CN104531689A

CN104531689A - 与哮喘相关的基因单核苷酸多态性位点、预测哮喘的试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN104531689A
Application number: CN201410768388.XA
Authority: CN
Inventors: 鲍一笑; 华丽
Original assignee: XinHua Hospital Affiliated To Shanghai JiaoTong University School of Medicine
Current assignee: XinHua Hospital Affiliated To Shanghai JiaoTong University School of Medicine
Priority date: 2014-12-12
Filing date: 2014-12-12
Publication date: 2015-04-22

Abstract

本发明涉及与哮喘相关的基因单核苷酸多态性位点、预测哮喘的试剂盒及其应用。本发明通过对9个单核苷酸多态性位点进行基因分型，对这些多态性位点进行单点、高阶交互作用以及多位点协同作用分析，结果证明：IL13 R110Q G、IL4-590C>T T、ADRB2 R16G A和FcER1B E237G G与中国汉族儿童哮喘发病相关，分别是风险等位基因，携带四个风险等位基因纯合子者患哮喘的危险度大大提高；IL13 R110Q、IL4-590C>T、ADRB2 R16G和FcER1 E237G在哮喘发病风险上有显著的协同作用，检测该四位点的试剂可用于中国汉族儿童哮喘预测。

Description

与哮喘相关的基因单核苷酸多态性位点、预测哮喘的试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学和疾病诊断技术领域，具体地说，涉及与哮喘相关的基因单核苷酸多态性位点、预测哮喘的试剂盒及其应用。

背景技术

儿童哮喘是一种严重影响小儿身心健康的最常见的呼吸道疾病，近年来儿童哮喘的患病率及死亡率均有上升趋势，1990年全国0-14岁儿童哮喘患病率调查结果为0.91％，2000年已上升至1.5％，这个数字意味着我国存在1000多万哮喘病患儿。现有研究证实哮喘是一种慢性气道炎症性疾病，由于这种慢性炎症反应的持续存在，导致气道呈高反应状态，当接触诱因时即会反复出现症状。临床治疗以抗炎和解除平滑肌痉挛的联合治疗为主。

在2000年的亚太地区哮喘现状研究——AIRAP(Asthma Insights andReality In Asia Pacific)中，从中国区的调查报告显示，我国哮喘控制状况与GINA方案中提到的哮喘长期管理目标相去甚远。在儿童哮喘的诊断方面，基层医疗单位漏诊、误诊，因此反复滥用抗生素来治疗儿童哮喘的现状较为普遍。因此儿科医务工作者应不断提高儿童哮喘的诊治水平。

哮喘是一种复杂的多因子、多基因遗传病。中国期刊《第六届江浙沪儿科学术会议暨儿科学基础与临床研究进展学术班论文汇编》2009年，刊出的论文《RANTES基因与Eotaxin-3基因单核苷酸多态性位点与汉族儿童哮喘关系研究》，研究了RANTES基因C-28G、RANTES基因A403G单核苷酸多态性(SNP)以及嗜酸性粒细胞趋化蛋白(eotaxin-3)基因C+77T SNP对汉族儿童哮喘的影响，结果表明RANTES C-28G和RANTES A-403G两个SNP位点与中国汉族儿童哮喘发生无关，Eotaxin-3 C+77T是汉族儿童哮喘易感SNP位点，其中Eotaxin-3 C+77T T/T纯合子基因型与哮喘发病明显相关。中国期刊《上海交通大学》2009年刊出的论文《汉族儿童哮喘易感基因预测模型的初步建立》，应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性方法，对8个基因(IL13、IL4、IL4RA、ADRB2、FcER1、TGFB1、NOS1和RANTES基因)的15个单核苷酸多态性位点(IL13 C-1112T、C1923T、A2044G，IL4 C-590T，IL4RA I75V、Q551R，ADRB2 R16G、Q27E，FcER1 C-109T、E237G，TGFB1 C-509T、R25P，NOS1C5266T，RANTES A-403G、G-28C)进行基因分型，对这些多态性位点进行单点、高阶交互作用以及两两协同作用分析，结果证明：①IL13 A2044G、ADRB2 R16G和FcER1 C-109T三位点在两组间的基因型和等位基因频率分布差异具有统计学意义(P值均＜0.05)，病例组A2044G位点GG基因型和G等位基因频率，R16G位点AA基因型和A等位基因频率，C-109T位点TT基因型和T等位基因频率均高于对照组。其余十二位点在两组间的基因型和等位基因频率分布差异无统计学意义(P值＞0.05)。②MDR分析显示，FcER1 E237G、FcER1 C-109T、ADRB2 R16G、IL4RA Q551R、IL4RA I75V、IL4 C-590T、IL13A2044G、IL13 C1923T和IL13 C-1112T组成最佳模型，其交叉验证一致性为10/10，哮喘预测指标为：准确度92.97％，灵敏度97.92％，特异度88.02％，OR(95％CI)＝345.3478(117.0514，1018.9122)，χ2值＝286.3984，P值＜0.0001。③ADRB2 R16G和FcER1 C-109T，IL13 A2044G和ADRB2 R16G，ADRB2R16G和FcER1 E237G两两之间对哮喘发生具有协同作用。最终得出以下结论：汉族儿童哮喘易感基因预测模型初步建立，由FcER1 E237G、FcER1 C-109T、ADRB2 R16G、IL4RA Q551R、IL4RA I75V、IL4 C-590T、IL13 A2044G、IL13C1923T和IL13 C-1112T九个单核苷酸多态性位点组成，具有良好的哮喘预测效能，但该模型仍需进一步完善。

然而，为更好的诊断儿童哮喘，建立更多的儿童哮喘易感基因预测模型仍然是十分必要的。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种多个基因单核苷酸多态性位点的组合。

本发明的再一的目的是，提供所述的多个基因单核苷酸多态性位点的组合的用途。

本发明的另一的目的是，提供检测单核苷酸多态性位点IL13 R110Q、IL4-590C>T、ADRB2 R16G和FcER1 E237G的试剂组合的用途。

本发明第四个目的是，提供一种评估个体患哮喘风险的试剂盒。

本发明第五个目的是，提供检测单核苷酸多态性位点IL13 R110Q、IL4-590C>T或FcER1 E237G的试剂的用途。

为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：

多个基因单核苷酸多态性位点的组合，所述的多个基因单核苷酸多态性位点包括以下位点：IL13 R110Q、IL4-590C>T、ADRB2 R16G和FcER1 E237G。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

如上所述的多个基因单核苷酸多态性位点的组合在制备用于评估个体患哮喘风险的检测装置中的应用。

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：

检测单核苷酸多态性位点IL13 R110Q、IL4-590C>T、ADRB2 R16G和FcER1 E237G的试剂组合在制备评估个体患哮喘风险的试剂、试剂盒或检测装置中的应用。

所述的检测单核苷酸多态性位点IL13 R110Q、IL4-590C>T、ADRB2 R16G和FcER1 E237G的试剂为：用于直接测序法的试剂；或用于聚合酶链式反应与限制性片段长度多态性分析相结合的试剂；或用于聚合酶链式反应与直接测序法相结合的试剂；或用于以下任一种SNP分型方法的试剂：基于杂交的方法、基于引物延伸的方法、基于构象的方法或高分辨率溶解曲线分析技术。

为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是：

一种评估个体患哮喘风险的试剂盒，所述的试剂盒包含：检测单核苷酸多态性位点IL13 R110Q、IL4-590C>T、ADRB2 R16G和FcER1 E237G的试剂。

所述的试剂盒包含SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.9-SEQ IDNO.12、SEQ ID NO.21-SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25-SEQ ID NO.28所示的核苷酸序列。

为实现上述第五个目的，本发明采取的技术方案是：

检测单核苷酸多态性位点IL13 R110Q、IL4-590C>T或FcER1 E237G的试剂在制备评估个体患哮喘风险的试剂、试剂盒或检测装置中的应用。

所述的检测单核苷酸多态性位点IL13 R110Q、IL4-590C>T或FcER1E237G的试剂为：用于直接测序法的试剂；或用于聚合酶链式反应与限制性片段长度多态性分析相结合的试剂；或用于聚合酶链式反应与直接测序法相结合的试剂；或用于以下任一种SNP分型方法的试剂：基于杂交的方法、基于引物延伸的方法、基于构象的方法或高分辨率溶解曲线分析技术。

需要说明的是，检测本发明的多个单核苷酸多态性位点可用本领域已知的多种技术在DNA水平、RNA水平检测本发明所述的多个单核苷酸多态性位点。例如：

可以采用直接测序的方法，通过DNA直接测序可以直接揭示对照基因和携带突变基因之间的序列差异，具体可以是传统的使用商业测序试剂盒或自动测序仪对DNA直接进行测序，或是近年来发展的焦磷酸测序(Pyrosequencing)、微测序(SNaPshot)等。焦磷酸测序技术适于对已知的短序列的测序分析，其原理是引物与模板DNA退火后，在DNA聚合酶(DNA polymerase)、ATP硫酸化酶(ATP sulfurytase)、荧光素酶(luciferase)和三磷酸腺苷双磷酸酶(Apyrase)4种酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号的释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列的目的。SnaPshot技术平台是Applied Biosystems，ABI公司推出了专为检测SNP设计的分析软件和试剂盒，可对多个SNP位点同时进行基因分型，也被称为minisequencing，该方法针对不同突变位点设计不同长度的引物SNaPshot反应后，产物通过电泳分离、五色荧光检测、Gene mapper分析，可在一次电泳胶内检测多个SNP位点。

也可以采用基于杂交的方法，具体包括Taqman探针法，DNA芯片法等。TaqMan SNP基因分型原理：利用核酸外切酶对5’特异等位基因染色标记的切除产生持续的检验信号，反应体系包括：以基因组DNA或PCR产物为模板；一对PCR引物，以及分别用FAM和VIC标记的2条MGB探针检测SNP的两种类型；在PCR反应终点读取分型数据。DNA芯片技术：待测基因经提取后，被切成长短不一的片段，经荧光化学物质标记后，注射到嵌有芯片的载片上，由于DNA和探针杂交的程度与荧光强度相关，因此通过激光扫描，即可根据荧光强弱测出被检测序列的变异。

还可以采用基于引物延伸的方法，如基质辅助激光解析离子飞行时间质谱(MALDI-Tof-MS)。基质辅助激光解析离子飞行时间质谱检测原理：紧挨SNP位点设计一段探针，在反应体系中以ddNTP替代dNTP，使探针仅在SNP位点处延伸一个碱基即终止，根据SNP位点的不同，探针将结合不同的ddNTP，从而具有不同的分子量，质谱仪即可检测出这种分子量差异，从而实现SNP分型的目的。

还可以采用基于构象的方法，具体例如限制性片段长度多态性(RFLP)分析、单链构象多态性(single-strand conformational polymorphism，SSCP)分析、变性梯度凝胶电泳(denauring gradient gel electrophoresis，DGGE)分析、变性高效液相色谱技术(denaturing high performance liquid chromatography，dHPLC)等分析技术。其中，RFLP的原理：有些SNP多态位点正好处于限制性内切酶的识别位点处，其中一种多态对应的PCR扩增片断能够被相应的内切酶切动，而另一种却不能，因此通过对酶切后的PCR产物电泳后的片断长度分析可知检测样本在该位点处的基因型；如果检测SNP位点不存在合适的酶切位点，往往可以通过在PCR引物3’端改变个别碱基引入限制性内切酶酶切位点，通过这种引物修饰法可以实现绝大多数SNP位点的分型都能用RFLP分析来实现。SSCP：在非变性的条件下，单链DNA具有一定的折叠结构，这种折叠结构是由它的核苷酸序列决定的，SSCP的灵敏性依赖于SNP对折叠的影响和折叠如何影响目的序列的电泳迁移率，其策略是，将PCR扩增的待测片段与去离子甲酰胺混合，接着95℃变性解链，再骤冷到冰中，然后通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离；稳定的理想条件下，凝胶电泳分离的结果是在某一位置范围内杂合子包含分隔很近的两条带，正常的DNA片段居于其中一条带，纯合突变SNP的DNA片段居于另一条带。DGGE：利用双链DNA分子在一定梯度变性剂浓度的凝胶中电泳时，会在一定变性剂浓度下发生部分解链，导致电泳迁移率下降；分别具有一种SNP等位基因型的两种DNA分子间即使只有一个碱基对的差异，也会在不同时间发生部分解链，从而被分离成两条带。DHPLC：该技术是一项在SSCP和DGGE基础上发展起来的检测SNP的突变技术，此技术将未知的DNA片段与野生型DNA混和，经加热变性后再使其降温重退火，若为有突变的DNA，此时所形成的双螺旋有两种，即为同源双螺旋和异源双螺旋，基于同源双螺旋和异源双螺旋解链温度的不同，通过控制DHPLC的温度，使其维持在接近DNA分子Tm值下运行，然后进行洗脱，越小的DNA分子与柱的亲和力越小，就越容易洗脱下来；DNA经过PCR扩增后，由于错配碱基的存在而形成异源双链，因为单链DNA所带的电荷比双链少，先被洗脱下来，而与正常的配对双链分开，最后根据色谱峰的峰型或数目来确定SNP的有或无。

还可以采用高分辨率溶解曲线分析技术(HRM)。该分析技术是依据在一定的温度范围内将PCR扩增的产物进行变性，期间实时检测体系内荧光信号。荧光值随着温度变化，可绘制溶解曲线。每一段DNA都有其独特的序列，因而也就有了独特的熔解曲线形状，如同DNA指纹图谱一样，具有很高的特异性、稳定性和重复性。根据曲线准确区分野生型纯合子、杂合子和突变性纯合子。

在具体实施时，本领域的技术人员可以根据实际情况选择上述的任一种技术体外检测本发明所述多个基因标签单核苷酸多态性位点。也可以采用多种技术的组合来体外检测所述多个基因标签单核苷酸多态性位点。

本发明优点在于：本发明通过对9个单核苷酸多态性位点进行基因分型，对这些多态性位点进行单点、高阶交互作用以及多位点协同作用分析，结果证明：IL13 R110Q G、IL4-590C>T T、ADRB2 R16G A和FcER1B E237GG与中国汉族儿童哮喘发病相关，分别是风险等位基因，携带四个风险等位基因纯合子者患哮喘的危险度大大提高；IL13 R110Q、IL4-590C>T、ADRB2 R16G和FcER1 E237G在哮喘发病风险上有显著的协同作用，该四位点组成的基因模型可用于中国汉族儿童哮喘预测，且准确度、灵敏度、特异度均十分优异，同时位点数目少，使检测操作更加便利。

附图说明

附图1是Taqman探针法测序技术原理。

附图2是IL4RA Q551R(rs1801275)应用TAQMAN-MGB探针的分型图。图中样本落在X轴附近，代表该样本检测出的是VIC荧光信号，基因型为AA，落在Y轴附近，代表该样本检测出的是FAM荧光信号，基因型为GG，若落在对角线处，则代表该样本同时检测出FAM、VIC荧光信号，基因型为AG。

附图3是FcER1 E237G(rs569108)应用TAQMAN-MGB探针的分型图。图中样本落在X轴附近，代表该样本检测出的是VIC荧光信号，基因型为AA，落在Y轴附近，代表该样本检测出的是FAM荧光信号，基因型为GG，若落在对角线处，则代表该样本同时检测出FAM、VIC荧光信号，基因型为AG。

附图4是FcER1 C-109T(rs1441586)应用TAQMAN-MGB探针的分型图。图中样本落在X轴附近，代表该样本检测出的是VIC荧光信号，基因型为TT，落在Y轴附近，代表该样本检测出的是FAM荧光信号，基因型为CC，若落在对角线处，则代表该样本同时检测出FAM、VIC荧光信号，基因型为CT。

附图5是IL4RA I75V(rs1805010)应用TAQMAN-MGB探针的分型图。图中样本落在X轴附近，代表该样本检测出的是VIC荧光信号，基因型为AA，落在Y轴附近，代表该样本检测出的是FAM荧光信号，基因型为GG，若落在对角线处，则代表该样本同时检测出FAM、VIC荧光信号，基因型为AG。

附图6是IL4 C-590T(rs2243250)应用TAQMAN-MGB探针的分型图。图中样本落在X轴附近，代表该样本检测出的是VIC荧光信号，基因型为CC，落在Y轴附近，代表该样本检测出的是FAM荧光信号，基因型为TT，若落在对角线处，则代表该样本同时检测出FAM、VIC荧光信号，基因型为CT。

附图7是IL13 A2044G(rs20541)应用TAQMAN-MGB探针的分型图。图中样本落在X轴附近，代表该样本检测出的是VIC荧光信号，基因型为AA，落在Y轴附近，代表该样本检测出的是FAM荧光信号，基因型为GG，若落在对角线处，则代表该样本同时检测出FAM、VIC荧光信号，基因型为AG。

附图8是IL13 C-1112T(rs1800925)应用TAQMAN-MGB探针的分型图。图中样本落在X轴附近，代表该样本检测出的是VIC荧光信号，基因型为CC，落在Y轴附近，代表该样本检测出的是FAM荧光信号，基因型为TT，若落在对角线处，则代表该样本同时检测出FAM、VIC荧光信号，基因型为CT。

附图9是IL13 C1923T(rs1295686)应用TAQMAN-MGB探针的分型图。图中样本落在X轴附近，代表该样本检测出的是VIC荧光信号，基因型为CC，落在Y轴附近，代表该样本检测出的是FAM荧光信号，基因型为TT，若落在对角线处，则代表该样本同时检测出FAM、VIC荧光信号，基因型为CT。

附图10是ADRB2 R16G(rs1042713)应用TAQMAN-MGB探针的分型图。图中样本落在X轴附近，代表该样本检测出的是VIC荧光信号，基因型为GG，落在Y轴附近，代表该样本检测出的是FAM荧光信号，基因型为AA，若落在对角线处，则代表该样本同时检测出FAM、VIC荧光信号，基因型为AG。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1

1材料与方法

1.1材料

1.1.1研究对象

(1)哮喘病例组：2007年至2013年期间来自新华医院哮喘专科门诊的1000例哮喘患儿，男503名，女497名，年龄为3～12岁。均符合2006年全球哮喘创议(Global Initiative for Asthma，GINA)委员会修订的儿童哮喘诊断标准：频繁的喘息发作(或可追溯与某种变应原或刺激因素有关)；发作时双肺闻及呼气相为主的哮鸣音，呼气相延长；支气管舒张剂有明显疗效，存在可逆性气流受限；除外其他引起喘息、胸闷和咳嗽的疾病。由于呼吸道合胞病毒感染患儿常有喘息发生，故将入组年龄下限定为3岁。76％具有IgE资料的入组患儿，其总IgE水平均在400IU/ml以上。

(2)正常对照组：同期来自上海师范大学、华东理工大学和上海交通大学医学院的1000名健康学生，男503名，女497名，年龄为18～25岁。入选标准：本人及三代以内直系亲属中无哮喘史、无肺部其它疾病史、无变态反应史。之所以选择18～22岁这一年龄组作为对照，是为了有足够长时间除外哮喘等疾病诊断，说明至少在此年龄前无哮喘等过敏疾病史。

以上两组均为汉族人群，相互间无亲缘关系。

1.1.2主要试剂耗材

1.1.2.1口腔拭子基因组DNA提取试剂

口腔拭子基因组DNA提取试剂盒：购自天根生化科技(北京)有限公司，内含缓冲液GA、缓冲液GB、缓冲液GD、缓冲液PW、洗脱缓冲液TB、蛋白酶K，4℃保存。

1.1.2.2 Taqman探针法反应所用试剂耗材

(1)Genotyping Master Mix(含上下游引物及FAM和VIC标记的探针)：购自美国生物应用系统(公司货号：4371357)。

(2)Genotyping Master Mix(内含DNA聚合酶、dNTP、buffer、Mg²⁺等)：购自美国生物应用系统。

(3)ABI 384孔板：购自美国生物应用系统。

(4)ABI光学盖膜：美国Luminex公司。

(5)AXYGEN枪头：德国艾本德(Eppendorf)股份有限公司。

1.1.3主要仪器

(1)ABI 7900HT荧光定量PCR仪(美国生物应用系统公司)。

(2)ABI 9700双384PCR仪(美国生物应用系统公司)。

(3)ABI 9700单96 PCR仪(美国生物应用系统公司)。

(5)Eppendorf 5424小型高速离心机(德国艾本德Eppendorf股份有限公司)。

(6)Eppendorf MiniSpin个人型高速离心机(德国艾本德Eppendorf股份有限公司)。

(7)Eppendorf Research单道可调量程移液器(德国艾本德Eppendorf股份有限公司)。

(8)Eppendorf Research 8道可调量程移液器(德国艾本德Eppendorf股份有限公司)。

(9)Eppendorf Multipette plus连续分液器(德国艾本德Eppendorf股份有限公司)。

(10)全自动数显立式高压蒸汽灭菌器(上海申安)。

1.2方法

1.2.1标本采集

根据知情同意原则，采集口腔颊粘膜拭子。具体方法如下：

(1)入组人员于采集前禁食半小时。

(2)使用棉签刮拭面颊内侧粘膜10次，期间转动棉签以获取最大细胞收集量。

(3)剪下棉签头，放入2ml灭菌离心管中，盖上管盖，-20℃保存。

1.2.2口腔拭子基因组DNA提取

(1)在内置棉签头的2ml离心管中加入600μl缓冲液GA。

(2)加入30μl蛋白酶K(20mg/ml)溶液，盖上管盖，涡旋60秒混匀，56℃放置60分钟，期间每10分钟涡旋混匀一次。

(3)加入600μl缓冲液GB，涡旋30秒混匀，70℃放置10分钟，此时溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的液滴。

(4)加入300μl无水乙醇，涡旋30秒混匀，简短离心以去除管盖内壁的液滴。

(5)将700μl上一步所得溶液加入一个吸附柱CR中(吸附柱CR放入收集管中)，12000rpm(～13400×g)离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR放回收集管中。

(6)将剩余的第(4)步所得溶液全部转移入吸附柱CR中，重复步骤(5)。

(7)向吸附柱CR中加入500μl缓冲液GD(使用前先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm(～13400×g)离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR放回收集管中。

(8)向吸附柱CR中加入700μl漂洗液PW(使用前先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm(～13400×g)离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR放回收集管中。

(9)向吸附柱CR中加入500μl漂洗液PW，12000rpm(～13400×g)离心30秒，倒掉收集管中的废液。

(10)将吸附柱CR放回收集管中，12000rpm(～13400×g)离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CR室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

(11)将吸附柱放入剪去管盖的1.5ml灭菌离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加100μl洗脱液TB，室温放置5分钟，12000rpm(～13400×g)离心30秒。

(12)将离心得到的溶液重新加入吸附柱中，室温放置5分钟，12000rpm(～13400×g)离心2分钟，将洗脱液转移入新的1.5ml灭菌离心管中。

(13)纯化的基因组DNA置-20℃保存。

1.2.3单核苷酸多态性(single-nucleotide polymorphism,SNP)位点的选择及Taqman探针的设计与合成

(1)根据课题组前期设计的哮喘易感基因预测模型，选取了5个基因(分别为IL13、IL4、ADRB2、FcER1B和IL4RA基因)的9个SNP位点(IL13-1112C>T、IL13+1923C>T、IL13 R110Q、IL4-590C>T、ADRB2 R16G、FcER1B-109C>T、FcER1B E237G、IL4RA I75V和IL4RA Q551R)为此次的研究位点，详见表1。这些位点的次要等位基因频率均高于10％。

表1研究的基因SNP位点

基因	SNP	rs号	染色体位置	基因位置
					IL13	-1112C>T	rs1800925	5:132657117	启动子
IL13	+1923C>T	rs1295686	5:132660151	内含子3
					IL13	R110Q	rs20541	5:132660272	外显子4
IL4	-590C>T	rs2243250	5:132673462	启动子
					ADRB2	R16G	rs1042713	5:148826877	外显子1
FCER1B	-109C>T	rs1441586	11:60088555	启动子
					FCER1B	E237G	rs569108	11:60095631	外显子7
IL4RA	I75V	rs1805010	16:27344882	外显子5
					IL4RA	Q551R	rs1801275	16:27363079	外显子12

(2)采用Taqman探针的方法对上述九个SNP位点进行基因测序。Taqman探针的设计是根据每个位点的RS序号，由美国Applied Biosystems公司设计并合成。所用引物和探针均包含于Applied Biosystems公司设计并合成的SNP Genotyping Assay Mix，包括2条引物和2条TaqMan MGB探针，探针分别使用FAM和VIC标记。这些位点的RS号和荧光信号类型与基因型对应表见表2，引物和探针序列见表3。

表2荧光信号类型与基因型对应表

表3引物和探针序列(具体序列见说明书核苷酸或氨基酸序列表)

1.2.4 TaqMan探针法进行SNP位点分型

1.2.4.1技术原理和标本要求

(1)技术的技术原理

其技术原理是合成一种寡核苷酸探针，在探针的5’末端连接荧光基团，在3’末端连接淬灭剂，其序列与靶模板的一段序列互补。当完整的探针与目标序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3’端的淬灭剂接近而被淬灭，检测不到荧光信号。但在进行延伸反应时，探针先于引物与靶模板结合，当引物沿着DNA模板延伸到荧光标记探针的结合位点时，聚合酶的5’外切酶活性将探针进行酶切，使得荧光基团与淬灭剂分离，从而可以检测荧光信号。并随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累，荧光强度也不断增强。其用于基因分型检测的技术原理见图1。

(2)标本要求

用于SNP检测的样本浓度在20ng/μl-50ng/μl之间，每个SNP位点至少50ng的样品，不含PCR抑制剂。

1.2.4.2配置PCR反应液

(1)将SNP Genotyping Assay Mix(内含2条FAM、VIC标记的探针和2条引物)、Genotyping Master Mix(内含DNA聚合酶、dNTP、buffer、Mg²⁺等)、DNA样本放至室温完全融化。

(2)将探针在振荡器上充分振荡混匀10秒后，Eppendorf MiniSpin个人型高速离心机快递离心900转左右即停。

(3)计算总的PCR反应混合体系(10μl体系)：

(4)在反应液配置管中依次加入灭菌蒸馏水、SNP Genotyping AssayMix和Genotyping Master Mix，在漩涡混合器上混合5秒。

(5)取出384反应板，按照加样分布表用马克笔标注在384孔板上。

(6)按照加样分布表分装PCR反应液至384孔板中。

(7)按照样本编号顺序依次加入样本DNA。

1.2.4.3使用ABI9700双384PCR仪进行PCR反应

(1)打开PCR仪提前预热10分钟。

(2)加样完毕后，将384孔板放置于BLOCK中，橡胶盖膜压紧所有反应孔，保证密闭。

(3)盖好顶盖。

(4)设置PCR循环反应条件：

1.2.4.4使用ABI 7900HT荧光定量PCR仪进行终点读板

完成上述步骤后，把加好样品的384孔板放在ABI 7900 Sequence Detector上进行反应，7900定量仪的相关操作如下：

(1)开启电脑及显示器电源，进入Windows 2000操作系统，登陆电脑。

(2)待电脑完全启动后(即鼠标沙漏消失)，打开7900HT电源(红黄绿依次闪动2次并变成绿灯亮即可)。

(3)打开7900定量PCR仪软件SDS2.2进行设置。

选择File→New新建New document，其中Assay代表实验测定类型，共有四个选项：Background(背景校正)，Pure Dyes(纯荧光校正)，AllelicDiscrimination(等位基因检测时使用)，Absolute Quantification(绝对定量、相对定量时使用)；Container(选择反应板类型)，选择384wellclear plate项；Template项用于调用事先设置好模板文件；依次填写Barcode(每板的编号)。按OK确认此时可以把上面的设定存为模板文件，以方便以后调用。Detector：单击Setup选单中的Add，打开Detector Manager，在File→New新建detector，然后设定相关参数，本实验用普通TaqMan探针的Quencher Dye，选择TAMRA即可。将荧光种类复制到实验检测的模板中。在Instrument选单中设定循环参数：Thermal profile选单下设定循环的温度、时间、反应体系。设置完毕后，选择Instrument选单下方的Open/Close按钮弹出样品架(在机器右侧)。把样品板置入托盘，注意A1靠托盘的左上角，再单击Open/Close按钮自动弹回样品架并关闭上样门。按Start按钮弹出Save对话框，对反应板取名，save即可，等待出现Remain Time若干时间后即开始正式运行。实验结束，单击Analysis对结果进行分析，而后打开Result选单展示实验结果。输出数据在File→Exportresult，取名，save即可；输出图片，点击鼠标右键选Save plot to Image File，键入文件名，save，记录结果。

1.2.5统计学分析

1.2.5.1基因型频率和等位基因频率计算

(1)基因型频率的计算：A，a分别代表两种等位基因，N代表例数

AA频率＝N_AA/(N_AA+N_Aa+N_aa)

Aa频率＝N_Aa/(N_AA+N_Aa+N_aa)

aa频率＝N_aa/(N_AA+N_Aa+N_aa)

(2)等位基因频率的计算：A，a分别代表两种等位基因，N代表例数

A频率＝(N_AA+1/2N_Aa)/(N_AA+N_Aa+N_aa)

a频率＝(N_aa+1/2N_Aa)/(N_AA+N_Aa+N_aa)

1.2.5.2 Hardy-Weinberg平衡吻合度检验

根据Hardy-Weinberg平衡定律计算各SNP位点在对照组中的预期基因型频率，采用卡方检验比较对照组中观察到的基因型频率与预期基因型频率间的差异，P＞0.05表示样本的基因型频率符合遗传平衡法则。确定选取的样本在所研究的各SNP位点均处于遗传平衡状态，具有群体代表性。

1.2.5.3 SNP位点与哮喘的关联分析

应用PLINK 1.07软件进行卡方检验以分析各SNP位点在哮喘组与对照组间的等位基因频率差异，以P＜0.0055(Bonferroni校正后)表示差异具有统计学意义。若某SNP位点的等位基因频率在组间具有统计学差异，说明该多态位点与哮喘具有相关性，反之则与哮喘无相关性。除等位基因关联分析，我们还采用logistic回归分析对遗传模型(显性模型、隐形模型和共显性模型)进行研究，校正性别和年龄后，确定各SNP位点与哮喘发生最相关的遗传模型。同样以P＜0.0055(Bonferroni校正后)表示统计学显著性。

1.2.5.4多个SNP位点的高阶交互作用分析

采用多因子降维法(multifactor-dimensionality reduction，MDR V2.0 Beta 2)进行多个SNP位点的高阶交互作用分析。MDR模型的评估基于检验样本准确度(testing balanced accuracy，TBA)、交叉验证一致性(cross-validationconsistency，CVC)和统计学显著性。通常要求TBA大于0.55，而最佳模型则应CVC和TBA最高。模型的统计学显著性采用10000次置换检验。对MDR方法确定的最佳模型中相距不足20kb的SNP位点，在对照组中进行连锁不平衡分析。此外，我们还采用卡方检验对MDR方法确定的最佳模型进一步验证，以P＜0.05表示具有统计学意义。

2结果

2.1九个SNP位点应用TAQMAN-MGB探针进行分型的分型图

九个SNP位点应用TAQMAN-MGB探针进行分型的分型图如图2-图10所示。

2.2单一SNP位点与儿童哮喘的关联研究

结果显示，各SNP位点均处于遗传平衡状态(P＞0.05)。从表4中可见，IL13 R110Q、IL4-590C>T、ADRB2 R16G和FcER1B E237G四个位点分别与儿童哮喘相关。IL13 R110Q的G等位基因(OR＝1.24，P＝1.23E-03)、IL4-590C>T的T等位基因(OR＝1.25，P＝3.81E-03)、ADRB2 R16G的A等位基因(OR＝1.29，P＝6.75E-05)和FcER1B E237G的G等位基因(OR＝1.27，P＝3.86E-03)在哮喘组中的频率明显高于对照组。IL13 R110Q(P＝3.07E-04)和ADRB2 R16G(P＝3.92E-05)两位点与哮喘最相关的遗传模型是显性模型，而FcER1B E237G则是隐性模型(P＝1.16E-05)。其余五个SNP位点未发现与儿童哮喘显著相关(P＞0.0055，Bonferroni校正后)。

表4单一SNP位点与儿童哮喘的关联分析

SNP，单核苷酸多态性；OR，比数比；CI，置信区间。

^aPearson卡方检验P值；

^b共显性模型(AA、AB和BB三者比较)，显性模型(AA与AB+BB比较)，隐形模型(AA+AB与BB比较)，A是主要等位基因，B是次要等位基因；

^clogistic回归分析P值，校正性别和年龄。

2.3采用MDR方法进行基因-基因高阶交互作用分析

采用MDR方法对所有九位点进行基因-基因高阶交互作用分析，发现仅三个模型具有最高的CVC值10/10，见表5。基于TBA和10000次置换检验P值，可见这三个模型均显示显著的基因-基因交互作用(ADRB2 R16G和FcER1E237G，P＝9.34E-04；IL13 R110Q、IL4-590C>T和ADRB2 R16G，P＝3.12E-04；IL13 R110Q、IL4-590C>T、ADRB2 R16G和FcER1 E237G，P＝6.98E-05)。其中四位点模型具有最高的TBA和最低的置换检验P值，因而被认为是最佳模型。该模型中，IL13 R110Q和IL4-590C>T两位点相距不足20kb，对其进行连锁不平衡分析发现D’＝0.1934，r²＝0.0069，表明两者不存在紧密连锁不平衡。该模型的准确度为0.7976，灵敏度为0.8745，特异度为0.7206。

表5采用多因子降维法进行基因-基因高阶交互作用分析

2.4 MDR最佳模型各SNP位点在儿童哮喘中的协同作用分析

表6显示IL13 R110Q、IL4-590C>T、ADRB2 R16G和FcER1 E237G在哮喘发病风险上有显著的协同作用。四个位点均为危险等位基因纯合子者(IL13R110Q GG+IL4-590C>T TT+ADRB2 R16G AA+FCER1B E237G GG)患哮喘的风险显著高于不携带任何危险等位基因纯合子者(P＝4.28E-03，OR＝13.55)，也明显高于携带少于四个危险等位基因纯合子者(P＝6.51E-03，OR＝10.09)。

表6 IL13 R110Q、IL4-590C>T、ADRB2 R16G和FcER1 E237G四个SNP位点在儿童哮喘中的协同作用分析

SNP，单核苷酸多态性；OR，比数比。

^a卡方检验P值。

3结论

IL13 R110Q、IL4-590C>T、ADRB2 R16G和FcER1 E237G四个SNP位点分别与中国汉族儿童哮喘发病相关，且相互间存在协同作用。IL13 R110Q G、IL4-590C>T T、ADRB2 R16G A和FcER1B E237G G分别是风险等位基因，携带四个风险等位基因纯合子者患哮喘的危险度大大提高。该四位点组成的基因模型可考虑用于中国汉族儿童哮喘预测。

实施例2

对具体的某一个体(该个体属于中国汉族儿童)进行患哮喘风险的评价时，按以下方法进行：

1、采集标本：可以是该个体的血液、唾液、口腔黏膜、头发或或组织等。

2、提取标本的基因组DNA。

3、通过直接测序；或聚合酶链式反应与限制性片段长度多态性分析相结合；或聚合酶链式反应与直接测序法相结合；或任一种SNP分型的方法获得个体的基因单核苷酸多态性位点IL13 R110Q、IL4-590C>T、ADRB2 R16G和FcER1 E237G的核苷酸序列。

4、将各基因单核苷酸多态性位点的序列与实施例1表5进行比对，查找出该个体患哮喘风险的概率。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.多个基因单核苷酸多态性位点的组合，其特征在于，所述的多个基因单核苷酸多态性位点包括以下位点：IL13R110Q、IL4-590C>T、ADRB2R16G和FcER1E237G。

2.权利要求1所述的多个基因单核苷酸多态性位点的组合在制备用于评估个体患哮喘风险的检测装置中的应用。

3.检测单核苷酸多态性位点IL13R110Q、IL4-590C>T、ADRB2R16G和FcER1E237G的试剂组合在制备评估个体患哮喘风险的试剂、试剂盒或检测装置中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的检测单核苷酸多态性位点IL13R110Q、IL4-590C>T、ADRB2R16G和FcER1E237G的试剂为：用于直接测序法的试剂；或用于聚合酶链式反应与限制性片段长度多态性分析相结合的试剂；或用于聚合酶链式反应与直接测序法相结合的试剂；或用于以下任一种SNP分型方法的试剂：基于杂交的方法、基于引物延伸的方法、基于构象的方法或高分辨率溶解曲线分析技术。

5.一种评估个体患哮喘风险的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含：检测单核苷酸多态性位点IL13R110Q、IL4-590C>T、ADRB2R16G和FcER1E237G的试剂。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含SEQ IDNO.1-SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.9-SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.21-SEQ IDNO.24、SEQ ID NO.25-SEQ ID NO.28所示的核苷酸序列。

7.检测单核苷酸多态性位点IL13R110Q、IL4-590C>T或FcER1E237G的试剂在制备评估个体患哮喘风险的试剂、试剂盒或检测装置中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的检测单核苷酸多态性位点IL13R110Q、IL4-590C>T或FcER1E237G的试剂为：用于直接测序法的试剂；或用于聚合酶链式反应与限制性片段长度多态性分析相结合的试剂；或用于聚合酶链式反应与直接测序法相结合的试剂；或用于以下任一种SNP分型方法的试剂：基于杂交的方法、基于引物延伸的方法、基于构象的方法或高分辨率溶解曲线分析技术。