CN100408698C - 用于确定大前庭水管综合症耳聋pds基因的引物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种可用于体外确定含有大前庭水管综合症IVS7-2A→G位点突变的引物制备方法。方法包括：根据PDS基因的IVS7-2突变位点A→G，设计能在包括IVS7-2位点(A→G)在内的上下游1-13个碱基范围内引入任意一个碱基替换突变的引物对，从而在扩增产物中能获得可鉴别IVS7-2野生型A位点与突变型G的新限制性内酶切位点。本发明还涉及由此方法所制备的引物、含有该引物的试剂盒或试剂或类似产品，以及利用该引物体外确定含有大前庭水管综合症IVS7-2A→G位点突变的方法。

Description

用于确定大前庭水管综合症耳聋PDS基因的引物

技术领域

本发明涉及一种用于体外确定大前庭水管综合症耳聋PDS基因突变的引物备的方法，具体地说，本发明提供一种用于确定大前庭水管综合症性耳聋PDS基因中IVS7-2A→G突变的引物制备方法。本发明还提供一种根据该方法而制备的引物及其试剂盒，以及该引物或试剂盒在体外确定大前庭水管综合症性耳聋PDS基因中IVS7-2A→G突变中的应用。

背景技术

新生儿耳聋的发病率为1-3/1000。造成耳聋的原因很多，一半以上的儿童期耳聋为遗传性耳聋，发病率为1/800-1/1000(王锦玲，“大前庭水管综合征与波动性听力损失”，听力学及言语疾病杂志，2003，11(2)：81-84)，由PDS基因(Pendred’s syndrome gene)突变引起的大前庭水管综合症是其中一种重要的类型。1978年，Valvassori和Clemis在对3700例颞骨连续分层扫描中发现有50例前庭水管扩大，将其命名为大前庭水管，又将临床上伴感音神经性听力损失等症状者称为“大前庭水管综合症”(larged Vestibular Aqueduct Syndrome，LVAS)。此病出生时可能听力正常，或伴有轻度至中重度的听力损失，患儿早期多有较好的语言能力，听力逐渐下降，听力下降的诱发因素多为头部外伤、颅内压增高、感冒等，因堕床、儿童玩耍或体育活动中的轻度碰撞可以造成明显的听力下降，故此病的早期发现并引入正确的生活监护措施可以有效地防止耳聋的发生和加重，使得此病成为一种可以预防的疾病(汪吉宝，“大前庭水管综合征”，中华耳鼻咽喉科杂志，2002，37：398-400)。

近年来国外的多项研究表明大前庭水管综合症与PDS基因突变有密切的关系(Campbell C，Cucci RA，Green GE，et al.Pendred Syndrome，DFNB4andPDS----identification for eight novel mutations and phenotype-genotype correlations.Human mutation，2001，17：403-411；Scott DA，Wang R，Kreman，et al.Functionaldifferences of the PDS gene product are associated with phenotypic variation inpatients with Pendred syndrome and non-syndromic hearing loss(DFNB4).HumanMolecular Genetics，2000，9：1709-1715)。PDS(SLC26A4)(Solute carrier family)基因含21个外显子，开放阅读框架2343bp，编码780个氨基酸的蛋白质Pendrin。Pendrin主要由疏水性氨基酸组成，属于离子转运体家族，研究表明其功能主要与碘/氯离子转运有关。PDS基因突变造成耳聋的遗传模式绝大部分属于常染色体隐性遗传方式，即父母是携带者，1/4的子女因遗传父母的两条突变的PDS基因而发病(隐性纯合体)，2/4的子女仅遗传父或母的一条突变基因而成为携带者(不发病的显性杂合体)，另1/4的子女则可能遗传父母的两条正常PDS基因而成为PDS基因野生型个体(显性纯合体)。

在我们针对的29例中国人大前庭水管病人的研究中，发现26例患者携带有不同的PDS突变，其中19例患者带有IVS7-2A→G突变，显示IVS7-2A→G突变是导致大前庭水管综合症性耳聋的重要原因。在来自内蒙古赤峰市的63名聋哑学生的PDS基因检测中发现5例IVS7-2A→G纯合突变，4例IVS7-2A→G杂合突变，突变率为14.28％，这9例患儿若能早期发现，可以及时地采取适当的生活监护措施防止外伤而保护听力，避免进入聋哑儿童的行列。在100名正常听力的中国人筛查中发现1例IVS7-2A→G杂合突变，从而估计中国正常人群中此突变的携带率为1％左右。

由我们的研究首先发现IVS7-2A→G是中国人大前庭水管患者中最热点的突变，具有相当高的发病率，但是在PDS的原始序列中，IVS7-2位点无合适的酶切位点来鉴别IVS7-2A→G突变和野生型序列，常规方法只能通过序列分析来鉴定此区域的突变，序列分析虽然是基因诊断的标准方法，但其成本高，需要昂贵的设备，操作复杂，技术要求高，并且耗时耗力，不适合筛查和推广使用。

因此目前需要一种简便易行的技术来满足对大前庭水管综合症性耳聋PDS基因IVS7-2A→G突变进行广泛筛查和快速诊断的需要。

发明内容

本发明是基于以下原理进行实施：利用导致大前庭水管综合症性耳聋的PDS突变基因中突变位点(即序列SEQ ID NO：1中第252位的IVS7-2A→G)，使用或不使用生物软件，设计特殊引物，人为地通过PCR在PDS基因中引入一个包括IVS7-2位点在内的新限制性内切酶位点，并通过待检样品PCR产物的限制性酶切结果，从而准确获得大前庭水管综合症性耳聋PDS基因IVS7-2A→G突变的检测结果。

因此，本发明第一个目的是提供一种用于体外确定含有大前庭水管综合症IVS7-2A→G位点突变的引物制备方法，包括：根据PDS基因的IVS7-2突变位点A→G(内含子7的方框内a为PDS IVS7-2位点，即SEQ ID NO：1中第252位，PDS IVS 7-2A-G突变即此位点碱基A发生碱基G替代突变，此突变为重要的剪切位点突变，可造成转录时外显子8的丢失)，使用或不使用生物软件，设计用于扩增PDS基因的IVS7-2位点的引物，其中该引物可在包括IVS7-2位点A→G在内的上下游1-13个碱基范围内引入一个碱基替换突变，从而能获得可鉴别IVS7-2野生型(A位点)与突变型(G)的新限制性酶切位点。

由于已知商品化的最短的限制性内切酶识别位点为4位(如CviJI，识别位点RGCY)，最长的限制性内切酶识别位点为13-14位(如Sfi I为13位，StySQI为14位)，因此能在包括IVS7-2位点(A→G)在内的上下游1-13个碱基范围内引入一个碱基替换突变的引物都可用于实现本发明。因此，所述上下游1-13个碱基范围优选是1-10个碱基，进一步优选是1-8个碱基，更优选是2-6个碱基，最优选是2-4个碱基。

本发明目的进一步提供可使用计算机引物设计软件程序进行设计上述引物的方法。所使用的软件程序包括但不限于：Genetool Lite程序(美国Biotools公司提供的软件)、Vector NTI、Oligo、Genestar、DNAMAN、DNASTAR、DNAtool、proteintool、Enzyme、pDRAW、Primer3、Primer5、Seq Convertor、DNAassist等等。

本发明的第二个目的是提供上述方法所制备的引物，包括正向引物(F1)和反向引物(R1)。其中引物长度范围在10-40bp，优选是15-35bp，更优选是18-32bp。本发明目的进一步提供一种由上述方法所制备的具体引物序列。引物序列包括：长度为30bp  的正向引物序列(SEQ  ID  NO：3)，5TGGAGTTTTTAACATCTTTTGTTTTATTCC 3′，其中3’端第二位引入T-C人为突变；和长度为20bp的反向引物序列(SEQ IDNO：4)，5′CCCTTGGGATGGATTTAACA3′。

本发明的第三个目的是提供含有上述引物的、并可用于体外确定大前庭水管综合症性耳聋的PDS突变基因的试剂盒或类似产品，包括：PCR扩增反应试剂；等比例混合的上述的正向引物和反向引物；新的限制性内切酶及其配套的缓冲液；阳性标本对照、阴性标本对照；以及使用说明书。其中上述试剂盒或类似产品，其主要功能在于可以将所有试剂集成在一个小盒内，使得核酸片段扩增、酶切鉴定可以在试剂盒或类似产品提供的试剂基础上顺序完成。

上述试剂盒或类似产品进一步还可包括用于提取血样DNA的试剂盒或试剂，这些试剂盒或试剂除了提取血样DNA的试剂外，其余组分都相同。I型试剂盒或试剂包括用于提取足根血样DNA的DNA裂解液的溶液I，其主要成分是Chelex(5％Chelex，0.1％SDS，1％NP40，1％Tween 20，ABI公司产品)；II型试剂盒或试剂包括用于提取外周血样DNA的试剂盒(上海华舜生物工程有限公司)。

本发明目的进一步提供了针对引入新限制性内切酶HpaII位点的试剂盒，包括：

1.如果需要，包括提取足根血或外周血样DNA的试剂或试剂盒；

2.PCR扩增反应试剂，包括dNTP、10XPCR缓冲液、Mg++、三蒸水、Taq酶；

3.等比例混合的正向引物(SEQ ID NO：3)和反向引物(SEQ ID NO：4)；

4.限制性酶HpaII及其配套的缓冲液；

5.阳性标本对照、阴性标本对照，以及

6.使用说明书。

本发明的第四个目的在于提供一种大前庭水管综合症性耳聋PDS基因IVS7-2A→G突变的体外确定方法，方法包括：利用上述的引物制备方法，设计用于扩增PDS基因的IVS7-2位点的引物，其中该引物可在包括IVS7-2位点(A→G)在内的上下游1-13个碱基范围内引入一个碱基替换突变，从而能获得可鉴别IVS7-2野生型(A位点)与突变型(G)的新限制性酶切位点；或直接利用上述方法制备的引物、或直接利用上述的试剂盒/类似产品，使用所述引物对待检样品进行扩增，由于正向引物3’端附近与扩增模板存在一个碱基的定点突变，但并不影响正向引物和反向引物的PCR效率，因此在野生型和突变型样品中可获得相同长度的扩增产物；使用所述新限制性内切酶对扩增产物进行酶切鉴定，其中野生型样品的扩增片段因不含突变的新酶切位点而不能被新限制性内切酶所酶切，而突变型样品的扩增产物因含有突变的新酶切位点而被酶切，从而鉴定出发生PDS基因的IVS7-2位点A-G突变的样品。

在上述方法中，所述上下游1-13个碱基范围优选是1-10个碱基，进一步优选是1-8个碱基，更优选是2-6个碱基，最优选是2-4个碱基。

在上述方法中，可进一步包括使用计算机引物设计软件程序进行设计上述引物的方法。所使用的软件程序包括但不限于：Genetool Lite程序(美国Biotools公司提供的软件)、Vector NTI、Oligo、Genestar、DNAMAN、DNAtool、Proteintool、Enzyme、pDRAW、Primer3、Primer5、Seq Convertor、DNAassist等等。

本发明目的更进一步提供涉及在PDS基因中引入新限制性内切酶HpaII位点的确定方法，方法包括：设计用于扩增PDS基因的IVS7-2位点的引物对(SEQID NO：3、4)，其中该引物可在包括IVS7-2位点(A→G)在内的上下游2-4个碱基范围内引入一个碱基替换突变，从而能获得可鉴别IVS7-2野生型(A位点)与突变型(G)的新限制性酶切位点HapII；如果需要，提取待检样品的DNA并获得扩增模板；使用上述引物对(SEQ ID NO：3、4)对扩增模板进行PCR扩增；在野生型和PDS IVS7-2A→G突变标本中均可扩增形成114bp扩增片段，实际PCR结果经琼脂糖电泳证实可以看到大于100bp的明亮条带，证明正向引物(SEQ ID

NO：3)3’端第二个碱基与模板异配并没有影响PCR的效率；对PCR产物进行HpaII酶切，其中PCR产物包含PDS IVS7-2位点，若模板为IVS7-2A→G突变型分子，则114bp的PCR产物存在HpaII酶切位点，HpaII酶切后获得83-85bp和29-31bp两组条带，若模板为PDSIVS7-2野生型分子，则114bp的PCR产物不存在HpaII酶切位点，不能被HpaII切开，酶切后仍是114bp一个条带；根据酶切电泳结果，可以确定待检样品中是否存在大前庭水管综合症性耳聋PDS基因IVS7-2A→G突变。

在上述涉及新制性内切酶HpaII位点的确定方法，其中引物对的设计可通过计算机引物设计软件来完成，如Genetool Lite程序(美国Biotools公司提供的软件)、Vector NTI、Oligo、Genestar、DNAMAN、DNAtool、Proteintool、Enzyme、pDRAW、Primer3、Primer5、Seq Convertor、DNAassist等等。

在上述涉及新限制性内切酶HpaII位点的确定方法中，其中样品DNA的提取和PCR、酶切可通过涉及引物对(SEQ ID NO：3或4)和新限制性内切酶HpaII位点的试剂盒或试剂来完成。

用本发明的方法检测PDS基因IVS7-2A→G突变与现有技术检测方法(测序法)相比有以下优点：

本发明的限制性内切酶的酶切法的操作步骤简单，所需时间为4小时，所用试剂均为常用生物化学试剂，成本低廉，所用的PCR仪和电泳设备均为分子生物实验室和检验实验室基本设备，这些特点为在全国范围内实行PDS基因IVS7-2A→G突变的筛查和大前庭水管的预防提供了便利的条件，从而从根本上减少大前庭水管综合症个体发生耳聋的机会。而序列分析法需要测序仪，技术操作复杂，要求的检测时间需要3-7天。

附图说明

图1是HpaII酶切法鉴定PDS基因IVS7-2A→G突变的2.5％琼脂糖凝胶电泳图，泳道b、c：PDS基因IVS7-2A→G杂合突变患者；泳道f、o：PDS基因IVS7-2A→G纯合突变患者；泳道a、x：标记marker(100bp间隔)；其余泳道：正常野生型个体。

图2序列分析证实酶切结果的准确性。左：酶切未切开测序显示无IVS7-2A-G突变(例如泳道d)；中：酶切见两条带测序显示IVS7-2A-G杂合突变(泳道b、c)；右：酶切见条带全部被切开或小条带亮于大条带测序显示IVS7-2A-G纯合突变(泳道f、o)。

具体实施方式

现在仅用参考下面非限制性的实施例的方式进一步描述本发明。但是应当理解，下面的实施例仅仅是作为例证的，不应以任何方式当作对上述本发明总体的限制。除非有其它说明，本发明的实施例使用本领域中的传统分子生物学、细胞生物学、PCR扩增和突变技术等等。这些技术是技术人员熟知的，并在文献中有详细解释。参见，例如，Sambrook and Russell″Molecular Cloning：A LaboratoryManual″(2001)；Cloning：APractical Approach，″Volumes I and II(D.N.Glover，ed.，1985)″；T.A Brown“Genome”BIOS Scientific Publishers Limited.

实施例一聋哑患者群体中PDS基因IVS7-2突变的检测

1.检测样本

选择聋哑患者66例(均来自赤峰市聋哑学校)，正常听力个体100人，从被检个体提取外周全血DNA(试剂盒方法，上海华舜生物制品公司)，作为检测样本。聋哑患者均经纯音测听证实为重度或极重度耳聋。

2.引物设计

引物设计的指导思想是在PDS IVS7-2位点(即SEQ ID NO：1中第252位)邻近的2-4个碱基引入一个碱基替换，造成可能的能够鉴别IVS7-2野生型(A)和突变型(G)的新的限制性酶切位点。使用GenetoolLite程序协助设计引物，正向引物长30bp，在PDS IVS7-4位点引入T-C突变，反向引物长20bp，与野生型PDS基因正向序列完全互补，正向引物序列(SEQ ID NO：3)是5′TGGAGTTTTTAACATCTTTTGTTTTATTCC 3′，反向引物序列(SEQ ID NO：4)是5′CCCTTGGGATGGATTTAACA 3′。在野生型和PDS IVS7-2A→G突变标本中均可扩增形成114bp扩增片段。PCR产物包含PDS IVS7-2位点，若模板为IVS7-2A→G突变型分子，则114bp的PCR产物存在HpaII酶切位点，HpaII酶切后获得83-85bp和29-31bp两组条带；若模板为PDS IVS7-2野生型分子，则114bp的PCR产物不存在HpaII酶切位点，不能被HpaII切开，酶切后仍是114bp一个条带。

3.PCR扩增反应

根据上述设计的正反向引物序列，通过人工合成(通过给定序列由自动化核酸合成仪合成)得到正向引物F和反向引物R，并以上述提取的被测样本周边血DNA为模板，进行PCR扩增反应：

反应体系：

模板         50ng

引物F1，R1   各50ng

10×dNTP     5μl

10×Buffer   5μl

Mg⁺⁺终浓度      1.5mmol/L

Taq酶           1.0u

加三蒸水至50μl体积。

反应条件：

95℃变性5分钟后，接着94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，共进行.30个循环，最后在72℃下再延伸7分钟。

用2.5％琼脂糖凝胶电泳检查产物。PCR扩增后F1R1能够获得明亮清晰的略大于100bp条带，证明正向引物3’端第二个碱基与模板异配并没有影响PCR的效率。

4.HpaII酶切检测

上述PCR产物包含PDS基因IVS7-2位点，若模板为IVS7-2A→G突变型分子，则114bp的PCR产物存在HpaII酶切位点，HpaII酶切后获得83-85bp和29-31bp两组条带(在凝胶上只看到代表83-85bp的一个条带；若模板为mtDNA野生型分子，则114bp的PCR产物不存在HpaII酶切位点，不能被HpaII切开，酶切后仍是114bp一个条带。

被测样本的PCR扩增产物按下述条件检测IVS7-2A→G突变。

酶切反应体系：

PCR产物        12-18μl

10×缓冲液     3μl

HpaII限制性酶  5-10u

BSA            0.3μl

三蒸水补足体积至30μl，37℃温育1小时。酶切反应物用2.5％琼脂糖凝胶检查。

5.结果

在酶切后的凝胶电泳检查中，66例聋哑患者中有57例只见到一条大于100bp的条带，代表不含有IVS7-2A→G突变；4例可见一条大于100bp和一条小于100bp的条带，大的条带较小的条带明亮，代表IVS7-2A→G的杂合突变；5例可见一条小于100bp的条带，代表IVS7-2A→G的纯合突变(部分数据参见图1)；

6.HpaII酶切法可靠性的检验

5例经酶切检测表明具有PDS基因IVS 7-2A→G纯合突变的DNA标本进行外显子7和8的直接测序检查，证实在IVS 7-2位点存在A→G的纯合替换；4例经酶切检测表明具有PDS基因IVS 7-2A→G杂合突变的DNA标本进行外显子7和8的直接测序检查，证实在IVS 7-2位点存在A to G的杂合替换；11例经酶切检测表明不具有PDS基因IVS 7-2A→G突变的DNA标本进行外显子7和8的直接测序检查，证实在IVS 7-2位点正常(见图2)。随后的颞骨CT检查证实9名IVS 7-2A→G突变个体(纯合或杂合)均为表现为前庭水管扩大，阴性个体未见前庭水管异常。(见表1)

表1.IVS 7-2A→G试剂盒检测、序列分析和颞骨CT检查结果对照

突变类型	IVS 7-2A→G试剂盒法	序列分析	颞骨CT
				纯合	5例	5例	5例前庭水管扩大
杂合	4例	4例	4例前庭水管扩大
				阴性	11例	11例	11例均无异常

实施例二足跟血片DNA提取PDS基因IVS7-2突变的检测

1.适用于足跟血片的一型试剂盒(100人份)包含以下组分：

(1)溶液I(主要成份为5％Chelex)25ml；

(2)PCR试剂(包括8mM dNTP 150μl、10×PCR缓冲液1ml、25mM Mg⁺⁺溶液1ml、三蒸水1ml×4管、5u/μlTaq酶25μl)；

(3)正向引物F1；反向引物R1(同实施例一)，正反向引物按等比例混合(浓度均为10nM)，共150μl；

(4)限制性酶HpaII，20u/μl，110μl及配套的10×缓冲液1ml；

(5)阳性对照标本125μl、阴性对照标本125μl；

(6)使用说明书。

2.检测对象

选择已经CT检查证实为大前庭水管并且携带PDS基因IVS7-2A→G纯合突变患者一名，其正常听力父母亲(均携带杂合突变)，以及不携带PDS基因IVS7-2A→G突变的正常听力个体两人为受检对象。

3.检测方法及结果

按照本试剂盒的使用说明书，用溶液I(主要成份为5％Chelex)提取受检者的足根血血片DNA，并取50ng作为模板，加入引物混合物100ng、10×dNTP 5μl、10×缓冲液5μl、Mg⁺⁺终浓度为1.5mmol/L，加三蒸水至50μl后，加1.0u Taq酶，95℃变性5分钟后，接着94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，共进行30个循环，最后在72℃下再延伸7分钟。按同样的PCR反应条件，用试剂盒内提供的PDS基因IVS7-2A→G杂合突变阳性模板和阴性模板同时作阳性和阴性对照PCR反应，并设立无模板PCR空白对照管，反应后用2.5％琼脂糖凝胶电泳检查扩增产物，结果，无模板对照物未见扩增产物，受检患者、其父母、正常个体、阳性及阴性对照标本的PCR产物均为114bp。PCR产物用HpaII酶切检测，酶切反应体系为30μl，包括：

10×缓冲液    3μl

100BSA        0.3μl

HpaII         20u

PCR产物       12-18μl

以三蒸水补足体积，37℃温育1小时。酶切反应物用2.5％琼脂糖凝胶电泳检查，1名大前庭水管耳聋患者的酶切产物可见83-85bp条带，表明PDS基因IVS7-2A→G纯合突变；大前庭水管耳聋患者父母和阳性对照的酶切产物可见83-85bp和114bp条带，表明PDS基因IVS7-2A→G杂合突变；两个听力正常个体和阴性对照仅见114bp条带，表明无PDS基因IVS7-2A→G突变。进一步测序証实此名患者携带IVS7-2A→G纯合突变，其父母携带IVS7-2A→G杂合突变，符合携带者状态；两名正常听力个体不携带任何IVS7-2A→G突变。

实施例三体外检测PDS基因IVS7-2突变的二型试剂盒及其应用

本实施例选择的受检对象同实施例二。除了受检样本为周边血，以及试剂盒中的血样DNA提取剂为市售的周边血DNA提取试剂盒，并用该试剂盒提取周边血DNA以外，试剂盒中其他组分和检测方法与实施例二相同。检测结果与实施例二完全相同，即1名大前庭水管耳聋患者的酶切产物可见83-85bp条带，表明PDS基因IVS7-2A→G纯合突变；大前庭水管耳聋患者父母和阳性对照的酶切产物可见83-85bp和114bp条带，表明PDS基因IVS7-2A→G杂合突变；两个听力正常个体和阴性对照仅见114bp条带，表明无PDS基因IVS7-2A→G突变。实施例四体外检测PDS基因IVS7-2突变的三型试剂盒及其应用

本实施例选择的受检对象同实施例二。除了受检样本为从血样提取的DNA，以及试剂盒中不含血样DNA提取剂以外，试剂盒中其他组分和检测方法与实施例二相同。检测结果与实施例二结果完全相同。

序列表

<210>SEQ ID NO：1

<211>336bp

<212>DNA

<212>PDS基因的外显子7+内含子7+外显子8

ACGCTGGTTGAGATTTTTCAAAATATTGGTGATACCAATCTTGCTGATTTCACTGCTGGATTGCTCAC

CATTGTCGTCTGTATGGCAGTTAAGGAATTAAATGATCGGTTTAGACACAAAATCCCAGTCCCTATTC

CTATAGAAGTAATTGTGgtaagtagaatatgtagttagaaagttcagcattatttggttgacaaacaa

ggaattattaaaaccaatggagtttttaacatcttttgttttatttc

gACGATAATTGCTACTGCCA

TTTCATATGGAGCCAACCTGGAAAAAAATTACAATGCTGGCATTGTTAAATCCATCCCAAGGGG  (内

含子7的方框内a为PDS IVS7-2位点，即SEQ ID NO：1中第252位，PDSIVS 7-2

A-G突变即此位点碱基A发生碱基G替代突变，此突变为重要的剪切位点突变，

可造成转录时外显子8的丢失)

<210>SEQ ID NO：2

<211>4bp

<212>DNA

<213>Hpa II内切酶识别位点

C↓CGG

<210>SEQ ID NO：3

<211>30bp

<212>DNA

<213>正向引物F1

5′TGGAGTTTTTAACATCTT TTGTTTTATTCC 3′，

<210>SEQ ID NO：4

<211>20bp

<212>DNA

<213>反向引物R1

5′CCCTTGGGATGGATTTAACA 3′

Claims (7)

1. 一种用于体外确定含有大前庭水管综合症IVS7-2A→G位点突变的引物对的制备方法，其特征在于方法包括：根据如序列SEQ ID NO：1所示的PDS基因的第7、第8外显子序列和两个外显子之间的第7内含子序列，使用或不使用生物软件设计用于扩增序列SEQ ID NO：1中第252位的IVS7-2突变位点A→G在内的正向引物和反向引物，其中引物对在该突变位点的上游或下游2-6个碱基范围内引入一个碱基替换突变，引物对的正向引物或反向引物长度范围是18-32bp，并且正向引物具有如SEQ ID NO：3所示的序列，以及反向引物具有如SEQ IDNO：4所示的序列，从而在扩增产物中能获得可鉴别IVS7-2野生型A位点与突变型G的新限制性内酶切位点。

2. 根据权利要求1所述的制备方法，其中相对于PDS基因扩增模板，正向引物3’第二位引入T-C人为突变，从而在扩增产物中获得含有如SEQ ID NO：2序列所示的新限制性酶切位点HpaII。

3. 一种权利要求1或2所述的引物对在制备可体外确定含有大前庭水管综合症IVS7-2A→G位点突变的试剂盒的用途。

4. 一种含有权利要求1或2的引物对并用于体外确定含有大前庭水管综合症IVS7-2A→G位点突变的试剂盒，包括：

(1)PCR扩增反应试剂；

(2)等比例混合的权利要求1或2所述的正向引物和反向引物；

(3)新的限制性内切酶及其配套的缓冲液；

(4)阳性标本对照、阴性标本对照。

5. 权利要求4所述的试剂盒，还包括使用说明书。

6. 根据权利要求4或5所述的试剂盒，其包括用于提取血样DNA的试剂或试剂盒。

7. 根据权利要求6所述的试剂盒，其中用于提取血样DNA的试剂或试剂盒包括用于提取足根血样DNA的试剂盒或试剂，其含有主要成分是Chelex的DNA裂解液；或者包括用于提取外周血样DNA的试剂盒或试剂。

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