CN1316038C - 检测与人类遗传性耳聋相关的wfs1基因突变的试剂盒 - Google Patents

Abstract

一种检测与遗传性耳聋相关的WFS1基因第2328位碱基或该基因编码区的第2158个碱基的A→G突变的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测WFS1基因第2328位碱基或该基因编码区的第2158个碱基的A→G突变的试剂和任选的用于扩增WFS1基因的试剂。

Description

检测与人类遗传性耳聋相关的WFS1基因突变的试剂盒

发明领域

本发明涉及检测与人类遗传性耳聋相关的WFS1基因突变，尤其WFS1基因2328A→G突变的试剂盒。

背景技术

Wolframin基因位于人类染色体的4p16上，含33.4kb个DNA碱基，包括8个外显子(exon)。exon₁未被编码，exon_2-7为小编码片断，exon₈为最大的外显子，有2.6kb长。大约有10个跨膜片断。

Wolframin蛋白质由890个氨基酸组成，分子量约为100kDa，是一种对糖苷内切酶敏感的膜糖蛋白。蛋白质结构中间有个疏水的区域(氨基酸330-650)，由9个螺旋状的跨膜部分构成，N端有一个亲水的部分位于细胞质外，C端部分位于细胞质内(参看图3)。65％存在于浆膜，26％存在于内质网中，还有4％存在于线粒体或细胞核中。荧光免疫染色显示：在转染的COS-7细胞中，WFS1蛋白位于细胞质中，呈现特征性的网状结构，并与内质网有交迭。在鼠的脑组织中，无论在蛋白质和mRNA水平，WFS1在海马回、杏仁核、嗅神经核以及不规则皮质表层的神经元中浓集。

WFS1基因首先是Wolfram综合征(WS：Wolfram Syndrome)的致病基因。对于WFS1基因的研究开始于对Wolfram综合征的认识。WS(Wolfram Syndrome)即Wolfram综合征，由Wolfram和Wagener于1938年首次提出，是一种罕见的常染色体隐性遗传的神经变性疾病。因为WS患者患有尿崩症(DiabetesInsipidus)、糖尿病(Diabetes mellitus)、视萎缩(Optic Atrophy)、耳聋(Deafness)四大典型并发病症，取其各病英文名称字首，又被称为DIDMOAD。WFS1基因突变可以引起神经的进行性退变性病变，病变为以轴突膨胀为特征的轴突营养不良，直接导致患者出现Wolfram综合征的种种复杂症状。

2001年，WFS1基因的突变被证实是导致低频感音神经性听力损失(LFSNHL)的原因之一，为DFNA6/14/38基因座位的致病基因。

自2001年以后，各国科学家通过对发现的不同家系的WFS1基因研究，不断发现了LFSNHL的突变位点。Bespalova 2001年，研究了多个家系，共报告了5个突变位点，它们是：2266C＞T T699M；2146G＞A A716T；2505G＞AV779M；2656T＞C L829P，2662G＞A G831D。Komatsu 2002年通过研究日本的家系，报告了：K634T。在这些突变中都未发现可以引起蛋白质的早熟、合成提前终止的突变。因此，对于WFS1基因突变与LFSNHL相关性的深入研究有望发现WFS1基因突变的真正致病机制。WFS1基因与Walfram综合征有关的突变有64％是失活的，因此可以说：只有活化的WFS1基因突变才是导致低频听力损失的原因。

WFS1基因突变的发现开辟了一个令人惊奇的新领域，为耳聋患者打开一扇新的诊断、治疗的大门。目前，通过国内外同行的研究仅发现了6个WFS1基因突变位点，通过发现新的突变位点有利于进一步认识WFS1基因对于正常听觉生理功能意义，更加深入的了解其与耳聋的关系。在以前所发现的6个突变位点中，都不是在中国人群中发现的，而我们此次首次在中国人群中发现WFS1基因新的突变位点，这提示这个突变位点可能是在中国人群中特有的突变，并且有可能存在着突变热点，这将有利于将来在临床上开展聋病患者的WFS1突变筛查工作，为耳聋患者诊断和治疗提供服务。

发明内容

发明人选取WFS1基因作为研究对象，通过在47名各种感音神经性耳聋患者和53名正常听力对照组中进行筛查，发现一个与耳聋有关的WFS1基因新的突变位点(2328A→G 720I→V，即编码区的第2158个碱基)。这一突变位点在53名对照组中均没有发现这一突变，说明这一突变位点与耳聋有关，这一突变位点位于Wolramin的细胞膜内区域。该发现从而为耳聋患者的诊断提供了一种新的途径，以及为耳聋患者提供了基因治疗的可能。

因此，根据，本发明提供了：

1、一种检测与遗传性耳聋相关的WFS1基因第2328位碱基或该基因编码区的第2158个碱基的A→G突变的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测WFS1基因第2328位碱基或该基因编码区的第2158个碱基的A→G突变的试剂和任选的用于扩增WFS1基因的试剂。

2、根据项1所述的试剂盒，其中所述用于检测WFS1基因第2328位碱基或该基因编码区的第2158个碱基的A→G突变的试剂为测序用试剂。

3、根据项1所述的试剂盒，其中所述用于检测WFS1基因第2328位碱基或该基因编码区的第2158个碱基的A→G突变的试剂为限制性片段长度多态方法用试剂。

4、根据项1所述的试剂盒，其中所述用于检测WFS1基因第2328位碱基或该基因编码区的第2158个碱基的A→G突变的试剂为探针杂交检测用试剂。

5、根据项4所述的试剂盒，其中所述探针能够与序列表中序列1杂交。

6、根据项4所述的试剂盒，其中所述探针为WFS1等位基因特异性探针。

正常WFS1基因的编码区2041-2220的碱基序列如序列表中序列1所示，其编码的氨基酸序列如序列2所示。突变基因的编码区2041-2220的碱基序列如序列表中序列3所示，其中编码区的第2158个碱基由A突变为G，其编码的氨基酸序列如序列4所示，其中第720位氨基酸由异亮氨酸突变为缬氨酸。图1显示了WFS1编码区氨基酸与核酸碱基的对照。

附图简述

图1：WFS1编码区氨基酸与核酸碱基的对照：突变位于WFS1的细胞膜内区。

图2：2.WFS1测序结果：1.3 WFS1突变1测序结果比对：(左图为正常序列，右图为突变序列)*注：测序图显示的序列为mRNA的互补序列。

图3：Wolframin结构示意图。

图4：不同连接蛋白氨基酸序列进化研究：(提示突变位于高度保守区域)。多种Wolframin蛋白氨基酸序列序列比对，箭头所指为720I位点，可见所有蛋白中该位点均为异亮氨酸(I)，说明为高度保守区。

图5：PCR反应条件。

在发明人进行的研究中，发明人收集耳聋遗传资源，建立遗传性耳聋资源库。通过聋病门诊收集各种感音神经性耳聋患者，在患者自愿的前提下，签署知情同意书后，留取5-10ml血样，并建立门诊病历资料库，详细记录患者病情、家系中的发病情况以及联系方式。应用酚氯仿的方法提取基因组DNA，定量后入库，-20℃保存，每份DNA样品均详细对应于登记的患者临床资料。应用在线引物设计软件Primer3设计引物(WFS1-F：GTC TGT AGTGTG CCC CTG CT，WFS1-R：CTC CAG GAT GGT GCT GAA CT)，包含WFS1整个编码区，应用PCR扩增。PCR产物直接测序：测序引物与PCR扩增引物相同，正反向测序(例如应用ABI公司3730DNA测序仪)。得到的序列与Genebank中的序列比较确定了WFS1突变位点。按正常阅读框进行翻译以确定Wolframin的突变位点。

本发明所述的突变可以通过本领域已知的任何检测方法来进行，例如扩增人体中全长或部分WFS1基因以获得扩增序列，然后对扩增序列测序来检测，或通过将从组织中分离出来的WFS1基因与WFS1基因探针杂交来检测，或通过从组织中分离出的WFS1基因与WFS1等位基因特异性探针杂交来检测所述碱基的改变，或通过限制性片段长度多态性来检测所述碱基的改变。

所用的杂交探针可以是与正常的WFS1核苷酸序列杂交，或与突变的核苷酸序列杂交，或与它们的互补序列杂交的探针。这些探针可以用放射性同位素，发色物质或荧光物质标记。在进行探针检测前，优选PCR扩增目标基因。尤其，利用等位基因特异探针，可以筛查已被确定的突变是否存在。

另外，还可以通过检测该基因的表达产物，如蛋白和mRNA来检测该基因的突变。

本发明还提供一种检测耳聋相关基因WFS1——(720I→V)突变位点的试剂盒，其内装有一个或多个容器，容器内装有用以检测WFS1基因(720I→V)突变的一种或多种成分，与之同时提供的可以是经政府药物管理机构审核的、有关药品或生物制品制造、使用及销售的信息。例如，采用PCR扩增后，直接检测样品中WFS1基因720I→A突变位点的试剂盒。可含有扩增引物，dNTP，用于PCR反应的DNA聚合酶及其缓冲液等的一种或多种。本领域技术人员已知，以上组分仅是示意性的，例如，所述的引物可以依据已知的核苷酸序列设计，通常为15-30个碱基，GC含量为45-50％左右，在适当的温度下与末拌特异性结合，其可以利用专门的计算机程序设计，所述的用于PCR反应的DNA聚合酶是能够用于PCR扩增的酶。并说明使用方法如下：

PCR扩增

用软件Primer 3对WFS1基因的编码区设计PCR引物反应条件为94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，退火温度62℃30秒，72℃延伸40秒，35个循环，反应结束后再72℃延伸7分钟，4℃保存。

PCR产物纯化

将含有PCR产物的MultiScreen-PCR板抽真空，加入去离子水，静置，随后将MultiScreen-PCR板置于混合器上震荡，纯化后的PCR产物重新溶解后至另一洁净的96孔板中。

测序反应及验证

以PCR引物作为测序引物进行测序反应，在ABI9700热循环仪上进行测序反应。反应结束后，延伸产物上样与ABI PRISM 3730DNA序列分析仪。将所得到的图谱进行分析。与Genebank中的标准序列比较可以发现突变位点。该试剂盒可简便快捷地检测WFS1——720I→A突变位点，从而应用于耳聋相关基因的检测和耳聋治疗方法中。例如，在检测为发生了突变之后，可以将正常基因导入携带突变基因的细胞并在其中表达，它可与内源性突变基因发生重组，从而可进行基因治疗。

WFS1基因——720I→V突变检测方法实施例

实施例1

一、WFS1基因编码区的PCR扩增

1.对象：聋病门诊收集的非综症型低频性感音神经性耳聋47例，正常对照53例。对所有参加者详细调查其病史以及家族史，并对其进行体格检查，耳科检查包括耳镜检查、听力学评估。在签署知情同意书以后每人采集血样5-10ml。

2.基因组DNA提取：采用酚氯仿抽提法。

第一天

1.抗凝血用PBS作1倍稀释。

2.在离心管中加入2倍体积的淋巴分离液(18℃-28℃)，上面铺一层1倍体积已稀释的血液，室温离心1000×g  20分。

3.吸弃上清，小心吸出中间有核细胞层，转入5mlEp管中，5000×g，10分钟，然后用PBS洗一次。5000×g  10分。

4.将细胞悬于2mlTE缓冲液中，加10％的SDS至终浓度0.5％(100μl)，蛋白激酶k100-200μg/ml(10mg/ml)，50℃水浴3-5小时。

5.用酚氯仿提取。用等体积的饱和酚，加入混匀，离心5000×g  10分钟。

6.吸上清液至新离心管中，弃下层沉淀，加入等体积酚：氯仿混合物，混匀，5000×g  10分钟。

7.吸上清液至新离心管中，弃下层沉淀，加入等体积氯仿：异戊醇混合物，混匀，5000×g  10分钟。

8.吸上清液至新离心管中，弃下层沉淀，加入1/10体积的乙酸钠，混匀。

9.加入2.5倍体积的无水乙醇。

10.-20℃沉淀DNA过夜。

第二天

11.高速离心，10000×g，10分钟，4℃。

12.弃上清，加入75％乙醇2ml，高速离心10000×g，5分钟。

13.弃上清，吹干。

14.用TE缓冲液溶解，(400μl TE/5ml全血，600-800 TE/10ml全血)

15.分装。1％琼脂糖电泳和分光光度计定量。

二、WFS1基因扩增——PCR反应条件

引物序列：WFS1-F：GTC TGT AGT GTG CCC CTG CT

        WFS1-R：CTC CAG GAT GGT GCT GAA CT

反应体系：25ul

名称	原液浓度	加样量(μl)	体系终浓度
				BufferdNTPPrimersAmpliTaq poiymeraseTemplate	10×2.5mM10μM5units/μl100ng/μl	2.53.011μl1	1×400μM7.5pmol1U/μl10ng/μl

ddH₂O补齐至25μl。

其中Buffer、dNTP、primers、Tag酶为上海生工公司合成。

反应条件：反应在ABI公司9700热循环仪上进行，反应条件如图5所示。

实施例2

PCR产物直接测序

PCR产物纯化

1.向装有PCR产物的96孔板中加入50微升无菌水，混匀。

2.将其转移到Millipore纯化板中，放到真空泵上抽滤约3分钟，看到纯化板中没有水即可。

3.向纯化板中再次加入50微升的去离子水，继续抽滤，直到纯化板中没有水为止。

4.将纯化板从真空泵上取下，向板中加入20微升的去离子水，静置15分钟，再震荡15分钟，然后吸到一新96孔板内。

5.保存在-20度冰箱中。

电泳定量

1.样品准备

DNA(2μl)+上样缓冲液(6μl)共8μl×96

取一96孔点样板，每孔先加上样缓冲液6ul，在从装有质粒的腔板中，每孔用排枪移出质粒DNA(2μl)，转移到点样板上、混匀、用离心机甩一下(腔板孔号要与96孔点样板一一对应)。

2.流程

1)配胶(0.8％琼脂糖)：称取2.4g琼脂糖，悬浮于300ml 0.5×TBE中(500ml锥形瓶)。

2)溶胶：微波炉中高火加热至沸，持续沸腾数分钟，注意不要沸出，其间取出混匀。

3)凉胶：待胶完全溶解，从微波炉中取出，凉至60℃左右，加入1滴EB(约10μl，10mg/ml)，摇匀。

4)铺胶：平板两端用胶布封严，把250ml胶液全部倒入平板，插入梳尺。

5)上胶：将平板放入已盛有电泳液(0.5×TBE，液面距胶面1至2mm)的电泳槽中，拔下梳尺。

6)加样：用排枪按规定格式加样，最后用单枪加入DNA标准品。

7)走胶：盖上电泳槽盖，检查正负级，开启电泳仪，调节电泳电压。

8)定量：当溴酚蓝走离加样孔1.5至2cm处，关闭电泳仪，小心取胶，放入摄相仪照相，定量。(涉及Quantity One软件的使用)

λDNA/HindIII经过电泳后，有6条带可见，片段长度分别是23Kb，9Kb，6Kb，4Kb，2.1Kb，2Kb，通常以第三条带(6Kb)为标准定量，根据λDNA/HindIII的总浓度是500ng/μl，可以算得第三条带的浓度为62ng/μl，然后再依次定量，用去离子水将模板浓度调整至100ng/μl。

λDNA/HindIII电泳条带见下：

23K

9K

6K

4K

2K

1K

单条带浓度＝DNA标准总浓度×单条带片段长度/DNA标准全长

例：第三条带浓度＝500ng/μl×6Kb/48.5kb＝62ng/μl

● DL2000经过电泳后，有6条带可见，片段长度分别是2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp而构成，DL2000的总浓度是300ng/5μl。一般取3μl+5μl(溴酚蓝)电泳。每条带的DNA量约为30ng。

实施例3

测序反应-BigDye 3.1测序反应

1.测序反应所需试剂应为新鲜配制，需要经高压灭菌的试剂必须灭菌后方可使用。测序反应所需的器材(如384孔板、tip头等)同样应为洁净无菌的。

2.为了保证测序样本及反应试剂的新鲜，加样时应在冰上操作。

3.目前的反应体系为5μl，各种试剂加入量如下：

模板	PCR产物	200-500bp	3-10ng
				500-1000bp	5-20ng
		1000-2000bp	40-100ng
				Double stranded plasmid		100-200ng
	BigDye v3.1						0.25μl
5×buffer(Tris-HCl pH9.0，MgCl2)				0.875μl(Kit)
			引物			3.2pmol
用无菌水补至5ul

4.样品放于PCR仪上做如下反应：

步骤	作用
		1	96℃，2分钟
2	重复以下程序30个循环：●    96℃，10秒钟；●    50℃，5秒钟；●    60℃，4分钟
		3	在4℃下保持直到准备纯化

5.反应完的样品要及时从PCR仪上取下，短时间会纯化的样品放置于4℃冰箱中，超过一天以上才能纯化的样品放置于-20℃冰箱冷冻。

测序纯化-BigDye3.1测序纯化

1.使用机械手程序15在384孔板的每个孔中加入20μl 80％乙醇，4,000rpm离心30min；将样品板放在折好的纸巾上，在离心机中倒甩，倒甩时速率不能超过1000rpm，

2.在每孔中加入30μl 70％乙醇，4,000rpm离心10min，倒甩；

3.重复第2步的操作；

4.重复第2步的操作；

5.将样品板放于干净的抽屉中，避光干燥30min；

6.加入5ul甲酰胺，封膜，离心后置于-20℃冰箱中；

7.上机器前95℃变性5分钟，放置冰上2分钟，离心后上样。

测序结果如图2所示。突变存在于第2328位碱基(编码区的第2158位，A→G)。

实施例4

突变位点进化研究

1.突变分析：应用DNAStar(Lasergene inc.)软件包中的SeqmanTM软件进行序列对比分析。将测序得到的序列与NCBI检索到的标准序列进行比对，找出突变序列。

2.进化研究：在数据库中找出各种不同物种的4种Wolframin蛋白氨基酸序列，应用ClustalX软件进行比对分析。通过研究发I760位点在Wolramin蛋白家族中高度保守(参看图4)。

实施例5

检测耳聋相关基因WFS1——2328A→G突变位点试剂盒及其应用

1.试剂盒含有：

扩增用引物：WFS1-F：GTC TGT AGT GTG CCC CTG CT

         WFS1-R：CTC CAG GAT GGT GCT GAA CT

PCR扩增用Taq酶5u/μl

10×缓冲液(含15ml MgCl₂)

dNTP    2Mm

Big-Dye mix

2.使用方法：

主要包括如下步骤：

A：提取DNA，利用上述引物，进行PCR反应；

B：PCR反应产物纯化后直接测序，将所得的序列与Genebank中的标准序列比较确定突变位点的存在。

C：按正常阅读框进行翻译以确定Cx31氨基酸突变位点。

具体方法参见实施例1、2、3。

应理解，在阅读了本发明的上述内容以后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，但改动或修改的等价形式同样落在本申请权利书所限定的范围内。

检测与人类遗传性耳聋相关的WFS1基因突变的方法

                       SEQUENCE LISTING

<110>北京诺赛基因组研究中心有限公司

<120>检测与人类遗传性耳聋相关的WFS1基因突变的方法

<130>

<160>4

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>180

<212>DNA

<213>人

<220>

<221>CDS

<222>(2041)..(2220)

<223>

<400>1

acc aac atg gcg cgc acc cag atc ctc tgc agc cac ctg gag ggc cac    2088

Thr Asn Met Ala Arg Thr Gln Ile Leu Cys Ser His Leu Glu Gly His

681                685                  690                 695

agg gtc acg tgg acc ggc cgc ttc aag tac gtc cgc gtg act gac atc    2136

Arg Val Thr Trp Thr Gly Arg Phe Lys Tyr Val Arg Val Thr Asp Ile

            700                 705                 710

gac aac agc gcc gag tct gcc atc aac atg ctc ccg ttc ttc atc ggc    2184

Asp Asn Ser Ala Glu Ser Ala Ile Asn Met Leu Pro Phe Phe Ile Gly

        715                 720                  725

gac tgg atg cgc tgc ctc tac ggc gag gcc tac cct                    2220

Asp Trp Met Arg Cys Leu Tyr Gly Glu Ala Tyr Pro

    730                 735                 740

<210>2

<211>60

<212>PRT

<213>人

<400>2

Thr Asn Met Ala Arg Thr Gln Ile Leu Cys Ser His Leu Glu Gly His

681               685                   690                 695

Arg Val Thr Trp Thr G1y Arg Phe Lys Tyr Val Arg Val Thr Asp Ile

            700                 705                 710

Asp Asn Ser Ala Glu Set Ala Ile Asn Met Leu Pro Phe Phe Ile Gly

        715                 720                  725

Asp Trp Met Arg Cys Leu Tyr Gly Glu Ala Tyr Pro

    730                 735                 740

<210>3

<211>180

<212>DNA

<213>人

<220>

<221>CDS

<222>(2041)..(2220)

<223>

<400>3

acc aac atg gcg cgc acc cag atc ctc tgc agc cac ctg gag ggc cac    2088

Thr Asn Met Ala Arg Thr Gin Ile Leu Cys Ser His Leu Glu Gly His

681               685                   690                 695

agg gtc acg tgg acc ggc cgc ttc aag tac gtc cgc gtg act gac atc    2136

Arg Val Thr Trp Thr Gly Arg Phe Lys Tyr Val Arg Val Thr Asp Ile

            700                 705                 710

gac aac agc gcc gag tct gcc gtc aac atg ctc ccg ttc ttc atc ggc    2184

Asp Asn Ser Ala Glu Ser Ala Val Asn Met Leu Pro Phe Phe Ile Gly

        715                 720                   725

gac tgg atg cgc tgc ctc tac ggc gag gcc tac cct                    2220

Asp Trp Met Arg Cys Leu Tyr Gly Glu Ala Tyr Pro

    730                 735                 740

<210>4

<211>60

<212>PRT

<213>人

<400>4

Thr Asn Met Ala Arg Thr Gln Ile Leu Cys Ser His Leu Glu Gly His

681               685                   690                 695

Arg Val Thr Trp Thr Gly Arg Phe Lys Tyr Val Arg Val Thr Asp Ile

            700                 705                 710

Asp Asn Ser Ala Glu Ser Ala Val Asn Met Leu Pro Phe Phe Ile Gly

        715                 720                  725

Asp Trp Met Arg Cys Leu Tyr Gly Glu Ala Tyr Pro

    730                 735                 740

Claims (6)

1、一种检测与遗传性耳聋相关的WFS1基因第2328位碱基或该基因编码区的第2158个碱基的A→G突变的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测WFS1基因第2328位碱基或该基因编码区的第2158个碱基的A→G突变的试剂和任选的用于扩增WFS1基因的试剂。

2、根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述用于检测WFS1基因第2328位碱基或该基因编码区的第2158个碱基的A→G突变的试剂为测序用试剂。

3、根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述用于检测WFS1基因第2328位碱基或该基因编码区的第2158个碱基的A→G突变的试剂为限制性片段长度多态方法用试剂。

4、根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述用于检测WFS1基因第2328位碱基或该基因编码区的第2158个碱基的A→G突变的试剂为探针杂交检测用试剂。

5、根据权利要求4所述的试剂盒，其中所述探针能够与序列表中序列1杂交。

6、根据权利要求4所述的试剂盒，其中所述探针为WFS1等位基因特异性探针。

Images