CN111778329B - 与哮喘相关基因的分子标记及其检测引物组和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明适用于生物技术及医药学领域，提供了一种与哮喘相关基因的分子标记及其检测引物组和应用，该分子标记的检测引物组包括10个哮喘易感基因、4个哮喘药物关联基因等的14个SNP位点的上下游引物对和单碱基延伸引物。该分子标记的检测引物不仅涵盖哮喘遗传风险关联基因的评估检测，其可通过建立的哮喘遗传风险综合评估模型，实现个体哮喘遗传风险水平的全面评估；同时还覆盖常见哮喘临床治疗药物的关联基因的评估检测，其可根据药物相关基因多态性与药物疗效的关联性分析，提供常见哮喘药物的临床用药指导信息，辅助指导临床医生对哮喘患者的科学合理化用药。
Description
技术领域
本发明属于生物技术及医药学领域，尤其涉及一种与哮喘相关基因的分子标记及其检测引物组和应用。
背景技术
支气管哮喘(Bronchial asthma)简称哮喘，是一种以慢性气道炎症为特征的异质性疾病，典型症状有喘息、气促、胸闷、咳嗽等，同时伴有可逆性呼气气流受限。据全球哮喘防治创议委员会(GINA)估计，全球哮喘患病人数约3.58亿，据WHO预测，至2025年哮喘患者将增至4亿人，已成为严重威胁公众健康的一种主要的慢性疾病。不同国家哮喘的发病率在1％～18％之间，中国哮喘患者达3000万左右，其中儿童是哮喘患病的多发人群，患病人数达1000万。据2013年公布的第三次中国城市儿童哮喘调查结果显示，我国主要城市城区0～14岁儿童哮喘的总患病率为3.02％，与2000年的调查数据相比，我国儿童哮喘的累计患病率增加了52.8％。
近年来的世界哮喘日主题都在强调“哮喘是可以控制的”，哮喘治疗最重要的一点就是早发现、早治疗，哮喘对于肺功能损害是在学龄前就开始的，早期的干预有利于疾病的控制。但是哮喘的临床控制情况并不理想，欧洲成人哮喘中未控制率达45％；而亚洲儿童哮喘未控制率更高，达53.4％。在我国，大于14岁哮喘患者中的控制率仅28.5％，儿童哮喘控制率不足10％。此外，尽管经过规范诊治，仍有3～4％的儿童期哮喘可持续至成人，30～50％的儿童哮喘在成人期复发。因此，早期预防对哮喘的控制及治疗至关重要。
哮喘病因复杂，属于一种多基因遗传性疾病，受到遗传和环境双重因素的影响，呈现家族聚集倾向，具有很高的遗传率。大型哮喘相关的GWAS研究及荟萃分析先后报道了一些哮喘遗传风险关联基因，如IL13、IL4、FCER1B、ADRB2、CTLA-4、TGF-β1等，这些基因多态性与哮喘易感性存在显著相关性。IL13基因编码的免疫调节细胞因子在致敏原引起的哮喘发病机制中起关键作用，在中国汉族人群及多项Meta分析研究中该IL13基因多态性位点与哮喘风险关联性强，是最常见的哮喘遗传风险关联位点之一。IL-4基因编码的蛋白质是由激活的T细胞产生的一种多效性细胞因子，这种细胞因子是白细胞介素4受体的配体，主要参与IgE的合成、Th2细胞因子分化的激活T细胞，巨噬细胞以及嗜碱性粒细胞的生成。该基因多态性位点与哮喘风险关联性较强。ADRB2基因是近年来国际上研究哮喘易感性及疾病调节基因的重要候选基因之一，其多态性不仅能引起ADRB2表型功能的改变，而且在一定程度上影响到哮喘的发生、严重程度及对治疗的反应。FcER1B基因又称MS4A2基因，编码高亲和力IgE受体的β亚基，参与IgE介导的I型超敏反应。Hua L等科学家利用多因素降维分析研究发现了儿童哮喘遗传风险关联的四个主效基因(IL13、IL4、FCER1B、ADRB2)，主效基因组成的四基因模型与哮喘预测指数(Asthma Predictive Index，API)和特异性反应密切相关。携带四个主效基因多态性位点纯合突变型的个体哮喘风险比野生型个体高出13.55倍，少于四个纯合突变型的个体患哮喘的风险比野生型高10倍左右。
药物基因组学是研究遗传因素对药物作用的影响和不同基因型个体对药物反应的差异，从而对临床合理用药和根据不同基因型群体对药物的反应来改进新药设计提供理论依据。研究发现哮喘的治疗效果和不良反应在个体间存在很大差异，这种差异大多(50％～60％)是由遗传差异所造成的不同个体对药物的活化、代谢、清除方面的差异所决定的，基因多态性会影响哮喘发作的严重程度以及患者对治疗药物的反应性，哮喘药物基因组学领域内的研究主要关注β2受体激动剂、白三烯调节剂和糖皮质激素三类常用的药物。
在哮喘药物的基因组学研究中，ADRB2基因是目前受到广泛关注的候选基因，ADRB2基因多态性研究也是最深入的。β2受体激动剂是最常用的一类抗哮喘的药，ADRB2基因第16位点的精氨-甘氨酸替换(Arg16Gly，A/G)的非同义突变，此突变在人群中的发生频率较高，占整个哮喘人群近六分之一，在非洲裔美国人中几乎达四分之一，而在中国哮喘人群中高达三分之一。研究表明对于长期使用β2受体激动剂(如沙丁胺醇)治疗哮喘的患者来说，ADRB2基因第16位点基因型的不同，会导致个体对药物反应性存在差异，ADRB2基因第16位纯合突变型的哮喘患者应尽可能的避免使用沙丁胺醇。白三烯(leukotriene，LTs)是花生四烯酸通过脂氧代谢途径形成的产物，是哮喘发作的重要炎症介质，它不仅能收缩气道平滑肌，还能参与气道炎症与重塑的发生过程。调查显示白三烯调节剂的临床表型在个体间有很大的差异，并且有相当一部分患者治疗后没有效果。ALOX5基因编码脂氧合酶基因家族的一个成员，并在花生四烯酸合成白三烯中发挥双重作用。一项回顾性分析，发现ALOX5基因启动子区的重复多态性和基因表达的降低有关，ALOX5基因在启动子区的变异使ALOX5表达下调，并使LTs合成量减少，从而使LTs调节剂对这部分患者无明显疗效，ALOX5和LTC4S基因多态性可以预测白三烯调节剂的反应性。另外，有研究表明促肾上腺皮质激素释放激素受体1(CRHR1)的变异型能够增强哮喘患者皮质激素治疗效果，该基因多态性一定程度上能够预测糖皮质激素的治疗效果。
哮喘遗传风险及哮喘药物疗效与基因的单核苷酸多态性密切有关，这一点已被科学界广泛证实。相关研究多集中于哮喘易感基因检测模型及相关试剂盒的开发，哮喘药物关联基因的研究较缺乏。针对儿童哮喘易感基因检测模型检测位点有限，哮喘遗传风险评估效能有待进一步提升，同时哮喘药物关联基因的检测模型及试剂盒多针对单种药物(如白三烯、糖皮质激素等)，覆盖哮喘常见药物的相关试剂盒较缺乏。常见的哮喘基因变异的主要检测方法是PCR-限制性片段长度多态性法RFLP，这种方法存在耗时长、操作繁琐、准确度不高等缺点；也有部分学者利用实时荧光定量PCR结合DNA测序方法进行基因多态性位点的检测，但是这种方法在大规模人群筛查或检测多个基因多个位点时成本较高、应用受到一定限制。因此有必要建立一种能够全面评估个体哮喘遗传风险及哮喘药物用药信息的高通量、高效能、低成本的检测方法和评估模型，以实现临床快速检测或规模化人群筛查。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种与哮喘相关基因的分子标记，旨在解决背景技术中提出的问题。
本发明实施例是这样实现的，一种与哮喘相关基因的分子标记，其中，所述与哮喘相关基因包括哮喘易感基因和哮喘药物关联基因；所述哮喘易感基因包括CTLA-4、TGF-β1、CDHR3、TNF-α、ADAM33、IL-13、IL-4、FcER1B、IL-4Rα和ADRB2；所述哮喘药物关联基因包括ADRB2、CRHR1、CRHR2和ALOX5；所述分子标记包括哮喘易感基因的SNP位点和哮喘药物关联基因的SNP位点；所述哮喘易感基因的SNP位点包括rs231775、rs1800469、rs6967330、rs1800629、rs678881、rs20541、rs2243250、rs569108、rs1805010、rs1800925和rs1042713；所述哮喘药物关联基因的SNP位点包括rs1042713、rs1876828、rs7793837和rs2115819。
作为本发明实施例的一个优选方案，所述哮喘药物关联基因中的哮喘药物包括β受体激动剂、白三烯调节剂和糖皮质激素类。
本发明实施例的另一目的在于提供一种上述与哮喘相关基因的分子标记在制备用于评估哮喘遗传风险和检测哮喘药物关联基因的试剂盒中的应用。
本发明实施例的另一目的在于提供一种上述的分子标记的检测引物组，其包括：
rs231775上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示；
rs231775下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示；
rs1800469上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示；
rs1800469下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:4所示；
rs6967330上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:5所示；
rs6967330下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:6所示；
rs1800629上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:7所示；
rs1800629下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:8所示；
rs678881上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:9所示；
rs678881下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:10所示；
rs20541上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:11所示；
rs20541下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:12所示；
rs2243250上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:13所示；
rs2243250下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:14所示；
rs1042713上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:15所示；
rs1042713下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:16所示；
rs569108上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:17所示；
rs569108下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:18所示；
rs1805010上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:19所示；
rs1805010下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:20所示；
rs1800925上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:21所示；
rs1800925下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:22所示；
rs1876828上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:23所示；
rs1876828下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:24所示；
rs7793837上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:25所示；
rs7793837下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:26所示；
rs2115819上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:27所示；
rs2115819下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:28所示。
作为本发明实施例的一个优选方案，所述引物组还包括：
rs231775单碱基延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:29所示；
rs1800469单碱基延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:30所示；
rs6967330单碱基延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:31所示；
rs1800629单碱基延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:32所示；
rs678881单碱基延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:33所示；
rs20541单碱基延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:34所示；
rs2243250单碱基延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:35所示；
rs1042713单碱基延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:36所示；
rs569108单碱基延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:37所示；
rs1805010单碱基延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:38所示；
rs1800925单碱基延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:39所示；
rs1876828单碱基延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:40所示；
rs7793837单碱基延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:41所示；
rs2115819单碱基延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:42所示。
本发明实施例的另一目的在于提供一种上述的检测引物组在制备用于评估哮喘遗传风险和检测哮喘药物关联基因的试剂盒中的应用。
作为本发明实施例的一个优选方案，所述试剂盒包括PCR反应液、延伸反应液以及所述检测引物组。
本发明实施例提供的一种与哮喘相关基因的分子标记及其检测引物，克服了现有技术的不足，开发一种检测效能高、检测通量大、检测成本低的技术方法，以解决哮喘遗传风险水平及哮喘用药关联基因的规模化人群普筛检测。另外，该分子标记的检测引物可应用于针对中国儿童哮喘遗传风险及哮喘药物关联基因的检测评估模型，该检测评估模型不仅涵盖哮喘遗传风险关联基因，通过建立的哮喘遗传风险综合评估模型，实现个体哮喘遗传风险水平的全面评估；同时覆盖常见哮喘临床治疗药物(β2受体激动剂、白三烯调节剂、糖皮质激素)的关联基因，根据药物相关基因多态性与药物疗效的关联性分析，提供常见哮喘药物的临床用药指导信息，辅助指导临床医生对哮喘患者的科学合理化用药。相比于现有技术，本发明具有以下优点：
(1)本发明的哮喘遗传风险及哮喘药物关联基因检测评估模型是国内首个同时涵盖哮喘遗传风险及哮喘药物关联基因的检测评估模型。该评估模型包含的哮喘遗传风险基因类别最丰富、哮喘药物种类覆盖最全面(β2受体激动剂、糖皮质激素类、白三烯调节剂)、检测基因多态性位点数量最多、检测效能较高、文献来源最新且专门针对亚洲人群(尤其中国人群)。
(2)本发明的哮喘遗传风险及哮喘药物关联基因检测评估模型通过SNP位点的全面Meta分析后构建了配套的哮喘遗传风险评估体系，能够从遗传学层面深度揭秘个体哮喘的易感性，实现了单次检测评估个体哮喘遗传风险水平的同时提供个体哮喘药物用药疗效信息，辅助指导临床医生对哮喘患者的科学合理化用药。
(3)本发明的哮喘遗传风险及哮喘药物关联基因检测评估模型通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱法，利用多重PCR扩增技术进行样本核酸质谱检测，实现单反应孔一次性检测14个SNP位点，检测通量高、效率高、准确度高、且成本较低，适合规模化人群筛查。
附图说明
图1为ADRB2基因rs1042713位点复孔1基因型核酸质谱峰图；
图2为ADRB2基因rs1042713位点复孔2基因型核酸质谱峰图；
图3为ADRB2基因rs1042713位点复孔3基因型核酸质谱峰图；
图4为CTLA-4基因rs231775位点复孔1基因型核酸质谱峰图；
图5为CTLA-4基因rs231775位点复孔2基因型核酸质谱峰图；
图6为CTLA-4基因rs231775位点复孔3基因型核酸质谱峰图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
该实施例提供了一种哮喘遗传风险及哮喘药物关联基因的检测评估模型，其涵盖亚洲人群(尤其中国人群)哮喘基因多态性位点，包括人基因组DNA的10个哮喘易感基因的11个SNP位点和4个哮喘药物关联基因的4个SNP位点的多重PCR扩增上下游引物对和单碱基延伸引物。
其中，哮喘易感基因包括CTLA-4、TGF-β1、CDHR3、TNF-α、ADAM33、IL-13、IL-4、FcER1B、IL-4Rα和ADRB2；哮喘药物关联基因包括ADRB2、CRHR1、CRHR2和ALOX5，其涵盖的哮喘药物包括控制型药物和缓解型药物，分为三类：β受体激动剂、白三烯调节剂、糖皮质激素类；另外，该评估模型所涉及的分子标记包括哮喘易感基因的SNP位点和哮喘药物关联基因的SNP位点；哮喘易感基因的SNP位点包括rs231775、rs1800469、rs6967330、rs1800629、rs678881、rs20541、rs2243250、rs569108、rs1805010、rs1800925和rs1042713；哮喘药物关联基因的SNP位点包括rs1042713、rs1876828、rs7793837和rs2115819。上述检测评估模型建立过程如下：
(1)选取Asthma、GWAS、Chinese、Meta analysis等关键词在NCBI数据库网站检索哮喘相关研究成果，汇总哮喘遗传风险基因、哮喘药物关联基因，筛选确定哮喘遗传风险及哮喘药物关联候选基因及多态性位点，形成检测PANEL模型。
(2)针对建立的哮喘遗传风险及哮喘药物关联基因检测PANEL模型涉及的所有SNP位点，进行多重PCR扩增引物对和单碱基延伸引物序列的设计。
(3)通过预实验数据库的积累及文献资料信息的检索汇总，整合每个基因多态性位点数据信息，利用数理统计学方法将所有SNP位点进行Meta分析，确定检测PANEL模型中每个SNP位点对哮喘遗传风险的贡献水平(OR值)，建立哮喘遗传风险评估体系。
(4)参考药物基因组学Pharm GKB数据库及相关文献资料，分析哮喘药物关联基因多态性与药物疗效的关联性，制作检测评估模型哮喘药物解读资料库，提供哮喘常见药物(β2受体激动剂、糖皮质激素类、白三烯调节剂)的临床用药疗效信息。
(5)以人基因组DNA为样本(口腔黏膜、外周血、组织)，利用多重PCR技术扩增技术，采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱法进行样本的SNP基因分型，从遗传学角度，评估个体哮喘遗传风险，为临床哮喘患者的个体化用药提供科学依据。
具体的，上述的哮喘遗传风险及哮喘药物关联基因检测评估模型的哮喘遗传风险评估体系的建立是通过数据库及文献资料信息的检索及汇总，利用数理统计学方法将所有SNP位点进行Meta分析，确定每个SNP位点对哮喘遗传风险的贡献水平(OR值)，形成哮喘风险权重公式算法，全面评估个体哮喘遗传风险水平。哮喘遗传风险评估体系的哮喘风险权重公式＝S1*1.33+S2*1.41+S3*1.32+S4*1.425+S5*2.03/2.87+S6*1.24+S7*1.25+S8*1.27+S9*3.73+S10*1.28+S11*1.18+S0*10.1/13.55。其中，S1～S11分别代表rs231775、rs1800469、rs6967330、rs1800629、rs678881、rs20541、rs2243250、rs569108、rs1805010、rs1800925和rs1042713位点；S1*1.33代表S1位点的风险基因型增加哮喘遗传风险约1.33倍；S5*2.03/2.87代表S5位点的杂合风险基因型增加哮喘遗传风险约2.03倍，纯合风险基因型增加约2.87倍；S0*10.1/13.55代表S6、S7、S8、S11位点少于4个纯合风险基因型增加哮喘遗传风险约10.1倍，4个纯合风险基因型增加哮喘遗传风险约13.55倍。
其中，上述的分子标记的检测引物组包括以下多重PCR扩增引物对：rs231775上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示；rs231775下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示；rs1800469上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示；rs1800469下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:4所示；rs6967330上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:5所示；rs6967330下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNO:6所示；rs1800629上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:7所示；rs1800629下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:8所示；rs678881上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:9所示；rs678881下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:10所示；rs20541上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:11所示；rs20541下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:12所示；rs2243250上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:13所示；rs2243250下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:14所示；rs1042713上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:15所示；rs1042713下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:16所示；rs569108上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:17所示；rs569108下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:18所示；rs1805010上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:19所示；rs1805010下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNO:20所示；rs1800925上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:21所示；rs1800925下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:22所示；rs1876828上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:23所示；rs1876828下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:24所示；rs7793837上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:25所示；rs7793837下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:26所示；rs2115819上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:27所示；rs2115819下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:28所示。具体如表1所示。
表1各位点PCR扩增上下游引物对序列
另外，上述的分子标记的检测引物还包括以下单碱基延伸引物：rs231775单碱基延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:29所示；rs1800469单碱基延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:30所示；rs6967330单碱基延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:31所示；rs1800629单碱基延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:32所示；rs678881单碱基延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:33所示；rs20541单碱基延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:34所示；rs2243250单碱基延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:35所示；rs1042713单碱基延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:36所示；rs569108单碱基延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:37所示；rs1805010单碱基延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:38所示；rs1800925单碱基延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:39所示；rs1876828单碱基延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:40所示；rs7793837单碱基延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:41所示；rs2115819单碱基延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:42所示。具体如表2所示。
表2各位点单碱基延伸引物序列
实施例2
一、为验证本发明的哮喘遗传风险和哮喘药物关联基因检测评估模型中扩增引物及延伸引物的有效性及检测结果与样本实际符合度，选取2个具哮喘症状的儿童口腔黏膜样本，分别编号为RY-ETAS-01和RY-ETAS-02，每个样本设置3个复孔，在核酸质谱平台上进行SNP分型，过程如下：
S1、口腔黏膜DNA提取：利用杭州博日口腔拭子基因组DNA提取试剂盒进行口腔黏膜脱落细胞DNA提取。在WB1和WB试剂中加入一定量的无水乙醇。从采样管中取出采样棉签转置于2mL离心管中，用剪刀将棉签部分从其杆上剪下；加入600uL Lysis Buffer和10uLPK Solution，震荡混匀15秒；56℃温育15分钟；在上述离心管加入300μL无水乙醇，充分震荡混匀，离心；将上述步骤液体转移至Spin column中，10000×g离心1min，弃去外套管内废液；将500μL WB1 Buffer加入Spin column上，10000×g离心1min，弃去外套管内废液；将500μL Wash Buffer加入Spin column上，10000×g离心1min，弃去外套管内废液；重复上述步骤一次；将Spin column放回接液管，10000×g离心2min；将Spin column转移至一只干净的1.5mL离心管中。向离心柱内加入30μL Elution Buffer，于室温静置2min，10000×g离心1min，并弃Spin column，离心管内液体中含有基因组DNA。
S2、PCR扩增：配制PCR Mix(ddH2O 15.8μL，10×PCR Buffer 4.4μL，MgCl2 3.5μL，dNTP 0.9μL，PCR酶1.8μL)，震荡混匀后按照多重PCR扩增的反应体系(5μL)：PCR Mix 3μL，扩增上下游引物Mix 1μL，模板DNA(20ng/μL)1μL依次添加至384孔板，封板膜封紧，防止样品蒸发，震荡混匀离心；将384孔板置于ABI 384Well Thermal Cycler进行扩增反应，反应条件：95℃预变性2min，(95℃30s，56℃30s，72℃1min)45个循环，72℃5min，4℃保持；得到PCR扩增产物，离心，备用。
S3、SAP消化：取出S2步骤中PCR扩增产物，离心后去封板膜，置于4℃冰板备用；配制SAP Mix(ddH2O 13.7μL，SAP Buffer 1.5μL，SAP酶2.7μL)，震荡混匀后添加至384孔板的每个反应孔2μL，使用封板膜封紧，防止样品蒸发，震荡混匀，离心；将密封的384孔板置于ABI 384Well Thermal Cycler上进行SAP消化反应，反应条件：37℃40min，85℃5min，4℃保持；得到SAP消化产物，离心备用。
S4、单碱基延伸反应：配制iPLEX Mix(ddH2O 5.9μL，iPLEX Buffer 1.9μL，Termination Mix 1.9μL，iPLEX酶0.4μL)，震荡混匀后添加至384孔板的每个反应孔1.06μL，然后在每个反应孔中分别加入对应的单碱基延伸引物Mix 0.94μL，使用封板膜封紧，防止样品蒸发，震荡混匀，离心；将密封的384孔板置于ABI 384Well Thermal Cycler上进行延伸反应，反应条件：94℃预变性30s，94℃变性5s，(52℃5s，80℃5s)5个重复；72℃3min，4℃保持；得到延伸产物，离心备用。
S5、树脂纯化：将步骤S4中得到的单碱基延伸产物的384孔板，轻轻撕下封板膜后，每孔加入16μL ddH2O，震荡混匀，离心置于4℃冰板上备用；取干净的A4纸将6MG 384板置于其上，用小勺取适量纯化树脂，用塑料板反复左右推平纯化树脂，压实，使每孔树脂含量均匀；将384板倒置压在6MG 384板上，两板对调，6MG板在上，敲打6MG板背面，使树脂落入装有单碱基延伸产物的384孔板中；封板膜封好后，Rotational Mixer WH-986上下颠倒混匀15min，充分纯化。
S6、芯片点样：将步骤S5中的384孔板置于高速冷冻离心机ST16R中，3000rpm离心5min，去封板膜备用；启动MassARRAY Nanodispenser RS1000点样仪，将树脂纯化后的延伸产物移至384孔SpectroCHIP芯片上；点样后的芯片使用MALDI-TOF分析，使用TYPER4.0软件分型并输出检测结果。
二、上述检测结果分析如下：
利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱法进行SNP基因分型，经TYPER4.0软件分型并输出检测结果，如表3和表4所示。表3和表4分别为实施例RY-ETAS-01和RY-ETAS-02的SNP位点基因检测结果，由表3和表4可以看出，上述实施例1提供的14个位点的基因型均能准确检出，检出率均为100％；所有位点3个复孔基因型进行比对后，符合率达到100％，随机选取实施例RY-ETAS-01样本2个位点的3个复孔质谱图谱在附图中进行展示说明，详见附图1～6。
表3样本RY-ETAS-01的SNP位点基因检测结果
| SNP位点 | 检测结果 | SNP位点 | 检测结果 |
| rs231775 | AG | rs1042713 | G |
| rs1800469 | A | rs569108 | AT |
| rs6967330 | G | rs1805010 | G |
| rs1800629 | AG | rs1800925 | G |
| rs678881 | CG | rs1876828 | AT |
| rs20541 | A | rs7793837 | G |
| rs2243250 | CT | rs2115819 | G |
表4样本RY-ETAS-02的SNP位点基因检测结果
| SNP位点 | 检测结果 | SNP位点 | 检测结果 |
| rs231775 | G | rs1042713 | A |
| rs1800469 | A | rs569108 | AT |
| rs6967330 | G | rs1805010 | G |
| rs1800629 | G | rs1800925 | G |
| rs678881 | CG | rs1876828 | T |
| rs20541 | G | rs7793837 | G |
| rs2243250 | CT | rs2115819 | G |
三、上述检测结果解读：
通过哮喘遗传风险及哮喘药物关联基因检测PANEL模型对受检者进行SNP基因分型后，利用建立的哮喘遗传风险评估体系对受检者的哮喘遗传风险水平进行综合评估，如表5所示；同时根据药物基因组学参照PharmGKB数据库基因多态性与药物关联性研究，对受检者的各类哮喘常见药物疗效进行解读，如表6所示。上述解读均以实施例样本RY-ETAS-01的基因检测结果为例。
表5样本RY-ETAS-01哮喘遗传风险基因解读
其中，表5中检测结果一栏中，“+”风险基因型(突变)，“-”野生基因型(未突变)；哮喘遗传风险基因评估体系是针对每种基因多态性位点进行Meta分析后，确定每个SNP位点对哮喘易感性的贡献率(OR值)，再经过数理统计学模型构建而来(如实施例1中所提及的哮喘风险权重公式，S1～S11位点分别代表rs231775、rs1800469、rs6967330、rs1800629、rs678881、rs20541、rs2243250、rs569108、rs1805010、rs1800925和rs1042713位点)，可实现受检者哮喘遗传风险水平(0～60％低风险水平、60～90％中风险水平、90～100％高风险水平)的综合评估。
表6样本RY-ETAS-01哮喘药物关联基因解读
表6为哮喘药物关联基因检测结果解读：哮喘药物关联基因检测结果解读：用药提示主要参照药物基因组PharmGKB数据库，针对每种基因型结果进行药效的解读，并提供用药指导。其中，S11～S14位点分别代表rs1042713、rs7793837、rs1876828和rs2115819位点。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 陕西九州医学检验有限公司
<120> 与哮喘相关基因的分子标记及其检测引物组和应用
<160> 42
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acgttggatg ttggatttca gcggcacaag 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acgttggatg aaaaacagga gagtgcaggg 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acgttggatg aagagggtct gtcaacatgg 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acgttggatg tacaggtgtc tgcctcctga 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acgttggatg gagaactcca gctggtaact 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
acgttggatg atgagtttat gacctcttgg 30
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acgttggatg atgagtttat gacctcttgg 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
acgttggatg tgatgctttc gaagtttcag 30
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acgttggatg tgatacgacc tgtccttctc 30
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
acgttggatg taacaggcag actctcctac 30
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<400> 15
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<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
acgttggatg ttacagtgag ttggaagacc 30
<210> 18
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
acgttggatg ctacaggtga ccagcctaac 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acgttggatg agccatgtcg ccttttcctg 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
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<210> 24
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
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<210> 25
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
acgttggatg ttctcacagg tatgtacatc 30
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
acgttggatg tccactgctt ggggaaatgc 30
<210> 27
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
acgttggatg ataacttttg ggtttcctcc 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
acgttggatg tttgtgtaac actgggatgg 30
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
gcacaacgcc tcagctgaac ctggct 26
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
tcctgaccct tccatcc 17
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
cagctggtaa ctaaagtgga ct 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
aataggtttt gaggggcatg 20
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
ggggcttcca gcatcctggt ct 22
<210> 34
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
atgctttcga agtttcagtt gaac 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
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<212> DNA
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tcttgctggc acccaat 17
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtgagttgga agacccaggg g 21
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cctccgttgt tctcaggga 19
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggaggacttc taggaaaa 18
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cccctaggga cctgga 16
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ggttttgaac tctgcgttag 20
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
gtttcctcct ttgcttaaga a 21
Claims (3)
1.一种与哮喘相关基因的分子标记的检测引物组，其特征在于，所述与哮喘相关基因包括哮喘易感基因和哮喘药物关联基因；所述哮喘易感基因包括CTLA-4、TGF-β1、CDHR3、TNF-α、ADAM33、IL-13、IL-4、FcER1B、IL-4Rα和ADRB2；所述哮喘药物关联基因包括ADRB2、CRHR1、CRHR2和ALOX5；所述分子标记包括哮喘易感基因的SNP位点和哮喘药物关联基因的SNP位点；所述哮喘易感基因的SNP位点包括rs231775、rs1800469、rs6967330、rs1800629、rs678881、rs20541、rs2243250、rs569108、rs1805010、rs1800925和rs1042713；所述哮喘药物关联基因的SNP位点包括rs1042713、rs1876828、rs7793837和rs2115819；
所述哮喘药物关联基因中的哮喘药物包括β受体激动剂、白三烯调节剂和糖皮质激素类；
所述检测引物组包括：
rs231775上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示；
rs231775下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示；
rs1800469上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示；
rs1800469下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:4所示；
rs6967330上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:5所示；
rs6967330下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:6所示；
rs1800629上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:7所示；
rs1800629下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:8所示；
rs678881上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:9所示；
rs678881下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:10所示；
rs20541上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:11所示；
rs20541下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:12所示；
rs2243250上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:13所示；
rs2243250下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:14所示；
rs1042713上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:15所示；
rs1042713下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:16所示；
rs569108上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:17所示；
rs569108下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:18所示；
rs1805010上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:19所示；
rs1805010下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:20所示；
rs1800925上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:21所示；
rs1800925下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:22所示；
rs1876828上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:23所示；
rs1876828下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:24所示；
rs7793837上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:25所示；
rs7793837下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:26所示；
rs2115819上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:27所示；
rs2115819下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:28所示；
rs231775单碱基延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:29所示；
rs1800469单碱基延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:30所示；
rs6967330单碱基延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:31所示；
rs1800629单碱基延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:32所示；
rs678881单碱基延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:33所示；
rs20541单碱基延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:34所示；
rs2243250单碱基延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:35所示；
rs1042713单碱基延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:36所示；
rs569108单碱基延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:37所示；
rs1805010单碱基延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:38所示；
rs1800925单碱基延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:39所示；
rs1876828单碱基延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:40所示；
rs7793837单碱基延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:41所示；
rs2115819单碱基延伸引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:42所示。
2.一种如权利要求1所述的检测引物组在制备用于评估哮喘遗传风险和检测哮喘药物关联基因的试剂盒中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括PCR反应液、延伸反应液以及所述检测引物组。
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