CN102108383A - 儿童过敏性哮喘遗传检测 - Google Patents

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冯哲民
邹祖烨
贺宪民
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SHANGHAI ZHUJIAN BIOENGINEERING CO Ltd
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Abstract

本发明公开了一种儿童过敏性哮喘遗传检测方法，通过采集受检者的口腔粘膜细胞，提取其基因组DNA，对其基因组DNA的ADRB2基因rs1042713位点、TNFA基因rs1800629位点、MS4A2基因rs569108位点和ACE基因rs4646994位点多态性进行检测，从基因层面评估儿童哮喘的遗传风险，并作为辅助诊断和鉴别诊断，把过敏性哮喘从儿童喘息性疾病区分出来，保证了诊断的正确性，在哮喘规范的诊断及治疗同时减少其误诊的机会，对临床工作提供了有利的指导。

Description

儿童过敏性哮喘遗传检测
技术领域
本发明涉及分子生物学和医学领域，更具体的，本发明涉及一种儿童过敏性哮喘遗传检测方法。
背景技术
儿童过敏性哮喘是儿童最常见的慢性呼吸道疾病，以反复发作的呼吸困难、伴有喘鸣音出现为主要症状，多在冬、春季发病，初次发病年龄多在学龄前。哮喘反复发作，对儿童健康、学习和生活影响很大，且部分儿童哮喘可迁延至成人哮喘，成为终生疾患，如诊治不及时，随病程延长可产生气道不可逆性狭窄和气道重塑，因此，对哮喘的合理防治至关重要。
儿童患过敏性哮喘有家族性说明该病和遗传因素有关，因此遗传体质不同的人，应该采取不同的疾病风险控制策略才能更好的预防哮喘的发生；有效区分喘息性疾病忠儿的病因(哮喘性和非哮喘性)，进行有效早期干预治疗，将提高治疗的针对性，避免过度化治疗。利用现代科学研究成果，开发一项基于分子遗传基础的儿童过敏性哮喘遗传辅助诊断与评估预测产品会对儿童过敏性哮喘的发生起到预警、个性化防治的作用。
肾上腺素能受体(ADRB2或β2-AR)是与鸟嘌呤核苷蛋白耦联(G蛋白耦联)的肽链跨膜至少7次的受体家族成员之一。ADRB2在机体多种组织中均有表达，包括心肌细胞、支气管和血管平滑肌细胞、脂肪细胞以及肾脏细胞。通过ADRB2激动剂的介导(如异丙肾上腺素、肾上腺素)后，引起血管扩张、支气管平滑肌松弛等生理效应。rs1042713是位于ADRB2第46位的A/G多态，导致氨基酸16的改变，即精氨酸(Arg16)变为甘氨酸(Gly16)。ADRB2编码区第16位氨基酸的变异已在体外试验中证实可以改变ADRB2的功能，影响气道平滑肌松弛和组胺等介质的释放，是近年来国际上研究哮喘易感性及疾病调节基因的重要候选基因之一。ADRB2基因多态性不仅能引起ADRB2表型功能的改变，而且在一定程度上影响到哮喘的发生、严重程度及对治疗的反应。
TNF-α基因，位于人类染色体6p21.3位置，位于HLA-I类和HLA-II类基因之间，并且与之紧密连锁。TNF-α基因全长2.8kb，共有4个外显子，mRNA全长1,669nt，编码234个氨基酸残基的蛋白。TNF-α可以由多种细胞产生，包括巨噬细胞、淋巴细胞、肥大细胞和表皮细胞，但主要来源于巨噬细胞。TNF-α基因存在多个多态位点，其是位于TNF-α基因启动子区第-308位的鸟嘌呤(G)变异为腺嘌呤(A)，存在三种基因型：GG(无突变)，GA(突变杂合子)，AA(突变纯合子)。许多研究发现该基因的多态性与哮喘疾病的易感性相关。
跨膜结构域4亚家族A，成员2(MS4A2)是一异型多聚复合物，属于多条链的免疫识别受体，其生物学功能，最主要功能是参与IgE介导的I型超敏反应，促进肥大细胞、嗜碱性细胞释放炎性介质，分泌细胞因子，表达粘附分子。过敏气喘相关的两种细胞：巨细胞(Mast cells)及嗜碱性白血球(Basophils)，都有MS4A2基因产生的接受器，环境中的过敏原与MS4A2结合后，会启动急性高度敏感反应，巨细胞会释放组织胺(Histamine)以及蛋白分解酵素，合成前列腺素(Prostaglandins)及白血球三烯素(Leukotrienes)，这过程会引起高度的敏感反应。rs569108基因多态性，即MS4A2E237G，是β链基因第七个外显子6843位点碱基由鸟嘌呤(G)取代了腺嘌呤(A)，从而导致β链氨基酸系列中胞浆区羧基末端第237位氨基酸由甘氨酸(G)代替了谷氨酸(E)。β链羧基末端胞浆区在IgE与α链结合后与细胞浆之间的信号传递中起重要作用。由于甘氨酸为非极性疏水性氨基酸，谷氨酸却为酸性氨基酸，含两个羧基，甘氨酸不带电荷、谷氨酸带负电荷，E237G便改变了β链羧基末端的亲水性，并进而可能影响β链的功能，导致血清总IgE水平升高，引起肥大细胞等释放炎性介质增多。同时，β链羧基末端第237位氨基酸邻近酪氨酸激酶受体与酪氨酸激酶相互作用并通过酪氨酸的磷酸化而激活细胞，E237G可能是通过影响ITAM的功能而导致细胞内信号传递方式发生改变。
ACE基因编码血管紧张素转化酶，位于第17号染色体17q23.3位置。全长44,769bp，mRNA全长4,195nt，共有48个外显子，编码1,306个氨基酸残基的蛋白。ACE是一种膜结合糖蛋白，属二肽基羧肽酶，能将血管紧张素I(十肽，由肾素转化而来)肽链C末端的组氨酸和亮氨酸残基水解，形成具有增压作用的血管紧张素II，从而在血压调节和电解质平衡方面发挥重要作用。ACE不仅使具有降血压作用和参与炎性作用的缓激肽、P物质等多肽性物质灭活，还能直接作用于肾上腺皮质，促进醛固酮分泌。因此，它是肾素-血管紧张素-醛固酮系统以及缓激肽系统的重要调节因素，影响人体多种生理功能。从1988年ACE基因被克隆，目前已发现多种ACE基因多态性标志。近年来研究最多的是位于第16内含子中一段长287bp的插入/缺失多态rs4646994位点，含有此片段的ACE等位基因称为I型等位基因，不含此片段的称为D型等位基因。从而产生了三个不同的基因型，即在17号染色体上均插入这一片段为插入型纯合子(I/I型)，均缺失这一片段为缺失型纯合子(D/D型)，如在一条染色体上插入而另一条染色体缺失这一片段为杂合子(I/D型)。关于DD型影响哮喘发病的机制，可能是通过Ang II的产生增加有关，另外DD基因可能与哮喘患者肺功能损害的程度有关。
通过对儿童哮喘的风险基因型的遗传检测，从基因角度评估儿童哮喘的遗传风险，从而更好的预防疾病的发生。作为疾病传统防控方法的创新发展，遗传检测项目在疾病尚未发生时，就从遗传角度提示疾病发生风险，继而对遗传高发病风险人群进行改变生活方式、调整环境因素及其他手段予以干预，达到降低疾病发生风险的目的，从而降低人群中儿童过敏性哮喘发病率，提升了群众生活质量，减轻了社会医疗负担。并且此遗传检测作为儿童哮喘疾病的一种辅助诊断和鉴别诊断方法，把过敏性哮喘从儿童喘息性疾病区分出来，保证了诊断的正确性，在哮喘规范的诊断及治疗同时减少其误诊的机会，对临床工作提供了有利的指导。
发明内容
本发明提供一种儿童过敏性哮喘遗传检测方法。
通过采集受检者的口腔粘膜细胞，提取其基因组DNA，对其基因组DNA的ADRB2基因rs1042713位点、TNFA基因rs1800629位点、MS4A2基因rs569108位点和ACE基因rs4646994位点多态性进行检测，从基因层面评估儿童哮喘的遗传风险，并作为辅助诊断和鉴别诊断，把过敏性哮喘从儿童喘息性疾病区分出来，保证了诊断的正确性，在哮喘规范的诊断及治疗同时减少其误诊的机会，对临床工作提供了有利的指导。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。
实施例  检测试剂盒的使用
步骤1：DNA模板的抽取
用硅胶吸附法抽提口腔上皮细胞的基因组DNA。
步骤2：荧光定量PCR反应
使用检测试剂盒中的荧光定量PCR套装，进行荧光定量PCR反应，反应的体系为总体积10μl，包含浓度为20ng/μl的DNA模板2μl、1μl 10X荧光定量PCR反应缓冲液、0.1μl 25mM dNTP混合液、0.6μl 25mM MgCl2溶液、0.025μl(5units/μl)Taq DNA聚合酶、20μM的有义引物和反义引物各0.225μl、10μM的带VIC荧光探针和带FAM荧光探针各0.25μl，去离子水5.325μl。
在PCR扩增仪上进行反应，反应条件为50℃、2分钟，95℃、10分钟，进行60个循环的95℃、30秒，60℃、1分钟。反应结束后在荧光定量PCR仪上读取样品荧光量。
步骤3：基因型分析
根据试剂盒使用说明书标示的基因分型图示对SNP位点进行基因型分析。
熟悉荧光定量PCR技术的本领域技术人员能够通过辨识荧光定量PCR仪上显示的最终样品荧光量，根据不同序列探针荧光信号的强弱即可确定所检测的SNP位点的基因型。

Claims (1)

1.一种儿童过敏性哮喘遗传检测方法，其特征在于：采集受检者的口腔粘膜细胞，提取其基因组DNA，对其基因组DNA的ADRB2基因rs1042713位点、TNFA基因rs1800629位点、MS4A2基因rs569108位点和ACE基因rs4646994位点多态性进行检测，从基因层面评估儿童哮喘的遗传风险，并作为辅助诊断和鉴别诊断，把过敏性哮喘从儿童喘息性疾病区分出来，保证了诊断的正确性，在哮喘规范的诊断及治疗同时减少其误诊的机会，对临床工作提供了有利的指导。
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