CN109355379A

CN109355379A - 一种用于检测常染色体显性遗传性耳聋家系致聋基因突变的试剂盒

Info

Publication number: CN109355379A
Application number: CN201811500244.0A
Authority: CN
Inventors: 王明明; 王海波; 樊兆民; 白晓卉; 李建峰
Original assignee: Shandong Otolaryngological Hospital
Current assignee: Shandong Otolaryngological Hospital
Priority date: 2018-12-07
Filing date: 2018-12-07
Publication date: 2019-02-19
Anticipated expiration: 2038-12-07
Also published as: CN109355379B

Abstract

本发明涉及医学领域，具体涉及一种用于检测常染色体显性遗传性耳聋家系致聋基因突变的试剂盒，该试剂盒中包括特异性引物、PCR混合液及酶切反应混合液等，其中发明人针对常染色体显性遗传性耳聋基因专门设计了对应的特异性引物，利用该试剂盒可以快速的检测出患者体内MYH14基因c.5417位点的C到A突变，从而更好的在该家系乃至全国范围内进行MYH14基因突变的大规模筛查和预防性检查，且检测成本低，操作简单，准确率高。

Description

一种用于检测常染色体显性遗传性耳聋家系致聋基因突变的试剂盒

技术领域

本发明涉及医学基因检测领域，具体涉及一种用于检测常染色体显性遗传性耳聋家系致聋基因突变的试剂盒。

背景技术

耳聋是最为常见的感觉功能障碍疾病，已成为全球性公共卫生问题，得到国际社会和各国政府的高度重视。据估计全球高达2.78亿人有听力障碍，中国约有2780万患者，占全球患者的10％左右。并且，每年新生儿重度耳聋发病率约为2‰，即每年新增聋儿2000余名。聋病患者失去听觉和言语交流能力，大多不能接受正常教育，导致知识和受教育水平较低，不具备很好的生活和工作能力，已成为社会和家庭的沉重负担，是引起社会动荡和不稳定的重要因素。聋病已成为严重影响患者生活质量、影响家庭和社会和谐发展的重大疾病之一。

神经性耳聋的病因有遗传因素、环境因素、年龄因素、噪声暴露、使用耳毒性药物等。研究发现，遗传学作用在听力障碍形成的机制中发挥着重要作用，约有60％的神经性聋是由遗传因素引起的。到目前为止，针对非综合征型耳聋共有110多个基因已被确定，遗传性耳聋基因的定位和识别方面取得了巨大的进步。然而，还有大量与遗传性耳聋相关的基因未被发现。

2003年，Leal等定位并克隆了MYH14基因，它位于19号染色体，包含41个外显子,长达108kb。外显子1为非翻译区，编码1995个氨基酸长度、分子量228kD的蛋白质。MYH14包括一个N端肌球蛋白头部结构域，2个IQ结构域，及一个C端肌球蛋白尾部。MYO7A、MYO15、MYH9、MYO6、MYO3A及MYO1A这6种肌球蛋白基因，它们的突变分别导致DFNA2、DFNB3、DFNA7、DFNA22、DFNB30及DFNA48型耳聋。因为所编码蛋白与MYH9具有高度同源性，MYH14被认为是19q13.33区域内最有可能的耳聋候选基因。2004年，Golomb等发现其在多种人体组织有表达，在骨骼肌内表达最高；而在小鼠发育期的耳蜗感觉区和肠上皮细胞端区亦有MYH14的表达。2004年，Donaudy等证实MYH14基因在小鼠耳蜗中表达，并对300名欧洲不同国家的耳聋患者及DFNA4家系实施了MYH14的突变筛查。他们在DFNA4连锁的大家系及一例散发病例中发现了一处无义突变和三处错义突变，上述突变在200名正常对照中没有发现，人们首次确认MYH14基因是DFNA4型耳聋的致病基因。

针对现有已知位点，检测突变位点的黄金方法是直接测序法，但该操作繁琐，费用昂贵限制了它的广泛应用。另外，新一代测序法、基因芯片筛查法、荧光定量PCR法等，设计和检测成本较高，不适合检测单个已知突变位点，也不易在临床进行推广。因此急需一种快速、简便、准确、经济的基因突变检测方法，来满足临床上对常染色体显性遗传性耳聋家系的聋病患者MYH14基因突变筛查工作的需要。

发明内容

本发明的发明人正是针对现有技术中对MYH14基因突变筛查的研究部分的缺失，首先从一个常染色体显性遗传的耳聋家系里发现了一个MYH14基因上c.5417C到A的新突变位点，携带该突变的患者来源一个常染色体显性遗传的家系，患者均表现为非综合征性中度至重度的全频神经性聋。基于这一发现，发明人进一步设计了特异性引物及应用该引物的试剂盒，利用该试剂盒可以快速的检测出患者体内或胚胎中MYH14基因c.5417的C到A突变位点，从而更好的在该家系及全国范围内进行耳聋相关基因突变的大规模筛查和预防性检查，且检测成本低，操作简单，准确率高。

发明人首先对我国一个患有耳聋的中国家系进行了研究，这个家系有四代共16位成员，其中患病的有4位，他们患有中度到重度非综合征性全频聋，发明人对耳聋患者进行了外显子测序，发现了MYH14基因上的一个c.5417C到A的新突变位点，并且通过酶切技术对10名家系成员及200例正常对照进行此突变点的排查，发现被采集的3位患者均有MYH14基因c.5417C到A的杂合突变，家系中7位正常者及200例正常对照均不携带此突变，同时我们对含有MYH14基因c.5417位点的片段进行了Sanger测序，测序结果与酶切结果完全吻合；进一步验证了该突变位点的存在以及其致病性。

在确定了上述突变位点之后，发明人进一步的设计开发了检测耳聋相关基因MYH14c.5417C到A位点突变的试剂盒，本试剂盒主要包括以下几部分：特异性引物，PCR混合液，酶切混合液，限制性内切酶，阳性对照样本及阴性对照样本；

其中特异性引物包括：

正向引物F:5'-GATGGTCTCGTGGACTTAT-3'，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

反向引物R:5'-TGTGGAGGTCACCTTTCT-3'，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

PCR混合液包括10×PCR buffer、2.5mM dNTP、Taq酶；

限制性内切酶包括限制性内切酶Eco130I，此限制性内切酶可以识别5‘C/CWWGG3’序列；

阳性标本对照是含有MYH14基因c.5417的C到A杂合突变的DNA片段；

阴性标本对照是不含此突变位点能发生酶切的DNA片段；

发明人同时提供了利用该试剂盒进行检测的具体步骤如下:

1.基因组DNA的提取：利用现有技术从血液、毛发等样本中提取的基因组DNA，均可用此试剂盒实现对MYH14基因c.5417C到A突变位点的检测；

2.目的片段的扩增：利用试剂盒中特异性引物扩增含有MYH14基因c.5417位点的DNA片段，这段PCR产物长512bp，其中未突变的片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，突变后的片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

3.将上述PCR产物用限制性内切酶Eco130I进行酶切；

4.酶切产物的鉴定：利用3％琼脂糖凝胶进行电泳，通过酶切产物的大小判断突变位点的有无。

采用本发明提供的试剂盒检测耳聋相关基因MYH14c.5417位点C到A突变时，结合特异性PCR技术和酶切技术，每份DNA样本分别用特异性引物于PCR反应管中进行普通PCR扩增，然后进行突变位点处的酶切，通过一次PCR便可在几小时内检出耳聋相关基因MYH14c.5417位点的C到A突变，而且杂合突变或者纯合突变也可一目了然，其主要判定标准为，对于杂合突变中只有一条发生突变的基因，故此在利用本发明的试剂盒进行酶切时会产生512bp、308bp和204bp的三条带；对于纯合突变，酶切位点消失，512bp的条带不被切开；而对于没有发生突变的情况，则在利用本发明的试剂盒进行酶切时会产生308bp和204bp的两条带；这样就可以进行清楚的判定；同时，阴性对照与阳性对照使检测更加准确、可信。

发明人需要说明的是，虽然现有技术中已经有相应的检测试剂盒出现过，且原理上与本申请的方案也有类似之处，但是由于现有技术中并没有任何关于耳聋相关基因MYH14c.5417位点C到A突变的报道出现过，本领域技术人员缺乏对该目标基因的研究，因此无法从现有技术中获得任何的技术启示，而本发明的发明人正式基于长期一线工作的积累，从众多的可能突变基因位点中找到并验证了上述位点突变与耳聋之间的关系，并提供了相应的检测方法来对其进行检测，所选择的限制性内切酶Eco130I与其他内切酶相比，识别率更高，可以大大提高检测的准确性，因此针对本发明所提供的突变基因位点而言，是填补了本领域空白的技术，是明显区别于现有技术的。

本发明所开发试剂盒具有以下的优点：

1.对待检样本没有苛刻要求：以患者的血液、毛发等为来源，用自制试剂或者试剂盒提取的基因组DNA均可用此试剂盒进行检测，使检测更易进行；

2.目前检测突变位点的方法有直接测序法，新一代测序法、基因芯片筛查法、荧光定量PCR法等，这些检测方法操作繁琐、检测费用偏高不易在临床进行推广。与这些方法相比较，本发明试剂盒中PCR-酶切技术则结合了特异性PCR技术及酶切技术两者的优点，每份DNA样本用特异性引物即引物F/R于PCR反应管中进行特异性PCR扩增，通过一次PCR-酶切便可在几小时内同时检出基因MYH14c.5417位点C到A的突变情况；另外值得一提的是，本方法所用的引物均经过仔细设计，首先，正常和突变等位基因间不同的碱基在酶切过程中对特异性限制性内切酶形成的位点不同，因而大大提高了酶切的特异性；另外由正常对照和空白对照的产物可作为整个PCR反应的分子内控指标，从而避免假阴性结果的出现，提高检测结果的稳定性；通过调整不同引物的浓度和比例以及对PCR反应条件进行优化，以确保结果的特异性和稳定性。

3.应用本发明提供的试剂盒进行耳聋相关基因MYH14c.5417位点C到A突变检测，与其他检测方法相比，成本低，操作简单，结果判读直观，准确率高，对实验设备及操作人员无特殊要求，适合在一般医院、分子生物实验室开展，有临床应用价值，便于在全国范围内特别是欠发达地区进行耳聋相关基因MYH14c.5417位点C到A的突变大规模筛查和预防性检查。

4.本发明所提供的试剂盒可以应用到遗传性耳聋高发人群的产前和孕期筛查中，只需要按照常规手段从胚胎、胎儿羊水、绒毛膜或脐带血中获得样本DNA即可进行筛查，可以广泛的应用于优生优育的前期筛查中，降低遗传性耳聋的发病率。

附图说明

图1为酶切鉴定MYH14基因c.5417位点突变情况的凝胶电泳图；

图中1,2,4是患者PCR产物经酶切后的条带，有512bp、308bp和204bp的三条带，说明MYH14基因c.5417处发生了杂合突变；

3是家系中未患病的成员PCR产物经酶切后的条带，有308bp和204bp的两条带，说明MYH14基因c.5417处没有发生突变；

5为control样本，PCR产物经酶切后有308bp和204bp的两条带；

6为未进行酶切的样品只有一条512bp的条带；

7为DNA Marker；

图2MYH14基因c.5417测序峰部分截图；

图中1在MYH14基因c.5417位点出现了杂峰，说明MYH14基因c.5417发生了杂合突变，3及5峰图显示MYH14基因c.5417位点未发生突变。

具体实施方式

以下实施例中进一步定义本发明，根据以上的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明作出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。除特殊注明外，本发明所采用的均为本领域现有技术；

实施例1

1.1基因组DNA的提取(来源为血液)

1)将2ml血样加入5ml Buffer AP1,剧烈混匀；

2)加入1ml Buffer AP2，立即混匀，4630g离心15min；

3)上清转移至中量制备管中，开启负压，保持负压，加入7ml Buffer W1,8mlBuffer W2,4ml Buffer W2；

4)卸下中量管管头12000g离心2min；

5)加入0.4ml Elution buffer，室温静置5min，12000g离心2min，-20℃保存备用；

1.2基因组DNA的提取(来源为毛发)

1)在1.5ml离心管中加入250ul缓冲液GA，20ul蛋白酶K，20ul 1M DTT，混匀，从毛发根部毛囊处取1cm长的一段，与上述溶液涡旋混匀10sec；56℃孵育至少60min至样本完全溶解消化，期间每隔20min涡旋10sec混匀；

2)加入300ul缓冲液GB和1ul carrier RNA储存液，充分混匀；56℃水浴10min，期间每3min涡旋混匀10sec；加入300ul无水乙醇，充分涡旋混匀；

3)将上一步所得溶液和絮状沉淀加入吸附柱CR2中，12000rpm离心30sec，弃废液，将吸附柱放入收集管中；加入500ul缓冲液GD，12000rpm离心30sec，弃废液，将吸附柱放入收集管中；加入600ul漂洗液PW，12000rpm离心30sec，弃废液，将吸附柱放入收集管中，重复操作一次；

4)12000rpm离心2min，弃废液，将吸附柱置于室温2-5min，晾干残余漂洗液；将吸附柱置于干净的离心管中，加入20-50ul洗脱液TB，室温放置2-5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中；

1.3基因组DNA的提取(来源为羊水、绒毛膜、脐带血)

1)取不超过10mg的组织到1.5ml的离心管中，立即加入180μl缓冲液GA，室温放置，使离心管温度平衡到室温。加入20μl Proteinase K溶液，涡旋混匀10sec。在56℃孵育直到样本充分降解消化，需要时间大约30min到1h，期间每15min需要涡旋混匀；简短离心以收集附着在管壁及管盖的液体。

2)加入200μl的缓冲液GB和1μl Carrier RNA储存液，充分颠倒混匀，70℃放置10min，期间每3min涡旋混匀10sec，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的液滴。加入200μl的乙醇(96-100％)；如果室温超过25℃，请将乙醇置冰上预冷；轻轻颠倒混匀样品，室温放置5min，简短离心以去除管盖内壁的液滴。

3)取上一步所得溶液全部转入吸附柱CR2中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm离心30sec，弃废液；向吸附柱CR2中加入500μl缓冲液GD，12,000rpm离心30sec，弃废液；向吸附柱CR2中加入600μl漂洗液PW,12,000rpm离心30sec，弃废液，将吸附柱CR2放回收集管中。向吸附柱CR2中加入600μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm离心30sec，弃废液，将吸附柱CR2放回收集管中。12,000rpm离心2min，倒掉废液。

4)将吸附柱CR2置于室温放置2-5min，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。将吸附柱CR2转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加20-50μl洗脱缓冲液TB，室温放置2-5min，12,000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。

实施例2 PCR扩增目的片段

利用试剂盒内的特异性引物

上游引物：5'-GATGGTCTCGTGGACTTAT-3'，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

下游引物：5'-TGTGGAGGTCACCTTTCT-3'，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

目的产物长512bp；

DNA模板来源于实施例1中1.1的基因组DNA的提取(来源为血液)；

按照如下体系及程序进行PCR扩增：

PCR反应体系：

PCR反应程序：

4℃保存；

用1％的琼脂糖凝胶检测PCR产物的大小是否正确，并测产物浓度，电泳过程如下：

1)配胶(1％琼脂糖):称取3g琼脂糖溶于100ml 1xTBE液中；

2)溶胶：微波炉中加热至沸腾后取出；

3)凉胶：取出后凉至40℃左右；

4)铺胶：把100ml的胶液全部倒入平板中，插入梳尺；

5)上胶：将平板放入盛有1xTBE液的电泳槽中，液面距胶面1-2mm，拔下梳尺；

6)加样：将混有loading buffer的PCR产物加到胶孔中；

7)走胶：盖上电泳槽盖，检查正负极，开启电泳仪，调节电压100V跑胶；

8)定量：当电泳30min时，关闭电泳仪，小心取胶，放入成像仪拍照，结果获得了512bp的目标序列。

实施例3.酶切鉴定

将上步得到的PCR产物用限制性内切酶Eco130I进行酶切，体系如下：

用3％的琼脂糖凝胶进行检测，结果如下：

限制性内切酶Eco130I可以识别5’C/CWWGG3’序列,当MYH14基因c.5417处未发生突变时，限制性内切酶Eco130I可以将512bp的PCR产物片段切成308bp和204bp两个片段；发生杂合突变以后，胶图显示512bp、308bp和204bp的三条带；发生纯合突变以后，酶切位点消失，只有512bp一条带。

如图1所示，患者1，2，4经酶切后有512bp、308bp和204bp的三条带，说明MYH14基因c.5417处发生了杂合突变，家系中未患病的成员3及正常对照5有308bp和204bp的两条带，说明MYH14基因c.5417处没有发生突变，其中未加酶进行酶切的样品6只有一条512bp的条带，7为DNA Marker。

与此同时，我们将PCR产物进行了测序，测序结果与酶切结果完全一致，峰图如图2所示，这充分验证了利用本发明方法检测与耳聋相关基因MYH14c.5417C>A突变的可靠性与准确性。

序列表

<110> 山东省耳鼻喉医院

<120> 一种用于检测常染色体显性遗传性耳聋家系致聋基因突变的试剂盒

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 1

gatggtctcg tggacttat 19

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 2

tgtggaggtc acctttct 18

<210> 3

<211> 512

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 3

gatggtctcg tggacttatt aaagtaagca gaaaactatc caaaatgtta agacccaggg 60

ctggcagtgc tgtgggtgac aagtcaataa actattaata aaaatacaag ctaacatctg 120

ttgagtattt agtatgtttc aggctctgtg ctatgcgtgt gacaatcatc agtgcactta 180

attctcagag gtgcctggat ttacctacca ccttccctct gagactccac catgacatcc 240

ttccttcccc tcctgctaca ggtagagtca ctgaccacag agctgtcagc tgagcgcagt 300

ttctcagcca aggcagagag cgggcggcag cagctggaac ggcagatcca ggagctacgg 360

ggacgcctgg gtgaggagga tgctggggcc cgtgcccgcc acaagatgac cattgctgcc 420

cttgagtcta agttggccca ggctgaggag cagctagagc aagagaccag gtaggtgaga 480

gcggaggcca caggagaaag gtgacctcca ca 512

<210> 4

<211> 512

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 4

gatggtctcg tggacttatt aaagtaagca gaaaactatc caaaatgtta agacccaggg 60

ctggcagtgc tgtgggtgac aagtcaataa actattaata aaaatacaag ctaacatctg 120

ttgagtattt agtatgtttc aggctctgtg ctatgcgtgt gacaatcatc agtgcactta 180

attctcagag gtgcctggat ttacctacca ccttccctct gagactccac catgacatcc 240

ttccttcccc tcctgctaca ggtagagtca ctgaccacag agctgtcagc tgagcgcagt 300

ttctcagaca aggcagagag cgggcggcag cagctggaac ggcagatcca ggagctacgg 360

ggacgcctgg gtgaggagga tgctggggcc cgtgcccgcc acaagatgac cattgctgcc 420

cttgagtcta agttggccca ggctgaggag cagctagagc aagagaccag gtaggtgaga 480

gcggaggcca caggagaaag gtgacctcca ca 512

Claims

1.一种用于检测常染色体显性遗传性耳聋家系致聋基因突变的试剂盒，主要包括：特异性引物，PCR混合液，酶切混合液，限制性内切酶，阳性对照样本及阴性对照样本；其特征在于：

其中特异性引物包括：

限制性内切酶为限制性内切酶Eco130I，此限制性内切酶可以识别5C/CWWGG3’序列；

阳性标本对照是含有MYH14基因c.5417的C到A杂合突变的DNA片段；

阴性标本对照是不含此突变位点能发生酶切的DNA片段。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的PCR混合液包括10×PCR buffer、2.5mM dNTP、Taq酶。