ES2378395T3 - Variantes genéticas de inositol polifosfato-4-fosfatasa humana tipo I (INPP4A) útiles para la predicción y la terapia de trastornos inmunológicos - Google Patents

Variantes genéticas de inositol polifosfato-4-fosfatasa humana tipo I (INPP4A) útiles para la predicción y la terapia de trastornos inmunológicos Download PDF

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Abstract

Un procedimiento in vitro de predicción de la susceptibilidad de un individuo a asma que comprende determinar si dicho individuo posee o no un haplotipo de variantes genéticas, seleccionándose dichas variantes de variantes genéticas del gen humano de inositol polifosfato 4-fosfatasa (INPP4A) y la repetición del dinucleótido CA en el locus M1 localizado 44, 7 kb en la dirección 5' del sitio de iniciación de dicho gen, en el que dicho haplotipo está positivamente asociado o negativamente asociado a la aparición de asma.

Description

Variantes genéticas de inositol polifosfato-4-fosfatasa humana tipo I (INPP4A) útiles para la predicción y la terapia de trastornos inmunológicos
Campo de la invención
La presente invención se refiere a variantes genéticas que incluyen variantes de corte y empalme del gen humano de inositol polifosfato 4-fosfatasa (INPP4A) útiles para la predicción de susceptibilidad al asma. Más particularmente, la invención proporciona cebadores y procedimientos adecuados para la detección de haplotipos de variantes alélicas del gen de INPP4A para la predicción de la susceptibilidad de un individuo al asma.
Antecedentes y referencias de la técnica anterior de la presente invención
El asma es una enfermedad de las vías respiratorias crónica común con considerable heterogeneidad tanto en su fenotipo como en la patofisiología subyacente. Afecta al 15-18% de la población mundial. Se conocen casos tanto intrínsecos como extrínsecos de asma. El asma intrínseco es principalmente un trastorno de la infancia, aunque la edad de aparición puede variar y se observa que es 35-45 años en la población general; mientras que el asma extrínseco se observa cuando la edad de aparición es superior a los 45 años y es principalmente debido a los cambios inducidos por la edad en la función pulmonar. Estudios recientes han demostrado que la inflamación de las vías respiratorias es una característica principal en la patofisiología del asma (Gem y col. 1999). El trastorno es multifactorial (en tanto la iniciación como la progresión) debido a la participación de numerosas células inflamatorias residentes y reclutadas. Se sabe que las respuestas mediadas por linfocitos T e IgE son un factor clave en la respuesta alérgica (Elias y col. 2003). El asma es un trastorno mediado por linfocitos T colaboradores de tipo 2 (Th2) con citocinas tales como interleucina 4, interleucina 5, interleucina 13 implicadas en la desviación del sistema inmunitario hacia atopicidad. El aumento de los niveles de estas citocinas conduce a elevados niveles de IgE en suero totales, reclutamiento de eosinófilos e hiperreceptividad bronquial que por último culminan en la patogénesis del asma. También se sabe que estas interleucinas interactúan y estimulan las células alveolares y las células bronquiales del músculo liso produciendo los fenotipos clínicos de hiperreceptividad bronquial (Barnes P. J., Respir. Res, 2:64-5, 1999). Las interacciones gen-gen y gen-entorno participan en el desarrollo del asma (Tay y col., Asian Pac J Allergy Immunol 17:239-42, 1999; Bleecker ER, Am J Respir Crit Care Med 156:S113-6,1997; Cookson W, Nature 402:B5-11, 1999).
La inflamación y la remodelación de las vías respiratorias son rasgos característicos del asma atópico. Diversos tipos de células, a saber: eosinófilos, mastocitos y linfocitos T migran a los pulmones y median en el proceso de inflamación en el sitio (Barnes PJ, 1992). Además de estas células, las plaquetas desempeñan una función clave en este proceso inflamatorio alérgico debido a que son una rica fuente de una amplia gama de materiales biológicamente activos que pueden inducir o aumentar las respuestas inflamatorias alérgicas (Herd CM, 1994, Klinger, 1995). Se ha demostrado que tales materiales son mediadores preformados guardados en a-gránulos que son quimiocinas tales como el factor plaquetario 4 (PF4) y se regulan tras la activación en linfocitos T normales expresados y supuestamente secretados (RANTES) (Herd CM, 1994, Klinger, 1995). Estas quimiocinas son liberadas de plaquetas después de la estimulación con potentes mediadores anafilácticos tales como factor activador de plaquetas (PAF) (Herd CM, 1994, Kameyoshi Y, 1992) y producen quimiotaxia eosinofílica (Kameyoshi Y, 1992), proporcionando pruebas adicionales de una contribución de las plaquetas al asma bronquial. Estudios en modelo de ratón de inflamación alérgica sugieren la función de las plaquetas en la remodelación de las vías respiratorias (Simon C y col., 1994). Se ha encontrado que la activación de plaquetas está asociada a la inactivación de una enzima independiente de magnesio, la inositol polifosfato 4-fosfatasa (INPP4A, EC 3.1.3.66) (Norris FA, 1997). La estimulación de plaquetas humanas con trombina o ionóforo de calcio produce la inactivación de la INPP4A por escisión proteolítica por la proteasa calpaína dependiente del calcio (Norris FA y col., 1997). La enzima INPP4A cataliza la hidrólisis del fosfato en la posición 4 del inositol 3,4-bisfosfato y del inositol 1,3,4-trisfosfato. También cataliza, a una velocidad mucho mayor, la hidrólisis del fosfato en la posición 4 del fosfatidilinositol 3,4-bisfosfato generado por la fosforilación en la posición D-3 de lípidos de inositol por fosfoinositida 3-cinasas (PI3K). Por tanto, la inactivación de INPP4A está asociada a calcio/acumulación dependiente de la agregación de PtdIns(3.4)P2 característica de plaquetas humanas estimuladas. Norris y col. (1995) observaron que la INPP4A también participa en mitogénesis mediada por el receptor de PDGF, rotura oxidativa de neutrófilos, translocalización del transportador de la glucosa a la membrana plasmática. Vyas P y col. 2000 encontraron que la INPP4A regula la proliferación celular en la dirección 3' del factor de transcripción GATA-1. Se encontró que los megacariocitos de GATA-1(precursor de plaquetas) carecían de esta enzima y mostraron hiperproliferación. La reintroducción de INPP4A en los megacariocitos de GATA-1-retrasó significativamente el crecimiento celular, sugiriendo la función de esta enzima en la proliferación celular. Cuando se comparó la expresión génica diferencial entre pulmones de ratones A/J sensibilizados/expuestos a albúmina de huevo frente a ratones de control se encontraron diversos genes que se expresaban de forma diferente (Base de datos Gene Expression Omnibus (GEO), GDS 349). Entre estos genes que se expresan de forma diferente también se encontró que la INPP4A se modulaba en los pulmones de ratones sensibilizados.
El gen de INPP4A codifica dos isoformas a y � de proteínas variables en su extremo carboxi y también se conocen diversas variantes de corte y empalme en la región del exón 17, 18 y 19 de este gen (NT022171), anteriormente designado exón 15, 16 y 17 (Shearn CT y col., 2001). Se han anotado dos exones más que codifican 5' UTR en el cóntigo NT022171. Hay 3 formas de corte y empalme, a saber;a1, 2 y 3 informadas en la región del exón 17-19 como se muestra en la Figura 1A.
INPP4 a 1 codifica una forma de 106 kDa de la enzima principal expresada en cerebro humano, de rata y de ratón (Norris FA y col., 1995; Vyas P y col., 2000). INPP4 a2codifica una forma de102 kDa que se expresa en especies menores en cerebro de rata y ratón (Norris FA y col., 1995). La isoforma a 3 resulta del uso de un sitio donante de corte y empalme de 5'-GU alternativo durante la escisión del intrón 17 y extiende el exón 17 120 pb y codifica una proteína de 110 kDa expresada como la forma principal en plaquetas humanas (Shearn CT y col., 2001). Esta región del exón 17 extendido contiene tres repeticiones separadas siete bases con la secuencia de nucleótidos CCCCTYCW en la que Y representa C o T y W representa A o T. El exón 18 también contiene una secuencia con este consenso. Estos elementos ricos en pirimidina consenso representan sitios de reconocimiento para factores de corte y empalme que regulan el corte y el empalme alternativo específico de tejido de los exones 17 y 18. El exón 17 extendido codifica un dominio de 40 aminoácidos que contiene la secuencia PEST. Las secuencias PEST son ricas en residuos de prolina, serina, glutamato/aspartato y treonina y las proteínas que contienen tales secuencias son rápidamente degradadas por la familia calpaína de proteasas (Rogers S y col., 1986; Rechsteiner M y Rogers S 1996).
La enzima INPP4A que contiene secuencias PEST también es rápidamente degradada por la familia calpaína de proteasas que actúa sobre proteínas que contienen secuencias PEST (Norris FA y col., 1997). Como la estimulación de plaquetas está asociada al asma, que a su vez guarda relación con la inactivación de la enzima INPP4A, los inventores plantearon como hipótesis que las variantes de genes de INPP4A podrían asociarse a trastornos inmunológicos que incluyen asma. Sin embargo, hasta la fecha no se han hecho estudios para estudiar la función genética de INPP4A en trastornos inmunológicos que incluyen asma atópico.
Novedad de la invención:
Los inventores han identificado por primera vez variantes del gen de INPP4A asociadas a asma en seres humanos que incluyen los polimorfismos de un único nucleótido +92031 A/T (S1), +92344 C/T (S2), +92817 C/T (S3), +110832 A/G (S4), +131237 C/T (S5) y la repetición D2S2311 (M1), D2S2187 (M2) y +99095 CA (M3) en las regiones intrónicas y exónicas y flanqueantes del gen.
Por tanto, en un aspecto de la invención se proporciona un procedimiento in vitro de predecir la susceptibilidad de un individuo al asma que comprende determinar si dicho individuo posee o no un haplotipo de variantes genéticas, seleccionándose dichas variantes de variantes genéticas del gen humano de inositol polifosfato 4-fosfatasa (INPP4A) y la repetición del dinucleótido CA en el sitio M1 localizado 44,7 kb en la dirección 5' del sitio de iniciación de dicho gen, en el que dicho haplotipo está positivamente asociado o negativamente asociado a la aparición de asma.
También se proporcionan cebadores específicos para la detección de polimorfismos de un único nucleótido y secuencias repetitivas específicas en y alrededor del gen de INPP4A como se define por SEC ID Nº 7-23.
Resumen de la invención
El asma atópico es una enfermedad pulmonar inflamatoria crónica caracterizada por problemas de respiración recurrentes en respuesta a un alérgeno. Las plaquetas desempeñan una función importante en este proceso inflamatorio alérgico liberando mediadores preformados como el factor plaquetario 4 (PF4) y se regulan tras la activación en linfocitos T normales expresados y se secretan (RANTES) tras la activación causando quimiotaxia de eosinófilos. La presente invención se refiere a variantes alélicas del gen humano de inositol polifosfato 4-fosfatasa (INPP4A) y a variantes de corte y empalme de la secuencia codificante que codifica la enzima INPP4A conocida por ser un regulador importante de la activación de plaquetas; y proporciona cebadores y procedimientos adecuados para la detección de estas variantes alélicas como se observa anteriormente para la predicción de la susceptibilidad de un individuo a asma.
Descripción detallada de la invención
La INPP4A se ha identificado como un gen candidato para encontrar la asociación a trastornos inmunológicos, particularmente asma, ya que se encontró que varios polimorfismos en este gen se asociaban a asma atópico en estudios de casos y controles y genealógicos.
El gen de INPP4A codifica una enzima independiente del magnesio, la inositol polifosfato 4-fosfatasa, que cataliza la hidrólisis del fosfato de la posición 4 del inositol 3,4-bisfosfato y del inositol 1,3,4-trisfosfato. También cataliza, a una velocidad mucho mayor, la hidrólisis del fosfato en la posición 4 del fosfatidilinositol 3,4-bisfosfato generado por la fosforilación en la posición D-3 de lípidos de inositol por fosfoinositida 3-cinasas (PI3K). El gen de INPP4A se expresa en seres humanos en diversos tejidos, a saber, vejiga, sangre, hueso, médula ósea, cerebro, cuello del útero, colon, ojo, corazón, riñón, hígado, pulmón, ganglio linfático, glándula mamaria, músculo, ovario, páncreas, placenta, próstata, piel, tejido blando, bazo, estómago, testículos, timo, útero (Perfil de expresión del conjunto de UniGene Hs. 469386). Norris y col. (1995) observaron que la última actividad de INPP4A participaba en mitogénesis mediada por el receptor PDGF, rotura oxidativa de neutrófilos, translocalización del transportador de la glucosa a la membrana plasmática y agregación de plaquetas. La estimulación de plaquetas humanas con trombina o ionóforo del calcio produce la inactivación de INPP4A por escisión proteolítica por la proteasa calpaína dependiente del calcio (Norris FA y col., 1997). Esta inactivación de INPP4A está asociada a calcio/acumulación dependiente de la agregación de PtdIns(3.4)P2 característica de plaquetas humanas estimuladas. Por tanto, INPP4A es una enzima importante que participa en la regulación de este segundo mensajero de lípidos en plaquetas. Se sabe que las plaquetas son actores importantes en la patogénesis del asma; muchos estudios en los años noventa han mostrado la importancia de estas células en el asma. Se encontró que las plaquetas eran necesarias para la remodelación de las vías respiratorias en el modelo de ratón de asma (Simon C y col., 2004) y promueven la adhesión de eosinófilos a endotelio en individuos asmáticos (Ulfman LH y col., 2003).
La presente solicitud trata de D2S2311; un marcador de microsatélite, 44,7 kb en la dirección 5' del gen, repetición polimórfica de dinucleótidos en el nucleótido 99095 a 99127, que está en el intrón 11 del gen de INPP4A (nº de acceso de GenBank NT_022171). Los tres primeros SNP (rs3769712, rs3769710, rs2278208), como se muestra en la Figura 1B, tienen 92031 pb, 92344 pb y 92817 pb en la dirección 3' del sitio de iniciación del gen respectivamente y se encuentran en el intrón 7 del gen. El cuarto SNP no sinónimo (rs2278206) está situado 110832 pb en la dirección 3' del gen humano de INPP4A en el exón 17 alternativamente cortado y empalmado y representa una transición A a G (Thr a Ala). El quinto SNP rs10201079 es una transición C a T situada 131237 bases en la dirección 3' del sitio de iniciación del gen de INPP4A en el intrón 24.
Los resultados del presente estudio proporcionan resultados únicos. Además de identificar, genotipar y establecer una asociación positiva del microsatélite D2S2311, 44,7 kb en la dirección 5' del gen con asma, los inventores han encontrado una asociación de los conocidos polimorfismos de un único nucleótido +92031 A/T, +110832 A/G, +131237 C/T y una repetición de dinucleótidos en +99095 en la población india. Todos los SNP y las repeticiones de microsatélites se han validado por primera vez en la población india.
La presente invención ha identificado las variantes genéticas que existen en cualquier tipo de población en el mundo independientemente de su origen, comunidad, color, localización geográfica o etnia. Los inventores han comparado frecuencias de alelos y de genotipos del polimorfismo de repetición D2S2311 de 44,7 kb en la dirección 5' del promotor, D2S2187 en el intrón 1 en la posición +43987, SNP +92031 A/T, +92344 C/T, +92817 C/T en el intrón 7, repetición de CA en +99095 en el intrón 11, +110832 A/G en el exón 17 de la variante de corte y empalme y +131237 C/T en el intrón 24 y los haplotipos generados usando cuatro loci en población india. En el presente estudio se llevaron a cabo estudios de asociación basados tanto en casos y controles como en familias para estos polimorfismos. Además, la invención define claramente que las variantes identificadas serían útiles para cualquier tipo de población de cualquier origen geográfico.
La presente invención también ha identificado la función funcional del polimorfismo +110832 A/G en el exón 17 de la variante de corte y empalme expresado en plaquetas. El exón extendido contiene la posible secuencia PEST del aminoácido 584 -607 con la puntuación de PESTfind de +7,49 (www.at.embnt.org/embnet/tools/bio/pestfind/). El polimorfismo +110832 A/G (rs2278206) produce una sustitución de treonina por alanina en la posición 604 en la secuencia de proteínas produciendo una secuencia PEST deficiente (puntuación de PESTfind +4,95). Por tanto, una sustitución de base de A por G en este locus particular puede hacer que la enzima INPP4 sea resistente a las proteasas calpaínas como se muestra por experimentos de transferencia Western de plaquetas humanas.
La presente invención también informa de la identificación de variantes de corte y empalme novedosas en individuos asmáticos. Una de la variantes de corte y empalme ha delecionado el exón 16 de 219 pares de bases. Esto produce la deleción de 73 aminoácidos de la proteína codificada. Esta variante de corte y empalme puede producir proteína con función alterada.
Los inventores también han mostrado menor expresión de la proteína de INPP4A en el modelo de ratón inducido por alérgeno de asma que en los ratones normales tratados con solución salina y su restablecimiento después del tratamiento con fármacos antiinflamatorios tales como esteroide.
Por consiguiente, la presente invención proporciona variantes genéticas del gen humano de inositol polifosfato 4fosfatasa (INPP4A) útiles para la predicción de asma, incluyendo dichas variantes:
(a)
La variante del gen de SEC ID Nº 1 que tiene 1-230 nucleótidos contiguos que contiene el grupo de dinucleótidos CA del locus M1 presentes 44,7 kb en la dirección 5' del sitio de iniciación del gen.
(b)
La variante del gen de SEC ID Nº 2 que tiene 1-400 nucleótidos contiguos que contiene los dinucleótidos GT en el locus M2.
(c)
La variante del gen de SEC ID Nº 3 que tiene 1-159 nucleótidos contiguos que contiene el polimorfismo de repetición de CA en el nucleótido 229 del locus M3.
(d)
La variante del gen de SEC ID Nº 4 que tiene 1-1036 nucleótidos contiguos que contiene el polimorfismo A/T en el nucleótido 75 del locus S1, el polimorfismo C/T en el nucleótido 388 del locus S2 y el polimorfismo C/T en el nucleótido 861 del locus S3.
(e)
La variante del gen de SEC ID Nº 5 que tiene 1-961 nucleótidos contiguos que contiene el polimorfismo G/A en el nucleótido 147 del locus S4.
(f)
La variante del gen de SEC ID Nº 6 que tiene 1-1707 nucleótidos contiguos que contiene el polimorfismo C/T en el nucleótido 1221 del locus S5.
(g)
La variante de corte y empalme de SEC ID Nº 24 que tiene 1-817 nucleótidos contiguos que contiene una región de variante de corte y empalme.
Otro aspecto de la invención se refiere a un procedimiento de detectar y predecir la predisposición a asma por cribado para haplotipos y variantes de corte y empalme de INPP4A y su expresión en un sujeto, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:
[a] aislar ADN de muestras seleccionadas de sangre completa, semen, saliva, lágrimas, orina, materia fecal, sudor, de la boca, piel o pelo;
[b] proporcionar cebadores que tienen SEC ID Nº 7-18;
[c] amplificar y secuenciar extensiones de ADN genómico usando cebadores de SEC ID Nº 7-18, en el que los cebadores de SEC ID Nº 7, 9, 11, 13, 15, 17 son cebadores directos y los cebadores de SEC ID Nº 8, 10, 12, 14, 16, 18 son cebadores inversos;
[d] amplificar y secuenciar la extensión de ADN de SEC ID Nº 1 del gen de INPP4A usando la combinación de cebadores de SEC ID Nº 7 y 8, conteniendo SEC ID Nº1 la secuencia correspondiente a la repetición de microsatélites en el locus M1 D2S2311;
[e] amplificar y secuenciar la extensión de ADN de SEC ID Nº 2 del gen de INPP4A usando la combinación de cebadores de SEC ID Nº 9 y 10, conteniendo SEC ID Nº 2 la secuencia correspondiente a la repetición de microsatélites en el locus M2 D2S2187 en la posición +43987 en el intrón 1;
[f] amplificar y secuenciar la extensión de ADN de SEC ID Nº 3 del gen de INPP4A usando la combinación de cebadores de SEC ID Nº 11 y 12, conteniendo SEC ID Nº 3 la secuencia correspondiente a la repetición de microsatélites en el locus M3 +99095;
[g] amplificar y secuenciar la extensión de ADN de SEC ID Nº 4 del gen de INPP4A usando la combinación de cebadores de SEC ID Nº 13 y 14, conteniendo SEC ID Nº 4 el locus S1 +92031A/T, el locus S2 +92344 C/T y el locus S3 +92817C/T de sitios de polimorfismo de un único nucleótido (SNP);
[h] amplificar y secuenciar la extensión de ADN de SEC ID Nº 5 del gen de INPP4A usando la combinación de cebadores de SEC ID Nº 15 y 16, conteniendo SEC ID Nº 5 el sitio de SNP en el locus S4 en la posición +110832A/G en el exón 17 de la variante de corte y empalme;
[i] amplificar y secuenciar la extensión de ADN de SEC ID Nº 6 del gen de INPP4A usando la combinación de cebadores de SEC ID Nº 17 y 18, conteniendo SEC ID Nº 6 el sitio de SNP en el locus S5 en la posición +131237 C/T, y
[j] validar e identificar las variantes del gen de INPP4A específicas computacionalmente comparando con las secuencias del gen de INPP4A naturales conocidas; y
[k] aislar ARN de muestras de sangre completa; y
[l] aislar e identificar variantes de corte y empalme de SEC ID Nº 24 usando la combinación de cebadores de SEC ID Nº 25 y 26.
Otros y más aspectos, características y ventajas de la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción de las realizaciones presentemente preferidas de la invención facilitadas con el fin de divulgación.
En otro aspecto de la invención se proporcionan marcadores farmacogenéticos correspondientes a variantes de genes del gen de INPP4A para predecir y detectar seres humanos susceptibles a asma: SEC ID Nº 1 asociada al locus D2S2311, SEC ID Nº 2 asociada al locus D2S2187, SEC ID Nº 3 asociada a la repetición de CA en +99095, SEC ID Nº 4 asociada al locus +92031 A/T, +92344 C/T, +92817 C/T, SEC ID Nº 5 asociada a +110832 A/G, SEC ID Nº 6 asociada a +131237 C/T y SEC ID Nº 24 asociada a variantes de corte y empalme.
Los inventores han identificado las siguientes asociaciones entre variantes del gen de INPP4A y asma:
-
la variante alélica del microsatélite D2S2311 en el locus M1 está asociada a susceptibilidad al asma x2= 43,441128, DF = 9, valor de p < 0,0001 y su asociación se confirma en estudios basados en familias (p = 0,0007).
-
se encontró que el alelo 402 del microsatélite D2S2311 era un alelo de riesgo con OR-2,289, IC del 95% [1,5443 -3,3929] y se confirmó en estudios basados en familias con x2 = 3,96, p = 0,0464. -se encontró que el alelo 400 del microsatélite D2S2311 era un alelo protector con razón de posibilidades 0,575, IC del 95% [0,4098 -0,8068] y se confirmó en estudios basados en familias con x2 = 11,306, p = 0,0008. -se ha encontrado que las variantes alélicas de repetición de CA en el locus M3 se asocian a susceptibilidad al
asma x2 = 11,467334, p = 0,000600 y se ha confirmado en estudios basados en familias (p = 0,008). -la variante alélica 154 de repetición de CA en el locus M3 tiene una frecuencia del 81% en pacientes. -la repetición de CA en el locus M3 en la que la variante alélica 152 tiene una frecuencia del 19% en pacientes. -se ha encontrado que la variante alélica 154 de repetición de CA es un alelo de riesgo en un estudio de casos y
controles con OR 1,734, IC del 95% [1,249 -2,407]; esta observación también se confirmó en un estudio basado en familias x2 = 7,078, valor de p = 0,008. -el polimorfismo +92031 A/T en el sitio S1 en el que el alelo T está en el sitio S1 tiene una frecuencia del 19 % en pacientes. -el polimorfismo +92031 A/T en el sitio S1 en el que el alelo A está en el sitio S1 tiene una frecuencia del 81 %
en pacientes. -el polimorfismo +92031 A/T en el sitio S1 está asociado a susceptibilidad al asma con x2 = 7,05, p = 0,00791
como se ha confirmado en una estudio basado en familias x2 = 9, valor de p = 0,0027. -+110832 A/G (rs2278206), un polimorfismo no sinónimo funcionalmente importante en el locus S4, cuando se
encontró que el alelo A estaba transmitido en exceso a la cría afectada en un estudio basado en familias (x2=
11,504, p = 0,0007); el polimorfismo +110832 A/G produce una sustitución de treonina por alanina en la posición
604 produciendo una secuencia PEST deficiente, haciendo la proteína más estable. -el polimorfismo +131237 C/T en el locus S5 cuando se encontró que el alelo T estaba transmitido en exceso a la
cría afectada en un estudio basado en familias (x2 = 4,545, p = 0,03).
Una realización de la presente invención se refiere a la determinación de un haplotipo de cuatro loci seleccionado de los treinta y seis haplotipos de cuatro loci novedosos generados usando loci M1, S1, M3 y S4 en un estudio de casos y controles. Dichos haplotipos novedosos son 396_T_154_G, 398_A_152_A, 400_T_152_A, 400_A_152_A, 406_T_152_A, 406_A_156_T, 412_A_154_A, 400_T_154_A, 402_T_152_A, 404_A_156_T, 410_A_154_A, 404_A_152_G, 406_A_152_A, 404_A_152_A, 406_T_152_G, 396_A_152_G, 400_A_154_G, 402_T_154_A, 402_A_152_A, 404_T_154_A, 400_T_154_G, 396_T_152_G, 404_T_152_A, 398_A_152_G, 386_A_154_A, 402_T_152_G, 398_T_152_G, 404_A_154_G, 408_A_154_A, 406_A_154_A, 398_A_154_A, 404_T_152_G, 400_A_154_A, 400_T_152_G, 402_A_154_A, 404_A_154_A.
Todavía otra realización de la presente invención se refiere a la confirmación de veintiocho haplotipos de cuatro loci novedosos en familias, concretamente 396_T_154_G, 398_A_152_A, 400_T_152_A, 400_A_152_A, 406_T_152_A, 406_A_156_T, 412_A_154_A, 400_T_154_A, 402_T_152_A, 404_A_156_T, 410_A_154_A, 404_A_152_G, 406_A_152_A, 404_A_152_A, 406_T_152_G, 396_A_152_G, 400_A_154_G, 402_T_154_A, 402_A_152_A, 404_T_154_A, 400_T_154_G, 396_T_152_G, 404_T_152_A, 398_A_152_G, 386_A_154_A, 402_T_152_G, 398_T_152_G, 404_A_154_G, 408_A_154_A, 406_A_154_A, 398_A_154_A, 404_T_152_G, 400_A_154_A, 400_T_152_G, 402_A_154_A, 404_A_154_A
En otra realización más de la invención, el haplotipo novedoso 402_A_154_A (loci M1_S1_M3 _S4) se detecta como un factor de riesgo para asma. Se encontró que tenía frecuencia en porcentaje del 16,14% en pacientes en el estudio de casos y controles.
El haplotipo 402_A_154_A estuvo fuertemente asociado a la aparición de asma (razón de posibilidades 3,68 con IC del 95%: 2,2977, 5,916, valor de p < 0,0001) que indica alto riesgo en un estudio de casos y controles. Además, el haplotipo de riesgo 402_A_154_A también se encontró que estaba transmitido en exceso a la cría afectada en un estudio basado en familias (x2 = 4,2714, DF = 1, valor de p = 0,038).
Se encontró que el haplotipo de los loci M1_S1_M3 _S4 400_A_154_A tenía frecuencia en porcentaje del 7,29% en pacientes.
Se encontró que los haplotipos 400_T_152_G y 400_A_154_A estaban negativamente asociados a la aparición de asma atópico que indica haplotipos protectores. La confirmación de asociación negativa del haplotipo 400_T_152_G a la aparición de asma atópico se obtuvo en un estudio basado en familias (x2 = 8,065, DF = 1, valor de p = 0,0045).
Adicionalmente se han identificado variantes de corte y empalme del gen de INPP4A en sujetos asmáticos atópicos.
La expresión de proteínas de INPP4A se reduce en ratones sensibilizados con y expuestos a albúmina de huevo en comparación con controles tratados con solución salina; hay restablecimiento después del tratamiento con un agente esteroideo antiinflamatorio conocido tal como dexametasona.
Todavía otro aspecto de la invención se refiere a un kit de diagnóstico que comprende marcadores farmacogenéticos que tienen los nucleótidos de SEC ID Nº 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 24 junto con un manual de instrucciones para detectar y predecir la predisposición a asma en un sujeto. Componentes adicionales opcionales del kit incluyen, por ejemplo, enzimas de restricción, transcriptasa inversa o polimerasa y el sustrato.
Metodología detallada
Aislamiento de ADN genómico de leucocitos de sangre periférica de pacientes asmáticos atópicos y los individuos de control normales:
Se aisló ADN genómico de la sangre periférica de pacientes e individuos de control usando un procedimiento de precipitación por sales modificado (Nagarkatti R y col., 2002). Brevemente, se obtuvieron 10 ml de sangre de pacientes e individuos de control sin parentesco usando ACD Vaccutainers (BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.). Se añadió igual volumen de tampón C1 helado (4X) y luego se añadieron 30 ml de agua estéril helada para producir la lisis de la membrana celular (Promega genomic DNA Isolation Handbook). Tras esto, los núcleos se sedimentaron a 1300 x g durante 15 min a 4ºC. El sedimento se lavó de nuevo con 1X tampón C1. Se añadieron 12 ml de tampón de lisis nuclear con 0,8 ml de 10% de SDS. Se añadieron 50 µl de una disolución 20 µg/µl de proteinasa K y el sedimento se resuspendió agitando brevemente con vórtex. Después de la incubación a 65ºC durante 2-3 h, el material proteináceo se precipitó con la adición de 4 ml de NaCl 6 M. Después de la centrifugación durante 15 min a 2500 rpm, el sobrenadante se transfirió a otro tubo y se usaron dos volúmenes de etanol absoluto (a temperatura ambiente) para precipitar el ADN (Miller y col., 1988). Entonces, el ADN precipitado se lavó dos veces con etanol al 70%, se secó al aire y se disolvió en tampón TE. Se usaron diluciones apropiadas (1:100, en tampón TE) para determinar la DO a 260 nm y 280 nm. La calidad del ADN se evaluó usando la relación 260 nm/280 nm. La disolución madre de ADN se diluyó a 50 ng/µl y se usó para la amplificación por PCR y los experimentos de genotipado. La disolución madre de ADN se almacenó a -20ºC.
Identificación de repeticiones putativas en y alrededor del gen de INPP4A usando el software RepeatMasker™:
Además de los dos microsatélites conocidos, concretamente D2S2311, D2S2187, se identificaron cinco secuencias repetitivas en el gen de INPP4A en el estudio población usando el software RepeatMasker™, pero se encontró que sólo la repetición de CT en el intrón 11 era polimórfica y se estudió en detalle (Figura 1B).
Diseño y síntesis de cebadores de oligonucleótidos para amplificación por PCR de variantes del gen de INPP4A:
Se diseñaron cebadores usando el software DNASTAR Primer Select SEC ID: 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 25 y 26. Los cebadores inversos para los polimorfismos de repetición se marcaron con 6-FAM para la detección por análisis de fragmentos en un secuenciador de matrices capilares automatizado 3100.
Condiciones de amplificación por PCR para diferentes conjuntos de cebadores:
Amplificación por PCR de SEC ID Nº 1 y SEC ID Nº 2:
Cebadores: SEC ID Nº 7, 8 y SEC ID Nº 9, 10
Amplificación por PCR de muestras de ADN genómico aisladas de leucocitos de sangre periférica de pacientes asmáticos atópicos e individuos de control normales usando los cebadores anteriormente dichos en una reacción agrupada. La PCR se llevó a cabo en un volumen total de 5 µl que contenía 25 ng de ADN genómico, 1,0 pmol de cada uno de los cebadores inversos marcados con 6-FAM y cebadores directos no marcados, MgCl2 1,5 Mm, 0,25 mM de cada dNTP, 0,03 U/µl de Taq ADN polimerasa (Bangalore Genie, India) y el tampón recomendado por el proveedor. Después de la PCR, 1 µl del producto de PCR se cargó con y patrón de tamaño interno (marcado con PET) en el analizador genético ABI Prism 3100 (Applied Biosystems). Se determinaron las longitudes de fragmentos usando (Genotyper 3.7, Applied Biosystems).
Condiciones de PCR:
Desnaturalización a 94ºC durante 5 minutos, treinta y cinco ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 30 segundos, hibridación a 65ºC durante 30 segundos, extensión a 72ºC durante 30 segundos; seguido de un periodo de extensión de segmentos de 10 minutos a 72ºC.
Amplificación por PCR de SEC ID Nº 3:
Cebador: SEC ID Nº 11 y 12
Amplificación por PCR de muestras de ADN genómico aisladas de leucocitos de sangre periférica de pacientes asmáticos atópicos e individuos de control normales usando los cebadores anteriormente dichos. La PCR se llevó a cabo en un volumen total de 5 µl que contenía 25 ng de ADN genómico, 1,0 pmol de cada uno de un cebador directo marcado con 6-FAM y un cebador inverso no marcado, MgCl2 1,5 Mm, 0,25 Mm de cada dNTP, 0,03 U/µl de Taq ADN polimerasa (Bangalore Genie, India) y el tampón recomendado por el proveedor. Después de la PCR, 1 µl del producto de PCR se cargó con y patrón de tamaño interno (marcado con PET) en el analizador genético ABI Prism 3100 (Applied Biosystems). Se determinaron las longitudes de fragmentos usando (Genotyper 3.7, Applied Biosystems).
Condiciones de PCR:
Desnaturalización a 94ºC durante 5 minutos, treinta y cinco ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 30 segundos, hibridación a 68ºC durante 30 segundos, extensión a 72ºC durante 30 segundos; seguido de un periodo de extensión de segmentos de 10 minutos a 72ºC.
Amplificación por PCR de SEC ID Nº 4:
Cebador: SEC ID Nº 13 y 14
Amplificación por PCR de muestras de ADN genómico aisladas de leucocitos de sangre periférica de pacientes asmáticos atópicos e individuos de control normales usando los cebadores anteriormente dichos. La PCR se llevó a cabo en un volumen total de 20 µl que contenía 50 ng de ADN genómico, 2,0 pmoles de cada uno de un cebador directo e inverso, MgCl2 1,5 Mm, 0,25 Mm de cada dNTP, 0,03 U/µl de Taq ADN polimerasa (Bangalore Genie, India) y el tampón recomendado por el proveedor. El producto de PCR purificado se usó para la reacción Snapshot.
Condiciones de PCR:
Desnaturalización a 94ºC durante 5 minutos, treinta y cinco ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 45 segundos, hibridación a 66ºC durante 45 segundos, extensión a 72ºC durante 45 segundos; seguido de un periodo de extensión de segmentos de 10 minutos a 72ºC.
Amplificación por PCR de SEC ID Nº 5:
Cebador: SEC ID Nº 15 y 16
Amplificación por PCR de muestras de ADN genómico aisladas de leucocitos de sangre periférica de pacientes asmáticos atópicos e individuos de control normales usando los cebadores anteriormente dichos. La PCR se llevó a cabo en un volumen total de 20 µl que contenía 50 ng de ADN genómico, 2,0 pmoles de cada uno de un cebador directo e inverso, MgCl2 1,5 Mm, 0,25 Mm de cada dNTP, 0,03 U/µl de Taq ADN polimerasa (Bangalore Genie, India) y el tampón recomendado por el proveedor. El producto de PCR purificado se usó para la reacción Snapshot.
Condiciones de PCR:
Desnaturalización a 94ºC durante 5 minutos, treinta y cinco ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 45 segundos, hibridación a 66ºC durante 45 segundos, extensión a 72ºC durante 45 segundos; seguido de un periodo de extensión de segmentos de 10 minutos a 72ºC.
Amplificación por PCR de SEC ID Nº 6:
Cebador: SEC ID Nº 17 y 18
Amplificación por PCR de muestras de ADN genómico aisladas de leucocitos de sangre periférica de pacientes asmáticos atópicos e individuos de control normales usando los cebadores anteriormente dichos. La PCR se llevó a cabo en un volumen total de 20 µl que contenía 50 ng de ADN genómico, 2,0 pmoles de cada uno de un cebador directo e inverso, MgCl2 1,5 Mm, 0,25 Mm de cada dNTP, 0,03 U/µl de Taq ADN polimerasa (Bangalore Genie, India) y el tampón recomendado por el proveedor. El producto de PCR purificado se usó para la reacción Snapshot.
Condiciones de PCR:
Desnaturalización a 94ºC durante 5 minutos, treinta y cinco ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 45 segundos, hibridación a 68ºC durante 45 segundos, extensión a 72ºC durante 45 segundos; seguido de un periodo de extensión de segmentos de 10 minutos a 72ºC.
SECUENCIACIÓN DIRECTA DE LOS PRODUCTOS DE PCR PURIFICADOS
La secuenciación directa de los productos de PCR purificados usando química de colorante terminador se llevó a cabo en un secuenciador de ADN automatizado ABI Prism 3100 para segmentos de genes con SEC ID Nº 4, 5 y 6. La secuenciación se llevó a cabo usando cebadores específicos, a saber: 13, 14, 15, 16, 17 y 18 en un secuenciador capilar ABI 3100 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.) para un mínimo de 20 individuos asmáticos atópicos y 20 de control. El producto de PCR se purificó en gel para la secuenciación. Brevemente, los cebadores de secuenciación, diluidos a 1 pmol por µl, y 75-150 ng/µl de producto de PCR se añadieron a 5 µl de mezcla de reacción, y el volumen se enrasó hasta 10 µl con agua MilliQ esterilizada en autoclave según las instrucciones del kit Big Dye Terminator (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). La PCR se estableció con las siguientes condiciones: 96ºC durante 5 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 60ºC durante 4 minutos. Las reacciones de secuenciación se purificaron con lavados con etanol al 70% para eliminar los cebadores sin incorporar y ddNTP fluorescentes. Brevemente, 26 µl de agua MilliQ esterilizada en autoclave se añadieron a la reacción de secuenciación. A los tubos se añadieron sesenta y cuatro microlitros de etanol al 100% enfriado y se agitaron con vórtex. Los tubos se centrifugaron a 16.000 g durante 20 minutos a temperatura ambiente. Los lavados se realizaron con etanol al 70% por centrifugación a 16.000 g durante 5 minutos. Los sedimentos se secaron al aire y se resuspendieron en 10 µl de formamida Hi-Di al 100%. Los tubos se incubaron a 94ºC durante 5 minutos y se dispusieron en el secuenciador automatizado 3100. El análisis de secuencias se llevó a cabo usando el software Sequence Navigator (ver 2.1, Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.) y DNAStar (ver 1.1, DNASTAR). Los alelos homocigóticos y heterocigóticos se puntuaron manualmente.
Genotipado de polimorfismos +92031 A/T, +92344 C/T, +92817 C/T, +110832 A/G y +131237 C/T:
Los polimorfismos +92031 A/T, +92344 C/T, +92817 C/T, +110832 A/G y +131237 C/T se seleccionaron basándose en el desequilibrio de enlace entre todos los SNP (Figura 2) y se estudiaron usando el kit de extensión de cebadores de ddNTP SNaPshot (Applied Biosystems, Foster City, EE.UU.). La PCR en SnaPshot se llevó a cabo usando 50 ng de molde de PCR purificado, 1 pmol de cebador con SE ID 19, 20, 21, 22 y 23 resp. y mezcla de reacción ABI ready y 1X tampón de dilución (como se suministra por el fabricante). La PCR se estableció con las siguientes condiciones: 96ºC durante 10 segundos, 58ºC durante 5 segundos y 60ºC durante 30 segundos durante un total de 30 ciclos.
Para purificar la reacción de extensión del cebador, 1 U de fosfatasa intestinal bovina (CIP) diluida en 10X NEB3 (New England Biolabs) se añadió a la mezcla de reacción y la mezcla se incubó a 37ºC durante 1 hora, seguido de una incubación durante 15 minutos a 72ºC para la inactivación de la enzima. Estas muestras se sometieron posteriormente a electroforesis usando el analizador genético ABI Prism 3100 según las instrucciones del fabricante. Los resultados se analizaron usando el programa ABI Prism GeneScan™ y Genotyper™ (Applied Biosystems, Foster City, EE.UU.).
Significancia funcional del polimorfismo +110832 A/G (rs2278206), en la variante de corte y empalme a 3 del exón 17 extendido:
Las secuencias PEST en la variante de corte y empalme a 3 se identificaron usando la herramienta PESTFIND de la base de datos proteómica ExPASY (www.at.cmbnt.org/embnet/tools/bio/pestfind/). La secuencia de proteínas se descargó de NCBI (AAK58870). La forma de corte y empalme de 977 aminoácidos de la proteína contiene aminoácidos adicionales a partir del exón 17 extendido. El polimorfismo +110832 A a G produce una sustitución de treonina por alanina no sinónima en la posición 604 en la secuencia de aminoácidos. La secuencia de aminoácidos se cambió en la posición 604 de treonina a alanina y esta secuencia se ejecutó de nuevo por PESTFIND para encontrar secuencias PEST. Se aislaron plaquetas de sangre periférica de individuos sanos normales que tenían genotipos AA, GG y AG para el polimorfismo A+110832G y se estimularon con ionomicina 2 µM en tampón de suspensión de plaquetas durante 5 y 10 minutos, respectivamente. Se realizó transferencia Western usando anticuerpo policlonal sc-12315 de cabra y anticuerpo anti-HRP de cabra. El barrido por densitometría de las bandas se hizo usando AlphaImager (Alpha Innotech Corporation, San Leandro, CA) (Figura 7).
Identificación de variantes de corte y empalme novedosas en la región de exón 15 -exón 19 de INPP4A usando cebadores con SEC ID Nº 25 y 26:
Se aisló ARN de los leucocitos totales de 12 individuos asmáticos atópicos y 6 normales usando el kit de aislamiento EZ-RNA siguiendo las indicaciones del fabricante (Biological Industries). Se preparó ADNc a partir de 10 µg de ARN total usando el kit cDNA Archive de Applied Biosystems. La PCR se llevó a cabo en un volumen total de 20 µl que contenía ADNc correspondiente a 100 ng de ARN de partida, 2,0 pmoles de cada uno de cebador directo e inverso, MgCl2 1,5 Mm, 0,25 Mm de cada dNTP, 0,03 U/µl de Taq ADN polimerasa (Bangalore Genie, India) y el tampón recomendado por el proveedor.
Condiciones de PCR:
Desnaturalización a 94ºC durante 5 minutos, treinta y ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 45 segundos, hibridación a 65ºC durante 45 segundos, extensión a 72ºC durante 45 segundos; seguido de un periodo de extensión de segmentos de 10 minutos a 72ºC.
La variante de corte y empalme de 598 pares de bases (Figura 8) se secuenció como se ha descrito anteriormente y se confirmó la deleción del exón 16.
Cálculo y estimación de la frecuencia de polimorfismos de repetición D2S2311, D2S2187 y de la de +99095 CA, polimorfismos de un único nucleótido +92031 A/T, +92344 C/T, +92817 C/T, +110832 A/G y +131237 C/T:
Se ha usado el software CLUMP con simulaciones de Monte Carlo para probar la asociación alélica de marcadores multialélicos con fenotipo de enfermedad para polimorfismos de repetición. Se calcularon razones de posibilidades y se realizaron las pruebas de la chi al cuadrado para estudiar la asociación con fenotipo de enfermedad. Las repeticiones se han denotado según la longitud de fragmento en la que el dimensionamiento se hizo usando patrón de tamaño interno durante el barrido de genes. Los SNP se designan S1, S2, S3, S4 y S5.
Estimación de las frecuencias de haplotipos generadas usando cuatro loci en individuos normales y pacientes asmáticos atópicos para encontrar la asociación entre estos haplotipos y la enfermedad:
Se han generado haplotipos novedosos para los loci M1, S1, M3 y S4 usando el programa PHASE para grupos de pacientes (N = 192) y de control (N = 272) (Stephens M, Am J Hum Genet. Nov 73:1162-9, 2003). Se usaron parámetros por defecto con 100 iteraciones para generar los haplotipos (http://archimedes.well.ox.ac.uk/pise/PHASE-simple.html, PHASE Ver. 2.0.2). Se calcularon chi al cuadrado y razones de posibilidades para asociación con fenotipo.
Análisis del desequilibrio de transmisión (TDT) de polimorfismos de repetición D2S2311, D2S2187 y del de +99095 CA, polimorfismos de un único nucleótido +92031 A/T, +92344 C/T, +92817 C/T, +110832 A/G y +131237 C/T y sus análisis haplotípicos en familias nucleares:
En las familias se hizo el análisis TDT entre alelos usando TDT-sTDT (http://genomics.med.upenn.edu/spielman/TDT.htm). La transmisión haplotípica al individuo afectado se observó usando TRANSMIT (Transmit, versión 2.5.4).
Entonces, se obtiene la materia en la que las características, ventajas y los objetos de la invención anteriormente mencionados, además de otros que serán evidentes, y puede entenderse en detalle. Estos dibujos forman una parte de la memoria descriptiva. Debe observarse, sin embargo, que los dibujos adjuntos ilustran realizaciones preferidas de la invención y, por tanto, no deben considerarse limitantes en su alcance.
Desarrollo del modelo de asma de ratón sensibilizado y expuesto a albúmina de huevo y ratones de control tratados con solución salina:
Los ratones BALB/c se sensibilizaron por inyecciones intraperitoneales de 20 µg de albúmina de huevo de huevo de gallina (OVA) (calidad V � 98% de pureza, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EE.UU.) en 0,2 ml de solución salina adsorbida sobre 2 mg de alumbre (sensibilizados) o alumbre sola (control) en los días 0, 7 y 14. Entonces, los ratones se expusieron a 3% de albúmina de huevo aerosolizada (sensibilizados) o solución salina aerosolizada (control) 30 minutos por día durante 10 días consecutivos (del día 22 al día 32). La receptividad a metacolina (Sigma-Aldrich) se evaluó en ratones sin limitaciones conscientes por pletismografía barométrica usando protocolo, aparato y software suministrado por BUXCO (Troy, NY, EE.UU.). Los ratones se sacrificaron 16 h después de la última exposición y se tomó tejido de pulmón para la inmunohistoquímica.
Tratamiento del modelo de asma de ratón inducido con albúmina de huevo con esteroide:
Los ratones BALB/c se sensibilizaron por inyecciones intraperitoneales de 20 µg de albúmina de huevo de huevo de gallina (OVA) (calidad V � 98%depureza, Sigma Chemical Co., St. Louis,MO, EE.UU.) en 0,2 ml de solucionsalina adsorbida sobre 2 mg de alumbre en los días 0, 7 y 14. Entonces, los ratones se expusieron a 3% de albúmina de huevo aerosolizada 30 minutos por día durante 10 días consecutivos (del día 22 al día 32). Se administró tratamiento con 1 mg/kg de dexametasona empezando desde el día de la última sensibilización hasta la última exposición (día 14-32). La hiperreceptividad bronquial se midió como se ha descrito previamente usando el pletismógrafo BUXCO (Troy, NY, EE.UU.).
Los ratones se sacrificaron 16 h después de la última exposición a OVA y los pulmones se sometieron a inmunohistoquímica.
Inmunohistoquímica de la sección de tejido de pulmón de ratón para proteína de INPP4A:
La inmunohistoquímica de la sección de pulmón de ratón se hizo usando el anticuerpo policlonal sc-12315 de cabra comercial (Santa Cruz Biotechnology, Inc.; CA, EE.UU.) producido contra un péptido próximo al extremo amino de INPP4A de origen humano y de ratón siguiendo el protocolo convencional con ligeras modificaciones (Ather MH y col., 2004). Se usó gamma globulina de cabra como control de isotipo (Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc.; PA, EE.UU.).
Breve descripción de los dibujos adjuntos:
La Figura 1A muestra la presentación esquemática de las diferentes formas de corte y empalme conocidas de INPP4A, la Figura 1B muestra una presentación esquemática de las diferentes regiones polimórficas del gen de INPP4A estudiado. La repetición D2S2311, 44,7 kb en la dirección 5' del promotor, se denota M1. La repetición D2S2187 se denomina en lo sucesivo M2, el polimorfismo de repetición de CA en +99095 se denota M3. Los cinco polimorfismos también se muestran en el contexto de la secuencia debajo del gen. La Figura 2 muestra una visión general gráfica del desequilibrio de enlace para los ocho loci estudiados usando GOLD. La Figura 3 muestra la distribución de alelos de D2S2311 en el grupo de pacientes y de control. La figura representa las frecuencias de alelos en el locus de repetición D2S2311 con los tamaños de fragmento representados en el eje X y sus frecuencias respectivas en el eje Y. La Figura 4 muestra la distribución alélica y genotípica de +92031 A/T (S1) en el estudio de casos y controles. La Figura 5 muestra la distribución alélica y genotípica del polimorfismo de repetición de CA en el intrón 11 en el estudio de casos y controles. La Figura 6 muestra la distribución de haplotipos (M1_S1_M3_S4) en pacientes y controles (Np = 192, Nc = 272) (Tabla 2). La figura representa las frecuencias de haplotipos en el eje X y sus frecuencias respectivas en el eje Y. La Figura 7 muestra la posible secuencia PEST y su validación experimental en la región de la variante de corte y empalme del exón 17 extendido y la comparación con la variante de sustitución de Thr por Ala. La Figura 8 muestra la imagen de gel de la variante de corte y empalme a 3 conocida junto con las variantes de corte y empalme novedosas identificadas en pacientes asmáticos atópicos.
La Figura 9 muestra la inmunohistoquímica de secciones de pulmón de ratón de ratones de control tratados con solución salina, ratones sensibilizados con albúmina de huevo y los ratones sensibilizados y expuestos a albúmina de huevo tratados con esteroide.
Asociación de los loci de repetición a trastornos atópicos tales como asma
Para demostrar la asociación de los loci de repetición M1 y M2 y M3 a trastornos atópicos tales como asma se realizó la prueba de la chi al cuadrado usando el software CLUMP. CLUMP es un programa diseñado para evaluar la significancia de la salida de valores observados en una tabla de contingencia de los valores esperados condicionados a los totales marginales. La significancia se evalúa usando un enfoque de Monte Carlo, realizando simulaciones repetidas para generar tablas que tienen los mismos totales marginales que el que se considera, y contando el número de veces que un valor de chi al cuadrado asociado a la tabla real se logra por los datos simulados al azar. Esto significa que los niveles de significancia asignados deberían ser objetivos (con precisión dependiente del número de simulaciones realizadas) y que no necesita tenerse en cuenta las correcciones de continuidad o pequeños valores esperados. El procedimiento se describe en completo en: Sham PC & Curtis D, 1995. Monte Carlo tests for associations between disease and alleles at highly polymorphic loci. Ann Hum Genet. 59: 97-105. Se obtuvo un patrón significativamente diferente de distribución de los alelos entre los dos grupos; para alelos en el locus M1 y encontrados que se asocian a susceptibilidad al asma x2 = 43,441128, DF = 9, valor de p < 0,0001. Se encontró que el alelo 402 era un alelo de riesgo con razón de posibilidades 2,289, IC del 95% [1,5443 3,3929]. Se encontró que el alelo 400 era un alelo protector con razón de posibilidades 0,575, IC del 95% [0,4098 0,8068] como se calcula por la tabla 2x2 (http://home.clara.net/sisa/twoby2.htm) (Figura 3). Se obtuvieron resultados similares en estudios de asociación basados en familias (valor de p = 0,0007) (Tabla 3a).
No hubo patrón de distribución significativamente diferente de los alelos entre los dos grupos para M2 (p = 0,214179) en casos y controles (Tabla 3b).
También se encontró que el locus M3 estaba significativamente asociado a asma (p = 0,0006). Se ha encontrado que las variantes alélicas de repetición de CA en el locus M3 se asocian a susceptibilidad al asma x2 = 11,467334, p = 0,0006. Se ha encontrado que la variante alélica de repetición de CA154 es un alelo de riesgo en el estudio de casos y controles con OR 1,734, IC del 95% [1,249 -2,407] (Figura 5). Esta observación también se confirmó en el estudio basado en familias x2 = 7,078, valor de p = 0,008 (Tabla 3f).
Demostración de la asociación del polimorfismo +92031 A/T (S1) a asma:
Para demostrar la asociación del polimorfismo +92031 A/T se realizó la prueba de tendencia de Armitage. El patrón de distribución de los tres genotipos, AA, AT y TT fue significativamente diferente en los dos grupos estudiados (x2= 7,05, p = 0,008). El alelo A fue predominante en los casos en comparación con el grupo de control {OR = 1,542, IC del 95% (1,121-2,120), p = 0,0075} (Figura 4). Similarmente, se encontró que el alelo T estaba transmitido en exceso a crías afectadas en el estudio basado en familias usando el programa TDT-sTDT (x2 = 9, p = 0,0027) (Tabla 3c).
Demostración de la asociación del polimorfismo +110832 A/G (S4) a asma:
Para demostrar la asociación del polimorfismo no sinónimo +110832 A/G se realizó la prueba de tendencia de Armitage en el estudio de casos y controles. El alelo de riesgo T mostró una asociación marginal con el fenotipo de enfermedad {razón de probabilidades = 1,324, IC del 95% (0,964 -1,819), x2 = 3,01, p = 0,08). Se encontró que el alelo A estaba transmitido en exceso a crías afectadas en el estudio basado en familias usando el programa TDTsTDT (x2 = 11,5, p = 0,0007) (Tabla 3g).
Generación de haplotipos:
Entonces, los inventores usaron el programa PHASE para generar haplotipos para grupos de pacientes y de control. El programa PHASE implementa un nuevo procedimiento estadístico para reconstruir haplotipos de datos de genotipo de población. Los experimentos con el software en datos tanto reales como simulados indican que puede proporcionar una mejora en el algoritmo EM para reconstruir haplotipos. Permite datos de genotipo ausentes y también puede manipular más de un locus independientemente del polimorfismo, por ejemplo, pueden analizarse simultáneamente SNP y repeticiones. Basándose en la salida del software, los valores de probabilidad de los haplotipos también se predicen y pueden utilizarse para diferenciar haplotipos más confiados. El software PHASE es adecuado para distancias genéticas de 100 cM o menores. Similarmente se realizó análisis haplotípico basado en familias usando el programa TRANSMIT. TRANSMIT prueba la asociación entre marcador genético y enfermedad examinando la transmisión de marcadores de padres a la cría afectada. Las pruebas se basan en un vector de puntuación que se promedia de todas las posibles configuraciones de haplotipos y transmisiones parentales de acuerdo con los datos observados.
En el estudio de casos y controles, los haplotipos cuya frecuencia esperada fue superior a 0,025 en cualquiera de los dos grupos se muestran en la Tabla 2 (Figura 6). La posibilidad en favor de pacientes en vez de controles que tienen haplotipo 402_A_154_A fue 3,68 con IC del 95%: 2,2977, 5,916. Las pruebas de x2 de relaciones de probabilidades correspondientes mostraron un valor de p inferior a 10-5. TRANSMIT también mostró resultados similares en el estudio de asociación basado en familias (x2 = 4,2714, DF = 1, valor de p = 0,038). Por tanto, el haplotipo de 4 loci 402_A_154_A estuvo fuertemente asociado a asma. Por otra parte, la posibilidad en favor de pacientes en vez de controles que tienen haplotipo 400_T_152_G y 400_A_154_A fue 0,16, IC del 95%: 0,46-1,09 y 0,12, IC del 95%: 0,33-0,82, respectivamente. También se encontró que el haplotipo 400_T_152_G estaba negativamente asociado a la aparición de asma atópico en el estudio basado en familias (x2 = 8,065, DF = 1, valor de p = 0,0045). Por tanto, se identificó que los haplotipos 402_A_154_A y 400_T_152_G eran haplotipos de riesgo y protectores muy importantes, respectivamente.
Significancia funcional del polimorfismo +110832 A/G (rs2278206) en la variante de corte y empalme a 3 del exón 17 extendido:
La sustitución de treonina por alanina en el aminoácido 604 en la variante de corte y empalme a 3 del gen de INPP4A produjo un cambio en la puntuación de PESTfind de +7,49 a +4,95 haciendo que fuera una secuencia PEST deficiente. Se encontró que la proteína de plaquetas de individuos con genotipo AA era más susceptible a degradación como se observa por casi el 60% de degradación en el plazo de 10 min desde la estimulación, mientras que la proteína de individuos con genotipo GG era menos susceptible (casi el 31% de degradación). Por tanto, se encontró que los niveles basales de proteína de INPP4A de individuos con genotipos AA eran menores (datos no mostrados), sugiriendo también escasa estabilidad in vivo (Figura 7).
Identificación de variantes de corte y empalme novedosas en la región del exón 15 -exón 19 de INPP4A:
Se identificó la variante de corte y empalme novedosa de 598 pares de bases en pacientes asmáticos. Esta variante tiene delecionado el exón 16 (219 bases) como se ha confirmado por secuenciación (Figura 8).
Disminución significativa en la expresión de proteínas de INPP4A en el modelo de ratón de asma inducido por alérgeno:
Se encontró que la proteína de INPP4A se expresaba a niveles significativamente inferiores en el modelo de ratón de asma inducido con albúmina de huevo con respecto a controles tratados con solución salina (Figura 9).
Restablecimiento de la proteína de INPP4A en ratones inducidos por albúmina de huevo mediante tratamiento con agente antiinflamatorio:
Se encontró que los niveles de proteína de INPP4A se restablecieron en el caso del modelo de ratón de asma inducido con albúmina de huevo tratado con esteroide. Sensiblemente, se encontró que la expresión de la proteína de INPP4A después del tratamiento con esteroide fue incluso superior que en los ratones de control tratados con solución salina (Figura 9).
Análisis de polimorfismos:
A. Preparación de muestras:
Los polimorfismos se detectan en un ácido nucleico diana de un individuo que se analiza. Para el ensayo de ADN genómico es adecuada prácticamente cualquier muestra biológica (distinta de glóbulos rojos puros). Por ejemplo, muestras de tejido convenientes incluyen sangre completa, semen, saliva, lágrimas, orina, materia fecal, sudor, de la boca, piel y pelo. Para el ensayo de ADNc o ARNm, la muestra de tejido debe obtenerse de un órgano en el que el ácido nucleico diana se expresa.
Muchos de los procedimientos descritos a continuación requieren la amplificación de ADN a partir de muestras diana. Esto puede llevarse a cabo, por ejemplo, por PCR. Véase generalmente PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification (ed. H. A. Erlich, Freeman Press, N.Y., N.Y., 1992); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (eds. Innis, y col., Academic Press, San Diego, Calif.,1990); Mattila y col., Nucleic Acids Res. 19, 4967 (1991) y la patente de EE.UU. nº 4.683.202 (cada uno de los cuales se incorpora por referencia para todos los fines).
Otros procedimientos de amplificación adecuados incluyen la reacción en cadena de la ligasa (LCR) (véase Barringer KJ y col., Gene 89:117-22, 1990; Friedhoff P y col., Anal Biochem 215:9-16, 1993) y Nucleic Acid Based Sequence Amplification (NASBA). Los dos últimos procedimientos de amplificación implican reacciones isotérmicas basadas en transcripción isotérmica que producen tanto ARN monocatenario (ARNmc) como ADN bicatenario (ADNbc) como productos de amplificación en una relación de aproximadamente 30 ó 100 a 1, respectivamente.
B. Detección de polimorfismos en ADN diana:
Hay dos tipos distintos de análisis dependiendo de si un polimorfismo en cuestión ya se ha caracterizado o no. El primer tipo de análisis se denomina algunas veces en lo sucesivo caracterización de novo. Este análisis compara secuencias diana en diferentes individuos para identificar puntos de variación, es decir, sitios polimórficos. Analizando grupos de individuos que representan la mayor diversidad étnica entre seres humanos y la mayor variedad de razas y especies en plantas y animales pueden identificarse patrones característicos de los alelos/haplotipos más comunes del locus, y las frecuencias de tales poblaciones en la población determinada. Pueden determinarse frecuencias alélicas adicionales para subpoblaciones caracterizadas por criterios tales como geografía, raza o sexo. La identificación de novo de los polimorfismos de la invención se describe en la sección de ejemplos. El segundo tipo de análisis está determinando qué forma(s) de un polimorfismo caracterizado está(n) presentes en individuos en prueba. Hay una variedad de procedimientos adecuados que a su vez se tratan.
1. Detección de repeticiones (detección de la variación del tamaño):
El diseño y el uso de cebadores que flanquean la secuencia contienen la secuencia de repetición u otros elementos polimórficos que conducen a una diferencia de tamaño. La amplificación por PCR de la secuencia conduce a la presencia de un conjunto de productos amplificados que se diferencian por la repetición específica o tamaño de polimorfismo. Estas diferencias de tamaño pueden entonces detectarse usando procedimientos basados en gel, basados en carga. Normalmente, para la detección basada en gel, uno de los cebadores está marcado con un compuesto fluorescente que luego puede excitarse y detectarse usando una cámara CCD u otros procedimientos.
2.
Sondas específicas de alelo:
El diseño y el uso de sondas específicas de alelo para analizar polimorfismos se describe, por ejemplo, por Saiki y col., Nature 324, 163-166, 1986; Dattagupta, documento EP 235.726, Saiki, documento WO 89/11548. Pueden diseñarse sondas específicas de alelo que se hibridan con un segmento de ADN diana de un individuo, pero que no se hibridan con el segmento correspondiente de otro individuo debido a la presencia de diferentes formas polimórficas en los segmentos respectivos de los dos individuos.
3.
Cebadores específicos de alelo:
Un cebador específico de alelo se hibrida con un sitio en ADN diana que se solapa con un polimorfismo y sólo ceba la amplificación de una forma alélica con la que el cebador presenta complementariedad perfecta. Este cebador se usa conjuntamente con un segundo cebador que se hibrida en un sitio distal. Véase, por ejemplo, el documento WO 93/22456.
4.
Secuenciación directa:
El análisis directo de la secuencia de polimorfismos de la presente invención puede llevarse a cabo usando tanto el procedimiento de terminación de la cadena didesoxi como el procedimiento de Maxam Gilbert (véase Sambrook y col., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2ª ed., CSHP, Nueva York 1989); Zystipo y col., Recombinant DNA Laboratory Manual, (Acad. Press, 1988)).
5.
Electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante:
Los productos de amplificación generados usando la reacción en cadena de la polimerasa pueden analizarse usando electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante. Pueden identificarse diferentes alelos basándose en las diferentes propiedades de fusión dependientes de secuencia y migración electroforética de ADN en disolución. Erlich, ed., PCR Technology, Principles and Applications for DNA Amplification, (W.H. Freeman y Co, Nueva York, 1992), Capítulo 7.
6.
Análisis de polimorfismos de conformación monocatenaria:
Pueden diferenciarse alelos de secuencias diana usando análisis de polimorfismos de conformación monocatenaria que identifican diferencias de bases por alteración en la migración electroforética de productos de PCR monocatenarios como se describe en Orita y col., Proc. Nat. Acad. Sci. 86, 2766-2770, 1989. Los productos de PCR amplificados pueden generarse como se ha descrito anteriormente, y calentarse o desnaturalizarse de otro modo para formar productos de amplificación monocatenarios. Los ácidos nucleicos monocatenarios pueden replegarse o formar estructuras secundarias que son parcialmente dependientes de la secuencia de bases. Las diferentes movilidades electroforéticas de productos de amplificación monocatenarios pueden relacionarse con la diferencia de secuencias de bases entre alelos de secuencias diana.
Procedimientos de uso:
Después de determinar la(s) forma(s) polimórfica(s) presente(s) en un individuo en uno o más sitios polimórficos, esta información puede usarse en varios procedimientos.
A. Correlación de polimorfismos con rasgos fenotípicos:
Las enfermedades atópicas son de naturaleza heterogénea y como tales hay muchos subfenotipos y rasgos para los cuales puede observarse la asociación. Los polimorfismos de la invención pueden contribuir al fenotipo de un organismo de diferentes formas. Como se ha descrito anteriormente, los polimorfismos pueden actuar a diversos niveles de organización celular, por lo que los fenotipos de enfermedad se observan como resultado final. Estos polimorfismos pueden proporcionar diferentes ventajas o desventajas de selección. Por ejemplo, una mutación de células falciformes heterocigótica confiere resistencia a malaria, pero una mutación de células falciformes homocigótica es normalmente letal. Un único polimorfismo puede afectar a más de un rasgo fenotípico.
Asimismo, un único rasgo fenotípico puede afectarse por polimorfismos en diferentes genes. Además, algunos polimorfismos predisponen a un individuo a una mutación distinta que está causalmente relacionada con un cierto fenotipo. Los rasgos fenotípicos incluyen enfermedades que tienen componentes genéticos conocidos, pero sin mapear hasta la fecha. Los rasgos fenotípicos también incluyen síntomas de, o susceptibilidad a, enfermedades multifactoriales de las que un componente es o puede ser genético tales como atopia, enfermedades autoinmunitarias, inflamación, cáncer, enfermedades del sistema nervioso e infección por microorganismos patógenos. Algunos ejemplos de enfermedades autoinmunitarias incluyen lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, diabetes, esclerosis múltiple (dependiente y no independiente de insulina) y enfermedad de Graves. Algunos ejemplos de cánceres incluyen cánceres de mama, vejiga, colon, cerebro, etc. Como tales, los rasgos fenotípicos también incluyen características, por ejemplo, susceptibilidad o receptividad a fármacos o tratamientos terapéuticos particulares.
Para realizar el análisis de asociación de los fenotipos de enfermedad y marcadores genéticos, la presencia o ausencia de un conjunto de polimorfismos (es decir, un conjunto polimórfico) se determina para un conjunto/población de individuos, algunos de los cuales presentan un rasgo particular llamado de forma muy diversa caso/ pacientes/ afectados/ individuos enfermos, etc., y algunos de los cuales presentan falta del rasgo llamado de forma muy diversa individuos de control/ normales etc. Entonces se cuentan los alelos de cada polimorfismo del conjunto para determinar si la presencia o ausencia de un alelo particular o un conjunto de alelos o un haplotipo está asociada al rasgo de interés. La prueba para tales asociaciones puede realizarse por procedimientos estadísticos convencionales tales como una prueba de x2, etc. El valor de significancia se obtiene basándose en los valores obtenidos para la hipótesis probada, por ejemplo, si el alelo X está más presente en pacientes que en controles y si el alelo X no está más presente en pacientes que en controles. Si este valor se encuentra en un intervalo particular, entonces determina el nivel de significancia de las correlaciones. Por ejemplo, podría encontrarse que la presencia del alelo A1 en el sitio polimórfico 1 establece una correlación con enfermedad de fibrosis quística. Como otro ejemplo podría encontrarse que la presencia combinada del alelo A1 en el sitio polimórfico 1 y el alelo B1 en el sitio polimórfico 2 establece una correlación con un aumento de 10 veces en la gravedad de fibrosis quística.
Tales asociaciones pueden ser de beneficio inmediato si existe una correlación extremadamente fuerte. Por ejemplo, la detección del polimorfismo A1 y B1 de fibrosis quística en un paciente puede permitir el rápido diagnóstico y discriminación de otras enfermedades que presentan fenotipos similares; también puede permitir el tratamiento si está disponible; puede permitir cribar neonatos para la detección y/o para la susceptibilidad y/o la evaluación del riesgo puede permitir la selección de procedimientos de control mejores y mejorados para la enfermedad de aquellos que están disponibles; puede permitir que se administre tratamiento si se determina que el sitio polimórfico también establece una correlación con pautas terapéuticas particulares y que tales fármacos terapéuticos son más beneficiosos para el paciente que otros fármacos.
B. Mapeo genético de rasgos fenotípicos:
La sección previa se refiere a identificar correlaciones entre rasgos fenotípicos y polimorfismos que contribuyen directamente o indirectamente a aquellos rasgos. La presente sección describe la identificación de un enlace físico entre un locus genético asociado a un rasgo de interés y marcadores polimórficos que no están asociados al rasgo, pero que están en proximidad física al locus genético responsable del rasgo y se co-segregan con él. Tal análisis es útil para mapear un locus genético asociado a un rasgo fenotípico para una posición cromosómica, y así clonar gen(es) responsable(s) del rasgo. Por favor, véanse (Altshuler D y col., 1998, N Engl J Med 338:1626; Cargill M y col., 1999, Nat Genet 22:231-8; Chang C, 1988, Proc Natl Acad Sci U S A 85:6856-60; Hacia JG y col., 1999, Nat Genet 22:164-7; Hirschhom JN y col., 2000, Proc Natl Acad Sci U S A 97:12164-9; Lander ES y Botstein D, 1986, Proc Natl Acad Sci U S A 83:7353-7; Lander ES, 1993, Nat Genet 4:5-6; Reich DE y col., 2001, Nature 411:199-204; Sachidanandam R y col., 2001, Nature 409:928-33). Los genes localizados por enlace pueden clonarse mediante un procedimiento conocido como clonación direccional.
Están disponibles programas informáticos para el cálculo de puntuaciones de yodo para valores diferentes de theta. Otras referencias sobre el enlace y el mapeo de la enfermedad que usan los enfoques anteriormente mencionados incluyen Kreutz R y col., 1995, Proc Natl Acad Sci U S A 92:8778-82; de Gouyon B y col., 1993, Proc Natl Acad Sci U S A 90:1877-81; Julier C y col., 1990, Proc Natl Acad Sci U S A 87:4585-9; Oberle I y col., 1986, Proc Natl Acad Sci U S A 83:1016-20; Lathrop GM y col., 1984, Proc Natl Acad Sci U S A 81:3443-6; Cohen D y col., 1984, Proc Natl Acad Sci U S A 81:1774-8.
El mismo sustrato puede usarse como molde para sondas de oligonucleótidos específicas de alelo para detectar todos los polimorfismos enumerados. Para fines de cribado iniciales, el polimorfismo de repetición D2S2311 encontrado 44,7 kb en la dirección 5' del gen humano de INPP4A podría ser útil ya que el alelo 400 de este polimorfismo está negativamente asociado, mientras que el alelo 402 está positivamente asociado a asma. Para este locus, la PCR se llevó a cabo en un volumen total de 5 µl que contenía 25 ng de ADN genómico, 1,25 pmoles de cada uno de un cebador directo marcado con 6-FAM y un cebador inverso no marcado, MgCl2 1,5 Mm, 0,25 Mm de cada dNTP, 0,03 U/µl de Taq ADN polimerasa (Bangalore Genie, India) y el tampón recomendado por el proveedor. Después de la PCR, 1 µl del producto de PCR se cargó con un patrón de tamaño interno (marcado con PET) en el analizador genético ABI Prism 3100 (Applied Biosystems). Se determinaron las longitudes de fragmentos usando el software Genotyper versión 3.7 (Applied Biosystems). Si se requiere, posteriormente también podría llevarse a cabo el genotipado en los otros siete loci, concretamente +92031 A/T, +92344 C/T, +92817 C/T, +110832 A/G, +131237 C/T y la repetición +99095 CA.
El genotipado de los polimorfismos +92031 A/T, +92344 C/T, +92817 C/T, +110832 A/G, +131237 C/T puede llevarse a cabo usando cebadores de SnapShot de SEC ID Nº 19, 20, 21, 22, 23, respectivamente.
Adicionalmente, los pares de oligonucleótidos pueden emplearse para detectar variantes de corte y empalme novedosas del ARNm de INPP4A como se indica anteriormente. Componentes adicionales opcionales de un kit incluyen, por ejemplo, enzimas de restricción, transcriptasa o polimerasa inversa, el sustrato nucleósido-trifosfatos, medios usados para marcar (por ejemplo, un conjugado de avidina-enzima y sustrato de enzima y cromógeno si la marca es biotina) y el tampón apropiado para la transcripción inversa, PCR, o reacciones de hibridación. Normalmente, el kit también contiene instrucciones para llevar a cabo los procedimientos.
Los siguientes ejemplos se facilitan sólo a modo de ilustración y, por tanto, no deben interpretarse que limitan el alcance de la presente invención.
Ejemplo 1
Asociación del locus de repetición D2S2311 a trastornos atópicos tales como asma:
La extensión de ADN de 401 pb de SEC ID Nº 1 del gen de INPP4A que tiene el polimorfismo de repetición D2S2311 se amplificó por PCR usando cebadores novedosos de SEC ID Nº 7 y 8. La amplificación por PCR de muestras de ADN genómico aisladas de leucocitos de sangre periférica de pacientes asmáticos atópicos e individuos de control normales se hizo usando los cebadores anteriormente dichos en una reacción agrupada. La PCR se llevó a cabo en un volumen total de 5 µl que contenía 25 ng de ADN genómico, 1,0 pmol de cada uno de cebadores inversos marcados con 6-FAM y cebadores directos no marcados, MgCl2 1,5 Mm, 0,25 Mm de cada dNTP, 0,03 U/µl de Taq ADN polimerasa (Bangalore Genie, India) y el tampón recomendado por el proveedor. Después de la PCR, 1 µl del producto de PCR se cargó con y el patrón de tamaño interno (marcado con PET) en el analizador genético ABI Prism 3100 (Applied Biosystems). Se determinaron las longitudes de fragmentos usando (Genotyper 3.7, Applied Biosystems). La PCR se estableció con las siguientes condiciones: desnaturalización a 94ºC durante 5 minutos, treinta y cinco ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 30 segundos, hibridación a 65ºC durante 30 segundos, extensión a 72ºC durante 30 segundos; seguido de un periodo de extensión de segmentos de 10 minutos a 72ºC. Para demostrar la asociación del locus de repetición D2S2311 a trastornos atópicos tales como asma se usó el software de análisis CLUMP. CLUMP es un programa diseñado para evaluar la significancia de la salida de valores observados en una tabla de contingencia de los valores esperados condicionados a los totales marginales. La significancia se evalúa usando un enfoque de Monte Carlo, realizando simulaciones repetidas para generar tablas que tienen los mismos totales marginales que el que se considera, y contando el número de veces que un valor de chi al cuadrado asociado a la tabla real se logra por los datos simulados al azar. Esto significa que los niveles de significancia asignados deberían ser objetivos (con precisión dependiente del número de simulaciones realizadas) y que no necesita tenerse en cuenta las correcciones de continuidad o pequeños valores esperados. Este análisis mostró diferencias significativas entre la distribución del recuento de alelos de grupos de pacientes y de control (x2 = 43,441128, DF = 9, valor de p < 0,0001). Los inventores observaron un patrón significativamente diferente de distribución de los alelos entre los dos grupos; los alelos 402 y 404 se representaron en exceso en el grupo de pacientes mientras que los alelos 400 y 406 fueron los principales alelos en el grupo de control. Se encontró que el alelo 402 era un alelo de riesgo con razón de posibilidades 2,289, IC del 95% [1,5443 -3,3929]. Se encontró que el alelo 400 era un alelo protector con razón de posibilidades 0,575, IC del 95% [0,4098 -0,8068] como se calcula por la tabla 2x2 (http://home.clara.net/sisa/twoby2.htm) (Figura 3). Se obtuvieron resultados similares en el estudio basado en familias (valor de p = 0,0007) (Tabla 3a).
Ejemplo 2
Asociación del polimorfismo +92031 A/T a trastornos atópicos tales como asma:
La extensión de ADN de 1036 pb de SEC ID Nº 4 del gen de INPP4A que tiene el polimorfismo +92031 A/T se amplificó por PCR usando cebadores novedosos de SEC ID Nº 13 y 14. El genotipado se hizo usando el kit de extensión de cebadores de ddNTP SNaPshot (Applied Biosystems, Foster City, EE.UU.). La PCR por SnaPshot se llevó a cabo usando 50 ng de molde de PCR purificado, 1 pmol de cebador con SEC ID 19 y mezcla de reacción ABI ready y 1X tampón de dilución (como se suministra por el fabricante). La PCR se estableció con las siguientes condiciones: 96ºC durante 10 segundos, 58ºC durante 5 segundos y 60ºC durante 30 segundos durante un total de 30 ciclos. Para purificar la reacción de extensión del cebador, 1 U de fosfatasa intestinal bovina (CIP) diluida en 10X NEB3 (New England Biolabs) se añadió a la mezcla de reacción y la mezcla se incubó a 37ºC durante 1 hora, seguido de una incubación durante 15 minutos a 72ºC para la inactivación de enzimas. Estas muestras se sometieron posteriormente a electroforesis usando el analizador genético ABI Prism 3100 según las instrucciones del fabricante. Los resultados se analizaron usando el programa ABI Prism GeneScan™ y Genotyper™ (Applied Biosystems, Foster City, EE.UU.). Para demostrar la asociación del polimorfismo +92031 A/T se realizó la prueba de tendencia de Armitage. El patrón de distribución de los tres genotipos, AA, AT y TT fue significativamente diferente en los dos grupos estudiados (x2 = 7,05, p = 0,008). El alelo A fue predominante en los casos en comparación con el grupo de control {OR = 1,542, IC del 95% (1,121 -2,120), p = 0,0075} (Tabla 1, Figura 4). Similarmente, se encontró que el alelo A se transmitía en exceso a crías afectadas en el estudio basado en familias usando el programa TDTsTDT (x2 = 9, p = 0,0027) (Tabla 3c).
Ejemplo 3
Asociación del polimorfismo +110832 A/G a trastornos atópicos tales como asma:
La extensión de ADN de 961 pb de SEC ID Nº 5 del gen de INPP4A que tiene el polimorfismo +110832 A/G se amplificó por PCR usando cebadores novedosos de SEC ID Nº 15 y 16. El genotipado se hizo usando el kit de extensión de cebadores de ddNTP SNaPshot (Applied Biosystems, Foster City, EE.UU.). La PCR por SnaPshot se llevó a cabo usando 50 ng de molde de PCR purificado, 1 pmol de cebador con SEC ID 22 y mezcla de reacción ABI ready y 1X tampón de dilución (como se suministra por el fabricante). La PCR se estableció con las siguientes condiciones: 96ºC durante 10 segundos, 58ºC durante 5 segundos y 60ºC durante 30 segundos durante un total de 30 ciclos. Para purificar la reacción de extensión del cebador, 1 U de fosfatasa intestinal bovina (CIP) diluida en 10X NEB3 (New England Biolabs) se añadió a la mezcla de reacción y la mezcla se incubó a 37ºC durante 1 hora, seguido de una incubación durante 15 minutos a 72ºC para la inactivación de enzimas. Estas muestras se sometieron posteriormente a electroforesis usando el analizador genético ABI Prism 3100 según las instrucciones del fabricante. Los resultados se analizaron usando el programa ABI Prism GeneScanTM y GenotyperTM (Applied Biosystems, Foster City, EE.UU.). Para demostrar la asociación del polimorfismo +110832 A/G se realizó la prueba de tendencia de Armitage en el estudio de casos y controles. El alelo de riesgo A mostró una asociación marginal con el fenotipo de enfermedad {razón de probabilidades = 1,324, IC del 95% (0,964-1,819), x2 = 3,01, p = 0,08) (Tabla 1). Se encontró que el alelo A se transmitió en exceso a crías afectadas en el estudio basado en familias usando el programa TDT-sTDT (x2 = 11,5, p = 0,0007) (Tabla 3e).
Ejemplo 4
Asociación del haplotipo del locus M1_S1_M3 _S4 de INPP4A a trastornos atópicos tales como asma:
Para demostrar la asociación haplotípica se usó el programa PHASE para generar haplotipos para grupos de pacientes y de control. El programa PHASE implementa un nuevo procedimiento estadístico para reconstruir haplotipos de datos de genotipo de población. Los experimentos con el software en datos tanto reales como simulados indican que puede proporcionar una mejora en el algoritmo EM para reconstruir haplotipos. Permite datos de genotipo ausentes y también puede manipular más de un locus independientemente del polimorfismo, por ejemplo, pueden analizarse simultáneamente SNP y repeticiones. Basándose en la salida del software, los valores de probabilidad de los haplotipos también se predicen y pueden utilizarse para diferenciar haplotipos más confiados. El software PHASE es adecuado para distancias genéticas de 100 cM o menores. Similarmente se realizó análisis haplotípico basado en familias usando el programa TRANSMIT. TRANSMIT prueba la asociación entre marcador genético y enfermedad examinando la transmisión de marcadores de padres a la cría afectada. Las pruebas se basan en un vector de puntuación que se promedia de todas las posibles configuraciones de haplotipos y transmisiones parentales de acuerdo con los datos observados.
En el estudio de casos y controles, los haplotipos cuya frecuencia esperada fue superior a 0,025 en cualquiera de los dos grupos se muestran en la Tabla 2 (Figura 6). La posibilidad en favor de pacientes en vez de controles que tienen haplotipo 402_A_154_A fue 3,68 con IC del 95%: 2,2977, 5,916. Las pruebas x2 de relaciones de probabilidades correspondientes mostraron un valor de p inferior a 10-5. TRANSMIT también mostró resultados similares en el estudio de asociación basado en familias (x2 = 4,2714, DF = 1, valor de p = 0,038). Por tanto, el haplotipo de 4 loci que comprende los loci M1_ S1_M3_S4, 402_A_154_A estuvo fuertemente asociado a asma. Por otra parte, la posibilidad en favor de pacientes en vez de controles que tienen haplotipo 400_T_152_G y 400_A_154_A fue 0,16, IC del 95%: 0,46-1,09 y 0,12, IC del 95%: 0,33-0,82, respectivamente. También se encontró que el haplotipo 400_T_152_G estaba negativamente asociado a la aparición de asma atópico en el estudio basado en familias. (x2 = 8,065, DF = 1, valor de p = 0,0045). Por tanto, se identificó que los haplotipos 402_A_154_A y 400_T_152_G eran haplotipos de riesgo y protectores muy importantes, respectivamente.
Ejemplo 5
Análisis PEST del polimorfismo +110832 A/G:
Para demostrar la importancia de la sustitución de treonina por alanina en el aminoácido 604 en la variante de corte y empalme a 3 del gen de INPP4A. El exón extendido contiene la posible secuencia PEST del aminoácido 584-607 con la puntuación PESTfind de +7,49 (www.at.embnt.org/embnet/tools/bio/pestfind/). El polimorfismo +110832 A/G (rs2278206) produce una sustitución de treonina por alanina en la posición 604 en la secuencia de proteínas produciendo una secuencia PEST deficiente (puntuación de PESTfind +4,95). Por tanto, la sustitución de treonina por alanina en este locus particular puede hacer que la enzima de INPP4 sea resistente a proteasas calpaínas (Figura 7 A).
Ejemplo 6
Validación funcional del polimorfismo +110832 A/G:
Para confirmar esta hipótesis experimentalmente, las plaquetas de individuos sanos normales de diferentes genotipos en A+110832G (S4) se estimularon con ionomicina y la degradación de INPP4A se comprobó por análisis de transferencia Western. Se encontró que la proteína de plaquetas de individuos con genotipo AA era más susceptible a degradación como se observa por casi el 60% de degradación en el plazo de 10 min desde la estimulación, mientras que la proteína de individuos con genotipo GG era menos susceptible (casi el 31% de degradación). Por tanto, se encontró que los niveles basales de proteína de INPP4A de individuos con genotipos AA eran menores (datos no mostrados), sugiriendo también escasa estabilidad in vivo (Figura 7b, 7c).
Ejemplo 7
Variantes de corte y empalme novedosas del gen de INPP4A:
Para demostrar la presencia de variantes de corte y empalme novedosas del gen de INPP4A expresado en sangre de pacientes asmáticos atópicos. Se llevó a cabo la RT-PCR del ARN de 12 individuos asmáticos atópicos y 4 sanos normales. Se aisló ARN de los leucocitos totales usando el kit de aislamiento EZ-RNA siguiendo las instrucciones del fabricante (Biological, Industries). Se preparó ADNc a partir de 10 µg de ARN total usando el kit cDNA Archive de Applied Biosystems. La PCR se llevó a cabo en un volumen total de 20 µl que contenía ADNc correspondiente a 100 ng de ARN de partida, 2,0 pmoles de cada uno de cebador directo e inverso (SEC ID 25 y 26, respectivamente), MgCl2 1,5 Mm, 0,25 Mm de cada dNTP, 0,03 U/µl de Taq ADN polimerasa (Bangalore Genie, India) y el tampón recomendado por el proveedor. Condiciones de PCR: desnaturalización a 94ºC durante 5 minutos, 30 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 45 segundos, hibridación a 65ºC durante 45 segundos, extensión a 72ºC durante 45 segundos; seguido de un periodo de extensión de segmentos de 10 minutos a 72ºC. Para demostrar la presencia de variantes de corte y empalme novedosas del gen de INPP4A expresado en sangre de pacientes asmáticos tópicos. Se llevó a cabo la RT-PCR del ARN de 12 individuos asmáticos atópicos y 4 sanos normales. Se identificaron dos variantes de corte y empalme adicionales, aparte de la a 3 informada, en cuatro individuos asmáticos atópicos, mientras que no se observó variante de corte y empalme en los individuos sanos normales (Figura 8).
Ejemplo 8
Expresión inducida por alérgenos del perfil de proteínas de INPP4A:
Los ratones BALB/c se sensibilizaron por inyecciones intraperitoneales de 20 µg de albúmina de huevo de huevo de gallina (OVA) (calidad V 98% de pureza, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EE.UU.) en 0,2 ml de solucion salina adsorbida sobre 2 mg de alumbre (sensibilizados) o alumbre sola (control) en los días 0, 7 y 14. Entonces, los ratones se expusieron a 3% de albúmina de huevo aerosolizada (sensibilizados) o solución salina aerosolizada (control) 30 minutos por día durante 10 días consecutivos (del día 22 al día 32). La receptividad a metacolina (Sigma-Aldrich) se evaluó en ratones sin limitaciones conscientes por pletismografía barométrica usando protocolo, aparato y software suministrado por BUXCO (Troy, NY, EE.UU.). Los ratones se sacrificaron 16 h después de la última exposición y se tomó tejido de pulmón para inmunohistoquímica. La inmunohistoquímica de la sección de pulmón de ratón se hizo usando el anticuerpo policlonal sc-12315 de cabra comercial (Santa Cruz Biotechnology, Inc.; CA, EE.UU.) producido contra un péptido próximo al extremo amino de INPP4A de origen humano y de ratón siguiendo el protocolo convencional con ligeras modificaciones (Ather MH y col., 2004). Se usó gamma-globulina de cabra como control de isotipo (Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc.; PA, EE.UU.).
Se observó que la proteína de INPP4A se expresaba a menores niveles en el modelo de ratón de asma inducido con albúmina de huevo que en los controles tratados con solución salina (Figura 9).
Ejemplo 9
Restablecimiento de la proteína de INPP4A mediante tratamiento con agente antiinflamatorio tal como esteroide:
Los ratones BALB/c se sensibilizaron por inyecciones intraperitoneales de 20 µg de albúmina de huevo de huevo de gallina (OVA) (calidad V 98% de pureza, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EE.UU.) en 0,2 ml de solucion salina adsorbida sobre 2 mg de alumbre en los días 0, 7 y 14. Entonces, los ratones se expusieron a 3% de albúmina de huevo aerosolizada 30 minutos por día durante 10 días consecutivos (del día 22 al día 32). Se administró tratamiento con 1 mg/kg de dexametasona empezando desde el día de la última sensibilización hasta la última exposición (día 14-32). La hiperreceptividad bronquial se midió como se ha descrito previamente usando el pletismógrafo BUXCO (Troy, NY, EE.UU.). Los ratones se sacrificaron 16 h después de la última exposición a OVA y los pulmones se sometieron a inmunohistoquímica. La inmunohistoquímica de la sección de pulmón de ratón se hizo usando el anticuerpo policlonal sc-12315 de cabra comercial (Santa Cruz Biotechnology, Inc.; CA, EE.UU.) producido contra un péptido próximo al extremo amino de INPP4A de origen humano y de ratón siguiendo el protocolo convencional con ligeras modificaciones (Ather MH y col., 2004). Se usó gamma-globulina de cabra como control de isotipo (Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc.; PA, EE.UU.). Se encontró que los niveles de proteína de INPP4A se restauraron a niveles normales en el caso del modelo de asma de ratón inducido con albúmina de huevo tratado con esteroide (Figura 9).
Tabla 1: Frecuencia (%) de SNP en pacientes y controles.
SNP ID
Genotipo Pacientes (N = 192) Controles (N = 272)
+92031 A/T
TT 3,19 7,78
(rs3769712)
AT 32,45 38,15
AA
64,36 54,07 15
+92344 C/T
TT 0,54 1,13
(rs3769710)
CT 13,98 19,17
CC
85,48 79,7
+92817 C/T
TT 3,51 7,48 20
(rs2278208)
CT 33,92 37,4
CC
62,57 55,12
+110832 A/G
GG 3,3 7,58
(rs2278206)
AG 34,62 36,74 25
AA
62,09 55,68
+131237
C/T TT 7,61 6,67
(rs10201079)
CT 40,76 32,22
CC
51,63 61,11
Tabla 2: Frecuencia (%) de haplotipos construidos usando D2S311/rs3769712/repetición de CA/ marcadores de rs2278206 en pacientes y controles estimados por PHASE. Los haplotipos con frecuencias relativas > 0,025 (2,5% de tamaño de muestra) en cualquiera de los grupos se han representado más adelante.
SEC Nº
HAPLOTIPO PACIENTES CONTROLES
1.
398_A_154_A 2,86 0,91
2.
400_T_152_G 9,11 12,32
3.
400_A_154_A 7,29 13,05
4.
402_T_152_G 1,04 3,49
5.
402_A_154_A 16,14 4,96
6.
404_T_152_G 6,25 5,51
7.
404_A_154_A 45,57 40,26
8.
406_A_154_A 2,60 6,62
Tabla 3: Prueba de desequilibrio de transmisión en familias (N = 158) para los ocho loci estudiados.
Tabla 3 (a): D2S2311 /M1 (p = 0,0007)
Alelo
Transmitidos No transmitidos Chi al cuadrado
386
4 0 4
396
3 5 0,5
398
9 11 0,2
400
27 58 11,306
402
36 22 3,379
404
72 50 3,967
406
4 9 1,923
408
5 5 0
Tabla 3 (b): D2S2187/M2 (p = 0,19)
Alelo
Transmitidos No transmitidos Chi al cuadrado
224
2 1 0,333
226
1 1 0
228
6 5 0,091
230
13 21 1,882
232
34 41 0,653
234
84 62 3,315
236
39 44 0,301
238
15 24 2,077
240
4 2 0,667
244
3 0 3
Tabla 3 (c): rs3769712 / SS1 (p = 0,0027)
Alelo
Transmitidos No transmitidos Chi al cuadrado
A
65 35 9
T
35 65 9
Tabla 3 (d): rs3769710 / SS2 (p = 0,058)
Alelo
Transmitidos No transmitidos Chi al cuadrado
C
30 17 3,596
T
17 30 3,596
Tabla 3 (e): rs2278208 / SS3 (p = 0,063)
Alelo
Transmitidos No transmitidos Chi al cuadrado
C
56 38 3,447
T
38 56 3,447
Tabla 3 (f): Repetición de CA (p = 0,008)
Alelo
Transmitidos No transmitidos Chi al cuadrado
152
38 65 7,078
154
65 38 7,078
Tabla 3 (g): rs2278206 / SS4 (p = 0,0007)
Alelo
Transmitidos No transmitidos Chi al cuadrado
A
78 41 11,504
G
41 78 11,504
Tabla 3 (h): rs10201079 / SS5 (p = 0,03)
Alelo
Transmitidos No transmitidos Chi al cuadrado
C
34 54 4,545
T
54 34 4,545
LISTA DE SECUENCIAS: Información general
SOLICITANTE: CSIR, INDIA T�?TULO DE LA INVESTIGACIÓN: Variantes genéticas de INOSITOL POLIFOSFATO-4-FOSFATASA HUMANA, 5 TIPO I (INPP4A), y diagnóstico, predicción y prevención de trastornos inmunológicos que incluyen asma atópico. NÚMERO DE SECUENCIAS: 26
i. INFORMACIÓN DE SEC ID Nº: 1
ii. CARACTER�?STICAS DE SECUENCIA: consiste en dinucleótidos CA (D2S2311) en el nucleótido 31-73
iii. LONGITUD: 401 pb 10 iv. TIPO: ADN
V.
vi. ORGANISMO: humano (secuencia natural)
vii. INMEDIATA: secuencia natural 15 viii. NOMBRE/CLAVE: N.A
ix.
SECUENCIA ID Nº 1
i.
INFORMACIÓN DE SEC ID Nº: 2
ii. CARACTER�?STICAS DE SECUENCIA: consiste en dinucleótidos GT (D2S2187) en el nucleótido 11620 164
iii. LONGITUD: 240 bases
iv.
TIPO: ADN
v.
25 vi. ORGANISMO: humano (secuencia natural)
vii. INMEDIATA: secuencia natural
viii. NOMBRE/CLAVE: N.A
ix. SECUENCIA ID Nº 2
i. INFORMACIÓN DE SEC ID Nº: 3 30 ii. CARACTER�?STICAS DE SECUENCIA: consiste en dinucleótidos CA en el nucleótido 105 a 122
iii. LONGITUD: 159 bases
iv.
TIPO: ADN
v.
vi. ORGANISMO: humano (secuencia natural)
vii. INMEDIATA: secuencia natural
viii. NOMBRE/CLAVE: N.A 5 ix. SECUENCIA ID Nº 3
i. INFORMACIÓN DE SEC ID Nº: 4
ii. CARACTER�?STICAS DE SECUENCIA: consiste en el polimorfismo 75 A/T (rs3769712), polimorfismo 388 C/T (rs3769710) y 861 C/T (rs2278208) en el nucleótido 229
iii. LONGITUD: 1036 bases 10 iv. TIPO: ADN
v.
vi. ORGANISMO: humano (secuencia natural)
vii. INMEDIATA: secuencia natural 15 viii. NOMBRE/CLAVE: N.A.
ix.
SECUENCIA ID Nº 4
i.
INFORMACIÓN DE SEC ID Nº: 5
ii. CARACTER�?STICAS DE SECUENCIA: consiste en el polimorfismo G/A (rs2278206) en el nucleótido 147
iii. LONGITUD: 961 bases 20 iv. TIPO: ADN
v.
vi. ORGANISMO: humano (secuencia natural)
vii. INMEDIATA: secuencia natural 5 viii. NOMBRE/CLAVE: N.A
ix.
SECUENCIA ID Nº 5
i.
INFORMACIÓN DE SEC ID Nº: 6
ii. CARACTER�?STICAS DE SECUENCIA: consiste en el polimorfismo C/T (rs10201079) en el nucleótido
1221 10 iii. LONGITUD: 1707 bases
iv.
TIPO: ADN
v.
vi. ORGANISMO: humano (secuencia natural)
vii. INMEDIATA: secuencia natural
viii. NOMBRE/CLAVE: N.A.
ix.
SECUENCIA ID Nº 6
i.
INFORMACIÓN DE SEC ID Nº: VII
ii. CARACTER�?STICAS DE SECUENCIA: cebador directo para la secuencia ID: 1
iii. LONGITUD: 18 bases
iv.
TIPO: ADN
v.
5' GGG GCA AGT GGC GAT AGG 3'
vi. ORGANISMO: humano (secuencia natural)
vii. INMEDIATA: secuencia natural
viii. NOMBRE/CLAVE: oligonucleótido sintético
ix.
SECUENCIA ID Nº 7
i.
INFORMACIÓN DE SEC ID Nº: VIII
ii. CARACTER�?STICAS DE SECUENCIA: cebador inverso para la secuencia ID: 1
iii. LONGITUD: 20 bases
iv.
TIPO: ADN
v.
5' TGT TCC CCC ATG GCA GTG TA 3'
vi. ORGANISMO: humano (secuencia natural)
vii. INMEDIATA: secuencia natural
viii. NOMBRE/CLAVE: oligonucleótido sintético
ix.
SECUENCIA ID Nº 8
i.
INFORMACIÓN DE SEC ID Nº: IX
ii. CARACTER�?STICAS DE SECUENCIA: cebador directo para la secuencia ID: 2
iii. LONGITUD: 21 bases
iv.
TIPO: ADN
v.
5' GGG CTG GAG GGG GTG GAG TAG 3'
vi. ORGANISMO: humano (secuencia natural)
vii. INMEDIATA: secuencia natural
viii. NOMBRE/CLAVE: oligonucleótido sintético
ix.
SECUENCIA ID Nº 9
i.
INFORMACIÓN DE SEC ID Nº: X
ii. CARACTER�?STICAS DE SECUENCIA: cebador inverso para la secuencia ID: 2 iii LONGITUD: 25 bases
iv.
TIPO: ADN
v.
5' ATC ACC CCA CAG AGC TAA GGC AAC A 3'
vi. ORGANISMO: humano (secuencia natural)
vii. INMEDIATA: secuencia natural
viii. NOMBRE/CLAVE: oligonucleótido sintético
ix.
SECUENCIA ID Nº 10
i.
INFORMACIÓN DE SEC ID Nº: XI
ii. CARACTER�?STICAS DE SECUENCIA: cebador directo para la secuencia ID: 3
iii. LONGITUD: 23 bases
iv.
TIPO: ADN
v.
5' TCA CCC AGT ACC AGA CCA TCA TC 3'
vi. ORGANISMO: humano (secuencia natural)
vii. INMEDIATA: secuencia natural
viii. NOMBRE/CLAVE: oligonucleótido sintético
ix.
SECUENCIA ID Nº 11
i.
INFORMACIÓN DE SEC ID Nº: XII
ii. CARACTER�?STICAS DE SECUENCIA: cebador inverso para la secuencia ID: 3
iii. LONGITUD: 22 bases
iv.
TIPO: ADN
v.
5' TGG GAA AGC AGA GGG AGT GAC T 3'
vi. ORGANISMO: humano (secuencia natural)
vii. INMEDIATA: secuencia natural
viii. NOMBRE/CLAVE: oligonucleótido sintético
ix.
SECUENCIA ID Nº 12
i.
INFORMACIÓN DE SEC ID Nº: XIII
ii. CARACTER�?STICAS DE SECUENCIA: cebador directo para la secuencia ID: 4
iii. LONGITUD: 24 bases
iv.
TIPO: ADN
v.
5' TGC AGC AGC CCT TAG TTT GTT TAG 3'
vi. ORGANISMO: humano (secuencia natural)
vii. INMEDIATA: secuencia natural
viii. NOMBRE/CLAVE: oligonucleótido sintético
ix.
SECUENCIA ID Nº 13
i.
INFORMACIÓN DE SEC ID Nº: XIV
ii. CARACTER�?STICAS DE SECUENCIA: cebador inverso para la secuencia ID: 4
iii. LONGITUD: 18 bases
iv.
TIPO: ADN
v.
5' AGG GGG CCG TTG GTC TGA 3'
vi. ORGANISMO: humano (secuencia natural)
vii. INMEDIATA: secuencia natural
viii. NOMBRE/CLAVE: oligonucleótido sintético
ix.
SECUENCIA ID Nº 14
i.
INFORMACIÓN DE SEC ID Nº: 15 ii CARACTER�?STICAS DE SECUENCIA: cebador directo para la secuencia ID: 5 iii LONGITUD: 23 bases
iv.
TIPO: ADN v 5' ATG GCG AGG GCT GTG AGG ATG TC 3' vi ORGANISMO: humano (secuencia natural) vii INMEDIATA: secuencia natural viii NOMBRE/CLAVE: oligonucleótido sintético ix SECUENCIA ID Nº 15
i.
INFORMACIÓN DE SEC ID Nº: XVI
ii. CARACTER�?STICAS DE SECUENCIA: cebador inverso para la secuencia ID: 5
iii. LONGITUD: 24 bases
iv.
TIPO: ADN
v.
5' GAA GCT AGG TCT GTG GGC AAG TCT 3'
vi. ORGANISMO: humano (secuencia natural)
vii. INMEDIATA: secuencia natural
viii. NOMBRE/CLAVE: oligonucleótido sintético
ix.
SECUENCIA ID Nº 16
i.
INFORMACIÓN DE SEC ID Nº: 17
ii. CARACTER�?STICAS DE SECUENCIA: cebador directo para la secuencia ID: 6
iii. LONGITUD: 21 bases
iv.
TIPO: ADN
v.
5' CCT TGG CTG CAT GGG TTC TCA 3'
vi. ORGANISMO: humano (secuencia natural)
vii. INMEDIATA: secuencia natural
viii. NOMBRE/CLAVE: oligonucleótido sintético
ix.
SECUENCIA ID Nº 17
i.
INFORMACIÓN DE SEC ID Nº: 18
ii. CARACTER�?STICAS DE SECUENCIA: cebador inverso para la secuencia ID: 6
iii. LONGITUD: 21 bases
iv.
TIPO: ADN
v.
5' CAT GCC TGG GCC CTC TTA TCA 3'
vi. ORGANISMO: humano (secuencia natural)
vii. INMEDIATA: secuencia natural
viii. NOMBRE/CLAVE: oligonucleótido sintético
ix.
SECUENCIA ID Nº 18
i.
INFORMACIÓN DE SEC ID Nº: 19
ii. CARACTER�?STICAS DE SECUENCIA: cebador de Snapshot para SNP 75 A/T (rs3769712) en secuencia ID: 4
iii. LONGITUD: 19 bases
iv.
TIPO: ADN
v.
5' CAA AGC CCT TTC CCT TAC A 3' (hebra inversa)
vi. ORGANISMO: humano (secuencia natural)
vii. INMEDIATA: secuencia natural
viii. NOMBRE/CLAVE: oligonucleótido sintético
ix.
SECUENCIA ID Nº 19
i.
INFORMACIÓN DE SEC ID Nº: 20
ii. CARACTER�?STICAS DE SECUENCIA: cebador de Snapshot para el polimorfismo 388 C/T (rs3769710) en secuencia ID: 4
iii. LONGITUD: 22 bases
iv.
TIPO: ADN
v.
5' ATC CCG AAG GGT GGC TGA TGG T 3' (hebra inversa)
vi. ORGANISMO: humano (secuencia natural)
vii. INMEDIATA: secuencia natural
viii. NOMBRE/CLAVE: oligonucleótido sintético
ix.
SECUENCIA ID Nº 20
i.
INFORMACIÓN DE SEC ID Nº: 21 ii CARACTER�?STICAS DE SECUENCIA: cebador de Snapshot para 861 C/T (rs2278208) en secuencia ID:
iii LONGITUD: 25 bases iv TIPO: ADN
v.
5' AGC CGT ACT GGG TCA TCA GGG TCC T 3' (hebra inversa) vi ORGANISMO: humano (secuencia natural) vii INMEDIATA: secuencia natural viii NOMBRE/CLAVE: oligonucleótido sintético ix SECUENCIA ID Nº 21
i.
INFORMACIÓN DE SEC ID Nº: XXII
ii. CARACTER�?STICAS DE SECUENCIA: cebador de Snapshot para el polimorfismo C/T (rs2278206) en el nucleótido 147 en secuencia ID: 5
iii. LONGITUD: 20 bases
iv.
TIPO: ADN
v.
5' CAG ATG AGG ATG GCA TGC AG 3' (hebra inversa)
vi. ORGANISMO: humano (secuencia natural)
vii. INMEDIATA: secuencia natural
viii. NOMBRE/CLAVE: oligonucleótido sintético
ix.
SECUENCIA ID Nº 22
i.
INFORMACIÓN DE SEC ID Nº: 23
ii.
CARACTER�?STICAS DE SECUENCIA: cebador de Snapshot para el polimorfismo C/T (rs10201079) en el nucleótido 1221 en secuencia ID: 6 iii LONGITUD: 18 bases iv TIPO: ADN
v.
5' GAT TGC CAC AGA TTT ACA 3' vi ORGANISMO: humano (secuencia natural) vii INMEDIATA: secuencia natural viii NOMBRE/CLAVE: oligonucleótido sintético ix SECUENCIA ID Nº 23
i.
INFORMACIÓN DE SEC ID Nº: 24
ii.
CARACTER�?STICAS DE SECUENCIA: secuencia de ADNc que contiene la región de variante de corte y empalme iii LONGITUD: variable de 817 -598 nucleótidos iv TIPO: ADN
vi ORGANISMO: humano (secuencia natural) vii INMEDIATA: secuencia natural viii NOMBRE/CLAVE: N.A. ix SECUENCIA ID Nº 24
i. INFORMACIÓN DE SEC ID Nº: 25
ii.
CARACTER�?STICAS DE SECUENCIA: cebador directo para la secuencia de ADNc que contiene la región de variante de corte y empalme iii LONGITUD: 19 bases iv TIPO: ADN
v.
5' GGG GCG CCA GCA GCA CAC T 3' vi ORGANISMO: humano (secuencia natural) vii INMEDIATA: secuencia natural viii NOMBRE/CLAVE: oligonucleótido sintético ix SECUENCIA ID Nº 25
i.
INFORMACIÓN DE SEC ID Nº: 26
ii.
CARACTER�?STICAS DE SECUENCIA: cebador inverso para la secuencia de ADNc que contiene la región de variante de corte y empalme iii LONGITUD: 24 bases iv TIPO: ADN
v.
5' GCG GGT AAA GGG CCT CAC TCC ATT 3' vi ORGANISMO: humano (secuencia natural) vii INMEDIATA: secuencia natural viii NOMBRE/CLAVE: oligonucleótido sintético ix SECUENCIA ID Nº 26
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LISTA DE SECUENCIAS
<110> COUNCIL OF SCIENTIFIC AND INDUSTRIAL RESEARCH
<120> VARIANTES GENÉTICAS DE INOSITOL POLIFOSFATO-4-FOSFATASA HUMANA, TIPO I (INPP4A),ÚTILES PARA LA PREDICCIÓN Y LA TERAPIA DE TRASTORNOS INMUNOLÓGICOS
5 <130> PCT0657
<150> 1536DEL2005
<151> 25/10/2005
<160> 26
<170> PatentIn versión 3.3 10 <210> 1
<211> 401
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 1
<210> 2
<211> 240
<212> ADN
<213> Homo sapiens
20 <400> 2
<210> 3
<211> 159
<212> ADN 25 <213> Homo sapiens
<400> 3
<210> 4 30 <211> 1036
<212> ADN
<213> Homo Sapiens
<400> 4
<210> 5
<211> 961
<212> ADN
<213> Homo Sapiens
<400> 5
<210> 6
<211> 1707
<212> ADN
<213> Homo Sapiens
<400> 6
<210> 7
<211> 18 10 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador directo para amplificar la secuencia ID: 1
<400> 7 15 ggggcaagtg gcgatagg 18 <210> 8
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador inverso para amplificar la secuencia ID: 1
<400> 8 tgttccccca tggcagtgta 20
<210> 9
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador directo para amplificar la secuencia ID: 2
<400> 9 gggctggagg gggtggagta g 21
<210> 10
<211> 25
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador inverso para amplificar la secuencia ID: 2
<400> 10 atcaccccac agagctaagg caaca 25
<210> 11
<211> 23
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador directo para amplificar la secuencia ID: 3
<400> 11 tcacccagta ccagaccatc atc 23
<210> 12
<211> 22
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador inverso para amplificar la secuencia ID: 3
<400> 12 tgggaaagca gagggagtga ct 22
<210> 13
<211> 24
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador directo para amplificar la secuencia ID: 4
<400> 13 tgcagcagcc cttagtttgt ttag 24
<210> 14
<211> 18
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador inverso para amplificar la secuencia ID: 4
<400> 14 agggggccgt tggtctga 18
<210> 15
<211> 23
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador directo para amplificar la secuencia ID: 5
<400> 15 atggcgaggg ctgtgaggat gtc 23
<210> 16
<211> 24
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador inverso para amplificar la secuencia ID: 5
<400> 16 gaagctaggt ctgtgggcaa gtct 24
<210> 17
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador directo para amplificar la secuencia ID: 6
<400> 17 ccttggctgc atgggttctc a 21
<210> 18
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador inverso para amplificar la secuencia ID: 6
<400> 18 catgcctggg ccctcttatc a 21
<210> 19
<211> 19
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador de Snapshot para SNP 75 A/T (rs3769712) en la secuencia ID: 4
<400> 19 caaagccctt tcccttaca 19
<210> 20
<211> 22
<212> ADN
<213> Artificial
<220> <223> Cebador de Snapshot para 388 C/T polimorfismo (rs3769710) en la secuencia ID: 4
<400> 20 atcccgaagg gtggctgatg gt 22
<210> 21 5 <211> 25
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador de Snapshot para 861 C/T (rs2278208) en la secuencia ID: 4
10 <400> 21 agccgtactg ggtcatcagg gtcct 25
<210> 22
<211> 20
<212> ADN 15 <213> Artificial
<220>
<223> Cebador de Snapshot para el polimorfismo C/T (rs2278206) en el nucleótido 147 en la secuencia ID: 5
<400> 22 cagatgagga tggcatgcag 20
20 <210> 23
<211> 18
<212> ADN
<213> Artificial
<220> 25 <223> Cebador de Snapshot para el polimorfismo C/T (rs10201079) en el nucleótido 1221 en la secuencia ID: 6
<400> 23 gattgccaca gatttaca 18
<210> 24
<211> 816 30 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia de ADNc que contiene la región de la variante de corte y empalme
<400> 24
<210> 25
<211> 19
<212> ADN 5 <213> Artificial
<220>
<223> Cebador directo para amplificar la secuencia de ADNc que contiene la región de la variante de corte y empalme
<400> 25 10 ggggcgccag cagcacact 19
<210> 26
<211> 24
<212> ADN
<213> Artificial
15 <220>
<223> Cebador inverso para amplificar la secuencia de ADNc que contiene la región de la variante de corte y empalme
<400> 26 gcgggtaaag ggcctcactc catt 24

Claims (13)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un procedimiento in vitro de predicción de la susceptibilidad de un individuo a asma que comprende determinar si dicho individuo posee o no un haplotipo de variantes genéticas, seleccionándose dichas variantes de variantes genéticas del gen humano de inositol polifosfato 4-fosfatasa (INPP4A) y la repetición del dinucleótido CA en el locus
    5 M1 localizado 44,7 kb en la dirección 5' del sitio de iniciación de dicho gen, en el que dicho haplotipo está positivamente asociado o negativamente asociado a la aparición de asma.
  2. 2. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que se determina un haplotipo que representa una combinación de variantes seleccionadas de una variante alélica de dicha repetición del dinucleótido CA en el locus M1, variante +92031A/T en el locus S1, repetición del dinucleótido CA en el locus M3 en +99095 y variante +110832 A/G en el
    10 locus S4.
  3. 3. Un procedimiento según la reivindicación 2, en el que se determina un haplotipo de cuatro loci con referencia al orden de los loci M1_S1_M3_S4 y se selecciona de:
    396_T_154_G, 398_A_152_A, 400_T_152_A, 400_A_152_A,
    406_T_152_A, 406_A_156_T, 412_A_154_A, 400_T_154_A,
    402_T_152_A, 404_A_156_T, 410_A_154_A, 404_A_152_G,
    406_A_152_A, 404_A_152_A, 406_T_152_G, 396_A_152_G,
    400_A_154_G, 402_T_154_A, 402_A_152_A, 404_T_154_A,
    400_T_154_G, 396_T_152_G, 404_T_152_A, 398_A_152_G,
    386_A_154_A, 402_T_152_G, 398_T_152_G, 404_A_154_G,
    408_A_154_A, 406_A_154_A, 398_A_154_A, 404_T_152_G,
    400_A_154_A, 400_T_152_G, 402_A_154_A, 404_A_154_A
    en el que el primer número representa la longitud en pares de bases del fragmento obtenible por la amplificación por PCR correspondiente al locus M1 usando el par de cebadores de SEC ID Nº 7 y 8 y el último número representa la 15 longitud en pares de bases obtenible por la amplificación por PCR correspondiente al locus M3 usando el par de cebadores de SEC ID Nº 11 y 12.
  4. 4.
    Un procedimiento según la reivindicación 3, en el que el haplotipo 402_A_154_A se detecta como un factor de riesgo para asma.
  5. 5.
    Un procedimiento según la reivindicación 3, en el que el haplotipo 400_A_154_A y/o 400_T_152_G se detecta
    20 como negativamente asociado a la aparición de asma y/o el haplotipo 400_T_152_G se detecta como negativamente asociado a la aparición de asma atópico.
  6. 6.
    Cebadores definidos por SEC ID Nº 7-18 para su uso en la predicción de la predisposición a asma.
  7. 7.
    Cebadores según la reivindicación 6 adicionalmente complementados con los cebadores definidos por SEC ID Nº 19-23.
    25 8. Uso in vitro de cebadores definidos por SEC ID Nº 7-18 para predecir la predisposición a asma.
  8. 9.
    El uso según la reivindicación 8, en el que dichos cebadores están adicionalmente complementados por los cebadores definidos por SEC ID Nº 19-23.
  9. 10.
    Un procedimiento in vitro para detectar y predecir la predisposición a asma cribando haplotipos de INPP4A y variantes de corte y empalme y su expresión en un sujeto, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:
    30 [a] aislar ADN de muestras seleccionadas de sangre completa, semen, saliva, lágrimas, orina, materia fecal, sudor, de la boca, piel o pelo;
    [b] proporcionar cebadores que tienen SEC ID Nº 7-18;
    [c] amplificar y secuenciar extensiones de ADN genómico usando cebadores de SEC ID Nº 7 -18, en el que
    los cebadores de SEC ID Nº 7, 9, 11, 13, 15, 17 son cebadores directos y los cebadores de SEC ID Nº 8, 35 10, 12, 14, 16, 18 son cebadores inversos;
    [d] amplificar y secuenciar la extensión de ADN de SEC ID Nº 1 del gen de INPP4A usando la combinación de cebadores de SEC ID Nº 7 y 8, conteniendo SEC ID Nº1 la secuencia correspondiente a la repetición de microsatélites en el locus M1 D2S2311;
    [e] amplificar y secuenciar la extensión de ADN de SEC ID Nº 2 del gen de INPP4A usando la combinación 40 de cebadores de SEC ID Nº 9 y 10, conteniendo SEC ID Nº 2 la secuencia correspondiente a la repetición de microsatélites en el locus M2 D2S2187 en la posición +43987 en el intrón 1;
    [f] amplificar y secuenciar la extensión de ADN de SEC ID Nº 3 del gen de INPP4A usando la combinación de cebadores de SEC ID Nº 11 y 12, conteniendo SEC ID Nº 3 la secuencia correspondiente a la repetición de microsatélites en el locus M3 +99095;
    [g] amplificar y secuenciar la extensión de ADN de SEC ID Nº 4 del gen de INPP4A usando la combinación de cebadores de SEC ID Nº 13 y 14, conteniendo SEC ID Nº 4 el locus S1 +92031A/T, el locus S2 +92344 C/T y el locus S3 locus +92817C/T de sitios de polimorfismo de un único nucleótido (SNP);
    [h] amplificar y secuenciar la extensión de ADN de SEC ID Nº 5 del gen de INPP4A usando la combinación de cebadores de SEC ID Nº 15 y 16, conteniendo SEC ID Nº 5 el sitio de SNP en el locus S4 en la posición +110832A/G en el exón 17 de variante de variante de corte y empalme;
    [i] amplificar y secuenciar la extensión de ADN de SEC ID Nº 6 del gen de INPP4A usando la combinación de cebadores de SEC ID Nº 17 y 18, conteniendo SEC ID Nº 6 el sitio de SNP en el locus S5 en la posición +131237 C/T, y
    [j] validar e identificar las variantes del gen de INPP4A específicas computacionalmente comparando con las secuencias del gen de INPP4A naturales conocidas; y
    [k] aislar ARN de muestras de sangre completa; y
    [l] aislar e identificar variantes de corte y empalme de SEC ID Nº 24 usando la combinación de cebadores de SEC ID Nº 25 y26.
  10. 11.
    Un procedimiento según la reivindicación 10, en el que el sujeto es humano.
  11. 12.
    Marcadores farmacogenéticos que tienen SEC ID Nº 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 24 para su uso en detectar y predecir la predisposición a asma en un sujeto, teniendo dichos marcadores las siguientes características:
    (i)
    la SEC ID Nº 1 contiene 1-230 nucleótidos contiguos que contienen un grupo de dinucleótidos CA del locus M1 presente 44,7 kb en la dirección 5' del sitio de iniciación del gen;
    (ii)
    la SEC ID Nº 2 contiene 1-400 nucleótidos contiguos que contienen los dinucleótidos GT en el locus M2;
    (iii) la SEC ID Nº 3 tiene 1-159 nucleótidos contiguos que contienen un polimorfismo de repetición de CA en el nucleótido 229 del locus M3;
    (iv)
    la SEC ID Nº 4 tiene 1-1036 nucleótidos contiguos que contienen un polimorfismo A/T en el nucleótido 75 del locus S1, un polimorfismo C/T en el nucleótido 388 del locus S2 y un polimorfismo C/T en el nucleótido 861 del locus S3;
    (v)
    la SEC ID Nº 5 tiene 1-961 nucleótidos contiguos que contienen un polimorfismo G/A en el nucleótido 147 del locus S4;
    (vi)
    la SEC ID Nº 6 tiene 1-1707 nucleótidos contiguos que contienen un polimorfismo C/T en el nucleótido 1221 del locus S5;
    (vii) la SEC ID Nº 24 tiene 1-817 nucleótidos contiguos que contienen variantes de corte y empalme.
  12. 13.
    Un kit de diagnóstico que comprende marcadores farmacogenéticos que tienen los nucleótidos de SEC ID Nº 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 24 junto con un manual de instrucciones para detectar y predecir la predisposición a asma en un sujeto.
  13. 14.
    Uso in vitro de un kit de diagnóstico según la reivindicación 13 para predecir y detectar seres humanos susceptibles a asma.
    FIGURA 1A.
    Fig. 1. Diagrama esquemático del gen de INPP4A con las variantes conocidas (A) y los loci estudiados (B).
    Fig. 2 Visión general gráfica del desequilibrio de enlace para los ocho loci estudiados usando GOLD (la distancia entre marcadores entre M1 y M2 se ha reducido 50 kb en el mapa para una clara visión general gráfica).
    Fig. 3: Distribución alélica de los alelos de D2S311 en pacientes y el grupo de control (Np = 192, Nc = 272)
    Fig. 4: Distribución alélica y genotípica de +92031 A/T (S1) en el estudio de casos y controles
    Fig. 5: Distribución alélica y genotípica del polimorfismo de repeticiones de CA/CT en el intrón 11 en el estudio de casos y controles.
    Fig. 6: Distribución de haplotipos en pacientes y controles (Np = 192, Nc = 272)
    ARNm de 3
    (Puntuación de PESTfind: +7,49)
    (Puntuación de PESTfind: +4,95)
    Figura 7: A. Las puntuaciones comparativas de la posible secuencia PEST (www.at.cmbnt.org/embnet/tools/bio/pestfind/) antes y después de la sustitución de treonina por alanina en el aminoácido 604. B) Análisis de transferencia Western para INPP4A y 1-tubulina en plaquetas aisladas de sangre humana (una imagen representativa de tres experimentos independientes) que tienen genotipos AG (carriles 1, 2 y 3), GG (carriles 4, 5 y 6) y AA (carriles 7, 8 y 9). Los carriles 1, 4 y 7 representan plaquetas sin estimulación, los carriles 2, 5 y 8 representan plaquetas estimuladas con ionomicina 2 !M durante 5 minutos, los carriles 3, 6 y 9 estimuladas con ionomicina 2 !M durante 10 minutos. C) Intensidad relativa de proteína de INPP4A con respecto a 1-tubulina en plaquetas sin estimular y estimuladas por barrido por densitometría de puntos de datos de transferencia Western.
    Figura 8: Imagen de gel de variantes de corte y empalme en individuo asmático atópico que muestra la variante de corte y empalme novedosa de 598 pb. Carril M: marcador en escalera de 100 pb, carril N: normal, carril P: asmático atópico.
    Figura 9: Inmunohistoquímica de INPP4A en secciones de tejido de pulmón de ratón (20x) de (a) ratones sensibilizados con referencia y expuestos a solución salina, (b) ratones sensibilizados con OVA y expuestos a OVA y (c) ratones sensibilizados con OVA y expuestos a OVA tratados con dexametasona a partir del día uno de la exposición. Las flechas negras indican células inflamatorias infiltrantes en la región broncovascular (bronquio B).
    * Imagen representativa del experimento hecho en ratones BALB/c hembra. La sensibilización con OVA y el experimento de tratamiento con solución salina se hizo en 3 experimentos independientes que tenían al menos 3 ratones en cada grupo (dos veces con ratones BALB/c macho y una vez con ratones BALB/c hembra). El experimento de tratamiento con esteroide se hizo una vez con ratones BALB/c hembra.
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