KR20080109715A - 체외에서 전정 도수관 확장성 청각 장애와 관련있는 ｐｄｓ유전자 돌연변이를 검출하는 프라이머의 제조방법 및 용도 - Google Patents

체외에서 전정 도수관 확장성 청각 장애와 관련있는 ｐｄｓ유전자 돌연변이를 검출하는 프라이머의 제조방법 및 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 체외에서 전정 도수관 확장 증후군 IVS7-2A→G 부위 돌연변이를 검출하는 프라이머의 제조 방법에 대한 것으로, 상기 방법은 PDS 유전자의 IVS7-2 돌연변이 부위 A→G에 근거하여, IVS7-2 부위(A→G)를 포함하는 상하위 2-4개 염기 영역내에서 임의의 하나의 염기를 도입하여 돌연변이를 치환하는 프라이머 쌍을 제작하고, 증폭 산물에서 IVS7-2 야생형 A 부위와 돌연변이형 G를 구별할 수 있는 제한 효소 절단 부위를 만드는 단계를 포함한다. 또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조한 프라이머, 상기 프라이머를 포함하는 키트, 시약 또는 유사 제품, 그리고 상기 프라이머를 이용하여 체외에서 전정 도수관 확장 증후군과 관련있는 IVS7-2A→G 부위 돌연변이를 검출하는 방법에 관한 것이다.

Description

체외에서 전정 도수관 확장성 청각 장애와 관련있는 ＰＤＳ 유전자 돌연변이를 검출하는 프라이머의 제조방법 및 용도{A METHOD FOR PREPARING THE PRIMERS FOR IN VITRO IDENTIFYING MUTATIONS WITHIN LARGED VESTIBULAR AQUEDUCT SYNDROMIC HEARING LOSS PDS GENE AND THE USE THEREOF}
본 발명은 체외에서 전정 도수관 확장성 청각 장애(large vestibular aqueduct syndrome)와 관련있는 PDS 유전자의 돌연변이를 검출하는 프라이머의 제조방법에 관한 것이며, 특히 전정 도수관 확장성 청각 장애와 관련있는 PDS 유전자에서의 IVS7-2A→G 돌연변이를 검출하는 프라이머의 제조방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 방법에 따라 제조된 프라이머 및 키트를 제공하며, 체외에서 전정 도수관 확장성 청각 장애와 관련있는 PDS 유전자에서의 IVS7-2A→G 돌연변이를 검출하기 위한 상기 프라이머 또는 키트의 용도를 제공한다.
신생아의 청각 장애 발병율은 1-3/1000이다. 청각 장애를 일으키는 원인은 여러 가지가 있는데, 절반 이상의 아동기 청각 장애는 유전성 청각 장애로, 이의 발병율은 1/800－1/1000이며(Wang, Jinling, "Large Vestibular Aqueduct Syndrome and Fluctuating Heating Loss", Journal of Audiology and Speech Pathology, 2003, 11(2): 81-84), 그 중 PDS 유전자(Pendred's syndrome gene)의 돌연변이에 인한 전정 도수관 확장증이 가장 중요한 유형 중 하나이다. 1978년에 Valvassori와 Clemis는 3700명에 대한 측두골 연속 단층 스캔에서 50건의 전정 도수관 확장을 발견하였고, 그 중 신경성 청력상실을 동반한 임상 증상을 "전정 도수관 확장 증후군(larged Vestibular Aqueduct Syndrome, LVAS)"이라고 명명하였다. 상기 질환은 출생 시에는 청각이 정상이거나 경도 내지 중도의 청각 상실을 동반하며, 초기에는 비교적 훌륭한 언어 능력을 보이지만 청각은 점차적으로 상실되며, 청각 상실의 주된 원인은 두부 외상, 두개골 내 압력 증가, 감기 등이고, 침대에서 떨어지거나 놀이 및 체육 활동 중에 가벼운 부딪침 등도 현저한 청각 감소를 유발한다. 때문에 조기 발견 및 일상 생활에서의 적절한 보호 조치는 상기 청각 장애의 발생과 악화를 막을 수 있으며, 상기 질환은 예방 가능한 질병이다(Wang,Jibao, "Large Vestibular Aquduct Syndrome", Chinese Journal of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery, 2002, 37: 398-400).
최근 해외의 여러 가지 연구 결과는 전정 도수관 확장 증후군과 PDS 유전자의 돌연변이 사이에 밀접한 연관성이 있음을 밝혀냈다(Campbell C, Cucci RA, Green GE, et al. Pendred Syndrome, DFNB4 and PDS----identification for eight novel mutations and phenotype-genotype correlations. Human mutation, 2001,17:403-411; Scott DA, Wang R, Kreman, et al. Functional differences of the PDS gene product are associated with phenotypic variation in patients with Pendred syndrome and non-syndromic hearing loss(DFNB4). Human Molecular Genetics, 2000, 9:1709-1715). PDS(SLC26A4)(Solute carrier family). PDS 유전 자는 21개의 엑손으로 이루어져 있으며, ORF(Open Reading Frame)는 2343bp이고, 780개의 아미노산으로 구성된 단백질 "펜드린(Pendrin)"을 코딩하고 있다. 펜드린은 주로 소수성 아미노산으로 구성되어 있으며, 이온 수송체 유형에 속하며, 연구에 의하면 이는 주로 요오드/염소 이온의 수송과 관련되어 있다. PDS 유전자 돌연변이가 청각 장애를 일으키는 유전 패턴은 대부분 상염색체의 열성 유전 패턴으로, 즉 부모가 보인자인 경우 자녀의 1/4는 부모로부터 두 개의 PDS 돌연변이 유전자를 유전받게 되어 발병되며(열성 동형접합체), 자녀의 2/4는 아버지나 어머니로부터 단지 하나의 돌연변이 유전자를 유전받기 때문에 보인자가 된다(발병하지 않는 우성 이형접합체). 그리고 자녀의 1/4은 부모로부터 두 개의 정상적인 PDS 유전자를 유전받기 때문에, PDS 유전자에 대해 야생형 개체(우성 동형접합체)이다.
본 발명자들의 29명의 전정 도수관 확장 증후군 중국 환자들에 대한 연구 결과에 의하면, 26명의 환자들은 상이한 PDS 돌연변이를 보유하고 있었으며, 그 중 19명의 환자들이 IVS7-2 A→G 돌연변이를 갖고 있었다. 이는 IVS7-2 A→G 돌연변이가 전정 도수관 확장성 청각 장애를 일으키는 주요 원인임을 말해준다. 내몽고 적봉시의 청각 장애 학생 63명에 대한 PDS 유전자 검사에서, 5명은 IVS7-2 A→G 동형접합체 돌연변이에 속하였고, 4명은 IVS7-2 A→G 이형접합체 돌연변이에 속하였으며, 돌연변이 비율은 14.28%였다. 이들 9명의 아동은 조기 발견하여 적시적인 보호 조치를 행하여 외상을 방지한다면, 청각 상실을 피할 수 있을 것이다. 100명의 정상 아동에 대한 스크리닝에서, 1명의 IVS7-2 A→G 이형접합체 돌연변이가 발견되었으므로, 이로부터 중국 정상인들 중 상기 돌연변이 보인자는 약 1%인 것으로 추산할 수 있다.
본 발명자들은 최초로 IVS7-2 A→G가 중국 사람들의 전정 도수관 확장 증후군의 가장 중요한 돌연변이이고 매우 높은 발병율을 갖고 있다는 것을 발견하였으나, 선천적인 PDS 서열의 IVS7-2 부위에서는 IVS7-2 A→G 돌연변이와 야생형 서열을 구별할만한 적절한 효소 절단 부위가 없어, 일반적으로 서열 분석을 통하여 상기 부위의 돌연변이를 검증하고 있다. 서열 분석은 유전자 진단의 일반적인 방법이기는 하지만, 원가가 높고 거액의 설비가 필요하며 조작이 복잡하고 기술요구가 높으며 시간과 노력이 많이 들어, 스크리닝과 보급화에 적합하지 않다.
상기한 문제를 해결하기 위하여, 전정 도수관 확장성 청각 장애와 관련된 PDS 유전자의 IVS7-2 A→G 돌연변이를 스크리닝하여 신속하게 진단할 수 있는 간편한 기술이 요구되고 있다.
본 발명의 원리는 하기와 같다: 전정 도수관 확장성 청각 장애를 일으키는 PDS 돌연변이 유전자내 돌연변이 부위(즉 서열번호 1의 252번 위치의 IVS7-2 A→G)를 이용하여 바이오-프로그램을 이용하거나 이용하지 않고 특수 프라이머를 제작하여, 인공적으로 PCR을 통해 PDS 유전자에 IVS7-2 부위를 포함하는 새로운 제한 효소 절단 부위를 도입한 후, 샘플 PCR 산물의 제한 효소 절단 결과를 분석하여 전정 도수관 확장성 청각 장애와 관련있는 PDS 유전자의 IVS7-2 A→G 돌연변이에 대한 정확한 검사 결과를 얻을 수 있다.
따라서, 본 발명은 체외에서 전정 도수관 확장 증후군의 IVS7-2A→G 부위 돌연변이를 검출하는 프라이머의 제조 방법을 제공하는 것을 첫번째 목적으로 하며, 이는 PDS 유전자의 IVS7-2 돌연변이 부위 A→G(인트론 7의 프레임 내의 a는 PDS IVS7-2 부위, 즉 서열번호 1의 252번 위치이고, PDS IVS 7-2 A-G 돌연변이는 상기 부위의 염기 A에 염기 G가 치환된 돌연변이이고, 이 돌연변이는 중요한 효소 절단 부위 돌연변이로서 전사 과정 중에 엑손8이 없어질 수 있다)에 대해, 바이오-프로그램을 이용하거나 이용하지 않고 PDS 유전자의 IVS7-2 부위를 증폭하는 프라이머를 제작하며, 특히 상기 프라이머는 IVS7-2 부위 A→G를 포함하여 상류 및 하류 1-13개 염기 영역에 하나의 염기 치환 돌연변이를 도입할 수 있도록 치환하여, IVS7-2 야생형(A 부위)과 돌연변이형(G)을 구별하는 새로운 제한 효소 절단 부위를 만들 수 있다.
공지된 상품화된 가장 짧은 제한 엔도뉴클레아제 인지 부위는 4개의 염기를 포함하고(예를 들면, CviJI， 인지 부위는 RGCY)이고, 가장 긴 제한 엔도뉴클레아제 인지 부위는 13-14개의 염기(예를 들면, Sfi I는 13개의 염기를 포함하며, StySQI는 14개의 염기를 포함함)를 포함하기 때문에, IVS7-2 부위(A→G)를 포함하는 상하위 1-13개 염기 영역에 하나의 염기 치환성 돌연변이를 도일할 수 있는 프라이머는 모두 본 발명에 사용가능하다. 따라서, 상기 상하위 1-13개 염기 영역의 길이는 1-10개의 염기가 바람직하고, 1-8개 염기가 더욱 바람직하며, 2-4개 염기가 가장 바람직하다.
본 발명은 나아가 컴퓨터 프라이머 제작 프로그램을 이용하여 상기 프라이머를 제작하는 방법을 제공한다. 사용 가능한 프로그램은 Genetool Lite 프로그램(미국 Biotools사에서 제공하는 프로그램), Vector NTI, Oligo, Genestar, DNAMAN, DNASTAR, DNAtool, proteintool, Enzyme, pDRAW, Primer3, Primer5, Seq Convertor, DNAassist 등이 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 상기 방법으로 제조된 프라이머를 제공하는 것을 두번째 목적으로 하며, 정방향 프라이머(F1)와 역방향 프라이머(R1)를 포함한다. 특히, 프라이머의 길이 범위는 10-40bp이고, 바람직하게는 15-35bp이며, 더욱 바람직하게는 18-32bp이다. 본 발명은 상기 방법으로 제조된 구체적인 프라이머 서열을 제공한다. 프라이머 서열은 길이가 30bp인 정방향 프라이머 서열(서열번호 3), 5'TGGAGTTTTTAACATCTTTTGTTTTATTCC 3', 이는 3’말단에서 두번째 위치에 T-C 인공 돌연변이를 도입함); 및 길이가 20bp인 역방향 프라이머 서열(서열번호 4), 5'CCCTTGGGATGGATTTAACA 3'을 포함한다.
본 발명은 상기 프라이머를 포함하며, 체외에서 전정 도수관 증폭 증후군의 PDS 돌연변이 유전자를 검출할 수 있는 시약 키트 또는 이와 유사한 제품을 제공하는 것을 세번째 목적으로 한다. 여기에서, PCR 증폭 시약, 동일 비율로 혼합된 상기 정방향 프라이머와 역방향 프라이머, 새로운 제한 엔도뉴클레아제 및 해당 완충액, 양성 대조군 샘플 및 음성 대조군 샘플과, 사용 설명서가 포함된다. 상기 시약 키트 또는 유사 제품의 주된 기능은 모든 시약을 하나의 키트에 있도록 하여, 핵산 단편 증폭, 효소 절단 검증 등이 시약 키트 또는 유사 제품에서 제공되는 시약을 기초로 원활하게 진행되게 한다.
상기 시약 키트 또는 유사 제품은 나아가 혈액 샘플 DNA를 추출할 수 있는 시약 키트 또는 시약을 포함할 수 있으며, 상기 시약 키트와 시약은 혈액 샘플 DNA를 추출하는 시약을 제외하고는, 기타 구성은 모두 동일하다. I형 시약 키트 또는 시약은 발바닥 혈액으로부터 샘플 DNA를 추출하는 DNA 용해액(lysis buffer)을 포함하며, 이의 주요 성분은 Chelex(5％ Chelex, 0.1％ SDS, 1％ NP40, 1％ Tween 20, ABI사 제품)이며, II형 시약 키트와 시약은 말초 혈액 샘플 DNA를 추출하는 시약 키트(Watson Biotechnologies,Inc)를 포함한다.
본 발명은 나아가 새로운 제한성 엔도뉴클레아제 HpaII 부위를 도입하는 시약 키트를 포함한다. 여기에서,
1. 선택적으로, 발바닥 혈액 또는 말초 혈액으로부터 샘플 DNA를 추출하기 위한 시약 또는 시약 키트;
2. dNTP, 10X PCR 완충액, 3차 증류수, Taq 효소를 포함하는 PCR 증폭 반응 시약;
3. 동일 비율로 혼합된 정방향 프라이머(서열번호 3)와 역방향 프라이머(서열번호 4);
4. 제한 효소 HpaII 및 이에 상응하는 완충액;
5. 양성 표본 대조군 및 음성 표본 대조군; 및
6. 사용 설명서를 포함한다.
본 발명은 전정 도수관 확장 증후군과 관련된 PDS 유전자의 IVS7-2 A→G 돌연변이를 체외에서 검출하는 방법을 제공하는 것을 네번째 목적으로 한다. 상기 방법은, 상기 프라이머 제조 방법을 이용하여 PDS 유전자의 IVS7-2 부위를 증폭시키는 프라이머를 제작하며, 상기 프라이머는 IVS7-2 부위에 A→G를 포함하는 상하위 1-13개의 염기 영역 내에 하나의 염기를 도입하여 돌연변이를 치환하도록 하여 IVS7-2 야생형(A 부위)과 돌연변이형(G)을 구별하는 새로운 제한성 효소 절단 부위를 만들고; 직접 상기 방법으로 제조한 프라이머나 또는 상기 시약 키트/유사 제품을 이용하여 샘플을 증폭시켜, 정방향 프라이머의 3’말단 영역과 증폭 주형 간에 염기의 점 돌연변이가 발생되지만, 정방향 프라이머와 역방향 프라이머의 PCR 효율에는 영향을 미치지 않기 때문에, 야생형과 돌연변이형 샘플들로 일정한 길이의 증폭 산물을 수득할 수 있으며; 상기 새로운 제한성 엔도뉴클레아제를 이용하여 증폭 산물에 대하여 효소 절단 검증을 진행한 결과, 야생형 샘플의 증폭 단편은 돌연변이로 생긴 새로운 제한성 효소 절단 부위를 포함하고 있지 않기 때문에 새로운 제한성 엔도뉴클레아제에 의하여 효소 절단되지 않지만, 돌연변이형 샘플의 증폭 산물은 돌연변이가 발생한 새로운 효소 절단 부위를 포함하고 있기 때문에 효소 절단되므로, 이로부터 PSD 유전자의 IVS7-2 부위 A-G 돌연변이가 발생된 샘플을 구별해 낼 수 있다.
상기 방법에서, 상기 상하위 1-13개 염기 범위는 1-10개 염기가 바람직하고, 1-8개 염기가 더욱 바람직하며, 2-4개 염기가 가장 바람직하다.
상기 방법에서, 컴퓨터 프라이머 제작 프로그램을 사용하여 상기 프라이머를 제작하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 사용 가능한 프로그램은 Genetool Lite 프로그램(미국 Biotools사에서 제공하는 프로그램), Vector NTI, Oligo, Genestar, DNAMAN, DNASTAR, DNAtool, proteintool, Enzyme, pDRAW, Primer3, Primer5, Seq Convertor, DNAassist 등이 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 더 나아가 PSD 유전자에 새로운 제한성 엔도뉴클레아제 HpaII 부위를 도입하는 방법을 제공한다. 상기 방법은, PDS 유전자의 IVS7-2 부위의 증폭에 사용되는 프라이머 쌍(서열번호 3, 4)을 제작하였고, 상기 프라이머는 IVS7-2 부위(A→G)를 포함하는 상하위 2-4개 염기 범위 내에서 하나의 염기를 도입하여 돌연변이를 치환하여 IVS7-2 야생형(A 부위)와 돌연변이형(G)을 구별할 수 있는 제한성 효소 절단 부위 HapII를 만들며; 필요에 따라, 샘플을 취하여 증폭 주형을 수득하며; 상기 프라이머 쌍(서열번호 3, 4)을 이용하여 증폭 주형에 대하여 PCR 증폭을 진행하고; 야생형과 PDS IVS7-2 A→G 돌연변이 샘플에서 모두 114bp의 증폭 단편을 증폭할 수 있으며, 실제 PCR 산물은 아가로스 전기영동으로 100bp보다 큰 밝은 밴드를 발견할 수 있으며, 이는 정방향 프라이머(서열번호 3)의 3’말단에 두번째 염기와 주형간의 미스매치가 PCR의 효율에 영향을 미치지 않았음을 증명하며; PDS IVS7-2 부위를 포함하는 PCR 산물에 대하여 HpaII 효소 절단을 진행하면, 만일 주형이 IVS7-2 A→G 돌연변이형 분자인 경우에는 114bp의 PCR 산물에 HpaII 효소 절단 부위가 존재하여, HpaII 효소 절단시 83-85bp와 29-31bp의 2개 밴드가 나타나지만, 만일 주형이 PDS IVS7-2 야생형 분자인 경우에는 114bp의 PCR 산물에 HpaII 효소 절단 부위가 존재하지 않아 HpaII에 의해 절단되지 않으므로 효소 절단을 진행한 후에도 여전히 114bp로 하나의 밴드로 존재하므로; 따라서, 효소 절단 전기영동 결과를 통해 샘플에 전정 도수관 확장 증후군과 관련된 PDS 유전자의 IVS7-2 A→G 돌연변이가 존재하는지를 판단할 수 있다.
상기 새로운 제한성 엔도뉴클레아제 HpaII 부위를 결정하는 방법에 있어서, 상기 프라이머 쌍의 제작은 컴퓨터 프라이머 제작 프로그램을 이용하여 달성할 수 있으며, 사용 가능한 프로그램으로는 Genetool Lite 프로그램(미국 Biotools사에서 제공하는 프로그램), Vector NTI, Oligo, Genestar, DNAMAN, DNAtool, Proteintool, Enzyme, pDRAW, Primer3, Primer5, Seq Convertor, DNAassist 등이 있다.
상기 새로운 제한성 엔도뉴클레아제 HpaII 부위를 결정하는 방법에 있어서, 샘플 DNA의 추출, PCR 및 효소 절단은 프라이머 쌍(서열번호 3 또는 4)과 새로운 제한성 엔도뉴클레아제 HpaII 부위 시약 키트 또는 시약을 사용하여 달성할 수 있다.
본 발명에 따른 PDS 유전자의 IVS7-2 A→G 돌연변이 검사방법은 종래의 검사방법과 비교하여 하기와 같은 이점을 갖는다.
본 발명의 제한 효소 절단을 이용한 효소 절단은 조작이 간단하고 소요 시간이 4시간 이내이며, 사용하는 시약들 모두 일반적인 생물화학 시약이기 때문에 원가가 낮고, 사용하는 PCR 기기와 전기이동 설비는 모두 생물 실험실과 검사 실험실의 기본 설비에 속한다. 이러한 특징으로, 전국적인 PDS 유전자 IVS7-2 A→G 돌연변이 스크리닝에 이로우며, 전정 도수관 확장 증후군을 예방하는 방편을 제공하였으며, 근본적으로 전정 도수관 확장 증후군의 발병율을 낮출 수 있다. 그러나, 서열 분석법은 서열분석기가 필요하고, 기술과 조작이 복잡하며, 소요 시간은 3-7일 걸린다.
도 1은 HpaII 효소 절단 방법으로 PDS 유전자의 IVS7-2 A→G 돌연변이를 검증하기 위한 2.5% 아가로스 젤 전기영동 결과로, 레인 b, c: PDS 유전자의 IVS7-2 A→G 이형접합체 환자이고; 레인 f, o: PDS 유전자의 IVS7-2 A→G 동형접합체 환자이고; 레인 a, x: 마커(100bp 간격)이고; 그외 레인: 정상적인 야생형 개체이다.
도 2는 서열 분석법으로 효소 절단 결과의 정확성을 확인한 도면으로, 좌측: 효소 절단이 이루어지지 않았으며, 서열분석에서 IVS7-2A-G 돌연변이가 없는(예를 들면, 레인 d) 것으로 확인되었고; 중앙: 효소 절단 후 2개의 밴드가 나타나, 이를 서열 분석한 결과 IVS7-2A-G 이형접합체 돌연변이가 확인되었고(레인b, c); 우측: 효소 절단시 전부 절단되거나 작은 밴드가 큰 밴드보다 더 밝았으며, 서열 분석에서 IVS7-2A-G 동형접합체 돌연변이로 확인되었다(레인 f, o).
하기 비제한적인 실시예를 참조하여, 본 발명을 구체적으로 설명한다. 그러나, 이는 비제한적인 실시예를 참조하는 방식으로 본 발명을 상세히 설명하는 것으로, 하기 실시예는 예시에 불과하며 어떠한 방식으로든지 본 발명의 전반적인 내용을 제한하는 것은 아니다. 특별한 설명이 없는 이상, 본 발명의 실시예는 당업계의 전통적인 생물학, 세포 생물학, PCR 증폭과 돌연변이 기술 등을 이용한다. 상기 기술들은 이미 당업자들에게 숙지된 것이며, 문헌에 상세하게 설명되어 있다. 예를 들면, Sambrook and Russell "Molecular Cloning: A Laboratory Manual"(2001); Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II(D.N.Glover, ed., 1985); T.A Brown "Genome" BIOS Scientific Publishers Limited 등을 참조할 수 있다.
실시예 1: 청각 장애 환자들에 대한 PDS 유전자의 IVS7-2 돌연변이 검사
1. 샘플
청각 장애 환자 66명(모두 중국 적봉시 농아학교의 학생)과 청각 정상 개체 100명을 선정하고, 이들의 말초 혈액으로부터 DNA(시약 키트에 제공된 방법, Watson Biotechnologies, Inc)를 취하여 샘플로 하였다. 청각 장애 환자들은 모두 청각 테스트를 통하여 중증 또는 극도로 심각한 청각 장애임을 확인하였다.
2. 프라이머 제작
프라이머 제작은 PDS IVS7-2 부위(즉, 서열번호 1 에서252번째 위치) 부근의 2-4 염기 영역에 염기 치환을 도입하여, IVS7-2 야생형(A)과 돌연변이형(G)을 구별할 수 있는 새로운 제한성 효소 절단 부위를 만든다. GenetoolLite 프로그램을 사용하여 프라이머 제작을 보조한다. 정방향 프라이머의 길이는 30bp이고 PDS IVS7-4 부위에 T-C 돌연변이를 도입하며, 역방향 프라이머의 길이는 20bp이며, 야생형 PDS 유전자의 정방향 서열과 완전히 상보적이다. 정방향 프라이머 서열(서열번호 3)은 5'TGGAGTTTTTAACATCTTTTGTTTTATTCC 3'이고, 역방향 프라이머 서열(서열번호 4)은 5'CCCTTGGGATGGATTTAACA 3'이다. 야생형과 PDS IVS7-2 A→G 돌연변이형 샘플들에서 모두 114bp의 증폭 단편을 증폭시킬 수 있다. PCR 산물에는 PDS IVS7-2 부위가 포함되어 있어, 만일 주형이 IVS7-2 A→G 돌연변이형 분자인 경우에는 114bp의 PCR 산물에 HpaII 효소 절단 부위가 존재하므로, HpaII 효소 절단시 83-85bp와 29-31bp의 2개의 밴드가 나타난다. 그러나, 만일 주형이 PDS IVS7-2 야생형 분자인 경우에는 114bp의 PCR 산물에는 HpaII 효소 절단 부위가 존재하지 않으므로, HpaII로 절단되지 않아 효소 절단을 진행한 후에도 여전히 114bp의 하나의 밴드로 존재한다.
3. PCR 증폭반응
제작한 상기 정방향 및 역방향 프라이머 서열에 의하여, 인공합성(주어진 서열에 대해 자동화 핵산 합성기기를 이용하여 합성)을 통하여 정방향 프라이머 F와 역방향 프라이머 R을 수득하였고, 상기 추출한 말초 혈액 DNA를 주형으로 하여 PCR 증폭반응을 진행하였다.
반응 시스템:
주형 50ng
프라이머 F1, R1 각 50ng
10× dNTP 5㎕
10× 완충액 5㎕
Mg++ 최종 농도 1.5mmol/L
Taq 효소 1.0u
3차 증류수를 반응 총 부피가 50㎕가 되도록 잔량으로 첨가한다.
반응 조건:
95℃ 변형을 5분 동안 진행한 후, 94℃ 변성을 30초 진행하며, 55℃ 어닐링 30초를 진행하고, 72℃ 연장 30초 진행하는 것을 모두 30회 진행한 후, 최종적으로 72℃에서 다시 7분 동안의 연장을 진행하였다.
2.5% 아가로스 젤에서 산물을 전기영동하였다. PCR 증폭 후, F1R1를 이용한 증폭으로 밝고 선명한 100bp보다 조금 큰 밴드가 확인되었는데, 이로써 프라이머 3’말단의 두번째 염기와 주형간의 미스매치가 PCR의 효율에 영향을 미치지 않았음을 알 수 있었다.
4. HpaII 효소 절단 검사
상기 PCR 산물은 PDS 유전자 IVS7-2 부위를 포함하므로, 만일 주형이 IVS7-2A→G 돌연변이형 분자라면 114bp의 PCR 산물에 HpaII 효소 절단 부위가 존재하므로 HpaII 효소 절단시 83-85bp와 29-31bp의 2개 밴드(젤에서는 오직 83-85bp를 표시하는 하나의 밴드만 볼 수 있음)가 나타나지만; 만일 주형이 mtDNA 야생형 분자라면 114bp의 PCR 산물에는 HpaII 효소 절단 부위가 존재하지 않으므로 HpaII에 의하여 절단되지 않아 효소 절단후에도 여전히 114bp의 하나의 밴드로 존재한다.
샘플의 PCR 증폭 산물은 하기 검사 조건으로 IVS7-2A→G 돌연변이를 검사하였다.
효소 절단 반응 시스템:
PCR 산물 12-18㎕
10× 완충액 3㎕
HpaII 제한 효소 5-10u
BSA 0.3㎕
3차 증류수는 반응 총 부피가 30㎕이 되도록 잔량으로 첨가하며, 37℃에서 한시간 배양하였다. 효소 절단 반응물은 2.5% 아가로스 젤로 확인한다.
5. 결과
효소 절단 후 실시한 젤 전기영동에서, 66명의 청각 장애 환자들 중에서 57명의 결과에서만 100bp 이상의 밴드 1개만 발견되었는데 이는 IVS7-2A→G 돌연변이가 없음을 의미하며, 4명의 결과에서는 100bp보다 큰 밴드 1개와 100bp 크기의 다른 밴드 1개가 발견되었으며, 큰 밴드가 작은 밴드보다 밝은 색을 띄어 이는 IVS7-2A→G의 이형접합체 돌연변이임을 의미하며, 그외 5명의 결과에서는 100bp보다 작은 1개의 밴드가 발견되었는데 이는 IVS7-2A→G의 동형접합체 돌연변이의 존재를 의미한다(일부 테이터는 도 1 참조).
6．HpaII 효소 절단 방법의 신뢰성 검사
5명의 효소 절단 검사로부터 PDS 유전자 IVS 7-2 A→G 동형접합체 돌연변이가 있는 것으로 입증된 DNA 샘플에 대해, 엑손 7과 8의 직접 서열분석을 진행한 결과, IVS 7-2 부위에 A→G의 동형접합체 치환이 있는 것으로 확인되었으며, 4명의 효소 절단 검사로부터 PDS 유전자 IVS 7-2 A→G 이형접합체 돌연변이가 있는 것으로 입증된 DNA 샘플에 대해 엑손 7과 8의 직접 서열분석을 진행한 결과, IVS 7-2 부위에 A -> G의 이형접합체 치환이 있는 것으로 확인되었다. 11명의 효소 절단 검사로부터 PDS 유전자 IVS 7-2 A→G 돌연변이가 있는 것으로 입증된 DNA 샘플에 대한 엑손 7과 8의 직접 서열분석을 진행한 결과, IVS 7-2 부위가 정상이었다(도 2 참조). 이어 진행한 측두골 CT 검사 결과에서, 9명의 IVS 7-2 A→G 돌연변이 개체(동형접합체 또는 이형접합체)에서는 모두 전정 도수관 확장 증후군 증세가 발견되었으며, 음성 개체에는 전정 도수관 이상이 발견되지 않았다(표 1 참조).
표 1. IVS 7-2A→G 키트 검사, 서열분석 및 측두골 CT 검사 결과 대조표
돌연변이 유형 IVS 7-2A→G 시약 키트 방법 서열분석 측두골 CT
동형접합체 5명 5명 5명 전정 도수관 확장 증후군
이형접합체 4명 4명 4명 전정 도수관 확장 증후군
음성 11명 11명 11명 모두 이상없음
실시예 2: 발바닥 혈액 DNA를 추출하여 PDS 유전자 IVS7-2 돌연변이를 검사하는 방법
1. 발바닥 혈액 검사에 적합한 I형 시약 키트(100인분)에는 아래와 같은 성분이 포함된다.
(1) 용액I(주요 성분은 5% Chelex) 25ml.
(2) PCR 시약(8mM dNTP 150㎕, 10× PCR 완충액 1ml, 25mM Mg++ 용액 1ml, 3차 증류수 1ml × 4튜브, 5u/㎕ Taq 효소 25㎕ 포함).
(3) 정방향 프라이머 F1 및 역방향 프라이머 R1(실시예 1과 동일함), 정, 역방향 프라이머를 동일 비율로 혼합한 것(농도는 각각 10nM) 150㎕.
(4) 제한 효소 HpaII, 20u/㎕, 110㎕ 및 해당 10× 완충액 1ml.
(5) 양성 대조군 125㎕, 음성 대조군 125㎕.
(6) 사용 설명서.
2. 검사대상
CT 검사를 통해 전정 도수과 확장 증후군이 검증된 PDS 유전자 IVS7-2 A→G 동형접합체 돌연변이 보인자 1명과 청각이 정상인 부모(모두 이형접합체 돌연변이 보인자) 및 PDS 유전자 IVS7-2 A→G 돌연변이가 없는 청각이 정상인 두 사람을 대상으로 한다.
3. 검사 방법 및 결과
키트의 사용 설명서에 따라, 용액1(주요 성분은 5% Chelex)을 사용하여 검사 대상의 발바닥 혈액으로부터 DNA를 추출하고, 그 중 50ng을 주형으로 하여, 프라이머 혼합물 100ng, 10× dNTP 5㎕, 10× 완충액 5㎕, Mg++을 최종 농도 1.5mmol/L로 첨가한 후, 반응 부피가 50㎕이 되도록 3차 증류수를 가한 다음, 1.0u Taq 효소를 가하고, 95℃ 변성, 5분 -> 94℃ 변형, 30초 -> 55℃ 어닐링, 30초 -> 72℃ 연장, 30초의 반응을 모두 30회 진행한 후, 최종적으로 72℃에서 다시 7분 동안의 연장을 진행한다. 동일한 PCR 반응 조건으로, 시약 키트에 포함된 PDS 유전자 IVS7-2 A→G 이형접합체 돌연변이 양성 주형과 음성 주형을 이용하여 동시에 양성 및 음성 대조군 PCR 반응을 진행하고, 주형을 첨가하지 않은 PCR 블랭크 대조군을 준비한다. 반응을 종결한 후, 2.5% 아가로스 젤 전기영동으로 증폭 산물을 조사하였고, 그 결과 주형이 무첨가된 대조군에서는 증폭 산물이 발견되지 않았으며, 환자, 이의 부모, 정상 개체, 음성 및 양성 대조군의 PCR 산물은 모두 114bp였다. PCR 산물은 HpaII 효소 절단을 통하여 검사하며, 효소 절단 반응 시스템은 30㎕이고, 하기 성 분들을 포함한다.
10×완충액 3㎕
100 BSA 0.3㎕
HpaII 20u
PCR 산물 12-18㎕
3차 증류수를 잔량으로 첨가한 다음, 37℃에서 한시간 배양한다. 효소 절단 반응물은 2.5% 아가로스 젤 전기영동하였고, 그 결과 전정 도수관 확장 증후군으로 인한 청각 장애 환자의 효소 절단 산물에서는 83-85bp 밴드를 발견할 수 있었는데, 이는 PDS 유전자 IVS7-2 A→G 동형접합체 돌연변이의 존재를 나타내며; 전정 도수관 확장 증후군 환자의 부모와 양성 대조군의 효소 절단 산물에서는 83-85bp와 114bp 밴드가 발견되어 PDS 유전자 IVS7-2 A→G 이형접합체 돌연변이가 존재하는 것으로 확인되었으며; 2명의 청각 정상 개체와 음성 대조군에서는 단지 114bp 밴드만 나타나 PDS 유전자 IVS7-2 A→G 돌연변이가 없는 것으로 확인되었다. 나아가, 서열분석에서 환자가 IVS7-2 A→G 동형접합체 돌연변이를 가지고 있으며, 이의 부모들은 IVS7-2 A→G 이형접합체 돌연변이를 가지고 있는 것으로 밝혀졌으며, 이러한 결과는 보인자의 상태와 부합되었으며, 청각이 정상인 2명의 개체는 어떠한 IVS7-2 A→G 돌연변이도 가지고 있지 않았다.
실시예 3: 체외에서 PDS 유전자 IVS7-2 돌연변이를 검사하기 위한 II형 키트 및 응용
본 실시예의 검사 대상은 실시예 2와 같다. 검사 대상 샘플은 말초 혈액이고, 시약 키트의 혈액 샘플 DNA 추출 시약은 시중에서 판매하는 말초 혈액 DNA 추출 시약 키트이고 상기 시약 키트를 이용하여 말초 혈액 DNA를 추출하는 것을 제외하고는, 키트에 포함된 기타 성분 및 검사 방법은 실시예 2와 동일하였다. 검사 결과는 실시예 2와 동일한 바, 즉 전정 도수관 확장성 청각 장애 환자의 효소 절단 산물에서는 83-85bp 밴드를 발견할 수 있었고, 이는 PDS 유전자 IVS7-2 A→G 동형접합체 돌연변이가 있음을 의미하며; 전정 도수관 확장 증후군 환자의 부모와 양성 대조군의 효소 절단 산물에서는 83-85bp와 114bp 밴드를 발견할 수 있어 PDS 유전자 IVS7-2 A→G 이형접합체 돌연변이가 있는 것으로 확인되었으며; 2명의 청각 정상인 개체와 음성 대조군에서는 단지 114bp 밴드만 발견할 수 있어 PDS 유전자 IVS7-2 A→G 돌연변이가 없는 것으로 확인되었다.
실시예 4: 체외에서 PDS 유전자 IVS7-2 돌연변이를 검사하기 위한 III형 키트 및 응용
본 실시예의 검사 대상은 실시예 2와 같다. 검사 대상 샘플이 혈액 샘플에서 추출한 DNA이고, 키트에 혈액 샘플 DNA를 추출하는 시약이 포함되지 않은 것을 제외하고는, 키트에 포함된 기타 성분과 검사 벙법은 실시예 2와 동일하다. 검사 결과도 실시예 2와 동일하였다.
본 발명은 체외에서 전정 도수관 확장 증후군과 관련있는 PDS 유전자 돌연변 이를 결정하는 프라이머와 키트를 포함하며, 이는 상기 돌연변이에 의해 발생되는 전정 도수관 확장 증후군의 신속한 스크리닝과 진단 및 예방에 방편을 제공하여, 전정 도수관 확장 증후군의 발병율을 낮출 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Jin zheng-ce <120> A method for preparing primer used for determining the mutation in the PDS gene of large vestibular aqueduct syndromic hearing loss in vitro and the use of said primer <160> 4 <170> PatentIn Version 2.1 <210> 1 <211> 336 <212> DNA <213> Homo Sapiens <220> <221> prim_transcript <222> (1)...(336) <223> exon7+intron7+exon8 of the PDS gene，the A at position 252 is PDS IVS7-2 site <400> 1 ACGCTGGTTG AGATTTTTCA AAATATTGGT GATACCAATC TTGCTGATTT CACTGCTGGA 60 TTGCTCACCA TTGTCGTCTG TATGGCAGTT AAGGAATTAA ATGATCGGTT TAGACACAAA 120 ATCCCAGTCC CTATTCCTAT AGAAGTAATT GTGGTAAGTA GAATATGTAG TTAGAAAGTT 180 CAGCATTATT TGGTTGACAA ACAAGGAATT ATTAAAACCA ATGGAGTTTT TAACATCTTT 240 TGTTTTATTT CAGACGATAA TTGCTACTGC CATTTCATAT GGAGCCAACC TGGAAAAAAA 300 TTACAATGCT GGCATTGTTA AATCCATCCC AAGGGG 336 <210> 2 <211> 4 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> the restriction recognizing site of Hpa II <400> 2 CCGG 4 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> forward primer F1 <400> 3 TGGAGTTTTT AACATCTTTT GTTTTATTCC 30 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> reverse primer R1 <400> 4 CCCTTGGGAT GGATTTAACA 20

Claims (10)

  1. PDS 유전자의 7 및 8번 엑손 서열과 상기 두 개의 엑손 사이의 7번 인트론 서열을 토대로, 252번 염기에 IVS7-2 돌연변이 부위 A→G를 포함하는 서열번호 1을 증폭하기 위한 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 생물 프로그램을 이용하거나 이용하지 않고 제작하는 단계를 포함하며;
    상기 프라이머는 상기 돌연변이 부위의 상하위 1-13개의 염기 영역내에 하나의 염기 치환 돌연변이를 도입하여, 증폭 산물에 IVS7-2 야생형 A 부위와 돌연변이형 G를 구별하는데 이용할 수 있는 새로운 제한 효소 절단 부위를 만드는 것을 특징으로 하는,
    체외에서 전정 도수관 확장 증후군(large vestibular aqueduct syndrome)과 관련있는 IVS7-2A→G 부위 돌연변이를 검출하기 위한 프라이머 쌍의 제조 방법.
  2. 제 1항에 있어서, PDS 유전자 증폭 주형에 대해 정방향 프라이머 3’ 말단의 2번째 위치에 T-C 인공 돌연변이를 도입하여, 증폭 산물에 서열번호 2의 새로운 제한 효소 절단 부위 HpaII를 만드는 것을 특징으로 하는 체외에서 전정 도수관 확장 증후군과 관련있는 IVS7-2A→G 부위 돌연변이를 검출하기 위한 프라이머 쌍의 제조 방법.
  3. 제 1항 또는 2항의 방법으로 제조된 프라이머 쌍으로서,
    제조된 프라이머 쌍의 정방향 프라이머와 역방향 프라이머의 길이는 바람직하게는 10-40bp이고, 더 바람직하게는 15-35bp이고, 가장 바람직하게는 18-32bp인 것을 특징으로 하는 체외에서 전정 도수관 확장 증후군과 관련있는 IVS7-2A→G 부위 돌연변이를 검출하기 위한 프라이머 쌍.
  4. 제 3항에 있어서,
    정방향 프라이머는 서열번호 3과 동일한 서열을 가지며, 3’말단에서 2번째 위치에 T-C 인공 돌연변이가 도입되어 있으며,
    역방향 프라이머는 서열번호 4와 동일한 서열을 가지며,
    상기 프라이머 쌍은 PDS 유전자의 IVS7-2 돌연변이 부위 A→G에 새로운 제한 엔도뉴클레아제 HpaII 부위를 도입할 수 있는 것을 특징으로 하는 체외에서 전정 도수관 확장 증후군과 관련있는 IVS7-2A→G 부위 돌연변이를 검출하기 위한 프라이머 쌍.
  5. 체외에서 전정 도수관 확장 증후군과 관련있는 IVS7-2A→G 부위 돌연변이를 검출하는 시약 키트 또는 유사 제품을 제조하기 위한 제 3항 또는 4항에 따른 프라이머 쌍의 용도.
  6. 제 3항 또는 4항의 프라이머를 포함하며, 체외에서 전정 도수관 확장 증후군과 관련있는 IVS7-2A→G 부위 돌연변이를 검출하는데 사용되는 키트 및 유사 제품 으로서,
    (1) PCR 증폭 반응 시약;
    (2) 동일 비율로 혼합된 제 3 항 또는 4항의 정방향 프라이머와 역방향 프라이머;
    (3) 새로운 제한 엔도뉴클레아제 및 해당 완충액;
    (4) 선택적으로, 음성 대조군 및 양성 대조군; 및
    (5) 사용 설명서
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트 및 유사 제품.
  7. 제 6항에 있어서, 혈액 샘플 DNA를 추출하기 위한 시약 및 키트를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트 및 유사 제품.
  8. 제 7항에 있어서, 혈액 샘플 DNA를 추출하기 위한 시약 및 키트는 주요 성분이 Chelex인 DNA 용해 완충액 용액I을 포함하는 발바닥 혈액으로부터 샘플 DNA를 추출하는 I형 시약 키트 또는 시약, 또는 말초 혈액 샘플 DNA를 추출하기 위한 II형 시약 키트 또는 시약을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트 및 유사 제품.
  9. (1) 제 1항 또는 2항에 따른 방법으로 제조된 프라이머 쌍을 이용하여 샘플에 대한 PCR 증폭을 진행하거나, 또는 제 3항 또는 4항에 따른 프라이머 쌍을 이용하여 직접 증폭을 진행하거나, 또는 제 6항 내지 8항중 어느 한항에 따른 키트 및 유사 제품을 이용하여 야생형과 돌연변이형 샘플에 대한 증폭을 진행하여, 동일한 길이의 증폭 산물을 수득하는 단계;
    (2) 프라이머 쌍에 의해 증폭 산물에 도입한 새로운 제한 엔도뉴클레아제 부위에 근거하여, 상기 제한 엔도뉴클레아제를 이용하여 증폭 산물에 대한 제한 효소 절단을 진행하는 단계;
    (3) 효소 절단 산물을 전기영동으로 분석하여, IVS7-2 A→G 돌연변이를 포함하는 증폭 산물에서는 새로운 제한성 엔도뉴클레아제 부위의 존재로 인해 효소 절단 후 여러 개의 밴드를 수득하고, IVS7-2 A→G 돌연변이를 포함하지 않는 증폭 산물에서는 새로운 제한성 엔도뉴클레아제 부위의 부재로 인해 효소 절단 후 하나의 밴드만을 수득하는 단계;
    (4) 효소 절단 전기영동 결과를 토대로, 검사 대상 샘플에 전정 도수관 확장 증후군 관련 PDS 유전자의 IVS7-2 A→G 돌연변이 존재 여부를 판단하는 단계;
    를 포함하는, 체외에서 전정 도수관 확장 증후군과 관련있는 PDS 유전자 IVS7-2 A→G 돌연변이를 검출하는 방법.
  10. 제 9항에 있어서,
    상기 프라이머 쌍은 서열번호 3과 동일한 정방향 프라이머와 서열번호 4와 동일한 역방향 프라이머이고,
    상기 새로운 제한 효소는 HapII이고,
    상기 동일한 길이의 증폭 산물은 114bp의 증폭 산물이고,
    상기 IVS7-2 A→G 돌연변이를 포함하는 증폭 산물에서는 효소 절단시 83-85bp 및 29-31bp의 두 개의 밴드가 수득되지만, 상기 IVS7-2 A→G 돌연변이를 포함하지 않는 증폭 산물에서는 효소 절단시 여전히 114bp의 하나의 밴드가 수득되는
    것을 특징으로 하는 체외에서 전정 도수관 확장 증후군과 관련있는 PDS 유전자 IVS7-2 A→G 돌연변이를 검출하는 방법.
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