CN104212892A - 一种用于检测耳聋基因突变的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医学领域，具体涉及一种用于检测耳聋基因突变的试剂盒，该试剂盒中包括特异性引物、PCR混合液及酶切反应混合液等，其中发明人针对耳聋基因专门设计了对应的特异性引物，利用该试剂盒可以快速的检测出患者体内WFS1基因c.2389的G到A突变位点，从而更好的在全国范围内特别是欠发达地区进行耳聋相关基因突变的大规模筛查和预防性检查，且检测成本低，操作简单，准确率高。

Description

一种用于检测耳聋基因突变的试剂盒

技术领域

本发明涉及医学领域，具体涉及一种用于检测耳聋基因突变的试剂盒。 

背景技术

听觉障碍是指听觉系统中的传音、感音以及对声音的综合分析的各级神经中枢发生器质性或功能性异常，而导致听力出现不同程度的减退，习惯称为耳聋。耳聋不仅影响个人的生活质量，而且给家庭和社会带来了沉重的负担。据估计全球高达2.78亿人有听力障碍，中国约有2780万患者，占全球患者的10％左右。导致听力损失的病因很多，如年龄增长，噪声暴露，使用耳毒性药物及基因改变等。研究发现，遗传学作用在听力障碍形成的机制中发挥着重要作用。在过去的20年里，遗传性耳聋基因的定位和识别方面取得了巨大的进步。到目前为止，针对非综合征型耳聋共有133个基因座(55显性和78隐性)和77个基因(30个显性和47个隐性)已被确定，但其致病机制仍需进一步研究，同时，还有大量与遗传性耳聋相关的基因未被发现。 

WFSl基因最早是由Strom1等人在1998年发现的，由于它是Wolfram综合征的致病基因，故被命名为wolframin基因(WFSl)。WFS1基因的纯合或复合杂合突变均可导致常隐遗传的Wolfram综合征，Wolfram综合征又称为糖尿病一视神经萎缩一听力减退一尿崩症综合征，其主要症状为糖尿病、视神经萎缩、耳聋及尿崩症，主要累及中高频率听力受损。它病变的特点是神经进行性退变，以轴突膨胀为特征的轴突营养不良。研究发现，WFS1基因的杂合突变可导致常染色体显性遗传非综合征性低频耳聋，目前已确定28个与之相关的突变位点。 

WFSl基因定位于人的染色体4p16上，含33.4kb个碱基，包括8个外显子，其编码的蛋白是Wolframin蛋白，含有890个氨基酸，分子量约为100KDa，包含10个跨膜区域，中间为疏水区域(氨基酸330～650)，N端有一个亲水的部分位于细胞质外，C端部分位于细胞质内。该蛋白是完整的内糖苷酶H敏感的膜糖蛋白，主要存在于内质网中，可以诱发位于内质网膜的离子通道活动，引起细胞内Ca²⁺浓度增加，Wolframin蛋白功能失常可以引起细胞功能状态异常，甚至死亡。 

到目前为止，针对现有已知位点，检测突变位点的方法有直接测序法，荧光定量PCR法，基因芯片法等，其中直接测序法是鉴定突变的黄金标准，但该操作繁琐，费用昂贵限制了它的广泛应用。因此急需一种快速、简便、准确、经济的基因突变检测方法，来满足临床上对聋病患者WFS1基因突变筛查工作的需要。 

发明内容

本发明的发明人正是针对现有技术的研究情况，首先从WFS1基因上发现了一个新突变位点c.2389的G到A的突变，并确定其为WFS1基因新突变位点，一般带有该突变的患者均患有重度到极重度非综合征性全频聋，基于这一发现，发明人进一步设计了特异性引物及应用该引物的试剂盒，利用该试剂盒可以快速的检测出患者体内WFS1基因c.2389的G到A突变位点，从而更好的在全国范围内特别是欠发达地区进行耳聋相关基因突变的大规模筛查和预防性检查，且检测成本低，操作简单，准确率高。 

发明人首先对我国一个患有耳聋的中国家系进行了研究，这个家系有六代共117位成员，其中患病的有26位，他们患有重度到极重度非综合征性全频聋，发明人对耳聋患者进行了外显子测序,发现了WFS1基因上的一个新突变位点c.2389的G到A的突变位点，并且通过酶切技术对20名家系成员及200例正常对照进行此突变点的排查，发现被采集的13位患者均有WFS1基因c.2389G到A的杂合突变，家系中7位正常者及200例正常对照均不携带此突变，同时我们对含有WFS1基因c.2389位点的片段进行了桑格测序，测序结果与酶切结果完全吻合；进一步验证了该突变位点的存在以及其致病性。 

在确定了上述突变位点之后，发明人进一步的设计开发了检测耳聋相关基因WFS1c.2389的G到A的位点突变的试剂盒，本试剂盒主要包括以下几部分：特异性引物，PCR混合液， 酶切混合液，限制性内切酶，阳性对照样本及阴性对照样本； 

其中特异性引物包括正向引物F:5'-AAGTTTGAGATTACCGTGGGC-3'，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示；反向引物R:5'-CGACAGGAATGGGAAGAAAA-3'，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示； 

PCR混合液包括10×PCR buffer、2.5mM dNTP、Taq酶； 

酶切混合液为10×NEB Buffer； 

限制性内切酶包括限制性内切酶AatII，此限制性内切酶可以识别5’GACGT/C3’序列； 

阳性对照样本是含有WFS1基因c.2389的G到A的杂合突变不能发生酶切的DNA片段； 

阴性对照样本是不含此突变位点能发生酶切的DNA片段； 

发明人同时提供了利用该试剂盒进行检测的具体步骤如下: 

1.基因组DNA的提取：利用现有技术从血液、毛发等样本中提取的基因组DNA，均可用此试剂盒实现对WFS1基因c.2389的G到A的突变位点的检测； 

2.目的片段的扩增：利用试剂盒中特异性引物扩增含有WFS1基因c.2389位点的DNA片段，这段PCR产物长345bp，其中未突变的片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，突变后的片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示； 

3.将上述PCR产物用限制性内切酶AatII进行酶切； 

4.酶切产物的鉴定：利用3％琼脂糖凝胶进行电泳，通过酶切产物的大小判断突变位点的有无。 

采用本发明提供的试剂盒检测耳聋相关基因WFS1c.2389的G到A的突变时，结合特异性PCR技术和酶切技术，每份DNA样本分别用特异性引物于PCR反应管中进行普通PCR扩增，然后进行突变位点处的酶切，通过一次PCR便可在几小时内检出耳聋相关基因WFS1c.2389的G到A的突变，而且杂合突变或者纯合突变也可一目了然，其主要判定标准为，对于杂合突变中只有一条发生突变的基因，故此在利用本发明的试剂盒进行酶切时会产生345bp、74bp和271bp的三条带；而对于纯合突变而言，由于两条基因均发生了突变，故此在利用本发明的试剂盒进行酶切时会产生345bp这一条条带；而对于没有发生突变的情况，则在利用本发明的试剂盒进行酶切时会产生74bp和271bp两条条带；这样就可以进行清楚的判定了；同时，阴性对照与阳性对照使检测加过更加准确、可信。 

用本发明所开发试剂盒具有以下的优点： 

1.对待检样本没有苛刻要求：患者的血液、组织、毛发等用自制试剂或者试剂盒提取的基因组DNA均可用此试剂盒进行检测，使检测更易进行； 

2.目前检测突变位点的方法有荧光定量PCR法，基因芯片检测法，直接测序法等，这些检测方法操作繁琐、检测费用偏高不易在临床进行推广。与这些方法相比较，本发明试剂盒中PCR-酶切技术则结合了特异性PCR技术及酶切技术两者的优点，每份DNA样本用特异性引物即引物F/R于PCR反应管中进行特异性PCR扩增，通过一次PCR-酶切便可在几小时内同时检出基因WFS1c.2389的G到A的突变情况；另外值得一提的是，本方法所用的引物均经过仔细设计，首先，正常和突变等位基因间不同的碱基在酶切过程中对特异性限制性内切酶形成的位点不同，因而大大提高了酶切的特异性；另外由正常对照和空白对照的产物可作为整个PCR反应的分子内控指标，从而避免假阴性结果的出现，提高检测结果的稳定性。通过调整不同引物的浓度和比例以及对PCR反应条件进行优化，以确保结果的特异性和稳定性。 

3.应用本发明提供的试剂盒进行耳聋相关基因WFS1c.2389的G到A突变检测，与其他检测方法相比，成本低，操作简单，结果判读直观，准确率高，对实验设备及操作人员无特殊要求，适合在一般医院、分子生物实验室开展，有临床应用价值，便于在全国范围内特别是欠发达地区进行耳聋相关基因WFS1c.2389的G到A的突变大规模筛查和预防性检查。 

附图说明

图1为酶切鉴定WFS1基因c.2389位点突变情况的凝胶电泳图； 

图中Ⅲ-9、Ⅲ-15、Ⅲ-20、Ⅳ-21、Ⅳ-43、Ⅴ-4、Ⅴ-7、Ⅴ-10、Ⅴ-12是患者PCR产物 经酶切后的条带，有345bp、74bp和271bp的三条带，说明WFS1基因c.2389处发生了杂合突变； 

Ⅲ-16、Ⅲ-18、Ⅳ-7是家系中未患病的成员PCR产物经酶切后的条带，有74bp和271bp的两条带，说明WFS1基因c.2389处没有发生突变； 

control样本PCR产物经酶切后有74bp和271bp的两条带； 

未加酶进行酶切的样品(undigested)只有一条345bp的条带； 

图2WFS1基因c.2389测序峰部分截图； 

图中Ⅳ-8在WFS1基因c.2389处出现了杂峰，说明WFS1基因c.2389发生了杂合突变， 

Ⅳ-7及control峰图显示WFS1基因c.2389处未发生突变。 

具体实施方式

以下实施例中进一步定义本发明，根据以上的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明作出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。除特殊注明外，本发明所采用的均为本领域现有技术； 

实施例1 基因组DNA的提取 

1)将2ml血样加入5ml Buffer AP1,剧烈混匀； 

2)加入1ml Buffer AP2，立即混匀，4630g离心15min； 

3)上清转移至中量制备管中，开启负压，保持负压，加入7ml Buffer W1,8ml Buffer 

W2,4ml Buffer W2； 

4)卸下中量管管头12000g离心2min； 

5)加入0.4ml Elution buffer，室温静置5min，12000g离心2min，-20℃保存备用。 

实施例2 PCR扩增目的片段 

利用试剂盒内的特异性引物 

上游引物：5'-AAGTTTGAGATTACCGTGGGC-3'，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示； 

下游引物：5'-CGACAGGAATGGGAAGAAAA-3'，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示； 

目的产物长345bp； 

按照如下体系及程序进行PCR扩增： 

PCR反应体系： 

PCR反应程序： 

用1％的琼脂糖凝胶检测PCR产物的大小是否正确，并测产物浓度，电泳过程如下： 

1)配胶(1％琼脂糖):称取3g琼脂糖溶于100ml 1xTBE液中； 

2)溶胶：微波炉中加热至沸腾后取出； 

3)凉胶：取出后凉至40℃左右； 

4)铺胶：把100ml的胶液全部倒入平板中，插入梳尺； 

5)上胶：将平板放入盛有1xTBE液的电泳槽中，液面距胶面1～2mm,拔下梳尺； 

6)加样：将混有loading buffer的PCR产物加到胶孔中； 

7)走胶：盖上电泳槽盖，检查正负极，开启电泳仪，调节电压100V跑胶； 

8)定量：当电泳30min时，关闭电泳仪，小心取胶，放入成像仪拍照，结果获得了345bp的目标序列。 

实施例3.酶切鉴定 

将上步得到的PCR产物用限制性内切酶AatII进行酶切，体系如下： 

用3％的琼脂糖凝胶进行检测，结果如下： 

限制性内切酶AatⅡ可以识别5’GACGT/C3’序列,当WFS1基因未发生c.2389G>A突变时，限制性内切酶AatⅡ可以将345bp的PCR产物片段切成74bp和271bp两个个片段，而发生突变以后，酶切位点消失，不能切开，胶图显示只有一条345bp的条带； 

如图1所示，患者Ⅲ-9、Ⅲ-15、Ⅲ-20、Ⅳ-21、Ⅳ-43、Ⅴ-4、Ⅴ-7、Ⅴ-10、Ⅴ-12经酶切后有345bp、74bp和271bp的三条带，说明WFS1基因c.2389处发生了杂合突变，家系中未患病的成员Ⅲ-16、Ⅲ-18、Ⅳ-7及正常对照有74bp和271bp的两条带，说明WFS1基因c.2389处没有发生突变，其中未加酶进行酶切的样品(undigested)只有一条345bp的条带。 

与此同时，我们将PCR产物进行了测序，测序结果与酶切结果完全一致，峰图如图2所示，这充分验证了利用本发明方法检测与耳聋相关基因WFS1c.2389G>A突变的可靠性与准确性。 

Claims (3)

1.一种用于检测耳聋基因突变的试剂盒，主要包括：特异性引物，PCR混合液，酶切混合液，限制性内切酶，阳性对照样本及阴性对照样本；其特征在于：

其中特异性引物包括正向引物F:5'-AAGTTTGAGATTACCGTGGGC-3'，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示；反向引物R:5'-CGACAGGAATGGGAAGAAAA-3'，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

限制性内切酶为限制性内切酶AatII，此限制性内切酶可以识别5’GACGT/C3’序列；

阳性对照样本是含有WFS1基因c.2389的G到A的杂合突变不能发生酶切的DNA片段；

阴性对照样本是不含此突变位点能发生酶切的DNA片段。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的PCR混合液包括10×PCR buffer、2.5mM dNTP、Taq酶。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的酶切混合液为10×NEB Buffer。