から構成されるＬＲＰ結合ド
メインを有する。
連続する残基から構成されるＡβ結合ドメイン、および配列番号８の残基１３６
６〜１３９２を含む、配列番号８の１０〜５０個の連続する残基を含むＬＲＰ結
合ドメインを有する抗ＬＲＰ−Ａβペプチドである。本発明の別の実施形態では
、この抗ＬＲＰ−Ａβペプチドは、配列番号６、配列番号１２、配列番号１６、
配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４および配列番号２６
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＡβ結合ドメイン；ならびに配
列番号１０のアミノ酸配列から構成されるＬＲＰ結合ドメインを有する。本発明
のなお別の実施形態では、この抗ＬＲＰ−Ａβペプチドは、配列番号１２、配列
番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４および配
列番号２６からなる群より選択されるアミノ酸を有する配列Ａβ結合ドメイン；
ならびに配列番号８の１０〜５０個の連続する残基から構成されるＬＲＰ結合ド
メインを有する。
【００１２】 このＡβ結合ドメインは、共有結合、リンカー分子またはリンカーを含まない
ポリエチレングリコールによって、抗ＬＲＰ−Ａβ分子のＬＲＰ結合ドメインへ
と連結され得る。好ましい実施形態では、このＡβ結合ドメインおよびＬＲＰ結
合ドメインは、ペプチド結合によって連結される。本発明の別の好ましい実施形
態では、このＡβ結合ドメインおよびＬＲＰ結合ドメインは、１〜２０個のグリ
シン残基から構成されるペプチドによって連結される。
ポリエチレングリコールによって、抗ＬＲＰ−Ａβ分子のＬＲＰ結合ドメインへ
と連結され得る。好ましい実施形態では、このＡβ結合ドメインおよびＬＲＰ結
合ドメインは、ペプチド結合によって連結される。本発明の別の好ましい実施形
態では、このＡβ結合ドメインおよびＬＲＰ結合ドメインは、１〜２０個のグリ
シン残基から構成されるペプチドによって連結される。
【００１３】 別の実施形態では、この抗ＬＲＰ−Ａβペプチドは、配列番号１４のアミノ酸
配列を有する。あるいは、この抗ＬＲＰ−Ａβペプチドは、配列番号６、配列番
号１２、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号
２４および配列番号２６からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＡβ結
合ドメイン；配列番号１０のアミノ酸配列を有するＬＲＰ結合ドメイン；ならび
にＬＲＰ結合ドメインへとＡβ結合ドメインを連結するリンカーを有する。
配列を有する。あるいは、この抗ＬＲＰ−Ａβペプチドは、配列番号６、配列番
号１２、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号
２４および配列番号２６からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＡβ結
合ドメイン；配列番号１０のアミノ酸配列を有するＬＲＰ結合ドメイン；ならび
にＬＲＰ結合ドメインへとＡβ結合ドメインを連結するリンカーを有する。
【００１４】 さらに、本発明は、抗ＬＲＰ−Ａβペプチドの薬学的に受容可能な塩およびこ
の抗ＬＲＰ−Ａβペプチドをコードする核酸分子を提供する。
の抗ＬＲＰ−Ａβペプチドをコードする核酸分子を提供する。
【００１５】 本発明の別の実施形態は、抗ＬＲＰ−Ａβペプチドをコードする核酸分子に関
し、ここで、このＡβ結合ドメインは、配列番号５の３０〜１５０個の連続する
ヌクレオチドによってコードされ、そしてこのＬＲＰ結合ドメインは、配列番号
７の３０〜１５０個の連続するヌクレオチドによってコードされる。本発明の別
の実施形態では、Ａβ結合ドメインをコードする核酸分子領域は、配列番号５、
配列番号１１、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配
列番号２３および配列番号２５からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有
し；そしてＬＲＰ結合ドメインをコードする領域は、配列番号９のヌクレオチド
配列を有する。本発明のなお別の実施形態では、Ａβ結合ドメインをコードする
核酸分子領域は、配列番号１１、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、
配列番号２１、配列番号２３および配列番号２５からなる群より選択されるヌク
レオチド配列を有し；そしてＬＲＰ結合ドメインをコードする領域は、配列番号
７の３０〜１５０個の連続するヌクレオチドによってコードされる。本発明の別
の実施形態では、この核酸分子は、配列番号１３のヌクレオチド配列を有する。
し、ここで、このＡβ結合ドメインは、配列番号５の３０〜１５０個の連続する
ヌクレオチドによってコードされ、そしてこのＬＲＰ結合ドメインは、配列番号
７の３０〜１５０個の連続するヌクレオチドによってコードされる。本発明の別
の実施形態では、Ａβ結合ドメインをコードする核酸分子領域は、配列番号５、
配列番号１１、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配
列番号２３および配列番号２５からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有
し；そしてＬＲＰ結合ドメインをコードする領域は、配列番号９のヌクレオチド
配列を有する。本発明のなお別の実施形態では、Ａβ結合ドメインをコードする
核酸分子領域は、配列番号１１、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、
配列番号２１、配列番号２３および配列番号２５からなる群より選択されるヌク
レオチド配列を有し；そしてＬＲＰ結合ドメインをコードする領域は、配列番号
７の３０〜１５０個の連続するヌクレオチドによってコードされる。本発明の別
の実施形態では、この核酸分子は、配列番号１３のヌクレオチド配列を有する。
【００１６】 Ａβ結合ドメインをコードする領域は、核酸分子のうちのＬＲＰ結合ドメイン
をコードする領域に、ホスホジエステル結合によって連結され得る。あるいは、
こえらの領域は、リンカーペプチドをコードするヌクレオチドによって連結され
得る。本発明の好ましい実施形態では、この連結するヌクレオチドは、１〜２０
個のグリシン残基をコードする。
をコードする領域に、ホスホジエステル結合によって連結され得る。あるいは、
こえらの領域は、リンカーペプチドをコードするヌクレオチドによって連結され
得る。本発明の好ましい実施形態では、この連結するヌクレオチドは、１〜２０
個のグリシン残基をコードする。
【００１７】 さらに、本発明は、これらの核酸分子に対して少なくとも９５％の相同性を有
する核酸分子に関する。
する核酸分子に関する。
【００１８】 本発明の別の実施形態は、上記の核酸分子に相補的である第２のポリヌクレオ
チドにハイブリダイズする、第１のポリヌクレオチドである核酸分子に関する。
本発明の別の実施形態では、この核酸分子は、配列番号１３のヌクレオチド配列
に相補的である第２のポリヌクレオチドにハイブリダイズする、第１のポリヌク
レオチドである。本発明のなお別の実施形態では、第１および第２のポリヌクレ
オチドのハイブリダイゼーションについてのハイブリダイズ条件は以下の通りで
ある：（ａ）５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐ
Ｈ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％デキストラン硫酸および２０μｇ／ｍ
ｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡからなる溶液中での４２℃での一晩のインキュベー
ト；ならびに（ｂ）０．１×ＳＳＣからなる溶液中での６５℃での洗浄。
チドにハイブリダイズする、第１のポリヌクレオチドである核酸分子に関する。
本発明の別の実施形態では、この核酸分子は、配列番号１３のヌクレオチド配列
に相補的である第２のポリヌクレオチドにハイブリダイズする、第１のポリヌク
レオチドである。本発明のなお別の実施形態では、第１および第２のポリヌクレ
オチドのハイブリダイゼーションについてのハイブリダイズ条件は以下の通りで
ある：（ａ）５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐ
Ｈ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％デキストラン硫酸および２０μｇ／ｍ
ｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡからなる溶液中での４２℃での一晩のインキュベー
ト；ならびに（ｂ）０．１×ＳＳＣからなる溶液中での６５℃での洗浄。
【００１９】 本発明の関連する実施形態は、抗ＬＲＰ−Ａβ分子および１以上の薬学的に受
容可能なキャリアを含む、薬学的組成物である。さらに、本発明は、抗ＬＲＰ−
Ａβペプチドまたは薬学的に受容可能なその塩を含む、薬学的組成物を提供する
。好ましい実施形態では、この薬学的組成物は、配列番号４もしくは配列番号１
４からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する抗ＬＲＰ−Ａβペプチドまた
は薬学的に受容可能なその塩、および１以上の薬学的に受容可能なキャリアを含
む。本発明はまた、抗ＬＲＰ−Ａβ分子または薬学的に受容可能なその塩を投与
することによる、被験体におけるアルツハイマー病と闘う方法に関する。好まし
い実施形態では、この抗ＬＲＰ−Ａβ分子はペプチドである。別の好ましい実施
形態では、この抗ＬＲＰ−Ａβペプチドは、配列番号４もしくは配列番号１４か
らなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチド、または薬学的に受容可
能なその塩である。
容可能なキャリアを含む、薬学的組成物である。さらに、本発明は、抗ＬＲＰ−
Ａβペプチドまたは薬学的に受容可能なその塩を含む、薬学的組成物を提供する
。好ましい実施形態では、この薬学的組成物は、配列番号４もしくは配列番号１
４からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する抗ＬＲＰ−Ａβペプチドまた
は薬学的に受容可能なその塩、および１以上の薬学的に受容可能なキャリアを含
む。本発明はまた、抗ＬＲＰ−Ａβ分子または薬学的に受容可能なその塩を投与
することによる、被験体におけるアルツハイマー病と闘う方法に関する。好まし
い実施形態では、この抗ＬＲＰ−Ａβ分子はペプチドである。別の好ましい実施
形態では、この抗ＬＲＰ−Ａβペプチドは、配列番号４もしくは配列番号１４か
らなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチド、または薬学的に受容可
能なその塩である。
【００２０】 本発明はまた、Ａ２Ｍ−２ ＲＮＡを標的化するように設計されたＡ２Ｍ−２
アンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。本発明の１つの好ましい実施形態で
は、このＡ２Ｍ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ａ２Ｍ−２異核ＲＮＡ
を標的化するように設計される。別の好ましい実施形態では、このＡ２Ｍ−２ア
ンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ａ２Ｍ−２ ｍＲＮＡを標的化するように設
計される。本発明の１つの実施形態では、Ａ２Ｍ ｈｎＲＮＡを標的化するよう
に設計されたこのＡ２Ｍ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号２７
のヌクレオチド配列を有する。このＡ２Ｍ−２アンチセンスオリゴヌクレオチド
は好ましくは、８〜５０ヌクレオチド長であり、より好ましくは１５〜３０ヌク
レオチド長であり、そして最も好ましくは１５ヌクレオチド長である。従って、
本発明の別の好ましい実施形態では、Ａ２Ｍ−２ ｈｎＲＮＡを標的化するよう
に設計されたＡ２Ｍ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号２７の最
後の１５〜３０の連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する。本発明の
別の実施形態では、Ａ２Ｍ−２を標的化するように設計されたこのＡ２Ｍ−２ア
ンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号２７のヌクレオチド３６〜５０の配
列または配列番号２７のヌクレオチド２０〜５０を有する。本発明はまた、Ａ２
Ｍ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび１以上の薬学的に受容可能なキャ
リアを含む薬学的組成物に関する。さらに、本発明は、このＡ２Ｍ−２アンチセ
ンスオリゴヌクレオチドを投与することによる、被験体におけるアルツハイマー
病と闘う方法に関する。
アンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。本発明の１つの好ましい実施形態で
は、このＡ２Ｍ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ａ２Ｍ−２異核ＲＮＡ
を標的化するように設計される。別の好ましい実施形態では、このＡ２Ｍ−２ア
ンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ａ２Ｍ−２ ｍＲＮＡを標的化するように設
計される。本発明の１つの実施形態では、Ａ２Ｍ ｈｎＲＮＡを標的化するよう
に設計されたこのＡ２Ｍ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号２７
のヌクレオチド配列を有する。このＡ２Ｍ−２アンチセンスオリゴヌクレオチド
は好ましくは、８〜５０ヌクレオチド長であり、より好ましくは１５〜３０ヌク
レオチド長であり、そして最も好ましくは１５ヌクレオチド長である。従って、
本発明の別の好ましい実施形態では、Ａ２Ｍ−２ ｈｎＲＮＡを標的化するよう
に設計されたＡ２Ｍ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号２７の最
後の１５〜３０の連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する。本発明の
別の実施形態では、Ａ２Ｍ−２を標的化するように設計されたこのＡ２Ｍ−２ア
ンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号２７のヌクレオチド３６〜５０の配
列または配列番号２７のヌクレオチド２０〜５０を有する。本発明はまた、Ａ２
Ｍ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび１以上の薬学的に受容可能なキャ
リアを含む薬学的組成物に関する。さらに、本発明は、このＡ２Ｍ−２アンチセ
ンスオリゴヌクレオチドを投与することによる、被験体におけるアルツハイマー
病と闘う方法に関する。
【００２１】 本発明はまた、α2Ｍまたは抗ＬＲＰ−Ａβペプチドをコードする導入遺伝子
を保有するウイルスベクターを提供する。本発明の好ましい実施形態では、この
ウイルスベクターは、α2Ｍをコードする遺伝子を保有する。本発明の別の好ま
しい実施形態では、α2Ｍをコードする遺伝子は、配列番号１のヌクレオチド４
４〜４４６５のヌクレオチド配列を有する。本発明はまた、抗ＬＲＰ−Ａβペプ
チドをコードする遺伝子を保有するウイルスベクターに関する。本発明の別の好
ましい実施形態では、このウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスである。さ
らに、本発明は、ウイルスベクターおよび１以上の薬学的に受容可能なキャリア
を含む薬学的組成物、ならびにこのウイルスベクターを投与することによって被
験体においてアルツハイマー病と闘う方法を提供する。
を保有するウイルスベクターを提供する。本発明の好ましい実施形態では、この
ウイルスベクターは、α2Ｍをコードする遺伝子を保有する。本発明の別の好ま
しい実施形態では、α2Ｍをコードする遺伝子は、配列番号１のヌクレオチド４
４〜４４６５のヌクレオチド配列を有する。本発明はまた、抗ＬＲＰ−Ａβペプ
チドをコードする遺伝子を保有するウイルスベクターに関する。本発明の別の好
ましい実施形態では、このウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスである。さ
らに、本発明は、ウイルスベクターおよび１以上の薬学的に受容可能なキャリア
を含む薬学的組成物、ならびにこのウイルスベクターを投与することによって被
験体においてアルツハイマー病と闘う方法を提供する。
【００２２】 本発明の第２の局面は、α２Ｍ機能を置換もしくは補充し得るか、またはＡ２
Ｍ−２の発現を抑制し得るアルツハイマー病のための治療剤についてスクリーニ
ングする方法を提供することである。本発明の１つの実施形態は、Ａ２Ｍ−２対
立遺伝子についてヘテロ接合性またはホモ接合性である細胞を、試験薬剤の存在
下でインキュベートすること、次いで正常なＡ２Ｍ ｍＲＮＡの、異常なＡ２Ｍ
ｍＲＮＡに対する比が、この試験薬剤で未処理の細胞において見出される、正
常なＡ２Ｍ ｍＲＮＡの、異常なＡ２Ｍ ｍＲＮＡに対する比と比較して増加し
ているか否かを決定することによって、ＡＤのための治療剤についてスクリーニ
ングする方法である。この方法の１つの好ましい実施形態では、この細胞は、神
経膠腫細胞である。別の好ましい実施形態では、この細胞は、肝細胞癌である。
本発明のなお別の好ましい実施形態では、この細胞は、Ａ２Ｍ−２対立遺伝子に
ついてヘテロ接合性である。
Ｍ−２の発現を抑制し得るアルツハイマー病のための治療剤についてスクリーニ
ングする方法を提供することである。本発明の１つの実施形態は、Ａ２Ｍ−２対
立遺伝子についてヘテロ接合性またはホモ接合性である細胞を、試験薬剤の存在
下でインキュベートすること、次いで正常なＡ２Ｍ ｍＲＮＡの、異常なＡ２Ｍ
ｍＲＮＡに対する比が、この試験薬剤で未処理の細胞において見出される、正
常なＡ２Ｍ ｍＲＮＡの、異常なＡ２Ｍ ｍＲＮＡに対する比と比較して増加し
ているか否かを決定することによって、ＡＤのための治療剤についてスクリーニ
ングする方法である。この方法の１つの好ましい実施形態では、この細胞は、神
経膠腫細胞である。別の好ましい実施形態では、この細胞は、肝細胞癌である。
本発明のなお別の好ましい実施形態では、この細胞は、Ａ２Ｍ−２対立遺伝子に
ついてヘテロ接合性である。
【００２３】 この方法の関連する実施形態では、Ｓ１ヌクレアーゼを用いて、正常なＡ２Ｍ
ｍＲＮＡの、異常なＡ２Ｍ ｍＲＮＡに対する比が決定され、そして用いられ
るプローブは、Ａ２Ｍをコードするヌクレオチド（配列番号１）に相補的である
。従って、本発明の１つの実施形態では、配列番号１に相補的なプローブを用い
たＳ１ヌクレアーゼ分析（ここで、このプローブは、配列番号１のヌクレオチド
２０５７〜２２８４を含む）を用いて、正常なＡ２Ｍ ｍＲＮＡの、異常なＡ２
Ｍ ｍＲＮＡに対する比が増加したか否かが決定される。本発明の好ましい方法
では、Ｓ１ヌクレアーゼ分析において用いられるプローブは、３００ｂｐ長であ
る。本発明の別の実施形態では、Ｓ１ヌクレアーゼ分析において用いられるプロ
ーブは、配列番号１のヌクレオチド２０２４〜２３２３に相補的である。
ｍＲＮＡの、異常なＡ２Ｍ ｍＲＮＡに対する比が決定され、そして用いられ
るプローブは、Ａ２Ｍをコードするヌクレオチド（配列番号１）に相補的である
。従って、本発明の１つの実施形態では、配列番号１に相補的なプローブを用い
たＳ１ヌクレアーゼ分析（ここで、このプローブは、配列番号１のヌクレオチド
２０５７〜２２８４を含む）を用いて、正常なＡ２Ｍ ｍＲＮＡの、異常なＡ２
Ｍ ｍＲＮＡに対する比が増加したか否かが決定される。本発明の好ましい方法
では、Ｓ１ヌクレアーゼ分析において用いられるプローブは、３００ｂｐ長であ
る。本発明の別の実施形態では、Ｓ１ヌクレアーゼ分析において用いられるプロ
ーブは、配列番号１のヌクレオチド２０２４〜２３２３に相補的である。
【００２４】 あるいは、ＲＴ ＰＣＲ分析を用いて、正常なＡ２Ｍ ｍＲＮＡの、異常なＡ
２Ｍ ｍＲＮＡに対する比が増加したか否かを決定する。ＲＴ ＰＣＲ分析の好
ましい方法では、プライマーは、エキソン１７〜１８を含むＡ２Ｍの領域を増幅
するために設計される。ＲＴ ＰＣＲ分析のより好ましい方法では、エキソン１
７〜１８を含むＡ２Ｍの増幅された領域は、３００ｂｐ長である。本発明の別の
実施形態では、ＲＴ ＰＣＲ分析のために用いられるプライマーは、配列番号１
のヌクレオチド２０５２〜２２８９を増幅するために設計される。本発明の別の
実施形態は、ＲＴ ＰＣＲ分析のための、配列番号１のヌクレオチド２０２４〜
２０３８に相補的なヌクレオチド配列を有する第１のプライマーおよび配列番号
１のヌクレオチド２３０９〜２３２３のヌクレオチド配列を有する第２のプライ
マーの使用に関する。
２Ｍ ｍＲＮＡに対する比が増加したか否かを決定する。ＲＴ ＰＣＲ分析の好
ましい方法では、プライマーは、エキソン１７〜１８を含むＡ２Ｍの領域を増幅
するために設計される。ＲＴ ＰＣＲ分析のより好ましい方法では、エキソン１
７〜１８を含むＡ２Ｍの増幅された領域は、３００ｂｐ長である。本発明の別の
実施形態では、ＲＴ ＰＣＲ分析のために用いられるプライマーは、配列番号１
のヌクレオチド２０５２〜２２８９を増幅するために設計される。本発明の別の
実施形態は、ＲＴ ＰＣＲ分析のための、配列番号１のヌクレオチド２０２４〜
２０３８に相補的なヌクレオチド配列を有する第１のプライマーおよび配列番号
１のヌクレオチド２３０９〜２３２３のヌクレオチド配列を有する第２のプライ
マーの使用に関する。
【００２５】 本発明はまた、α2Ｍを、試験薬剤とともにインキュベートし、次いでこの処
理したα2Ｍがコンホメーションの変化を受けたか否かを決定するか、またはこ
の処理したα2ＭがＬＲＰに結合し得るか否かを決定することによる、アルツハ
イマー病のための治療剤についてのスクリーニング方法を提供する。本発明の好
ましい実施形態では、試験薬剤で処理されたα2Ｍは、テトラマーα2Ｍである。
本発明の別の好ましい実施形態では、α2Ｍ電気泳動移動度アッセイを用いて、
処理したα2Ｍが、コンホメーションの変化を受けたか否かが決定される。本発
明の別の実施形態では、ＥＬＩＳＡを用いて、処理したα2ＭがＬＲＰに結合し
得るか否かが決定される。本発明の関連の実施形態では、このＥＬＩＳＡは、以
下の工程を連続した順番で含む：抗ＬＲＰ ＩｇＧで被覆されたウェルにおいて
、ＬＲＰをインキュベートする工程、このウェルを処理されたα2Ｍとともにイ
ンキュベートする工程、このウェルを酵素に結合体化された抗α2Ｍ ＩｇＧと
ともにインキュベートする工程、およびこのウェルをこの酵素の基質とともにイ
ンキュベートする工程。代替の実施形態では、このＥＬＩＳＡは、以下の工程を
連続した順番で含む：ＬＲＰで被覆されたウェルを、処理されたα2Ｍとともに
インキュベートする工程、このウェルを酵素に結合体化された抗α2Ｍ ＩｇＧ
とともにインキュベートする工程、およびこのウェルをこの酵素の基質とともに
インキュベートする工程。別の実施形態では、このＥＬＩＳＡは、以下の工程を
連続した順番で含む：活性化α2Ｍに特異的な抗α2Ｍ ＩｇＧで被覆されたウェ
ルにおいて、処理されたα2Ｍをインキュベートする工程、このウェルを酵素に
結合体化された抗α2Ｍ ＩｇＧとともにインキュベートする工程、およびこの
ウェルをこの酵素のための基質とともにインキュベートする工程。本発明の別の
実施形態では、抗ＬＲＰ ＩｇＧおよび抗α2Ｍ ＩｇＧを用いるイムノブロッ
ティングを用いて、処理されたα2ＭがＬＲＰに結合し得るか否かが決定される
。本発明のなお別の実施形態では、処理されたα2ＭがＬＲＰ媒介性エンドサイ
トーシスを受ける能力についての試験を用いて、処理されたα2ＭがＬＲＰに結
合し得るか否かが決定される。本発明の別の実施形態では、処理されたα2Ｍが
ＬＲＰ媒介分解を受ける能力についての試験を用いて、処理されたα2ＭがＬＲ
Ｐに結合し得るか否かが決定される。
理したα2Ｍがコンホメーションの変化を受けたか否かを決定するか、またはこ
の処理したα2ＭがＬＲＰに結合し得るか否かを決定することによる、アルツハ
イマー病のための治療剤についてのスクリーニング方法を提供する。本発明の好
ましい実施形態では、試験薬剤で処理されたα2Ｍは、テトラマーα2Ｍである。
本発明の別の好ましい実施形態では、α2Ｍ電気泳動移動度アッセイを用いて、
処理したα2Ｍが、コンホメーションの変化を受けたか否かが決定される。本発
明の別の実施形態では、ＥＬＩＳＡを用いて、処理したα2ＭがＬＲＰに結合し
得るか否かが決定される。本発明の関連の実施形態では、このＥＬＩＳＡは、以
下の工程を連続した順番で含む：抗ＬＲＰ ＩｇＧで被覆されたウェルにおいて
、ＬＲＰをインキュベートする工程、このウェルを処理されたα2Ｍとともにイ
ンキュベートする工程、このウェルを酵素に結合体化された抗α2Ｍ ＩｇＧと
ともにインキュベートする工程、およびこのウェルをこの酵素の基質とともにイ
ンキュベートする工程。代替の実施形態では、このＥＬＩＳＡは、以下の工程を
連続した順番で含む：ＬＲＰで被覆されたウェルを、処理されたα2Ｍとともに
インキュベートする工程、このウェルを酵素に結合体化された抗α2Ｍ ＩｇＧ
とともにインキュベートする工程、およびこのウェルをこの酵素の基質とともに
インキュベートする工程。別の実施形態では、このＥＬＩＳＡは、以下の工程を
連続した順番で含む：活性化α2Ｍに特異的な抗α2Ｍ ＩｇＧで被覆されたウェ
ルにおいて、処理されたα2Ｍをインキュベートする工程、このウェルを酵素に
結合体化された抗α2Ｍ ＩｇＧとともにインキュベートする工程、およびこの
ウェルをこの酵素のための基質とともにインキュベートする工程。本発明の別の
実施形態では、抗ＬＲＰ ＩｇＧおよび抗α2Ｍ ＩｇＧを用いるイムノブロッ
ティングを用いて、処理されたα2ＭがＬＲＰに結合し得るか否かが決定される
。本発明のなお別の実施形態では、処理されたα2ＭがＬＲＰ媒介性エンドサイ
トーシスを受ける能力についての試験を用いて、処理されたα2ＭがＬＲＰに結
合し得るか否かが決定される。本発明の別の実施形態では、処理されたα2Ｍが
ＬＲＰ媒介分解を受ける能力についての試験を用いて、処理されたα2ＭがＬＲ
Ｐに結合し得るか否かが決定される。
【００２６】 （好ましい実施形態の詳細な説明） （定義） 以下の説明において、組換えＤＮＡ技術、分子生物学および細胞生物学、なら
びに薬理学において使用される多数の用語が広汎に使用される。そのような用語
によって与えられる範囲を含め、明細書および請求の範囲のより明瞭でかつ一貫
した理解を提供するために、以下に定義を提供する。
びに薬理学において使用される多数の用語が広汎に使用される。そのような用語
によって与えられる範囲を含め、明細書および請求の範囲のより明瞭でかつ一貫
した理解を提供するために、以下に定義を提供する。
【００２７】 ヌクレオチド：「ヌクレオチド」とは、塩基−糖−ホスフェートの組合せをい
う。ヌクレオチドは、核酸配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ）のモノマー単位である。
用語ヌクレオチドには、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＩＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ、
ｄＴＴＰ、またはそれらの誘導体のようなデオキシリボヌクレオシド三リン酸が
包含される。そのような誘導体としては、例えば、［αＳ］ｄＡＴＰ、７−デア
ザ−ｄＧＴＰおよび７−デアザ−ｄＡＴＰが挙げられる。用語ヌクレオチドは、
本明細書において使用されるときにはまた、ジデオキシリボヌクレオシド三リン
酸（ｄｄＮＴＰ）およびその誘導体をもいう。ジデオキシリボヌクレオチド三リ
ン酸の例示的な例としては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：ｄｄＡ
ＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰおよびｄｄＴＴＰ。本発明に従って
、「ヌクレオチド」は、標識されていないか、または周知の技術によって検出可
能に標識され得る。検出可能な標識としては、例えば、放射性同位体、蛍光標識
、化学発光標識、生物発光標識および酵素標識が挙げられる。
う。ヌクレオチドは、核酸配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ）のモノマー単位である。
用語ヌクレオチドには、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＩＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ、
ｄＴＴＰ、またはそれらの誘導体のようなデオキシリボヌクレオシド三リン酸が
包含される。そのような誘導体としては、例えば、［αＳ］ｄＡＴＰ、７−デア
ザ−ｄＧＴＰおよび７−デアザ−ｄＡＴＰが挙げられる。用語ヌクレオチドは、
本明細書において使用されるときにはまた、ジデオキシリボヌクレオシド三リン
酸（ｄｄＮＴＰ）およびその誘導体をもいう。ジデオキシリボヌクレオチド三リ
ン酸の例示的な例としては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：ｄｄＡ
ＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰおよびｄｄＴＴＰ。本発明に従って
、「ヌクレオチド」は、標識されていないか、または周知の技術によって検出可
能に標識され得る。検出可能な標識としては、例えば、放射性同位体、蛍光標識
、化学発光標識、生物発光標識および酵素標識が挙げられる。
【００２８】 ポリヌクレオチド：「ポリヌクレオチド」とは、あるヌクレオチドの３’位と
、隣接するヌクレオチドの５’位との間のホスホジエステル結合によって連結さ
れるヌクレオチドの直鎖状ポリマーである。
、隣接するヌクレオチドの５’位との間のホスホジエステル結合によって連結さ
れるヌクレオチドの直鎖状ポリマーである。
【００２９】 オリゴヌクレオチド：「オリゴヌクレオチド」とは、天然に存在する塩基、糖
および糖間の（骨格）連結からなるヌクレオチドまたはヌクレオシドのモノマー
のオリゴマーもしくはポリマーをいう。用語「オリゴヌクレオチド」はまた、同
様に機能する、非天然に存在するモノマー、またはその部分を含むオリゴマーを
も包含する。そのような改変されたかまたは置換されたオリゴヌクレオチドはし
ばしば、以下の点において天然の形態より好ましい：非天然の形態は、細胞取り
込みの強化、ヌクレアーゼの存在下での安定性の増加、および治療試薬または診
断試薬としてより受容可能にさせる他の機能を示し得る。
および糖間の（骨格）連結からなるヌクレオチドまたはヌクレオシドのモノマー
のオリゴマーもしくはポリマーをいう。用語「オリゴヌクレオチド」はまた、同
様に機能する、非天然に存在するモノマー、またはその部分を含むオリゴマーを
も包含する。そのような改変されたかまたは置換されたオリゴヌクレオチドはし
ばしば、以下の点において天然の形態より好ましい：非天然の形態は、細胞取り
込みの強化、ヌクレアーゼの存在下での安定性の増加、および治療試薬または診
断試薬としてより受容可能にさせる他の機能を示し得る。
【００３０】 核酸分子：「核酸分子」とは、ヌクレオチドから構成されるポリマー性分子を
意味する。本発明の核酸分子は、クローニングによって入手可能であるかまたは
合成的に産生される、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡ（例え
ば、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを含む）の形態で存在し得る。ＤＮＡは、二本
鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖であり得、
これはまたセンス鎖としても知られ、あるいはこれらは、非コード鎖であり得、
これはまたアンチセンスとしても知られる。
意味する。本発明の核酸分子は、クローニングによって入手可能であるかまたは
合成的に産生される、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡ（例え
ば、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを含む）の形態で存在し得る。ＤＮＡは、二本
鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖であり得、
これはまたセンス鎖としても知られ、あるいはこれらは、非コード鎖であり得、
これはまたアンチセンスとしても知られる。
【００３１】 相補（的）：本明細書において使用される「相補（的）」とは、２つの核酸（
例えば、２つのＤＮＡ分子）の間でのサブユニット配列の相補性に対していう。
それらの分子の両方におけるヌクレオチド位置が通常互いに塩基対合し得るヌク
レオチドによって占有される場合、その核酸は、その位置において互いに相補的
であるとみなされる。従って、２つの核酸は、それらの分子の各々における対応
する位置において実質的な数（少なくとも６０％）が互いに通常塩基対合するヌ
クレオチドによって占有されている場合に、互いに対して相補的である（例えば
、Ａ：ＴおよびＧ：Ｃのヌクレオチド対）。
例えば、２つのＤＮＡ分子）の間でのサブユニット配列の相補性に対していう。
それらの分子の両方におけるヌクレオチド位置が通常互いに塩基対合し得るヌク
レオチドによって占有される場合、その核酸は、その位置において互いに相補的
であるとみなされる。従って、２つの核酸は、それらの分子の各々における対応
する位置において実質的な数（少なくとも６０％）が互いに通常塩基対合するヌ
クレオチドによって占有されている場合に、互いに対して相補的である（例えば
、Ａ：ＴおよびＧ：Ｃのヌクレオチド対）。
【００３２】 ハイブリダイゼーション：用語「ハイブリダイゼーション」および「〜に特異
的にハイブリダイズする」とは、二本の相補的な一本鎖核酸分子（ＲＮＡおよび
／またはＤＮＡ）が対合して二本鎖分子を与えることをいう。これらの用語は、
そのＤＮＡもしくはＲＮＡの標的と、オリゴヌクレオチドとの間に安定かつ特異
的な結合が生じるように、そのヌクレオチドが充分に相補的であることをいうた
めに使用される。特異的にハイブリダイズ可能であるために、オリゴヌクレオチ
ドがその標的核酸配列に対して１００％相補的である必要はないことが理解され
る。オリゴヌクレオチドは、そのオリゴヌクレオチドのその標的への結合がその
標的分子の通常の機能に干渉して有用性の喪失を生じ、そして特異的結合が所望
される条件下（すなわち、インビボアッセイまたは治療処置の場合には生理学的
条件下、またはインビトロアッセイの場合には、そのアッセイが実施される条件
下）で、そのオリゴヌクレオチドの非標的配列への非特異的結合を回避するに充
分な程度の相補性が存在する場合に、別のオリゴヌクレオチドに対して特異的に
ハイブリダイズする。
的にハイブリダイズする」とは、二本の相補的な一本鎖核酸分子（ＲＮＡおよび
／またはＤＮＡ）が対合して二本鎖分子を与えることをいう。これらの用語は、
そのＤＮＡもしくはＲＮＡの標的と、オリゴヌクレオチドとの間に安定かつ特異
的な結合が生じるように、そのヌクレオチドが充分に相補的であることをいうた
めに使用される。特異的にハイブリダイズ可能であるために、オリゴヌクレオチ
ドがその標的核酸配列に対して１００％相補的である必要はないことが理解され
る。オリゴヌクレオチドは、そのオリゴヌクレオチドのその標的への結合がその
標的分子の通常の機能に干渉して有用性の喪失を生じ、そして特異的結合が所望
される条件下（すなわち、インビボアッセイまたは治療処置の場合には生理学的
条件下、またはインビトロアッセイの場合には、そのアッセイが実施される条件
下）で、そのオリゴヌクレオチドの非標的配列への非特異的結合を回避するに充
分な程度の相補性が存在する場合に、別のオリゴヌクレオチドに対して特異的に
ハイブリダイズする。
【００３３】 プライマー：本明細書において「プライマー」とは、ＤＮＡ分子の増幅または
重合化の間のヌクレオチドモノマーの共有結合によって伸長される一本鎖オリゴ
ヌクレオチドをいう。ミニサテライトのダイマー、トリマー、テトラマーなどの
配列の増幅のために使用されるミニサテライトプライマーは、当該分野において
周知である。
重合化の間のヌクレオチドモノマーの共有結合によって伸長される一本鎖オリゴ
ヌクレオチドをいう。ミニサテライトのダイマー、トリマー、テトラマーなどの
配列の増幅のために使用されるミニサテライトプライマーは、当該分野において
周知である。
【００３４】 テンプレート：用語「テンプレート」とは、本明細書において使用される場合
、増幅、合成または配列決定されるべき、二本鎖または一本鎖の核酸分子をいう
。二本鎖ＤＮＡ分子の場合、その鎖を変性させて第一および第二の鎖を形成させ
ることは、これらの分子が、増幅、合成または配列決定され得る前に実施される
。ＤＮＡテンプレートの一部に相補的なプライマーは、適切な条件下でハイブリ
ダイズし、次いで、本発明のＤＮＡポリメラーゼが、そのテンプレートまたはそ
の一部に対して相補的なＤＮＡ分子を合成し得る。本発明に従って、新たに合成
されたＤＮＡ分子は、もとのＤＮＡテンプレートと同等またはそれ未満の長さで
あり得る。新たに合成されたＤＮＡ分子の合成または伸長の間のミスマッチ取り
込みもしくは鎖の漏れ（ｓｌｉｐｐａｇｅ）は、１または多数のミスマッチの塩
基対合を生じ得る。従って、合成されたＤＮＡ分子は、そのＤＮＡテンプレート
に対して正確に相補的である必要はない。
、増幅、合成または配列決定されるべき、二本鎖または一本鎖の核酸分子をいう
。二本鎖ＤＮＡ分子の場合、その鎖を変性させて第一および第二の鎖を形成させ
ることは、これらの分子が、増幅、合成または配列決定され得る前に実施される
。ＤＮＡテンプレートの一部に相補的なプライマーは、適切な条件下でハイブリ
ダイズし、次いで、本発明のＤＮＡポリメラーゼが、そのテンプレートまたはそ
の一部に対して相補的なＤＮＡ分子を合成し得る。本発明に従って、新たに合成
されたＤＮＡ分子は、もとのＤＮＡテンプレートと同等またはそれ未満の長さで
あり得る。新たに合成されたＤＮＡ分子の合成または伸長の間のミスマッチ取り
込みもしくは鎖の漏れ（ｓｌｉｐｐａｇｅ）は、１または多数のミスマッチの塩
基対合を生じ得る。従って、合成されたＤＮＡ分子は、そのＤＮＡテンプレート
に対して正確に相補的である必要はない。
【００３５】 増幅：本明細書において使用される場合、「増幅」とは、ＤＮＡポリメラーゼ
を使用してヌクレオチド配列のコピー数を増加させるための任意のインビトロ方
法をいう。核酸増幅は、ＤＮＡまたは分子またはプライマーへのヌクレオチドの
取り込みを生じ、それによって、ＤＮＡテンプレートに対して相補的な新たなＤ
ＮＡ分子が形成する。形成されたＤＮＡ分子およびそのテンプレートをテンプレ
ートとして使用して、さらなるＤＮＡ分子を合成し得る。本明細書において使用
される場合、ある増幅反応は、多数のＤＮＡ複製からなり得る。ＤＮＡ増幅反応
としては、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が挙げられる。あるＰＣＲ
反応は、５〜１００の「サイクル」の、ＤＮＡ分子の変性および合成からなり得
る。
を使用してヌクレオチド配列のコピー数を増加させるための任意のインビトロ方
法をいう。核酸増幅は、ＤＮＡまたは分子またはプライマーへのヌクレオチドの
取り込みを生じ、それによって、ＤＮＡテンプレートに対して相補的な新たなＤ
ＮＡ分子が形成する。形成されたＤＮＡ分子およびそのテンプレートをテンプレ
ートとして使用して、さらなるＤＮＡ分子を合成し得る。本明細書において使用
される場合、ある増幅反応は、多数のＤＮＡ複製からなり得る。ＤＮＡ増幅反応
としては、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が挙げられる。あるＰＣＲ
反応は、５〜１００の「サイクル」の、ＤＮＡ分子の変性および合成からなり得
る。
【００３６】 ９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性：参照ヌクレオチド配
列に対して少なくとも例えば９５％「同一」であるヌクレオチド配列を有するポ
リヌクレオチドとは、そのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、そのポリヌ
クレオチド配列がその参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチドあたり５つ
の点変異までを包含し得ることを除き、その参照配列と同一であることを意図す
る。換言すれば、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一であるヌ
クレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、その参照配列における
ヌクレオチドの５％までが欠失するかまたは別のヌクレオチドに置換され得るか
、またはその参照配列の全ヌクレオチドの５％までの多数のヌクレオチドがその
参照配列に挿入され得る。この参照配列のこれらの変異は、その参照ヌクレオチ
ド配列の５’末端位置または３’末端位置あるいはそれらの末端位置の間のどこ
かで、その参照配列内ヌクレオチド間で個々にか、またはその参照配列内の１つ
以上の連続する群においていずれかで分散されて、生じ得る。
列に対して少なくとも例えば９５％「同一」であるヌクレオチド配列を有するポ
リヌクレオチドとは、そのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、そのポリヌ
クレオチド配列がその参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチドあたり５つ
の点変異までを包含し得ることを除き、その参照配列と同一であることを意図す
る。換言すれば、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一であるヌ
クレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、その参照配列における
ヌクレオチドの５％までが欠失するかまたは別のヌクレオチドに置換され得るか
、またはその参照配列の全ヌクレオチドの５％までの多数のヌクレオチドがその
参照配列に挿入され得る。この参照配列のこれらの変異は、その参照ヌクレオチ
ド配列の５’末端位置または３’末端位置あるいはそれらの末端位置の間のどこ
かで、その参照配列内ヌクレオチド間で個々にか、またはその参照配列内の１つ
以上の連続する群においていずれかで分散されて、生じ得る。
【００３７】 実際には、任意の特定の核酸分子が、例えば、配列番号１に示されるヌクレオ
チド配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一
であるか否かは、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムのような公知のコンピュータプログ
ラムを用いて従来のように決定され得る（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃ
ｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉ
ｘ（登録商標）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖ
ｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄ
ｉｓｏｎ、ＷＩ ５３７１ １）。Ｂｅｓｔｆｉｔは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗ
ａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔ
ｉｃｓ ２：４８２−４８９（１９８１）の局所相同性アルゴリズムを用いて、
２つの配列の間の相同性の最良のセグメントを見出す。Ｂｅｓｔｆｉｔまたは他
の任意の配列アラインメントプログラムを用いて、特定の配列が例えば本発明に
従う参照配列に対して９５％同一であるか否かを決定する場合、パラメータは、
当然、同一性の百分率がその参照ヌクレオチド配列の全長に対して算出され、そ
してその参照配列におけるヌクレオチドの総数の５％までの相同性におけるギャ
ップが許容されるように設定される。
チド配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一
であるか否かは、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムのような公知のコンピュータプログ
ラムを用いて従来のように決定され得る（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃ
ｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉ
ｘ（登録商標）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖ
ｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄ
ｉｓｏｎ、ＷＩ ５３７１ １）。Ｂｅｓｔｆｉｔは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗ
ａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔ
ｉｃｓ ２：４８２−４８９（１９８１）の局所相同性アルゴリズムを用いて、
２つの配列の間の相同性の最良のセグメントを見出す。Ｂｅｓｔｆｉｔまたは他
の任意の配列アラインメントプログラムを用いて、特定の配列が例えば本発明に
従う参照配列に対して９５％同一であるか否かを決定する場合、パラメータは、
当然、同一性の百分率がその参照ヌクレオチド配列の全長に対して算出され、そ
してその参照配列におけるヌクレオチドの総数の５％までの相同性におけるギャ
ップが許容されるように設定される。
【００３８】 ポリペプチド：ポリペプチドは、ペプチド結合によって結合されるアミノ酸モ
ノマーから構成されるポリマーである。
ノマーから構成されるポリマーである。
【００３９】 ペプチド結合：ペプチド結合とは、２つのアミノ酸の間の共有結合である。そ
こでは、一方のアミノ酸のαアミノ基が、他方のアミノ酸のαカルボキシル基に
結合している。
こでは、一方のアミノ酸のαアミノ基が、他方のアミノ酸のαカルボキシル基に
結合している。
【００４０】 単離された核酸分子またはポリペプチド：核酸分子、ＤＮＡまたはＲＮＡある
いはポリペプチドであって、その天然の環境から取り出されているもの。例えば
、ベクターに含まれる組換えＤＮＡ分子は、本発明の目的について単離されてい
るとみなされる。単離されたＤＮＡ分子のさらなる例は、溶液中の異種宿主細胞
または精製された（部分的もしくは実質的に）ＤＮＡ分子において維持される組
換えＤＮＡ分子を包含する。単離されたＲＮＡ分子は、本発明のＤＮＡ分子のイ
ンビボまたはインビトロのＲＮＡ転写物を包含する。本発明に従う単離された核
酸分子またはポリペプチドは、さらに合成的に生成されたそのような分子を包含
する。
いはポリペプチドであって、その天然の環境から取り出されているもの。例えば
、ベクターに含まれる組換えＤＮＡ分子は、本発明の目的について単離されてい
るとみなされる。単離されたＤＮＡ分子のさらなる例は、溶液中の異種宿主細胞
または精製された（部分的もしくは実質的に）ＤＮＡ分子において維持される組
換えＤＮＡ分子を包含する。単離されたＲＮＡ分子は、本発明のＤＮＡ分子のイ
ンビボまたはインビトロのＲＮＡ転写物を包含する。本発明に従う単離された核
酸分子またはポリペプチドは、さらに合成的に生成されたそのような分子を包含
する。
【００４１】 リンカー：「リンカー」とは、抗ＬＲＰ−Ａβ分子のＡβ結合ドメインに対し
てＬＲＰ結合ドメインを連結させる分子を意図する。アミノ酸残基からなるリン
カーについて言及するとき、リンカーは、２つのドメインを接続するアミノ酸残
基をいう。リンカーをコードする核酸について言及するとき、リンカーは、連結
アミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列をいう。このリンカーがアミノ酸残
基から構成される場合、代表的には、このリンカーは、１つ以上のグリシン残基
からなるか、またはこれらの残基をコードするヌクレオチド配列からなるが、プ
ロリンもまた使用され得る。
てＬＲＰ結合ドメインを連結させる分子を意図する。アミノ酸残基からなるリン
カーについて言及するとき、リンカーは、２つのドメインを接続するアミノ酸残
基をいう。リンカーをコードする核酸について言及するとき、リンカーは、連結
アミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列をいう。このリンカーがアミノ酸残
基から構成される場合、代表的には、このリンカーは、１つ以上のグリシン残基
からなるか、またはこれらの残基をコードするヌクレオチド配列からなるが、プ
ロリンもまた使用され得る。
【００４２】 アルツハイマー病の駆逐（ｃｏｍｂａｔｉｎｇ）：用語「アルツハイマー病の
駆逐」とは、ＡＤ過程を遅延、延期（ｄｅｌａｙ）または反転さえさせることを
意味することを意図する。従って、例えば、本発明の治療剤は、ＡＤの症状が存
在する患者において治療的にか、またはＡＤを発祥する危険にある被験体におい
て予防的にかのいずれかで投与され得る。
駆逐」とは、ＡＤ過程を遅延、延期（ｄｅｌａｙ）または反転さえさせることを
意味することを意図する。従って、例えば、本発明の治療剤は、ＡＤの症状が存
在する患者において治療的にか、またはＡＤを発祥する危険にある被験体におい
て予防的にかのいずれかで投与され得る。
【００４３】 薬学的に受容可能なキャリア：薬学的に受容可能なキャリアとは、任意の型の
非毒性の固体、半固体または液体のフィラー、希釈剤、カプセル化材料、または
処方物の助剤を意味する。
非毒性の固体、半固体または液体のフィラー、希釈剤、カプセル化材料、または
処方物の助剤を意味する。
【００４４】 連続的な順番で行われる：「連続的な順番で行われる」とは、この用語によっ
て記載される工程が、その工程が記載される順番で行われるが、他の記載されて
いない工程がその記載される工程の間に行われ得ることを意図する。
て記載される工程が、その工程が記載される順番で行われるが、他の記載されて
いない工程がその記載される工程の間に行われ得ることを意図する。
【００４５】 試験因子（薬剤）（ａｇｅｎｔ）：「試験因子」とは、ＡＤの処置または予防
について関心があり、そして本発明のスクリーニング方法を用いて試験されるべ
き任意の分子を意味する。
について関心があり、そして本発明のスクリーニング方法を用いて試験されるべ
き任意の分子を意味する。
【００４６】 範囲：種々の範囲の数が本明細書において記載されている。ある範囲が使用さ
れる場合、その範囲の数は、境界の数を内包することを意味する。例えば、配列
番号２７のヌクレオチド２０〜５０からなるオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチ
ド２０および５０ならびにその間のすべてのヌクレオチドを含むことを意味する
。
れる場合、その範囲の数は、境界の数を内包することを意味する。例えば、配列
番号２７のヌクレオチド２０〜５０からなるオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチ
ド２０および５０ならびにその間のすべてのヌクレオチドを含むことを意味する
。
【００４７】 組換えＤＮＡ技術、分子生物学、細胞生物学および薬理学の分野において使用
される他の用語は、本明細書において使用される場合、適用可能な分野における
当業者によって一般的に理解される。 （α−２−マクログロブリン） α−２−マクログロブリン（α2Ｍ）は、血清において高濃度で見出される７
１８ｋＤ糖タンパク質である（Ｂｏｒｔｈ、Ｗ．、ＦＡＳＥＢ Ｊ ６：３３４
５−３３５３（１９９２））。α2Ｍの構造は、各々１４５１アミノ酸の、４つ
の同一の１８０ｋＤモノマーユニットからなる（Ｓｏｔｔｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎ
、Ｌ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：８３１８−８３２７（１９８４）
）。ジスルフィド結合は、これらのモノマーを連結してダイマーとし、そしてダ
イマーの間の比供給結合的相互作用は、機能的なホモテトラマーの形成を導く（
Ｈａｒｐｅｌ、Ｐ．Ｃ．、Ｊ Ｅｘｐ．Ｍｅｄ １３８：５０８−５２１（１９
７３）；Ｓｗｅｎｓｏｎ、Ｒ．Ｐ．およびＨｏｗａｒｄ、Ｊ．Ｂ．、Ｊ Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２５４：４４５２−４４５６（１９７９））。さらに、Ａβを結
合する能力に加え、α2Ｍは、種々のポリペプチド（プロテアーゼ、成長因子お
よびサイトカイン）およびイオン（Ｚｎ、Ｃｕ、Ｆｅ）を結合する（Ｂｏｒｔｈ
、Ｗ．、ＦＡＳＥＢ Ｊ ６：３３４５−３３５３（１９９２）；Ｊａｍｅｓ、
Ｋ．、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １１：１６３−１６６（１９９０）；Ｐａ
ｒｉｓｉ、Ａ．Ｆ．およびＶａｌｌｅｅ、Ｂ．Ｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．９：２４
２１−２４２６（１９７０））。
される他の用語は、本明細書において使用される場合、適用可能な分野における
当業者によって一般的に理解される。 （α−２−マクログロブリン） α−２−マクログロブリン（α2Ｍ）は、血清において高濃度で見出される７
１８ｋＤ糖タンパク質である（Ｂｏｒｔｈ、Ｗ．、ＦＡＳＥＢ Ｊ ６：３３４
５−３３５３（１９９２））。α2Ｍの構造は、各々１４５１アミノ酸の、４つ
の同一の１８０ｋＤモノマーユニットからなる（Ｓｏｔｔｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎ
、Ｌ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：８３１８−８３２７（１９８４）
）。ジスルフィド結合は、これらのモノマーを連結してダイマーとし、そしてダ
イマーの間の比供給結合的相互作用は、機能的なホモテトラマーの形成を導く（
Ｈａｒｐｅｌ、Ｐ．Ｃ．、Ｊ Ｅｘｐ．Ｍｅｄ １３８：５０８−５２１（１９
７３）；Ｓｗｅｎｓｏｎ、Ｒ．Ｐ．およびＨｏｗａｒｄ、Ｊ．Ｂ．、Ｊ Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２５４：４４５２−４４５６（１９７９））。さらに、Ａβを結
合する能力に加え、α2Ｍは、種々のポリペプチド（プロテアーゼ、成長因子お
よびサイトカイン）およびイオン（Ｚｎ、Ｃｕ、Ｆｅ）を結合する（Ｂｏｒｔｈ
、Ｗ．、ＦＡＳＥＢ Ｊ ６：３３４５−３３５３（１９９２）；Ｊａｍｅｓ、
Ｋ．、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １１：１６３−１６６（１９９０）；Ｐａ
ｒｉｓｉ、Ａ．Ｆ．およびＶａｌｌｅｅ、Ｂ．Ｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．９：２４
２１−２４２６（１９７０））。
【００４８】 α2Ｍの最もよく研究された機能は、その汎プロテアーゼ阻害活性である（Ｂ
ａｒｒｅｔ、Ａ．Ｊ．およびＳｔａｒｋｅｙ、Ｐ．Ｍ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ
１３３：７０９−７２４（１９７３））。プロテアーゼ分子は、α２Ｍテトラマ
ーのベイト領域であるアミノ酸６６６〜７０６に結合し、そしてこの領域の多数
の感受性ペプチド結合のいずれかを切断する（（Ｈａｒｐｅｌ、Ｐ．Ｃ．、Ｊ．
Ｅｘｐ．Ｍｅｄ １３８：５０８−５２１（１９７３）；Ｂａｒｒｅｔ、Ａ．Ｊ
．およびＳｔａｒｋｅｙ、Ｐ．Ｍ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１３３：７０９−７
２４（１９７３）；Ｓｏｔｔｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎ、Ｌ．ら．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．２６４：１５７８１−１５７８９（１９８９））。プロテアーゼ結合
および切断は、α2Ｍ／プロテアーゼ複合体において、活性化と称される、コン
フォメーションの大きな変化を引き起こす。これは、最終的には、そのテトラマ
ー内でのプロテアーゼの捕捉を生じる（図５）（Ｂｏｒｔｈ、Ｗ．、ＦＡＳＥＢ
Ｊ．６：３３４５−３３５３（１９９２））。各々のモノマーにおいて、独特
のβ−Ｃｙｓ−γ−Ｇｌｕチオールエステル結合が、Ｃｙｓ−９４９とＧｌｕ−
９５２との間の存在する（Ｂｏｒｔｈ、Ｗ．、ＦＡＳＥＢ Ｊ ６：３３４５−
３３５３（１９９２））。活性化の際に、このチオールエステル結合が疎水性環
境から出現し、そして例えば、反応中のプロテアーゼ由来のリジン残基によって
、求核攻撃を受け得る。この求核攻撃の結果は、α2ＭのＧｌｕ−９５２と、そ
のプロテアーゼの表面リジン残基との間の共有結合である（図５）。このプロテ
アーゼは、有効に捕捉され、α2Ｍから解離され得ないがなおも小さなペプチド
基質を切断し得る（Ｑｕｉ、Ｗ．Ｑ．ら．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：
８４４３−８４５１（１９９６））。プロテアーゼ媒介性の活性化は、α2Ｍレ
セプター／低密度リポタンパク質レセプター関連のタンパク質結合ドメインの暴
露を生じる（図５）（Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄ、Ｄ．ら．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２６５：１７４０１−１７４０４（１９９０））。低密度リポタンパク質レ
セプター関連タンパク質（ＬＲＰ）は、低密度リポタンパク質レセプターファミ
リーに属する６００ｋＤ細胞内膜結合性レセプターである（Ｂｏｒｔｈ、Ｗ．、
ＦＡＳＥＢ Ｊ ６：３３４５−３３５３（１９９２））。ＬＲＰは、多機能レ
セプターである。なぜなら、それは、異なるクラスの由来のリガンドに結合する
からである（Ｋｏｕｎｎａｓ、Ｍ．Ｚ．ら．、Ｃｅｌｌ ８２：３３１−３４０
（１９９５））。このＬＲＰ結合ドメインの暴露は、α2Ｍ／リガンド複合体お
よび標的化された分解のＬＲＰ媒介性エンドサイトーシスのために必要である（
Ｂｏｒｔｈ、Ｗ．、ＦＡＳＥＢ Ｊ．６：３３４５−３３５３（１９９２））。
まとめると、α2Ｍは、Ａβを含む多数のタンパク質基質に結合し、そしてそれ
らをインターナリゼーションおよび分解のために標的化する役割を果たす。
ａｒｒｅｔ、Ａ．Ｊ．およびＳｔａｒｋｅｙ、Ｐ．Ｍ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ
１３３：７０９−７２４（１９７３））。プロテアーゼ分子は、α２Ｍテトラマ
ーのベイト領域であるアミノ酸６６６〜７０６に結合し、そしてこの領域の多数
の感受性ペプチド結合のいずれかを切断する（（Ｈａｒｐｅｌ、Ｐ．Ｃ．、Ｊ．
Ｅｘｐ．Ｍｅｄ １３８：５０８−５２１（１９７３）；Ｂａｒｒｅｔ、Ａ．Ｊ
．およびＳｔａｒｋｅｙ、Ｐ．Ｍ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１３３：７０９−７
２４（１９７３）；Ｓｏｔｔｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎ、Ｌ．ら．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．２６４：１５７８１−１５７８９（１９８９））。プロテアーゼ結合
および切断は、α2Ｍ／プロテアーゼ複合体において、活性化と称される、コン
フォメーションの大きな変化を引き起こす。これは、最終的には、そのテトラマ
ー内でのプロテアーゼの捕捉を生じる（図５）（Ｂｏｒｔｈ、Ｗ．、ＦＡＳＥＢ
Ｊ．６：３３４５−３３５３（１９９２））。各々のモノマーにおいて、独特
のβ−Ｃｙｓ−γ−Ｇｌｕチオールエステル結合が、Ｃｙｓ−９４９とＧｌｕ−
９５２との間の存在する（Ｂｏｒｔｈ、Ｗ．、ＦＡＳＥＢ Ｊ ６：３３４５−
３３５３（１９９２））。活性化の際に、このチオールエステル結合が疎水性環
境から出現し、そして例えば、反応中のプロテアーゼ由来のリジン残基によって
、求核攻撃を受け得る。この求核攻撃の結果は、α2ＭのＧｌｕ−９５２と、そ
のプロテアーゼの表面リジン残基との間の共有結合である（図５）。このプロテ
アーゼは、有効に捕捉され、α2Ｍから解離され得ないがなおも小さなペプチド
基質を切断し得る（Ｑｕｉ、Ｗ．Ｑ．ら．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：
８４４３−８４５１（１９９６））。プロテアーゼ媒介性の活性化は、α2Ｍレ
セプター／低密度リポタンパク質レセプター関連のタンパク質結合ドメインの暴
露を生じる（図５）（Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄ、Ｄ．ら．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２６５：１７４０１−１７４０４（１９９０））。低密度リポタンパク質レ
セプター関連タンパク質（ＬＲＰ）は、低密度リポタンパク質レセプターファミ
リーに属する６００ｋＤ細胞内膜結合性レセプターである（Ｂｏｒｔｈ、Ｗ．、
ＦＡＳＥＢ Ｊ ６：３３４５−３３５３（１９９２））。ＬＲＰは、多機能レ
セプターである。なぜなら、それは、異なるクラスの由来のリガンドに結合する
からである（Ｋｏｕｎｎａｓ、Ｍ．Ｚ．ら．、Ｃｅｌｌ ８２：３３１−３４０
（１９９５））。このＬＲＰ結合ドメインの暴露は、α2Ｍ／リガンド複合体お
よび標的化された分解のＬＲＰ媒介性エンドサイトーシスのために必要である（
Ｂｏｒｔｈ、Ｗ．、ＦＡＳＥＢ Ｊ．６：３３４５−３３５３（１９９２））。
まとめると、α2Ｍは、Ａβを含む多数のタンパク質基質に結合し、そしてそれ
らをインターナリゼーションおよび分解のために標的化する役割を果たす。
【００４９】 α2Ｍは、Ａβに特異的かつ厳密に結合する。α2ＭのＡβ結合領域は、ベイト
領域に対しておよそ６００残基Ｃ末端側にある残基１２０２−１３１２の間に位
置する（Ｈｕｇｈｅｓ、Ｓ．Ｒ．ら．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ
．ＵＳＡ ９５：３２７５−３２８０（１９９８））。結合は、α2Ｍ活性化を
要せず、そして結合化学量論は、およそ１，１Ａβ／α2Ｍのモルである（Ｄｕ
、Ｙ．ら．、Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６９：２９９−３０５（１９９７））。
Ａβ／α2Ｍ複合体についての見かけ上の解離定数（ＫD）は、α2Ｍ／125Ｉ−Ａ
βについて３．８×１０-10Ｍ（Ｄｕ、Ｙ．ら．、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６
９．２９９−３０５（１９９７））と、そしてビオチンＡβ／（ルテニウム（Ｉ
Ｉ）トリス−ビピリジン−ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）改変α2Ｍ
について３．５×１０-7Ｍ（Ｈｕｇｈｅｓ、Ｓ．Ｒ．ら．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：３２７５−３２８０（１９９８））と報告
されている。ＫＤ値におけるこの矛盾にもかかわらず（これは、おそらく、方法
論的な相違に起因する）、Ａβとα2Ｍとの間に強力な相互作用が存在する。こ
の相互作用は、Ａβ原繊維形成および原繊維関連神経毒性を予防する（（Ｈｕｇ
ｈｅｓ、Ｓ．Ｒ．ら．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：
３２７５−３２８０（１９９８）；Ｄｕ、Ｙ．ら．、Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．
７０：１１８２−１１８８（１９９８））。近年、α2ＭのＡβおよびＬＲＰ結
合ドメインのみを包含する領域がインビボにおけるＡβ結合について充分である
ことが実証された（Ｈｕｇｈｅｓ、Ｓ．Ｒ．ら．、Ｐｒｏｃ．ＮａｔＩ．Ａｃａ
ｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：３２７５−３２８０（１９９８））。これらのデー
タは、Ａβ結合ドメインは、独立した構造ユニットであり、そして首尾よいα2
Ｍ／Ａβ相互作用は、いくつかの重要な相互作用にのみ依存し得ることを示唆す
る。Ｓｏｔｏらによる最近の研究によって、１１残基ペプチドがＡβを結合し、
そしてＡβ原繊維形成を阻害し得ることが示されている（Ｓｏｔｏ、Ｃ．ら．、
Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ４：８２２−８２６（１９９８））。このこ
とは、いくつかの重要な相互作用がＡβを結合するために必要とされる考えを支
持する。まとめると、α2Ｍは、Ａβの代謝を、ＬＲＰ依存性過程において媒介
し得る。
領域に対しておよそ６００残基Ｃ末端側にある残基１２０２−１３１２の間に位
置する（Ｈｕｇｈｅｓ、Ｓ．Ｒ．ら．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ
．ＵＳＡ ９５：３２７５−３２８０（１９９８））。結合は、α2Ｍ活性化を
要せず、そして結合化学量論は、およそ１，１Ａβ／α2Ｍのモルである（Ｄｕ
、Ｙ．ら．、Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６９：２９９−３０５（１９９７））。
Ａβ／α2Ｍ複合体についての見かけ上の解離定数（ＫD）は、α2Ｍ／125Ｉ−Ａ
βについて３．８×１０-10Ｍ（Ｄｕ、Ｙ．ら．、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６
９．２９９−３０５（１９９７））と、そしてビオチンＡβ／（ルテニウム（Ｉ
Ｉ）トリス−ビピリジン−ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）改変α2Ｍ
について３．５×１０-7Ｍ（Ｈｕｇｈｅｓ、Ｓ．Ｒ．ら．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：３２７５−３２８０（１９９８））と報告
されている。ＫＤ値におけるこの矛盾にもかかわらず（これは、おそらく、方法
論的な相違に起因する）、Ａβとα2Ｍとの間に強力な相互作用が存在する。こ
の相互作用は、Ａβ原繊維形成および原繊維関連神経毒性を予防する（（Ｈｕｇ
ｈｅｓ、Ｓ．Ｒ．ら．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：
３２７５−３２８０（１９９８）；Ｄｕ、Ｙ．ら．、Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．
７０：１１８２−１１８８（１９９８））。近年、α2ＭのＡβおよびＬＲＰ結
合ドメインのみを包含する領域がインビボにおけるＡβ結合について充分である
ことが実証された（Ｈｕｇｈｅｓ、Ｓ．Ｒ．ら．、Ｐｒｏｃ．ＮａｔＩ．Ａｃａ
ｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：３２７５−３２８０（１９９８））。これらのデー
タは、Ａβ結合ドメインは、独立した構造ユニットであり、そして首尾よいα2
Ｍ／Ａβ相互作用は、いくつかの重要な相互作用にのみ依存し得ることを示唆す
る。Ｓｏｔｏらによる最近の研究によって、１１残基ペプチドがＡβを結合し、
そしてＡβ原繊維形成を阻害し得ることが示されている（Ｓｏｔｏ、Ｃ．ら．、
Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ４：８２２−８２６（１９９８））。このこ
とは、いくつかの重要な相互作用がＡβを結合するために必要とされる考えを支
持する。まとめると、α2Ｍは、Ａβの代謝を、ＬＲＰ依存性過程において媒介
し得る。
【００５０】 （Ａ２Ｍ−２遺伝子型） Ａ２Ｍ−２遺伝子型（これは、後期発症ＡＤに連鎖する）は、人口集団の３０
％に存在する（Ｂｌａｃｋｅｒ、Ｄ．ら．、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
１９：３５７−３６０（１９９８））。この遺伝子型は、α2Ｍのベイト領域を
コードする第二のエキソン（エキソン１８）の５’スプライス部位において５ヌ
クレオチド欠失を有する（Ｂｌａｃｋｅｒ、Ｄ．ら．、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅ
ｔｉｃｓ１９：３５７−３６０（１９９８））。
％に存在する（Ｂｌａｃｋｅｒ、Ｄ．ら．、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
１９：３５７−３６０（１９９８））。この遺伝子型は、α2Ｍのベイト領域を
コードする第二のエキソン（エキソン１８）の５’スプライス部位において５ヌ
クレオチド欠失を有する（Ｂｌａｃｋｅｒ、Ｄ．ら．、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅ
ｔｉｃｓ１９：３５７−３６０（１９９８））。
【００５１】 低分解能Ｘ線データおよび生化学的なデータは、このベイト領域が、ダイマー
界面上に存在し、そして機能性テトラマーの形成に重要であること、ならびに活
性化を伴うコンフォメーション変化の媒介を示唆する（Ａｎｄｅｒｓｅｎ、Ｇ．
Ｒ．、ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２５１３３−２５１４１（１９９
５）；Ｂｏｗｅｎ、Ｍ．Ｅ．ａｎｄ Ｇｅｔｔｉｎｓ、Ｐ．Ｇ．Ｗ．、Ｊ Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｉｎ．２７３：１８２５−１８３１（１９９８））。このベイト領
域におけるＡ２Ｍ−２欠失は、以下の場合にＡβ消失および分解を予防する：（
ｉ）プロテアーゼが変化していないベイト領域を切断し得ない、（ｉｉ）プロテ
アーゼ誘発された活性化が生じ得ない、（ｉｉｉ）ＬＲＰ結合が破壊されていな
い、および／または（ｉｖ）Ａβ結合が破壊されていない。
界面上に存在し、そして機能性テトラマーの形成に重要であること、ならびに活
性化を伴うコンフォメーション変化の媒介を示唆する（Ａｎｄｅｒｓｅｎ、Ｇ．
Ｒ．、ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２５１３３−２５１４１（１９９
５）；Ｂｏｗｅｎ、Ｍ．Ｅ．ａｎｄ Ｇｅｔｔｉｎｓ、Ｐ．Ｇ．Ｗ．、Ｊ Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｉｎ．２７３：１８２５−１８３１（１９９８））。このベイト領
域におけるＡ２Ｍ−２欠失は、以下の場合にＡβ消失および分解を予防する：（
ｉ）プロテアーゼが変化していないベイト領域を切断し得ない、（ｉｉ）プロテ
アーゼ誘発された活性化が生じ得ない、（ｉｉｉ）ＬＲＰ結合が破壊されていな
い、および／または（ｉｖ）Ａβ結合が破壊されていない。
【００５２】 （低密度リポタンパク質レセプター関連タンパク質） 低密度リポタンパク質レセプター関連タンパク質であるＬＲＰは、６００ｋＤ
の細胞内膜結合レセプターであり、これは、低密度リポタンパク質レセプターフ
ァミリーに属する（Ｂｏｒｔｈ、Ｗ．、ＦＡＳＥＢ Ｊ．６：３３４５−３３５
３（１９９２））。ＬＲＰは、以下の物を含む種々の細胞型において発現する：
脂肪細胞、星状細胞、線維芽細胞、肝細胞、マクロファージ、単球、および合胞
体層（ｓｙｎｃｙｔｉｏｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ）。ＬＲＰは、４５２５残基の
単鎖前駆体として翻訳される（Ｎｉｅｌｓｅｎ、Ｋ．Ｌ．ら．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．２７１：１２９０９−１２９１２（１９９６））。次いで、ＬＲＰは
、５１５ｋＤのＡ鎖および８５ｋＤのβ鎖へとプロセシングされる。β鎖は、単
一の膜貫通セグメントおよび細胞質テイルを有する。このテイルは、ＮＰＸＹエ
ンドサイトーシスのシグナル配列の２つのコピーを含む（Ｎｉｅｌｓｅｎ、Ｋ．
Ｌ．ら．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１．１２９０９−１２９１２（１９９
６））。細胞外に位置するα鎖は、上皮増殖因子（ＥＧＦ）反復に隣接する４つ
のシステインリッチＬＤＬレセプターリガンド結合反復を含む（Ｎｉｅｌｓｅｎ
、Ｋ．Ｌ．ら．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１２９０９−１２９１２（
１９９６））。β鎖の細胞外部分とのα鎖の非共有結合性の会合が機能性ＬＲＰ
を形成する（Ｂｏｒｔｈ、Ｗ．、ＦＡＳＥＢ Ｊ．６：３３１４５−３３５３（
１９９２））。ＬＲＰは、多機能レセプターである。なぜなら、ＬＲＰは、異な
るクラスのリガンドに結合するからである（Ｋｏｕｎｎａｓ、Ｍ．Ｚ．ら．、Ｃ
ｅｌｌ ８２：３３１−３４０（１９９５））。これらには、α2Ｍプロテアー
ゼ複合体、プラスミノゲンアクチベーターインヒビター−プラスミノゲンアクチ
ベーター複合体、リポタンパク質リパーゼ、ａｐｏＥ、ウシ膵臓トリプシンイン
ヒビター、ラクトフェリン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ，ネキシン（ｎｅ
ｘｉｎ）−１複合体、およびレセプター関連タンパク質（ＲＡＰ）（Ｋｏｕｎｎ
ａｓ、Ｍ．Ｚ．ら．、Ｃｅｌｌ ８２：３３１−３４０（１９９５））。これら
のリガンドの殆どが、同じ結合部位については競合しない。しかし、ＲＡＰは、
これらすべてのリガンドの結合を阻害する。
の細胞内膜結合レセプターであり、これは、低密度リポタンパク質レセプターフ
ァミリーに属する（Ｂｏｒｔｈ、Ｗ．、ＦＡＳＥＢ Ｊ．６：３３４５−３３５
３（１９９２））。ＬＲＰは、以下の物を含む種々の細胞型において発現する：
脂肪細胞、星状細胞、線維芽細胞、肝細胞、マクロファージ、単球、および合胞
体層（ｓｙｎｃｙｔｉｏｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ）。ＬＲＰは、４５２５残基の
単鎖前駆体として翻訳される（Ｎｉｅｌｓｅｎ、Ｋ．Ｌ．ら．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．２７１：１２９０９−１２９１２（１９９６））。次いで、ＬＲＰは
、５１５ｋＤのＡ鎖および８５ｋＤのβ鎖へとプロセシングされる。β鎖は、単
一の膜貫通セグメントおよび細胞質テイルを有する。このテイルは、ＮＰＸＹエ
ンドサイトーシスのシグナル配列の２つのコピーを含む（Ｎｉｅｌｓｅｎ、Ｋ．
Ｌ．ら．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１．１２９０９−１２９１２（１９９
６））。細胞外に位置するα鎖は、上皮増殖因子（ＥＧＦ）反復に隣接する４つ
のシステインリッチＬＤＬレセプターリガンド結合反復を含む（Ｎｉｅｌｓｅｎ
、Ｋ．Ｌ．ら．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１２９０９−１２９１２（
１９９６））。β鎖の細胞外部分とのα鎖の非共有結合性の会合が機能性ＬＲＰ
を形成する（Ｂｏｒｔｈ、Ｗ．、ＦＡＳＥＢ Ｊ．６：３３１４５−３３５３（
１９９２））。ＬＲＰは、多機能レセプターである。なぜなら、ＬＲＰは、異な
るクラスのリガンドに結合するからである（Ｋｏｕｎｎａｓ、Ｍ．Ｚ．ら．、Ｃ
ｅｌｌ ８２：３３１−３４０（１９９５））。これらには、α2Ｍプロテアー
ゼ複合体、プラスミノゲンアクチベーターインヒビター−プラスミノゲンアクチ
ベーター複合体、リポタンパク質リパーゼ、ａｐｏＥ、ウシ膵臓トリプシンイン
ヒビター、ラクトフェリン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ，ネキシン（ｎｅ
ｘｉｎ）−１複合体、およびレセプター関連タンパク質（ＲＡＰ）（Ｋｏｕｎｎ
ａｓ、Ｍ．Ｚ．ら．、Ｃｅｌｌ ８２：３３１−３４０（１９９５））。これら
のリガンドの殆どが、同じ結合部位については競合しない。しかし、ＲＡＰは、
これらすべてのリガンドの結合を阻害する。
【００５３】 （α2Ｍ／ＬＲＰ会合） 活性化されたα2ＭおよびＬＲＰの会合は、非常にｐＨ依存性であり、ｐＨ６
．８以下への酸性化によって結合が消失する（Ｂｏｒｔｈ、Ｗ．、ＦＡＳＥＢ
Ｊ．６：３３４５−３３５３（１９９２））。このことは、エンドサイトーシス
の際に、α2ＭがＬＲＰから解離することを示唆する。エンドサイトーシスの後
、α2Ｍおよびその会合したリガンドは、リソソーム内で分解し、そしてＬＲＰ
がリサイクルされて膜になる（Ｂｏｒｔｈ、Ｗ．、ＦＡＳＥＢ Ｊ．６：３３４
５−３３５３（１９９２））。インターナリゼーションおよび分解についての半
減期は、１５分と６０分との間を変動する。（Ｂｏｒｔｈ、Ｗ．、ＦＡＳＥＢ
Ｊ．６：３３４５−３３５３（１９９２））。
．８以下への酸性化によって結合が消失する（Ｂｏｒｔｈ、Ｗ．、ＦＡＳＥＢ
Ｊ．６：３３４５−３３５３（１９９２））。このことは、エンドサイトーシス
の際に、α2ＭがＬＲＰから解離することを示唆する。エンドサイトーシスの後
、α2Ｍおよびその会合したリガンドは、リソソーム内で分解し、そしてＬＲＰ
がリサイクルされて膜になる（Ｂｏｒｔｈ、Ｗ．、ＦＡＳＥＢ Ｊ．６：３３４
５−３３５３（１９９２））。インターナリゼーションおよび分解についての半
減期は、１５分と６０分との間を変動する。（Ｂｏｒｔｈ、Ｗ．、ＦＡＳＥＢ
Ｊ．６：３３４５−３３５３（１９９２））。
【００５４】 ＬＲＰのα2Ｍプロテアーゼ結合部位は、β鎖の残基７７６−１３９９にマッ
ピングされた（Ｎｉｅｌｓｅｎ、Ｋ．Ｌ．ら．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７
１：１２９０９−１２９１２（１９９６））。この領域は、ＥＧＦ反復４〜６お
よびＬＤＬレセプターリガンド結合反復３−１０を包含する。α2ＭのＬＲＰ結
合ドメインは、残基１３１２と１４５１との間に位置付けされており、これは、
Ａβ結合ドメインのＣ末端に直接的である（Ｈｕｇｈｅｓ、Ｓ．Ｒ．ら．、Ｐｒ
ｏｃ．ＮａｔＩ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：３２７５−３２８０（１９
９８））。このドメインは、α2Ｍの核に対して非常に可撓性がある（Ａｎｄｅ
ｒｓｅｎ、Ｇ．Ｒ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２５１３３−２５１
４１（１９９５））。低分解能の結晶構造（１０Å）は、活性化されたα2Ｍが
ほぼＨの形状をしており、そしてＬＲＰ結合ドメインは、そのＨの尖端に配置さ
れることを示す（図５）（Ａｎｄｅｒｓｅｎ、Ｇ．Ｒ．ら．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２ ７０：２５１３）３−２５１４１（１９９５））。ＬＲＰコンセン
サス結合配列が７つの異なるタンパク質ファミリーからの３１のＬＲＰリガンド
に基づいて提唱されている（Ｎｉｅｌｓｅｎ、Ｋ．Ｌ．ら．、Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２７１．１２９０９−１２９１２（１９９３））。この２７残基のコン
センサス配列は、ヒトα2Ｍの残基１３６５と１３９６との間に配置されている
。再び、実験の証拠は、いくつかの重要な相互作用がＬＲＰ／α2Ｍ結合におい
て重要であり得ることを示唆する。コンセンサス配列の５位および１０位におけ
る変異（ヒトα2ＭにおいてＬｙｓ−１３７０およびＬｙｓ−１３７４に対応す
る）は、他の高度に保存された残基における変異とは異なり、結合を消失させる
。
ピングされた（Ｎｉｅｌｓｅｎ、Ｋ．Ｌ．ら．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７
１：１２９０９−１２９１２（１９９６））。この領域は、ＥＧＦ反復４〜６お
よびＬＤＬレセプターリガンド結合反復３−１０を包含する。α2ＭのＬＲＰ結
合ドメインは、残基１３１２と１４５１との間に位置付けされており、これは、
Ａβ結合ドメインのＣ末端に直接的である（Ｈｕｇｈｅｓ、Ｓ．Ｒ．ら．、Ｐｒ
ｏｃ．ＮａｔＩ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：３２７５−３２８０（１９
９８））。このドメインは、α2Ｍの核に対して非常に可撓性がある（Ａｎｄｅ
ｒｓｅｎ、Ｇ．Ｒ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２５１３３−２５１
４１（１９９５））。低分解能の結晶構造（１０Å）は、活性化されたα2Ｍが
ほぼＨの形状をしており、そしてＬＲＰ結合ドメインは、そのＨの尖端に配置さ
れることを示す（図５）（Ａｎｄｅｒｓｅｎ、Ｇ．Ｒ．ら．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２ ７０：２５１３）３−２５１４１（１９９５））。ＬＲＰコンセン
サス結合配列が７つの異なるタンパク質ファミリーからの３１のＬＲＰリガンド
に基づいて提唱されている（Ｎｉｅｌｓｅｎ、Ｋ．Ｌ．ら．、Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２７１．１２９０９−１２９１２（１９９３））。この２７残基のコン
センサス配列は、ヒトα2Ｍの残基１３６５と１３９６との間に配置されている
。再び、実験の証拠は、いくつかの重要な相互作用がＬＲＰ／α2Ｍ結合におい
て重要であり得ることを示唆する。コンセンサス配列の５位および１０位におけ
る変異（ヒトα2ＭにおいてＬｙｓ−１３７０およびＬｙｓ−１３７４に対応す
る）は、他の高度に保存された残基における変異とは異なり、結合を消失させる
。
【００５５】 （アルツハイマー病におけるα2Ｍの示唆） アミロイドの大脳沈着はＡＤにおける中心的な事象である（Ｓｏｔｏ、Ｃ．ら
、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：８２２−８２６（１９９８））。遺伝的証拠、神経病理
学的証拠および生化学的証拠は、アミロイドの不適切な沈着が、ＡＤの病理にお
いて基本的な役割を果たしていることを示す。ＡＤアミロイド斑の主要な成分は
、３９−４３アミノ酸ペプチドであるＡβである。Ａβは、ＡＤおよびダウン症
候群（ＤＳ）の患者の両方の神経網において（Ｍａｓｔｅｒｓ、Ｃ．Ｌ．ら、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４２４５−４２４９（１
９８５））、および脳血管（コンゴ好染血管障害）（Ｇｌｅｎｎｅｒ、Ｇ．Ｇ．
およびＷｏｎｇ、Ｃ．Ｗ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ
ｍ．１２０．８８５−８９０（１９８４））において、密な（アミロイド斑）お
よび広汎性の細胞外沈着として重合する。可溶性Ａβは、脳脊髄液（ＣＳＦ）に
おいて見出され、そしてその膜貫通の親分子であるアミロイドタンパク質前駆体
（ＡＰＰ）の構成的切断（Ｋａｎｇ、Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３２５：７３３−
７３６（１９８７）；Ｇｏｌｄｂａｒｇｅｒ、Ｄ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５
：８７７−８８０（１９８７）；Ｒｏｂａｋｉｓ、Ｎ．Ｋ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：４１９０−４１９４（１９８７）；Ｔ
ａｎｚｉ、Ｒ．Ｅ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：８８０−８８４（１９８７）
）によって、産生される（Ｈａａｓｓ、Ｃ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３５９：３２２
−３２５（１９９２）；Ｓｅｕｂｅｒｔ、Ｐ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３５９：３２
５−３２７（１９９２）；Ｓｈｏｊｉ、Ｍ．、ｅｔａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
５８：１２６−１２９（１９９２））。ＡＰＰは、普遍的に発現される機能が未
知の選択スプライシングされるタンパク質のファミリーである。（Ｔａｎｚｉ、
Ｒ．Ｅ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３３１：５２８−５３０（１９８８））。未知のプ
ロテアーゼは、ＡＰＰを切断して、カルボキシル末端に不均一性を有するＡβペ
プチドの混合物を産生する。主要な可溶性Ａβ種である、Ａβ１−４０は、低ナ
ノモル濃度でＣＳＦに見出される（Ｖｉｇｏ−Ｐｅｌｆｒｅｙ、Ｃ．ら、Ｊ．Ｎ
ｅｕｒｏｃｈｅｍ．６１：１９６５−１９６８（１９９３））。Ａβ１−４２は
、少数の可溶性Ａβ種であるが、アミロイド斑において非常に富化されている（
Ｍａｓｔｅｒｓ、Ｃ．Ｌ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８２：４２４５−４２４９（１９８５）；Ｋａｎｇ、Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ
３２５：７３３−７３６（１９８７）；Ｒｏｈｅｒ、Ａ．Ｅ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．２６８：３０７２−３０８３（１９９３））。
、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：８２２−８２６（１９９８））。遺伝的証拠、神経病理
学的証拠および生化学的証拠は、アミロイドの不適切な沈着が、ＡＤの病理にお
いて基本的な役割を果たしていることを示す。ＡＤアミロイド斑の主要な成分は
、３９−４３アミノ酸ペプチドであるＡβである。Ａβは、ＡＤおよびダウン症
候群（ＤＳ）の患者の両方の神経網において（Ｍａｓｔｅｒｓ、Ｃ．Ｌ．ら、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４２４５−４２４９（１
９８５））、および脳血管（コンゴ好染血管障害）（Ｇｌｅｎｎｅｒ、Ｇ．Ｇ．
およびＷｏｎｇ、Ｃ．Ｗ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ
ｍ．１２０．８８５−８９０（１９８４））において、密な（アミロイド斑）お
よび広汎性の細胞外沈着として重合する。可溶性Ａβは、脳脊髄液（ＣＳＦ）に
おいて見出され、そしてその膜貫通の親分子であるアミロイドタンパク質前駆体
（ＡＰＰ）の構成的切断（Ｋａｎｇ、Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３２５：７３３−
７３６（１９８７）；Ｇｏｌｄｂａｒｇｅｒ、Ｄ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５
：８７７−８８０（１９８７）；Ｒｏｂａｋｉｓ、Ｎ．Ｋ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：４１９０−４１９４（１９８７）；Ｔ
ａｎｚｉ、Ｒ．Ｅ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：８８０−８８４（１９８７）
）によって、産生される（Ｈａａｓｓ、Ｃ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３５９：３２２
−３２５（１９９２）；Ｓｅｕｂｅｒｔ、Ｐ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３５９：３２
５−３２７（１９９２）；Ｓｈｏｊｉ、Ｍ．、ｅｔａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
５８：１２６−１２９（１９９２））。ＡＰＰは、普遍的に発現される機能が未
知の選択スプライシングされるタンパク質のファミリーである。（Ｔａｎｚｉ、
Ｒ．Ｅ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３３１：５２８−５３０（１９８８））。未知のプ
ロテアーゼは、ＡＰＰを切断して、カルボキシル末端に不均一性を有するＡβペ
プチドの混合物を産生する。主要な可溶性Ａβ種である、Ａβ１−４０は、低ナ
ノモル濃度でＣＳＦに見出される（Ｖｉｇｏ−Ｐｅｌｆｒｅｙ、Ｃ．ら、Ｊ．Ｎ
ｅｕｒｏｃｈｅｍ．６１：１９６５−１９６８（１９９３））。Ａβ１−４２は
、少数の可溶性Ａβ種であるが、アミロイド斑において非常に富化されている（
Ｍａｓｔｅｒｓ、Ｃ．Ｌ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８２：４２４５−４２４９（１９８５）；Ｋａｎｇ、Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ
３２５：７３３−７３６（１９８７）；Ｒｏｈｅｒ、Ａ．Ｅ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．２６８：３０７２−３０８３（１９９３））。
【００５６】 これらのアミロイド沈着が痴呆を生じる機構は、明らかではないが、マイクロ
モル濃度でのＡβの神経毒性効果に関連し得る（Ｐｉｋｅ、Ｃ．Ｊ．ら、Ｂｒａ
ｉｎ Ｒｅｓ．５６３：３１１−３１４（１９９１））。アミロイド沈着形成の
機構に対する検証は、ＡＢドメインの付近、またはその中のＡＰＰの病原性変異
の発見に始まった（ｖａｎ Ｂｒｏｅｃｋｈｏｖｅｎ、Ｃ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４８：１１２０−１１２２（１９９０）；Ｌｅｖｙ、Ｅ．ら、Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２４８：１１２４−１１２６（１９９０）；Ｇｏａｔｅ、Ａ．ら、Ｎａｔｕ
ｒｅ ３４９：７０４−７０６（１９９１）；Ｍｕｒｒｅｌｌ、Ｊ．ら、Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２５４：９７−９９（１９９１）；Ｍｕｌｌａｎ、Ｍ．ら、Ｎａｔ．
Ｇｅｎｅｔ．１：３４５−３４７（１９９２））。これらの研究は、Ａβの代謝
およびＡＰＰがＡＤの病態生理学に密接に関与することを示している。増大する
証拠によって、Ａβ１−４２のレベルの増加が家族性ＡＤ（ＦＡＤ）の初期発症
におけるアミロイド沈着を加速することが示唆されている。ＦＡＤと連鎖するＡ
ＰＰ６７０／６７１の変異がＡβ種の分泌を数倍に増加させることが示された（
Ｃｉｔｒｏｎ、Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３６０：６７２−６７４（１９９２））
。ＡＰＰ７１７の変異は、ＡＰ産生の量には影響を与えないが（Ｃａｉ、Ｘ−Ｄ
．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：５１４−５１６（１９９３））、この変異は、
産生されるＡβ１−４２の比率を増加させる（Ｓｕｚｕｋｉ、Ｎ．ら、Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２６４：１３３６−１３４０（１９９４））。増加した可溶性Ａβ１−
４２はまた、未熟なＡＤと複合する状態であるダウン症に罹患する個体の脳に見
出された（Ｔｅｌｌｅｒ、Ｊ．Ｋ．ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２：９３−９５（１９
９６））。プレセニリン−１（ＰＳＥＮ１）またはプレセニリン−２（ＰＳＥＮ
２）の他のＦＡＤと連鎖する変異の遺伝（Ｓｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎ、Ｒ．ら、Ｎ
ａｔｕｒｅ ３７５：７５４−７６０（１９９５）；Ｌｅｖｙ−Ｌａｈａｄ、Ｅ
．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：９７３−９７７（１９９５））が皮質アミロイ
ドの負荷の増加と相関する。新たなコンセンサスは、ＦＡＤに連鎖するプレセニ
リン変異の一般的な効果がＡβ１−４２産生を増加させることである（Ｃｉｔｒ
ｏｎ、Ｍ．ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．３：６７−７２（１９９７）；Ｘｉａ、Ｗ．ら
、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：７９７７−７９８２（１９９７））。まと
めると、これらの研究は、ＦＡＤと連鎖する遺伝子（ＡＰＰ、ＰＳＥＮ１、ＰＳ
ＥＮ２）における変異が、Ａβ１−４２産生の増加をもたらし得、そしてこの増
加がＦＡＤを引き起こし得ることを示唆する。しかし、ＡＤ患者の大部分におい
て、過剰産生は生じていない（Ｖａｎ Ｇｏｏｌ、Ｗ．Ａ．ら、Ａｎｎ．Ｎｅｕ
ｒｏｌ．３７：２７７−２７９（１９９５））。
モル濃度でのＡβの神経毒性効果に関連し得る（Ｐｉｋｅ、Ｃ．Ｊ．ら、Ｂｒａ
ｉｎ Ｒｅｓ．５６３：３１１−３１４（１９９１））。アミロイド沈着形成の
機構に対する検証は、ＡＢドメインの付近、またはその中のＡＰＰの病原性変異
の発見に始まった（ｖａｎ Ｂｒｏｅｃｋｈｏｖｅｎ、Ｃ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４８：１１２０−１１２２（１９９０）；Ｌｅｖｙ、Ｅ．ら、Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２４８：１１２４−１１２６（１９９０）；Ｇｏａｔｅ、Ａ．ら、Ｎａｔｕ
ｒｅ ３４９：７０４−７０６（１９９１）；Ｍｕｒｒｅｌｌ、Ｊ．ら、Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２５４：９７−９９（１９９１）；Ｍｕｌｌａｎ、Ｍ．ら、Ｎａｔ．
Ｇｅｎｅｔ．１：３４５−３４７（１９９２））。これらの研究は、Ａβの代謝
およびＡＰＰがＡＤの病態生理学に密接に関与することを示している。増大する
証拠によって、Ａβ１−４２のレベルの増加が家族性ＡＤ（ＦＡＤ）の初期発症
におけるアミロイド沈着を加速することが示唆されている。ＦＡＤと連鎖するＡ
ＰＰ６７０／６７１の変異がＡβ種の分泌を数倍に増加させることが示された（
Ｃｉｔｒｏｎ、Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３６０：６７２−６７４（１９９２））
。ＡＰＰ７１７の変異は、ＡＰ産生の量には影響を与えないが（Ｃａｉ、Ｘ−Ｄ
．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：５１４−５１６（１９９３））、この変異は、
産生されるＡβ１−４２の比率を増加させる（Ｓｕｚｕｋｉ、Ｎ．ら、Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２６４：１３３６−１３４０（１９９４））。増加した可溶性Ａβ１−
４２はまた、未熟なＡＤと複合する状態であるダウン症に罹患する個体の脳に見
出された（Ｔｅｌｌｅｒ、Ｊ．Ｋ．ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２：９３−９５（１９
９６））。プレセニリン−１（ＰＳＥＮ１）またはプレセニリン−２（ＰＳＥＮ
２）の他のＦＡＤと連鎖する変異の遺伝（Ｓｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎ、Ｒ．ら、Ｎ
ａｔｕｒｅ ３７５：７５４−７６０（１９９５）；Ｌｅｖｙ−Ｌａｈａｄ、Ｅ
．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：９７３−９７７（１９９５））が皮質アミロイ
ドの負荷の増加と相関する。新たなコンセンサスは、ＦＡＤに連鎖するプレセニ
リン変異の一般的な効果がＡβ１−４２産生を増加させることである（Ｃｉｔｒ
ｏｎ、Ｍ．ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．３：６７−７２（１９９７）；Ｘｉａ、Ｗ．ら
、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：７９７７−７９８２（１９９７））。まと
めると、これらの研究は、ＦＡＤと連鎖する遺伝子（ＡＰＰ、ＰＳＥＮ１、ＰＳ
ＥＮ２）における変異が、Ａβ１−４２産生の増加をもたらし得、そしてこの増
加がＦＡＤを引き起こし得ることを示唆する。しかし、ＡＤ患者の大部分におい
て、過剰産生は生じていない（Ｖａｎ Ｇｏｏｌ、Ｗ．Ａ．ら、Ａｎｎ．Ｎｅｕ
ｒｏｌ．３７：２７７−２７９（１９９５））。
【００５７】 ９０％のＡＤ患者は、後期発症ＡＤ（ＬＯＡＤ）に罹患する。３つの遺伝子は
、この形態のＡＤ：ＡＰＯＥ、ＬＲＰおよびＡ２Ｍと連鎖する。第１９染色体に
おけるＡＰＯＥ−ε４対立遺伝子の遺伝は、皮質アミロイド負荷の増加と相関す
る（Ｒｅｂｅｃｋ、Ｇ．Ｗ．ら、Ｎｅｕｒｏｎ．１１：５７５−５８０（１９９
３））。ＡＰＯＥの転写を上方制御するＡＰＯＥプロモーター多型は、ＡＤと関
連することが最近示された（Ｂｕｌｌｉｄｏ、Ｍ．Ｊ．ら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ
．１８：６９−７１（１９９８）；Ｌａｍｂｅｒｔ、Ｊ．Ｃ．ら、Ｈｕｍａｎ
Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．６：５３３−５４０（１９９８））。ＡＰＯＥ−ε３と比較し
ての、ＡＰＯＥ−ε４対立遺伝子のより高い発現は、ＡＰＯＥ−ε４陽性ＡＤ患
者の脳に見出されたが、年齢および遺伝子型を一致させたコントロールには見出
されなかった（Ｌａｍｂｅｒｔ、Ｊ．Ｃ．ら、Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．６
：２１５１−２１５４（１９９７））。ＦＡＤ変異ＡＰＰを発現するトランスジ
ェニックマウス中のａｐｏＥの非存在は、Ａβ沈着を減弱する（Ｂａｌｅｓ、Ｋ
．Ｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １ ７：２６４（１９９７））。
ＬＯＡＤに連鎖する第二の遺伝子であるＬＲＰ遺伝子は、低密度リポタンパク質
レセプター関連タンパク質をコードする。ＡＰＰ、ａｐｏＥ、およびａ2Ｍはす
べて、この細胞表面レセプターに対するリガンドである（Ｂｌａｃｋｅｒ、Ｄ．
ａｎｄ Ｔａｎｚｉ、Ｒ．Ｅ．、Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ
５５：２９４−２９６（１９９８）；Ｋａｎｇ、Ｄ．Ｅ．ら、Ｎｅｕｒｏｌｏ
ｇｙ ４９：５６−６１（１９９７）；Ｂｌａｃｋｅｒ、Ｄ．ら、Ｎｅｕｒｏｌ
ｏｇｙ ４８：１３９−１４７（１９９７）；Ｆａｒｒｅｒ、Ｌ．Ａ．ら、ＪＡ
ＭＡ ２７８：１３４９−１３５６（１９９７）；Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ、
Ｗ．Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１９７７
−１９８１（１９９３））。ＬＲＰは、エンドサイトーシスを介してリガンドを
インターナライズし、そしてそのリガンドをリソソーム分解について標的化する
（Ｂｏｒｔｈ、Ｗ．、ＦＡＳＥＢ Ｊ．６：３３４５−３３５３（１９９２））
。ＬＯＡＤに関連する第三の遺伝子であるＡ２Ｍ中のペンタヌクレオチドの欠失
の遺伝（すなわち、Ａ２Ｍ−２の遺伝）は、ＡＤについての危険性の増加を付与
し、そしてその集団の約３０％に存在する（Ｂｌａｃｋｅｒ、Ｄ．ら、Ｎａｔ．
Ｇｅｎｅｔ．１９：３５７−３６０（１９９８））。Ａ２Ｍのタンパク質産物で
あるα2Ｍは、血清に主に見出される豊富な汎プロテアーゼインヒビターである
が、これはまた、脳および他の器官（例えば、肝臓）にも存在する。α2Ｍは、
Ａβを結合し、そしてそのインターナリゼーションおよび分解を媒介し得る（Ｂ
ｏｒｔｈ、Ｗ．、ＦＡＳＥＢ Ｊ ６：３３４５−３３５３（１９９２）；Ｎａ
ｒｉｔａ、Ｍ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６９：１９０４−１９１１（１９
９７））。
、この形態のＡＤ：ＡＰＯＥ、ＬＲＰおよびＡ２Ｍと連鎖する。第１９染色体に
おけるＡＰＯＥ−ε４対立遺伝子の遺伝は、皮質アミロイド負荷の増加と相関す
る（Ｒｅｂｅｃｋ、Ｇ．Ｗ．ら、Ｎｅｕｒｏｎ．１１：５７５−５８０（１９９
３））。ＡＰＯＥの転写を上方制御するＡＰＯＥプロモーター多型は、ＡＤと関
連することが最近示された（Ｂｕｌｌｉｄｏ、Ｍ．Ｊ．ら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ
．１８：６９−７１（１９９８）；Ｌａｍｂｅｒｔ、Ｊ．Ｃ．ら、Ｈｕｍａｎ
Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．６：５３３−５４０（１９９８））。ＡＰＯＥ−ε３と比較し
ての、ＡＰＯＥ−ε４対立遺伝子のより高い発現は、ＡＰＯＥ−ε４陽性ＡＤ患
者の脳に見出されたが、年齢および遺伝子型を一致させたコントロールには見出
されなかった（Ｌａｍｂｅｒｔ、Ｊ．Ｃ．ら、Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．６
：２１５１−２１５４（１９９７））。ＦＡＤ変異ＡＰＰを発現するトランスジ
ェニックマウス中のａｐｏＥの非存在は、Ａβ沈着を減弱する（Ｂａｌｅｓ、Ｋ
．Ｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １ ７：２６４（１９９７））。
ＬＯＡＤに連鎖する第二の遺伝子であるＬＲＰ遺伝子は、低密度リポタンパク質
レセプター関連タンパク質をコードする。ＡＰＰ、ａｐｏＥ、およびａ2Ｍはす
べて、この細胞表面レセプターに対するリガンドである（Ｂｌａｃｋｅｒ、Ｄ．
ａｎｄ Ｔａｎｚｉ、Ｒ．Ｅ．、Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ
５５：２９４−２９６（１９９８）；Ｋａｎｇ、Ｄ．Ｅ．ら、Ｎｅｕｒｏｌｏ
ｇｙ ４９：５６−６１（１９９７）；Ｂｌａｃｋｅｒ、Ｄ．ら、Ｎｅｕｒｏｌ
ｏｇｙ ４８：１３９−１４７（１９９７）；Ｆａｒｒｅｒ、Ｌ．Ａ．ら、ＪＡ
ＭＡ ２７８：１３４９−１３５６（１９９７）；Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ、
Ｗ．Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１９７７
−１９８１（１９９３））。ＬＲＰは、エンドサイトーシスを介してリガンドを
インターナライズし、そしてそのリガンドをリソソーム分解について標的化する
（Ｂｏｒｔｈ、Ｗ．、ＦＡＳＥＢ Ｊ．６：３３４５−３３５３（１９９２））
。ＬＯＡＤに関連する第三の遺伝子であるＡ２Ｍ中のペンタヌクレオチドの欠失
の遺伝（すなわち、Ａ２Ｍ−２の遺伝）は、ＡＤについての危険性の増加を付与
し、そしてその集団の約３０％に存在する（Ｂｌａｃｋｅｒ、Ｄ．ら、Ｎａｔ．
Ｇｅｎｅｔ．１９：３５７−３６０（１９９８））。Ａ２Ｍのタンパク質産物で
あるα2Ｍは、血清に主に見出される豊富な汎プロテアーゼインヒビターである
が、これはまた、脳および他の器官（例えば、肝臓）にも存在する。α2Ｍは、
Ａβを結合し、そしてそのインターナリゼーションおよび分解を媒介し得る（Ｂ
ｏｒｔｈ、Ｗ．、ＦＡＳＥＢ Ｊ ６：３３４５−３３５３（１９９２）；Ｎａ
ｒｉｔａ、Ｍ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６９：１９０４−１９１１（１９
９７））。
【００５８】 α2Ｍは、生物学的知見および遺伝学的知見の両方によって、ＡＤの病因と関
係づけられている。α2Ｍ様の免疫反応性は、ＡＤの老人性皮質斑において観察
され（Ｂａｕｅｒ、Ｊ．ら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２８５：１１１−１１４（１
９９１））、そしてα2Ｍが神経炎性斑に局在化するが、広汎性アミロイド斑に
は局在化しないＡＤ脳においてα2Ｍが上方調節されていることが示された（Ｓ
ｔｒａｕｓｓ、Ｓ．ら、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ ６６：２２３−２３０（１９９
２）；Ｖａｎ Ｇｏｏｌ、Ｄ．ら、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ １４：２
３３−２３７（１９９３））。さらに、Ａβは、高親和性でα2Ｍに結合するこ
とが見出され（Ｄｕ、Ｙ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６９：２９９−３０５
（１９９７））、そして結合によって、アミロイド原線維形成および凝集したＡ
βと関連する神経毒性を妨害した（Ｄｕ、Ｙ．ら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７
０：１１８２−１１８８（１９９８）；Ｈｕｇｈｅｓ、Ｓ．Ｒ．ら、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：３２７５−３２８０（１９９８）
）。活性化したα2Ｍ−Ａβ複合体は、最近になって、ＬＲＰへの結合を介して
インターナライズされ、そして神経芽腫細胞による分解について標的化されるこ
とが示された（Ｎａｒｉｔａ、Ｍ．ら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６９：１９０
４−１９１１（１９９７））。さらに、ＬＲＰは、海馬のようなＡＤに罹患する
脳の領域において特に豊富であり（Ｒｅｂｅｃｋ、Ｇ．Ｗ．ら、Ｎｅｕｒｏｎ
１１：５７５−５８０（１９９３）；Ｔｏｏｙａｍａ、Ｉ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．１８：１５３−１６０（１９９３））、そして十
分に確立された遺伝的危険因子（Ｂｌａｃｋｅｒ、Ｄ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅ
ｎ．１９：３５７−３６０（１９９８））であるＡｐｏＥについてのレセプター
として作用する（Ｒｅｂｅｃｋ、Ｇ．Ｗ．ら、Ｎｅｕｒｏｎ １１：５７５−５
８０（１９９３））。
係づけられている。α2Ｍ様の免疫反応性は、ＡＤの老人性皮質斑において観察
され（Ｂａｕｅｒ、Ｊ．ら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２８５：１１１−１１４（１
９９１））、そしてα2Ｍが神経炎性斑に局在化するが、広汎性アミロイド斑に
は局在化しないＡＤ脳においてα2Ｍが上方調節されていることが示された（Ｓ
ｔｒａｕｓｓ、Ｓ．ら、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ ６６：２２３−２３０（１９９
２）；Ｖａｎ Ｇｏｏｌ、Ｄ．ら、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ １４：２
３３−２３７（１９９３））。さらに、Ａβは、高親和性でα2Ｍに結合するこ
とが見出され（Ｄｕ、Ｙ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６９：２９９−３０５
（１９９７））、そして結合によって、アミロイド原線維形成および凝集したＡ
βと関連する神経毒性を妨害した（Ｄｕ、Ｙ．ら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７
０：１１８２−１１８８（１９９８）；Ｈｕｇｈｅｓ、Ｓ．Ｒ．ら、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：３２７５−３２８０（１９９８）
）。活性化したα2Ｍ−Ａβ複合体は、最近になって、ＬＲＰへの結合を介して
インターナライズされ、そして神経芽腫細胞による分解について標的化されるこ
とが示された（Ｎａｒｉｔａ、Ｍ．ら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６９：１９０
４−１９１１（１９９７））。さらに、ＬＲＰは、海馬のようなＡＤに罹患する
脳の領域において特に豊富であり（Ｒｅｂｅｃｋ、Ｇ．Ｗ．ら、Ｎｅｕｒｏｎ
１１：５７５−５８０（１９９３）；Ｔｏｏｙａｍａ、Ｉ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．１８：１５３−１６０（１９９３））、そして十
分に確立された遺伝的危険因子（Ｂｌａｃｋｅｒ、Ｄ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅ
ｎ．１９：３５７−３６０（１９９８））であるＡｐｏＥについてのレセプター
として作用する（Ｒｅｂｅｃｋ、Ｇ．Ｗ．ら、Ｎｅｕｒｏｎ １１：５７５−５
８０（１９９３））。
【００５９】 ＡＰＰ、ＡＰＯＥ、Ａ２Ｍ、およびそれらのレセプターＬＲＰのＡＤへの遺伝
的連鎖は、これらのタンパク質が、ＡＤへと導く一般的な神経病理学的経路に関
与し得ることを示唆する（Ｂｌａｃｋｅｒ、Ｄ．ら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９
：３５７−３６０（１９９８））。この経路は、エンドサイトーシスおよびリソ
ソーム分解についてのＬＲＰへのα2Ｍの結合を介し、そしてα2Ｍが同定されて
いないセリンプロテアーゼと複合体化されるときにＡβ分解についての直接のメ
ディエーターとして作用することによる、Ａβのα2Ｍ媒介性のクリアランスお
よび分解であり得る。（Ｑｉｕ、Ｗ．Ｑ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１
：８４４３−８４５１（１９９６））。この仮説は、とりわけ、ａｐｏＥおよび
α2Ｍが両方ともＬＲＰについてのリガンドであり、さらに、ａｐｏＥがこれま
でにα2Ｍ媒介性のＡβの分解を阻害することが報告されているという事実に支
持される（Ｒｅｂｅｃｋ、Ｇ．Ｗ．ら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．３７：２１１−
２１７（１９９５）；Ｚｈａｎｇ、Ｚ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｉ
ｎｖｅｓｔ．３：１５６−１６１（１９９６））。
的連鎖は、これらのタンパク質が、ＡＤへと導く一般的な神経病理学的経路に関
与し得ることを示唆する（Ｂｌａｃｋｅｒ、Ｄ．ら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９
：３５７−３６０（１９９８））。この経路は、エンドサイトーシスおよびリソ
ソーム分解についてのＬＲＰへのα2Ｍの結合を介し、そしてα2Ｍが同定されて
いないセリンプロテアーゼと複合体化されるときにＡβ分解についての直接のメ
ディエーターとして作用することによる、Ａβのα2Ｍ媒介性のクリアランスお
よび分解であり得る。（Ｑｉｕ、Ｗ．Ｑ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１
：８４４３−８４５１（１９９６））。この仮説は、とりわけ、ａｐｏＥおよび
α2Ｍが両方ともＬＲＰについてのリガンドであり、さらに、ａｐｏＥがこれま
でにα2Ｍ媒介性のＡβの分解を阻害することが報告されているという事実に支
持される（Ｒｅｂｅｃｋ、Ｇ．Ｗ．ら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．３７：２１１−
２１７（１９９５）；Ｚｈａｎｇ、Ｚ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｉ
ｎｖｅｓｔ．３：１５６−１６１（１９９６））。
【００６０】 しかし、その正常な役割において、α2Ｍはまた、サイトカイン、増殖因子お
よび生物学的に活性なペプチドの宿主を結合する（Ｂｏｒｔｈ、Ｗ．、ＦＡＳＥ
Ｂ Ｊ．６：３３４５−３３５３（１９９２））。α2Ｍはまた、最近になって
、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼを活性化し、シグナル伝達における
役割を示唆することが示された（Ｍｉｓｒａ、Ｕ．Ｋ．ａｎｄ Ｐｉｚｚｏ、Ｓ
．Ｖ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２７３：１３３９９−１３４０２（１９９８
））。従って、α2Ｍの欠損活性は、Ａβ蓄積および沈着に対する可能な効果以
外に種々の機構によりＡＤ関連の神経変性をもたらし得る。
よび生物学的に活性なペプチドの宿主を結合する（Ｂｏｒｔｈ、Ｗ．、ＦＡＳＥ
Ｂ Ｊ．６：３３４５−３３５３（１９９２））。α2Ｍはまた、最近になって
、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼを活性化し、シグナル伝達における
役割を示唆することが示された（Ｍｉｓｒａ、Ｕ．Ｋ．ａｎｄ Ｐｉｚｚｏ、Ｓ
．Ｖ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２７３：１３３９９−１３４０２（１９９８
））。従って、α2Ｍの欠損活性は、Ａβ蓄積および沈着に対する可能な効果以
外に種々の機構によりＡＤ関連の神経変性をもたらし得る。
【００６１】 分泌されたα2Ｍの減少した定常状態レベルまたはＡ２Ｍ−２の優性ネガティ
ブ効果に起因する欠損テトラマーの存在は、損傷したα2Ｍ機能を生じ得る。エ
キソン１７または１８におけるベイト領域をコードする配列の部分的または全体
的な欠損は、おそらく、変異モノマーを含む潜在的欠損テトラマーの、プロテア
ーゼの結合、活性化、およびインターナリゼーションを改変する。従って、非常
に低レベルの変異モノマーの産生は、１つの変異モノマーが潜在的にそのテトラ
マーにおける３つの野生型モノマーの機能を阻害し得ること（優性ネガティブ効
果）から、増幅された効果を有し得る。従って、α2Ｍについての重要な役割は
、ＡＤ神経病因に関連づけられる。実施例１に記載されるデータは、Ａ２Ｍ−２
欠損が、正常なα2Ｍに対して優性ネガティブ効果を有し得るα2Ｍ ＲＮＡ、タ
ンパク質の欠失／短縮形態をもたらす。Ａ２Ｍ−２欠失が変化したα2Ｍ転写物
およびタンパク質の産生をもたらすという本明細書に記載される知見に基づいて
、正常なα2Ｍ機能および活性を置換もしくは補充すること、ならびに／または
脳における欠損α2Ｍ機能を抑制することを目的とした戦略は、ＡＤ神経病因を
治療的に予防、処置、または反転させるための手段として有効に作用し得る。さ
らに、これらの戦略は、欠損α2Ｍ機能と関連する他の病因を処置するために有
用であり得る。さらに、本明細書に記載される結果および実験に基づいた方法を
用いて、これらの治療剤についてスクリーニングし得る。
ブ効果に起因する欠損テトラマーの存在は、損傷したα2Ｍ機能を生じ得る。エ
キソン１７または１８におけるベイト領域をコードする配列の部分的または全体
的な欠損は、おそらく、変異モノマーを含む潜在的欠損テトラマーの、プロテア
ーゼの結合、活性化、およびインターナリゼーションを改変する。従って、非常
に低レベルの変異モノマーの産生は、１つの変異モノマーが潜在的にそのテトラ
マーにおける３つの野生型モノマーの機能を阻害し得ること（優性ネガティブ効
果）から、増幅された効果を有し得る。従って、α2Ｍについての重要な役割は
、ＡＤ神経病因に関連づけられる。実施例１に記載されるデータは、Ａ２Ｍ−２
欠損が、正常なα2Ｍに対して優性ネガティブ効果を有し得るα2Ｍ ＲＮＡ、タ
ンパク質の欠失／短縮形態をもたらす。Ａ２Ｍ−２欠失が変化したα2Ｍ転写物
およびタンパク質の産生をもたらすという本明細書に記載される知見に基づいて
、正常なα2Ｍ機能および活性を置換もしくは補充すること、ならびに／または
脳における欠損α2Ｍ機能を抑制することを目的とした戦略は、ＡＤ神経病因を
治療的に予防、処置、または反転させるための手段として有効に作用し得る。さ
らに、これらの戦略は、欠損α2Ｍ機能と関連する他の病因を処置するために有
用であり得る。さらに、本明細書に記載される結果および実験に基づいた方法を
用いて、これらの治療剤についてスクリーニングし得る。
【００６２】 本発明の第一の局面は、ＡＤについての治療剤に関する。この治療剤は、正常
なα2Ｍ機能を置換もしくは補充し得、ならびに／あるいはＡ２Ｍ−２の発現を
抑制し得る。
なα2Ｍ機能を置換もしくは補充し得、ならびに／あるいはＡ２Ｍ−２の発現を
抑制し得る。
【００６３】 本発明の１つの実施形態において、治療剤は、抗ＬＲＰ−Ａβ分子である。こ
の分子は、ＬＲＰ結合ドメインおよびＡβ結合ドメインを含む分子である。この
分子は、ＡβおよびＬＲＰの両方に結合し得る、ペプチドまたは他の分子であり
得る。この抗ＬＲＰ−Ａβ分子はまた、他のドメインを含み得る。Ａβ結合ドメ
インおよびＬＲＰ結合ドメインを有する、抗ＬＲＰ−Ａβ分子は、Ａβに結合し
得、そしてＡβを、ＬＲＰ媒介性のエンドサイトーシスに続きリソソーム分解に
ついて標的化し得、そして従って、とりわけ治療剤として有用である。
の分子は、ＬＲＰ結合ドメインおよびＡβ結合ドメインを含む分子である。この
分子は、ＡβおよびＬＲＰの両方に結合し得る、ペプチドまたは他の分子であり
得る。この抗ＬＲＰ−Ａβ分子はまた、他のドメインを含み得る。Ａβ結合ドメ
インおよびＬＲＰ結合ドメインを有する、抗ＬＲＰ−Ａβ分子は、Ａβに結合し
得、そしてＡβを、ＬＲＰ媒介性のエンドサイトーシスに続きリソソーム分解に
ついて標的化し得、そして従って、とりわけ治療剤として有用である。
【００６４】 本発明の１つの実施形態において、抗ＬＲＰ−Ａβ分子は、本明細書において
抗ＬＲＰ−Ａβペプチドと呼ばれるペプチドである。α2Ｍモノマーの２５０残
基のフラグメントは、Ａβ結合ドメインおよびＬＲＰ結合ドメインの両方を含む
（Ｈｕｇｈｅｓ、Ｓ．Ｒ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳ．
Ａ．９５：３２７５−３２８０（１９９８））。従って、本発明の１つの実施形
態において、抗ＬＲＰ−Ａβペプチドは、α2ＭのＡβ結合ドメインおよびＬＲ
Ｐ結合ドメインの全体から構成される（配列番号４）。あるいは、Ａβ結合ドメ
インおよびＬＲＰ結合ドメインは、α2ＭのＡβ結合ドメインおよびＬＲＰ結合
ドメインの一部から構成され得る。α2ＭのＡβ結合ドメインは、およそ１２０
１残基と１３１３残基との間で、ベイト領域に対しておよそ６００残基Ｃ末端に
配置される（Ｈｕｇｈｅｓ、Ｓ．Ｒ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ９５：３２７５−３２８０（１９９８））。従って、本発明の別の
実施形態において、抗ＬＲＰ−ＡβペプチドのＡβ結合ドメインは、α2ＭのＡ
β結合ドメイン全体である（残基１２０１−１３１３の間、配列番号６）が、Ｌ
ＲＰ結合ドメインの一部のみからなる。本発明の別の実施形態において、Ａβ結
合ドメインは、α2ＭのＡβ結合ドメインの全体の少なくとも５０の連続する残
基からなる。本発明の別の実施形態において、Ａβ結合ドメインは、α2ＭのＡ
β結合ドメイン全体の１０〜５０の連続する残基からなる。
抗ＬＲＰ−Ａβペプチドと呼ばれるペプチドである。α2Ｍモノマーの２５０残
基のフラグメントは、Ａβ結合ドメインおよびＬＲＰ結合ドメインの両方を含む
（Ｈｕｇｈｅｓ、Ｓ．Ｒ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳ．
Ａ．９５：３２７５−３２８０（１９９８））。従って、本発明の１つの実施形
態において、抗ＬＲＰ−Ａβペプチドは、α2ＭのＡβ結合ドメインおよびＬＲ
Ｐ結合ドメインの全体から構成される（配列番号４）。あるいは、Ａβ結合ドメ
インおよびＬＲＰ結合ドメインは、α2ＭのＡβ結合ドメインおよびＬＲＰ結合
ドメインの一部から構成され得る。α2ＭのＡβ結合ドメインは、およそ１２０
１残基と１３１３残基との間で、ベイト領域に対しておよそ６００残基Ｃ末端に
配置される（Ｈｕｇｈｅｓ、Ｓ．Ｒ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ９５：３２７５−３２８０（１９９８））。従って、本発明の別の
実施形態において、抗ＬＲＰ−ＡβペプチドのＡβ結合ドメインは、α2ＭのＡ
β結合ドメイン全体である（残基１２０１−１３１３の間、配列番号６）が、Ｌ
ＲＰ結合ドメインの一部のみからなる。本発明の別の実施形態において、Ａβ結
合ドメインは、α2ＭのＡβ結合ドメインの全体の少なくとも５０の連続する残
基からなる。本発明の別の実施形態において、Ａβ結合ドメインは、α2ＭのＡ
β結合ドメイン全体の１０〜５０の連続する残基からなる。
【００６５】 さらに、インビボでＡβに結合し得、そしてＡβ原線維形成を阻害し得るペプ
チドは、Ｓｏｔｏらに記載される（Ｓｏｔｏ、Ｃ．ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ ４：８
２２−８２６（１９９８）；Ｓｏｔｏ、Ｃ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２２６：６７２−６８０（１９９６））。これらのペプ
チド（配列番号１２、１６、１８、２０、２２、２４および２６）は、Ａβに対
して相同性、および類似の程度の疎水性を有するが、βシート構造を採用する低
い傾向を有する。特に、配列番号１２のアミノ酸配列を有し、そして配列番号１
１の核酸配列によりコードされる、１つの１１残基のＡβ結合ペプチドは、特に
有効であった。従って、本発明の好ましい実施形態において、抗ＬＲＰ−Ａβペ
プチドのＡβドメインは、この１１残基のペプチドの配列を有する。従って、本
発明の好ましい実施形態において、抗ＬＲＰ−ＡβペプチドのＡβドメインは、
配列番号１２のアミノ酸配列を有し、そして配列番号１１の核酸配列によってコ
ードされる。５残基のペプチド（配列番号２２）および７残基のペプチド（配列
番号１８）から構成される、この１１残基のＡβ結合ペプチドの２つのより短い
誘導体はまた、Ａβに有効に結合し、そして原線維形成を阻害した（Ｓｏｔｏ、
Ｃ．ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：８２２−８２６（１９９８）；Ｓｏｔｏ、Ｃ．ら
、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２２６．６７２−６８
０（１９９６））。従って、本発明の別の好ましい実施形態において、Ａβ結合
ドメインは、配列番号２２のアミノ酸配列を有し、そして配列番号２１の核酸配
列によってコードされるか、または配列番号１８のアミノ酸配列を有し、そして
配列番号１７の核酸配列によってコードされる。あるいは、Ａβ結合ドメインは
、３、４または６の残基（それぞれ、配列番号２４、２２および１８）を有する
、１１残基のＡβ結合ペプチドの他の誘導体から構成され得る。従って、本発明
の別の実施形態において、Ａβ結合ドメインは、配列番号２４、２２または１８
のアミノ酸配列を有し、そしてそれぞれ配列番号２３、２１または１７の核酸配
列によってコードされる。
チドは、Ｓｏｔｏらに記載される（Ｓｏｔｏ、Ｃ．ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ ４：８
２２−８２６（１９９８）；Ｓｏｔｏ、Ｃ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２２６：６７２−６８０（１９９６））。これらのペプ
チド（配列番号１２、１６、１８、２０、２２、２４および２６）は、Ａβに対
して相同性、および類似の程度の疎水性を有するが、βシート構造を採用する低
い傾向を有する。特に、配列番号１２のアミノ酸配列を有し、そして配列番号１
１の核酸配列によりコードされる、１つの１１残基のＡβ結合ペプチドは、特に
有効であった。従って、本発明の好ましい実施形態において、抗ＬＲＰ−Ａβペ
プチドのＡβドメインは、この１１残基のペプチドの配列を有する。従って、本
発明の好ましい実施形態において、抗ＬＲＰ−ＡβペプチドのＡβドメインは、
配列番号１２のアミノ酸配列を有し、そして配列番号１１の核酸配列によってコ
ードされる。５残基のペプチド（配列番号２２）および７残基のペプチド（配列
番号１８）から構成される、この１１残基のＡβ結合ペプチドの２つのより短い
誘導体はまた、Ａβに有効に結合し、そして原線維形成を阻害した（Ｓｏｔｏ、
Ｃ．ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：８２２−８２６（１９９８）；Ｓｏｔｏ、Ｃ．ら
、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２２６．６７２−６８
０（１９９６））。従って、本発明の別の好ましい実施形態において、Ａβ結合
ドメインは、配列番号２２のアミノ酸配列を有し、そして配列番号２１の核酸配
列によってコードされるか、または配列番号１８のアミノ酸配列を有し、そして
配列番号１７の核酸配列によってコードされる。あるいは、Ａβ結合ドメインは
、３、４または６の残基（それぞれ、配列番号２４、２２および１８）を有する
、１１残基のＡβ結合ペプチドの他の誘導体から構成され得る。従って、本発明
の別の実施形態において、Ａβ結合ドメインは、配列番号２４、２２または１８
のアミノ酸配列を有し、そしてそれぞれ配列番号２３、２１または１７の核酸配
列によってコードされる。
【００６６】 α2ＭのＬＲＰ結合ドメインは、α2Ｍの残基１３１２と１４５１との間で、Ａ
β結合ドメインのＣ末端に直接配置される（Ｈｕｇｈｅｓ、Ｓ．Ｒ．ら、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：３２７５−３２８０（１９９
８））。従って、本発明の１つの実施形態において、抗ＬＲＰ−Ａβペプチドの
ＬＲＰ結合ドメインは、α2ＭのＬＲＰ結合ドメインの全体から構成される（残
基１３１３−１４５１、配列番号８）。本発明の別の実施形態において、ＬＲＰ
結合ドメインは、α2ＭのＬＲＰ結合ドメインの全体の少なくとも５０の連続す
る残基から構成される。本発明のさらに別の実施形態において、ＬＲＰ結合ドメ
インは、α2ＭのＬＲＰ結合ドメイン全体の１０−５０の連続する残基から構成
される。ＬＲＰの結合ドメイン内において、２７残基のＬＲＰ結合コンセンサス
配列は、残基１３６６−１３９２に存在する（Ｎｉｅｌｓｅｎ、Ｋ．Ｌ．ら、Ｊ
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１２９０９−１２９１２（１９９６））。従っ
て、本発明の好ましい実施形態において、抗ＬＲＰ−ＡβペプチドのＬＲＰ結合
ドメインは、α2Ｍの残基１３６６−１３９２（配列番号１０）から構成される
。あるいは、ＬＲＰ結合ドメインは、残基１３６６−１３９２を含むα2Ｍの残
基１３１３−１４５１の連続する部分から構成され得る。別の好ましい実施形態
において、抗ＬＲＰ−Ａβペプチドは、１１残基のＡβ結合ドメインおよびα2
Ｍ ＬＲＰ結合ドメインの２７残基のコンセンサス配列（配列番号１４）から構
成される。
β結合ドメインのＣ末端に直接配置される（Ｈｕｇｈｅｓ、Ｓ．Ｒ．ら、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：３２７５−３２８０（１９９
８））。従って、本発明の１つの実施形態において、抗ＬＲＰ−Ａβペプチドの
ＬＲＰ結合ドメインは、α2ＭのＬＲＰ結合ドメインの全体から構成される（残
基１３１３−１４５１、配列番号８）。本発明の別の実施形態において、ＬＲＰ
結合ドメインは、α2ＭのＬＲＰ結合ドメインの全体の少なくとも５０の連続す
る残基から構成される。本発明のさらに別の実施形態において、ＬＲＰ結合ドメ
インは、α2ＭのＬＲＰ結合ドメイン全体の１０−５０の連続する残基から構成
される。ＬＲＰの結合ドメイン内において、２７残基のＬＲＰ結合コンセンサス
配列は、残基１３６６−１３９２に存在する（Ｎｉｅｌｓｅｎ、Ｋ．Ｌ．ら、Ｊ
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１２９０９−１２９１２（１９９６））。従っ
て、本発明の好ましい実施形態において、抗ＬＲＰ−ＡβペプチドのＬＲＰ結合
ドメインは、α2Ｍの残基１３６６−１３９２（配列番号１０）から構成される
。あるいは、ＬＲＰ結合ドメインは、残基１３６６−１３９２を含むα2Ｍの残
基１３１３−１４５１の連続する部分から構成され得る。別の好ましい実施形態
において、抗ＬＲＰ−Ａβペプチドは、１１残基のＡβ結合ドメインおよびα2
Ｍ ＬＲＰ結合ドメインの２７残基のコンセンサス配列（配列番号１４）から構
成される。
【００６７】 抗ＬＲＰ−Ａβ分子のＡβ結合ドメインおよびＬＲＰ結合ドメインは、共有結
合によって直接、または別の分子（例えば、リンカー）によってもしくはリンカ
ーなしのポリエチレングリコールにより間接的に、互いに接続され得る。リンカ
ー分子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびペプチドのようなポリマー
またはアミノ酸残基を含む。さらに、リンカーなしのＰＥＧ改変（ＰＥＧ化）が
使用され得る（Ｆｒａｎｃｉｓ、Ｇ．Ｅ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ．６
８：１−１８（１９９８））。リンカーおよび他の分子を用いた分子を接続する
種々の方法は、当該分野で周知であり、そしてＡβおよびＬＲＰの結合ドメイン
を接続するために使用され得る（例えば、Ｆｒａｎｃｉｓ、Ｇ．Ｅ．ら、Ｉｎｔ
．Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ．６８：１−１８（１９９８）；Ｒａａｇ、Ｒ．およびＷ
ｈｉｔｌｏｗ、Ｍ．、ＦＡＳＥＢ Ｊ ９：８０（１９９５）；Ｄｅｇｕｃｈｉ
、Ｙ．ら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１０．３７（１９９９）；Ｌｕｏ、
Ｄ．ら、Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６５：２２５−２２８（１９９８）；Ｒｅ
ｉｔｅｒ、Ｙ．およびＰａｓｔａｎ、Ｉ．、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．
２：２４５−５２（１９９６）；ＤｅＮａｒｄｏ、Ｇ．Ｌ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｃａ
ｎｃ．Ｒｅｓ．４：２４８３−９０（１９９８）；Ｔａｒｅｒｎｉ、Ｓ．Ｓ．、
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．７．２１４３−２１４９（１９９８）；Ｓｃｈａｆｆ
ｅｒ、Ｄ．Ｖ．、およびＬａｕｆｆｅｎｂｕｒｇｅｒ、Ｄ．Ａ．、Ｊ Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．２７３：２８００４−２８００９（１９９８）；Ｓｋｏｒｄａｌａ
ｋｅｓ、Ｅ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３７：１４４２０−１４４２７（１９９８）
；Ｃｚｅｒｗｉｎｓｋｉ、Ｇ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ．９５：１１５２０−１１５２５（１９９８）；Ｄａｆｆｉｘ、Ｉ．ら、Ｊ
Ｐｅｐｔ．Ｒｅｓ．５２：１−１４（１９９８）；Ｌｉｕ、Ｓ．Ｊ．ら、Ｂｌ
ｏｏｄ ９２：２１０３−２１１２（１９９８）；Ｃｈａｎｄｌｅｒ、Ｌ．Ａ．
ら、Ｉｎｔ．Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ７８：１０６−１１１（１９９８）；Ｐａｒｋ
、Ｃ．Ｊ．、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５０：７
１−７６（１９９８）；Ｓｕｚｕｋｉ、Ｙ．ら、Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｍａｔｅｒ
．Ｒｅｓ．４２．１１６（１９９８）；Ｆｉｌｉｋｏｖ、Ａ．Ｖ．、およびＪａ
ｍｅｓ、Ｔ．Ｌ．、Ｊ Ｃｏｍｐｕｔ．ＡｉｄｅｄＭｏｌ．Ｄｅｓ．１２．２４
０（１９９８）；ＭａｃＫｅｎｚｉｅ、Ｒ．、およびＴｏ、Ｒ．、Ｊ Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２２０．４９（１９９８）を参照のこと）。
合によって直接、または別の分子（例えば、リンカー）によってもしくはリンカ
ーなしのポリエチレングリコールにより間接的に、互いに接続され得る。リンカ
ー分子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびペプチドのようなポリマー
またはアミノ酸残基を含む。さらに、リンカーなしのＰＥＧ改変（ＰＥＧ化）が
使用され得る（Ｆｒａｎｃｉｓ、Ｇ．Ｅ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ．６
８：１−１８（１９９８））。リンカーおよび他の分子を用いた分子を接続する
種々の方法は、当該分野で周知であり、そしてＡβおよびＬＲＰの結合ドメイン
を接続するために使用され得る（例えば、Ｆｒａｎｃｉｓ、Ｇ．Ｅ．ら、Ｉｎｔ
．Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ．６８：１−１８（１９９８）；Ｒａａｇ、Ｒ．およびＷ
ｈｉｔｌｏｗ、Ｍ．、ＦＡＳＥＢ Ｊ ９：８０（１９９５）；Ｄｅｇｕｃｈｉ
、Ｙ．ら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１０．３７（１９９９）；Ｌｕｏ、
Ｄ．ら、Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６５：２２５−２２８（１９９８）；Ｒｅ
ｉｔｅｒ、Ｙ．およびＰａｓｔａｎ、Ｉ．、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．
２：２４５−５２（１９９６）；ＤｅＮａｒｄｏ、Ｇ．Ｌ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｃａ
ｎｃ．Ｒｅｓ．４：２４８３−９０（１９９８）；Ｔａｒｅｒｎｉ、Ｓ．Ｓ．、
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．７．２１４３−２１４９（１９９８）；Ｓｃｈａｆｆ
ｅｒ、Ｄ．Ｖ．、およびＬａｕｆｆｅｎｂｕｒｇｅｒ、Ｄ．Ａ．、Ｊ Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．２７３：２８００４−２８００９（１９９８）；Ｓｋｏｒｄａｌａ
ｋｅｓ、Ｅ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３７：１４４２０−１４４２７（１９９８）
；Ｃｚｅｒｗｉｎｓｋｉ、Ｇ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ．９５：１１５２０−１１５２５（１９９８）；Ｄａｆｆｉｘ、Ｉ．ら、Ｊ
Ｐｅｐｔ．Ｒｅｓ．５２：１−１４（１９９８）；Ｌｉｕ、Ｓ．Ｊ．ら、Ｂｌ
ｏｏｄ ９２：２１０３−２１１２（１９９８）；Ｃｈａｎｄｌｅｒ、Ｌ．Ａ．
ら、Ｉｎｔ．Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ７８：１０６−１１１（１９９８）；Ｐａｒｋ
、Ｃ．Ｊ．、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５０：７
１−７６（１９９８）；Ｓｕｚｕｋｉ、Ｙ．ら、Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｍａｔｅｒ
．Ｒｅｓ．４２．１１６（１９９８）；Ｆｉｌｉｋｏｖ、Ａ．Ｖ．、およびＪａ
ｍｅｓ、Ｔ．Ｌ．、Ｊ Ｃｏｍｐｕｔ．ＡｉｄｅｄＭｏｌ．Ｄｅｓ．１２．２４
０（１９９８）；ＭａｃＫｅｎｚｉｅ、Ｒ．、およびＴｏ、Ｒ．、Ｊ Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２２０．４９（１９９８）を参照のこと）。
【００６８】 本発明の１つの好ましい実施形態において、そのリンカーはアミノ酸残基（例
えば、グリシン残基もしくはプロリン残基）から構成される。そのリンカーがア
ミノ酸残基から構成されるが、それは、１〜２０残基であり得るが、好ましくは
、５〜１０残基であり、そしてより好ましくは５残基である。 抗ＬＲＰ−Ａβ分子がペプチドである場合、ペプチド内において、Ａβ結合ド
メインは、ＬＲＰ結合ドメインに対してＣ末端またはＮ末端であり得る。しかし
、好ましくは、Ａβ結合ドメインは、ＬＲＰ結合ドメインに対してＮ末端側にあ
り、これは、天然に存在するα2ＭにおけるＡβ結合ドメインおよびＬＲＰ結合
ドメインの順番である。
えば、グリシン残基もしくはプロリン残基）から構成される。そのリンカーがア
ミノ酸残基から構成されるが、それは、１〜２０残基であり得るが、好ましくは
、５〜１０残基であり、そしてより好ましくは５残基である。 抗ＬＲＰ−Ａβ分子がペプチドである場合、ペプチド内において、Ａβ結合ド
メインは、ＬＲＰ結合ドメインに対してＣ末端またはＮ末端であり得る。しかし
、好ましくは、Ａβ結合ドメインは、ＬＲＰ結合ドメインに対してＮ末端側にあ
り、これは、天然に存在するα2ＭにおけるＡβ結合ドメインおよびＬＲＰ結合
ドメインの順番である。
【００６９】 さらに、本発明は、抗ＬＲＰ−Ａβペプチドをコードする核酸分子を提供する
。従って、本発明の別の実施形態において、この核酸分子は、上記の配列を有す
る、抗ＬＲＰ−Ａβペプチドをコードする。本発明はまた、これらの核酸に対し
て少なくとも９５％の相同性を有する核酸に関する。さらに、本発明は、抗ＬＲ
Ｐ−Ａβペプチドをコードする核酸に相補的である核酸とハイブリダイズする核
酸に関する。第一のポリヌクレオチドおよび第二のポリヌクレオチドがハイブリ
ダイズする条件は、好ましくは以下の通りである：（ａ）５０％ホルムアルデヒ
ド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ ７．６）、５×デンハルト
溶液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性され剪断されたサ
ケ精子ＤＮＡからなる溶液中で４２℃で一晩インキュベートすること；ならびに
（ｂ）０．１×ＳＳＣからなる溶液中で６５℃で洗浄すること。
。従って、本発明の別の実施形態において、この核酸分子は、上記の配列を有す
る、抗ＬＲＰ−Ａβペプチドをコードする。本発明はまた、これらの核酸に対し
て少なくとも９５％の相同性を有する核酸に関する。さらに、本発明は、抗ＬＲ
Ｐ−Ａβペプチドをコードする核酸に相補的である核酸とハイブリダイズする核
酸に関する。第一のポリヌクレオチドおよび第二のポリヌクレオチドがハイブリ
ダイズする条件は、好ましくは以下の通りである：（ａ）５０％ホルムアルデヒ
ド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ ７．６）、５×デンハルト
溶液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性され剪断されたサ
ケ精子ＤＮＡからなる溶液中で４２℃で一晩インキュベートすること；ならびに
（ｂ）０．１×ＳＳＣからなる溶液中で６５℃で洗浄すること。
【００７０】 この抗ＬＲＰ−Ａβペプチドは、タンパク質合成のための標準的固相合成法を
使用して生成され得、そして当該分野で周知である、高速液体クロマトグラフィ
ー（ＨＰＬＣ）によって精製され得る（「Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｈ
ａｎｄｌｉｎｇ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ
ｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．ら編、
Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．刊、第２巻、第１８章（補
遺１４、１９９８）を参照のこと）。あるいは、この抗ＬＲＰ−Ａβペプチドは
、標準的組換えＤＮＡ法を使用して生成され得る。例えば、このＬＲＰ結合ドメ
インの所望の配列（例えば、２７残基のコンセンサス配列）をコードするＤＮＡ
は、所望のコドンに隣接するように設計されたプライマーを使用して、所望のＬ
ＲＰ結合ドメインをコードするコドンのＰＣＲ増幅によって入手され得る。次い
でこのＤＮＡは、所望のＡβ結合ドメインをコードする配列のＰＣＲ媒介性組み
込みのテンプレートとして使用され得る。ＡβドメインのＰＣＲ媒介性挿入のた
めに、以下を有する、ヌクレオチド５’ＰＣＲプライマーが設計され得る：（１
）直前に記載されたように増幅された所望のＬＲＰ結合ドメインをコードするＤ
ＮＡ配列の末端に相同な領域、および（２）この領域のすぐ５’側に、所望のＡ
β結合ドメインをコードする領域、および（３）この領域のすぐ５’側に、開始
コドン。その３’プライマーについて、ＬＲＰ結合ドメイン（このＬＲＰ結合ド
メイン配列が、ここでテンプレートとして使用されている）を増幅するために使
用される３’隣接プライマーが使用され得る。あるいは、α2ＭのＡβ結合ドメ
インおよびＬＲＰ結合ドメイン全体（残基１２０２〜１４５１）を有する抗ＬＲ
Ｐ−Ａβペプチドを生成するために、プライマーが、これらのドメインのコード
配列に隣接し、この領域（ヌクレオチド３７１３〜４４６５）を増幅するように
設計され得る。次いで、開始コドンが、ＰＣＲ媒介性挿入によって付加され得る
。ＡＢ結合ドメインおよびＬＲＰ結合ドメイン全体に満たないものをコードする
コード領域を増幅するために、代わりに、これらのプライマーは、α2Ｍの小さ
い方の領域に隣接するように設計され得る。生じる核酸分子は、ＬＲＰ結合ドメ
インおよびＡβ結合ドメインならびに開始コドンを有する、融合タンパク質をコ
ードするＤＮＡであり、その結果、この分子は、発現ベクターに挿入されて、抗
ＬＲＰ−Ａβペプチドを生成し得る。
使用して生成され得、そして当該分野で周知である、高速液体クロマトグラフィ
ー（ＨＰＬＣ）によって精製され得る（「Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｈ
ａｎｄｌｉｎｇ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ
ｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．ら編、
Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．刊、第２巻、第１８章（補
遺１４、１９９８）を参照のこと）。あるいは、この抗ＬＲＰ−Ａβペプチドは
、標準的組換えＤＮＡ法を使用して生成され得る。例えば、このＬＲＰ結合ドメ
インの所望の配列（例えば、２７残基のコンセンサス配列）をコードするＤＮＡ
は、所望のコドンに隣接するように設計されたプライマーを使用して、所望のＬ
ＲＰ結合ドメインをコードするコドンのＰＣＲ増幅によって入手され得る。次い
でこのＤＮＡは、所望のＡβ結合ドメインをコードする配列のＰＣＲ媒介性組み
込みのテンプレートとして使用され得る。ＡβドメインのＰＣＲ媒介性挿入のた
めに、以下を有する、ヌクレオチド５’ＰＣＲプライマーが設計され得る：（１
）直前に記載されたように増幅された所望のＬＲＰ結合ドメインをコードするＤ
ＮＡ配列の末端に相同な領域、および（２）この領域のすぐ５’側に、所望のＡ
β結合ドメインをコードする領域、および（３）この領域のすぐ５’側に、開始
コドン。その３’プライマーについて、ＬＲＰ結合ドメイン（このＬＲＰ結合ド
メイン配列が、ここでテンプレートとして使用されている）を増幅するために使
用される３’隣接プライマーが使用され得る。あるいは、α2ＭのＡβ結合ドメ
インおよびＬＲＰ結合ドメイン全体（残基１２０２〜１４５１）を有する抗ＬＲ
Ｐ−Ａβペプチドを生成するために、プライマーが、これらのドメインのコード
配列に隣接し、この領域（ヌクレオチド３７１３〜４４６５）を増幅するように
設計され得る。次いで、開始コドンが、ＰＣＲ媒介性挿入によって付加され得る
。ＡＢ結合ドメインおよびＬＲＰ結合ドメイン全体に満たないものをコードする
コード領域を増幅するために、代わりに、これらのプライマーは、α2Ｍの小さ
い方の領域に隣接するように設計され得る。生じる核酸分子は、ＬＲＰ結合ドメ
インおよびＡβ結合ドメインならびに開始コドンを有する、融合タンパク質をコ
ードするＤＮＡであり、その結果、この分子は、発現ベクターに挿入されて、抗
ＬＲＰ−Ａβペプチドを生成し得る。
【００７１】 一旦、所望の融合タンパク質をコードするＤＮＡが得られると、ＰＣＲ媒介性
挿入が使用されて、その融合遺伝子の５’末端および３’末端の制限酵素部位が
、その融合タンパク質遺伝子が次に、発現ベクターおよび酵母スリーハイブリッ
ド系における使用のためにベクターへの挿入のためにこれらの制限酵素によって
切断され得るように、挿入され得る（Ｔｉｒｏｄｅ，Ｆ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２７２：２２９９５〜２２９９９（１９９７））。例えば、ＸｈｏＩお
よびＫｐｎＩの制限酵素部位が、それぞれ、その融合タンパク質遺伝子の５’末
端および３’末端に挿入され得る。これらの制限酵素による切断は、次に、以下
へのその融合タンパク質遺伝子のクローニングを容易にする：（ｉ）Ｅ．ｃｏｌ
ｉにおける抗ＬＲＰ−Ａβのアラビノース依存性発現のために、ｐＢＡＤ／Ｈｉ
ｓ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、および（ｉｉ）酵母スリーハイブリ
ッド系における使用のための、ｐＬｅｘ９−３Ｈベクター（Ｔｉｒｏｄｅ，Ｆ．
ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２２９９５〜２２９９９（１９９７））
。生じた遺伝子のタンパク質産物（抗ＬＲＰ−Ａβペプチドと名付ける）は、Ａ
β結合特性およびＬＲＰ結合特性の両方を有するはずである。
挿入が使用されて、その融合遺伝子の５’末端および３’末端の制限酵素部位が
、その融合タンパク質遺伝子が次に、発現ベクターおよび酵母スリーハイブリッ
ド系における使用のためにベクターへの挿入のためにこれらの制限酵素によって
切断され得るように、挿入され得る（Ｔｉｒｏｄｅ，Ｆ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２７２：２２９９５〜２２９９９（１９９７））。例えば、ＸｈｏＩお
よびＫｐｎＩの制限酵素部位が、それぞれ、その融合タンパク質遺伝子の５’末
端および３’末端に挿入され得る。これらの制限酵素による切断は、次に、以下
へのその融合タンパク質遺伝子のクローニングを容易にする：（ｉ）Ｅ．ｃｏｌ
ｉにおける抗ＬＲＰ−Ａβのアラビノース依存性発現のために、ｐＢＡＤ／Ｈｉ
ｓ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、および（ｉｉ）酵母スリーハイブリ
ッド系における使用のための、ｐＬｅｘ９−３Ｈベクター（Ｔｉｒｏｄｅ，Ｆ．
ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２２９９５〜２２９９９（１９９７））
。生じた遺伝子のタンパク質産物（抗ＬＲＰ−Ａβペプチドと名付ける）は、Ａ
β結合特性およびＬＲＰ結合特性の両方を有するはずである。
【００７２】 抗ＬＲＰ−Ａβ分子がＡβおよびＬＲＰを結合し、そしてＬＲＰ媒介性エンド
サイトーシスおよび分解を受ける能力は、ゲル濾過クロマトグラフィー技術、イ
ムノブロッティング技術および細胞培養技術を使用して、試験され得る。この抗
ＬＲＰ−Ａβ分子がペプチドである場合、酵母スリーハイブリッド系もまた、こ
の抗ＬＲＰ−Ａβペプチドを評価するために使用され得る（Ｔｉｒｏｄｅ，Ｆ．
ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２２９９５〜２２９９９（１９９７））
。必要である場合は、抗ＬＲＰ−Ａβペプチドの結合特性は、インビボ進化技術
を使用して再び最適化され得る（Ｂｕｃｈｈｏｌｚ，Ｆ．ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌ．１６：６５７〜６６２（１９９８））。
サイトーシスおよび分解を受ける能力は、ゲル濾過クロマトグラフィー技術、イ
ムノブロッティング技術および細胞培養技術を使用して、試験され得る。この抗
ＬＲＰ−Ａβ分子がペプチドである場合、酵母スリーハイブリッド系もまた、こ
の抗ＬＲＰ−Ａβペプチドを評価するために使用され得る（Ｔｉｒｏｄｅ，Ｆ．
ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２２９９５〜２２９９９（１９９７））
。必要である場合は、抗ＬＲＰ−Ａβペプチドの結合特性は、インビボ進化技術
を使用して再び最適化され得る（Ｂｕｃｈｈｏｌｚ，Ｆ．ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌ．１６：６５７〜６６２（１９９８））。
【００７３】 ゲル濾過クロマトグラフィーが、Ｎａｒｉｔａら（Ｎａｒｉｔａ，Ｍ．ら、Ｊ
．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６９：１９０４〜１９１１（１９９７））により記載さ
れるように実施されて、抗ＬＲＰ−Ａβ分子がＡβに結合する能力が試験され得
る。この抗ＬＲＰ−Ａβ分子は、3Ｈ、14Ｃまたは125Ｉで放射能標識されたＡβ
Ｉ−４２とともにインキュベートされる。以下の議論において、125Ｉ−Ａβが
、放射能標識されたＡβの例として使用される。メチルアミンまたはトリプシン
で活性化されたα2Ｍおよびα2Ｍ−２ならびに活性化されていないα2Ｍおよび
α2Ｍ−２が、コントロールとして使用され得る。次いで、抗ＬＲＰ−Ａβ／125 Ｉ−Ａβ複合体、α2Ｍ／125Ｉ−Ａβ複合体およびα2Ｍ−２／125Ｉ−Ａβ複合
体が、ＦＰＬＣ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の制御下にあるＳｕｐｅｒｏｓｅ ６ゲ
ル濾過カラム（０．７×２０ｃｍ）を使用して、非結合125Ｉ−Ａβから分離さ
れる。このＦＰＬＣは、分子量マーカー１０００ｋＤ〜４ｋＤを用いて標準化さ
れている。抗ＬＲＰ−Ａβが結合125Ｉ−Ａβを有する場合、125Ｉ−Ａβは、２
つのピークにてγ計数管によって検出されるはずである。１つのピークは、抗Ｌ
ＲＰ−Ａβ／125Ｉ−Ａβ複合体（約４０残基の抗ＬＲＰ−Ａβを含む複合体に
ついて約８〜９ｋＤ）に対応し、そして１つのピークは、125Ｉ−Ａβの分子量
（４．５ｋＤ）に対応する。
．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６９：１９０４〜１９１１（１９９７））により記載さ
れるように実施されて、抗ＬＲＰ−Ａβ分子がＡβに結合する能力が試験され得
る。この抗ＬＲＰ−Ａβ分子は、3Ｈ、14Ｃまたは125Ｉで放射能標識されたＡβ
Ｉ−４２とともにインキュベートされる。以下の議論において、125Ｉ−Ａβが
、放射能標識されたＡβの例として使用される。メチルアミンまたはトリプシン
で活性化されたα2Ｍおよびα2Ｍ−２ならびに活性化されていないα2Ｍおよび
α2Ｍ−２が、コントロールとして使用され得る。次いで、抗ＬＲＰ−Ａβ／125 Ｉ−Ａβ複合体、α2Ｍ／125Ｉ−Ａβ複合体およびα2Ｍ−２／125Ｉ−Ａβ複合
体が、ＦＰＬＣ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の制御下にあるＳｕｐｅｒｏｓｅ ６ゲ
ル濾過カラム（０．７×２０ｃｍ）を使用して、非結合125Ｉ−Ａβから分離さ
れる。このＦＰＬＣは、分子量マーカー１０００ｋＤ〜４ｋＤを用いて標準化さ
れている。抗ＬＲＰ−Ａβが結合125Ｉ−Ａβを有する場合、125Ｉ−Ａβは、２
つのピークにてγ計数管によって検出されるはずである。１つのピークは、抗Ｌ
ＲＰ−Ａβ／125Ｉ−Ａβ複合体（約４０残基の抗ＬＲＰ−Ａβを含む複合体に
ついて約８〜９ｋＤ）に対応し、そして１つのピークは、125Ｉ−Ａβの分子量
（４．５ｋＤ）に対応する。
【００７４】 あるいは、またはゲル濾過クロマトグラフィーに加えて、イムノブロッティン
グ法（Ｎａｒｉｔａ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６９：１９０４〜１９
１１（１９９７））が、抗ＬＲＰ−Ａβ分子がＡβに結合し得るか否かを決定す
るために使用され得る。非標識Ａβが、抗ＬＲＰ−Ａβ、非活性化α2Ｍ、非活
性化α2Ｍ−２、メチルアミンまたはトリプシンにより活性化されたα2Ｍ、ある
いはメチルアミンまたはトリプシンにより活性化されたα2Ｍ−２とともに、別
々にインキュベートされる。次いで、サンプルが、非還元条件下で、５％ ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ上で電気泳動され、ポリビニルジフルオリドニトロセルロース膜に
トランスファーされ、そして抗ＡβＩｇＧまたはこの抗ＬＲＰ−Ａβ分子に特異
的な抗体を用いてプローブされる。この抗ＬＲＰ−Ａβ分子のうちの１つ以上の
ドメインが、α2Ｍに由来する場合、α2Ｍ由来のドメインを認識する抗α2ＭＩ
ｇＧ（例えば、α2ＭのＬＲＰ結合ドメインに対して惹起される抗α2ＭＩｇＧ）
が使用され得る（例えば、Ｍａｒｙｎｅｎ，Ｐ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２
７：１７８２〜１７８７（１９８１））。この抗ＬＲＰ−Ａβ／Ａβサンプルが
、抗ＬＲＰ−Ａβに対する抗体、および抗ＡβＩｇＧの両方によって検出され得
る場合、この抗ＬＲＰ−Ａβ分子がＡβに結合し得ることが、結論付けられ得る
。この抗ＬＲＰ−Ａβ分子のＡβ結合ドメインがＡβに由来する場合、この抗Ａ
β抗体は、この抗Ａβ抗体が抗ＬＲＰ−Ａβ分子を認識しないことを確認するた
めに試験されるべきである。Ａβに対するいくつかの抗体（６３１０、ＷＯ２、
４Ｇ８、Ｇ２１０およびＧ２１１を含む）が、利用可能である。抗体４Ｇ８は、
Ａβ結合ドメインが、Ａβに由来する抗ＬＲＰ−Ａβ分子を認識し得る。さらに
、いくつかの抗α2Ｍ抗体は、α2Ｍに由来する抗ＬＲＰ−Ａβを認識しないかも
しれず、従って、これらの抗体は、本明細書中に記載されるイムノブロッティン
グプロトコル、エンドサイトーシスプロトコルおよび分解プロトコルを実施する
前に、このペプチドを認識する能力について試験されるべきである。Ｍａｒｙｎ
ｅｎら（Ｍａｒｙｎｅｎ，Ｐ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２７：１７８２〜１
７８７（１９８１））は、ＬＲＰ結合ドメインに対して惹起された抗α2Ｍ抗体
を記載しており、この抗α2Ｍ抗体は、α2Ｍに由来するＬＲＰ結合ドメインを有
する抗ＬＲＰ−Ａβペプチドを認識し得る。他の抗α2Ｍ抗体が、Ｓｉｇｍａお
よびＣｏｒｔｅｘ Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ、ＣＡ、Ｕ．Ｓ．
Ａ．）から入手可能である。α2Ｍは、Ｓｉｇｍａから入手され得るか、または
Ｗａｒｓｈａｗｓｋｙ，Ｉ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：９３７〜
９４４（１９９３）に記載されるように、ヒト血漿から精製されそして活性化さ
れ得る。合成Ａβ1-42が、Ｂａｃｈｅｍ（Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ、Ｕ．Ｓ．Ａ
．）から購入され得る。
グ法（Ｎａｒｉｔａ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６９：１９０４〜１９
１１（１９９７））が、抗ＬＲＰ−Ａβ分子がＡβに結合し得るか否かを決定す
るために使用され得る。非標識Ａβが、抗ＬＲＰ−Ａβ、非活性化α2Ｍ、非活
性化α2Ｍ−２、メチルアミンまたはトリプシンにより活性化されたα2Ｍ、ある
いはメチルアミンまたはトリプシンにより活性化されたα2Ｍ−２とともに、別
々にインキュベートされる。次いで、サンプルが、非還元条件下で、５％ ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ上で電気泳動され、ポリビニルジフルオリドニトロセルロース膜に
トランスファーされ、そして抗ＡβＩｇＧまたはこの抗ＬＲＰ−Ａβ分子に特異
的な抗体を用いてプローブされる。この抗ＬＲＰ−Ａβ分子のうちの１つ以上の
ドメインが、α2Ｍに由来する場合、α2Ｍ由来のドメインを認識する抗α2ＭＩ
ｇＧ（例えば、α2ＭのＬＲＰ結合ドメインに対して惹起される抗α2ＭＩｇＧ）
が使用され得る（例えば、Ｍａｒｙｎｅｎ，Ｐ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２
７：１７８２〜１７８７（１９８１））。この抗ＬＲＰ−Ａβ／Ａβサンプルが
、抗ＬＲＰ−Ａβに対する抗体、および抗ＡβＩｇＧの両方によって検出され得
る場合、この抗ＬＲＰ−Ａβ分子がＡβに結合し得ることが、結論付けられ得る
。この抗ＬＲＰ−Ａβ分子のＡβ結合ドメインがＡβに由来する場合、この抗Ａ
β抗体は、この抗Ａβ抗体が抗ＬＲＰ−Ａβ分子を認識しないことを確認するた
めに試験されるべきである。Ａβに対するいくつかの抗体（６３１０、ＷＯ２、
４Ｇ８、Ｇ２１０およびＧ２１１を含む）が、利用可能である。抗体４Ｇ８は、
Ａβ結合ドメインが、Ａβに由来する抗ＬＲＰ−Ａβ分子を認識し得る。さらに
、いくつかの抗α2Ｍ抗体は、α2Ｍに由来する抗ＬＲＰ−Ａβを認識しないかも
しれず、従って、これらの抗体は、本明細書中に記載されるイムノブロッティン
グプロトコル、エンドサイトーシスプロトコルおよび分解プロトコルを実施する
前に、このペプチドを認識する能力について試験されるべきである。Ｍａｒｙｎ
ｅｎら（Ｍａｒｙｎｅｎ，Ｐ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２７：１７８２〜１
７８７（１９８１））は、ＬＲＰ結合ドメインに対して惹起された抗α2Ｍ抗体
を記載しており、この抗α2Ｍ抗体は、α2Ｍに由来するＬＲＰ結合ドメインを有
する抗ＬＲＰ−Ａβペプチドを認識し得る。他の抗α2Ｍ抗体が、Ｓｉｇｍａお
よびＣｏｒｔｅｘ Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ、ＣＡ、Ｕ．Ｓ．
Ａ．）から入手可能である。α2Ｍは、Ｓｉｇｍａから入手され得るか、または
Ｗａｒｓｈａｗｓｋｙ，Ｉ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：９３７〜
９４４（１９９３）に記載されるように、ヒト血漿から精製されそして活性化さ
れ得る。合成Ａβ1-42が、Ｂａｃｈｅｍ（Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ、Ｕ．Ｓ．Ａ
．）から購入され得る。
【００７５】 上記のようなゲル濾過クロマトグラフィーおよびイムノブロッティングもまた
、ゲル濾過クロマトグラフィーの実験については標識Ａβの代わりに標識可溶性
ＬＲＰ（例えば、ＬＲＰの細胞外領域）を使用することによって、そしてイムノ
ブロッティングの実験については抗Ａβ ＩｇＧの代わりに抗ＬＲＰ ＩｇＧを
使用することによって、抗ＬＲＰ−ＡβがＬＲＰに結合する能力を決定するため
に使用され得る。あるいは、このイムノブロッティングプロトコルについては、
この抗ＬＲＰ−Ａβ分子は、蛍光標識または放射能標識で標識され得る。標識抗
ＬＲＰ−Ａβ分子について、この抗ＬＲＰ−Ａβ分子は、その標識バンドが抗Ａ
β抗体により認識されるバンドに対応する場合に、Ａβに結合し得ることが、結
論付けられ得る。
、ゲル濾過クロマトグラフィーの実験については標識Ａβの代わりに標識可溶性
ＬＲＰ（例えば、ＬＲＰの細胞外領域）を使用することによって、そしてイムノ
ブロッティングの実験については抗Ａβ ＩｇＧの代わりに抗ＬＲＰ ＩｇＧを
使用することによって、抗ＬＲＰ−ＡβがＬＲＰに結合する能力を決定するため
に使用され得る。あるいは、このイムノブロッティングプロトコルについては、
この抗ＬＲＰ−Ａβ分子は、蛍光標識または放射能標識で標識され得る。標識抗
ＬＲＰ−Ａβ分子について、この抗ＬＲＰ−Ａβ分子は、その標識バンドが抗Ａ
β抗体により認識されるバンドに対応する場合に、Ａβに結合し得ることが、結
論付けられ得る。
【００７６】 Ａβ／抗ＬＲＰ−Ａβ複合体がＬＲＰ媒介性エンドサイトーシスされ、続いて
分解される能力は、Ｋｏｕｎｎａｓら（Ｋｏｕｎａｓｓ，Ｍ．Ｚ．ら、Ｃｅｌｌ
８２：３３１〜３４０（１９９５）；Ｋｏｕｎｎａｓ，Ｍ．Ｚ．ら、Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：９３０７〜９３１２（１９９５））により記載される
ように、ＬＲＰを発現する細胞を使用する細胞培養実験を使用して、決定され得
る。細胞によってインターナライズされるかまたは分解される放射性リガンドの
量は、以前に記載されている（Ｋｏｕｎｎａｓ，Ｍ．Ｚ．ら、Ｃｅｌｌ ８２：
３３１〜３４０（１９９５）；Ｋｏｕｎｎａｓ，Ｍ．Ｚ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２７０：９３０７〜９３１２（１９９５））。ＬＲＰを発現する細胞と
しては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：脂肪細胞、星状細胞、線
維芽細胞、肝細胞、マクロファージ、単球、および合胞体層。本発明の１つの好
ましい実施形態において、マウス胚線維芽細胞が、細胞培養実験のために使用さ
れる。
分解される能力は、Ｋｏｕｎｎａｓら（Ｋｏｕｎａｓｓ，Ｍ．Ｚ．ら、Ｃｅｌｌ
８２：３３１〜３４０（１９９５）；Ｋｏｕｎｎａｓ，Ｍ．Ｚ．ら、Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：９３０７〜９３１２（１９９５））により記載される
ように、ＬＲＰを発現する細胞を使用する細胞培養実験を使用して、決定され得
る。細胞によってインターナライズされるかまたは分解される放射性リガンドの
量は、以前に記載されている（Ｋｏｕｎｎａｓ，Ｍ．Ｚ．ら、Ｃｅｌｌ ８２：
３３１〜３４０（１９９５）；Ｋｏｕｎｎａｓ，Ｍ．Ｚ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２７０：９３０７〜９３１２（１９９５））。ＬＲＰを発現する細胞と
しては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：脂肪細胞、星状細胞、線
維芽細胞、肝細胞、マクロファージ、単球、および合胞体層。本発明の１つの好
ましい実施形態において、マウス胚線維芽細胞が、細胞培養実験のために使用さ
れる。
【００７７】 ＬＲＰを発現する細胞が、抗ＬＲＰ−Ａβ、非活性化α2Ｍ、非活性化α2Ｍ−
２、メチルアミンまたはトリプシンにより活性化されたα2Ｍ、あるいはメチル
アミンまたはトリプシンにより活性化されたα2Ｍ−２の、存在下または不在下
で；ＲＡＰ（４００ｎＭ）の存在下かまたは不在下で、125Ｉ−Ａβとともに１
８時間インキュベートされる（あるいは、Ａβは、3Ｈまたは14Ｃで標識され得
る）。ＲＡＰは、ＬＲＰリガンド結合のインヒビターであり、そしてエンドサイ
トーシスがＬＲＰ媒介性であるか否かを決定するために添加される。ＲＡＰは、
Ｗａｒｓｈａｗｓｋｙ，Ｉ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：９３７〜
９４４（１９９３ｂ）に記載されるように、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現されらグ
ルタチオンＳトランスフェラーゼ融合タンパク質から、単離および精製され得る
。分解ではなくエンドサイトーシスを評価するために、クロロキノン（０．１ｍ
Ｍ）が、抗ＬＲＰ−Ａβ／125Ｉ−Ａβと同時に、125Ｉ−Ａβのリソソーム性分
解を阻害するために添加される。
２、メチルアミンまたはトリプシンにより活性化されたα2Ｍ、あるいはメチル
アミンまたはトリプシンにより活性化されたα2Ｍ−２の、存在下または不在下
で；ＲＡＰ（４００ｎＭ）の存在下かまたは不在下で、125Ｉ−Ａβとともに１
８時間インキュベートされる（あるいは、Ａβは、3Ｈまたは14Ｃで標識され得
る）。ＲＡＰは、ＬＲＰリガンド結合のインヒビターであり、そしてエンドサイ
トーシスがＬＲＰ媒介性であるか否かを決定するために添加される。ＲＡＰは、
Ｗａｒｓｈａｗｓｋｙ，Ｉ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：９３７〜
９４４（１９９３ｂ）に記載されるように、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現されらグ
ルタチオンＳトランスフェラーゼ融合タンパク質から、単離および精製され得る
。分解ではなくエンドサイトーシスを評価するために、クロロキノン（０．１ｍ
Ｍ）が、抗ＬＲＰ−Ａβ／125Ｉ−Ａβと同時に、125Ｉ−Ａβのリソソーム性分
解を阻害するために添加される。
【００７８】 トリプシン−ＥＤＴＡ、プロテイナーゼＫ溶液による処理によって放出された
放射性リガンドの量は、その膜結合物質を規定し、そしてその細胞ペレットと結
合した放射能の量は、インターナライズされたリガンドの量を規定する。活性化
されたα2Ｍ／125Ｉ−Ａβは、ポジティブコントロールとして作用する。記載さ
れる条件下で、８ｆｍｏｌｅ／１０4細胞を越える活性化α2Ｍ／125Ｉ−Ａβが
、インキュベーションの１８時間後にインタナライズされるはずである（Ｋｏｕ
ｎｎａｓ，Ｍ．Ｚ．ら、Ｃｅｌｌ ８２：３３１〜３４０（１９９５））。不活
性化α2Ｍ／125Ｉ−Ａβは、エンドサイトーシスについてのネガティブコントロ
ールとして作用する。なぜなら、α2Ｍは、ＬＲＰに認識されるには、トリプシ
ンまたはメチルアミンによって活性化されなければばらないからである。抗ＬＲ
Ｐ−Ａβ／125Ｉ−Ａβの量が４〜８ｆｍｏｌｅ／１０4細胞を越える場合、抗Ｌ
ＲＰ−Ａβ／125Ｉ−Ａβが、ＬＲＰ媒介性エンドサイトーシスを受ける能力を
有することが、結論付けられ得る。不活性化α2Ｍ／125Ｉ−Ａβおよび活性化α 2 Ｍ／125Ｉ−Ａβは、ＲＡＰの存在下において、インターナライズされるはずが
なく、従って、わずか２〜４ｆｍｏｌｅ／１０4細胞以下しか、インターナライ
ズされないはずである（Ｋｏｕｎｎａｓ，Ｍ．Ｚ．ら、Ｃｅｌｌ ８２：３３１
〜３４０（１９９５））。この抗ＬＲＰ−Ａβ／125Ｉ−Ａβ複合体のインタナ
リゼーションは、抗ＬＲＰ−Ａβ／125Ｉ−Ａβおよび不活性化α2Ｍ／125Ｉ−
Ａβが、ＲＡＰの存在下および不在下にて、その細胞ペレットと結合した同量の
放射能を示す場合に、完全に消滅したとみなされる。
放射性リガンドの量は、その膜結合物質を規定し、そしてその細胞ペレットと結
合した放射能の量は、インターナライズされたリガンドの量を規定する。活性化
されたα2Ｍ／125Ｉ−Ａβは、ポジティブコントロールとして作用する。記載さ
れる条件下で、８ｆｍｏｌｅ／１０4細胞を越える活性化α2Ｍ／125Ｉ−Ａβが
、インキュベーションの１８時間後にインタナライズされるはずである（Ｋｏｕ
ｎｎａｓ，Ｍ．Ｚ．ら、Ｃｅｌｌ ８２：３３１〜３４０（１９９５））。不活
性化α2Ｍ／125Ｉ−Ａβは、エンドサイトーシスについてのネガティブコントロ
ールとして作用する。なぜなら、α2Ｍは、ＬＲＰに認識されるには、トリプシ
ンまたはメチルアミンによって活性化されなければばらないからである。抗ＬＲ
Ｐ−Ａβ／125Ｉ−Ａβの量が４〜８ｆｍｏｌｅ／１０4細胞を越える場合、抗Ｌ
ＲＰ−Ａβ／125Ｉ−Ａβが、ＬＲＰ媒介性エンドサイトーシスを受ける能力を
有することが、結論付けられ得る。不活性化α2Ｍ／125Ｉ−Ａβおよび活性化α 2 Ｍ／125Ｉ−Ａβは、ＲＡＰの存在下において、インターナライズされるはずが
なく、従って、わずか２〜４ｆｍｏｌｅ／１０4細胞以下しか、インターナライ
ズされないはずである（Ｋｏｕｎｎａｓ，Ｍ．Ｚ．ら、Ｃｅｌｌ ８２：３３１
〜３４０（１９９５））。この抗ＬＲＰ−Ａβ／125Ｉ−Ａβ複合体のインタナ
リゼーションは、抗ＬＲＰ−Ａβ／125Ｉ−Ａβおよび不活性化α2Ｍ／125Ｉ−
Ａβが、ＲＡＰの存在下および不在下にて、その細胞ペレットと結合した同量の
放射能を示す場合に、完全に消滅したとみなされる。
【００７９】 Ａβ／抗ＬＲＰ−Ａβ複合体がエンドサイトーシス後に分解される能力を決定
するために、この細胞培養プロトコルが、クロロキンを用いずに反復される。１
０％トリクロロ酢酸中にて可溶性である細胞培養培地中で現れる放射能は、分解
された125Ｉ−Ａβを示すとみなされる（Ｋｏｕｎｎａｓ，Ｍ．Ｚ．ら、Ｃｅｌ
ｌ ８２：３３１〜３４０（１９９５）；Ｎａｒｉｔａ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒ
ｏｃｈｅｍ．６９：１９０４〜１９１１（１９９７））。総リガンド分解は、細
胞を欠くコントロールウェルにて生じる分解の量について補正される。遊離の12 5 Ｉ−ＡβはＬＲＰ非依存性様式で分解され得るので、分解は、125Ｉ−Ａβとの
抗ＬＲＰ−Ａβの複合体およびα2Ｍの複合体について、ならびに遊離125Ｉ−Ａ
βについて、ＲＡＰの存在下および不在下にて測定される。上記と同じポジティ
ブコントロールおよびネガティブコントロールを使用して、ＲＡＰが、抗ＬＡＰ
−Ａβ／125Ｉ−Ａβ複合体についてより少なくとも３０％ＴＣＡ可溶性放射能
の量を減少させない場合には、抗ＬＲＰ−Ａβの125Ｉ−Ａβリガンドは分解さ
れないことが、結論付けられ得る。
するために、この細胞培養プロトコルが、クロロキンを用いずに反復される。１
０％トリクロロ酢酸中にて可溶性である細胞培養培地中で現れる放射能は、分解
された125Ｉ−Ａβを示すとみなされる（Ｋｏｕｎｎａｓ，Ｍ．Ｚ．ら、Ｃｅｌ
ｌ ８２：３３１〜３４０（１９９５）；Ｎａｒｉｔａ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒ
ｏｃｈｅｍ．６９：１９０４〜１９１１（１９９７））。総リガンド分解は、細
胞を欠くコントロールウェルにて生じる分解の量について補正される。遊離の12 5 Ｉ−ＡβはＬＲＰ非依存性様式で分解され得るので、分解は、125Ｉ−Ａβとの
抗ＬＲＰ−Ａβの複合体およびα2Ｍの複合体について、ならびに遊離125Ｉ−Ａ
βについて、ＲＡＰの存在下および不在下にて測定される。上記と同じポジティ
ブコントロールおよびネガティブコントロールを使用して、ＲＡＰが、抗ＬＡＰ
−Ａβ／125Ｉ−Ａβ複合体についてより少なくとも３０％ＴＣＡ可溶性放射能
の量を減少させない場合には、抗ＬＲＰ−Ａβの125Ｉ−Ａβリガンドは分解さ
れないことが、結論付けられ得る。
【００８０】 抗ＬＡＰ−Ａβ分子がＡβおよびＬＲＰに結合する能力を試験する別の方法は
、Ｔｉｒｏｄｅら（Ｔｉｒｏｄｅ，Ｆ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：
２２９９５〜２２９９９（１９９７））により記載される酵母スリーハイブリッ
ド系である。この方法は、この抗ＬＲＰ−Ａβ分子がペプチドである場合に使用
され得る。このシステムにおいて、酵母の増殖は、「ベイト」が「フック（ｈｏ
ｏｋ）」および「フィッシュ（ｆｉｓｈ）」の両方を認識する場合にのみ生じる
（図７）。この場合において、この「フック」は、ｐＬｅｘ９−３Ｈ（ＴＲＰ１
エピソームベクター）（Ｔｉｒｏｄｅ，Ｆ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７
２：２２９９５〜２２９９９（１９９７））中でＬｅｘＡ ＤＮＡ結合タンパク
質のコード配列に融合された、ＡβをコードするＤＮＡから構築されている（Ｂ
ａｌｅｓ，Ｋ．Ｒ．ら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１７：２６４（１９９７））。こ
の「フィッシュ」は、ＬＥＵ２エピソームベクターであるｐＶＰ１６（Ｔｒｉｏ
ｄｅ，Ｆ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２２９９５〜２２９９９（１
９９７））においてＢ４２活性化ドメインに融合された、ＬＲＰの５１５ｋＤの
細胞外ドメインのコード配列から構築されている。この「ベイト」は、ｐＬｅｘ
９−３Ｈベクター中にある抗ＬＲＰ−ＡβをコードするＤＮＡであり、抗ＬＲＰ
−Ａβの発現が、メチオニンによって抑制されている。これらのベクターによる
酵母の形質転換の後、Ａβ融合ＤＮＡ結合ドメインがＬＲＰに融合した転写活性
化ドメインに接近した場合にのみ、そのＬｅｕ２レポーター遺伝子の転写が生じ
る。このＡβ／ＬＲＰ結合融合ペプチドは、レポーター遺伝子の転写を促進する
はずである。抗ＬＲＰ−ＡβとＡβとＬＲＰ（５１５ｋＤ）との間の相互作用は
、Ａβ−ＬｅｘＡ、ＬＲＰ（５１５ｋＤ）−Ｂ４２、および抗ＬＲＰ−Ａβが発
現された場合にレポーター遺伝子発現（酵母の増殖）が生じる場合にのみ、正で
あるとみなされる。
、Ｔｉｒｏｄｅら（Ｔｉｒｏｄｅ，Ｆ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：
２２９９５〜２２９９９（１９９７））により記載される酵母スリーハイブリッ
ド系である。この方法は、この抗ＬＲＰ−Ａβ分子がペプチドである場合に使用
され得る。このシステムにおいて、酵母の増殖は、「ベイト」が「フック（ｈｏ
ｏｋ）」および「フィッシュ（ｆｉｓｈ）」の両方を認識する場合にのみ生じる
（図７）。この場合において、この「フック」は、ｐＬｅｘ９−３Ｈ（ＴＲＰ１
エピソームベクター）（Ｔｉｒｏｄｅ，Ｆ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７
２：２２９９５〜２２９９９（１９９７））中でＬｅｘＡ ＤＮＡ結合タンパク
質のコード配列に融合された、ＡβをコードするＤＮＡから構築されている（Ｂ
ａｌｅｓ，Ｋ．Ｒ．ら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１７：２６４（１９９７））。こ
の「フィッシュ」は、ＬＥＵ２エピソームベクターであるｐＶＰ１６（Ｔｒｉｏ
ｄｅ，Ｆ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２２９９５〜２２９９９（１
９９７））においてＢ４２活性化ドメインに融合された、ＬＲＰの５１５ｋＤの
細胞外ドメインのコード配列から構築されている。この「ベイト」は、ｐＬｅｘ
９−３Ｈベクター中にある抗ＬＲＰ−ＡβをコードするＤＮＡであり、抗ＬＲＰ
−Ａβの発現が、メチオニンによって抑制されている。これらのベクターによる
酵母の形質転換の後、Ａβ融合ＤＮＡ結合ドメインがＬＲＰに融合した転写活性
化ドメインに接近した場合にのみ、そのＬｅｕ２レポーター遺伝子の転写が生じ
る。このＡβ／ＬＲＰ結合融合ペプチドは、レポーター遺伝子の転写を促進する
はずである。抗ＬＲＰ−ＡβとＡβとＬＲＰ（５１５ｋＤ）との間の相互作用は
、Ａβ−ＬｅｘＡ、ＬＲＰ（５１５ｋＤ）−Ｂ４２、および抗ＬＲＰ−Ａβが発
現された場合にレポーター遺伝子発現（酵母の増殖）が生じる場合にのみ、正で
あるとみなされる。
【００８１】 本発明のＬＲＰ−Ａβ分子は、それ自体で投与され得るし、または任意の非毒
性有機酸または無機酸との薬学的に受容可能な塩の形態で投与され得る。適切な
塩を形成する例示的無機酸としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸およびリン酸が挙
げられ、そして酸金属塩（例えば、オルトリン酸水素ナトリウムおよび硫酸水素
カリウム）が挙げられる。適切な塩を形成する例示的有機酸としては、モノカル
ボン酸、ジカルボン酸、およびトリカルボン酸が挙げられる。このような酸の例
とは、例えば、酢酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、マロン酸、コハク酸、
グルタール酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、マレ
イン酸、ヒドロキシマレイン酸、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、フェニル乳酸
、ケイ皮酸、サリチル酸、２−フェノキシ安息香酸、およびスルホン酸（例えば
、メタンスルホン酸および２−ヒドロキシエタンスルホン酸）。そのカルボキシ
末端のアミノ酸部分の塩としては、適切な任意の無機塩基または有機塩基と形成
される、非毒性カルボン酸塩が挙げられる。例示的には、これらの塩としては、
以下が挙げられる：アルカリ金属（例えば、ナトリウムおよびカリウム）の塩；
アルカリ土類金属（例えば、カルシウムおよびマグネシウム）の塩；ＩＩＩＡ群
の軽金属（アルミニウムを含む）の塩；ならびに有機一級アミン、二級アミン、
および三級アミン（例えば、トリアルキルアミン（トリエチルアミンを含む）、
プロカイン、ジベンジルアミン、１−エテンアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチ
レンジアミン、ジヒドロアビエチルアミン、Ｎ−（低級）アルキルピペリジン、
ならびに他の適切なアミン）の塩。
性有機酸または無機酸との薬学的に受容可能な塩の形態で投与され得る。適切な
塩を形成する例示的無機酸としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸およびリン酸が挙
げられ、そして酸金属塩（例えば、オルトリン酸水素ナトリウムおよび硫酸水素
カリウム）が挙げられる。適切な塩を形成する例示的有機酸としては、モノカル
ボン酸、ジカルボン酸、およびトリカルボン酸が挙げられる。このような酸の例
とは、例えば、酢酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、マロン酸、コハク酸、
グルタール酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、マレ
イン酸、ヒドロキシマレイン酸、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、フェニル乳酸
、ケイ皮酸、サリチル酸、２−フェノキシ安息香酸、およびスルホン酸（例えば
、メタンスルホン酸および２−ヒドロキシエタンスルホン酸）。そのカルボキシ
末端のアミノ酸部分の塩としては、適切な任意の無機塩基または有機塩基と形成
される、非毒性カルボン酸塩が挙げられる。例示的には、これらの塩としては、
以下が挙げられる：アルカリ金属（例えば、ナトリウムおよびカリウム）の塩；
アルカリ土類金属（例えば、カルシウムおよびマグネシウム）の塩；ＩＩＩＡ群
の軽金属（アルミニウムを含む）の塩；ならびに有機一級アミン、二級アミン、
および三級アミン（例えば、トリアルキルアミン（トリエチルアミンを含む）、
プロカイン、ジベンジルアミン、１−エテンアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチ
レンジアミン、ジヒドロアビエチルアミン、Ｎ−（低級）アルキルピペリジン、
ならびに他の適切なアミン）の塩。
【００８２】 被験体に投与される抗ＬＲＰ−Ａβ分子の量は、その被験体の年齢、体重、お
よび状態に依存して変化する。処置の経過は、数日から数ヶ月、または治癒がも
たらされるまで、もしくは疾患状態の軽減が達成されるまで続き得るか、あるい
は例えば、予防的に使用される場合は、何年間もの間継続し得る。最適な投薬ス
ケジュールは、身体における薬物の蓄積の測定から計算され得る。当業者は、最
適投薬量、投薬方法論および反復率を容易に決定し得る。しかし、被験体に投与
される抗ＬＲＰ−Ａβ分子の量は、一般的に、０．１ｎｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ
／ｋｇ／日であり、そして代表的には、１ｎｇ／ｋｇ／日〜１ｍｇ／ｋｇ／日の
範囲の量である。
よび状態に依存して変化する。処置の経過は、数日から数ヶ月、または治癒がも
たらされるまで、もしくは疾患状態の軽減が達成されるまで続き得るか、あるい
は例えば、予防的に使用される場合は、何年間もの間継続し得る。最適な投薬ス
ケジュールは、身体における薬物の蓄積の測定から計算され得る。当業者は、最
適投薬量、投薬方法論および反復率を容易に決定し得る。しかし、被験体に投与
される抗ＬＲＰ−Ａβ分子の量は、一般的に、０．１ｎｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ
／ｋｇ／日であり、そして代表的には、１ｎｇ／ｋｇ／日〜１ｍｇ／ｋｇ／日の
範囲の量である。
【００８３】 本発明はまた、Ａ２Ｍ−２ＲＮＡを標的とされたアンチセンスオリゴヌクレオ
チド、ならびにＡＤについての治療剤としてのこれらのアンチセンスオリゴヌク
レオチドの使用ならびにＡ２Ｍ−２発現を抑制するためにこれらのアンチセンス
オリゴヌクレオチドの使用に関する。α2Ｍのエキソン１７およびエキソン１８
におけるベイト領域をコードする配列の部分的欠失または全体の欠失は、プロテ
アーゼ結合を改変し、α2Ｍ活性化を妨げるようである。テトラマーへの１つ以
上の変異体モノマーの組み込みは、それによって、効率的に活性化され得ない欠
損テトラマーを生じ得、従って、続いて、ＬＲＰを介してエンドサイトーシスを
受け得る。従って、非常に低レベルの変異体モノマーの生成は、増幅された効果
を有し得る。なぜなら、１つの変異体モノマーは、そのテトラマーにおいて、３
つの野生型モノマーの機能を潜在的に阻害し得るからである（ドミナントネガテ
ィブ効果）。このドミナントネガティブ効果を押し留めるための１つの方法は、
異常なα2Ｍのレベルを、ＲＮＡレベルでの遺伝子発現を妨げることによって減
少させることである。この目的のために、Ａ２Ｍ−２ ＲＮＡに特異的なアンチ
センスオリゴヌクレオチドが使用され得る。このオリゴヌクレオチドは、本明細
書中において、Ａ２Ｍ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドと呼ばれる。このＡ
２Ｍ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドは、任意のＡ２Ｍ−２ ＲＮＡ分子を
標的とされ得るが、本発明の好ましい実施形態において、このオリゴヌクレオチ
ドは、ヘテロ核を標的とされる（ｈｎＲＮＡ）。
チド、ならびにＡＤについての治療剤としてのこれらのアンチセンスオリゴヌク
レオチドの使用ならびにＡ２Ｍ−２発現を抑制するためにこれらのアンチセンス
オリゴヌクレオチドの使用に関する。α2Ｍのエキソン１７およびエキソン１８
におけるベイト領域をコードする配列の部分的欠失または全体の欠失は、プロテ
アーゼ結合を改変し、α2Ｍ活性化を妨げるようである。テトラマーへの１つ以
上の変異体モノマーの組み込みは、それによって、効率的に活性化され得ない欠
損テトラマーを生じ得、従って、続いて、ＬＲＰを介してエンドサイトーシスを
受け得る。従って、非常に低レベルの変異体モノマーの生成は、増幅された効果
を有し得る。なぜなら、１つの変異体モノマーは、そのテトラマーにおいて、３
つの野生型モノマーの機能を潜在的に阻害し得るからである（ドミナントネガテ
ィブ効果）。このドミナントネガティブ効果を押し留めるための１つの方法は、
異常なα2Ｍのレベルを、ＲＮＡレベルでの遺伝子発現を妨げることによって減
少させることである。この目的のために、Ａ２Ｍ−２ ＲＮＡに特異的なアンチ
センスオリゴヌクレオチドが使用され得る。このオリゴヌクレオチドは、本明細
書中において、Ａ２Ｍ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドと呼ばれる。このＡ
２Ｍ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドは、任意のＡ２Ｍ−２ ＲＮＡ分子を
標的とされ得るが、本発明の好ましい実施形態において、このオリゴヌクレオチ
ドは、ヘテロ核を標的とされる（ｈｎＲＮＡ）。
【００８４】 このＡ２Ｍ−２の欠失が、エキソン１８のスプライシング領域にて見出され、
従って、本発明の１つの実施形態において、このＡ２Ｍ−２アンチセンスオリゴ
ヌクレオチドは、スプライシングが生じる前にＡ２Ｍ−２ ＲＮＡ転写物を標的
とするように設計され、ｈｎＲＮＡと呼ばれる。さらに、Ａ２Ｍ−２ ｈｎＲＮ
Ａに特異的であるために、このＡ２Ｍ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドは、
Ａ２Ｍ−２にて見出される５ヌクレオチドの欠失を標的とするように設計される
。本発明の別の実施形態において、このＡ２Ｍ−２アンチセンスオリゴヌクレオ
チドは、Ａ２Ｍ−２ ｍＲＮＡを標的とするように設計される。このＡ２Ｍ−２
の欠失は、種々の配列を有するいくつかの改変体ｍＲＮＡ転写物を生じる。本発
明のＡ２Ｍ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドは、個々の改変体を標的するよ
うにか、またはこれらの改変体のうちの１つより多くを標的とするように、設計
され得る。さらに、異なるＡ２Ｍ−２ ｍＲＮＡ改変体を標的とするかまたはＡ
２Ｍ−２ ｈｎＲＮＡを標的とする、Ａ２Ｍ−２アンチセンスオリゴヌクレオチ
ドが、単独でかまたは互いに組み合わせてかのいずれかにて、使用され得る。
従って、本発明の１つの実施形態において、このＡ２Ｍ−２アンチセンスオリゴ
ヌクレオチドは、スプライシングが生じる前にＡ２Ｍ−２ ＲＮＡ転写物を標的
とするように設計され、ｈｎＲＮＡと呼ばれる。さらに、Ａ２Ｍ−２ ｈｎＲＮ
Ａに特異的であるために、このＡ２Ｍ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドは、
Ａ２Ｍ−２にて見出される５ヌクレオチドの欠失を標的とするように設計される
。本発明の別の実施形態において、このＡ２Ｍ−２アンチセンスオリゴヌクレオ
チドは、Ａ２Ｍ−２ ｍＲＮＡを標的とするように設計される。このＡ２Ｍ−２
の欠失は、種々の配列を有するいくつかの改変体ｍＲＮＡ転写物を生じる。本発
明のＡ２Ｍ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドは、個々の改変体を標的するよ
うにか、またはこれらの改変体のうちの１つより多くを標的とするように、設計
され得る。さらに、異なるＡ２Ｍ−２ ｍＲＮＡ改変体を標的とするかまたはＡ
２Ｍ−２ ｈｎＲＮＡを標的とする、Ａ２Ｍ−２アンチセンスオリゴヌクレオチ
ドが、単独でかまたは互いに組み合わせてかのいずれかにて、使用され得る。
【００８５】 さらに、このＡ２Ｍ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドは、このＡ２Ｍ−２
アンチセンスオリゴヌクレオチドがＡ２Ｍ−２のみを標的とするように十分長い
が、送達を最適にするに十分短くなければならない。従って、本発明のアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは長さ８〜５０ヌクレオチドであり、より
好ましくは長さ１５〜３０ヌクレオチドである。従って、本発明の１つの実施形
態において、このＡ２Ｍ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドは、８〜５０ヌク
レオチドであり、そしてこの５ヌクレオチドの欠失の部位を含むＡ２Ｍ−２の領
域のコード鎖に相補的である。本発明の好ましい実施形態において、このＡ２Ｍ
−２アンチセンスオリゴヌクレオチドは、この５ヌクレオチド欠失を含むＡ２Ｍ
−２のコード鎖上の部位に相補的である領域の１５〜３０個連続するヌクレオチ
ドから構成される。本発明の別の実施形態において、このＡ２Ｍ−２アンチセン
スオリゴヌクレオチドは、配列番号２７の最後の８〜５０個連続するヌクレオチ
ドから構成される。本発明の好ましい実施形態において、このＡ２Ｍ−２アンチ
センスオリゴヌクレオチドは、配列番号２７の最後の１５〜３０個連続するヌク
レオチドから構成される。なお別の好ましい実施形態において、このＡ２Ｍ−２
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号２７のヌクレオチド３６〜５０か
ら構成される。本発明の別の好ましい実施形態において、このＡ２Ｍ−２アンチ
センスオリゴヌクレオチドは、配列番号２７のヌクレオチド２０〜５０から構成
される。
アンチセンスオリゴヌクレオチドがＡ２Ｍ−２のみを標的とするように十分長い
が、送達を最適にするに十分短くなければならない。従って、本発明のアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは長さ８〜５０ヌクレオチドであり、より
好ましくは長さ１５〜３０ヌクレオチドである。従って、本発明の１つの実施形
態において、このＡ２Ｍ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドは、８〜５０ヌク
レオチドであり、そしてこの５ヌクレオチドの欠失の部位を含むＡ２Ｍ−２の領
域のコード鎖に相補的である。本発明の好ましい実施形態において、このＡ２Ｍ
−２アンチセンスオリゴヌクレオチドは、この５ヌクレオチド欠失を含むＡ２Ｍ
−２のコード鎖上の部位に相補的である領域の１５〜３０個連続するヌクレオチ
ドから構成される。本発明の別の実施形態において、このＡ２Ｍ−２アンチセン
スオリゴヌクレオチドは、配列番号２７の最後の８〜５０個連続するヌクレオチ
ドから構成される。本発明の好ましい実施形態において、このＡ２Ｍ−２アンチ
センスオリゴヌクレオチドは、配列番号２７の最後の１５〜３０個連続するヌク
レオチドから構成される。なお別の好ましい実施形態において、このＡ２Ｍ−２
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号２７のヌクレオチド３６〜５０か
ら構成される。本発明の別の好ましい実施形態において、このＡ２Ｍ−２アンチ
センスオリゴヌクレオチドは、配列番号２７のヌクレオチド２０〜５０から構成
される。
【００８６】 このＡ２Ｍ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡであってもまたは
ＲＮＡであってもよい。すなわち、このＡ２Ｍ−２アンチセンスオリゴヌクレオ
チドは、それぞれ、デオキシリボ核酸から構成されてもまたはリボ核酸から構成
されてもよい。あるいは、このオリゴヌクレオチドは、このオリゴヌクレオチド
が酵素分解に対してより抵抗性になるように、ホスホロチオエート骨格を有する
ヌクレオチドから構成され得る（ｖａｎ ｄｅｒ Ｋｒｏｌ，Ａ．Ｒ．ら、Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：９５８〜９７６（１９８８）；Ｃａｚｅｎａｖｅ
，Ｃ．およびＨｅｌｅｎｅ，Ｃ．「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅ
ｏｔｉｄｅｓ」Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ｐ
ｒｏｔｅｉｎｓ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ
、Ｍｏｌ，Ｊ．Ｎ．Ｍ．およびｖａｎ ｄｅｒ Ｋｒｏｌ，Ａ．Ｒ．編、Ｍ．Ｄ
ｅｋｋｅｒ刊、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１〜６頁（１９９１）；Ｍｉｌｌｉｇａｎ，
Ｊ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６：１９２３〜１９３７（１９９３））
。本発明の好ましい実施形態において、このＡ２Ｍ−２アンチセンスオリゴヌク
レオチドはＤＮＡである。
ＲＮＡであってもよい。すなわち、このＡ２Ｍ−２アンチセンスオリゴヌクレオ
チドは、それぞれ、デオキシリボ核酸から構成されてもまたはリボ核酸から構成
されてもよい。あるいは、このオリゴヌクレオチドは、このオリゴヌクレオチド
が酵素分解に対してより抵抗性になるように、ホスホロチオエート骨格を有する
ヌクレオチドから構成され得る（ｖａｎ ｄｅｒ Ｋｒｏｌ，Ａ．Ｒ．ら、Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：９５８〜９７６（１９８８）；Ｃａｚｅｎａｖｅ
，Ｃ．およびＨｅｌｅｎｅ，Ｃ．「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅ
ｏｔｉｄｅｓ」Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ｐ
ｒｏｔｅｉｎｓ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ
、Ｍｏｌ，Ｊ．Ｎ．Ｍ．およびｖａｎ ｄｅｒ Ｋｒｏｌ，Ａ．Ｒ．編、Ｍ．Ｄ
ｅｋｋｅｒ刊、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１〜６頁（１９９１）；Ｍｉｌｌｉｇａｎ，
Ｊ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６：１９２３〜１９３７（１９９３））
。本発明の好ましい実施形態において、このＡ２Ｍ−２アンチセンスオリゴヌク
レオチドはＤＮＡである。
【００８７】 このオリゴヌクレオチドを保護するために使用され得る他の改変としては、こ
のオリゴヌクレオチドの３’末端に対する化学変化（ｖａｎ ｄｅｒ Ｋｒｏｌ
，Ａ．Ｒ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：９５８〜９７６（１９８８）
；Ｋｈａｎ，Ｉ．Ｍ．およびＣｏｕｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：２９５７〜２９５８（１９９３）；Ｔａｎｇ，Ｊ．Ｙ．
ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ．２１：２７２９〜２７３５（１９９３
））またはその３’末端のビオチン化に続いてのアビジンによる結合（Ｂｏａｄ
ｏ，Ｒ．Ｊ．およびＰａｒｄｒｉｄｇｅ，Ｗ．Ｍ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ
Ｃｈｅｍ．３：５１９〜５２３（１９９２））が、挙げられる。あるいは、リ
ポフェクチンが、このオリゴヌクレオチドを送達するため、すなわち、このオリ
ゴヌクレオチドを脂質中にパッケージングするために、使用され得る（ＭｃＣａ
ｒｔｈｙ，Ｍ．Ｍ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．１３３：４３３〜４３９（１９９３
ｂ）；Ｏｇａｗａ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１４：１７６６〜１７７４
（１９９４））。リポフェクチンは、ヌクレアーゼからこのオリゴヌクレオチド
を保護し、そして中枢神経系への送達を補助し得る。
のオリゴヌクレオチドの３’末端に対する化学変化（ｖａｎ ｄｅｒ Ｋｒｏｌ
，Ａ．Ｒ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：９５８〜９７６（１９８８）
；Ｋｈａｎ，Ｉ．Ｍ．およびＣｏｕｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：２９５７〜２９５８（１９９３）；Ｔａｎｇ，Ｊ．Ｙ．
ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ．２１：２７２９〜２７３５（１９９３
））またはその３’末端のビオチン化に続いてのアビジンによる結合（Ｂｏａｄ
ｏ，Ｒ．Ｊ．およびＰａｒｄｒｉｄｇｅ，Ｗ．Ｍ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ
Ｃｈｅｍ．３：５１９〜５２３（１９９２））が、挙げられる。あるいは、リ
ポフェクチンが、このオリゴヌクレオチドを送達するため、すなわち、このオリ
ゴヌクレオチドを脂質中にパッケージングするために、使用され得る（ＭｃＣａ
ｒｔｈｙ，Ｍ．Ｍ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．１３３：４３３〜４３９（１９９３
ｂ）；Ｏｇａｗａ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１４：１７６６〜１７７４
（１９９４））。リポフェクチンは、ヌクレアーゼからこのオリゴヌクレオチド
を保護し、そして中枢神経系への送達を補助し得る。
【００８８】 このＡ２Ｍ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドは、市販の自動ＤＮＡ合成機
（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓまたはＭｉｌｌｉＧｅｎなど
によって製造される、ＤＮＡ合成機）によって、容易に合成され得る。さらに、
オリゴヌクレオチドを合成する方法は、当該分野で周知であり、そして例えば、
Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ ａ Ｐｒ
ａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．編、Ｏｘｆｏｒｄ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ刊、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９１）および
「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｌｉｇｏ
ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら編、Ｊｏｈｎ Ｗ
ｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．刊、第１巻、第２．１１〜２．１２節（補遺９、
１９９３）に記載される。
（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓまたはＭｉｌｌｉＧｅｎなど
によって製造される、ＤＮＡ合成機）によって、容易に合成され得る。さらに、
オリゴヌクレオチドを合成する方法は、当該分野で周知であり、そして例えば、
Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ ａ Ｐｒ
ａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．編、Ｏｘｆｏｒｄ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ刊、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９１）および
「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｌｉｇｏ
ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら編、Ｊｏｈｎ Ｗ
ｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．刊、第１巻、第２．１１〜２．１２節（補遺９、
１９９３）に記載される。
【００８９】 本発明はまた、Ａ２Ｍ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび１つ以上の
薬学的に受容可能なキャリアを含有する薬学的組成物に関する。さらに、本発明
は、ＡＤを処置する方法、および／またはＡ２Ｍ−２発現をＡ２Ｍ−２アンチセ
ンスオリゴヌクレオチドを被験体に投与することによって抑制する方法を提供す
る。好ましくは、Ａ２Ｍ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ａ２Ｍ−２対
立遺伝子について異種接合性または同種接合性であることが決定されている被験
体に送達される。Ａ２Ｍ−２について異種接合性または同種接合性である被験体
を選択および評価するための手順は、Ｔａｎｚｉら、米国特許出願第０９／１４
８，５０３号、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８５３５、およびＢｌａｃｋ
ｅｒ，Ｄ．ら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９：３５７−３６０（１９９８年８月）
に記載される。本発明の別の好ましい実施形態において、Ａ２Ｍ−２アンチセン
スオリゴヌクレオチドでの被験体の処置は、α2Ｍ機能を置換または補充するよ
うに設計された治療と組み合わせて行われる。
薬学的に受容可能なキャリアを含有する薬学的組成物に関する。さらに、本発明
は、ＡＤを処置する方法、および／またはＡ２Ｍ−２発現をＡ２Ｍ−２アンチセ
ンスオリゴヌクレオチドを被験体に投与することによって抑制する方法を提供す
る。好ましくは、Ａ２Ｍ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ａ２Ｍ−２対
立遺伝子について異種接合性または同種接合性であることが決定されている被験
体に送達される。Ａ２Ｍ−２について異種接合性または同種接合性である被験体
を選択および評価するための手順は、Ｔａｎｚｉら、米国特許出願第０９／１４
８，５０３号、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８５３５、およびＢｌａｃｋ
ｅｒ，Ｄ．ら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９：３５７−３６０（１９９８年８月）
に記載される。本発明の別の好ましい実施形態において、Ａ２Ｍ−２アンチセン
スオリゴヌクレオチドでの被験体の処置は、α2Ｍ機能を置換または補充するよ
うに設計された治療と組み合わせて行われる。
【００９０】 アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトに安全に投与されており、そしてい
くつかの臨床試験が、現在進行中である。これらの臨床試験に基づいて、オリゴ
ヌクレオチドは、治療的効力が必要とされる投薬量で、受容可能な限界内で毒性
を有することが理解される。１つのこのようなアンチセンスオリゴヌクレオチド
（ＩＳＩＳ２１０５として同定される）は、現在臨床試験中であり、そしてパピ
ローマウイルスに対する治療として使用される。別のアンチセンスオリゴヌクレ
オチド（ＩＳＩＳ２９２２）は、サイトメガロウイルス関連網膜炎に対する臨床
的効力を有することが示されている（Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ａｇｅｎｔｓ Ｂｕ
ｌｌｅｔｉｎ ５：１６１−１６３（１９９２）；ＢｉｏＷｏｒｌｄ Ｔｏｄａ
ｙ，１９９３年１２月２０日）。従って、オリゴヌクレオチドが有用な治療剤で
あること、およびそれらは動物、特にヒトの処置に使用され得ることが確立され
ている。
くつかの臨床試験が、現在進行中である。これらの臨床試験に基づいて、オリゴ
ヌクレオチドは、治療的効力が必要とされる投薬量で、受容可能な限界内で毒性
を有することが理解される。１つのこのようなアンチセンスオリゴヌクレオチド
（ＩＳＩＳ２１０５として同定される）は、現在臨床試験中であり、そしてパピ
ローマウイルスに対する治療として使用される。別のアンチセンスオリゴヌクレ
オチド（ＩＳＩＳ２９２２）は、サイトメガロウイルス関連網膜炎に対する臨床
的効力を有することが示されている（Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ａｇｅｎｔｓ Ｂｕ
ｌｌｅｔｉｎ ５：１６１−１６３（１９９２）；ＢｉｏＷｏｒｌｄ Ｔｏｄａ
ｙ，１９９３年１２月２０日）。従って、オリゴヌクレオチドが有用な治療剤で
あること、およびそれらは動物、特にヒトの処置に使用され得ることが確立され
ている。
【００９１】 被験体に投与されるＡ２Ｍ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドの量は、その
被験体の年齢、体重、および状態に依存して変化する。処置の経過は、数日から
数ヶ月、または治癒されるまで、または疾患状態の軽減が達成されるまで、続き
得、あるいは、数年の期間（例えば、予防的に使用される場合）継続し得る。至
適用量スケジュールは、体内の薬物蓄積の測定から計算され得る。当業者は、至
適投薬量、投薬方法、および反復率を容易に決定し得る。至適投薬量は、個々の
オリゴヌクレオチドの相対的な強度に依存して変化し得、そして一般に、インビ
トロおよびインビボでの動物研究において、ＥＣ50に基づいて推定され得る。一
般に、投薬量は、０．０１ｍｇ〜１００ｇであり、そして一日一回、週に一回、
月に一回、または年に一回投与され得る。
被験体の年齢、体重、および状態に依存して変化する。処置の経過は、数日から
数ヶ月、または治癒されるまで、または疾患状態の軽減が達成されるまで、続き
得、あるいは、数年の期間（例えば、予防的に使用される場合）継続し得る。至
適用量スケジュールは、体内の薬物蓄積の測定から計算され得る。当業者は、至
適投薬量、投薬方法、および反復率を容易に決定し得る。至適投薬量は、個々の
オリゴヌクレオチドの相対的な強度に依存して変化し得、そして一般に、インビ
トロおよびインビボでの動物研究において、ＥＣ50に基づいて推定され得る。一
般に、投薬量は、０．０１ｍｇ〜１００ｇであり、そして一日一回、週に一回、
月に一回、または年に一回投与され得る。
【００９２】 本発明の別の治療法は、α2Ｍ機能を補充するための遺伝子治療である。Ａ２
Ｍ−２欠失がα2Ｍ機能の欠陥を生じ得るので、正常α2Ｍを補充することを目的
とするストラテジー（例えば、遺伝子治療）は、ＡＤを治療、予防、逆転するた
めの手段として作用し得る。本発明の１つの実施形態は、野生型α2Ｍまたは抗
ＬＲＰ−Ａβペプチドをコードするトランスジーンを保有するウイルスベクター
である。本発明における使用のために適切なウイルスベクターは、非分裂、有糸
分裂後の細胞をトランスフェクトし得、そして低細胞傷害性を有するものである
。これらのベクターには、アデノウイルス、レンチウイルス、およびＨＳＶ−１
が含まれるが、これらに限定されず、しかし、好ましくは、アデノ随伴ウイルス
ベクター（ＡＡＶ）である。ＡＡＶは、任意のヒト疾患と直接関連しておらず、
従って、細胞傷害性の危険性の少ないはずであるＤＮＡウイルスである（Ｆｒｅ
ｅｓｅ，Ａ．ら、Ｅｐｉｌｅｓｉａ ３８：７５９−７６６（１９９７））。非
分裂、有糸分裂後細胞（例えば、ニューロンおよび潜伏グリア細胞）をトランス
フェクトし得る。さらに、ＡＡＶが宿主染色体に安定に組み込まれ得るいくつか
の証拠が存在する（Ｆｒｅｅｓｅ，Ｚ．ら、Ｍｏｖ．Ｄｉｓｏｒｄ．１１：４６
９−４８８（１９９６）；Ｋａｐｌｉｔｔ，Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒ．Ｇｅｎｅｔ．
８：１４８−１５４（１９９４）；Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｖｉｒ
ｏｌ ６３：３８２２−２８８８（１９８９）；Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．ら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：２２１１−２２１５（
１９９０）；Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．ら、Ｅ．Ｍ．Ｂ．Ｏ．Ｊ．１０：３９
４１−３９５０（１９９１）；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃ
ｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７−１２９（１９９２）
）。最近、ＡＡＶは、レポータートランスジーンをヒト海馬組織に送達するため
に首尾良く使用された（Ｆｒｅｅｓｅ，Ａ．ら、Ｅｐｉｌｅｓｉａ ３８：７５
９−７６６（１９９７））。
Ｍ−２欠失がα2Ｍ機能の欠陥を生じ得るので、正常α2Ｍを補充することを目的
とするストラテジー（例えば、遺伝子治療）は、ＡＤを治療、予防、逆転するた
めの手段として作用し得る。本発明の１つの実施形態は、野生型α2Ｍまたは抗
ＬＲＰ−Ａβペプチドをコードするトランスジーンを保有するウイルスベクター
である。本発明における使用のために適切なウイルスベクターは、非分裂、有糸
分裂後の細胞をトランスフェクトし得、そして低細胞傷害性を有するものである
。これらのベクターには、アデノウイルス、レンチウイルス、およびＨＳＶ−１
が含まれるが、これらに限定されず、しかし、好ましくは、アデノ随伴ウイルス
ベクター（ＡＡＶ）である。ＡＡＶは、任意のヒト疾患と直接関連しておらず、
従って、細胞傷害性の危険性の少ないはずであるＤＮＡウイルスである（Ｆｒｅ
ｅｓｅ，Ａ．ら、Ｅｐｉｌｅｓｉａ ３８：７５９−７６６（１９９７））。非
分裂、有糸分裂後細胞（例えば、ニューロンおよび潜伏グリア細胞）をトランス
フェクトし得る。さらに、ＡＡＶが宿主染色体に安定に組み込まれ得るいくつか
の証拠が存在する（Ｆｒｅｅｓｅ，Ｚ．ら、Ｍｏｖ．Ｄｉｓｏｒｄ．１１：４６
９−４８８（１９９６）；Ｋａｐｌｉｔｔ，Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒ．Ｇｅｎｅｔ．
８：１４８−１５４（１９９４）；Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｖｉｒ
ｏｌ ６３：３８２２−２８８８（１９８９）；Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．ら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：２２１１−２２１５（
１９９０）；Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．ら、Ｅ．Ｍ．Ｂ．Ｏ．Ｊ．１０：３９
４１−３９５０（１９９１）；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃ
ｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７−１２９（１９９２）
）。最近、ＡＡＶは、レポータートランスジーンをヒト海馬組織に送達するため
に首尾良く使用された（Ｆｒｅｅｓｅ，Ａ．ら、Ｅｐｉｌｅｓｉａ ３８：７５
９−７６６（１９９７））。
【００９３】 ウイルスベクターにおいて使用されるべきトランスジーンには、α2Ｍをコー
ドする全長ｃＤＮＡ（配列番号１）、または上記の抗ＬＲＰ−Ａβペプチドが含
まれる。ＡＡＶｌａｃＺの構築は、ＫａｐｌｉｔｔらおよびＳａｍｕｌｓｋｉら
によって記載される（Ｋａｐｌｉｔｔ，Ｍ．Ｇ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ
．８：１４８−１５４（１９９４）；Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｖｉ
ｒｏｌ．６３：３８２２−３８８８（１９８９））。トランスジーンをウイルス
ベクターに挿入するために、ウイルスベクターは、まず、制限酵素によって切断
される。ＰＣＲ媒介組み込みは、対応する制限部位を、トランスジーンの３’お
よび５’末端に作製するために使用され、そしてそのトランスジーンがＡＡＶで
連結される。
ドする全長ｃＤＮＡ（配列番号１）、または上記の抗ＬＲＰ−Ａβペプチドが含
まれる。ＡＡＶｌａｃＺの構築は、ＫａｐｌｉｔｔらおよびＳａｍｕｌｓｋｉら
によって記載される（Ｋａｐｌｉｔｔ，Ｍ．Ｇ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ
．８：１４８−１５４（１９９４）；Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｖｉ
ｒｏｌ．６３：３８２２−３８８８（１９８９））。トランスジーンをウイルス
ベクターに挿入するために、ウイルスベクターは、まず、制限酵素によって切断
される。ＰＣＲ媒介組み込みは、対応する制限部位を、トランスジーンの３’お
よび５’末端に作製するために使用され、そしてそのトランスジーンがＡＡＶで
連結される。
【００９４】 本発明はまた、α2Ｍまたは抗ＬＲＰ−Ａβペプチドトランスジーンを保有す
るウイルスベクター、およびこのウイルスベクターを含有する薬学的組成物を投
与することによって、ＡＤと闘う方法を提供する。
るウイルスベクター、およびこのウイルスベクターを含有する薬学的組成物を投
与することによって、ＡＤと闘う方法を提供する。
【００９５】 本発明の遺伝子療法は、インビボまたはエキソビボでのストラテジーを使用し
て投与され得る。インビボアプローチは、ウイルスベクターを被験体の組織に直
接導入することを包含する。投与のインビボ方法には、脳脊髄液への直接注入、
または海馬への定位固定の脳内接種が含まれる。さらに、いくつかのウイルスベ
クター（例えば、アデノウイルス）は、注入の点から逆行する様式で移送され得
る（Ｒｉｄｏｕｘ，Ｖ．ら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．６４８：１７１−１７５（１
９９４）；Ｋｕｏ，Ｈ．ら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．２４：３１−３８（１９９５
））。別の投与経路には、鼻内吸入（Ｄｒａｇｈｉａ，Ｒ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅ
ｒ．２：４１８−４２４（１９９５））および血液脳関門の破壊後のカロチド動
脈への注入（Ｄｏｒａｎ，Ｓ．Ｅ．，ら、Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ ３６：９
６５−９７０（１９９５）；Ｍｕｌｄｏｏｎ，Ｌ．Ｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏ
ｌ．１４７：１８４０−１８５１（１９９５））が含まれる。
て投与され得る。インビボアプローチは、ウイルスベクターを被験体の組織に直
接導入することを包含する。投与のインビボ方法には、脳脊髄液への直接注入、
または海馬への定位固定の脳内接種が含まれる。さらに、いくつかのウイルスベ
クター（例えば、アデノウイルス）は、注入の点から逆行する様式で移送され得
る（Ｒｉｄｏｕｘ，Ｖ．ら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．６４８：１７１−１７５（１
９９４）；Ｋｕｏ，Ｈ．ら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．２４：３１−３８（１９９５
））。別の投与経路には、鼻内吸入（Ｄｒａｇｈｉａ，Ｒ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅ
ｒ．２：４１８−４２４（１９９５））および血液脳関門の破壊後のカロチド動
脈への注入（Ｄｏｒａｎ，Ｓ．Ｅ．，ら、Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ ３６：９
６５−９７０（１９９５）；Ｍｕｌｄｏｏｎ，Ｌ．Ｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏ
ｌ．１４７：１８４０−１８５１（１９９５））が含まれる。
【００９６】 エキソビボアプローチのために、適切な細胞型（例えば、線維芽細胞、筋芽細
胞、または神経前駆体細胞）がドナーから回収され、そして組織培養において増
殖される。次いで、細胞をトランスフェクトし、その細胞を回収し、そして被験
体中に移植する。エキソビボ方法は、例えば、Ｒａｙｍｏｎ，Ｈ．Ｋ．ら，Ｅｘ
ｐｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．１４４．８２−９１（１９９７）；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，
Ｍ．Ｂ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４２：１５７５−１５７８（１９８８）；Ｓ
ｕｈｒ，Ｓ．Ｔ．およびＧａｇｅ，Ｆ．Ｈ．，Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．５０：
１２５２−１２６８（１９９３）；Ｔｕｓｚｙｎｓｋｉ，Ｍ．Ｈ．ら、Ｅｘｐ．
Ｎｅｕｒｏｌ．１２６：１−１４（１９９４）；Ｒｉｄｏｕｘ，Ｖ．ら、Ｎｅｕ
ｒｏｒｅｐｏｒｔ ５：８０１−８０４（１９９４）；Ｂｕｃ−Ｃａｒｏｎ，Ｍ
．Ｈ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｄｉｓ．２：３７−４７（１９９５）；Ｓａｂａ
ｔｅ，Ｏ．ら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．９：２５６−２６０（１９９５）に記載さ
れている。
胞、または神経前駆体細胞）がドナーから回収され、そして組織培養において増
殖される。次いで、細胞をトランスフェクトし、その細胞を回収し、そして被験
体中に移植する。エキソビボ方法は、例えば、Ｒａｙｍｏｎ，Ｈ．Ｋ．ら，Ｅｘ
ｐｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．１４４．８２−９１（１９９７）；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，
Ｍ．Ｂ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４２：１５７５−１５７８（１９８８）；Ｓ
ｕｈｒ，Ｓ．Ｔ．およびＧａｇｅ，Ｆ．Ｈ．，Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．５０：
１２５２−１２６８（１９９３）；Ｔｕｓｚｙｎｓｋｉ，Ｍ．Ｈ．ら、Ｅｘｐ．
Ｎｅｕｒｏｌ．１２６：１−１４（１９９４）；Ｒｉｄｏｕｘ，Ｖ．ら、Ｎｅｕ
ｒｏｒｅｐｏｒｔ ５：８０１−８０４（１９９４）；Ｂｕｃ−Ｃａｒｏｎ，Ｍ
．Ｈ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｄｉｓ．２：３７−４７（１９９５）；Ｓａｂａ
ｔｅ，Ｏ．ら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．９：２５６−２６０（１９９５）に記載さ
れている。
【００９７】 被験体に投与されたトランスジーンを保有するウイルスベクターの量は、被験
体の年齢、体重、および状態に依存して変化する。処置の経過は、数日から数ヶ
月、または治癒がもたらされるまで、または疾患状態の軽減が達成されるまで、
継続し得、あるいは、数年の期間（例えば、予防的に使用された場合）継続し得
る。最適な投薬スケジュールは、体内での薬物の蓄積の測定値から計算され得る
。当業者は、最適な投薬量、投薬方法、および反復率を容易に決定し得る。一般
に、投薬量は、１×１０4〜１×１０10プラーク形成ユニット（ｐｆｕ）である
が、好ましくは、１×１０6〜５×１０7ｐｆｕ／ｋｇであり、そして一日一回、
週一回、月一回、または年一回投与され得る。
体の年齢、体重、および状態に依存して変化する。処置の経過は、数日から数ヶ
月、または治癒がもたらされるまで、または疾患状態の軽減が達成されるまで、
継続し得、あるいは、数年の期間（例えば、予防的に使用された場合）継続し得
る。最適な投薬スケジュールは、体内での薬物の蓄積の測定値から計算され得る
。当業者は、最適な投薬量、投薬方法、および反復率を容易に決定し得る。一般
に、投薬量は、１×１０4〜１×１０10プラーク形成ユニット（ｐｆｕ）である
が、好ましくは、１×１０6〜５×１０7ｐｆｕ／ｋｇであり、そして一日一回、
週一回、月一回、または年一回投与され得る。
【００９８】 本発明の治療剤は、単独、または互いに組み合わせて、または他の治療剤と組
み合わせて、投与され得る。例えば、被験体は、本発明の抗ＬＲＰ−Ａβ分子お
よびアンチセンスオリゴヌクレオチドの両方で処置され、Ａ２Ｍ機能の補充およ
び欠損Ａ２Ｍ機能の遮断の両方を同時に提供し得る。
み合わせて、投与され得る。例えば、被験体は、本発明の抗ＬＲＰ−Ａβ分子お
よびアンチセンスオリゴヌクレオチドの両方で処置され、Ａ２Ｍ機能の補充およ
び欠損Ａ２Ｍ機能の遮断の両方を同時に提供し得る。
【００９９】 本発明を実行するための適切な被験体は、代表的には、男性または女性のヒト
被験体であり、そしてＡＤを発症する危険性があると以前に決定されているもの
、およびＡＤであると最初に診断されているものの両方を含む。本発明は、家族
性ＡＤ（後期発症および初期発症）および散発性ＡＤの両方と闘うことに利用さ
れ得る。被験体の１つの好ましい群は、Ａ２Ｍ−２対立遺伝子について、異種接
合性または同種接合性であることが決定されているものである。Ａ２Ｍ−２につ
いて異種接合性または同種接合性である被験体を選択および評価する手順は、Ｔ
ａｎｚｉら、米国特許出願第０９／１４８，５０３号、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／Ｕ
Ｓ９８／１８５３５、およびＢｌａｃｋｅｒ，Ｄ．ら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１
９：３５７−３６０（１９９８年８月）に記載され、これらの全てが本明細書に
おいて参考として援用される。
被験体であり、そしてＡＤを発症する危険性があると以前に決定されているもの
、およびＡＤであると最初に診断されているものの両方を含む。本発明は、家族
性ＡＤ（後期発症および初期発症）および散発性ＡＤの両方と闘うことに利用さ
れ得る。被験体の１つの好ましい群は、Ａ２Ｍ−２対立遺伝子について、異種接
合性または同種接合性であることが決定されているものである。Ａ２Ｍ−２につ
いて異種接合性または同種接合性である被験体を選択および評価する手順は、Ｔ
ａｎｚｉら、米国特許出願第０９／１４８，５０３号、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／Ｕ
Ｓ９８／１８５３５、およびＢｌａｃｋｅｒ，Ｄ．ら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１
９：３５７−３６０（１９９８年８月）に記載され、これらの全てが本明細書に
おいて参考として援用される。
【０１００】 上記の治療剤が、アルツハイマー病の予防剤または治療剤として使用される場
合、これらは、特定の投与経路および通常のキャリアの必要条件を満足する調製
物へと作製され得る。例えば、経口投与の場合、錠剤、カプセル、顆粒、希釈さ
れた粉末、液体などの形態での調製物が調製される。
合、これらは、特定の投与経路および通常のキャリアの必要条件を満足する調製
物へと作製され得る。例えば、経口投与の場合、錠剤、カプセル、顆粒、希釈さ
れた粉末、液体などの形態での調製物が調製される。
【０１０１】 本発明の治療剤を含有する薬学的組成物は、固体または液体形態のいずれかで
調製され得る。本発明の薬学的組成物を調製するために、従来の薬学的処方の技
術に従って、投与（例えば、経口または非経口）に所望される調製物の形態に依
存する広範に種々の形態をとり得る１つ以上の治療剤が薬学的キャリアと混合さ
れる。「薬学的に受容可能なキャリア」は、非毒性の固体、半固体、液体フィル
ター、希釈液、カプセル化材料、または任意の型の処方物補助剤を意味する。経
口投薬形態の組成物を調製するにおいて、任意の通常の薬学的媒体が利用され得
る。従って、液体経口調製物（例えば、懸濁剤、エリキシル剤、および溶液）に
ついて、適切なキャリアおよび添加物には、水、グリコール、油、アルコール、
香料、保存剤、着色剤などが含まれる；固体経口調製物（例えば、粉末、カプセ
ル、および錠剤）について、適切なキャリアおよび添加物には、デンプン、ショ
糖、希釈剤、顆粒化剤、滑液剤、結合剤、崩壊剤などが含まれる。このような薬
学的キャリアに加えて、カチオン性液体は、オリゴヌクレオチドの取り込みを容
易にするために処方物中に含められ得る。取り込みを容易にすることが示されて
いる１つのこのような組成物は、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，
Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）である。
調製され得る。本発明の薬学的組成物を調製するために、従来の薬学的処方の技
術に従って、投与（例えば、経口または非経口）に所望される調製物の形態に依
存する広範に種々の形態をとり得る１つ以上の治療剤が薬学的キャリアと混合さ
れる。「薬学的に受容可能なキャリア」は、非毒性の固体、半固体、液体フィル
ター、希釈液、カプセル化材料、または任意の型の処方物補助剤を意味する。経
口投薬形態の組成物を調製するにおいて、任意の通常の薬学的媒体が利用され得
る。従って、液体経口調製物（例えば、懸濁剤、エリキシル剤、および溶液）に
ついて、適切なキャリアおよび添加物には、水、グリコール、油、アルコール、
香料、保存剤、着色剤などが含まれる；固体経口調製物（例えば、粉末、カプセ
ル、および錠剤）について、適切なキャリアおよび添加物には、デンプン、ショ
糖、希釈剤、顆粒化剤、滑液剤、結合剤、崩壊剤などが含まれる。このような薬
学的キャリアに加えて、カチオン性液体は、オリゴヌクレオチドの取り込みを容
易にするために処方物中に含められ得る。取り込みを容易にすることが示されて
いる１つのこのような組成物は、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，
Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）である。
【０１０２】 それらの投与の容易さのために、錠剤およびカプセルは、最も有利な経口投薬
単位形態を代表し、その場合、固体薬学的キャリアが利用される。所望であれば
、錠剤は、標準的な技術によって、糖衣されたか、または腸溶コーティングされ
得る。非経口注入組成物については、キャリアは、通常、滅菌の、発熱物質を含
まない水、または滅菌の、発熱物質を含まない生理学的食塩水溶液を含むが、他
の成分（例えば、溶解性を補助する目的で、または保存剤のために）が含められ
得る。非経口の注射可能懸濁液（例えば、静脈内またはくも膜下内注射）もまた
、調製され得、その場合、適切な液体キャリア、懸濁剤などが利用され得る。一
般的には、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅ
ｎｃｅｓ（第１８版）、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（１９９０）
を参照のこと。
単位形態を代表し、その場合、固体薬学的キャリアが利用される。所望であれば
、錠剤は、標準的な技術によって、糖衣されたか、または腸溶コーティングされ
得る。非経口注入組成物については、キャリアは、通常、滅菌の、発熱物質を含
まない水、または滅菌の、発熱物質を含まない生理学的食塩水溶液を含むが、他
の成分（例えば、溶解性を補助する目的で、または保存剤のために）が含められ
得る。非経口の注射可能懸濁液（例えば、静脈内またはくも膜下内注射）もまた
、調製され得、その場合、適切な液体キャリア、懸濁剤などが利用され得る。一
般的には、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅ
ｎｃｅｓ（第１８版）、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（１９９０）
を参照のこと。
【０１０３】 本発明の薬学的組成物は、局所的、または全身的な処置が所望されるか否かに
依存して、および処置される領域に依存して、多くの方法によって投与され得る
。投与は、局所的（眼の、膣の、直腸の、鼻内の、経皮の）、経口または非経口
（例えば、静脈内点滴、皮下、腹腔内、または筋肉内注射もしくはくも膜下内も
しくは脳室内投与であり得る。局所投与のための処方物には、経皮パッチ、軟膏
、ローション、クリーム、ジェル、点滴薬、坐剤、スプレー、液剤、および散剤
を含み得る。経口投与のための組成物には、粉末もしくは顆粒、水中または非水
性媒体中の懸濁液もしくは溶液、カプセル、サシェ、または錠剤が含まれる。濃
厚剤、香味料、希釈剤、乳化剤、分散助剤、または結合剤が、望ましくあり得る
。くも膜下内または脳室内投与のための組成物は、緩衝剤、希釈剤、およびその
他の添加剤を含み得る水性溶液を含み得る。非経口投与のための処方物には、緩
衝液、希釈剤、およびその他の適切な添加剤もまた含み得る滅菌水溶液が含まれ
得る。
依存して、および処置される領域に依存して、多くの方法によって投与され得る
。投与は、局所的（眼の、膣の、直腸の、鼻内の、経皮の）、経口または非経口
（例えば、静脈内点滴、皮下、腹腔内、または筋肉内注射もしくはくも膜下内も
しくは脳室内投与であり得る。局所投与のための処方物には、経皮パッチ、軟膏
、ローション、クリーム、ジェル、点滴薬、坐剤、スプレー、液剤、および散剤
を含み得る。経口投与のための組成物には、粉末もしくは顆粒、水中または非水
性媒体中の懸濁液もしくは溶液、カプセル、サシェ、または錠剤が含まれる。濃
厚剤、香味料、希釈剤、乳化剤、分散助剤、または結合剤が、望ましくあり得る
。くも膜下内または脳室内投与のための組成物は、緩衝剤、希釈剤、およびその
他の添加剤を含み得る水性溶液を含み得る。非経口投与のための処方物には、緩
衝液、希釈剤、およびその他の適切な添加剤もまた含み得る滅菌水溶液が含まれ
得る。
【０１０４】 必要な場合、薬学的組成物は、その治療剤が血液脳関門を通して通過するよう
に、調製され得る。血液脳関門を介しての輸送を達成するための１つの方法は、
治療剤を二次的な分子（「キャリア」）（これはペプチドまたは非タンパク質性
部分のいずれかである）に結合または結合体化することである。そのキャリアは
、血液脳関門を貫通することができるように選択される。適切なキャリアの例は
、ピリジニウム、脂肪酸、イノシトール、コレステロール、およびグルコース誘
導体である。あるいは、キャリアは、脳内皮細胞中の特定の輸送系（例えば、イ
ンスリンまたはインスリン様成長因子ＩおよびＩＩを輸送するための輸送系）を
介して脳に侵入し得る化合物であり得る。治療剤およびキャリアのこの組み合わ
せは、プロドラッグと呼ばれる。中枢神経系に侵入するにあたり、プロドラッグ
は、インタクトなままであり得るか、またはキャリアと治療剤との間の化学的結
合が、加水分解され得、それにより、治療剤からのキャリアを分離する。一般的
には、ｏｄｏｒに対する米国特許第５，０１７，５６６号を参照のこと。
に、調製され得る。血液脳関門を介しての輸送を達成するための１つの方法は、
治療剤を二次的な分子（「キャリア」）（これはペプチドまたは非タンパク質性
部分のいずれかである）に結合または結合体化することである。そのキャリアは
、血液脳関門を貫通することができるように選択される。適切なキャリアの例は
、ピリジニウム、脂肪酸、イノシトール、コレステロール、およびグルコース誘
導体である。あるいは、キャリアは、脳内皮細胞中の特定の輸送系（例えば、イ
ンスリンまたはインスリン様成長因子ＩおよびＩＩを輸送するための輸送系）を
介して脳に侵入し得る化合物であり得る。治療剤およびキャリアのこの組み合わ
せは、プロドラッグと呼ばれる。中枢神経系に侵入するにあたり、プロドラッグ
は、インタクトなままであり得るか、またはキャリアと治療剤との間の化学的結
合が、加水分解され得、それにより、治療剤からのキャリアを分離する。一般的
には、ｏｄｏｒに対する米国特許第５，０１７，５６６号を参照のこと。
【０１０５】 血液脳関門を介して治療剤を輸送するための代替の方法は、キャリアを微小血
漿またはリポソームのような脂質粒子中にカプセル化することである。このよう
な脂質粒子は、単一または複数の層であり得、そして治療剤をその中心かまたは
その層の間のいずれかにカプセル化し得る。このような調製物は周知である。例
えば、ＣｏｌｌｉｎｓらのＰＣＴ出願ＷＯ９１／０４０１４は、治療剤がリポソ
ーム内にカプセル化されて、そしてそのリポソームの外層が血液脳関門を介して
通常輸送される分子に添加されたリポソーム送達系を記載する。このようなリポ
ソームは、血液脳関門を横切る特異的なリガンド（移動中のインスリン、ならび
にインスリン様成長因子ＩおよびＩＩが含まれるが、これらに限定されない）を
輸送する内因性の脳輸送系を標的化し得る。あるいは、このようなリガンドに対
する脳内皮細胞レセプターに対する抗体は、外側のリポソーム層に添加され得る
。Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎに対する米国特許第４，７０４，３５５号は、抗体をリポ
ソームに結合する方法を記載する。
漿またはリポソームのような脂質粒子中にカプセル化することである。このよう
な脂質粒子は、単一または複数の層であり得、そして治療剤をその中心かまたは
その層の間のいずれかにカプセル化し得る。このような調製物は周知である。例
えば、ＣｏｌｌｉｎｓらのＰＣＴ出願ＷＯ９１／０４０１４は、治療剤がリポソ
ーム内にカプセル化されて、そしてそのリポソームの外層が血液脳関門を介して
通常輸送される分子に添加されたリポソーム送達系を記載する。このようなリポ
ソームは、血液脳関門を横切る特異的なリガンド（移動中のインスリン、ならび
にインスリン様成長因子ＩおよびＩＩが含まれるが、これらに限定されない）を
輸送する内因性の脳輸送系を標的化し得る。あるいは、このようなリガンドに対
する脳内皮細胞レセプターに対する抗体は、外側のリポソーム層に添加され得る
。Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎに対する米国特許第４，７０４，３５５号は、抗体をリポ
ソームに結合する方法を記載する。
【０１０６】 血液脳関門を介して通過する治療剤を処方する別の方法は、上記のような薬学
的組成物を調製することである。ここで、その治療剤は、シクロデキストリン中
にカプセル化される。血液脳関門を介して通過する任意の適切なシクロデキスト
リンが利用され得、これには、βシクロデキストリン、γシクロデキストリン、
およびこれらの誘導体が含まれる。一般的には、Ｂｏｄｏｒに対する米国特許第
５，０１７，５６６号；Ｂｏｄｏｒに対する米国特許第５，００２，９３５号；
Ｂｏｄｏｒに対する米国特許第４，９８３，５８６号を参照のこと。
的組成物を調製することである。ここで、その治療剤は、シクロデキストリン中
にカプセル化される。血液脳関門を介して通過する任意の適切なシクロデキスト
リンが利用され得、これには、βシクロデキストリン、γシクロデキストリン、
およびこれらの誘導体が含まれる。一般的には、Ｂｏｄｏｒに対する米国特許第
５，０１７，５６６号；Ｂｏｄｏｒに対する米国特許第５，００２，９３５号；
Ｂｏｄｏｒに対する米国特許第４，９８３，５８６号を参照のこと。
【０１０７】 治療剤を血液脳関門を介して通過させる別の方法は、上記の薬学的組成物を調
製しそして投与することであり、その組成物は、Ｅｉｂｌに対する米国特許第５
，１５３，１７９号に記載されるグリセロール誘導体をさらに含む。
製しそして投与することであり、その組成物は、Ｅｉｂｌに対する米国特許第５
，１５３，１７９号に記載されるグリセロール誘導体をさらに含む。
【０１０８】 治療剤を脳に送達するための別の方法は、その薬剤を含有するポリマーデバイ
スを移植することである。そのデバイスは、移植後、長時間、その薬剤の脳への
徐放送達を提供し得る。このような移植可能なポリマーデバイスの例は、Ｓａｂ
ｅｌらに対する米国特許第５，６０１，８３５号およびＢｒｅｍに対する米国特
許第５，８４６，５６５号に記載される。
スを移植することである。そのデバイスは、移植後、長時間、その薬剤の脳への
徐放送達を提供し得る。このような移植可能なポリマーデバイスの例は、Ｓａｂ
ｅｌらに対する米国特許第５，６０１，８３５号およびＢｒｅｍに対する米国特
許第５，８４６，５６５号に記載される。
【０１０９】 本発明の別の局面は、正常α2Ｍ機能および活性を置換または補充し得る、お
よび／または欠陥α2Ｍ機能を抑制し得る、ＡＤについての治療剤のスクリーニ
ングの方法に関する。
よび／または欠陥α2Ｍ機能を抑制し得る、ＡＤについての治療剤のスクリーニ
ングの方法に関する。
【０１１０】 本発明は、α2Ｍ−２改変体をコードするＲＮＡの産生を抑制し得、それによ
り、α2Ｍ−２改変体の産生を抑制し得、ＡＤのための治療剤についてスクリー
ニングする方法を提供する。本発明の１つの実施形態は、Ａ２Ｍ−２に対して異
種接合性または同種接合性であり、かつＡ２Ｍ−２を発現する細胞を試験剤とと
もにインキュベートすることによって、そしてその薬剤が異常Ａ２Ｍ ｍＲＮＡ
に対する正常Ａ２Ｍ ｍＲＮＡの比を増大させるか否かを決定することによって
、治療剤をスクリーニングする方法である。好ましくは、使用される細胞は、Ａ
２Ｍ−２対立遺伝子に対して異種接合性であり、そしてその他の対立遺伝子は、
Ａ２Ｍ−１（Ａ２Ｍ−１／２細胞）である。このアッセイに使用され得る細胞の
例には、神経膠腫細胞、肝細胞、および肝細胞腫細胞株が含まれるが、これらに
限定されない。さらに、アッセイに使用される細胞は、それらが培養中で無限に
増殖することを可能にするために形質転換されるかまたはトランスフェクトされ
得る。これらの薬剤をスクリーニングするために、保有する細胞は、試験剤とと
もに、好ましくは、２時間から２４時間の範囲の期間、インキュベートされる。
インキュベーション時間は、その薬剤に依存して長いかまたは短くあり得、そし
て適切なインキュベーション時間は、当業者によって決定され得る。Ａ２Ｍ−１
に対して同種接合性の細胞は、コントロールとして使用される。Ａ２Ｍ−２遺伝
子型についての手順は、Ｔａｎｚｉらの米国特許出願第０９／１４８，５０３号
、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８５３５号、およびＢｌａｃｋｅｒ，Ｄ．
らのＮａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９：３５７−３６０（１９９８年８月）に記載され
る。インキュベーション後、正常対異常α2Ｍ ｍＲＮＡ転写物の比が決定され
、そして薬剤で非処理の細胞（薬剤で処理される細胞と同じ遺伝子型を有する）
に対する比、および薬剤で非処理のＡ２Ｍ−１／１細胞と比較される。その薬剤
で非処理の細胞に対するこの比に対する正常対α2Ｍ ｍＲＮＡ転写物の比にお
ける増加は、有効な薬剤の指標である。薬剤で処置されていないＡ２Ｍ−１／２
細胞に対する比は、代表的には、５：１〜２０：１である。異常α2Ｍ ｍＲＮ
Ａ転写物に対する正常の比が、薬剤で処理されていないＡ２Ｍ−１／１細胞に見
出される比に近づく場合、その薬剤は有効であると考えられる。従って、例えば
、Ａ２Ｍ−１／２細胞におけるその比が１０：１である場合、およびＡ２Ｍ−１
／１細胞におけるその比が、１００：１である場合、２０：１の比を生じる試験
薬剤は、有効であると考えられる。
り、α2Ｍ−２改変体の産生を抑制し得、ＡＤのための治療剤についてスクリー
ニングする方法を提供する。本発明の１つの実施形態は、Ａ２Ｍ−２に対して異
種接合性または同種接合性であり、かつＡ２Ｍ−２を発現する細胞を試験剤とと
もにインキュベートすることによって、そしてその薬剤が異常Ａ２Ｍ ｍＲＮＡ
に対する正常Ａ２Ｍ ｍＲＮＡの比を増大させるか否かを決定することによって
、治療剤をスクリーニングする方法である。好ましくは、使用される細胞は、Ａ
２Ｍ−２対立遺伝子に対して異種接合性であり、そしてその他の対立遺伝子は、
Ａ２Ｍ−１（Ａ２Ｍ−１／２細胞）である。このアッセイに使用され得る細胞の
例には、神経膠腫細胞、肝細胞、および肝細胞腫細胞株が含まれるが、これらに
限定されない。さらに、アッセイに使用される細胞は、それらが培養中で無限に
増殖することを可能にするために形質転換されるかまたはトランスフェクトされ
得る。これらの薬剤をスクリーニングするために、保有する細胞は、試験剤とと
もに、好ましくは、２時間から２４時間の範囲の期間、インキュベートされる。
インキュベーション時間は、その薬剤に依存して長いかまたは短くあり得、そし
て適切なインキュベーション時間は、当業者によって決定され得る。Ａ２Ｍ−１
に対して同種接合性の細胞は、コントロールとして使用される。Ａ２Ｍ−２遺伝
子型についての手順は、Ｔａｎｚｉらの米国特許出願第０９／１４８，５０３号
、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８５３５号、およびＢｌａｃｋｅｒ，Ｄ．
らのＮａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９：３５７−３６０（１９９８年８月）に記載され
る。インキュベーション後、正常対異常α2Ｍ ｍＲＮＡ転写物の比が決定され
、そして薬剤で非処理の細胞（薬剤で処理される細胞と同じ遺伝子型を有する）
に対する比、および薬剤で非処理のＡ２Ｍ−１／１細胞と比較される。その薬剤
で非処理の細胞に対するこの比に対する正常対α2Ｍ ｍＲＮＡ転写物の比にお
ける増加は、有効な薬剤の指標である。薬剤で処置されていないＡ２Ｍ−１／２
細胞に対する比は、代表的には、５：１〜２０：１である。異常α2Ｍ ｍＲＮ
Ａ転写物に対する正常の比が、薬剤で処理されていないＡ２Ｍ−１／１細胞に見
出される比に近づく場合、その薬剤は有効であると考えられる。従って、例えば
、Ａ２Ｍ−１／２細胞におけるその比が１０：１である場合、およびＡ２Ｍ−１
／１細胞におけるその比が、１００：１である場合、２０：１の比を生じる試験
薬剤は、有効であると考えられる。
【０１１１】 異常転写物に対する正常の比は、Ｓ１ヌクレアーゼ分析によって、またはＲＴ
ＰＣＲによって、神経膠腫細胞から単離されたＲＮＡ上で、定量され得る。培
養中の細胞についてのＲＮＡ単離のためのプロトコル、およびＳ１ヌクレアーゼ
分析についてのプロトコルは、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．，ら編、Ｊｏ
ｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．，出版、第１巻第４章（補遺３７
１９９７）中の「Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ
ＲＮＡ」に記載される。Ｓ１ヌクレアーゼ分析は、全長Ａ２Ｍ ｃＤＮＡ鋳型
（配列番号１）から合成された少なくともエキソン１７〜１８（配列番号１の２
０５７〜２２８４ｂｐ）を包含する１本鎖アンチセンスプローブを使用して行わ
れる。好ましくは、そのプローブは、エキソン１７、１８、およびエキソン１９
の一部を包含する。プローブの長さは、好ましくは、２５０ｂｐ〜５００ｂｐ長
であり、そしてより好ましくは、３００ｂｐ長である。プローブは、４３５３ｂ
ｐ（コード領域の長さ）までであり得るが、プローブの長さを増大させることは
、アッセイの精度を減少し得る。本発明の好ましい実施態様において、そのプロ
ーブは、配列番号１のヌクレオチド２０２４〜２３２３に相補的である；別の好
ましい実施態様において、そのプローブは、配列番号１のヌクレオチド２０５７
〜２３８４に相補的である。ＲＮＡがそのプローブにハイブリダイズし、そして
Ｓ１ヌクレアーゼで消化された後に、サンプルをポリアクリルアミドゲル上で分
子量マーカーとともに泳動する。野生型ｍＲＮＡ転写物（Ａ２Ｍ−１）は、プロ
ーブの長さに対応するバンド、例えば、３００ｂｐとして現れるべきであり、Ａ
２Ｍ−２改変体転写物は、小さなバンドとして現れるべきである。総正常ｍＲＮ
Ａに対して総改変体ｍＲＮＡが比較され、そして正常対異常の比が決定される。
ＰＣＲによって、神経膠腫細胞から単離されたＲＮＡ上で、定量され得る。培
養中の細胞についてのＲＮＡ単離のためのプロトコル、およびＳ１ヌクレアーゼ
分析についてのプロトコルは、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．，ら編、Ｊｏ
ｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．，出版、第１巻第４章（補遺３７
１９９７）中の「Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ
ＲＮＡ」に記載される。Ｓ１ヌクレアーゼ分析は、全長Ａ２Ｍ ｃＤＮＡ鋳型
（配列番号１）から合成された少なくともエキソン１７〜１８（配列番号１の２
０５７〜２２８４ｂｐ）を包含する１本鎖アンチセンスプローブを使用して行わ
れる。好ましくは、そのプローブは、エキソン１７、１８、およびエキソン１９
の一部を包含する。プローブの長さは、好ましくは、２５０ｂｐ〜５００ｂｐ長
であり、そしてより好ましくは、３００ｂｐ長である。プローブは、４３５３ｂ
ｐ（コード領域の長さ）までであり得るが、プローブの長さを増大させることは
、アッセイの精度を減少し得る。本発明の好ましい実施態様において、そのプロ
ーブは、配列番号１のヌクレオチド２０２４〜２３２３に相補的である；別の好
ましい実施態様において、そのプローブは、配列番号１のヌクレオチド２０５７
〜２３８４に相補的である。ＲＮＡがそのプローブにハイブリダイズし、そして
Ｓ１ヌクレアーゼで消化された後に、サンプルをポリアクリルアミドゲル上で分
子量マーカーとともに泳動する。野生型ｍＲＮＡ転写物（Ａ２Ｍ−１）は、プロ
ーブの長さに対応するバンド、例えば、３００ｂｐとして現れるべきであり、Ａ
２Ｍ−２改変体転写物は、小さなバンドとして現れるべきである。総正常ｍＲＮ
Ａに対して総改変体ｍＲＮＡが比較され、そして正常対異常の比が決定される。
【０１１２】 あるいは、ＲＴ ＰＣＲは、ｍＲＮＡ転写物を定量するために使用され得る。
ＲＴ ＰＣＲについてのプロトコルは、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、編
、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ｐｕｂｌ．，Ｖｏｌ．２，
§１５．４（補遺１７ １９９２）中の「Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈ
ａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ」に記載される。処置された細胞およびコントロール
細胞から単離されたＲＮＡは、ＲＴ ＰＣＲを、少なくともエキソン１７〜１８
（配列番号１の２０５７〜２２８４）、ならびに好ましくは、エキソン１７、１
８、およびエキソン１９の一部を含む領域を増幅するために設計された標識され
たプライマーとともに用いて増幅される。さらに、プライマーは、それらが２つ
のエキソンの結合部に結合するように、それらを合成することによって、ｍＲＮ
Ａを標的化するために設計され得る。例えば、プライマーの好ましい対において
、第１のプライマーは、エキソン１６の末端およびエキソン１７の開始部分をコ
ードするＡ２Ｍ ｃＤＮＡにハイブリダイズし、そして第２のプライマーは、エ
キソン１８の末端およびエキソン１９の開始部分をコードするＡ２Ｍ ｃＤＮＡ
にハイブリダイズする。プライマーは、８〜５０ヌクレオチド長であり得るが、
好ましくは、１５〜３０ヌクレオチド長であり、そしてより好ましくは、１５ヌ
クレオチド長である。次いで、ＰＣＲ産物を、分子量マーカーとともにポリアク
リルアミドゲル上で泳動する。野生型ｍＲＮＡ転写物に対応するバンドは、使用
されるプライマーの最末端に対応するＡ２Ｍ−１ ｃＤＮＡの長さに対応するべ
きである。例えば、エキソン１６の最後の５塩基対からエキソン１９の最初の５
塩基対（配列番号１の２０５２〜２２８９ｂｐ）を増幅するように設計されたプ
ライマーによって増幅される野生型ｍＲＮＡは、２３８ヌクレオチドである。プ
ライマーがエキソン１７の始めの開始領域（エキソン１８を含み、そしてエキソ
ン１９の最初の１００ヌクレオチドの後に終わる）（配列番号１の２０５７〜２
４５６ｂｐ）を増幅するように設計された場合、予想されるフラグメント長は、
正常ｍＲＮＡについて４００ヌクレオチドである。改変体ｍＲＮＡ転写物は、よ
り短い。総正常ｍＲＮＡ対総改変体ｍＲＮＡが比較され、そして正常対異常の比
が決定される。
ＲＴ ＰＣＲについてのプロトコルは、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、編
、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ｐｕｂｌ．，Ｖｏｌ．２，
§１５．４（補遺１７ １９９２）中の「Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈ
ａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ」に記載される。処置された細胞およびコントロール
細胞から単離されたＲＮＡは、ＲＴ ＰＣＲを、少なくともエキソン１７〜１８
（配列番号１の２０５７〜２２８４）、ならびに好ましくは、エキソン１７、１
８、およびエキソン１９の一部を含む領域を増幅するために設計された標識され
たプライマーとともに用いて増幅される。さらに、プライマーは、それらが２つ
のエキソンの結合部に結合するように、それらを合成することによって、ｍＲＮ
Ａを標的化するために設計され得る。例えば、プライマーの好ましい対において
、第１のプライマーは、エキソン１６の末端およびエキソン１７の開始部分をコ
ードするＡ２Ｍ ｃＤＮＡにハイブリダイズし、そして第２のプライマーは、エ
キソン１８の末端およびエキソン１９の開始部分をコードするＡ２Ｍ ｃＤＮＡ
にハイブリダイズする。プライマーは、８〜５０ヌクレオチド長であり得るが、
好ましくは、１５〜３０ヌクレオチド長であり、そしてより好ましくは、１５ヌ
クレオチド長である。次いで、ＰＣＲ産物を、分子量マーカーとともにポリアク
リルアミドゲル上で泳動する。野生型ｍＲＮＡ転写物に対応するバンドは、使用
されるプライマーの最末端に対応するＡ２Ｍ−１ ｃＤＮＡの長さに対応するべ
きである。例えば、エキソン１６の最後の５塩基対からエキソン１９の最初の５
塩基対（配列番号１の２０５２〜２２８９ｂｐ）を増幅するように設計されたプ
ライマーによって増幅される野生型ｍＲＮＡは、２３８ヌクレオチドである。プ
ライマーがエキソン１７の始めの開始領域（エキソン１８を含み、そしてエキソ
ン１９の最初の１００ヌクレオチドの後に終わる）（配列番号１の２０５７〜２
４５６ｂｐ）を増幅するように設計された場合、予想されるフラグメント長は、
正常ｍＲＮＡについて４００ヌクレオチドである。改変体ｍＲＮＡ転写物は、よ
り短い。総正常ｍＲＮＡ対総改変体ｍＲＮＡが比較され、そして正常対異常の比
が決定される。
【０１１３】 本発明において使用され得るＲＮＡ定量の他の方法は、当該分野で周知であり
、そして例えば、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｎｉｓ，Ａ．ら編、Ａｃａ
ｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ発行、６０−７
５頁（１９９０）に記載される。
、そして例えば、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｎｉｓ，Ａ．ら編、Ａｃａ
ｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ発行、６０−７
５頁（１９９０）に記載される。
【０１１４】 本発明の別の実施形態は、ベイトドメインの切断以外の機構を介してα2Ｍを
活性化し得る、非毒性薬剤についてスクリーニングすることである。１以上のα 2 Ｍ−２モノマーを有するα2Ｍテトラマーについては、ベイトドメインのプロテ
アーゼ活性化が損なわれ得る。活性化は、ＬＲＰ結合ドメインを露出するために
必要とされるので、テトラマーの１以上のモノマーの活性化の損失は、ＬＲＰに
結合する能力の減少を生じる。結果として、これらのテトラマーは、ＬＲＰ媒介
性エンドサイトーシスを介してＡβを排出するには不十分である。しかし、α2
Ｍは、ベイトドメインのプロテアーゼ切断以外の機構を介して活性化され得る。
例えば、プロテアーゼ以外の薬剤（例えば、メチルアミン）は、チオエステル部
位を介してα2Ｍを活性化する。これらの薬剤は、欠損α2Ｍモノマーを活性化し
得、ＬＲＰ結合ドメイン（および他のドメイン）を露出させ、そしてＡβのＬＲ
Ｐ媒介クリアランスを潜在的に可能にする。さらに、これらの薬剤は、活性な野
生型α2Ｍテトラマーの量を増加して、欠損α2Ｍテトラマーを補うために使用さ
れ得る。現在、ベイトドメイン以外の部位でα2Ｍを活性化し得る有効な非毒性
薬剤は、未知である。本発明は、このような薬剤についてスクリーニングする方
法を提供する。
活性化し得る、非毒性薬剤についてスクリーニングすることである。１以上のα 2 Ｍ−２モノマーを有するα2Ｍテトラマーについては、ベイトドメインのプロテ
アーゼ活性化が損なわれ得る。活性化は、ＬＲＰ結合ドメインを露出するために
必要とされるので、テトラマーの１以上のモノマーの活性化の損失は、ＬＲＰに
結合する能力の減少を生じる。結果として、これらのテトラマーは、ＬＲＰ媒介
性エンドサイトーシスを介してＡβを排出するには不十分である。しかし、α2
Ｍは、ベイトドメインのプロテアーゼ切断以外の機構を介して活性化され得る。
例えば、プロテアーゼ以外の薬剤（例えば、メチルアミン）は、チオエステル部
位を介してα2Ｍを活性化する。これらの薬剤は、欠損α2Ｍモノマーを活性化し
得、ＬＲＰ結合ドメイン（および他のドメイン）を露出させ、そしてＡβのＬＲ
Ｐ媒介クリアランスを潜在的に可能にする。さらに、これらの薬剤は、活性な野
生型α2Ｍテトラマーの量を増加して、欠損α2Ｍテトラマーを補うために使用さ
れ得る。現在、ベイトドメイン以外の部位でα2Ｍを活性化し得る有効な非毒性
薬剤は、未知である。本発明は、このような薬剤についてスクリーニングする方
法を提供する。
【０１１５】 これらの薬剤についてスクリーニングするために、α2Ｍは、試験薬剤で処理
され、次いで、そのα2Ｍがコンフォーメーション変化を受けたか否かを決定す
るため、またはＬＲＰに結合するその能力について試験される。このアッセイの
ために使用されるα2Ｍは、野生型α2Ｍ、α2Ｍ−２、あるいはベイトドメイン
の全てまたは一部を欠損しているα2Ｍ変異体であり得る。しかし、好ましくは
、野生型α2Ｍが、使用される。さらに、このアッセイのために使用されるα2Ｍ
は、ダイマーまたはテトラマーの形態であり得るが、好ましくは、テトラマーの
形態である。試験薬剤でのα2Ｍの処理のために、α2Ｍは、好ましくは、試験薬
剤と共に２〜２４時間インキュベートされる。しかし、インキュベーション期間
は、薬剤に従ってより長くまたはより短くあり得、そして適切なインキュベーシ
ョン期間は、当業者によって決定され得る。処理されたα2Ｍがコンフォーメー
ション変化を受けたか否かを決定するために、α2Ｍ電気泳動移動度アッセイが
、使用され得る。処理されたα2ＭがＬＲＰに結合する能力を決定するために、
ＬＲＰ結合を測定する任意の方法が、使用され得る。しかし、好ましい方法とし
ては、酵素連結イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、イムノブロッティン
グ、ＬＲＰ媒介性エンドサイトーシスおよびＬＲＰ媒介分解が挙げられる。
され、次いで、そのα2Ｍがコンフォーメーション変化を受けたか否かを決定す
るため、またはＬＲＰに結合するその能力について試験される。このアッセイの
ために使用されるα2Ｍは、野生型α2Ｍ、α2Ｍ−２、あるいはベイトドメイン
の全てまたは一部を欠損しているα2Ｍ変異体であり得る。しかし、好ましくは
、野生型α2Ｍが、使用される。さらに、このアッセイのために使用されるα2Ｍ
は、ダイマーまたはテトラマーの形態であり得るが、好ましくは、テトラマーの
形態である。試験薬剤でのα2Ｍの処理のために、α2Ｍは、好ましくは、試験薬
剤と共に２〜２４時間インキュベートされる。しかし、インキュベーション期間
は、薬剤に従ってより長くまたはより短くあり得、そして適切なインキュベーシ
ョン期間は、当業者によって決定され得る。処理されたα2Ｍがコンフォーメー
ション変化を受けたか否かを決定するために、α2Ｍ電気泳動移動度アッセイが
、使用され得る。処理されたα2ＭがＬＲＰに結合する能力を決定するために、
ＬＲＰ結合を測定する任意の方法が、使用され得る。しかし、好ましい方法とし
ては、酵素連結イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、イムノブロッティン
グ、ＬＲＰ媒介性エンドサイトーシスおよびＬＲＰ媒介分解が挙げられる。
【０１１６】 α2Ｍ電気泳動移動度アッセイはまた、処理されたα2Ｍが活性化されたα2Ｍ
に予測されるコンフォーメーション変化を受けたか否かを決定することによって
、処理されたα2Ｍが活性化されたか否かを決定するために使用され得る。α2Ｍ
電気泳動移動度アッセイは、試験薬剤（あるいは、コントロールとして、プロテ
アーゼ、またはα2Ｍをその高速形態（ｆａｓｔ ｆｏｒｍ）に変換し得る他の
試薬（Ｂａｒｒｅｔ，Ａ．Ｊ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１８１：４０１−４１
８（１９７９）；Ｂｏｗｅｎ，Ｍ．Ｅ．およびＧｅｔｔｉｎｓ，Ｐ．Ｗ．，Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１８２５−１８３１（１９９８））とのインキュ
ベーション後に、非変性条件下でのα2Ｍの電気泳動移動度を分析する工程から
なる。α2Ｍは、ゲル電気泳動における移動度によって容易に識別可能な２つの
形態で存在し得る（Ｂａｒｒｅｔ，Ａ．Ｊ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１８１：
４０１−４１８（１９７９））。移動度における差異は、α2Ｍが、プロテアー
ゼまたは他の薬剤（例えば、メチルアミン）での活性化後に受けるコンフォーメ
ーション変化に起因する。このコンフォーメーション変化は、非変性条件下でポ
リアクリルアミドゲル泳動上での電気泳動移動度における増加を生じる（この形
態は、α2Ｍの「高速形態」と呼ばれる）（Ｂａｒｒｅｔ，Ａ．Ｊ．ら、Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．Ｊ．１８１：４０１−４１８（１９７９）；Ｂｏｗｅｎ，Ｍ．Ｅ．お
よびＧｅｔｔｉｎｓ，Ｐ．Ｗ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１８２５−
１８３１（１９９８））。この「低速から高速」への変換は、このコンフォーメ
ーション変化についてのアッセイのための基礎として使用され、そして２つの異
なるα2Ｍコンフォーメーションは、低速形態および高速形態と呼ばれる（Ｂｏ
ｗｅｎ，Ｍ．Ｅ．およびＧｅｔｔｉｎｓ，Ｐ．Ｗ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２７３：１８２５−１８３１（１９９８））。試験薬剤で処理されたα2Ｍにつ
いての低速形態から高速形態への変換は、この薬剤がα2Ｍを活性化したことを
示す。このアッセイが、試験薬剤の有効性を決定するために使用される場合、こ
の薬剤で処理されたα2Ｍは、好ましくは、テトラマーである。
に予測されるコンフォーメーション変化を受けたか否かを決定することによって
、処理されたα2Ｍが活性化されたか否かを決定するために使用され得る。α2Ｍ
電気泳動移動度アッセイは、試験薬剤（あるいは、コントロールとして、プロテ
アーゼ、またはα2Ｍをその高速形態（ｆａｓｔ ｆｏｒｍ）に変換し得る他の
試薬（Ｂａｒｒｅｔ，Ａ．Ｊ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１８１：４０１−４１
８（１９７９）；Ｂｏｗｅｎ，Ｍ．Ｅ．およびＧｅｔｔｉｎｓ，Ｐ．Ｗ．，Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１８２５−１８３１（１９９８））とのインキュ
ベーション後に、非変性条件下でのα2Ｍの電気泳動移動度を分析する工程から
なる。α2Ｍは、ゲル電気泳動における移動度によって容易に識別可能な２つの
形態で存在し得る（Ｂａｒｒｅｔ，Ａ．Ｊ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１８１：
４０１−４１８（１９７９））。移動度における差異は、α2Ｍが、プロテアー
ゼまたは他の薬剤（例えば、メチルアミン）での活性化後に受けるコンフォーメ
ーション変化に起因する。このコンフォーメーション変化は、非変性条件下でポ
リアクリルアミドゲル泳動上での電気泳動移動度における増加を生じる（この形
態は、α2Ｍの「高速形態」と呼ばれる）（Ｂａｒｒｅｔ，Ａ．Ｊ．ら、Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．Ｊ．１８１：４０１−４１８（１９７９）；Ｂｏｗｅｎ，Ｍ．Ｅ．お
よびＧｅｔｔｉｎｓ，Ｐ．Ｗ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１８２５−
１８３１（１９９８））。この「低速から高速」への変換は、このコンフォーメ
ーション変化についてのアッセイのための基礎として使用され、そして２つの異
なるα2Ｍコンフォーメーションは、低速形態および高速形態と呼ばれる（Ｂｏ
ｗｅｎ，Ｍ．Ｅ．およびＧｅｔｔｉｎｓ，Ｐ．Ｗ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２７３：１８２５−１８３１（１９９８））。試験薬剤で処理されたα2Ｍにつ
いての低速形態から高速形態への変換は、この薬剤がα2Ｍを活性化したことを
示す。このアッセイが、試験薬剤の有効性を決定するために使用される場合、こ
の薬剤で処理されたα2Ｍは、好ましくは、テトラマーである。
【０１１７】 α2Ｍ電気泳動移動度アッセイ、および血清からα2Ｍを精製する方法は、Ｂａ
ｒｒｅｔら（Ｂａｒｒｅｔ，Ａ．Ｊ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１８１：４０１
−４１８（１９７９））によって、ならびにＢｏｗｅｎら（Ｂｏｗｅｎ，Ｍ．Ｅ
．ら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅ，．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３３７：１９１−２０１（
１９９７）およびＢｏｗｅｎ，Ｍ．Ｅ．およびＧｅｔｔｉｎｓ，Ｐ．Ｗ．，Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１８２５−１８３１（１９９８））によって記載
される。試験薬剤とのインキュベーション後、α2Ｍサンプルは、非変性条件（
例えば、Ｂｏｗｅｎ，Ｍ．Ｅ．ら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅ，．Ｂｉｏｐｈｙｓ
．３３７：１９１−２０１（１９９７）に記載される条件）下のポリアクリルア
ミドゲル上で泳動され得る。このα2Ｍサンプルは、当該分野で周知の方法によ
って（例えば、使用されるプロテアーゼを放射標識することによって、または抗
α2Ｍ抗体を使用するウェスタンブロットによって）検出され得る。活性化され
たα2Ｍおよび活性化されていないα2Ｍは、分析されるサンプルとの、電気泳動
移動度の比較のためのコントロールとして使用され得る。
ｒｒｅｔら（Ｂａｒｒｅｔ，Ａ．Ｊ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１８１：４０１
−４１８（１９７９））によって、ならびにＢｏｗｅｎら（Ｂｏｗｅｎ，Ｍ．Ｅ
．ら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅ，．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３３７：１９１−２０１（
１９９７）およびＢｏｗｅｎ，Ｍ．Ｅ．およびＧｅｔｔｉｎｓ，Ｐ．Ｗ．，Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１８２５−１８３１（１９９８））によって記載
される。試験薬剤とのインキュベーション後、α2Ｍサンプルは、非変性条件（
例えば、Ｂｏｗｅｎ，Ｍ．Ｅ．ら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅ，．Ｂｉｏｐｈｙｓ
．３３７：１９１−２０１（１９９７）に記載される条件）下のポリアクリルア
ミドゲル上で泳動され得る。このα2Ｍサンプルは、当該分野で周知の方法によ
って（例えば、使用されるプロテアーゼを放射標識することによって、または抗
α2Ｍ抗体を使用するウェスタンブロットによって）検出され得る。活性化され
たα2Ｍおよび活性化されていないα2Ｍは、分析されるサンプルとの、電気泳動
移動度の比較のためのコントロールとして使用され得る。
【０１１８】 本発明の１つの実施形態において、ＥＬＩＳＡを使用して、処理されたα2Ｍ
がＬＲＰに結合する能力を決定する。ＥＬＩＳＡプロトコルは、「Ｉｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｙ」：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆
Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．発行、第２巻、§１１．２（補遺、１５ １９９１）に記
載される。このアッセイにおいて、活性化されたα2Ｍのみを認識するα2Ｍ Ｉ
ｇＧ（Ｍａｒｙｎｅｎら（Ｍａｒｙｎｅｎ，Ｐ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２
７：１７８２−１７８６（１９８１））によって記載される抗体）でコートされ
たマイクロタイタープレートウェルを、処理されたα2Ｍまたはコントロール分
子と共にインキュベートする。次いで、ウェルを、酵素結合体化抗α2Ｍ Ｉｇ
Ｇと共にインキュベートし、そしてリンスする。次に、これらのウェルを、この
酵素結合体の基質と共にインキュベートし、リンスし、そしてウェル中の結合さ
れたα2Ｍサンプルの量を決定する。あるいは、マイクロタイタープレートウェ
ルを、抗ＬＲＰ ＩｇＧでコートし、そしてリンスする。次いで、それらのウェ
ルをＬＲＰと共にインキュベートし、そしてリンスする。好ましくは、このＬＲ
Ｐは、可溶性のＬＲＰである。次いで、これらのウェルを、試験薬剤で処理され
たα2Ｍ、処理されていないα2Ｍ、または活性化されたα2Ｍと共にインキュベ
ートし、そしてリンスする。次に、これらのウェルを、酵素結合体化抗α2Ｍ
ＩｇＧと共にインキュベートし、再度リンスし、次いで、抗α2Ｍ ＩｇＧに結
合体化された酵素の基質と共にインキュベートする。次いで、ウェルに結合され
たα2Ｍサンプルの量を決定する。別の実施形態において、ＬＲＰでコートした
ウェルを、試験薬剤で処理されたα2Ｍ、未処理の活性化されていないα2Ｍ、ま
たは未処理の活性化されたα2Ｍと共にインキュベートし、そしてリンスする。
次いで、これらのウェルを、酵素結合体化抗α2Ｍ ＩｇＧと共にインキュベー
トし、リンスし、次いで、酵素基質で処理し、そして、結合されたα2Ｍサンプ
ルの量を決定する。抗α2Ｍ ＩｇＧは、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ
、ウレアーゼまたはアルカリホスファターゼとともに結合体化され得るが、好ま
しくは、蛍光標識（例えば、４−メチルウンベリフェリルホスフェート（ＭＵＰ
）で標識される。適切な基質をウェルに添加し、ウェルを洗浄し、次いで、マイ
クロタイタープレートリーダーで定量する。
がＬＲＰに結合する能力を決定する。ＥＬＩＳＡプロトコルは、「Ｉｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｙ」：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆
Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．発行、第２巻、§１１．２（補遺、１５ １９９１）に記
載される。このアッセイにおいて、活性化されたα2Ｍのみを認識するα2Ｍ Ｉ
ｇＧ（Ｍａｒｙｎｅｎら（Ｍａｒｙｎｅｎ，Ｐ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２
７：１７８２−１７８６（１９８１））によって記載される抗体）でコートされ
たマイクロタイタープレートウェルを、処理されたα2Ｍまたはコントロール分
子と共にインキュベートする。次いで、ウェルを、酵素結合体化抗α2Ｍ Ｉｇ
Ｇと共にインキュベートし、そしてリンスする。次に、これらのウェルを、この
酵素結合体の基質と共にインキュベートし、リンスし、そしてウェル中の結合さ
れたα2Ｍサンプルの量を決定する。あるいは、マイクロタイタープレートウェ
ルを、抗ＬＲＰ ＩｇＧでコートし、そしてリンスする。次いで、それらのウェ
ルをＬＲＰと共にインキュベートし、そしてリンスする。好ましくは、このＬＲ
Ｐは、可溶性のＬＲＰである。次いで、これらのウェルを、試験薬剤で処理され
たα2Ｍ、処理されていないα2Ｍ、または活性化されたα2Ｍと共にインキュベ
ートし、そしてリンスする。次に、これらのウェルを、酵素結合体化抗α2Ｍ
ＩｇＧと共にインキュベートし、再度リンスし、次いで、抗α2Ｍ ＩｇＧに結
合体化された酵素の基質と共にインキュベートする。次いで、ウェルに結合され
たα2Ｍサンプルの量を決定する。別の実施形態において、ＬＲＰでコートした
ウェルを、試験薬剤で処理されたα2Ｍ、未処理の活性化されていないα2Ｍ、ま
たは未処理の活性化されたα2Ｍと共にインキュベートし、そしてリンスする。
次いで、これらのウェルを、酵素結合体化抗α2Ｍ ＩｇＧと共にインキュベー
トし、リンスし、次いで、酵素基質で処理し、そして、結合されたα2Ｍサンプ
ルの量を決定する。抗α2Ｍ ＩｇＧは、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ
、ウレアーゼまたはアルカリホスファターゼとともに結合体化され得るが、好ま
しくは、蛍光標識（例えば、４−メチルウンベリフェリルホスフェート（ＭＵＰ
）で標識される。適切な基質をウェルに添加し、ウェルを洗浄し、次いで、マイ
クロタイタープレートリーダーで定量する。
【０１１９】 あるいは、試験薬剤で処理されたα2ＭがＬＲＰに結合する能力は、イムノブ
ロッティング方法によって決定され得る。未標識の可溶性ＬＲＰを、試験化合物
で処理されたα2Ｍ、未処理の活性化されていないα2Ｍ、およびメチルアラニン
またはトリプシンによって活性化された未処理のα2Ｍと共に、別々にインキュ
ベートした。次いで、サンプルを、非還元条件下で５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で
電気泳動し、ポリビニルジフルオリドニトロセルロース膜に転写し、そして抗α 2 Ｍ ＩｇＧおよび抗ＬＲＰ ＩｇＧでプローブした。試験薬剤で処理されたα2 Ｍが、抗α2Ｍ ＩｇＧおよび抗ＬＲＰ ＩｇＧの両方で検出され得る場合、こ
の処理されたα2Ｍは、Ａβを結合し得ると結論付けられ得る。イムノブロッテ
ィングの別の方法において、α2ＭのＬＲＰ結合ドメインに特異的な抗体（例え
ば、Ｍａｒｙｎｅｎら（Ｍａｒｙｎｅｎ，Ｐ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２７
：１７８２−１７８６（１９８１））によって記載される抗体）が、抗α2Ｍ
ＩｇＧとして使用され、そしてサンプルを、ＬＲＰと共にインキュベートしない
。この抗体による処理されたα2Ｍの認識は、α2Ｍが活性化されたことを示す。
ロッティング方法によって決定され得る。未標識の可溶性ＬＲＰを、試験化合物
で処理されたα2Ｍ、未処理の活性化されていないα2Ｍ、およびメチルアラニン
またはトリプシンによって活性化された未処理のα2Ｍと共に、別々にインキュ
ベートした。次いで、サンプルを、非還元条件下で５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で
電気泳動し、ポリビニルジフルオリドニトロセルロース膜に転写し、そして抗α 2 Ｍ ＩｇＧおよび抗ＬＲＰ ＩｇＧでプローブした。試験薬剤で処理されたα2 Ｍが、抗α2Ｍ ＩｇＧおよび抗ＬＲＰ ＩｇＧの両方で検出され得る場合、こ
の処理されたα2Ｍは、Ａβを結合し得ると結論付けられ得る。イムノブロッテ
ィングの別の方法において、α2ＭのＬＲＰ結合ドメインに特異的な抗体（例え
ば、Ｍａｒｙｎｅｎら（Ｍａｒｙｎｅｎ，Ｐ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２７
：１７８２−１７８６（１９８１））によって記載される抗体）が、抗α2Ｍ
ＩｇＧとして使用され、そしてサンプルを、ＬＲＰと共にインキュベートしない
。この抗体による処理されたα2Ｍの認識は、α2Ｍが活性化されたことを示す。
【０１２０】 さらに、試験薬剤で処理されたα2ＭがＬＲＰに結合する能力は、このα2Ｍが
ＬＲＰ媒介性エンドサイトーシスを受ける能力によって決定され得る。これは、
Ｋｏｕｎｎａｓら（Ｋｏｕｎｎａｓ，Ｍ．Ｚ．ら、Ｃｅｌｌ ８２：３３１−３
４０（１９９５）；Ｋｏｕｎｎａｓ，Ｍ．Ｚ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
７０：９３０７−９３１２（１９９５））に記載されるような、細胞培養実験を
使用する。ＬＲＰを発現する細胞、マウス胚性線維芽細胞を、ＲＡＰ（４００ｎ
Ｍ）の存在下または非存在下で、試験薬剤で処理されたα2Ｍ、未処理の活性化
されていないα2Ｍおよびメチルアミンもしくはトリプシンによって活性化され
た未処理のα2Ｍの存在下または非存在下で、125Ｉ−Ａβ（あるいは、Ａβは、 3 Ｈまたは14Ｃで標識され得る）と共に１８時間インキュベートする。ＲＡＰは
、ＬＲＰリガンド結合のインヒビターであり、そしてエンドサイトーシスがＬＲ
Ｐ媒介性であるか否かを決定するために添加される。さらに、クロロキン（０．
１ｍＭ）を添加して、125Ｉ−Ａβのリソソーム分解を阻害する。
ＬＲＰ媒介性エンドサイトーシスを受ける能力によって決定され得る。これは、
Ｋｏｕｎｎａｓら（Ｋｏｕｎｎａｓ，Ｍ．Ｚ．ら、Ｃｅｌｌ ８２：３３１−３
４０（１９９５）；Ｋｏｕｎｎａｓ，Ｍ．Ｚ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
７０：９３０７−９３１２（１９９５））に記載されるような、細胞培養実験を
使用する。ＬＲＰを発現する細胞、マウス胚性線維芽細胞を、ＲＡＰ（４００ｎ
Ｍ）の存在下または非存在下で、試験薬剤で処理されたα2Ｍ、未処理の活性化
されていないα2Ｍおよびメチルアミンもしくはトリプシンによって活性化され
た未処理のα2Ｍの存在下または非存在下で、125Ｉ−Ａβ（あるいは、Ａβは、 3 Ｈまたは14Ｃで標識され得る）と共に１８時間インキュベートする。ＲＡＰは
、ＬＲＰリガンド結合のインヒビターであり、そしてエンドサイトーシスがＬＲ
Ｐ媒介性であるか否かを決定するために添加される。さらに、クロロキン（０．
１ｍＭ）を添加して、125Ｉ−Ａβのリソソーム分解を阻害する。
【０１２１】 トリプシン−ＥＤＴＡ、プロテイナーゼＫ溶液での処理によって放出された放
射活性リガンドの量は、表面結合物質を規定し、そして細胞ペレットに関連する
放射活性の量は、インターナライズされたリガンドの量を規定する。活性化され
たα2Ｍ／125Ｉ−Ａβは、ポジティブコントロールとして作用する。記載された
条件下で、４〜８フェムトモル／１０4細胞より多くの活性されたα2Ｍ／125Ｉ
−Ａβが、１８時間のインキュベーション後にインターナライズされるはずであ
る（Ｋｏｕｎｎａｓ，Ｍ．Ｚ．ら、Ｃｅｌｌ ８２：３３１−３４０（１９９５
））。活性化されていないα2Ｍ／125Ｉ−ＡβおよびＲＡＰ存在下で活性化され
たα2Ｍ／125Ｉ−Ａβは、インターナライズされないはずであり、従って、２〜
４フェムトモル／１０4細胞以下が、インターナライズされるはずである。試験
薬剤で処理されたα2Ｍ／125Ｉ−Ａβの量が、４〜８フェムトモル／１０4細胞
よりも多い場合、α2Ｍ／125Ｉ−Ａβは、ＬＲＰ媒介性エンドサイトーシスを受
ける能力を有することが結論付けられ得る。さらに、活性化されていないα2Ｍ
／125Ｉ−Ａβ、およびＲＡＰ存在下で活性化されたα2Ｍ／125Ｉ−Ａβは、イ
ンターナライズされないはずであり、従って、２〜４フェムトモル／１０4細胞
以下が、インターナライズされるはずである（Ｋｏｕｎｎａｓ，Ｍ．Ｚ．ら、Ｃ
ｅｌｌ ８２：３３１−３４０（１９９５））。ＲＡＰの存在下および非存在下
でのその処理されたα2Ｍ／125Ｉ−Ａβ、ならびに活性化されてないα2Ｍ／125 Ｉ−Ａβが、細胞ペレットに関連する同じ量の放射活性を示す場合、処理された
α2Ｍ／125Ｉ−Ａβ複合体のインターナライズは、無かったものとみなされる。
射活性リガンドの量は、表面結合物質を規定し、そして細胞ペレットに関連する
放射活性の量は、インターナライズされたリガンドの量を規定する。活性化され
たα2Ｍ／125Ｉ−Ａβは、ポジティブコントロールとして作用する。記載された
条件下で、４〜８フェムトモル／１０4細胞より多くの活性されたα2Ｍ／125Ｉ
−Ａβが、１８時間のインキュベーション後にインターナライズされるはずであ
る（Ｋｏｕｎｎａｓ，Ｍ．Ｚ．ら、Ｃｅｌｌ ８２：３３１−３４０（１９９５
））。活性化されていないα2Ｍ／125Ｉ−ＡβおよびＲＡＰ存在下で活性化され
たα2Ｍ／125Ｉ−Ａβは、インターナライズされないはずであり、従って、２〜
４フェムトモル／１０4細胞以下が、インターナライズされるはずである。試験
薬剤で処理されたα2Ｍ／125Ｉ−Ａβの量が、４〜８フェムトモル／１０4細胞
よりも多い場合、α2Ｍ／125Ｉ−Ａβは、ＬＲＰ媒介性エンドサイトーシスを受
ける能力を有することが結論付けられ得る。さらに、活性化されていないα2Ｍ
／125Ｉ−Ａβ、およびＲＡＰ存在下で活性化されたα2Ｍ／125Ｉ−Ａβは、イ
ンターナライズされないはずであり、従って、２〜４フェムトモル／１０4細胞
以下が、インターナライズされるはずである（Ｋｏｕｎｎａｓ，Ｍ．Ｚ．ら、Ｃ
ｅｌｌ ８２：３３１−３４０（１９９５））。ＲＡＰの存在下および非存在下
でのその処理されたα2Ｍ／125Ｉ−Ａβ、ならびに活性化されてないα2Ｍ／125 Ｉ−Ａβが、細胞ペレットに関連する同じ量の放射活性を示す場合、処理された
α2Ｍ／125Ｉ−Ａβ複合体のインターナライズは、無かったものとみなされる。
【０１２２】 処理されたα2Ｍ／Ａβ複合体がエンドサイトーシス後に分解を受ける能力を
決定するために、この細胞培養プロトコルは、クロロキンを用いずに繰り返す。
１０％のトリクロロ酢酸において可溶性である、細胞培養培地中に現される放射
活性は、分解された125Ｉ−Ａβを表すものとして解釈される（Ｋｏｕｎｎａｓ
，Ｍ．Ｚ．ら、Ｃｅｌｌ ８２：３３１−３４０（１９９５）；Ｎａｒｉｔａ，
Ｍ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６９：１９０４−１９１１（１９９７））。
全リガンド分解を、細胞を欠くコントロールウェル中に生じる分解量に対して補
正する。遊離の125Ｉ−Ａβは、ＬＲＰ非依存性様式で分解され得るので、分解
は、ＲＡＰの存在下および非存在下での、処理されたα2Ｍ、および125Ｉ−Ａβ
との未処理α2Ｍ複合体、ならびに遊離の125Ｉ−Ａβについて測定する。上記の
ようなポジティブコントロールおよびネガティブコントロールを使用して、ＲＡ
Ｐが、処理されたα2Ｍ／125Ｉ−Ａβ複合体について、ＴＣＡ可溶性放射活性の
量を少なくとも３０％減少させない場合、処理されたα2Ｍの125Ｉ−Ａβリガン
ドは分解されていないと結論付けられ得る。
決定するために、この細胞培養プロトコルは、クロロキンを用いずに繰り返す。
１０％のトリクロロ酢酸において可溶性である、細胞培養培地中に現される放射
活性は、分解された125Ｉ−Ａβを表すものとして解釈される（Ｋｏｕｎｎａｓ
，Ｍ．Ｚ．ら、Ｃｅｌｌ ８２：３３１−３４０（１９９５）；Ｎａｒｉｔａ，
Ｍ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６９：１９０４−１９１１（１９９７））。
全リガンド分解を、細胞を欠くコントロールウェル中に生じる分解量に対して補
正する。遊離の125Ｉ−Ａβは、ＬＲＰ非依存性様式で分解され得るので、分解
は、ＲＡＰの存在下および非存在下での、処理されたα2Ｍ、および125Ｉ−Ａβ
との未処理α2Ｍ複合体、ならびに遊離の125Ｉ−Ａβについて測定する。上記の
ようなポジティブコントロールおよびネガティブコントロールを使用して、ＲＡ
Ｐが、処理されたα2Ｍ／125Ｉ−Ａβ複合体について、ＴＣＡ可溶性放射活性の
量を少なくとも３０％減少させない場合、処理されたα2Ｍの125Ｉ−Ａβリガン
ドは分解されていないと結論付けられ得る。
【０１２３】 本明細書中に記載される方法および適用に対する、他の適切な改変および適応
が、明らかであり、そして本発明または本発明の任意の実施形態の範囲を逸脱す
ることなくなされ得ることが、関連分野の当業者に容易に明らかである。ここで
、本発明を詳細に記載してきたが、同じことが、以下の実施例を参照することに
よってより明らかに理解され、これらの実施例は、例示目的のみで本明細書中に
含まれ、本発明を限定することが意図されない。
が、明らかであり、そして本発明または本発明の任意の実施形態の範囲を逸脱す
ることなくなされ得ることが、関連分野の当業者に容易に明らかである。ここで
、本発明を詳細に記載してきたが、同じことが、以下の実施例を参照することに
よってより明らかに理解され、これらの実施例は、例示目的のみで本明細書中に
含まれ、本発明を限定することが意図されない。
【０１２４】 （実施例１） Ａ２Ｍ−２の遺伝と脳におけるα2Ｍの役割との間の関連を考慮して、Ａ２Ｍ
ｍＲＮＡおよびα2Ｍタンパク質に対するＡ２Ｍ−２欠失多型の潜在的効果を
調べた。これらの研究は、この多型がα2Ｍのコード配列を直接的に変更しない
が、エキソン１８のスプライスアクセプター部位の直前のイントロン欠失からな
るという事実（Ｍａｔｔｈｉｊｓ，Ｇ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．１９：５１０２（１９９１））によって複雑なものとなった。エキソン１８
は、Ａ２Ｍ−２多型の結果として欠失されるはずならば、この欠失は、α2Ｍの
活性中心または「ベイト」領域の半分の損失（詳細には、ベイト領域を形成する
３９アミノ酸のうちの最後の２０アミノ酸の欠失）を生じるはずであり、これは
、おそらくα2Ｍ活性に対する有害な機能的結果を伴う。特にＡβに関して、こ
のペプチドは、ベイト領域に直接的に結合しない。しかし、標的プロテアーゼに
よるベイトドメインの認識および切断は、α2Ｍテトラマーにおけるコンフォー
メーション変化を介するα2Ｍの活性化のための、インビボでの必須要件である
。次いで、α2Ｍの活性化は、ＬＲＰへの結合に必須である、ＬＲＰ結合ドメイ
ンの提示を生じる（Ｂｏｒｔｈ，Ｗ．ＦＡＳＥＢ Ｊ．６：３３４５−３３５３
（１９９２））。従って、α2Ｍリガンド（例えば、サイトカイン、増殖因子、
Ａβ）のクリアランスは、ベイトドメイン（エキソン１８）の欠失によって阻害
される。
ｍＲＮＡおよびα2Ｍタンパク質に対するＡ２Ｍ−２欠失多型の潜在的効果を
調べた。これらの研究は、この多型がα2Ｍのコード配列を直接的に変更しない
が、エキソン１８のスプライスアクセプター部位の直前のイントロン欠失からな
るという事実（Ｍａｔｔｈｉｊｓ，Ｇ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．１９：５１０２（１９９１））によって複雑なものとなった。エキソン１８
は、Ａ２Ｍ−２多型の結果として欠失されるはずならば、この欠失は、α2Ｍの
活性中心または「ベイト」領域の半分の損失（詳細には、ベイト領域を形成する
３９アミノ酸のうちの最後の２０アミノ酸の欠失）を生じるはずであり、これは
、おそらくα2Ｍ活性に対する有害な機能的結果を伴う。特にＡβに関して、こ
のペプチドは、ベイト領域に直接的に結合しない。しかし、標的プロテアーゼに
よるベイトドメインの認識および切断は、α2Ｍテトラマーにおけるコンフォー
メーション変化を介するα2Ｍの活性化のための、インビボでの必須要件である
。次いで、α2Ｍの活性化は、ＬＲＰへの結合に必須である、ＬＲＰ結合ドメイ
ンの提示を生じる（Ｂｏｒｔｈ，Ｗ．ＦＡＳＥＢ Ｊ．６：３３４５−３３５３
（１９９２））。従って、α2Ｍリガンド（例えば、サイトカイン、増殖因子、
Ａβ）のクリアランスは、ベイトドメイン（エキソン１８）の欠失によって阻害
される。
【０１２５】 Ａ２Ｍ−２欠失に起因するエキソン１８の特異的欠失はまた、エキソン１９の
コード領域においてフレームシフトを生じる。これは、短縮型α2Ｍモノマーの
合成を生じる。従って、ベイト領域の改変の１つの可能性のある結果としては、
欠損α2Ｍテトラマー（欠損モノマーの挿入）の形成であり、このテトラマーは
、活性化され得ず、そしてその後のＬＲＰを介するエンドサイトーシスを受け得
る。細胞中で発現されるエキソン１８欠失α2Ｍ構築物を用いる実験は、ベイト
領域での短縮型α2Ｍタンパク質がなお、分泌され得、そしてそれ自体でテトラ
マーを形成し得ることを示す。さらに、Ａ２Ｍ−２対立遺伝子によって産生され
る変更されたＡ２Ｍメッセンジャーおよび対応する短縮型α2Ｍモノマーについ
て陽性であるヒト神経膠腫細胞のみが、エキソン１８の欠失、それに続くエキソ
ン１９のアミノ酸配列の終結と一貫する。
コード領域においてフレームシフトを生じる。これは、短縮型α2Ｍモノマーの
合成を生じる。従って、ベイト領域の改変の１つの可能性のある結果としては、
欠損α2Ｍテトラマー（欠損モノマーの挿入）の形成であり、このテトラマーは
、活性化され得ず、そしてその後のＬＲＰを介するエンドサイトーシスを受け得
る。細胞中で発現されるエキソン１８欠失α2Ｍ構築物を用いる実験は、ベイト
領域での短縮型α2Ｍタンパク質がなお、分泌され得、そしてそれ自体でテトラ
マーを形成し得ることを示す。さらに、Ａ２Ｍ−２対立遺伝子によって産生され
る変更されたＡ２Ｍメッセンジャーおよび対応する短縮型α2Ｍモノマーについ
て陽性であるヒト神経膠腫細胞のみが、エキソン１８の欠失、それに続くエキソ
ン１９のアミノ酸配列の終結と一貫する。
【０１２６】 （方法および結果） 第１に、ＲＮＡスプライシングならびにα2Ｍ複合体の形成および分泌に対す
る、Ａ２Ｍ−２欠失の効果を調べた。内因性の系におけるＡ２Ｍ−２多型の生物
学的効果を研究するために、高レベルのα2Ｍを発現する１５のヒト神経膠芽腫
細胞株を、遺伝子型決定した（Ｂｌａｃｋｅｒ，Ｄ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎ
ｅｔｉｃｓ １９：３５７−２６０（１９９８））。最も高いレベルのα2Ｍは
、ヘパトーム細胞株から予測されたが、神経膠芽腫が、それらがＣＮＳ起源であ
ることから選択された。１０の原発性神経膠芽腫細胞株（全て、異なる患者由来
である）は、Ａ２Ｍ−１（非欠失）対立遺伝子に対してホモ接合体であり、一方
、３つの細胞株は、その欠失に対してＡ２Ｍ−１／２のヘテロ接合体であった。
２つの細胞株は、これらの対立遺伝子のいずれも限定されず、これらをさらなる
研究から排除した。分子レベルで、Ａ２Ｍ−２対立遺伝子は、エキソン１８のス
プライスアクセプター部位で、コンセンサス３’ＡＧの直前のコンセンサスポリ
ピリミジン領域（ｔｒａｃｔ）における５ｂｐ（ＡＣＣＡＴ）の欠失からなる（
Ｍａｔｔｈｉｊｓ，Ｇ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：５１
０２（１９９１））。多型の位置を考慮すると、異常なＡ２Ｍ ＲＮＡスプライ
シングが、エキソン１８での欠失を導くことが予測され得る。なぜなら、コンセ
ンサスポリピリミジン領域は、３つのピリミジン（エキソンスプライシングにつ
いての最少のコンセンサスコンフォーメーションへと）に減少されるからである
。次いで、エキソン１８の欠失は、エキソン１９の終止コドンに起因してタンパ
ク質の終結を生じる。逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を、Ａ２Ｍ遺伝子のエキソ
ン１８の近傍の異常なスプライシング産物を同定するための試みにおいて使用し
た。エキソン１７、１８および１９を含む、予測された３９９ｂｐフラグメント
を、１３のヒト神経膠腫細胞株から単離されたＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲによって増
幅した。アガロースゲル／エチジウムブロマイド染色は、Ａ２Ｍ−２対立遺伝子
を含むいずれの細胞株においても、異常なＡ２Ｍ転写物を明らかにするには十分
に高感度ではなかった。しかし、ポリアクリルアミドゲルを使用して、２５０〜
２９０ｂｐのサイズ範囲の種々の33Ｐ標識ＰＣＲ産物を検出した。これらの産物
は、Ａ２Ｍ−１／２細胞株において排他的に見出された（図１）。
る、Ａ２Ｍ−２欠失の効果を調べた。内因性の系におけるＡ２Ｍ−２多型の生物
学的効果を研究するために、高レベルのα2Ｍを発現する１５のヒト神経膠芽腫
細胞株を、遺伝子型決定した（Ｂｌａｃｋｅｒ，Ｄ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎ
ｅｔｉｃｓ １９：３５７−２６０（１９９８））。最も高いレベルのα2Ｍは
、ヘパトーム細胞株から予測されたが、神経膠芽腫が、それらがＣＮＳ起源であ
ることから選択された。１０の原発性神経膠芽腫細胞株（全て、異なる患者由来
である）は、Ａ２Ｍ−１（非欠失）対立遺伝子に対してホモ接合体であり、一方
、３つの細胞株は、その欠失に対してＡ２Ｍ−１／２のヘテロ接合体であった。
２つの細胞株は、これらの対立遺伝子のいずれも限定されず、これらをさらなる
研究から排除した。分子レベルで、Ａ２Ｍ−２対立遺伝子は、エキソン１８のス
プライスアクセプター部位で、コンセンサス３’ＡＧの直前のコンセンサスポリ
ピリミジン領域（ｔｒａｃｔ）における５ｂｐ（ＡＣＣＡＴ）の欠失からなる（
Ｍａｔｔｈｉｊｓ，Ｇ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：５１
０２（１９９１））。多型の位置を考慮すると、異常なＡ２Ｍ ＲＮＡスプライ
シングが、エキソン１８での欠失を導くことが予測され得る。なぜなら、コンセ
ンサスポリピリミジン領域は、３つのピリミジン（エキソンスプライシングにつ
いての最少のコンセンサスコンフォーメーションへと）に減少されるからである
。次いで、エキソン１８の欠失は、エキソン１９の終止コドンに起因してタンパ
ク質の終結を生じる。逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を、Ａ２Ｍ遺伝子のエキソ
ン１８の近傍の異常なスプライシング産物を同定するための試みにおいて使用し
た。エキソン１７、１８および１９を含む、予測された３９９ｂｐフラグメント
を、１３のヒト神経膠腫細胞株から単離されたＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲによって増
幅した。アガロースゲル／エチジウムブロマイド染色は、Ａ２Ｍ−２対立遺伝子
を含むいずれの細胞株においても、異常なＡ２Ｍ転写物を明らかにするには十分
に高感度ではなかった。しかし、ポリアクリルアミドゲルを使用して、２５０〜
２９０ｂｐのサイズ範囲の種々の33Ｐ標識ＰＣＲ産物を検出した。これらの産物
は、Ａ２Ｍ−１／２細胞株において排他的に見出された（図１）。
【０１２７】 次に、これらの産物を、ｐＣＲ２．１中にクローニングした。異常なｍＲＮＡ
転写物を代表する４つの異なるクローンを、このアプローチを使用して同定した
（図２）。これらのクローンの配列決定によって、種々のサイズのＲＮＡの産生
を導くエキソン１８の周辺の異常なスプライシング事象が明らかになった、これ
らのＲＮＡにおいて、エキソン１７および／または１９もまた、短縮化され得る
。クローン１は、２０８ｂｐの欠失（２１２６−２３３４）を有し、これには、
エキソン１８、および興味深いことに、エキソン１７および１９の、それぞれ４
２ｂｐおよび５０ｂｐもまた含まれる。このような欠失から生じたタンパク質産
物はさらに、インフレームで６９アミノ酸の欠失を有し、これには、ベイト領域
の大部分が含まれる。クローン２、３および４は、同定されていないＤＮＡフラ
グメントを含み、これらのフラグメントは、エキソン１９内で、それぞれ、２３
５５ｂｐ、２３２０ｂｐおよび２２９７ｂｐまで続く。この未知の配列は、ほぼ
おそらく、ＤＮＡデータベース中でアクセス可能ではないイントロン配列である
。従って、エキソン１８周辺の異常なスプライシング事象は、エキソン１８の正
確な欠失を単に生じるようではない。むしろ、これらの事象は、種々のサイズの
ＲＮＡの産生を生じ、これには、エキソン１７および／または１９もまた、部分
的に欠失され得る。
転写物を代表する４つの異なるクローンを、このアプローチを使用して同定した
（図２）。これらのクローンの配列決定によって、種々のサイズのＲＮＡの産生
を導くエキソン１８の周辺の異常なスプライシング事象が明らかになった、これ
らのＲＮＡにおいて、エキソン１７および／または１９もまた、短縮化され得る
。クローン１は、２０８ｂｐの欠失（２１２６−２３３４）を有し、これには、
エキソン１８、および興味深いことに、エキソン１７および１９の、それぞれ４
２ｂｐおよび５０ｂｐもまた含まれる。このような欠失から生じたタンパク質産
物はさらに、インフレームで６９アミノ酸の欠失を有し、これには、ベイト領域
の大部分が含まれる。クローン２、３および４は、同定されていないＤＮＡフラ
グメントを含み、これらのフラグメントは、エキソン１９内で、それぞれ、２３
５５ｂｐ、２３２０ｂｐおよび２２９７ｂｐまで続く。この未知の配列は、ほぼ
おそらく、ＤＮＡデータベース中でアクセス可能ではないイントロン配列である
。従って、エキソン１８周辺の異常なスプライシング事象は、エキソン１８の正
確な欠失を単に生じるようではない。むしろ、これらの事象は、種々のサイズの
ＲＮＡの産生を生じ、これには、エキソン１７および／または１９もまた、部分
的に欠失され得る。
【０１２８】 次に、大きい欠失または切断を含むα2Ｍタンパク質の変異体形態を検出する
ように設計された実験を行った。低レベルの異常なｍＲＮＡ転写物に基づいて、
予期される量の変異体タンパク質は、検出量未満であり得ったか、または使用さ
れる抗体によって認識され得なかった。なぜなら、その抗体は、ホロタンパク質
に対して惹起されたからである。最終的には、短縮型タンパク質または大いに変
更されたタンパク質は、分泌前の分解に対して、ＥＲにおける品質管理系によっ
て標的化され得る。これらの関心事に、終止コドンがエキソン１８の中間に挿入
されているＡ２Ｍ ｃＤＮＡ構築物を生成し、そしてこの構築物を、α2Ｍを内
因的に産生しないチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞にトランスフェク
トすることによって取り組んだ。図３に示されるように、トランスフェクトされ
た細胞ゆらいの培地および抽出物の両方は、短縮型α2Ｍタンパク質産物および
コントロールの全長α2Ｍタンパク質産物を含んだ。示されたゲルを、変性条件
下であるが、非還元条件下で泳動させた。これらの条件下で、短縮型タンパク質
のモノマーならびに全長タンパク質のモノマーおよびダイマーが、細胞溶解物中
に検出された。しかし、培地中では、ほぼ全ての短縮型タンパク質がテトラマー
を形成し、そしてダイマーは、ほとんど検出可能でなかった。野生型の全長α2
Ｍもまた、主にテトラマーおよびダイマーの形態で培地中に存在した。使用され
る抗体がα2ＭのＮ末端側半分を認識し得ること、および短縮型α2Ｍタンパク質
がＣＨＯ細胞によって合成および分泌され得ることを実証することに加え、この
実験の結果（図３）はまた、分泌されたα2Ｍレベルが、切断の結果として劇的
に減少し得ることを示す予備的データを提供した。
ように設計された実験を行った。低レベルの異常なｍＲＮＡ転写物に基づいて、
予期される量の変異体タンパク質は、検出量未満であり得ったか、または使用さ
れる抗体によって認識され得なかった。なぜなら、その抗体は、ホロタンパク質
に対して惹起されたからである。最終的には、短縮型タンパク質または大いに変
更されたタンパク質は、分泌前の分解に対して、ＥＲにおける品質管理系によっ
て標的化され得る。これらの関心事に、終止コドンがエキソン１８の中間に挿入
されているＡ２Ｍ ｃＤＮＡ構築物を生成し、そしてこの構築物を、α2Ｍを内
因的に産生しないチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞にトランスフェク
トすることによって取り組んだ。図３に示されるように、トランスフェクトされ
た細胞ゆらいの培地および抽出物の両方は、短縮型α2Ｍタンパク質産物および
コントロールの全長α2Ｍタンパク質産物を含んだ。示されたゲルを、変性条件
下であるが、非還元条件下で泳動させた。これらの条件下で、短縮型タンパク質
のモノマーならびに全長タンパク質のモノマーおよびダイマーが、細胞溶解物中
に検出された。しかし、培地中では、ほぼ全ての短縮型タンパク質がテトラマー
を形成し、そしてダイマーは、ほとんど検出可能でなかった。野生型の全長α2
Ｍもまた、主にテトラマーおよびダイマーの形態で培地中に存在した。使用され
る抗体がα2ＭのＮ末端側半分を認識し得ること、および短縮型α2Ｍタンパク質
がＣＨＯ細胞によって合成および分泌され得ることを実証することに加え、この
実験の結果（図３）はまた、分泌されたα2Ｍレベルが、切断の結果として劇的
に減少し得ることを示す予備的データを提供した。
【０１２９】 次に、内因性のα2Ｍの分泌およびテトラマー形成に対するＡ２Ｍ−２多型の
効果を試験した。この目的のために、内因性の分泌α2Ｍを、ウェスタンブロッ
ト分析によって分析した。神経膠芽腫細胞を、ＯｐｔｉＭｅｍ（Ｇｉｂｃｏ）無
血清培地中で一晩培養し（なぜなら、ウシ血清は高レベルのα2Ｍを含むから）
、そして分泌されたα2Ｍを、Ｓｉｇｍａから得たポリクローナルα2Ｍ抗体とと
もに免疫沈降させた。この免疫沈降物を、ＳＤＳ ＰＡＧＥによって分離し、予
測された１８０ｋＤのモノマーが、全てのレーンで検出されたが、より小さい異
常形態のα2Ｍが、Ａ２Ｍ−２陽性細胞においてのみ検出された。図４は、野生
型細胞およびＡ２Ｍ−２欠失保有細胞由来の細胞溶解物を示す。このデータは、
Ａ２Ｍ−２欠失含有細胞において排他的な切断形態のα2Ｍと一致するタンパク
質バンドを明らかにした。Ａ２Ｍ−１細胞およびＡ２Ｍ−２細胞由来の培地（デ
ータは示さず）は、主に全長のα2Ｍモノマーを含んだが、Ａ２Ｍ−２細胞由来
の培地において、少量の短縮型種もまた観察され得た。
効果を試験した。この目的のために、内因性の分泌α2Ｍを、ウェスタンブロッ
ト分析によって分析した。神経膠芽腫細胞を、ＯｐｔｉＭｅｍ（Ｇｉｂｃｏ）無
血清培地中で一晩培養し（なぜなら、ウシ血清は高レベルのα2Ｍを含むから）
、そして分泌されたα2Ｍを、Ｓｉｇｍａから得たポリクローナルα2Ｍ抗体とと
もに免疫沈降させた。この免疫沈降物を、ＳＤＳ ＰＡＧＥによって分離し、予
測された１８０ｋＤのモノマーが、全てのレーンで検出されたが、より小さい異
常形態のα2Ｍが、Ａ２Ｍ−２陽性細胞においてのみ検出された。図４は、野生
型細胞およびＡ２Ｍ−２欠失保有細胞由来の細胞溶解物を示す。このデータは、
Ａ２Ｍ−２欠失含有細胞において排他的な切断形態のα2Ｍと一致するタンパク
質バンドを明らかにした。Ａ２Ｍ−１細胞およびＡ２Ｍ−２細胞由来の培地（デ
ータは示さず）は、主に全長のα2Ｍモノマーを含んだが、Ａ２Ｍ−２細胞由来
の培地において、少量の短縮型種もまた観察され得た。
【０１３０】 （考察） 定常状態レベルの分泌α2Ｍの減少、またはＡ２Ｍ−２のドミナントネガティ
ブな効果に起因する欠損テトラマーの存在は、α2Ｍ機能の損失を生じた。エキ
ソン１７および１８におけるベイト領域をコードする配列の部分的欠失または全
欠失は、おそらく、変異体モノマーを含む潜在的な欠損テトラマーのプロテアー
ゼ結合、活性化、およびインターナライズを改変するようである。従って、非常
に低レベルの変異体モノマーの生成は、増幅された効果を有し得る。なぜなら、
１つの変異体モノマーは、テトラマー中の３つの野生型モノマーの機能を潜在的
に阻害し得るからである（ドミナントネガティブな効果）。これらおよびＡ２Ｍ
−２欠失とＡＤとの間の連鎖（Ｂｌａｃｋｅｒ，Ｄ．ら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．
１９：３５７−３６０（１９９８））に基づいて、α2Ｍの重要な役割が、ＡＤ
の神経病発生に示される。本明細書中に記載されるデータは、Ａ２Ｍ−３欠失が
、α2Ｍ ＲＮＡおよびタンパク質の欠失／切断形態を導き、これらが、正常な
α2Ｍに対するドミナントネガティブな効果を有し得ることを示す。
ブな効果に起因する欠損テトラマーの存在は、α2Ｍ機能の損失を生じた。エキ
ソン１７および１８におけるベイト領域をコードする配列の部分的欠失または全
欠失は、おそらく、変異体モノマーを含む潜在的な欠損テトラマーのプロテアー
ゼ結合、活性化、およびインターナライズを改変するようである。従って、非常
に低レベルの変異体モノマーの生成は、増幅された効果を有し得る。なぜなら、
１つの変異体モノマーは、テトラマー中の３つの野生型モノマーの機能を潜在的
に阻害し得るからである（ドミナントネガティブな効果）。これらおよびＡ２Ｍ
−２欠失とＡＤとの間の連鎖（Ｂｌａｃｋｅｒ，Ｄ．ら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．
１９：３５７−３６０（１９９８））に基づいて、α2Ｍの重要な役割が、ＡＤ
の神経病発生に示される。本明細書中に記載されるデータは、Ａ２Ｍ−３欠失が
、α2Ｍ ＲＮＡおよびタンパク質の欠失／切断形態を導き、これらが、正常な
α2Ｍに対するドミナントネガティブな効果を有し得ることを示す。
【０１３１】 （実施例２） 本発明のＡ２Ｍ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドを試験するため、および
Ｓ１ヌクレアーゼアッセイのために、配列番号２７のヌクレオチド３５〜５０、
およびヌクレオチド２０〜５０のヌクレオチド配列を有するＡ２Ｍ−２アンチセ
ンスオリゴヌクレオチドを、自動ＤＮＡシンセサイザー（ＭｉｌｌｉＧｅｎ）を
使用して合成する。このオリゴヌクレオチドを、２０％アクリルアミド−尿素ゲ
ルから回収し、そしてエタノール沈殿法によって精製し、そして沈殿物を１μｍ
ｏｌの濃度で水に溶解する。各アンチセンスヌクレオチドに対して相補的なＡ２
Ｍ−２センスオリゴヌクレオチドをポジティブコントロールとして使用する。各
Ａ２Ｍ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＡ２Ｍ−２センスヌクレオチ
ド（１μｍｏｌ）を、１ｍｌの細胞培養培地に添加する。次いで、各１ｍｌのサ
ンプルを、Ａ２Ｍ−２対立遺伝子に対してヘテロ接合性の神経膠腫細胞、または
野生型Ａ２Ｍ（Ａ２Ｍ−１）に対してホモ接合性である神経膠腫細胞とともに、
３７℃で２４時間インキュベートする。その細胞を、リン酸緩衝化生理食塩水で
洗浄し、そして４Ｍグアニジンチオシアネートを含有する変性溶液中でホモジナ
イズする。ＲＮＡを、フェノール／クロロホルム抽出および超遠心分離を使用し
て抽出する。次いで、ＲＮＡペレットを、１ｍｌの７５％エタノール／２５％
０．１Ｍ 酢酸ナトリウムでリンスし、そして１００μｌの水に再懸濁する。次
いで、各サンプル由来のＲＮＡを、32Ｐで末端標識した、エキソン１７および１
８（α2Ｍ（配列番号１）に対する全長ｃＤＮＡのヌクレオチド２０５７〜２３
５６）を含む３００ｂｐアンチセンスＤＮＡプローブを使用して探索（ｐｒｏｂ
ｅ）する。プローブを、各サンプル由来の１５μｇのＲＮＡとハイブリダイズさ
せる。次いで、ＲＮＡを沈殿させ、洗浄し、そしてＳ１ハイブリダイゼーション
溶液に再懸濁する。次いで、サンプルを６５℃で１０分間変性させ、そして３０
℃で一晩ハイブリダイズさせる。次いで、一本鎖仔ウシ胸腺ＤＮＡを有する１５
０μｌのＳ１ヌクレアーゼ緩衝液中の３００ＵのＳ１ヌクレアーゼ緩衝液を、各
サンプルに添加し、そして３０℃で６０分間インキュベートした。反応を停止し
、ＲＮＡを沈殿させ、洗浄し、そして再懸濁し、そしてこのサンプルを分子量マ
ーカーとともにポリアクリルアミドゲル上で泳動する。野生型転写物（Ａ２Ｍ−
１）は、３００ｂｐのバンドとして現れ、Ａ２Ｍ−２改変体転写物は、より小さ
なバンドとして現れるはずである。Ａ２Ｍ−２アンチセンスオリゴヌクレオチド
処理がない場合、この比は約１０：１の野生型対改変体ｍＲＮＡであると予測さ
れる。この野生型転写物対改変体転写物の比が決定され、そしてＡ２Ｍ−１／１
細胞からのＡ２Ｍ ｍＲＮＡについて見出された比と比較される。
Ｓ１ヌクレアーゼアッセイのために、配列番号２７のヌクレオチド３５〜５０、
およびヌクレオチド２０〜５０のヌクレオチド配列を有するＡ２Ｍ−２アンチセ
ンスオリゴヌクレオチドを、自動ＤＮＡシンセサイザー（ＭｉｌｌｉＧｅｎ）を
使用して合成する。このオリゴヌクレオチドを、２０％アクリルアミド−尿素ゲ
ルから回収し、そしてエタノール沈殿法によって精製し、そして沈殿物を１μｍ
ｏｌの濃度で水に溶解する。各アンチセンスヌクレオチドに対して相補的なＡ２
Ｍ−２センスオリゴヌクレオチドをポジティブコントロールとして使用する。各
Ａ２Ｍ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＡ２Ｍ−２センスヌクレオチ
ド（１μｍｏｌ）を、１ｍｌの細胞培養培地に添加する。次いで、各１ｍｌのサ
ンプルを、Ａ２Ｍ−２対立遺伝子に対してヘテロ接合性の神経膠腫細胞、または
野生型Ａ２Ｍ（Ａ２Ｍ−１）に対してホモ接合性である神経膠腫細胞とともに、
３７℃で２４時間インキュベートする。その細胞を、リン酸緩衝化生理食塩水で
洗浄し、そして４Ｍグアニジンチオシアネートを含有する変性溶液中でホモジナ
イズする。ＲＮＡを、フェノール／クロロホルム抽出および超遠心分離を使用し
て抽出する。次いで、ＲＮＡペレットを、１ｍｌの７５％エタノール／２５％
０．１Ｍ 酢酸ナトリウムでリンスし、そして１００μｌの水に再懸濁する。次
いで、各サンプル由来のＲＮＡを、32Ｐで末端標識した、エキソン１７および１
８（α2Ｍ（配列番号１）に対する全長ｃＤＮＡのヌクレオチド２０５７〜２３
５６）を含む３００ｂｐアンチセンスＤＮＡプローブを使用して探索（ｐｒｏｂ
ｅ）する。プローブを、各サンプル由来の１５μｇのＲＮＡとハイブリダイズさ
せる。次いで、ＲＮＡを沈殿させ、洗浄し、そしてＳ１ハイブリダイゼーション
溶液に再懸濁する。次いで、サンプルを６５℃で１０分間変性させ、そして３０
℃で一晩ハイブリダイズさせる。次いで、一本鎖仔ウシ胸腺ＤＮＡを有する１５
０μｌのＳ１ヌクレアーゼ緩衝液中の３００ＵのＳ１ヌクレアーゼ緩衝液を、各
サンプルに添加し、そして３０℃で６０分間インキュベートした。反応を停止し
、ＲＮＡを沈殿させ、洗浄し、そして再懸濁し、そしてこのサンプルを分子量マ
ーカーとともにポリアクリルアミドゲル上で泳動する。野生型転写物（Ａ２Ｍ−
１）は、３００ｂｐのバンドとして現れ、Ａ２Ｍ−２改変体転写物は、より小さ
なバンドとして現れるはずである。Ａ２Ｍ−２アンチセンスオリゴヌクレオチド
処理がない場合、この比は約１０：１の野生型対改変体ｍＲＮＡであると予測さ
れる。この野生型転写物対改変体転写物の比が決定され、そしてＡ２Ｍ−１／１
細胞からのＡ２Ｍ ｍＲＮＡについて見出された比と比較される。
【０１３２】 （実施例３） ベイトドメイン以外の部位を通してα2Ｍを活性化し得る治療剤をスクリーニ
ングするために、活性化されていないテトラマーのα2Ｍ（Ｓｉｇｍａ）（約１
ｍｇ／ｍｌ）を、５、２０、５０、または１００μｇの試験薬剤とともに、Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌまたはリン酸ナトリウム緩衝液中で３７℃、２時間インキュベート
する。処理していない活性化していないα2Ｍ、およびメチルアミンまたはトリ
プシンで活性化した処理していないα2Ｍを、コントロールとして使用する。
ングするために、活性化されていないテトラマーのα2Ｍ（Ｓｉｇｍａ）（約１
ｍｇ／ｍｌ）を、５、２０、５０、または１００μｇの試験薬剤とともに、Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌまたはリン酸ナトリウム緩衝液中で３７℃、２時間インキュベート
する。処理していない活性化していないα2Ｍ、およびメチルアミンまたはトリ
プシンで活性化した処理していないα2Ｍを、コントロールとして使用する。
【０１３３】 マイクロタイタープレートを、５０μｌのＬＲＰ（１０μｇ）／ウェルととも
に３７℃で２時間インキュベートし、次いで脱イオン水でリンスする。次いで、
プレートをブロッキング緩衝液で満たし、そしてリンスする。処理したα2Ｍ、
処理していない活性化していないα2Ｍ、またはメチルアミンもしくはトリプシ
ンで活性化した処理していないα2Ｍ（５０μｌ）を各ウェルに添加し、そして
室温で２時間インキュベートする。リンスの後、ＭＵＰと結合体化したブロッキ
ング緩衝液中の５０μｌの抗α2Ｍ ＩｇＧをウェルに添加し、そして室温で２
時間インキュベートする。リンスの後、ＭＵＰ基質をウェルに添加し、そして室
温で１時間インキュベートする。結合したα2Ｍの量を、３６５ｎｍの励起フィ
ルターおよび４５０ｎｍの発光フィルターを用いる分光蛍光計で定量する。
に３７℃で２時間インキュベートし、次いで脱イオン水でリンスする。次いで、
プレートをブロッキング緩衝液で満たし、そしてリンスする。処理したα2Ｍ、
処理していない活性化していないα2Ｍ、またはメチルアミンもしくはトリプシ
ンで活性化した処理していないα2Ｍ（５０μｌ）を各ウェルに添加し、そして
室温で２時間インキュベートする。リンスの後、ＭＵＰと結合体化したブロッキ
ング緩衝液中の５０μｌの抗α2Ｍ ＩｇＧをウェルに添加し、そして室温で２
時間インキュベートする。リンスの後、ＭＵＰ基質をウェルに添加し、そして室
温で１時間インキュベートする。結合したα2Ｍの量を、３６５ｎｍの励起フィ
ルターおよび４５０ｎｍの発光フィルターを用いる分光蛍光計で定量する。
【０１３４】 （実施例４） ＬＲＰおよびＡβに対するα2Ｍ結合のためにほんのわずかだけの重要な相互
作用が必要とされるという証拠を考慮すると（上記で議論したように）、ＬＲＰ
結合ドメインおよびＡβ結合ドメインを含む小さなペプチドが、Ａβ結合、ＬＲ
Ｐ媒介性エンドサイトーシス、および最終的なＡβ分解を促進し得る。このよう
なペプチドは、Ａβ除去および分解を促進し得ない場合、α2Ｍ−２の代替物と
して働き得る。
作用が必要とされるという証拠を考慮すると（上記で議論したように）、ＬＲＰ
結合ドメインおよびＡβ結合ドメインを含む小さなペプチドが、Ａβ結合、ＬＲ
Ｐ媒介性エンドサイトーシス、および最終的なＡβ分解を促進し得る。このよう
なペプチドは、Ａβ除去および分解を促進し得ない場合、α2Ｍ−２の代替物と
して働き得る。
【０１３５】 タンパク質−タンパク質相互作用は、通常、わずかだけ重要な相互作用によっ
て媒介される（Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：１−６（１９９６））。α2ＭのＡβ除去特性は、インタ
クトな５８０４残基のα2Ｍテトラマーのすべてのドメインを必要とするわけで
はない。α2Ｍモノマーの２５０残基フラグメントは、Ａβ結合ドメインとＬＲ
Ｐ結合ドメインとの両方を含む（Ｈｕｇｈｅｓ，Ｓ．Ｒ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：３２７５−３２８０（１９９８））
。１１残基のペプチドは、インビボでＡβを結合し得、そして２７残基のＬＲＰ
結合コンセンサス配列が存在する（Ｓｏｔｏ，Ｃ．ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：８
２２−８２６（１９９８）；Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｋ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２７１：１２９０９−１２９１２（１９９６）；Ｓｏｔｏ，Ｃ．ら、Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２２６：６７２−６８０
（１９９６））。Ａβ結合ドメインおよびＬＲＰ結合ドメインを含むペプチドは
、Ａβに結合し、そしてＬＲＰ媒介性エンドサイトーシス、続いてリソソームに
よる分解のためにそれを標的化する。この目的を達成するために、まず、１１残
基のＡβ結合ペプチドおよび２７残基のＬＲＰ結合ドメインからなるペプチドを
産生し、そしてＡβ結合特性およびＡβ除去特性について試験する。必要な場合
、この抗ＬＲＰ−Ａβペプチドの結合特性は、インビボ進化技術を用いて再最適
化され得る（Ｂｕｃｈｈｏｌｚ，Ｆ．ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６
：６５７−６６２（１９９８））。
て媒介される（Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：１−６（１９９６））。α2ＭのＡβ除去特性は、インタ
クトな５８０４残基のα2Ｍテトラマーのすべてのドメインを必要とするわけで
はない。α2Ｍモノマーの２５０残基フラグメントは、Ａβ結合ドメインとＬＲ
Ｐ結合ドメインとの両方を含む（Ｈｕｇｈｅｓ，Ｓ．Ｒ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：３２７５−３２８０（１９９８））
。１１残基のペプチドは、インビボでＡβを結合し得、そして２７残基のＬＲＰ
結合コンセンサス配列が存在する（Ｓｏｔｏ，Ｃ．ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：８
２２−８２６（１９９８）；Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｋ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２７１：１２９０９−１２９１２（１９９６）；Ｓｏｔｏ，Ｃ．ら、Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２２６：６７２−６８０
（１９９６））。Ａβ結合ドメインおよびＬＲＰ結合ドメインを含むペプチドは
、Ａβに結合し、そしてＬＲＰ媒介性エンドサイトーシス、続いてリソソームに
よる分解のためにそれを標的化する。この目的を達成するために、まず、１１残
基のＡβ結合ペプチドおよび２７残基のＬＲＰ結合ドメインからなるペプチドを
産生し、そしてＡβ結合特性およびＡβ除去特性について試験する。必要な場合
、この抗ＬＲＰ−Ａβペプチドの結合特性は、インビボ進化技術を用いて再最適
化され得る（Ｂｕｃｈｈｏｌｚ，Ｆ．ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６
：６５７−６６２（１９９８））。
【０１３６】 （方法） 図６は、１つの可能性のある抗ＬＲＰ−Ａβペプチドの配列を示す。標準的な
固相合成法を用いて、このペプチドを、Ａβ除去における機能を決定するための
試験を実行するのに十分な量合成する（「Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｈ
ａｎｄｌｉｎｇ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏ
ｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．ら編
、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，刊、第２巻、第１８章
（補遺１４、１９９８）を参照のこと）。次いで、融合ペプチドをコードするＤ
ＮＡを合成する。２７残基のＬＲＰ結合ペプチドをコードするＤＮＡを、Ａ２Ｍ
遺伝子のコドン１３６６〜１３９２のＰＣＲ増幅によって得る（Ｎｉｅｌｓｅｎ
，Ｋ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１２９０９〜１２９１２（１
９９６））。１１残基のＡβ結合配列をＬＲＰ結合配列に挿入するために、ＰＣ
Ｒ媒介挿入を使用する。ＬＲＰ結合配列に相同な２５ヌクレオチドおよび１１残
基のＡβ結合ペプチドおよび開始コドンに対応する３６ヌクレオチドを有する、
５５ヌクレオチドの５’ＰＣＲプライマーを設計する。ＰＣＲ媒介挿入をまた、
融合遺伝子の５’末端および３’末端にＸｈｏＩおよびＫｐｎＩ制限酵素部位を
それぞれ挿入するために使用する。これらの酵素を用いる切断は、融合タンパク
質遺伝子の、（ｉ）Ｅ．ｃｏｌｉ中での抗ＬＲＰ−Ａβのアラビノース依存性発
現のためのｐＢＡＤ／Ｈｉｓ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、および（
ｉｉ）酵母スリーハイブリッド系における使用のためのｐＬｅｘ９−３ＩＩベク
ターへのクローニングを容易にする（Ｔｉｒｏｄｅ，Ｆ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２７２：２２９９５−２２９９９（１９９７））。得られる遺伝子のこ
のタンパク質産物（抗ＬＲＰ−Ａβと名付けられた）は、Ａβ結合特性とＬＲＰ
結合特性の両方を有するはずである。
固相合成法を用いて、このペプチドを、Ａβ除去における機能を決定するための
試験を実行するのに十分な量合成する（「Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｈ
ａｎｄｌｉｎｇ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏ
ｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．ら編
、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，刊、第２巻、第１８章
（補遺１４、１９９８）を参照のこと）。次いで、融合ペプチドをコードするＤ
ＮＡを合成する。２７残基のＬＲＰ結合ペプチドをコードするＤＮＡを、Ａ２Ｍ
遺伝子のコドン１３６６〜１３９２のＰＣＲ増幅によって得る（Ｎｉｅｌｓｅｎ
，Ｋ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１２９０９〜１２９１２（１
９９６））。１１残基のＡβ結合配列をＬＲＰ結合配列に挿入するために、ＰＣ
Ｒ媒介挿入を使用する。ＬＲＰ結合配列に相同な２５ヌクレオチドおよび１１残
基のＡβ結合ペプチドおよび開始コドンに対応する３６ヌクレオチドを有する、
５５ヌクレオチドの５’ＰＣＲプライマーを設計する。ＰＣＲ媒介挿入をまた、
融合遺伝子の５’末端および３’末端にＸｈｏＩおよびＫｐｎＩ制限酵素部位を
それぞれ挿入するために使用する。これらの酵素を用いる切断は、融合タンパク
質遺伝子の、（ｉ）Ｅ．ｃｏｌｉ中での抗ＬＲＰ−Ａβのアラビノース依存性発
現のためのｐＢＡＤ／Ｈｉｓ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、および（
ｉｉ）酵母スリーハイブリッド系における使用のためのｐＬｅｘ９−３ＩＩベク
ターへのクローニングを容易にする（Ｔｉｒｏｄｅ，Ｆ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２７２：２２９９５−２２９９９（１９９７））。得られる遺伝子のこ
のタンパク質産物（抗ＬＲＰ−Ａβと名付けられた）は、Ａβ結合特性とＬＲＰ
結合特性の両方を有するはずである。
【０１３７】 （Ａβ結合）抗ＬＲＰ−ＡβのＡβを結合する能力は、ゲル濾過クロマトグラ
フィーおよびイムノブロッティングによって最初に決定される。これらの方法の
両方が、野生型α2Ｍおよび改変体α2ＭへのＡβの結合を研究する他の研究者に
よって首尾よく使用されてきた（Ｎａｒｉｔａ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅ
ｍ．６９：１９０４−１９１１（１９９７）；Ｄｕ，Ｙ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃ
ｈｅｍ．６９：２９９−３０５（１９９７））。Ａβ１−４２は、Ｎａｒｉｔａ
ら（Ｎａｒｉｔａ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６９：１９０４−１９１
１（１９９７））の手順に従って125Ｉでヨウ素化される。125Ｉ−Ａβ（５ｎｍ
ｏｌ）を、抗ＬＲＰ−Ａβ、活性化していないα2Ｍ、活性化していないα2Ｍ−
２、メチルアミンもしくはトリプシンで活性化したα2Ｍ、またはメチルアミン
もしくはトリプシンで活性化したα2Ｍ−２とともに別々にインキュベートする
。１０倍モル過剰のＡβを使用して、そしてサンプルを２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ ７．４中、３７℃で２時間インキュベート
する。125Ｉ−Ａβのみを含むコントロールもまた、インキュベートする。抗Ｌ
ＲＰ−Ａβ／125Ｉ−Ａβ、α2Ｍ／125Ｉ−Ａβ、およびα2Ｍ−２／125Ｉ−Ａ
β複合体を、ＦＰＬＣ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の制御下でＳｕｐｅｒｏｓｅ ６
ゲル濾過カラム（０．７×２０ｃｍ）を使用して非結合125Ｉ−Ａβから分離す
る。２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４を使用し
てカラムを平衡化し、そしてサンプルを溶出する。０．０５ｍｌ／分の流速を用
いて、２００μＬの画分を収集する。１０００ｋＤ〜４ｋＤの範囲の分子量マー
カーを用いてカラムを標準化して、抗ＬＲＰ−Ａβ／125Ｉ−Ａβ、α2Ｍ／125
Ｉ−Ａβ、およびα2Ｍ−２／125Ｉ−Ａβの画分を、γカウンターで計数し、12 5 Ｉ−Ａβの溶出プロフィールを決定する。抗ＬＲＰ−Ａβが125Ｉ−Ａβを結合
した場合、125Ｉ−Ａβはγカウンターによって２つのピークで検出され、１つ
は抗ＬＲＰ−Ａβ／125Ｉ−Ａβ複合体の分子量（この抗ＬＲＰ−Ａβペプチド
について約８〜９ｋＤ）に一致し、そして１つは125Ｉ−Ａβ（４．５ｋＤ）の
分子量に一致する。
フィーおよびイムノブロッティングによって最初に決定される。これらの方法の
両方が、野生型α2Ｍおよび改変体α2ＭへのＡβの結合を研究する他の研究者に
よって首尾よく使用されてきた（Ｎａｒｉｔａ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅ
ｍ．６９：１９０４−１９１１（１９９７）；Ｄｕ，Ｙ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃ
ｈｅｍ．６９：２９９−３０５（１９９７））。Ａβ１−４２は、Ｎａｒｉｔａ
ら（Ｎａｒｉｔａ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６９：１９０４−１９１
１（１９９７））の手順に従って125Ｉでヨウ素化される。125Ｉ−Ａβ（５ｎｍ
ｏｌ）を、抗ＬＲＰ−Ａβ、活性化していないα2Ｍ、活性化していないα2Ｍ−
２、メチルアミンもしくはトリプシンで活性化したα2Ｍ、またはメチルアミン
もしくはトリプシンで活性化したα2Ｍ−２とともに別々にインキュベートする
。１０倍モル過剰のＡβを使用して、そしてサンプルを２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ ７．４中、３７℃で２時間インキュベート
する。125Ｉ−Ａβのみを含むコントロールもまた、インキュベートする。抗Ｌ
ＲＰ−Ａβ／125Ｉ−Ａβ、α2Ｍ／125Ｉ−Ａβ、およびα2Ｍ−２／125Ｉ−Ａ
β複合体を、ＦＰＬＣ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の制御下でＳｕｐｅｒｏｓｅ ６
ゲル濾過カラム（０．７×２０ｃｍ）を使用して非結合125Ｉ−Ａβから分離す
る。２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４を使用し
てカラムを平衡化し、そしてサンプルを溶出する。０．０５ｍｌ／分の流速を用
いて、２００μＬの画分を収集する。１０００ｋＤ〜４ｋＤの範囲の分子量マー
カーを用いてカラムを標準化して、抗ＬＲＰ−Ａβ／125Ｉ−Ａβ、α2Ｍ／125
Ｉ−Ａβ、およびα2Ｍ−２／125Ｉ−Ａβの画分を、γカウンターで計数し、12 5 Ｉ−Ａβの溶出プロフィールを決定する。抗ＬＲＰ−Ａβが125Ｉ−Ａβを結合
した場合、125Ｉ−Ａβはγカウンターによって２つのピークで検出され、１つ
は抗ＬＲＰ−Ａβ／125Ｉ−Ａβ複合体の分子量（この抗ＬＲＰ−Ａβペプチド
について約８〜９ｋＤ）に一致し、そして１つは125Ｉ−Ａβ（４．５ｋＤ）の
分子量に一致する。
【０１３８】 ヨウ素化されたＡβは、擬陽性の結合または陰性の結合をもたらし得ることは
なさそうであるが、しかし、可能性はある。従って、イムノブロッティング実験
を行って、ゲル濾過クロマトグラフィー実験の結果を確認する（Ｎａｒｉｔａ，
Ｍ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６９：１９０４−１９１１（１９９７）；Ｄ
ｕ，Ｙ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６９：２９９−３０５（１９９７））。
非標識のＡβを、上記に記載した同一の条件で、抗ＬＲＰ−Ａβ、活性化してい
ないα2Ｍ、活性化していないα2Ｍ−２、メチルアミンもしくはトリプシンで活
性化したα2Ｍ、またはメチルアミンもしくはトリプシンで活性化したα2Ｍ−２
とともに別々にインキュベートする。サンプルを、５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で非
還元条件下で電気泳動し、そしてポリビニルジフルオリドニトロセルロースメン
ブレン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ）に転写する。これらのメンブレンを、ポリク
ローナル抗α2Ｍ ＩｇＧまたはモノクローナル抗Ａβ ＩｇＧで探索する。免
疫反応性タンパク質を、ＥＣＬおよびペルオキシダーゼ結合体化抗ウサギＩｇＧ
を使用して可視化する。分子量マーカーを使用して、対応するレーンについての
抗α2Ｍブロットおよび抗Ａβブロット由来の免疫反応性タンパク質が同じ移動
度を示すかどうかを決定する。免疫反応性タンパク質が同じ移動度を示すならば
、Ａβが抗ＬＲＰ−Ａβに結合することが結論付けられる。
なさそうであるが、しかし、可能性はある。従って、イムノブロッティング実験
を行って、ゲル濾過クロマトグラフィー実験の結果を確認する（Ｎａｒｉｔａ，
Ｍ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６９：１９０４−１９１１（１９９７）；Ｄ
ｕ，Ｙ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６９：２９９−３０５（１９９７））。
非標識のＡβを、上記に記載した同一の条件で、抗ＬＲＰ−Ａβ、活性化してい
ないα2Ｍ、活性化していないα2Ｍ−２、メチルアミンもしくはトリプシンで活
性化したα2Ｍ、またはメチルアミンもしくはトリプシンで活性化したα2Ｍ−２
とともに別々にインキュベートする。サンプルを、５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で非
還元条件下で電気泳動し、そしてポリビニルジフルオリドニトロセルロースメン
ブレン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ）に転写する。これらのメンブレンを、ポリク
ローナル抗α2Ｍ ＩｇＧまたはモノクローナル抗Ａβ ＩｇＧで探索する。免
疫反応性タンパク質を、ＥＣＬおよびペルオキシダーゼ結合体化抗ウサギＩｇＧ
を使用して可視化する。分子量マーカーを使用して、対応するレーンについての
抗α2Ｍブロットおよび抗Ａβブロット由来の免疫反応性タンパク質が同じ移動
度を示すかどうかを決定する。免疫反応性タンパク質が同じ移動度を示すならば
、Ａβが抗ＬＲＰ−Ａβに結合することが結論付けられる。
【０１３９】 （エンドサイトーシス）抗ＬＲＰ−Ａβ／Ａβ複合体がＬＲＰ媒介性エンドサ
イトーシスおよび引き続く分解を受ける能力を、細胞培養実験において決定する
。内部移行するかまたは細胞によって分解される放射性リガンドの量は、以前に
記載されている（Ｋｏｕｎｎａｓ，Ｍ．Ｚ．ら、Ｃｅｌｌ ８２：３３１−３４
０（１９９５）；Ｋｏｕｎｎａｓ，Ｍ．Ｚ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７
０：９３０７−９３１２（１９９５））。マウス胚線維芽細胞（これは、ＬＲＰ
を発現する細胞である）を、ウェルあたり２×１０5細胞の密度まで１２ウェル
プレートにプレーティングし、そして５％ＣＯ2中で３７℃、１８時間増殖させ
る。細胞を、１％ Ｎｕｔｒｉｄｏｍａ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅ
ｉｍ）、ペニシリン／ストレプトマイシン、１．５％ウシ血清アルブミン中で１
時間インキュベートし、その後、抗ＬＲＰ−Ａβ、活性化していないα2Ｍ、活
性化していないα2Ｍ−２、メチルアミンもしくはトリプシンで活性化したα2Ｍ
、またはメチルアミンもしくはトリプシンで活性化したα2Ｍ−２の存在下また
は非存在下で、ＲＡＰ（４００ｎＭ）の存在下または非存在下で、125Ｉ−Ａβ
を添加する。ＬＲＰによる抗ＬＲＰ−Ａβ／125Ｉ−Ａβエンドサイトーシスを
評価するために、クロロキン（０．１ｍＭ）を、抗ＬＲＰ−Ａβ／125Ｉ−Ａβ
（４ｎＭ）と同時に添加して、125Ｉ−Ａβのリソソームによる分解を阻害する
（Ｋｏｕｎｎａｓ，Ｍ．Ｚ．ら、Ｃｅｌｌ ８２：３３１−３４０（１９９５）
）。
イトーシスおよび引き続く分解を受ける能力を、細胞培養実験において決定する
。内部移行するかまたは細胞によって分解される放射性リガンドの量は、以前に
記載されている（Ｋｏｕｎｎａｓ，Ｍ．Ｚ．ら、Ｃｅｌｌ ８２：３３１−３４
０（１９９５）；Ｋｏｕｎｎａｓ，Ｍ．Ｚ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７
０：９３０７−９３１２（１９９５））。マウス胚線維芽細胞（これは、ＬＲＰ
を発現する細胞である）を、ウェルあたり２×１０5細胞の密度まで１２ウェル
プレートにプレーティングし、そして５％ＣＯ2中で３７℃、１８時間増殖させ
る。細胞を、１％ Ｎｕｔｒｉｄｏｍａ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅ
ｉｍ）、ペニシリン／ストレプトマイシン、１．５％ウシ血清アルブミン中で１
時間インキュベートし、その後、抗ＬＲＰ−Ａβ、活性化していないα2Ｍ、活
性化していないα2Ｍ−２、メチルアミンもしくはトリプシンで活性化したα2Ｍ
、またはメチルアミンもしくはトリプシンで活性化したα2Ｍ−２の存在下また
は非存在下で、ＲＡＰ（４００ｎＭ）の存在下または非存在下で、125Ｉ−Ａβ
を添加する。ＬＲＰによる抗ＬＲＰ−Ａβ／125Ｉ−Ａβエンドサイトーシスを
評価するために、クロロキン（０．１ｍＭ）を、抗ＬＲＰ−Ａβ／125Ｉ−Ａβ
（４ｎＭ）と同時に添加して、125Ｉ−Ａβのリソソームによる分解を阻害する
（Ｋｏｕｎｎａｓ，Ｍ．Ｚ．ら、Ｃｅｌｌ ８２：３３１−３４０（１９９５）
）。
【０１４０】 抗ＬＲＰ−Ａβ／125Ｉ−Ａβとの１８時間のインキュベーション後、細胞を
リン酸緩衝化生理食塩水で洗浄し、そしてトリプシン−ＥＤＴＡ、プロテイナー
ゼＫ溶液で処理する。表面結合物質を、この処理によって放出された放射性リガ
ンドの量として規定し、そして内在化したリガンドの量を、処理後の細胞ペレッ
トと結合して残っている放射能の量として規定する。
リン酸緩衝化生理食塩水で洗浄し、そしてトリプシン−ＥＤＴＡ、プロテイナー
ゼＫ溶液で処理する。表面結合物質を、この処理によって放出された放射性リガ
ンドの量として規定し、そして内在化したリガンドの量を、処理後の細胞ペレッ
トと結合して残っている放射能の量として規定する。
【０１４１】 活性化したα2Ｍ／125Ｉ−Ａβは、ポジティブコンロトロールとして働く。記
載した条件下で、４〜８ｆｍｏｌｅ／１０4細胞より多い活性化したα2Ｍ／125
Ｉ−Ａβがインキュベーションの１８時間後に内在化されるはずである（Ｋｏｕ
ｎｎａｓ，Ｍ．Ｚ．ら、Ｃｅｌｌ ８２：３３１−３４０（１９９５））。活性
化していないα2Ｍ／125Ｉ−Ａβはネガティブコントロールとして働く。なぜな
ら、α2Ｍは、ＬＲＰによって認識されるトリプシンまたはメチルアミンによっ
て活性化されなければならないからである。抗ＬＲＰ−Ａβ／125Ｉ−Ａβの量
が２〜４ｆｍｏｌｅ／１０4細胞よりも多い場合には、抗ＬＲＰ−Ａβ／125Ｉ−
ＡβはＬＲＰ媒介性エンドサイトーシスを受ける能力を有すると結論付けられ得
る。活性化していないα2Ｍ／125Ｉ−ＡβおよびＲＡＰの存在下で活性化したα 2 Ｍ／125Ｉ−Ａβは内在化されないのが当然であり、従って、わずか２〜４ｆｍ
ｏｌｅ／１０4細胞が内在化されるはずである（Ｋｏｕｎｎａｓ，Ｍ．Ｚ．ら、
Ｃｅｌｌ ８２：３３１−３４０（１９９５））。抗ＬＲＰ−Ａβ／125Ｉ−Ａ
β複合体の内在化は、抗ＬＲＰ−Ａβ／125Ｉ−Ａβ（ＲＡＰの存在下および非
存在下で）および活性化されていないα2Ｍ／125Ｉ−Ａβが細胞ペレットに付随
する放射能と同じ量を示す場合に、破壊されたと見なされる。
載した条件下で、４〜８ｆｍｏｌｅ／１０4細胞より多い活性化したα2Ｍ／125
Ｉ−Ａβがインキュベーションの１８時間後に内在化されるはずである（Ｋｏｕ
ｎｎａｓ，Ｍ．Ｚ．ら、Ｃｅｌｌ ８２：３３１−３４０（１９９５））。活性
化していないα2Ｍ／125Ｉ−Ａβはネガティブコントロールとして働く。なぜな
ら、α2Ｍは、ＬＲＰによって認識されるトリプシンまたはメチルアミンによっ
て活性化されなければならないからである。抗ＬＲＰ−Ａβ／125Ｉ−Ａβの量
が２〜４ｆｍｏｌｅ／１０4細胞よりも多い場合には、抗ＬＲＰ−Ａβ／125Ｉ−
ＡβはＬＲＰ媒介性エンドサイトーシスを受ける能力を有すると結論付けられ得
る。活性化していないα2Ｍ／125Ｉ−ＡβおよびＲＡＰの存在下で活性化したα 2 Ｍ／125Ｉ−Ａβは内在化されないのが当然であり、従って、わずか２〜４ｆｍ
ｏｌｅ／１０4細胞が内在化されるはずである（Ｋｏｕｎｎａｓ，Ｍ．Ｚ．ら、
Ｃｅｌｌ ８２：３３１−３４０（１９９５））。抗ＬＲＰ−Ａβ／125Ｉ−Ａ
β複合体の内在化は、抗ＬＲＰ−Ａβ／125Ｉ−Ａβ（ＲＡＰの存在下および非
存在下で）および活性化されていないα2Ｍ／125Ｉ−Ａβが細胞ペレットに付随
する放射能と同じ量を示す場合に、破壊されたと見なされる。
【０１４２】 （分解）エンドサイトーシスを試験するための上記の実験を、クロロキンなし
で反復する。１０％トリクロロ酢酸中で可溶性である細胞培養培地中に現れる放
射能を、分解した125Ｉ−Ａβを表すために採用する（Ｋｏｕｎｎａｓ，Ｍ．Ｚ
．ら、Ｃｅｌｌ ８２：３３１−３４０（１９９５）；Ｎａｒｉｔａ．Ｍ．ら、
Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６９：１９０４−１９１１（１９９７））。全リガン
ド分解を、細胞を欠くコントロールウェル中で起こる分解の量について補正する
。遊離の125Ｉ−Ａβは、ＬＲＰ非依存性の様式で分解され得るので、分解を、1 25 Ｉ−Ａβを有する抗ＬＲＰ−Ａβおよびα2Ｍ複合体ならびにＲＡＰの存在下
および非存在下で遊離の125Ｉ−Ａβについて測定する。上記と同じポジティブ
コントロールおよびネガティブコントロールを使用して、抗ＬＲＰ−Ａβ／125
Ｉ−Ａβ複合体について少なくとも３０％、ＲＡＰがＴＣＡ可溶性放射能の量を
減少しない場合、抗ＬＲＰ−Ａβの125Ｉ−Ａβリガンドが分解されていないと
いうことが結論付けられ得る。
で反復する。１０％トリクロロ酢酸中で可溶性である細胞培養培地中に現れる放
射能を、分解した125Ｉ−Ａβを表すために採用する（Ｋｏｕｎｎａｓ，Ｍ．Ｚ
．ら、Ｃｅｌｌ ８２：３３１−３４０（１９９５）；Ｎａｒｉｔａ．Ｍ．ら、
Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６９：１９０４−１９１１（１９９７））。全リガン
ド分解を、細胞を欠くコントロールウェル中で起こる分解の量について補正する
。遊離の125Ｉ−Ａβは、ＬＲＰ非依存性の様式で分解され得るので、分解を、1 25 Ｉ−Ａβを有する抗ＬＲＰ−Ａβおよびα2Ｍ複合体ならびにＲＡＰの存在下
および非存在下で遊離の125Ｉ−Ａβについて測定する。上記と同じポジティブ
コントロールおよびネガティブコントロールを使用して、抗ＬＲＰ−Ａβ／125
Ｉ−Ａβ複合体について少なくとも３０％、ＲＡＰがＴＣＡ可溶性放射能の量を
減少しない場合、抗ＬＲＰ−Ａβの125Ｉ−Ａβリガンドが分解されていないと
いうことが結論付けられ得る。
【０１４３】 抗ＬＲＰ−Ａβペプチドは、立体的な制約により、Ａβ結合および分解を促進
しないかもしれない。抗ＬＲＰ−ＡβポリペプチドがＡβ結合および分解を促進
しない場合、別のペプチドを、Ａβ結合領域とＬＲＰ結合領域との間にペンタグ
リシンリンカーを用いて合成して、両方の標的に同時に結合するために必要とさ
れる可撓性を提供する。リンカーを有するこの抗ＬＲＰ−Ａβを、上記のように
、Ａβ結合、ＬＲＰ媒介性エンドサイトーシス、および分解について試験する。
この抗ＬＲＰ−ＡβがＡβおよびＬＲＰ結合のために提供されない場合、スリー
ハイブリッド系を使用して、結合を再最適化し、そしてＡβとＬＲＰとの両方を
結合する能力を有する抗ＬＲＰ−Ａβをスクリーニングする。
しないかもしれない。抗ＬＲＰ−ＡβポリペプチドがＡβ結合および分解を促進
しない場合、別のペプチドを、Ａβ結合領域とＬＲＰ結合領域との間にペンタグ
リシンリンカーを用いて合成して、両方の標的に同時に結合するために必要とさ
れる可撓性を提供する。リンカーを有するこの抗ＬＲＰ−Ａβを、上記のように
、Ａβ結合、ＬＲＰ媒介性エンドサイトーシス、および分解について試験する。
この抗ＬＲＰ−ＡβがＡβおよびＬＲＰ結合のために提供されない場合、スリー
ハイブリッド系を使用して、結合を再最適化し、そしてＡβとＬＲＰとの両方を
結合する能力を有する抗ＬＲＰ−Ａβをスクリーニングする。
【０１４４】 治療におけるペプチドの使用は、血液脳関門を横切る輸送および免疫応答の産
生の２つの問題と関連する。これらの問題は、ペプチドの長さを短くすることに
よって最小化され得る。従って、抗ＬＲＰ−Ａβペプチドを最適化する場合、よ
り短い結合ドメインがより長いドメインよりも好まれ得、ここで結合の能力は、
同等に効果的である。
生の２つの問題と関連する。これらの問題は、ペプチドの長さを短くすることに
よって最小化され得る。従って、抗ＬＲＰ−Ａβペプチドを最適化する場合、よ
り短い結合ドメインがより長いドメインよりも好まれ得、ここで結合の能力は、
同等に効果的である。
【０１４５】 （酵母スリーハイブリッド系）酵母スリーハイブリッド系は、三成分タンパク
質複合体形成を検出するための一般的方法である（図７）（Ｔｉｒｏｄｅ，Ｆ．
ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２２９９５−２２９９９（１９９７）；
Ｏｓｂｏｒｎｅ，Ｍ．Ａ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：１４７４−
１４７８（１９９５）；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．およびＬａｕｔａｒ，Ｓ．、Ａｎａｌ
．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４２：６８−７２（１９９６）；Ｌｉｃｉｔｒａ，Ｅ．Ｊ
．およびＬｉｕ，Ｊ．Ｏ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．
Ａ．９３：１２８１７−１２８２１（１９９６））。この系において、酵母の増
殖は、「ベイト」が「フック」と「フィッシュ」の両方を認識する場合にのみ起
こる（図７）。この場合には、「フック」はＡβをコードするＤＮＡから構築さ
れ（Ｂａｌｅｓ，Ｋ．Ｒ．ら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１７：２６４（１９９７）
）、これは、ＴＲＰ１エピソームベクターであるｐＬｅｘ９−３Ｈ中でＬｅｘＡ
ＤＮＡ結合タンパク質のコード配列に融合される（Ｔｉｒｏｄｅ，Ｆ．ら、Ｊ
．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２２９９５−２２９９９（１９９７））。「フ
ィッシュ」は、ＬＲＰの５１５ｋＤの細胞外ドメインのコード配列から構築され
、これは、ＬＥＵ２エピソームベクターであるｐＶＰ１６中でＢ４２活性化ドメ
インに融合される（Ｔｉｒｏｄｅ，Ｆ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：
２２９９５−２２９９９（１９９７））。「ベイト」は、ｐＬｅｘ９−３Ｈベク
ター中の抗ＬＲＰ−ＡβをコードするＤＮＡであり、抗ＬＲＰ−Ａβの発現は、
メチオニンによって抑制される。これらのベクターを、Ｌ４０酵母株に形質転換
する。Ｌｅｕ２レポーター遺伝子の転写は、Ａβが融合したＤＮＡ結合ドメイン
がＬＲＰに融合した転写活性化ドメインに対して近位に置かれる場合にのみ起こ
る。
質複合体形成を検出するための一般的方法である（図７）（Ｔｉｒｏｄｅ，Ｆ．
ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２２９９５−２２９９９（１９９７）；
Ｏｓｂｏｒｎｅ，Ｍ．Ａ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：１４７４−
１４７８（１９９５）；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．およびＬａｕｔａｒ，Ｓ．、Ａｎａｌ
．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４２：６８−７２（１９９６）；Ｌｉｃｉｔｒａ，Ｅ．Ｊ
．およびＬｉｕ，Ｊ．Ｏ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．
Ａ．９３：１２８１７−１２８２１（１９９６））。この系において、酵母の増
殖は、「ベイト」が「フック」と「フィッシュ」の両方を認識する場合にのみ起
こる（図７）。この場合には、「フック」はＡβをコードするＤＮＡから構築さ
れ（Ｂａｌｅｓ，Ｋ．Ｒ．ら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１７：２６４（１９９７）
）、これは、ＴＲＰ１エピソームベクターであるｐＬｅｘ９−３Ｈ中でＬｅｘＡ
ＤＮＡ結合タンパク質のコード配列に融合される（Ｔｉｒｏｄｅ，Ｆ．ら、Ｊ
．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２２９９５−２２９９９（１９９７））。「フ
ィッシュ」は、ＬＲＰの５１５ｋＤの細胞外ドメインのコード配列から構築され
、これは、ＬＥＵ２エピソームベクターであるｐＶＰ１６中でＢ４２活性化ドメ
インに融合される（Ｔｉｒｏｄｅ，Ｆ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：
２２９９５−２２９９９（１９９７））。「ベイト」は、ｐＬｅｘ９−３Ｈベク
ター中の抗ＬＲＰ−ＡβをコードするＤＮＡであり、抗ＬＲＰ−Ａβの発現は、
メチオニンによって抑制される。これらのベクターを、Ｌ４０酵母株に形質転換
する。Ｌｅｕ２レポーター遺伝子の転写は、Ａβが融合したＤＮＡ結合ドメイン
がＬＲＰに融合した転写活性化ドメインに対して近位に置かれる場合にのみ起こ
る。
【０１４６】 Ａβ／ＬＲＰ結合融合ペプチドは、レポーター遺伝子の転写を促進するはずで
ある。抗ＬＲＰ−Ａβと、ＡβおよびＬＲＰ（５１５ｋＤ）との間の相互作用は
、レポーター遺伝子の発現（酵母の増殖）が、Ａβ−ＬｅｘＡ、ＬＲＰ（５１５
ｋＤ）−Ｂ４２、および抗ＬＲＰ−Ａβが発現されるときに起こる場合のみにポ
ジティブであるとみなされる。この構築物は、過去において首尾よく使用されて
きたので、Ａβ−ＬｅｘＡの発現がレポーターの転写の活性化を引き起こすよう
ではない。ＬＲＰ（５１５ｋＤ）−Ｂ４２発現単独がレポーターの転写を引き起
こすようでもなく、ＬＲＰ（５１５ｋＤ）はＤＮＡに結合することが知られてい
ない。Ａβ−ＬｅｘＡとＬＲＰ（５１５ｋＤ）−Ｂ４２との相互作用は、レポー
ターの転写を引き起こし、そしてＡβの親のタンパク質ＡＰＰはＬＲＰと相互作
用することが知られている。しかし、ＬＲＰとＡＰＰとの間の相互作用は、ＡＰ
Ｐ中のＡβの位置から遠く離れているＫｕｎｉｔｚプロテアーゼ阻害ドメインを
介して起こる（Ｋｏｕｎｎａｓ，Ｍ．Ｚ．ら、Ｃｅｌｌ ８２：３３１−３４０
（１９９５））。さらに生化学的証拠は、ＬＲＰがＡβを認識しないことを示唆
する（Ｎａｒｉｔａ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６９：１９０４−１９
１１（１９９７））。Ａβ−ＬｅｘＡおよびＬＲＰ（５１５ｋＤ）−Ｂ４２含有
プラスミドのＥＧＹ４８への形質転換およびロイシンを欠く培地上での増殖をモ
ニタリングすることを実行して、Ａβ−ＬｅｘＡおよびＬＲＰ（５１５ｋＤ）−
Ｂ４２が相互作用しないことを保証する。ポジティブコントロールとして、完全
なα2ＭモノマーをコードするＤＮＡ配列およびα2Ｍの残基１２０２−１４５１
をコードする配列を、抗ＬＲＰ−Ａβの代わりにｐＬｅｘ９−３Ｈに別々にクロ
ーニングする。α2ＭのＣ末端フラグメントは、全長Ａβ結合ドメインおよびＬ
ＲＰ結合ドメイン（α2Ｍの残基１２０２−１４５１）を含み、そしてこれは、
モノマーとともに、レポーター遺伝子の転写を生じるはずである。
ある。抗ＬＲＰ−Ａβと、ＡβおよびＬＲＰ（５１５ｋＤ）との間の相互作用は
、レポーター遺伝子の発現（酵母の増殖）が、Ａβ−ＬｅｘＡ、ＬＲＰ（５１５
ｋＤ）−Ｂ４２、および抗ＬＲＰ−Ａβが発現されるときに起こる場合のみにポ
ジティブであるとみなされる。この構築物は、過去において首尾よく使用されて
きたので、Ａβ−ＬｅｘＡの発現がレポーターの転写の活性化を引き起こすよう
ではない。ＬＲＰ（５１５ｋＤ）−Ｂ４２発現単独がレポーターの転写を引き起
こすようでもなく、ＬＲＰ（５１５ｋＤ）はＤＮＡに結合することが知られてい
ない。Ａβ−ＬｅｘＡとＬＲＰ（５１５ｋＤ）−Ｂ４２との相互作用は、レポー
ターの転写を引き起こし、そしてＡβの親のタンパク質ＡＰＰはＬＲＰと相互作
用することが知られている。しかし、ＬＲＰとＡＰＰとの間の相互作用は、ＡＰ
Ｐ中のＡβの位置から遠く離れているＫｕｎｉｔｚプロテアーゼ阻害ドメインを
介して起こる（Ｋｏｕｎｎａｓ，Ｍ．Ｚ．ら、Ｃｅｌｌ ８２：３３１−３４０
（１９９５））。さらに生化学的証拠は、ＬＲＰがＡβを認識しないことを示唆
する（Ｎａｒｉｔａ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６９：１９０４−１９
１１（１９９７））。Ａβ−ＬｅｘＡおよびＬＲＰ（５１５ｋＤ）−Ｂ４２含有
プラスミドのＥＧＹ４８への形質転換およびロイシンを欠く培地上での増殖をモ
ニタリングすることを実行して、Ａβ−ＬｅｘＡおよびＬＲＰ（５１５ｋＤ）−
Ｂ４２が相互作用しないことを保証する。ポジティブコントロールとして、完全
なα2ＭモノマーをコードするＤＮＡ配列およびα2Ｍの残基１２０２−１４５１
をコードする配列を、抗ＬＲＰ−Ａβの代わりにｐＬｅｘ９−３Ｈに別々にクロ
ーニングする。α2ＭのＣ末端フラグメントは、全長Ａβ結合ドメインおよびＬ
ＲＰ結合ドメイン（α2Ｍの残基１２０２−１４５１）を含み、そしてこれは、
モノマーとともに、レポーター遺伝子の転写を生じるはずである。
【０１４７】 抗ＬＲＰ−Ａβ、Ａβ−ＬｅｘＡ、およびＬＲＰ（５１５ｋＤ）−Ｂ４２の発
現がレポーターの転写を活性化しないならば、抗ＬＲＰ−Ａβの二成分性の相互
作用の各々は、伝統的なツーハイブリッド系で試験される。すなわち、抗ＬＲＰ
−Ａβ−Ｂ４２およびＡβ−ＬｅｘＡの同時発現を、抗ＬＲＰ−Ａβ−Ｂ４２お
よびＬＲＰ（５１５ｋＤ）−ＬｅｘＡと同様に使用して、抗ＬＲＰ−ＡβがＡβ
−ＬｅｘＡおよびＬＲＰ（５１５ｋＤ）−ＬｅｘＡと個々に相互作用する能力を
評価する。抗ＬＲＰ−Ａβが両方の標的と個々に相互作用するならば、以下の１
つまたはすべてを実行する：（ｉ）５残基のグリシンリンカーを、Ａβ結合ドメ
インとＬＲＰ結合ドメインとの間に付加し、２つの結合ドメイン間の可撓性を可
能にする、（ｉｉ）Ａβ−ＬｅｘＡおよびＬＲＰ（５１５ｋＤ）−Ｂ４２融合パ
ートナーを切り換えてＬＲＰ（５１５ｋＤ）−ＬｅｘＡおよびＡβ−Ｂ４２を生
じる、および（ｉｉｉ）抗ＬＲＰ−Ａβの極性を切り換えて、その結果、ＬＲＰ
結合ドメインがＡβ結合ドメインに対してＮ末端にある。抗ＬＲＰ−Ａβが、１
つの標的と相互作用するか、またはいずれの標的とも相互作用しないならば、結
合は、両方の標的に対する結合についてランダム変異誘発およびスリーハイブリ
ッドスクリーニングによる選択を使用して再最適化される。抗ＬＲＰ−Ａβの非
結合領域を、タンパク質進化技術、誤りがちなＰＣＲ、およびＤＮＡシャッフリ
ング（Ｂｕｃｈｈｏｌｚ，Ｆ．ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：６５
７−６６２（１９９８））に供し、続いて標的タンパク質に結合する構築物の選
択を行う。これを、標的結合が達成されるまで繰り返す。
現がレポーターの転写を活性化しないならば、抗ＬＲＰ−Ａβの二成分性の相互
作用の各々は、伝統的なツーハイブリッド系で試験される。すなわち、抗ＬＲＰ
−Ａβ−Ｂ４２およびＡβ−ＬｅｘＡの同時発現を、抗ＬＲＰ−Ａβ−Ｂ４２お
よびＬＲＰ（５１５ｋＤ）−ＬｅｘＡと同様に使用して、抗ＬＲＰ−ＡβがＡβ
−ＬｅｘＡおよびＬＲＰ（５１５ｋＤ）−ＬｅｘＡと個々に相互作用する能力を
評価する。抗ＬＲＰ−Ａβが両方の標的と個々に相互作用するならば、以下の１
つまたはすべてを実行する：（ｉ）５残基のグリシンリンカーを、Ａβ結合ドメ
インとＬＲＰ結合ドメインとの間に付加し、２つの結合ドメイン間の可撓性を可
能にする、（ｉｉ）Ａβ−ＬｅｘＡおよびＬＲＰ（５１５ｋＤ）−Ｂ４２融合パ
ートナーを切り換えてＬＲＰ（５１５ｋＤ）−ＬｅｘＡおよびＡβ−Ｂ４２を生
じる、および（ｉｉｉ）抗ＬＲＰ−Ａβの極性を切り換えて、その結果、ＬＲＰ
結合ドメインがＡβ結合ドメインに対してＮ末端にある。抗ＬＲＰ−Ａβが、１
つの標的と相互作用するか、またはいずれの標的とも相互作用しないならば、結
合は、両方の標的に対する結合についてランダム変異誘発およびスリーハイブリ
ッドスクリーニングによる選択を使用して再最適化される。抗ＬＲＰ−Ａβの非
結合領域を、タンパク質進化技術、誤りがちなＰＣＲ、およびＤＮＡシャッフリ
ング（Ｂｕｃｈｈｏｌｚ，Ｆ．ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：６５
７−６６２（１９９８））に供し、続いて標的タンパク質に結合する構築物の選
択を行う。これを、標的結合が達成されるまで繰り返す。
【０１４８】 医学、遺伝学、分子生物学、生化学、薬学、および／または関連する分野の当
業者に明白である、本発明を実行するための上記に記載の様式の改変は、上記の
特許請求の範囲の範囲内にあることが意図される。
業者に明白である、本発明を実行するための上記に記載の様式の改変は、上記の
特許請求の範囲の範囲内にあることが意図される。
【０１４９】 本明細書中で言及されるすべての刊行物および特許は、本発明が属する分野の
当業者のレベルを示す。言及されたすべての刊行物および特許は、各々の個々の
刊行物または特許出願が具体的にかつ個々に参考として援用されることが示され
るかのように同程度に、本明細書中に参考として援用される。
当業者のレベルを示す。言及されたすべての刊行物および特許は、各々の個々の
刊行物または特許出願が具体的にかつ個々に参考として援用されることが示され
るかのように同程度に、本明細書中に参考として援用される。
【０１５０】 前述の発明は、理解の明確さの目的のために例証および例示によっていくぶん
詳細に記載されてきたが、特定の変更および改変が添付の特許請求の範囲内で実
施され得ることは明白である。
詳細に記載されてきたが、特定の変更および改変が添付の特許請求の範囲内で実
施され得ることは明白である。
【配列表】
【図１】 図１は、ＲＴ−ＰＣＲによって入手されそしてポリアクリルアミドゲルで分離
した、野生型Ａ２Ｍ（（Ｂｌａｃｋｅｒ，Ｄ．ら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９：
３５７−３６０（１９９８））を発現するかまたはＡ２Ｍ−２欠失対立遺伝子に
ついてヘテロ接合であるかのいずれかのヒト神経膠腫細胞株由来のＡ２Ｍからの 33 Ｐ標識α２Ｍ ｍＲＮＡ転写物の結果を示すオートラジオグラフである。Ａ２
Ｍ−１／２株を、「２」と標記されるレーンとして示し、Ａ２Ｍ−１／１株を「
１」として標記されるレーンとして示す。
した、野生型Ａ２Ｍ（（Ｂｌａｃｋｅｒ，Ｄ．ら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９：
３５７−３６０（１９９８））を発現するかまたはＡ２Ｍ−２欠失対立遺伝子に
ついてヘテロ接合であるかのいずれかのヒト神経膠腫細胞株由来のＡ２Ｍからの 33 Ｐ標識α２Ｍ ｍＲＮＡ転写物の結果を示すオートラジオグラフである。Ａ２
Ｍ−１／２株を、「２」と標記されるレーンとして示し、Ａ２Ｍ−１／１株を「
１」として標記されるレーンとして示す。
【図２】 図２は、Ａ２Ｍ−２対立遺伝子を発現するヒト神経膠腫細胞株によって生成さ
れる、変化したＡ２Ｍ転写物のうちの４つの模式図である。
れる、変化したＡ２Ｍ転写物のうちの４つの模式図である。
【図３】 図３は、抗α2Ｍ抗体でプロービングした、エキソン１８の後ろで短縮化した
α2ＭでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞からの培地および抽出物のイムノブロ
ットの写真である。抗α２Ｍ抗体は、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞中の短
縮化α2Ｍを検出した。パネルＡ：細胞溶解物；パネルＢ：培地；（−）は、ト
ランスフェクトしていない細胞からのサンプルを示す；（ｗｔ）は、全長α2Ｍ
構築物でトランスフェクトした細胞からのサンプルを示す；（△）は、エキソン
１８の後ろで短縮化したα2Ｍ構築物でトランスフェクトした細胞からのサンプ
ルを示す；ｍ、ｄおよびｔは、ぞれぞれ、単量体、二量体および三量体の形態の
短縮化タンパク質を示す。これらの形態の野生型α2Ｍもまた、見られるが、顕
著ではない。
α2ＭでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞からの培地および抽出物のイムノブロ
ットの写真である。抗α２Ｍ抗体は、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞中の短
縮化α2Ｍを検出した。パネルＡ：細胞溶解物；パネルＢ：培地；（−）は、ト
ランスフェクトしていない細胞からのサンプルを示す；（ｗｔ）は、全長α2Ｍ
構築物でトランスフェクトした細胞からのサンプルを示す；（△）は、エキソン
１８の後ろで短縮化したα2Ｍ構築物でトランスフェクトした細胞からのサンプ
ルを示す；ｍ、ｄおよびｔは、ぞれぞれ、単量体、二量体および三量体の形態の
短縮化タンパク質を示す。これらの形態の野生型α2Ｍもまた、見られるが、顕
著ではない。
【図４】 図４は、抗α2Ｍ抗体でプロービングした、野生型細胞（Ａ２Ｍ−１）（１／
１と標記されるレーン）およびＡ２Ｍ−２欠失についてヘテロ接合である細胞（
１／２と標記されるレーン）由来の細胞溶解物からのイムノブロットの写真であ
る。（＋）と標記されたレーンは、全長α2ＭでトランスフェクトされたＣＨＯ
細胞由来の溶解物を示し、そして抗α2Ｍ抗体でプロービングされた。Ａ２Ｍ−
１細胞およびＡ２Ｍ−２細胞由来の培地（データは示さず）は、主に全長α2Ｍ
単量体を含んでいたが、Ａ２Ｍ−２細胞由来の培地には、少量の短縮化種もまた
観察され得る（データは示さず）。
１と標記されるレーン）およびＡ２Ｍ−２欠失についてヘテロ接合である細胞（
１／２と標記されるレーン）由来の細胞溶解物からのイムノブロットの写真であ
る。（＋）と標記されたレーンは、全長α2ＭでトランスフェクトされたＣＨＯ
細胞由来の溶解物を示し、そして抗α2Ｍ抗体でプロービングされた。Ａ２Ｍ−
１細胞およびＡ２Ｍ−２細胞由来の培地（データは示さず）は、主に全長α2Ｍ
単量体を含んでいたが、Ａ２Ｍ−２細胞由来の培地には、少量の短縮化種もまた
観察され得る（データは示さず）。
【図５】 図５は、プロテアーゼ（円中の文字Ｐによって表される）切断によって誘導さ
れた、α2Ｍのコンホメーション変化を示す。コンホメーション変化後のＬＲＰ
結合ドメイン（□によって表される）の露出に留意のこと。
れた、α2Ｍのコンホメーション変化を示す。コンホメーション変化後のＬＲＰ
結合ドメイン（□によって表される）の露出に留意のこと。
【図６】 図６は、抗ＬＲＰ−Ａβペプチドについての１つの可能なアミノ酸配列を示す
。
。
【図７】 図７は、ＡβおよびＬＲＰへの抗ＬＲＰ−Ａβペプチド結合を検出するための
酵母スリーハイブリッド系の模式図である。
酵母スリーハイブリッド系の模式図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 48/00 Ｃ０７Ｋ 14/47 ４Ｃ０８６ Ａ６１Ｐ 25/28 19/00 ４Ｃ０８７ Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 7/00 ４Ｈ０４５ 19/00 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 7/00 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 1/68 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 27/447 33/53 Ｚ 33/15 Ｃ１２Ｒ 1:91 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/53 Ｇ０１Ｎ 27/26 ３１５Ｋ //(Ｃ１２Ｑ 1/02 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 コバクス， ドラ エム． アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02110， ボストン， アパートメント 23エイチ， イースト インディア ロウ 65 (72)発明者 サウンダース， アレイスター ジェイ． アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02139， ケンブリッジ， ナンバー２， タフツ ストリート 35 Ｆターム(参考） 2G045 AA34 BB50 BB51 CB01 DA13 DA36 FA29 FB02 FB03 FB05 FB08 GC10 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 CA06 CA07 CA11 DA03 EA02 HA11 4B063 QA19 QA20 QQ08 QQ53 QR08 QR42 QR56 QS25 QS34 QX07 4B065 AA93X AA95X AB01 BA02 CA24 CA44 CA46 4C084 AA02 AA13 AA17 BA02 BA22 CA18 NA14 ZA16 4C086 AA01 AA02 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA16 4C087 AA01 AA02 BC83 CA12 NA14 ZA16 4H045 AA10 AA30 BA10 CA40 EA21 EA50 FA74
Claims (81)
- 【請求項１】 アルツハイマー病と闘うための治療剤であって、α2Ｍ機能
を置換もしくは補足し得るか、またはＡ２Ｍ−２の発現を抑制し得る、治療剤。 - 【請求項２】 Ａβ結合ドメインおよびＬＲＰ結合ドメインを含む、抗ＬＲ
Ｐ−Ａβ分子またはその薬学的に受容可能な塩。 - 【請求項３】 前記分子が、ペプチドである、請求項２に記載の抗ＬＲＰ−
Ａβ分子またはその薬学的に受容可能な塩。 - 【請求項４】 抗ＬＲＰ−Ａβペプチドであって、以下： （ａ）配列番号６の１０〜５０個連続する残基を含む、Ａβ結合ドメイン；お
よび （ｂ）残基１３６６〜１３９２を包含する、配列番号８の１０〜５０個連続す
る残基を含む、ＬＲＰ結合ドメイン、 を含む、抗ＬＲＰ−Ａβペプチドまたはその薬学的に受容可能な塩。 - 【請求項５】 抗ＬＲＰ−Ａβペプチドであって、以下： （ａ）配列番号６、配列番号１２、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２
０、配列番号２２、配列番号２４、および配列番号２６からなる群より選択され
るアミノ酸配列を有する、Ａβ結合ドメイン；および （ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を有する、ＬＲＰ結合ドメイン、 を含む、抗ＬＲＰ−Ａβペプチドまたはその薬学的に受容可能な塩。 - 【請求項６】 抗ＬＲＰ−Ａβペプチドであって、以下： （ａ）配列番号１２、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号
２２、配列番号２４、および配列番号２６からなる群より選択されるアミノ酸配
列を有する、Ａβ結合ドメイン；および （ｂ）配列番号８の１０〜５０個連続する残基を含む、ＬＲＰ結合ドメイン、
を含む、抗ＬＲＰ−Ａβペプチドまたはその薬学的に受容可能な塩。 - 【請求項７】 前記Ａβ結合ドメインが、前記ＬＲＰ結合ドメインにペプチ
ド結合によって結合されている、請求項４、５または６に記載の抗ＬＲＰ−Ａβ
ペプチド。 - 【請求項８】 前記Ａβ結合ドメインが、前記ＬＲＰ結合ドメインにリンカ
ーによって結合されている、請求項４、５または６に記載の抗ＬＲＰ−Ａβペプ
チド。 - 【請求項９】 前記リンカーが、ペプチド、またはポリエチレングリコール
からなる群より選択される、請求項８に記載の抗ＬＲＰ−Ａβペプチド。 - 【請求項１０】 前記リンカーが、１〜２０個のグリシン残基を含む、請求
項８に記載の抗ＬＲＰ−Ａβペプチド。 - 【請求項１１】 請求項４、５、または６の抗ＬＲＰ−Ａβペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドを含む、核酸。 - 【請求項１２】 配列番号１４の配列を有するポリペプチドを含む、抗ＬＲ
Ｐ−Ａβペプチドまたはその薬学的に受容可能な塩。 - 【請求項１３】 抗ＬＲＰ−Ａβペプチドであって、以下： （ａ）配列番号６、配列番号１２、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２
０、配列番号２２、配列番号２４、および配列番号２６からなる群より選択され
るアミノ酸配列を有する、Ａβ結合ドメイン； （ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を有する、ＬＲＰ結合ドメイン；および （ｃ）該Ａβ結合ドメインを、該ＬＲＰ結合ドメインに結合するリンカー を含む、抗ＬＲＰ−Ａβペプチド。 - 【請求項１４】 請求項１２または１３に記載の抗ＬＲＰ−Ａβペプチドを
コードするヌクレオチドを含む、核酸分子。 - 【請求項１５】 抗ＬＲＰ−Ａβペプチドをコードする核酸分子であって、
以下： （ａ）配列番号５の３０〜１５０個連続するヌクレオチドを含む、Ａβ結合ド
メインをコードする領域；および （ｂ）配列番号７の３０〜１５０個連続するヌクレオチドを含む、ＬＲＰ結合
ドメインをコードする領域、 を含む、核酸分子。 - 【請求項１６】 抗ＬＲＰ−Ａβペプチドをコードする核酸分子であって、
以下： （ａ）配列番号５、配列番号１１、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１
９、配列番号２１、配列番号２３、および配列番号２５からなる群より選択され
るヌクレオチド配列を有する、Ａβ結合ドメインをコードする領域；および （ｂ）配列番号９のヌクレオチド配列を有する、ＬＲＰ結合ドメインをコード
する領域、 を含む、核酸分子。 - 【請求項１７】 抗ＬＲＰ−Ａβペプチドをコードする核酸分子であって、
以下： （ａ）配列番号１１、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号
２１、配列番号２３、および配列番号２５からなる群より選択されるヌクレオチ
ド配列を有する、Ａβ結合ドメインをコードする領域；および （ｂ）配列番号７の３０〜１５０個連続するヌクレオチドを含む、ＬＲＰ結合
ドメインをコードする領域 を含む、核酸分子。 - 【請求項１８】 前記Ａβ結合ドメインをコードする領域が、前記ＬＲＰ結
合ドメインをコードする領域にリン酸ジエステル結合によって結合されている、
請求項１５、１６、または１７に記載の核酸分子。 - 【請求項１９】 前記Ａβ結合ドメインをコードする領域が、前記ＬＲＰ結
合ドメインをコードする領域に１〜２０個のグリシン残基をコードするヌクレオ
チドによって結合されている、請求項１５、１６または１７に記載の核酸分子。 - 【請求項２０】 請求項１５、１６、または１７に記載の核酸分子に対して
少なくとも９５％の相同性を有するポリヌクレオチドを含む、核酸分子。 - 【請求項２１】 請求項１５、１６、または１７に記載の核酸分子に相補的
である、第２ポリヌクレオチドにハイブリダイズする、第１ポリヌクレオチドを
含む、核酸分子。 - 【請求項２２】 請求項２１に記載の核酸分子であって、以下： （ａ）５０％ ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐ
Ｈ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％ デキストラン硫酸、および２０μｇ
／ｍｌ 変性剪断サケ精子ＤＮＡからなる溶液中で４２℃で一晩、インキュベー
トする工程；および （ｂ）０．１×ＳＳＣからなる溶液中で６５℃で洗浄する工程、 を含む条件下で、前記第１ポリヌクレオチドが前記第２ポリヌクレオチドにハイ
ブリダイズする、核酸分子。 - 【請求項２３】 配列番号１３のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチ
ドを含む、核酸分子。 - 【請求項２４】 配列番号１３のヌクレオチド配列に対して少なくとも９５
％の同一性を有するポリヌクレオチドを含む、核酸分子。 - 【請求項２５】 配列番号１３のヌクレオチド配列に相補的である、第２ポ
リヌクレオチドにハイブリダイズする、第１ポリヌクレオチドを含む、核酸分子
。 - 【請求項２６】 請求項２５に記載の核酸分子であって、以下： （ａ）５０％ ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐ
Ｈ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％ デキストラン硫酸、および２０μｇ
／ｍｌ 変性剪断サケ精子ＤＮＡからなる溶液中で４２℃で一晩、インキュベー
トする工程；および （ｂ）０．１×ＳＳＣからなる溶液中で６５℃で洗浄する工程、 を含む条件下で、前記第１ポリヌクレオチドが前記第２ポリヌクレオチドにハイ
ブリダイズする、核酸分子。 - 【請求項２７】 抗ＬＲＰ−Ａβ分子、および１つ以上の薬学的に受容可能
なキャリアを含む、薬学的組成物。 - 【請求項２８】 請求項４、５、６、または１３に記載の抗ＬＲＰ−Ａβペ
プチド、またはその薬学的に受容可能な塩、および１つ以上の薬学的に受容可能
なキャリアを含む、薬学的組成物。 - 【請求項２９】 配列番号４および配列番号１４からなる群より選択される
アミノ酸配列を有する抗ＬＲＰ−Ａβペプチド、またはその薬学的に受容可能な
塩、および１つ以上の薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。 - 【請求項３０】 抗ＬＲＰ−Ａβ分子を投与する工程を包含する、被験体に
おいてアルツハイマー病と闘う方法。 - 【請求項３１】 前記抗ＬＲＰ−Ａβ分子がペプチドである、請求項３０に
記載の方法。 - 【請求項３２】 請求項４、５、６または１３に記載の抗ＬＲＰ−Ａβペプ
チド、またはそれらの薬学的に受容可能な塩を投与する工程を包含する、被験体
においてアルツハイマー病と闘う方法。 - 【請求項３３】 配列番号４および配列番号１４からなる群より選択される
、アミノ酸配列を有する抗ＬＲＰ−Ａβペプチド、またはその薬学的に受容可能
な塩を投与する工程を包含する、被験体においてアルツハイマー病と闘う方法。 - 【請求項３４】 Ａ２Ｍ−２ ＲＮＡを標的とするように設計されたヌクレ
オチドを含む、Ａ２Ｍ−２アンチセンスオリゴヌクレオチド。 - 【請求項３５】 前記ＲＮＡがｈｎＲＮＡである、請求項３４に記載のＡ２
Ｍ−２アンチセンスオリゴヌクレオチド。 - 【請求項３６】 前記ＲＮＡがｍＲＮＡである、請求項３４に記載のＡ２Ｍ
−２アンチセンスオリゴヌクレオチド。 - 【請求項３７】 配列番号２７の配列を有するヌクレオチドを含む、Ａ２Ｍ
−２アンチセンスオリゴヌクレオチド。 - 【請求項３８】 配列番号２７の最後の１５〜３０個連続するヌクレオチド
の配列を有するヌクレオチドを含む、Ａ２Ｍ−２アンチセンスオリゴヌクレオチ
ド。 - 【請求項３９】 配列番号２７のヌクレオチド３６〜５０を含む、Ａ２Ｍ−
２アンチセンスオリゴヌクレオチド。 - 【請求項４０】 配列番号２７のヌクレオチド２０〜５０を含む、Ａ２Ｍ−
２アンチセンスオリゴヌクレオチド。 - 【請求項４１】 請求項３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０に
記載のＡ２Ｍ−２アンチセンスオリゴヌクレオチド、および１つ以上の薬学的に
受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。 - 【請求項４２】 請求項３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０に
記載のＡ２Ｍ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する工程を包含する、
被験体においてアルツハイマー病と闘う方法。 - 【請求項４３】 α2Ｍをコードする遺伝子、および抗ＬＲＰ−Ａβペプチ
ドをコードする遺伝子からなる群より選択される導入遺伝子を保有するウイルス
ベクターを含む、アルツハイマー病の遺伝子治療のための、ベクター。 - 【請求項４４】 前記導入遺伝子がα2Ｍをコードする遺伝子である、請求
項４３に記載のウイルスベクター。 - 【請求項４５】 前記導入遺伝子が配列番号１のヌクレオチド４４〜４４６
５のヌクレオチド配列を有する、請求項４４に記載のウイルスベクター。 - 【請求項４６】 前記導入遺伝子が抗ＬＲＰ−Ａβペプチドをコードする遺
伝子である、請求項４３に記載のウイルスベクター。 - 【請求項４７】 前記導入遺伝子が請求項４、５、６、１２または１３に記
載の抗ＬＲＰ−Ａβペプチドをコードする、請求項４３に記載のウイルスベクタ
ー。 - 【請求項４８】 前記ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルスである、請求
項４３、４４、４５または４６に記載のウイルスベクター。 - 【請求項４９】 請求項４３、４４、４５または４６に記載のウイルスベク
ター、および１つ以上の薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。 - 【請求項５０】 請求項４３、４４、４５または４６に記載のウイルスベク
ターを投与することによって、被験体においてアルツハイマー病と闘う、方法。 - 【請求項５１】 アルツハイマー病について治療剤をスクリーニングする方
法であって、以下： （ａ）Ａ２Ｍ−２対立遺伝子についてヘテロ接合またはホモ接合であり、そし
てＡ２Ｍ−２を発現する、細胞を試験薬剤の存在下でインキュベートする工程；
および （ｂ）試験薬剤で未処理の細胞において見出される正常なＡ２Ｍ ｍＲＮＡ対
異常なＡ２Ｍ ｍＲＮＡの比に対して、正常なＡ２Ｍ ｍＲＮＡ対異常なＡ２Ｍ ｍＲＮＡの比が、上昇したか否かを決定する工程、 を包含する、方法。 - 【請求項５２】 前記細胞が神経膠腫細胞である、請求項５１に記載の方法
。 - 【請求項５３】 前記細胞が肝癌細胞である、請求項５１に記載の方法。
- 【請求項５４】 前記細胞がＡ２Ｍ−２対立遺伝子についてヘテロ接合であ
る、請求項５１に記載の方法。 - 【請求項５５】 前記細胞がＡ２Ｍ−２対立遺伝子についてホモ接合である
、請求項５１に記載の方法。 - 【請求項５６】 前記工程（ｂ）が配列番号１に相補的なプローブを使用す
るＳ１ヌクレアーゼ分析を包含し、ここで該プローブが配列番号１のヌクレオチ
ド２０５７〜２２８４を含む、請求項５１に記載の方法。 - 【請求項５７】 前記プローブが長さ３００ｂｐである、請求項５６に記載
の方法。 - 【請求項５８】 前記工程（ｂ）が配列番号１のヌクレオチド２０２４〜２
３２３に相補的なプローブを使用するＳ１ヌクレアーゼ分析を包含する、請求項
５１に記載の方法。 - 【請求項５９】 前記工程（ｂ）がＲＴ ＰＣＲ分析を包含する、請求項５
１に記載の方法。 - 【請求項６０】 前記工程（ｂ）が、エキソン１７〜１８を含む、Ａ２Ｍの
領域を増幅するように設計されたプライマーを使用するＲＴ ＰＣＲ分析を包含
する、請求項５９に記載の方法。 - 【請求項６１】 エキソン１７〜１８を含む前記Ａ２Ｍの領域が、長さ３０
０ｂｐである、請求項６０に記載の方法。 - 【請求項６２】 前記プライマーが、配列番号１のヌクレオチド２０５２〜
２２８９を増幅するように設計される、請求項６０に記載の方法。 - 【請求項６３】 前記プライマーが、配列番号１のヌクレオチド２０２４〜
２０３８に相補的なヌクレオチド配列を有する第１プライマー、および配列番号
１のヌクレオチド２３０９〜２３２３のヌクレオチド配列を有する第２プライマ
ーからなる、請求項６０に記載の方法。 - 【請求項６４】 アルツハイマー病についての治療剤をスクリーニングする
方法であって、以下： （ａ）α2Ｍを試験薬剤とともにインキュベートする工程；および （ｂ）該工程（ａ）のα2Ｍがコンフォメーション変化を受けたか否かを決定
する工程を含み、ここで該工程を連続的な順番で実施する、 方法。 - 【請求項６５】 前記工程（ｂ）がα2Ｍ電気泳動移動度アッセイを実施す
ることを包含する、請求項６４に記載の方法。 - 【請求項６６】 アルツハイマー病についての治療剤をスクリーニングする
方法であって、以下： （ａ）α2Ｍを試験薬剤とともにインキュベートする工程；および （ｂ）該工程（ａ）のα2ＭがＬＲＰに結合し得るか否かを決定する工程を含
み、ここで該工程を連続的な順番で実施する、 方法。 - 【請求項６７】 前記α2Ｍがテトラマーである、請求項６４、６５または
６６に記載の方法。 - 【請求項６８】 前記工程（ｂ）がＥＬＩＳＡを実施することを包含する、
請求項６６に記載の方法。 - 【請求項６９】 前記ＥＬＩＳＡが以下： （ａ）抗ＬＲＰ ＩｇＧで被覆されたウェルにおいて、ＬＲＰをインキュベー
トする工程； （ｂ）該ウェルを前記α2Ｍとともにインキュベートする工程； （ｃ）該ウェルを酵素に結合体化された抗α2Ｍ ＩｇＧとともにインキュベ
ートする工程；および （ｄ）該ウェルを該酵素の基質とともにインキュベートする工程を含み、ここ
で該工程を連続的な順番で実施する、 請求項６８に記載の方法。 - 【請求項７０】 前記ＥＬＩＳＡが以下： （ａ）ＬＲＰで被覆されたウェルを前記α2Ｍとともにインキュベートする工
程； （ｂ）該ウェルを酵素に結合体化された抗α2Ｍ ＩｇＧとともにインキュベ
ートする工程；および （ｃ）該ウェルを該酵素の基質とともにインキュベートする工程を含み、ここ
で該工程を連続的な順番で実施する、 請求項６８に記載の方法。 - 【請求項７１】 前記ＥＬＩＳＡが以下： （ａ）活性化α2Ｍに特異的な抗α2Ｍ ＩｇＧで被覆されたウェルにおいて、
前記α2Ｍをインキュベートする工程； （ｂ）該ウェルを該α2Ｍとともにインキュベートする工程； （ｃ）該ウェルを酵素に結合体化された抗α2Ｍ ＩｇＧとともにインキュベ
ートする工程；および （ｄ）該ウェルを該酵素のための基質とともにインキュベートする工程を含み
、ここで該工程を連続的な順番で実施する、 請求項６８に記載の方法。 - 【請求項７２】 前記工程（ｂ）がイムノブロッティングを包含する、請求
項６６に記載の方法。 - 【請求項７３】 抗ＬＲＰ ＩｇＧおよび抗α2Ｍ ＩｇＧを使用して、前
記イムノブロッティングを実施する、請求項７２に記載の方法。 - 【請求項７４】 前記工程（ｂ）が、前記α2ＭがＬＲＰ媒介性エンドサイ
トーシスを受ける能力を決定することを包含する、請求項６６に記載の方法。 - 【請求項７５】 前記工程（ｂ）が、前記α2ＭがＬＲＰ媒介性分解を受け
る能力を決定することを包含する、請求項６６に記載の方法。 - 【請求項７６】 請求項１０に記載の抗ＬＲＰ−Ａβをコードするポリヌク
レオチドを含む、核酸分子。 - 【請求項７７】 請求項１８に記載の核酸分子に対して少なくとも９５％の
相同性を有するポリヌクレオチドを含む、核酸分子。 - 【請求項７８】 請求項１９に記載の核酸分子に対して少なくとも９５％の
相同性を有する、ポリヌクレオチドを含む、核酸分子。 - 【請求項７９】 請求項１８に記載の核酸分子に相補的である第２ポリヌク
レオチドにハイブリダイズする、第１ポリヌクレオチドを含む、核酸分子。 - 【請求項８０】 請求項１９に記載の核酸分子に相補的である、第２ポリヌ
クレオチドにハイブリダイズする、第１ポリヌクレオチドを含む、核酸分子。 - 【請求項８１】 前記ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルスである、請求
項４７に記載のウイルスベクター。
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