【発明の詳細な説明】
タイプ１偽性低アルドステロン症等の不完全イオン輸送に由来する病理状態の
診断および治療方法
技術分野
本発明は、イオン輸送における同型接合および異型接合型の遺伝欠陥、特にタ
イプ１の偽性低アルドステロン症（ＰＨＡ１）の様々な形態をもたらす核酸分子
およびタンパク質の変化を検出ならびに治療する分野に関する。さらに詳しくは
、本発明は、個体イオン輸送に関与するタンパク質をコードする遺伝子の突然変
異によって影響を受けているか、またはそのキャリアであるかを決定するための
組成物および方法に関する。本願は1997年３月11日に出願された、米国特許出願
60/040，171号に関連し、その全体は参考文献として、ここに援用される。
背景技術
背景
タイプ１の偽性低アルドステロン症（ＰＨＡ１）は、新生児期に、正常な腎糸
球体濾過および副腎機能にも拘わらず脱水症、低ナトリウム血症、高カリウム血
症(ｈｙｐｅｒｋａｌａｅｍｉａ)、代謝性アシドーシス、そして生育不全および
体重減少という、しばしば劇症の症状の出現によって特徴づけられる、希な塩消
耗病である。Cheek，D．et al．Archives of Dis．in Childhood 33：252−256(
1958)、Dillon，M．J．et al．Archives of Dis．in Childhood 55：427−434(1
980)、Popow，C.，et al．Acta Paediatr．Scand．77：136−141(1988)、総説お
よび二つの新しい症例Speiser，P．W.，Stoner，E．& New，M．I．Psuedohypoal
dosteronism，Mechanisms and clinical aspects of steroid hormone resistan
ce（eds．Chrousos，G．P.，Loriaux，D．T．& Lipsett，M．B.）173−195(Peln
um Press，New York)，1986。PHA1は、これらの幼児が鉱質コルチコイドに反応
できない時に、疑われる。その診断は、上昇した血漿アルドステロン濃度および
血漿レニン活性の所見によって支持される。Dillon，M．J．et al．Archives of
Dis．in Childhood 55：427−434(1980)、Popow，C.，et al．Acta Paediatr．
Scand．77：136−141(1988)、総説および二つの新しい症例Speiser，P.W.,Stone
r,E.& New,M.I.Psuedohypoaldosteronism，Mechanisms and clinical
aspects of steroid hormone resistance（eds．Chrousos，G．P.，Loriaux，D
．T．& Lipsett，M．B.）173−195(Pelnum Press，New York)，1986。治療とし
ては、塩化ナトリウムを補うこと、並びに生命を脅かす高カリウム血症を軽減す
るためにイオン結合性樹脂での処置または透析が挙げられる。Cheek，D．et al
．Archives of Dis．in Childhood 33：252−256(1958)、Dillon，M．J．et al
．Archives of Dis．in Childhood 55：427−434(1980)、Popow，C.，et al．Ac
ta Paediar．Scand．77：136−141(1988)、総説および二つの新しい症例Speiser
，P.W.,Stoner,E.& New,M.I.Psuedohypoaldosteronism，Mechanisms and clinic
al aspects of steroid hormone resistance（eds．Chrousos，G．P.，Loriaux
，D．T．& Lipsett，M．B.）173−195(Pelnum Press，New York)，1986、Donnel
l，G．N.，et al．Am．J．Dis．Child．97：813−828(1959)、Mathew，P．M.，e
t al．Clinical Pediatrics．１：58−60(1993)。診断がなされないと、新生児
期における死亡は、よくあることである。
常染色体の劣性および優性の両方の伝達を示す、PHA1の血族が記述された(Han
ukoglu，A．J．Clin．Endocrin．& Metab．73，936−９４４(1991))。劣性の血
族の症例は、典型的に腎臓、汗および唾液腺そして結腸粘膜での鉱質コルチコイ
ド耐性を示す。総説および二つの新しい症例、Speiser，P．W.，Stoner，E．& N
ew，M．I．Psuedohypoaldosteronism，Mechanisms and clinical aspects of st
eroid hormone resistance(eds.Chrousos,G.P.,Loriaux,D.T.& Lipsett,M.B.)17
3−195(Pelnum Press,New York),1986、Hanukoglu,A.J.Clin.Endocrin.& Metab
．73，936−944(1991)、Hanukoglu，A.，et al．J．Pediatr．125：752−755(19
94)、Hogg，R．J.，et al．Pediatric Nephrology 5：205−210(1991)。これら
の症例の場合、両親は、測定された時、正常なアルデステロンとレニンのレベル
を有していた。総説および二つの新しい症例、Speiser，P．W.，Stoner，E．& N
ew，M．I．Psuedohypoaldosteronism，Mechanisms and clinical aspects of st
eroid hormone resistance(eds.Chrousos,G.P.,Loriaux,D.T.& Lipsett,M.B.)17
3−195(Pelnum Press,New York),1986、Hanukoglu,A.J.Clin.Endocrin.& Metab
．73，936−944(1991)。対照的に、優性の伝達を支持する血族も報告されており
、これらのうちの幾人かは、腎臓に限定された疾患を有すると示され
た。総説および二つの新しい症例、Speiser，P．W.，Stoner，E．& New，M．I．
Psuedohypoaldosteronism，Mechanisms and clinical aspects of steroid horm
one resistance（eds．Chrousos，G．P.，Loriaux，D．T．& Lipsett，M．B.）1
73−195(Pelnum Press，New York)，1986、Hanukoglu，A．J．Clin．Endocrin．
& Metab．73，936−944(1991)、Limal，J．M.，et al．Lancet １：51(1978)、H
anukoglu，A.，et al．Lancet １：1359(1978)。生まれてから最初の数年で、臨
床上の兆候および代謝異常が改善する患者がかなりあり、治療の中止が可能とな
る。Cheek，D．et al．Archives of Dis．in Childhood 33：252−256(1958)、D
illon，M．J．et al．Archives of Dis．in Childhood 55：427−434(1980)、総
説および二つの新しい症例の報告Speiser，P．W.，Stoner，E．& New，M．I．Ps
uedohypoaldosteronism，Mechanisms and clinical aspects of steroid hormon
e resistance（eds．Chrousos，G．P.，Loriaux，D．T．& Lipsett，M．B.）173
−195(Pelnum Press，New York)，1986、Donnell，G．N.，et al．Am．J．Dis．
Child．97：813−828(1959)、Hanukoglu，A．J．Clin．Endocrin．& Metab．73
，936−944(1991)。これらの患者は、ほとんど優性伝達の患者であると示唆され
ている(Hanukoglu，A．J．Clin．Endocrin．& Metab．73，936−944(1991))。
この症候群の病因は、未だ解明されていない。腎臓での塩消耗、高カリウム血
症、および鉱質コルチコイドに反応できないこと、以上の三つ組は、末端ネフロ
ンにおける腎臓の欠陥と最も一致する(Cheek，D．et al．Archives of Dis．in
Childhood 33：252−256(1958)、Rosler，A．J．Clin．Endocrin．& Metab．59
：689−700(1984))。罹患した患者の鉱質コルチコイド受容体のレベルは、低い
と分かっているが(Armanini，D．et al．N．Eng．J．Med．313：1178−1181(198
5)、Kuhnle U．et al．J．Clin．Endocrin．& Metab．70：638−641(1990)、Bos
son，D．et al．Acta Endo．113：S376−S381(1986))、分子学的研究によって、
鉱質コルチコイド受容体に一次的欠陥があるとの証拠は、明らかになっていない
(Komesaroff，P．A.，et al．J．Clin．Endocrin．& Metab．79：27−31(1994)
、Zennaro，M．C.，et al．J．Clin．Endocrin．& Metab．79：32−38(1994))。
電気発生的な上皮を経てのナトリウム輸送は、末端ネフロン、末端結腸、唾液
および汗腺、そして肺上皮におけるナトリウム再吸収の律速段階である(Horisbe
rger，J，D.，et al．Cell Physiol．Biochem．32:283−294(1993))。腎臓でこ
の電気発生的ナトリウム輸送は、アルドステロンによってはっきりと調節され(R
ossier，B．C．& Palmer，L．G．Mechanism of aldosterone action on sodium
and potasium transport、The Kidney，physiology and pathophysiology （eds
．Seldin，D．W．and Gilbisch，G.）1373−1409(Ravens Press，New York，199
2))、そしてアミロライド−感受性の上皮ナトリウムチャンネル（ＥＮａｃ）に
よって媒介される。このチャンネルは、少なくとも同様な構造の三つのサブユニ
ットからなり(Canessa，C．M.，et al．Nature 361：467−470(1993)、Canessa
，C．M.，et al．Nature 367：463−467(1994))、それらの各々は細胞内アミノ
およびカルボキシ末端、二つのトランスメンブランスパンニングドメイン、およ
び大きな細胞外ループを有する。ヒトにおいて、αＥＮａｃはヒト染色体１２上
にあり、一方、ｂおよびｇは、染色体１６２２上でしっかりと結合されている。
ＥＮａｃ活性の体質的な活性化に帰着する突然変異が、リドル(Ｌｉｄｄｌｅ)
症候群である常染色体の優性形の高血圧を引き起こすことが示された。Shimkets
，R．A．et al．Cell 79：407−414(1994)、Hansson，J．H．et al．Nature Gen
etics 11：76−82(1995)、Hansson，J．H．et al．Proc．Nat．Acad．Sci．USA9
2：11495−11499(1995)、Schild，L．et al．Proc．Nat．Acad．Sci．USA 92：5
699−5703(1995)。これは、肺体積膨張、低カリウム血症およびアルカローシス
によって特徴づけられる。
本発明は、イオン輸送の欠乏、特にＰＨＡ１を区別し、診断するのに使用でき
る組成物および方法を提供する。本発明は、さらにこの疾患の異型接合型のキャ
リアを特定するのに使用することができる方法および組成物を提供する。キャリ
アは、臨床上のひどい症状を示さないが、それにもかかわらず軽度から中度の病
状を示す。
発明の開示
本発明は、異常なイオン輸送、特にＰＨＡ１、低カリウム血症アルカローシス
、低カリウム血症アシドーシスおよび塩消耗に関連する病理状態における、上皮
ナトリウムチャンネル（ＥＮａｃ）の役割の同定に、一部基づく。すなわち本発
明
は、幾つかの、ヒト野生型のＥＮａＣタンパク質およびＥＮａＣタンパク質の改
変された変異体のアミノ酸配列、並びにこれらの変異体をコードする核酸配列を
提供する。これらのタンパク質および核酸分子は、イオン輸送の障害を診断する
のに、そしてこれらの病状を治療するための方法および薬剤を開発するのに使用
できる。
図面の簡単な説明
図１は、ＰＨＡ１の血縁関係を示す。
突然変異が同定された５組のＰＨＡ１血族の家族関係を示す。全ての罹患した
被験者は、血族結婚の産物である。罹患者と分類される被験者は、うめられた記
号で表示されている。罹患していない者は、うめられていない記号で表示されて
いる。死亡した被験者は、対角線で表示されている。指標となる例は、矢印で表
示されている。試験体とされなかつた生存者は、点で表示されている。各々の血
族内で、試験体とされた各個人は、独自の番号で同定されており、それはそれぞ
れの記号の左上に示されている。各記号の下には、αＥＮａＣ（ＰＨＡ Ｋ１０
、Ｋ１３、Ｋ１４およびＫ３）またはβＥＮａＣ（ＰＨＡＫ８）のいずれかのＳ
ＳＣＰ遺伝子型が示されている。「+」記号は、正常なＳＳＣＰ変異体を指し、
そして番号１、２および３は、αＥＮａＣコドン６８フレームシフト、αＥＮａ
Ｃ終止コドン５０８、そしてβＥＮａＣＧ３７Ｓ突然変異をそれぞれ表す。
図２は、ＰＨＡ１患者における、ＥＮａＣサブユニット内の突然変異を示す。
各パネルにおいて、ＰＨＡ１血族中、ＳＳＣＰによって同定される変異体が示
されている。個人は図１と同様に、番号付けされ、そして代表的なオートラジオ
グラムが示されている。ＳＳＣＰ遺伝子型およびマーカーの遺伝子型は、各個人
について少なくとも２回の別々の増幅から確認された。罹患した個人は、星印で
表示され、そして罹患した被験者中、同型接合型である新規なＳＳＣＰ変異体は
、矢印で表示されている。これらの変異体は、図１と同様に、番号付けされる。
各パネルの下に、突然変異アレレ体（左側）および対応する野生型のアレレ体（
右側）のＤＮＡ配列が示されている。パネルＡで欠失された塩基は、括弧で表示
され、パネルＢおよびパネルＣで単一塩基置換は、星印で表示されている。
２ａ．ＰＨＡ１血族Ｋ１０、Ｋ１３、Ｋ１４中、罹患した被験者は、αＥＮａ
Ｃのコドン６８にフレームシフトを導入する同一の２塩基欠失について同型接合
型であり、そしてこの変異体は、病気とともに形質分離する。野生型配列のコド
ン６６の最後の２塩基からコドン７０の最初の２塩基まで延びるＤＮＡ配列は、
センス方向で示されている。コドンＩ６８の最後の２塩基は、突然変異体にはな
い。
２ｂ．ＰＨＡ Ｋ３のコドン５０８に早すぎる終止コドンを導入するαＥＮａ
Ｃの同型接合型変異体。アミノ酸５０７−５０９をコードするＤＮＡ配列がアン
チセンス方向で示されている。センス方向では、Ｒ５０８をコードするＣＧＡは
ＴＧＡに突然変異され、コーディングはコドン５０８で終止する。
２ｃ．ＰＨＡ Ｋ８の罹患した被験者においてＧ３７ＳをコードするβＥＮａ
Ｃの同型接合型変異体。コドン３６−３８のＤＮＡ配列がセンス方向で示されて
いる。Ｇ３７ＳをコードするＧＧＣ配列は、ＡＧＣに突然変異され、Ｓ３７をコ
ードする。
図３は、ＰＨＡ１血族で同定された突然変異の結果を示す。
３ａ．ＰＨＡ１血族中、αＥＮａＣおよびβＥＮａＣの突然変異の影響が示さ
れている。ＥＮａＣサブユニットは、原形質膜を二度またぐものとして、描かれ
ており(Canessa C．M.，et al．Am．J．Ped．267：C1682−169(1994))、そして
アミノおよびカルボキシ末端が表示されている。矢印は、各サブユニット内の同
定された突然変異の位置を指す。突然変異がそれぞれ見つかった血族が表示され
ている。αＥＮａＣ中の突然変異は、第一のトランスメンブランドメインに隣接
するコドン６８にフレームシフト突然変異を導入する。この突然変異は、三組の
血族に見出される。ＰＨＡ Ｋ３における突然変異は、αＥＮａＣの細胞外ドメ
インに早過ぎる終止コドンを導入し、そしてＰＨＡ Ｋ８におけるβＥＮａＣ中
の突然変異は、ミスセンス突然変異を導入し、残基３７でグリシンをセリンに変
える。
３ｂ．βＥＮａＣ中のＧ３７Ｓ突然変異は、保存されたＥＮａＣ断片で起きる
。ＥＮａＣ族の異なった構成貢の第一のトランスメンブランドメインに先行する
アミノ酸配列が示されている。接頭語「ｈ」「ｒ」および「ｘ」は、ヒト、ラッ
ト、ツメガエルからの遺伝子をそれぞれ表す。Canessa，C．M.，et al．Nature
361：
467−470(1993)、Canessa,C.M.,et al.Nature 367：463−467(1994)、McDonald
，F．J.，et al．Am．J．Physiol．268:L728−734(1994)、McDonald，F．J.，et
al．Am．J．Physiol．268：C1157−C1163(1995)、Puoti，A．et al．Am．J．Ph
ysiol．269：C188−C197(1995)、Waldmann，R.，et al．J．of Biol．Chem．270
：27411−27414(1995)、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓからｍｅｃ−１０およびＤｅｇ−１
(Huang，M．et al．Nature 367：467−470(1994))、Chalfie，M．et al．Nature
345：410−416(1990)。すべての種からのａ、ｂ、およびｇサブユニット中、同
一であるこれらの残基は、影をつけられている。ｈｂＥＮＡＣの３７位の完全に
保存されているグリシンは、ＰＨＡ血族８内ではセリンに突然変異されている。
図４は、ツメガエル乱母細胞でのアミロイド感受性Ｎａ+チャンネル活性に対
してのβＥＮａＣ Ｇ３７Ｓの影響を示す。
正常な、または突然変異体ＥＮａＣサブユニット類をコードするｃＲＮＡ類は
、ツメガエル乱母細胞にともに注射され、得られたアミロイド感受性ナトリウム
電流が測定された。Ｇ３７Ｓ突然変異を含むβＥＮａＣは、αおよびγサブユニ
ットとともに発現された(「αβ３７Ｓγ」と表す）。正常なα、βおよびγサブ
ユニットを注射されたか、またはαおよびγサブユニットのみを注射された（そ
れそれαβγおよびαγ）乱母細胞を対照とした。５つの異なった乱母細胞群か
らの３３乃至３５の乱母細胞から得られたアミロイド感受性ナトリウム電流の絶
対値の平均が示されている。誤差のバーは、ＳＥＭを表す。突然変異体型および
野生型のチャンネルの活性を比較するｔ−試験回の「ｐ」値が表示されている。
発明を実施するための形態
Ｉ 一般的な記載
本発明は、異常なイオン輸送、特にＰＨＡ１、低カリウム血症アシドーシス、
および塩消耗に関連する病理状態における、上皮ナトリウムチャンネル（ＥＮａ
ｃ）の役割の同定に、一部基づく。すなわち本発明は、幾つかの、ＥＮａｃタン
パク質のα、βおよびγサブユニットのヒト野生型および改変された変異体のア
ミノ酸配列、並びにこれらの変異体をコードする核酸配列を提供する。これらの
タンパク質および核酸分子は、イオン輸送の障害を診断するのに、そしてこれら
の病状を治療するための方法および薬剤を開発するのに使用できる。
ＩＩ 特定の実施の形態
Ａ．ＥＮａＣタンパク質
本発明以前に、従来技術は、ヒトＥＮａＣの三つのサブユニットのアミノ酸配
列を確認していた。しかしながら、本発明以前には、（１）不活性なＥＮａＣを
産生する、前記ＥＮａＣタンパク質のヒト変異体における変化が異常なイオン輸
送によって引き起こされる病状に苦しむ生存する個体に帰着することを確認した
ものは誰もいなかった、（２）天然に存在する、ＥＮａＣサブユニットのヒト野
生型変異体類を特定したものは誰もいなかった、（３）不活性なＥＮａＣを生産
したＥＮａＣタンパク質の改変されたヒト変異体類を特定したものは誰もいなか
った、そして（４）ＰＨＡ１のような異常なイオン輸送の結果である病理状態が
試料を、前記ＥＮａＣタンパク質の野生型変異体または改変された変異体の存在
について分析することにより特定できることを示したものは誰もいなかった。部
分的に、本発明は、イオン輸送の欠乏に至る、野生型ヒトＥＮａＣタンパク質そ
して前記ヒトＥＮａＣタンパク質の改変された変異体のアミノ酸配列、並びにコ
ードする核酸分子の核酸配列を提供する。
一つの実施の形態として、本発明は、ここに記載されるクローン化した核酸分
子を用いて、従来知られていなかったヒトＥＮａＣタンパク質の改変された変異
体を製造する能力を提供する。
ここで用いられる、「野生型ヒトＥＮａＣタンパク質」とは、ヒトＥＮａＣの
一つの野生型アレレ変異体のアミノ酸配列を有するタンパク質を指す。前記ＥＮ
ａＣタンパク質は、三つのサブユニットすなわち、ここでαＥＮａＣ、βＥＮａ
ＣおよびγＥＮａＣと、それぞれ呼ばれるα、βおよびγサブユニットからなる
。便宜上、集合的なサブユニットは、ＥＮａＣタンパク質と呼ばれる。本発明の
野生型ＥＮａＣタンパク質は、ここに記載される特定的に同定され、そして特徴
が明らかにされた変異体、並びに以下に略述される方法に従って、過度の実験を
することなしに単離そして同定できるアレレ変異体を包含する。便宜上、本発明
の野生型ヒトＥＮａＣタンパク質のすべては、集合的に「本発明の野生型ＥＮａ
Ｃタンパク質」または「本発明の野生型ヒトＥＮａＣタンパク質」と呼ばれるこ
とになる。
「野生型ヒトＥＮａＣタンパク質」という用語は、正常なＥＮａＣ活性を有す
るヒトＥＮａＣタンパク質の天然に存在するすべての野生型アレレ変異体を含む
。一般に、ＥＮａＣタンパク質の野生型アレレ変異体は、特定的に配列番号＿に
規定されたものと、僅かに相違するアミノ酸配列を有するであろう。上記に挙げ
られたものと、僅かに相違するアミノ酸配列を有するけれども、アレレ変異体は
、ナトリウム輸送体となる能力を有するであろう。典型的には、野生型ＥＮａＣ
タンパク質のアレレ変異体は、ここに記載される野生型配列からの保存されたア
ミノ酸置換を含むか、ＥＮａＣ同族体（ヒト以外の生物から単離されたＥＮａＣ
タンパク質）で対応する位置からのアミノ酸の一つの置換を含むであろう。
ここで用いられる、「突然変異した、または改変されたヒトＥＮａＣタンパク
質」は、減少したイオン輸送能を有するＥＮａＣタンパク質を産生する、ヒトＥ
ＮａＣの突然変異した、または改変されたアレレ変異体のアミノ酸配列を有する
タンパク質を指す。図１−３は、前記ヒトＥＮａＣタンパク質の三つのサブユニ
ットの各々について、幾つかの突然変異した、または改変されたアレレ変異体の
アミノ酸配列を提供する。本発明の突然変異した、または改変されたＥＮａＣタ
ンパク質は、ここで特定的に同定され、そして特徴が明らかにされたもの、並び
に以下に略述される方法に従って、過度の実験をすることなしに単離そして同定
されうるアレレ変異体を含む。便宜上、本発明の突然変異した、或いは改変され
たヒトＥＮａＣタンパク質のすべては、集合的に「本発明の突然変異した、また
は改変されたＥＮａＣタンパク質」または「本発明の突然変異した、または改変
されたヒトＥＮａＣタンパク質」と呼ばれることになる。
「突然変異した、または改変されたヒトＥＮａＣタンパク質」という用語は、
正常なＥＮａＣ活性を有しないヒトＥＮａＣタンパク質の天然に存在するすべて
のアレレ変異体を含む。一般に、ＥＮａＣタンパク質の突然変異した、または改
変されたアレレ変異体は、ここに記載される野生型ＥＮａＣタンパク質に対して
、特定的に配列番号＿で規定されたものと、僅かに異なるものから根本的に異な
るアミノ酸配列を有するかもしれないか、若しくは有するであろう。突然変異し
た、または改変されたアレレ変異体は、ナトリウムを輸送することができないで
あろう、若しくは野生型のＥＮａＣと比較して減少された速度でナトリウムを輸
送することになる。典型的には、突然変異した、または改変されたＥＮａＣタン
パク質アレレ変異休は、次のものを含むであろう。すなわち、ここに記載される
野生型配列からの保存されていないアミノ酸置換、ＥＮａＣ同族体（ヒト以外の
生物から単離されたＥＮａＣタンパク質）で対応する位置に見出されるアミノ酸
以外のアミノ酸の一つの置換、フレームシフト突然変異若しくは終止コドンの挿
入、またはＥＮａＣ配列への一若しくは複数のアミノ酸の欠失または挿入を含む
であろう。
本発明のＥＮａＣタンパク質（野生型および突然変異した変異体）は、好まし
くは単離した形態である。ここで用いられる用法として、物理的、機械的、また
は化学的方法を採用して、通常、タンパク質に会合している細胞構成成分からＥ
ＮａＣタンパク質を除去する場合、タンパク質は単離されたと言われる。熟練し
た技術者は、容易に標準的な精製法を採用して、単離ＥＮａＣタンパク質を得る
ことができる。単離の性質と程度は、目的とする用途に依る。
ＥＮａＣコーディング核酸分子のクローニングによって、本発明のＥＮａＣタ
ンパク質の定義された断片を生成することが可能となる。以下で議論されるよう
に、本発明のＥＮａＣタンパク質の断片は、ドメイン特異的な抗体を生成するの
に、ＥＮａＣタンパク質に結合する薬剤を同定するのに、そしてＥＮａＣの細胞
内、または細胞外結合パートナーを同定するのに特に有用である。
ＥＮａＣタンパク質の断片は、標準的なペプチド合成技術およびここに開示す
るアミノ酸配列を用いて生成され得る。別法として、組換え方法を使用してＥＮ
ａＣタンパク質の断片をコードする核酸分子を生成することができる。図１−３
は、ここに記載されるＥＮａＣタンパク質の改変された変異体中、野生型残基か
ら改変されたアミノ酸残基を同定している。これらの残基／改変を含む断片は、
特に改変された変異体に特異的な抗ＥＮａＣ抗体を生成するのに有用である。
下記のように、ＥＮａＣ族のタンパク質の構成貢は、限定はされないが、次の
ものに使用することができる。すなわち、（１）ＥＮａＣ活性を遮断するか、ま
たは促進する薬剤を同定するための標的として、（２）ＥＮａＣタンパク質に結
合する結合パートナーを同定および単離するための標的、または餌として、（３
）ＥＮａＣタンパク質の活性を遮断するか、または促進する薬剤を同定する、そ
し
て（４）ＥＮａＣに媒介される活性または病気を同定するアッセイ標的としてで
ある。
Ｂ．抗ＥＮａＣ抗体
本発明は、さらに一若しくは複数の本発明のＥＮａＣタンパク質に選択的に結
合する抗体を提供する。最も好ましい抗体は、ＥＮａＣタンパク質の改変された
変異体に結合するが、野生型の変異体に結合しないものであるか、或いはＥＮａ
Ｃタンパク質の野生型の変異体に結合するが、改変された変異体に結合しないも
のである。特に、意図する抗ＥＮａＣ抗体は、モノクロナールおよびポリクロナ
ール抗体、並びに抗原結合ドメインおよび／または一若しくは複数の補体決定領
域を含む。
一般に、抗体は、適当な哺乳類の宿主を、単離された、または免疫複合された
変異体の形でＥＮａＣタンパク質、若しくは断片を用いて免疫化することにより
調製される(Harlow，Antibodies，Cold Spring Harbor Press，NY(1989))。図１
−３は、ここに記載されるＥＮａＣタンパク質の様々に改変された変異体に、突
然変異されたことが示されたＥＮａＣタンパク質の幾つかの領域を同定している
。これらの残基を含む断片は、野生型の、または突然変異した変異体に特異的な
抗ＥＮａＣ抗体を生成するのに、特に適している。
免疫原として使用するタンパク質を製造する方法およびタンパク質とＢＳＡ、
ＫＬＨ等のキャリヤーまたは他のキャリヤータンパク質との免疫原性なコンジュ
ゲートを製造する方法は、技術分野でよく知られている。ある場合には、例えば
カルボジイミド試薬を用いる直接的なコンジュゲーションが使用できる。他の場
合には、Pierce Chemical Co.，Rockford，ILによって供給されるもののような
連結剤が有効であろう。
ＥＮａＣ免疫原の投与は、一般に適当な期間にわたって、そして適当なアジュ
バントを用いて注射により実施される。これは技術分野で一般に理解されている
ところである。免疫化の予定期間のあいだ、抗体の力価をとり、抗体形成の十分
さを決定することができる。
このようにして製造されたポリクロナール抗血清は、幾つかの用途には満足で
きるものであるかもしれないが、薬学的組成物としてはモノクロナール抗体の調
製物が好ましい。所望のモノクロナール抗体を分泌する不死化した細胞系は、Ko
hlerおよびMilsteinの標準的方法、或いはリンパ球または脾臓細胞の不死化をも
たらすその変法を用いて調製される。これは一般的に知られている。所望の抗体
を分泌する不死化した細胞系は、抗原がＥＮａＣタンパク質、またはペプチド断
片であるイムノアッセイによってスクリーニングされる。所望の抗体を分泌する
不死化した適当な細胞培養物が同定されたとき、細胞は生体外で、または腹水中
での製造によるいずれかで培養できる。
所望のモノクロナール抗体は、それから培養上澄み液または腹水の上澄み液か
ら回収される。免疫的に重要な部分を含むモノクロナール抗体の断片、またはポ
リクロナール抗血清は、拮抗薬として、同様に手付かずの抗体として使用するこ
とができる。Ｆ（ａｂ'）2断片のＦａｂ、Ｆａｂ’等の免疫的に活性な断片を使
用することは、しばしば好ましく、特に治療の関係ではそうである。これらの断
片は、一般的に全免疫グロブリンより免疫原性が少ないからである。
前記抗体または断片は、現在の科学技術を用いて組換え手段によっても製造さ
れ得る。輸送体の所望の領域に特異的に結合する領域は、キメラの、または多種
起源のＣＤＲグラフト抗体との関連でも製造されうる。
下記のように抗ＥＮａＣ抗体は、ＥＮａＣ活性の調節因子として有用であり、
ＥＮａＣ発現／活性を検出するためのイムノアッセイ、並びに前記ＥＮａＣタン
パク質の野生型および改変された変異体を精製するのに有用である。
Ｃ．ＥＮａＣコーディング核酸分子
上記のように、本発明は、ＥＮａＣタンパク質の野生型または改変された変異
体をコードする核酸分子をヒトから単離することに、一部基づく。従って、本発
明は、さらにここで開示されたＥＮａＣタンパク質の野生型および改変された変
異体をコードする核酸分子を、好ましくはここで定義されたように単離した形態
で提供する。便宜上、すべてのＥＮａＣをコーディング核酸分子は、「ＥＮａＣ
コーディング核酸分子」、「ＥＮａＣ遺伝子」または「ＥＮａＣ」と呼ばれる。
同定された、野生型および改変されたＥＮａＣコーディング核酸分子核酸配列は
、図１−３に提供される。
ここで用いられる、「核酸分子」は、上で定義されたようにペプチドをコード
するか、或いは係るペプチドをコードする核酸配列に相補的なＲＮＡまたはＤＮ
Ａ分子として定義される。特に、好ましい核酸分子は、ここで開示されるヒトｃ
ＤＮＡ配列と同一か、または相補的な核酸配列を有するであろう。特別に意図さ
れるのは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡおよびアンチセンス分子、並びに
天然の起源に由来するかまたは合成されたかにかかわらず、代わりのバックボー
ンに基づく、または代わりの塩基を含む核酸である。しかしながら、係る核酸分
子は、新規であり、且つヒト以外の生物から単離されたＥＮａＣのヒト以外の同
族体、および既知のヒトＥＮａＣタンパク質をコードするいかなる先行技術の核
酸分子に対して自明でないと、さらに定義される。
ここで用いられる、核酸分子は、該核酸分子がＥＮａＣ以外のポリペプチドを
コードする汚染核酸分子から実質的に分離されたとき、核酸分子は「単離された
」と言われる。熟練した技術者は、容易に核酸単離操作を採用して、単離された
ＥＮａＣコーディング核酸分子を得ることができる。
本発明は、さらに本発明のＥＮａＣコーディング核酸分子の断片を提供する。
ここで用いられるＥＮａＣコーディング核酸分子の断片とは、全タンパク質コー
ディング配列の小さな一部分を指す。前記断片のサイズは、意図する用途によっ
て決定される。例えば、断片が細胞内、または細胞外ドメインのようなＥＮａＣ
タンパク質の活性部分をコードするように選ばれる場合、断片は、前記ＥＮａＣ
タンパク質の機能的な領域をコードするのに充分大きい必要があるだろう。断片
が核酸プローブまたはＰＣＲプライマーとして使用されるはずなら、断片の長さ
は、プロービング／プライミングの間に比較的少ない誤った陽性数を与えるよう
に選ばれる。図１−３は、選択的なハイブリダイゼーションプローブまたはＰＣ
Ｒプライマーとして特に有用である前記ＥＮａＣ遺伝子の断片を同定する。係る
断片は、ＥＮａＣの野生型または改変された変異体の間で保存されている領域、
以前に同定されたＥＮａＣ遺伝子と共有されるホモロジー領域、そしてＥＮａＣ
遺伝子の改変された変異体の中で改変されている領域を含む。
ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）のためのプローブまたは特異的なプライマ
ーとして、或いはＥＮａＣタンパク質をコードする遺伝子配列を合成するために
使用する、本発明のＥＮａＣコーディング核酸分子の断片（すなわち合成オリゴ
ヌクレオチド）は、例えばMatteucciらのホスホトリエステル法（Matteuucci et
al.，J．Am ChemSoc（1981）103：3185−3191）または自動合成法のような化学
的手法によって容易に合成することができる。さらに、より大きなＤＮＡ断片は
、前記ＥＮａＣ遺伝子の様々なモジュール断片を定義する一群のオリゴペプチド
の合成、それに続く完全な修飾ＥＮａＣ遺伝子を作り上げるためのオリゴペプチ
ドの連結等の、よく知られた方法で容易に調製することができる。
本発明のＥＮａＣコーディング核酸分子は、さらに診断用およびプローブ用の
検出可能な標識を含むように修飾されていてもよい。上記のように係るプローブ
は、野生型または改変されたＥＮａＣタンパク質の他のアレレ変異体をコードす
る核酸分子を同定するために使用できる、そして下記のように係るプローブは、
異常なイオン輸送によって引き起こされる病理状態を診断する手段として、ＥＮ
ａＣタンパク質の改変された変異体の存在を診断するために使用できる。種々の
係る標識は、技術分野で知られており、そしてここに記載されるＥＮａＣコーデ
ィング核酸分子とともに手軽に採用することができる。適当な標識は、ビオチン
、放射能標識されたヌクレオチドおよびビオチン等を含むが、これらに限定はさ
れない。熟練した技術者は、技術分野で知られているいかなる標識をも採用して
、標識されたＥＮａＣコーディング核酸分子を得ることができる。
Ｄ．ＥＮａＣコーディング核酸分子の他の野生型および改変された形態の単離
上記のように、イオン輸送に媒介された欠乏症、特にＰＨＡ１の病状／厳しさ
におけるＥＮａＣタンパク質の役割を同定することによって、異常な(減少した)
イオン輸送に関連した病状をもたらすＥＮａＣタンパク質の幾つかの改変された
変異体の同定が可能となつた。これらの観察によって熟練した技術者は、ここに
記載される配列に加えて、ＥＮａＣタンパク質の他の野生型および改変された変
異体をコードする核酸分子を単離することが可能である。
実質的に、熟練した技術者は、ヒトＥＮａＣタンパク質のアミノ酸配列を使用
して、細胞から作成された発現ライブラリーをスクリーンするために抗体プロー
ブを生成することが容易にできる。典型的に、精製されたタンパク質（下記）で
免疫化されたウサギ等の哺乳動物からのポリクロナール抗血清、或いはモノクロ
ナール抗体を使用して、ＥＮａＣタンパク質の野生型または改変された変異体の
適当なコード配列を得るために、正常なまたは罹患した個体から調製されたラム
ダｇｔｌｌライブラリーのようなヒトｃＤＮＡまたはゲノム発現ライブラリーを
プローブすることができる。前記クローン化ｃＤＮＡ配列は、融合タンパク質と
して発現され得るか、それ自身の制御配列を用いて直接発現され得るか、または
酵素の発現に使用される特定の宿主にとって適切な制御配列を用いる作成法によ
って発現され得る。図１−３は、重要な作用ドメイン、そしてＥＮａＣタンパク
質の突然変異した変異体の中での、改変を含むことが示されたドメインを同定す
る。プローブ、診断用および治療用抗体を製造するために、係る領域は、ＥＮａ
Ｃタンパク質の抗原性部分の好適な供給原である。
代わりに、ここに記載されるＥＮａＣコーディング配列の一部分を合成するこ
とができ、そして正常なイオン輸送を有する個体から、または異常なイオン輸送
の結果である病理状態に苦しむ個体からＥＮａＣ族のタンパク質の一つの構成タ
ンパク質をコードするＤＮＡを回収するプローブとして使用することができる。
約１８−２０のヌクレオチド（約６−７のアミノ酸範囲をコードする）を含むオ
リゴマーを調製し、そしてゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリー
ンして、ストリンジェント条件または過度の誤った陽性レベルをなくすのに十分
ストリンジェントな条件でのハイブリダイゼーションを得るのに使用する。この
方法は、ＥＮａＣコーディング配列の改変されたおよび野生型の変異体を同定し
、そして単離するのに使用できる。
さらに、ＥＮａＣコーディング核酸分子またはその断片を選択的に増幅／クロ
ーンするために、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）で使用する目的でオリゴヌ
クレオチドプライマーの組を調製できる。係るＰＣＲプライマーを用いるＰＣＲ
変性／アニール／クローンのサイクルは、技術分野でよく知られており、そして
容易に他のＥＮａＣコーディング核酸分子を単離するのに使用するよう適合され
得る。図１−３は、プローブ、またはプライマーとして使用するのに最適のヒト
ＥＮａＣ遺伝子の領域を同定する。一般に、好ましいプライマーは、前記ＥＮａ
Ｃコーディング核酸分子の一若しくは複数のエキソンを挟むことになる。
Ｅ．異常なイオン輸送に伴う病理状態を同定する方法
本発明は、さらに前記ＥＮａＣタンパク質、または前記ＥＮａＣ遺伝子の活性
且つ改変された変異体を発現する細胞および個体を同定する方法を提供する。変
化した（減少した）イオン輸送に関連する生物学的および病理学的な過程、特に
ＰＨＡ１、ＰＨＡ１の進行、治療に対するＰＨＡ１の感受性、そしてＰＨＡ１の
ための治療の有効性を診断するために、係る方法を使用できる。本発明の方法は
、イオン輸送欠乏、特にＰＨＡ１のキャリアーを同定する、並びにＰＨＡ１とそ
の他のイオン輸送障害を識別するのに特に有用である。すなわち、前記ＥＮａＣ
タンパク質の野生型または改変された変異体、或いは該ＥＮａＣタンパク質をコ
ードする核酸が細胞中に発現されるかどうかを決定することにより、ＥＮａＣタ
ンパク質の野生型または改変された変異体の存在を同定することができる。改変
された変異体の発現、または正常なレベルのＥＮａＣ発現からの逸脱（発現の減
少）は、異常なＥＮａＣ活性／発現によって媒介される病理状態を診断するため
の、様々なイオン輸送欠乏を区別するための、そしてイオン輸送欠乏のキャリア
ーを同定するための手段として使用できる。
ＥＮａＣタンパク質の野生型または改変された変異体が特定の細胞で発現され
／産生されているかどうか、そして／または前記タンパク質が発現されるレベル
を決定するのに、様々免疫学的および分子遺伝学的手法が使用できる。好ましい
方法は、前記ＥＮａＣタンパク質の野生型または突然変異された形態が発現され
たかどうか同定する。
一般に、核酸分子を含む抽出物またはタンパク質を含む抽出物が個体の細胞か
ら調製される。ＥＮａＣタンパク質、またはＥＮａＣコーディング核酸分子が前
記細胞中に産生されているかどうか決定するために、前記抽出物は、それからア
ッセイされる。発現されたのは、タンパク質か核酸分子かの種類および／または
発現の程度／レベルは、ＥＮａＣ活性の性質および程度の測定基準を提供する。
例えば、核酸分子に基づく診断テストを実施するために、適当な核酸試料を従
来の手法を用いて患者から調製して得る。例えば、ＤＮＡは、単に試料をＳＤＳ
中で煮沸することにより調製できる。最も典型的には、前記核酸分子を提供する
ために、核酸試料として、血液試料、頬のスワブ、毛包調製物、または鼻吸引液
が細胞の供給源として使用される。その後、抽出核酸は、例えば標準的な操作に
従い、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）を用いることにより増幅に供し、選択
的にＥＮａｃコーディング核酸分子またはその断片を増幅することができる。増
幅された断片のサイズ（典型的には、制限エンドヌクレアーゼ消化によって）は
、その後ゲル電気泳動を用いて決定される、或いは断片の核酸配列が決定される
。例えば、WeberおよびMay，Am J Hum Genet（1989）44:388−339、Davies，J．
et al．Nature（1994）371：130−136を参照。得られた断片または核酸のサイズ
は、それからＥＮａＣタンパク質の公知の野生型、予測される野生型、公知の改
変されたおよび予測される改変された変異体と比較される。この方法を用いて、
ＥＮａＣタンパク質の野生型または改変された変異体の存在が識別されそして同
定できる。
別法として、ＥＮａＣコーディング核酸分子内での一若しくは複数の単一塩基
対の多形現象の有無は、次の方法に限定はされないが、これらを含む従来の方法
によって決定することができる。これらは、手動および自動の蛍光性ＤＮＡシー
ケンシング、選択的ハイブリダイゼーションプローブ、プライマー伸長法(Nikif
orv，T．T．et al．Nucl Acids Res（1994）22:4167−4175)、オリゴヌクレオチ
ドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）(Nickerson，D.A.et al Proc Natl Acad S
ci USA(1990)87：8923−8927)、アレレー特異的ＰＣＲ法(Rust，S．et al．Nucl
Acids Res（1993）6：3623−3629)、ＲＮａｓｅミスマッチ開裂、一本鎖コンホ
ーメーションポリモルフィズム(ＳＳＣＰ)(Orita,M.et al,Proc Natl Acad Sci
USA 86：2766−2770(1989))、変性グラディエントゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）等
である。本診断法は、試料中に多くの配列変化のうちの一つが存在するかどうか
を特定するのに使用するために、開発されているバイオチップ技術に用いるのに
最適である。熟練した技術者は、容易に、いかなる核酸分析法をも、試料がＥＮ
ａＣタンパク質の野生型、または改変された変異体をコードする核酸分子を含む
かどうか決定するのに用いるよう適合させることができる。
核酸に基づく診断テストを実施するために、適当なタンパク質試料を従来の手
法を用いて被験者から調製して得る。タンパク質試料は、例えば単に試料をＳＤ
Ｓと混合し、続いてタンパク質フラクションの塩沈殿により調製できる。典型的
には、前記タンパク質を提供するために、タンパク質試料として、血液試料、頬
のスワブ、毛包調製物、鼻吸引液、またはＥＮａＣタンパク質を発現する組織か
ら細胞のバイオプシーが細胞の供給源に使用される。その後、抽出タンパク質を
、公知の方法を用いてＥＮａＣタンパク質の野生型、または改変された変異体の
有無を決定するために分析することができる。例えば、特定の長さにされた、ま
たは荷電された変異体の存在を電場中での移動度を用いて、同定できる。代わり
に、野生型、または改変された変異体に特異的な抗体を使用することができる。
熟練した技術者は、容易に、公知のタンパク質分析法を、試料がＥＮａＣタンパ
ク質の野生型、および／または改変され変異体を含むかどうか決定するのに適合
させることができる。
ＥＮａＣ発現は、天然に存在するＥＮａＣ遺伝子の発現における減少の結果起
きる、障害を特定する方法にも使用することができる。特に、ｍＲＮＡを検出す
る核酸プローブは、ＥＮａＣタンパク質を発現する細胞または組織、そして係る
発現のレベルを検出するのに使用できる。
試料中のＥＮａＣタンパク質の改変された変異体（同型接合の状態）のみの存
在は、ＰＨＡ１の症状を示す。さらにＥＮａＣタンパク質の野生型の変異体を含
み、前記ＥＮａＣタンパク質の改変された変異体が試料中に存在するとき、ＰＨ
Ａ１キャリアーおよび低いレベルの活性ＥＮａＣを発現する個体の症状を示す。
減少したＥＮａＣ活性は、軽度のイオン輸送欠乏に導き、そして副作用を受け易
くする。
代わりに、ＥＮａＣ発現は、天然に存在するＥＮａＣ遺伝子の発現のレベルを
増加または減少させる薬剤を同定する方法にも使用できる。例えば、ＥＮａＣタ
ンパク質を発現する細胞または組織を試験薬剤と接触させ、その薬剤のＥＮａＣ
発現に対する効果を測定することができる。ＥＮａＣ発現を活性化する薬剤は、
ＥＮａＣ活性の作用薬として使用でき、一方ＥＮａＣ発現を減少させる薬剤は、
ＥＮａＣ活性の拮抗薬として使用できる。
Ｆ．ＥＮａＣコーディング核酸分子を含むｒＤＮＡ分子
本発明は、さらに一若しくは複数のここに記載される野生型または改変された
ＥＮａＣコーディング配列、或いはここに記載される核酸分子の断片を含む、組
換えＤＮＡ分子（ｒＤＮＡｓ）を提供する。ここで用いられるｒＤＮＡ分子とは
、生体外の分子操作に供されたＤＮＡ分子である。ｒＤＮＡ分子を生成する方法
は、
技術分野においてよく知られている。例えば、Sambrook et al.,Molecular Clon
ing（1989）を参照。好ましいｒＤＮＡ分子内では、ＥＮａＣタンパク質の野生
型または改変された変異体をコードするＥＮａＣコーディングＤＮＡ配列が一若
しくは複数の発現制御配列そして／またはベクター配列に操作的に結合されてい
る。最も好適には、前記ＥＮａＣコーディング核酸分子は、ここに記載される新
規な改変された変異体の一つをコードする。
本発明のＥＮａＣコーディング核酸配列の一つが操作的に結合されている、ベ
クター配列そして／または発現制御配列の選択は、技術分野においてよく知られ
ているように、望ましい機能的特性、例えばタンパク質発現そして形質転換され
る宿主細胞等に直接依存する。本発明によって意図されるベクターは、前記ｒＤ
ＮＡ分子に含有されるＥＮａＣコーディング配列の複製または宿主染色体への挿
入、そして好ましくは発現もまた指示することが少なくとも可能である。
操作的に結合されたタンパク質コーディング配列の発現を調節するのに使用さ
れる発現制御要素は、技術分野においてよく知られている、そして誘導プロモー
ター、構成プロモーター、分泌シグナル、エンハンサー、転写ターミネーター、
そしてその他の調節要素を含むがそれらに限定されない。好ましくは、宿主細胞
の培地中で栄養素に対して応答するなど、容易に制御される誘導プロモーターが
使用される。
一つの実施の形態では、ＥＮａＣコーディング核酸分子を含むベクターは、原
核レプリコン、すなわち細菌宿主細胞等の、組換えＤＮＡ分子で形質転換された
原核宿主細胞において、染色体内での前記組換えＤＮＡ分子の自律的複製および
維持を行う能力を有するＤＮＡ配列を包含する。係るレプリコンは、技術分野に
おいてよく知られている。さらに、原核レプリコンを包含するベクターは、その
発現が薬剤耐性等の検出できるマーカーを与える遺伝子をも含んでよい。典型的
な細菌性の薬剤耐性遺伝子は、アンピシリンまたはテトラサイクリンに対する耐
性を与えるものである。
原核レプリコンを包含するベクターは、さらに大腸菌等の細菌宿主細胞中で、
前記ＥＮａＣコーディング配列の発現（転写および翻訳）を指示することが可能
な原核性またはウィルス性プロモーターを包含することができる。プロモーター
とは、ＲＮＡポリメラーゼの結合および転写が起こることを可能にする、ＤＮＡ
配列によって形成される発現制御要素である。細菌宿主と適合性のあるプロモー
ター配列は、典型的に、本発明のＤＮＡ断片を挿入するために便利な制限部位を
含むプラスミドベクター中に提供される。係るベクタープラスミドの典型的なも
のは、Ｂｉｏｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）か
ら入手できるｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２、およびｐＢＲ３２９、並びに
Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪから入手できるｐＰＬおよびｐ
ＫＫ２２３である。
真核細胞と適合性のある発現ベクター、好ましくは脊椎動物細胞と適合性のあ
るものは、ＥＮａＣコーディング配列を含むｒＤＮＡ分子を変異させるのにも使
用できる。真核細胞発現ベクターは、技術分野においてよく知られており、そし
ていくつかの商業的供給源から入手可能である。典型的に、係るベクターは、所
望のＤＮＡ断片を挿入するための便利な制限部位を含んで提供される。係るベク
ターの典型的なものは、ＰＳＶＬおよびｐＫＳＶ−１０(Ｐｈａｒｍａｃｉａ)、
ｐＢＰＶ−１／ｐＭＬ２ｄ(Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔｅｈｎｏｌｏ
ｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．)、ｐＴＤＴ１(ＡＴＣＣ，＃３１２５５)、ここに記載され
るベクターｐＣＤＭ８、および同様な真核細胞と適合性のある発現ベクターであ
る。
本発明のｒＤＮＡ分子を作成するために使用される真核細胞発現ベクターは、
さらに真核細胞中で有効な選択可能なマーカー、好ましくは薬剤耐性選択マーカ
ーを包含してもよい。好ましい薬剤耐性選択マーカーは、その発現がネオマイシ
ン耐性、すなわちネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子を生
む遺伝子である(Southern et al.，J Mol Anal Genet（1982）１：327−321)。
別法として、前記選択可能なマーカーは、別のプラスミド上に存在でき、前記二
つのベクターは宿主細胞のコトランスフェクション（ｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉ
ｏｎ）によって導入され、そして選択可能なマーカーのための適当な薬剤の存在
下、培養することによって選択される。
Ｇ．外から供給されたＥＮａＣコーディング核酸分子を含む宿主細胞
本発明は、さらに本発明の野生型または改変されたヒトＥＮａＣタンパク質の
一つをコードする核酸分子で形質転換された宿主細胞を提供する。前記宿主細胞
は、原核または真核のいずれでもあり得る。ＥＮａＣタンパク質の発現に有用な
真核細胞は、細胞系が細胞培養法と適合性があり、そして前記発現ベクターの増
殖およびＥＮａＣ遺伝子の発現と適合性があるかぎり限定されない。好ましい真
核宿主細胞は、酵母、昆虫および哺乳動物細胞、好ましくは、マウス、ラット、
モンキーまたはヒト繊維芽細胞系からのもののような脊椎動物細胞を包含するが
、これらに限定されない。最も好適には、自然にはヒトＥＮａＣタンパク質を発
現しない細胞である。
いかなる原核宿主もＥＮａＣコーディングｒＤＮＡ分子を発現するのに使用す
ることができる。好ましい原核宿主は、大腸菌である。
本発明のｒＤＮＡ分子での適当な細胞宿主の形質転換は、使用するベクターの
種類および採用する宿主系に、典型的に依存するよく知られた方法によって達成
される。原核宿主細胞の形質転換に関して、エレクトロポーレーションおよび塩
処理法が典型的に採用される。例えば、Cohen et al.，Proc Acad Sci USA（197
2）69：2110、およびManiatis et al.，Molecular Cloning A Laboratory Manua
l，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor NY（1982）を参照。
ｒＤＮＡを含むベクターでの脊椎動物細胞の形質転換に関して、エレクトロポー
レーション、陽イオン性脂質または塩処理法が典型的に採用される。例えば、Gr
aham et al.，Virol（1973）52：456、Wigler et al.，Proc Acad Sci USA（197
9）76：1373−76を参照。
うまく形質転換された細胞、すなわち本発明のｒＤＮＡ分子を含む細胞は、よ
く知られた手法によって同定できる。例えば、本発明のｒＤＮＡの導入の結果得
られる細胞は、クローン化して単一コロニーを産生することができる。これらの
コロニーから細胞は収穫され、溶解され得る、そしてそれらのＤＮＡ内容物をSo
urthern，J MolBiol（1975）98：503またはBerent et al.，Biotech（1985）3：
208によって記載された方法等を用いて、ｒＤＮＡの存在について調べることが
できる。或いは、免疫学的な方法を介してアッセイされた細胞からタンパク質を
製造することができる。
Ｈ．ｒＤＮＡ分子を用いるＥＮａＣタンパク質の製造
本発明は、さらにここに記載されるＥＮａＣコーディング核酸分子の一つを用
いる、野生型または改変されたヒトＥＮａＣタンパク質を製造する方法を提供す
る。一般的表現では、野生型または改変された組換えヒトＥＮａＣタンパク質の
製造は、典型的には以下の工程を含む。
まず、図１−３に示された核酸分子のようなＥＮａＣをコードする核酸分子を
得る。前記ＥＮａＣコーディング配列がイントロンによって中断されていない場
合、それはいかなる宿主中でも直接、発現に適している。もしそうでないなら、
前記ＥＮａＣコーディング核酸分子のスプライスされた変異体を生成することが
でき、そして使用できる。或いは、核酸分子を含むイントロンが適合性のある真
核発現系中で使用できる。
前記ＥＮａＣコーディング核酸分子は、それから好ましくは、上記のように適
当な制御配列と操作的な結合状態に置かれ、前記ＥＮａＣコーディング配列を含
む発現単位を形成する。前記発現単位は、適当な宿主を形質転換するために使用
され、そして形質転換された宿主は、ＥＮａＣタンパク質の製造を可能にする条
件下、培養される。随意には、前記ＥＮａＣタンパク質が培地または細胞から単
離される。タンパク質の回収および精製は、多少の不純物が許容される場合、必
要でないかもしれない。
前記の工程の各々は、種々のやり方で実施できる。例えば、所望のコード配列
は、ゲノム断片から得てもよく、適当な宿主中で直接使用できる。種々の宿主中
で操作可能な発現ベクターの作成は、レプリコンと制御配列の適当な組み合わせ
を用いるよって達成される。制御配列、発現ベクター、および形質転換方法は、
遺伝子を発現するのに使用される宿主細胞の種類に依存し、そして以前に詳細に
議論された。これらのベクターに挿入する切り取り可能な遺伝子を提供できるよ
うに適当な制限部位が、もし通常、なければ、コード配列の末端に付加すること
ができる。熟練した技術者は、容易に、技術分野で知られているいかなる宿主／
発現系をも、ＥＮａＣタンパク質を製造するためにＥＮａｃコーディング配列と
使用するのに適合させることができる。特に、最適なものは、発現されたタンパ
ク質を含む脂質小胞の産生をもたらす発現系である。係る脂質含有小胞は、前記
ＥＮａＣタンパク質の作用薬および拮抗薬の同定に最適である。
Ｉ．イオン輸送
上述のように、前記ＥＮａＣタンパク質の変化は、異常イオン輸送の結果であ
る病理状態を引き起こす。従って、本発明の前記ＥＮａＣタンパク質の野生型お
よび改変された変異体は、ナトリウムの細胞外または細胞内濃度を変化する方法
に使用できる。一般的に、ＥＮａＣタンパク質の発現またはＥＮａＣタンパク質
の活性を変化させることにより、ナトリウムの細胞外または細胞内濃度を変化さ
せることができる。
ナトリウムの細胞外または細胞内濃度を変化させることが望ましい数々の状況
がある。異常な細胞外または細胞内ナトリウムは、塩消耗および低カリウム血症
性アシドーシスに導く。従って、ＥＮａＣタンパク質、またはＥＮａＣ遺伝子は
、細胞外または細胞内ナトリウム濃度を変化させるための標的または手段として
使用できる。例えば、ＥＮａＣ発現を増加させるために、ＥＮａＣ遺伝子を細胞
に導入し、そして発現させることができる。これによって、細胞外および細胞内
イオンレベルを変化させる手段および方法が提供される。
不適当な細胞外または細胞内ナトリウム濃度によって特徴づけられる病理状態
がある。例えば、ＰＨＡ１、低カリウム血症性アシドーシスおよび塩消耗は、す
べて異常な細胞外または細胞内ナトリウム濃度と関連がある。従って、ＥＮａＣ
活性／発現がこれらの症状を治療する手段として、目標とされる。ＥＮａＣ活性
／発現を調節する種々の方法を以下で詳細に議論する。
Ｊ．ＥＮａＣタンパク質に結合する薬剤の同定
本発明の別の実施の形態に従えば、ここに記載されるＥＮａＣタンパク質の作
用薬または拮抗薬である薬剤を同定する方法が提供される。すなわち、ＥＮａＣ
タンパク質の作用薬または拮抗薬は、ここに記載されるＥＮａＣタンパク質の野
生型または改変された変異体の一つに結合するその薬剤の能力によって、まず同
定することができる。ＥＮａＣタンパク質に結合する薬剤は、それからＥＮａＣ
発現細胞中でのナトリウム輸送を促進する、または阻止する能力について試験す
ることができる。
詳しくは、ＥＮａＣタンパク質を薬剤と混合する。ＥＮａＣと前記薬剤との会
合を可能にする条件下、混合した後、混合物を分析して薬剤がＥＮａＣタンパク
質に結合したかどうか決定する。作用薬および拮抗薬は、ＥＮａＣタンパク質に
結合することができるものとして同定される。
上記のアッセイに使用されるＥＮａＣタンパク質は、次のものであり得る。す
なわち、単離され、完全に特定されたタンパク質、部分的に精製されたタンパク
質、ＥＮａＣタンパク質を発現するように改変された細胞、またはＥＮａＣタン
パク質を発現するように改変された細胞の分画である。さらに、前記ＥＮａＣタ
ンパク質は、全ＥＮａＣタンパク質、ＥＮａＣタンパク質の特定の断片、または
ＥＮａＣタンパク質の単一サブユニットであり得る。前記ＥＮａＣタンパク質が
薬剤結合、例えば、分子量の移動または細胞内イオン含量の変化についてアッセ
イされ得るかぎり、本アッセイ法を使用できることは当業者にとって明白である
。
ＥＮａＣタンパク質に薬剤が結合するかどうかを決定するのに使用する方法は
、第一に用いたＥＮａＣタンパク質の性質に基づくことになる。例えば、薬剤が
ＥＮａＣタンパク質の可溶性断片に結合するかどうかを決定するために、ゲル遅
延アッセイが使用できる。一方、パッチクランピング(ｐａｔｃｈ ｃｌａｍｐｉ
ｎｇ)、電圧クランピング、イオン感受性マイクロプローブまたはイオン感受性
クロマホーレ（ｃｈｒｏｍａｐｈｏｒｅｓ）は、薬剤がＥＮａＣタンパク質を発
現する細胞に結合し、発現されたタンパク質の活性に影響するかどうかを決定す
るのに使用できる。熟練した技術者は、容易に、特定の薬剤がＥＮａＣタンパク
質に結合するかどうかを決定するための数々の手法を採用することができる。
結合が立証されると、、続いて細胞または卵母細胞発現系およびＥＮａＣ活性
を検出するアッセイを用いて、ＥＮａＣタンパク質の野生型または改変された変
異体の活性を調節する能力について薬剤を試験することができる。例えば、電圧
またはパッチクランピング、イオン感受性マイクロプローブまたはイオン感受性
クロマホーレそしてツメガエル卵母細胞、または組換え宿主細胞中での発現を使
用して、ＥＮａＣタンパク質に結合する薬剤がＥＮａＣ活性に作動することがで
きるか、拮抗することができるかを決定できる。
ここで用いる用法として、薬剤がＥＮａＣ活性を減少させるとき、その薬剤は
ＥＮａＣ活性に拮抗するという。好ましい拮抗薬は、他の細胞内タンパク質、特
に他のイオン輸送タンパク質に影響を与えることなく、ＥＮａＣに選択的に拮抗
する。さらに、好ましい拮抗薬は、ＥＮａＣ活性を５０％以上、より好ましくは
、９０％以上減少させ、最も好ましくは、すべてのＥＮａＣ活性をなくする。
ここで用いる用法としては、薬剤がＥＮａＣ活性を増加させるとき、その薬剤
はＥＮａＣ活性に作動するという。好ましい作用薬は、他の細胞内タンパク質、
特に他のイオン輸送タンパク質に影響を与えることなく、ＥＮａＣの改変された
変異体に選択的に作動する。さらに、好ましい作用薬は、ＥＮａＣ活性を５０％
以上、より好ましくは、９０％以上増加させ、最も好ましくは、ＥＮａＣ活性の
レベルを二倍以上にする。
上記の方法でアッセイされる薬剤は、ランダムに選択、または合理的に選択若
しくは設計することができる。ここで用いる用法としては、薬剤が前記ＥＮａＣ
タンパク質の特定の配列を考慮することなしにランダムに選ばれるとき、その薬
剤はランダムに選択されるという。ランダムに選択された薬剤の一つの例は、化
学ライブラリーまたはペプチドコンビナトリアルライブラリー、或いは、生物体
の培養ブロスを使用することである。
ここで用いる用法としては、薬剤が標的部位の配列そして／またはその薬剤の
作用に関係するコンフォメーションを考慮にいれて、ランダムでない基準で選ば
れるとき、その薬剤は合理的に選択若しくは設計されるという。ＥＮａＣタンパ
ク質を構成するペプチド配列を利用することによって、薬剤を合理的に選択若し
くは設計することができる。例えば、合理的に選択された薬剤は、そのアミノ酸
配列がＥＮａＣタンパク質の一断片と同一であるペチドであり得る。
例えば、本発明の薬剤は、ペプチド類、小さい分子類、ビタミン誘導体類、お
よび炭水化物類であり得る。熟練した技術者は、本発明の薬剤の構造的性質に関
して制限のないことが容易に認識できる。本発明の薬剤の一つのクラスは、その
アミノ酸配列がＥＮａＣタンパク質のアミノ酸配列に基づいて選ばれたペプチド
剤である。
本発明のペプチド剤は、技術分野で知られているように、標準的な固相（また
は液相）ペプチド合成法を用いることによって調製できる。さらに、これらのペ
プチドをコードするＤＮＡは、商業的に入手可能なオリゴヌクレオチド合成機器
を用いて合成され、そして標準的な組換え製造システムを用いて製造される。遺
伝子でコードされないアミノ酸が含まれるなら、固相ペプチド合成を用いる製造
が必要とされる。
本発明の薬剤の別のクラスは、ＥＮａＣタンパク質の重要な位置に免疫反応す
る抗体類である。上記のように、抗体は、適当な哺乳動物の対象を抗原領域とし
て前記抗体によって標的にされるはずであるＥＮａＣタンパク質の部分を含むペ
プチドで免疫化することによって得られる。重要な領域は、図１−３中で特定さ
れたドメインを含む。
Ｋ．ＥＮａＣタンパク質に結合する薬剤の使用
「背景」の項で説明したように、ＥＮａＣタンパク質は、細胞内および細胞外
ナトリウム濃度の調節に関与している。ＥＮａＣタンパク質に結合し、そして作
用薬または拮抗薬として働く薬剤は、ＥＮａＣの機能と活性に関連する生物学的
および病理学的過程を調節するのに使用できる。詳しくは、ＥＮａＣタンパク質
に結合し、そしてＥＮａＣ活性の作用薬または拮抗薬として働く薬剤を対象に投
与することによって、ＥＮａＣに媒介される生物学的および病理学的過程は、調
節可能である。
ここで用いる用法として、対象は哺乳動物がＥＮａＣに媒介される生物学的お
よび病理学的過程の調節を必要としているかぎり、いかなる哺乳動物でもよい。
「哺乳動物」という用語は、哺乳綱に属する個体を意味する。本発明は、ヒト対
象の治療に特に有用である。
ここで用いる、「ＥＮａＣに媒介される生物学的および病理学的過程」は、Ｅ
ＮａＣタンパク質によって媒介される広範囲の細胞内の事象を指す。病理学的過
程は、有害な作用をもたらす生物学的過程の範疇を指す。例えば、ＥＮａＣによ
って媒介される病理学的過程は、ＰＨＡ１、低カリウム血症アシドーシス、およ
び塩消耗を包含する。これら病理学的過程は、ＥＮａＣタンパク質の活性を減少
または増加させる薬剤を用いて調節され得る。好ましくは、前記薬剤は、そのま
までは不活性なＥＮａＣタンパク質の改変された変異体を活性化するように作用
する。
ここで用いる用法は、薬剤が病理学的過程の程度または厳しさを減少させると
き、その薬剤は病理学的過程を調節するという。例えば、薬剤が正常な細胞内お
よび細胞外ナトリウム濃度へ貢献するとき、その薬剤はＰＨＡ１を調節するとい
う。
Ｌ．ＥＮａＣタンパク質の作用薬および拮抗薬の投与
ＥＮａＣタンパク質の作用薬および拮抗薬は、非経口的、皮下、静脈内、筋肉
内、腹腔内、経皮、または頬面の経路を介して投与することができる。代わりに
、または同時に、投与は経口経路でもよい。投与される用量は、患者の年齢、健
康、および体重、あるならば同時治療法の種類、治療の頻度、そして望ましい効
果の性質に依存するであろう。例えば、異常なイオン輸送、例えば、水保持、上
昇した血圧、慢性の呼吸性および代謝性アシドーシス、炎症等に由来する病理状
態を治療するために、ＥＮａＣ活性を調節する薬剤が治療される個体に全身的に
、または局所的に投与される。下記のように、係る薬剤を投与するために容易に
適合されうる多くの方法がある。
本発明は、さらにここに記載される方法によって同定されるＥＮａＣタンパク
質の拮抗薬または作用薬を含む組成物を提供する。個々の要求は変わるけれども
、各成分の有効量の最適範囲の決定は、当該技術水準内である。典型的な用量は
、０．１−１００μｇ／ｋｇ体重からなる。好ましい用量は、０．１−１０μｇ
／ｋｇ体重からなる。最も好ましい用量は、０．１−１μｇ／ｋｇ体重からなる
。
本発明の組成物は、薬理学的に活性な薬剤の他に、適当な薬学的に許容される
担体を含んでもよい。これは活性化合物を、薬学的に作用部位に運ぶのに使用す
ることができる製剤中に処理するのをた易くする賦形剤および助剤からなる。非
経口投与に適する製剤は、活性化合物の水溶性形態、例えば、水溶性塩の水溶液
を包含する。さらに、活性化合物の懸濁液そして適当なら、油性の注射用懸濁液
を投与してよい。適当な親油性の溶媒またはビヒクルは、脂肪油、例えば、ゴマ
油、或いは合成脂肪酸エステル、例えば、オレイン酸エチルまたはトリグリセリ
ドを包含する。水性注射用懸濁液は、懸濁液の粘度を増加する物質を含んでよく
、そして、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールそして
／またはディントラン（ｄｉｎｔｒａｎ）を包含する。随意的には、前記懸濁液
は安定化剤を含んでもよい。細胞へ運ぶのに薬剤をカプセル化するために、リポ
ゾームも使用できる。
本発明に従う、全身投与用の薬学的製剤は、腸内、非経口または局所投与とし
て製剤化される。実際、活性成分の全身投与を達成するために、三つのタイプ全
ての製剤を同時に使用してよい。
経口投与用の適当な製剤は、ハードまたはソフトゼラチンカプセル、丸薬、被
覆錠剤を含む錠剤、エレキシル、懸濁液、シロップまたは吸引剤そしてそれらの
徐放タイプを包含する。
Ｍ．併用療法
本発明のＥＮａＣ活性を調節する薬剤は、単独で、または特定の生物学的また
は病理学的過程を調節する別の薬剤との併用として提供され得る。例えば、本発
明のＥＮａＣ活性を減少させる薬剤は、ナトリウム輸送に影響を及ぼす他の薬剤
と併用して投与できる。ここで用いる用法としては、二つの薬剤が同時に作用す
るような様式で同時に投与されるか、または独立して投与されるとき、前記二つ
の薬剤は併用して投与されるという。
Ｎ．動物モデルおよび遺伝子療法
前記ＥＮａＣ遺伝子およびＥＮａＣタンパク質は、様々な意味で遺伝子療法の
ための標的としても役に立つ。例えば、一つの応用例では、ＥＮａＣ欠損のヒト
以外の動物を、ＥＮａＣ遺伝子を不活性化する標準的なノックアウト法を用いて
つくることができる。代わりに、もし係る動物が生育不能であれば、誘発性ＥＮ
ａＣアンチセンス分子を用いて、ＥＮａＣ活性／発現を調節できる。別法として
、ＥＮａＣまたはアンチセンス分子の発現を組織特異的な様式で指示するＥＮａ
ＣまたはアンチセンスＥＮａＣ発現ユニットを含むように、動物を改変できる。
このような場合、ＥＮａＣ遺伝子の発現が不活性化、または活性化によって改変
されている、例えばマウスまたはラットであるヒト以外の動物をつくる。これは
、例えば、標的組換え(ｔａｒｇｅｔｅｄｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ)等の様々
な当該技術で知られている方法を用いて達成できる。一旦つくられると、前記Ｅ
ＮａＣ欠損動物、すなわち組織特異的な様式でＥＮａＣを発現する動物、または
アンチセンス分子を発現する動物は、次の目的に使用できる。（１）ＥＮａＣに
よって媒介される生物学的および病理学的過程を同定する、（２）ＥＮａＣと相
互作用するタンパク質および他の遺伝子を同定する、（３）ＥＮａＣ欠損を克服
するのに外から供給されうる薬剤を同定する、そして（４）活性を増加または減
少させるＥＮａＣ内の突然変異を同定するための適当なスクリーンとして用いる
。
例えば、ＥＮａＣ用のヒトミニ遺伝子を組織特異的な様式で発現するトランス
ジェニックマウスつくり、そして通常ＥＮａＣを含まない細胞および組織中での
前記タンパク質の過剰発現の影響を試験することが可能である。この戦略は、他
のタンパク質、すなわちｂｃｌ−２（Veis et al．Cell 75：229(1993)）に使用
されて、成功した。係るアプローチは、容易にＥＮａＣタンパク質に応用でき、
そして特定の組織の分野で潜在的なＥＮａＣの有利な効果という議題を提出する
のに用いることができる。
別の実施の形態において、ＥＮａＣに媒介された生物学的または病理学的過程
を調節する手段として遺伝子療法を使用できる。例えば、治療されている対象に
ＥＮａＣ発現のモデュレーターをコードする遺伝発現ユニット、例えば、アンチ
センスコーディング核酸分子、またはＥＮａＣコーディング核酸分子、または機
能的ＥＮａＣ発現ユニット等を導入することが望ましい。係るモデュレーターは
、構成的に製造されうるか、或いは細胞または、特定の標的細胞中に誘発しうる
。これは対象内でＥＮａＣモデュレーターの継続的なまたは誘発されうる供給、
或いは前記タンパク質発現を可能とする。
下記の実施例は、本発明の側面を例示することを意図し、これらを限定するこ
とを意図しない。
実施例 １
方法 遺伝子型決定（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）およびＳＳＣＰ
特定のプライマーを用いて、α、β、およびγＥＮａＣの全てのコーディング
エキソンのＳＳＣＰを以前報告されたＰＣＲ（Shimkets，R．A．et al．Cell 79
：407−414(1994)）によって実施し、ゲノムＤＮＡからエキソンまたはエキソン
１５０−２５０塩基対長さのエキソン断片を増幅した。各々のゲノム遺伝子座の
イントロン−エキソンの組織のクローニングおよび特定に基づき、４３組のプラ
イマーを使用した(表２)。Mcdonald，F．J.，et al．Am．J．Physiol．268：L72
8−734(1994)、Mcdonald，F．J.，et al．Am．J．Physiol．268：C1157−C1163
(1995)、Lu et al.，準備中。プライマーは、エキソン中の重なりあうプライマ
ー組を採用する、大きなコーディングエキソンを除いてイントロン中にある。以
前報告されたように(Simon，D．et al．Nature Genet．12：24−30(1996))、特
定のプライマーとゲノムＤＮＡを鋳型に用いて、ＰＣＲを実施して、生成物を非
変性ゲル上で分画した。新規なＳＳＣＰ配座異性体をオートラジオグラフィーで
同定し、精製し、そして以前報告された、直接ＤＮＡ配列分析に供した。全ての
ケースで両ＤＮＡ鎖をシーケンスすることによりＤＮＡ配列を確認した。α−、
β−、γＥＮａＣに密接に結合されているマーカーの遺伝子型は、標準的な方法
に従い、特定のプライマーとゲノムＤＮＡを鋳型に用いてポリメラーゼ連鎖反応
によって決定した。β−、γＥＮａＣの遺伝子座にしっかりと結合しているマー
カーは、以前報告されたように遺伝子型を決定した(Shimkets，R.A.et al．Cell
78：407−414(1994))。αＥＮａＣに結合しているマーカー遺伝子座は、ラット
αＥＮａＣｃＤＮＡをＴａｑ切断ヒトゲノムＤＮＡへハイブリダイズすることに
よって検出されたＲＦＬＰを使用して同定した。ＣＥＰＨ血族の１６６個体の遺
伝子型決定によって、Ｄ１２Ｓ３１４に対してテロメリックである２ｃＭ遺伝子
に局在する多重点ロッドスコアピークを持つ、αＥＮａＣの遺伝子座Ｄ１２Ｓ３
１４およびＤ１２Ｓ９３への連結が明らかとなった(組換えフラクション４％で
ロッドスコア８．３のＤ１２Ｓ３１４への連結)。ＰＨＡ血族からの被験者のゲ
ノムＤＮＡは、標準的方法に従って静脈血から調製した(Bell，G.，et al．Proc
．Natn．Acad．Sci．USA 78：5759−5763)。
ラットβＥＮａＣ３７Ｓの作成
変異原性のプライマーおよびＰＣＲを用いて、部位特異的変異誘発によってラ
ットβＥＮａＣｃＤＮＡの残基３７のグリシンをセリンに置換した。ラットβＥ
ＮａＣｃＤＮＡ２１を鋳型として、βＥＮａＣｃＤＮＡ配列の核酸１７０から１
９０まで延びる（コドン３３−３９）そして核酸１８１のＧをＡに改変した変異
原性のセンスプライマー(ＣＣＡＡＣＡＣＡＣＡＣＡＧＣＣＣＣＡＡＡＣ)、およ
び核酸３７８から４００まで延びる、リバースまたはアンチセンスプライマー(
ＣＴＴＧＡＣＣＴＴＧＧＡＧＴＡＣＴＧＧＡＡＧ)を用いてＰＣＲを実施した。
ＰＣＲの後、この生成物を精製し、そしてベクターＳｐ６プライマーと共にラッ
トβＥＮａＣｃＤＮＡを鋳型として用いるＰＣＲを実施するためにプライマーと
して使用した。得られた生成物は、所望の突然変異を含んでいた、そしてベクタ
ー配列中、ユニークなＥｃｏＲＩ開裂部位およびコドン１４６中、ユニークなＳ
ｃａＩ部位で開裂された。この断片を精製し、そしてβＥＮａＣｃＤＮＡ中の対
応する野生型配列を置換した。得られた変異体作成物の構造および配列をＤＮＡ
シーケンシングで確認した。正常なおよび突然変異体ＥＮａＣの発現研究
各α、β、γサブユニットの相補的ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）をインビトロで合成し
た。各サブユニットｃＲＮＡの等飽和濃度（各サブユニット／卵母細胞当たりの
３ｎｇ全ｃＲＮＡ）を、以前報告されたようにＶからＶＩ段階の卵母細胞に注射
した(Schild，L．et al．Proc．Natn．Acad．Sci．USA 92：5699−5703(1995))
。共に注射されたｃＲＮＡは、正常なα、β、およびγサブユニット、正常なα
およびγサブユニット加えて変異体βサブユニット、正常なαおよびγサブユニ
ットのみでβサブユニットなし、である。同一のカエルからの乱母細胞に同一の
日に野生型または突然変異体作成物を注射した。注射の２４時間後、全卵母細胞
電流を、２電極電圧クランプ手法を用いて、１２０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ
ＫＣｌ、１．８ｍＭ ＣａＣｌ2、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、ｐＨ７．２
を含む培地中で測定した。表されたＥＮａＣチャンネル活性を、アミロイドー感
受性ナトリウム電流の測定によって評価した。前記アミロイドー感受性ナトリウ
ム電流は、膜ポテンシャル−１００ｍＶで測定されるナトリウム電流における、
培地中５ｕＭアミロイドのある場合とない場合との差として定義される。
結果をＴ試験で分析した。
ツメガエル卵母細胞中で野生型βサブユニットとＧＳ３７Ｓ突然変異を含むも
のとの匹敵する発現レベルは、免疫沈殿によって確認された。それぞれ、α、β
、およびγサブユニット、またはαおよびγサブユニット、またはα、βＧ３７
ＳおよびγサブユニットをコードするｃＲＮＡを注射された卵母細胞は、（３５
Ｓ）メチオニンで１４時間、標識した、そしてミクロソーム膜を調製した。前記
三つのサブユニットを変性条件下、特異的抗血清で免疫沈殿させた、そして免疫
沈殿物を８％ ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分離した(Duc，C.，et al．J．
Cell．Biol．127：1907−1921(1994))。結果 ＰＨＡ血族
１０人の生存する罹患した被験者を含む７組のＰＨＡ１血族がサウジアラビア
およびイスラエル（表１）で確認された。これらの血族の内、二組ＰＨＡＫ１０
およびＰＨＡＫ３は、既に報告されていた。Mathew，P．M.，et al．Clinical P
ediatrics．１：58−60(1993)、Hanukoglu，A．J．Clin．Endocrin．& Metab．7
3，936−944(1991)。すべての罹患した被験者は、血族結婚の産物であり、常染
色体の劣性伝達を支持する(図１)。ほとんどの被験者は、新生児の時期に診断を
受けており、そしてすべてが正常な腎糸球体濾過速度にも拘わらず、酷い脱水症
、低血圧、低ナトリウム血症、高カリウム血症、および代謝性アシドーシスの臨
床的特徴を持っていた。血漿レニン活性およびアルドステロン濃度が顕著に上昇
していた。異常な男性化の兆候を持った被験者はいなかった。多重の臓器の関与
がＰＨＡ３で報告されていた(Hanukoglu,A.J.Clin.Endocrin.& Metab.73,936−9
44(1991))。幾つかの指標となる症例では、生後数日を経て同様な症候群で死亡
した血族の一員がいた。臨床管理は、食事のナトリウム補填およびカリウムレベ
ルを減少させるためにイオン結合樹脂または透析を使用することからなっていた
。臨床的特徴の一群は、すべての罹患した被験者でＰＨＡ１の確定的な診断を可
能にした。ＰＨＡ１におけるαＥＮａＣ内の突然変異
ＥＮａＣのαサブユニットは、ＥＮａＣ活性のために必要とされる(Canessa，
C．M.，et al．Nature 367：463−467(1994))、そしてその結果、この遺伝子中
の機能の低下突然変異は、ＰＨＡ１と同様な症候群をもたらし得る。血族結婚か
ら生じる罹患した被験者は、形質遺伝子座において同じアレレ突然変異体につい
て同型接合型であることが予想されている。対照的に、ランダム遺伝子座は、先
祖のアレレ体について実のいとこの子供達は１６分の１、そしてまたいとこの子
供達は６４分の１の予想で同型接合型であり、繋がりの強力なテストを提供する
(Lander，E．S．et al．Science 236：1567−1570(1987))。従って、αＥＮａＣ
のイントロンーエキソンの構造、および１本鎖の配座多形現象（ＳＳＣＰを使
用した）の知識が、ＰＨＡ１患者中のこの遺伝子のエキソンおよびイントロンー
エキソンの境界内で分子変異体をスクリーンするのに用いられた。前記７組の血
族のうち４組において罹患した被験者は、新規なαＥＮａＣ変異体を示した、各
々の場合、これらは各血族のすべての罹患した被験者において同型接合型であっ
た(図２ａ、図２ｂ)。他のミスセンス変異体、またはコンセンサススプライス部
位を変化させた変異体は同定されなかった。各々の場合、両親はこれらの変異体
に関して異型接合型であった、そして罹患した血族の一員は、誰も変異体の二つ
のコピーを受け継がなかったが、これは、これらの血族内でこれらの変異体がＰ
ＨＡ１と共に形質分離されていることを証明している(図１および図２)。
これらの変異体が曾祖父母から受け継いで同型接合型であるということは、こ
れらの変異体が稀であり(ＰＨＡ１をもたない血縁でない被験者からの１６０ア
レレ体にはない)、そしてαＥＮａＣ、ＤＳ１２Ｓ３１４およびＤ１２Ｓ９３（G
yapay，G．et al．Nature Genet．７：246−339(1994)）にしっかりと結合され
ている二つの高度な多形現象を示す遺伝子座は、これらの血族の罹患した被験者
においてそれぞれ同型接合型であるという知見により支持されている(データー
は示されていない)。
これらの３血族の罹患した被験者は、全員ダーレンにいると確認されたサウジ
アラビア人であり、互いに血縁であるとは知られていないが、彼らはαＥＮａＣ
のエキソン２中に、区別しえない同型接合型の変異体を示した(図２ａ)。前記こ
れらの血族中での変異体のＤＮＡ配列分析は、フレームシフト突然変異を導入す
る、コドンＩ６８位で２塩基対の欠失を明らかにした(図２ａ)。この突然変異は
、第一トランスメンブレンドメイン（図３ａ）の前のコードされたタンパク質を
乱す。前記コードされたタンパク質は、終止コドンが翻訳を停止するアミノ酸６
８乃至アミノ酸１４４の正常なタンパク質とは類似性を有しない。
イスラエルからのＰＨＡ Ｋ３である第４の血族中の同型接合型αＥＮａＣ変
異体のＤＮＡ配列は、コドンＲ５０８をＣＧＡからＴＧＡに変化させ、そして早
すぎる終止コドンを導入する単一塩基置換を明らかにしている(図２ｂ、図３ａ)
。このコドンは、細胞外ドメインにあり、そのため正常な第一トランスメンブレ
ンドメイン、細胞外ドメインの一部を含むが、第二トランスメンブレンドメイン
、
および細胞質内Ｃ末端を欠くタンパク質に帰着する。
手付かずの第二トランスメンブレンドメインが正常なチャンネル活性に要求さ
れるので、これらの突然変異の両方ともＥＮａＣチャンネル活性の低下に導くα
ＥＮａＣサブユニットに帰着する(Li,X.J.,et al.Molecular Pharmacology 47：
1133−1140(1995))。このように、これらの突然変異がこれらの家族中のＰＨＡ
１の病因を説明できる。
ＥＮａＣのαサブユニット内の別の突然変異は、これも偽性低アルドステロン
症タイプＩを引き起こすが、システイン１３３のチロシンへの突然変異である。ＰＨＡ１におけるβＥＮａＣ内の突然変異
４組のＰＨＡ１血族でαＥＮａＣ内の突然変異の同定は、他の血族らもまたこ
の遺伝子座における突然変異を隠しもっているかどうか、その代わりにこれら残
りの血族の中での病気を説明する他の遺伝子座における突然変異があるのかどう
かという疑問を未解決のままとする。ＥＮａＣのβおよびγサブユニットをこれ
らの遺伝子のエキソンの系統的なスクリーニングによって突然変異について試験
した。
すべてのＰＨＡ１血族でのこのスクリーニングは、ＰＨＡ Ｋ８中、コードさ
れたタンパク質を変化させる単一変異体を明らかにした(図２ｃ)。この血族は、
特に情報を与える。なぜなら罹患していない二人の兄弟は、罹患した子供を持ち
、これらの一人は、またいとことの結婚を介して、他のものは関係のはっきりし
ない妻との結婚を介している(図１)。罹患した、またまたいとこ達は、同じ変異
体について同型接合型である、ところが一方かれらの罹患していない兄弟、姉妹
または親戚のだれもこの変異体について同型接合でない。さらにこの変異体は、
血縁関係にない健康な被験者からの１６０アレレ体にはない。加えて、しっかり
とｂＥＮＡＣ、Ｄ１６Ｓ４１２、Ｄ１６Ｓ４１７、およびＤ１６Ｓ４２０に結合
されているマーカー遺伝子座の遺伝子型は、これらの罹患した被験者ではすべて
同型接合であるが、彼等の罹患していない親戚ではそうでない。これは観察され
た突然変異の血縁による同一性を強く支持する。
ＤＮＡ配列分析は、このβＥＮａＣ変異体がβＥＮａＣのアミノ酸３７位のグ
リシンをセリンに置換することを明らかにしている(図２ｃ、図３)。α、β、
およびγＥＮａＣの細胞質アミノ末端は、一般にお互いの間でアミノ酸配列の同
一性をほとんど示さないが、Ｇ３７は、ヒトからＣ．ｅｌｅｇａｎｓに及ぶ拡張
されたＥＮａＣ族のすべての構成員の間でホモロジーを示す一つの断片の中にあ
ることは注目に値する(図３ｂ)。Canessa，C．M.，et al．Nature 361：467−47
0(1993)、Canessa，C．M.，et al．Nature 367：463−467(1994)、McDonald，F
．J.，et al．Am．J．Physiol．268：L728−734(1994)、McDonald，F．J.，et a
l．Am．J．Physiol．268：C1157−C1163(1995)、Puoti，A．et al．Am．J．Phys
iol．269：C188−C197(1995)、Waldmann，R.，et al．J．of Biol．Chem．270：
27411−27414(1995)、Huang，M．et al．Nature 367：467−470(1994)、Chalfie
，M．et al．Nature 345：410−416(1990)。
Ｇ３７Ｓ変異体の機能的重要性は、正常なαおよびγサブユニットとともにこ
のβＥＮａＣ変異体をツメガエル乱母細胞で以前に報告されたように発現させる
ことによって評価した。Hanssaon,J.H.et al.Nature Genetic 11：76−82(1995)
、Hanssaon，J．H．et al．Proc．Natn．Acad．Sci．USA 92：11495−11499(199
5)、Schild，L．et al．Proc．Natn．Acad．Sci．USA 92：5699−5703(1995)。
野生型ＥＮａＣ、突然変異体βサブユニット、そしてαおよびγサブユニットの
みを含むチャンネルを発現する卵母細胞で二電極電圧クランプによって測定され
た、アミロイドー感受性Ｎａ+電流を決定して比較した(図４)。野生型および突
然変異体チャンネルを発現する卵母細胞中で、ＥＮａＣタンパク質のレベルを比
較するために、サブユニットを、各サブユニットに特異的な抗体を用いて、卵母
細胞膜から免疫沈殿させた(Ｄｕｃ，Ｃ.，et al．J．Cell．Biol．127：1907−1
921)。その結果は、野生型および突然変異体ＥＮａＣを発現する卵母細胞での各
サブユニットのレベルが見分けがつかないことを、証明した(データー示さず)。
野生型または突然変異体ＥＮａＣを発現する卵母細胞中でＮａ+電流の比較は、
突然変異体βサブユニットを発現しない卵母細胞でＥＮａＣ活性の非常に有意な
減少（野生型の活性の４０％、ｐ＜０．００００１）を例証する。突然変異体β
サブユニットを発現する卵母細胞は、しかしながらβサブユニットを発現するチ
ャンネルよりはまだ有意に高い活性を有する(ｐ＝０．００００１)。これは、こ
の突然変異が機能の完全な低下に帰着しないことを示唆する。
この血族でβＥＮａＣ Ｇ３７ＳとＰＨＡとの共形質分離の強い証拠、および
発現において証明された機能の低下は、この突然変異の機能的重要性を示してお
り、ＰＨＡ１の遺伝的異質さを明らかにしている。
ＥＮａＣのβサブユニット内の別の突然変異は、これもタイプ１偽性低アルド
ステロン症を引き起こすが、グリシン３７がセリン残基に突然変異されたときに
おきる。
表１ ＰＨＡ１血族の指標ケースの特徴 年齢：臨床面接での年齢（日）Ｎａ+：血清ナトリウム濃度(ｍＭ)、正常値１
３８−１４２ Ｋ+：血清カリウム濃度(ｍＭ)、正常値３.５−５.０ ＰＡＣ：血
清アルドステロン濃度（ｎｇ ｄｌ−１）正常値１−９５ ｆｒ：フ
レームシフト
表２ ＥＮａＣサブユニットのコーディング領域を増幅するのに使用したプライ
マー類 プライマーは、すべて５’−３’で表されている。Ａ、ＢおよびＣは、それぞ
れαＥＮａＣ、βＥＮａＣおよびγＥＮａＣのためのプライマーを指す。プライ
マーＡ１３Ｒ、Ａ１４Ｆ、Ｂ１３Ｒ、Ｂ１４Ｆ、およびＲ、Ｂ１５Ｆ、Ｇ１Ｆ、
およびＲ、Ｇ１１Ｒ、およびＧ１２Ｆは、コード領域にあり、残りはイントロン
または非翻訳領域にある。考察
ＰＨＡ１と共に形質分離するＥＮａＣサブユニット中の独立した突然変異が、
血族結婚からの罹患したこども達に受け継がれて、同型接合型であり、そして減
少したＥＮａＣ活性に帰着するという知見は、上皮ナトリウムチャンネルのサブ
ユニット中の突然変異が常染色体の劣性ＰＨＡ１を起こす証拠となる。
これまで、研究された血族結婚した７組の血族の内５組中で、機能的な突然変
異が同定された。これらの突然変異は、ＥＮａＣのαまたはβサブユニットのい
ずれかでおこり、形質の遺伝的異種性を証明している。これまでに突然変異が同
定されていなかった２組の血族では、一つのケースがβ、γＥＮａＣ遺伝子座に
しっかり結合されたすべてのマーカーについて同型接合型であり、これは検出さ
れていない突然変異の可能性を増す。他のケースは、β、γＥＮａＣに結合され
たいかなる遺伝子座についても同型接合型でなく、そしてαＥＮａＣに結合され
、試験された二つの遺伝子座のひとつのみについて同型接合型である。この後者
の被験者は、典型的なＰＨＡ１被験者よりも遅く、生後８ヶ月（表１）で診察を
受けたので、この患者がすこし異なった臨床兆候を有するかもしれない可能性が
でてくる。これらの知見は、付加的な遺伝子座がＰＨＡ１の劣性形態の病因に貢
献
することになるかどうかという疑問を未解決のままとする。
ここに記載される劣性血族とは対照的に、幾組かのＰＨＡ１血族は、常染色体
の優性伝達を示すことが報告されている。Hanukoglu，A．J．Clin．Endocrin．-
& Metab．73，936−944(1991)、Limal，J．M.，et al．Lancet １：51(1978)、H
anukoglu，A.，et al．Lancet １：51(1978)。ＥＮａＣは、多重結合チャンネル
であるので、幾つかのＥＮａＣ突然変異が、大部分のチャンネルの正常な組み立
てを妨害するのに十分な一つの欠陥遺伝子産物でもって、支配的に有害な機能を
持ち得ることはありうる。この可能性を評価するためには、係る血族をさらに調
査することが要求されるだろう。
ＰＨＡ１がＥＮａＣでの機能低下の突然変異に由来するという知識は、この病
気の病因を詳細に理解する基礎を提供する。罹患した新生児は、このチャンネル
によって媒介される腎臓のナトリウム再吸収にまず欠陥を有する。その結果は、
血管内体積減少に導く塩消耗である。これは血漿体積を元に戻そうとして、レニ
ンそしてその結果アルドステロンの分泌の著しい増加に帰着する。しかしながら
、ＥＮａＣに欠陥があるので、腎臓のナトリウム再吸収を適切に増加することが
できず、これは持続的な血管内体積減少をもたらす。さらに、ＥＮａＣを介して
のナトリウム再吸収は、間接的に末端ネフロンでのＫ+分泌およびＨ+分泌と繋が
っている。結果として、ＥＮａＣ機能の低下は、Ｋ+およびＨ+を分泌する能力を
減じ、高カリウム血症および代謝アシドーシスに貢献する。これらの特徴は、血
液量不足症のため組織の不十分な潅流によってさらに悪化する。この腎臓の欠陥
に加えて、結腸および汗腺でのＥＮａＣ機能を変化させる同様な欠陥が塩消耗を
さらに増加する。
ＰＨＡ１の一つの頭を悩ませる臨床的特徴は、ある罹患した子供達が病気から
、抜け出すという観察であった。すなわち、これは歳をとると、食事補助塩をと
るのを止められることを意味する。係る患者は、いつもそうであるとはかぎらな
いが、普通、常染色体の優性病をもつと提案されてきた(Hanukoglu，A．J．Clin
．Endocrin．& Metab．73，936−944(1991))。この区別と矛盾なく、ここで報告
された被験者は、すべて劣性伝達を示し、そしてすべて食事補助塩に依存したま
まである。従って、はっきりした優性伝達または年齢とともに改善する散発性
の病気の症状を示す血族がＥＮａＣサブユニットに突然変異を隠し持つかどうか
決定することは興味があるであろう。
ＥＮａＣが肺の肺胞空間から塩および水を除去するのに大きな役割を果たすこ
とが、最近認められた(Strang，L．B．Physiol．Rev．71：991−1016(1991))。
この発見は、明らかに肺胞空間からの液体の除去不能からくる呼吸器の不全によ
る新生児の致死性を示すαＥＮａＣノックアウトマウスによって強調されてきた
(Hummler et al．Nature Genet．1996印刷中）。従って、幾人かのＰＨＡ１患者
達が呼吸器の問題を同時にもっていることは、興味ぶかい(Hanukoglu，A.，et a
l．J．Pediatr．125：752−755(1994))。興味あることに、先端を切ったαＥＮ
ａＣをもつ、患者ＰＨＡ Ｋ３−１は、再発性の呼吸器感染症の病歴がある。に
もかかわらず、これらの患者は、急性呼吸困難症候群（ＡＲＤＳ）の臨床像を有
さない。これはαＥＮａＣ突然変異がＥＮａＣ活性の完全なノックアウトに帰着
するかどうか、またはこれらの患者中で発現されたαＥＮａＣの一部が生体内で
、例えば、他のサブユニットの会合を許すか、または先端方向の膜をそれらの標
的にすることによって、いくらかの残っているＥＮａＣ機能を与えるのに十分で
あるかどうかの疑問を提起する。これらのチャンネル、並びにこれらの患者の肺
での病状の現われをさらに調査することは、結果的に、興味があるだろう。
この病気の分子学的基礎を同定することは、胎児期の遺伝子テストのための手
段を提供する。それはこの形質を遺伝的に分離していることが知られている血族
において、この病気からの早期の死を防ぐのに、臨床効果があると証明されうる
。３組のサウジアラビア生まれの血族中、すべての罹患した被験者は、同一の変
異体について同型接合型であり、ほとんど間違いなく一人の遠い共通の先祖から
受け継いだものである。これらの血族が、お互いに血縁であるとは知られていな
いので、この知見は、この突然変異がこの国においてＰＨＡ１の支配的な原因で
あると判明するであろうと示唆している。
これらの知見は、突然変異がヒトで原発性の腎臓の塩消耗を引き起こす遺伝子
の数を３にする。ここで同定された二つの遺伝子およびジテルマン（Ｇｉｔｅｌ
ｍａｎ）症候群を起こすチアジドー感受性ナトリウムクロライド共輸送因子中の
突然変異である(Simon，D．et al Nature Genet．12：24−30(1996))。これは
低カリウム血症性代謝アルカローシスと関連した原発性腎管塩消耗によって特徴
づけられる障害である。これらの知見は、血管内体積を調節し、そして血管腔の
イオン組成物を制御する腎臓の一義的な役割を強調する。
最後に、ＥＮａＣサブユニット内の突然変異が二つの疾患を起こすことは注目
に値する。機能低下の突然変異は、塩消耗およびＰＨＡ１を起こし、一方、機能
上昇の突然変異は、高血圧およびリドル症候群を起こす。ＥＮａＣ活性の極端な
変化が、ヒトでナトリウム再吸収および血圧を増加させるか、または減少させる
ことは、ヒトの血圧の変化の異常発生過程におけるこれらの遺伝子およびそれら
の調節因子をさらに調べる動機となる。ＥＮａＣのα、β、およびγサブユニッ
トのいずれかでおきる、下に挙げた変異体は、高血圧を患っている患者から得た
。
ＥＮａＣのαサブユニット内
アラニン３３４をトレオニンへ
トリプトファン４９３をアルギニンへ
システイン６１８をフェニルアラニンへ
ＥＮａＣのβサブユニット内
セリン８２をシステインへ
アラニン５６７をバリンへ
イソロイシン５８６をヒスチジンへ
グリシン５８９をセリンへ
トレオニン５９４をメチオニンへ
アラニン５９５をアスパラギン酸へ
アルギニン６２５をシステインへ
バリン６３０をイソロイシンへ
ＥＮａＣγサブユニット内
トレオニン２５９をアスパラギンへ
セリン３７３をアスパラギンへ
バリン４４３をロイシンへ
プロリン５０２をアラニンへ
リシン５７０をアスパラギンへ
これらの突然変異の機能的重要性は、ツメガエル卵母細胞中の発現によって、
生休外で評価された。αサブユニット内トリプトファン４９３−アルギニン変異
体は、ナトリウム輸送の顕著な活性化を引き起こし、生体内での機能的役割を示
唆する。
熟練した技術者は、ここに提供された方法および実施例に従ってここに開示さ
れた発明を容易に実施することができる。
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(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｚ
33/50 33/53 Ｄ
33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ