CN107099616A - 检测ret基因突变的引物组及其应用和应用其的产品以及检测ret基因突变的方法 - Google Patents

检测ret基因突变的引物组及其应用和应用其的产品以及检测ret基因突变的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种检测RET基因突变的引物组及其应用和应用其的产品以及检测RET基因突变的方法，涉及基因工程技术领域。本发明提供的检测RET基因突变的引物组，包括用于检测RET基因多个外显子的引物对中的一种或两种以上，检测全面，应用广泛。本发明提供的用于检测RET基因突变的试剂，包括本发明提供的引物组，检测快速，准确。本发明提供的用于检测RET基因突变的试剂盒，包括本发明提供的引物组或试剂，能够快速、准确地检测RET基因的突变，灵敏度高、特异性强。本发明提供的检测RET基因突变的方法，操作简单，成本低廉，耗时短，临床应用范围广。

Description

检测RET基因突变的引物组及其应用和应用其的产品以及检 测RET基因突变的方法
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其是涉及一种检测RET基因突变的引物组及其应用和应用其的产品以及检测RET基因突变的方法。
背景技术
原癌基因RET(REarranged during Transfection；OMIM：164761)定位于人类染色体10q11.2，全长80kb，含21个外显子(约长55kb)，其剪接变异体包含RET基因的第1～19外显子，并带有独特的3’末端序列。RET编码1114个氨基酸的酪氨酸激酶受体，主要在神经内分泌细胞、泌尿生殖系统和中央或外周神经细胞系统中表达。RET蛋白属于细胞表面分子，包括胞外区、跨膜区和胞内区功能域，与胶质细胞衍生神经营养因子(glial-derivedneurotropic factor，GDNF)家族的配体：GDNF、neurturin、persephin和artemin相互作用，转导细胞分化和生长的信号。RET基因在体内和体外均能通过细胞遗传学重排激活成为致癌基因。种系水平RET突变(获得功能突变)可导致起源于神经嵴细胞的多发性内分泌腺瘤2型(Multiple endocrine neoplasia type 2，MEN 2)的发生，目前已发现超过166种RET变异体，其中70余种RET突变体可引起MEN2的发生。
MEN 2包括2种亚型：2A型(MEN 2A；占95％)和2B型(MEN 2B；占5％)。发病率约为1/30000。经典型MEN2A的临床主要表现为2种或以上特定的内分泌肿瘤：甲状腺髓样癌(medullary thyroid carcinoma，MTC；95％～100％)、肾上腺嗜铬细胞瘤(pheochromocytoma，PHEO；50％)和甲状旁腺功能亢进(hyperparathyroidism，HPT；20％～30％)。少部分MEN2A患者伴发肩背部区域(T2～T6)瘙痒性皮肤苔藓淀粉样变(cutaneouslichen amyloidosis，CLA；9％)或伴先天性巨结肠症(hirschsprung disease,HSCR；7％)，或仅患有MTC且不伴其它内分泌腺肿瘤的家族性MTC(familial medullary thyroidcarcinoma，FMTC；15％)。MEN2B患者很早就表现为侵袭性MTC，其他症状包括PHEO(50％)、舌前背、腭、咽黏膜神经节瘤(70％～100％)和胃肠道弥漫性神经节瘤(40％～90％)、眼部异常(上睑缘外翻，泪液分泌减少)和角膜增厚(60％～90％)和Marfan样体征(75％)或可伴发无临床意义的甲状旁腺瘤/增生。
与MEN 2相关的RET突变绝大多数为杂合性种系突变，极少数为纯合子或双突变、多位点突变，突变热区主要集中于RET基因的第5、8、10、11、13-16外显子：(1)在约98％的MEN 2A家系可见种系水平的RET基因第10和11外显子突变，其中约87％以上的突变发生在RET基因第11外显子第630(C630F/R/S/Y)、634(C634F/G/R/S/W/Y)位密码子点突变；其余突变多发生在第10外显子第609位(C609F/G/R/S/Y)、第611位(C611F/G/R/S/W/Y)、第618位(C618F/G/R/S/Y)和第620位(C620F/G/R/S/W/Y)密码子，即半胱氨酸被置换。在约95％的FMTC家系和7％的散发性MTC患者中可见种系水平的RET基因突变，典型的是第609位、第611位、第618位、第620位和第634位密码子突变，其中第618位、第620位和第634位的突变各占20％～30％。其余的突变发生在第5、8、13-16外显子，又以第768位和第804为密码子为常见。(2)MEN2B患者RET基因突变约95％为第16外显子的M918T，4％为第15外显子的A883F突变。这些特异的RET基因突变型转化甲状腺C细胞增生进展至MTC的活力呈现明显的年龄相关性，即突变型转化活力强的，MEN2-MTC侵袭性更强、发病年龄更早，其MTC的诊断年龄和外显率较PHEO更早或更高，反之亦然。RET突变基因型和临床表型呈现出很好的相关性。
1)第10外显子第609、611、618、620位和第11外显子第630、634位密码子是FMTC和MEN 2A最常见的突变位点，且常为半胱氨酸残基的错义突变。RET基因半胱氨酸残基替换导致在未与配体结合下使RET单体通过二硫键自身聚合，形成畸变的同源二聚体，启动胞内酪氨酸残基磷酸化，异常激活酪氨酸蛋白激酶活性(RET蛋白二聚体的激酶活性至少是单体的10倍)。
2)第13外显子第768、790、791位密码子、第14外显子第804、819、833、844和15外显子第866、891位密码子等。胞内区突变常为非半胱氨酸密码子突变；上述位点突变导致的激酶自身磷酸化活性较低、转化能力较弱，往往与FMTC表型密切相关，仅见少部分突变与其他MEN 2A亚型相关。
3)同为胞内区的RET基因第15外显子A833F和第16外显子M918T突变主要与MEN2B有关。这类突变具有超强的激酶活性和激活大多以单体形式的受体转化活性，导致底物结合区构象的改变、不适当底物磷酸化刺激信号转导途径，使正常RET基因不能参与这一信号转导途径。
4)其他，可见于RET基因的5号外显子(V292M)和8号外显子(c.1585_1593dupGAGGAGTGT；G533C)可导致MEN 2A或FMTC。
依据MEN 2的表型可做出临床诊断，但MEN 2的精准诊断需基于种系RET突变检测，后者是诊断MEN 2的金标准，也是与散发MTC/PHEO/HPT的本质区别所在。国际MTC诊治指南：美国甲状腺协会(ATA)-2015、欧洲甲状腺协会(ETA)-2012和美国国家癌症网(NCCN)-2010均推荐对所有首诊MTC患者进行RET突变检测，对突变者的其他家族成员进行RET突变筛查：(1)MTC患者其一生中进行一次RET突变检测可明确是不是MEN 2；(2)循MEN 2患者进行家系调查和RET突变筛查，可发现RET突变者在没有出现MEN 2临床症状前得以早期明确诊断；(3)依据RET突变危险分级整合血清降钙素水平等，对MEN 2患者实施早期个体化精准治疗或监视随访；(4)有别于无症状散发MTC患者，大多限于体检发现或并经穿刺活检病理明确诊断后才进行治疗；(5)5.6％～9％的MEN 2A为De novo RET突变，90％的MEN 2B为De novoRET-M918T所致，有利于此部分原先考虑“散发MTC”诊断的修正及其子代的及时治疗或监视；(6)MEN 2相关伴随疾病的及早准确诊治；(7)有利于MEN 2的预防。因此加强MTC/PHEO等患者的RET基因筛查(分子诊断)，进行遗传咨询指导，积极采取临床早期干预措施及其综合规范治疗，有效实践转化医学和精准医疗，可最大限度减少MEN 2的临床危害。
目前，对RET基因突变的检测方法相对复杂，使用效率相对较低。因此，开发一种能够快速、准确、有效的检测RET基因突变的试剂盒及操作简单的检测方法尤为重要。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种检测RET基因突变的引物组，本发明的第二个目的在于提供上述引物组在检测RET基因突变中的应用，本发明的第三个目的在于提供上述引物组在制备用于检测RET基因突变的产品中的应用，本发明的第四个目的在于提供一种用于检测RET基因突变的试剂，本发明的第五个目的在于提供一种用于检测RET基因突变的试剂盒，本发明的第六个目的在于提供一种检测RET基因突变的方法，以缓解现有技术中存在的对RET基因突变的检测尚不全面，并且检测方法复杂，效率低的技术问题。
本发明提供的一种检测RET基因突变的引物组，所述引物组包括如下7个引物对中的至少一个引物对，所述7个引物对为：
用于检测RET基因第5外显子的引物对，用于检测RET基因第8外显子的引物对，用于检测RET基因第10外显子的引物对，用于检测RET基因第11外显子的引物对，用于检测RET基因第13外显子的引物对，用于检测RET基因第14外显子和/或第15外显子的引物对以及用于检测RET基因第16外显子的引物对；
所述用于检测RET基因第5外显子的引物对包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
所述用于检测RET基因第8外显子的引物对包括SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；
所述用于检测RET基因第10外显子的引物对包括SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列；
所述用于检测RET基因第11外显子的引物对包括SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列；
所述用于检测RET基因第13外显子的引物对包括SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列；
所述用于检测RET基因第14外显子和/或第15外显子的引物对包括SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列；
所述用于检测RET基因第16外显子的引物对包括SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的核苷酸序列。
进一步地，所述引物组由7个所述引物对组成。
本发明还提供了上述的引物组在检测RET基因突变中的应用。
本发明还提供了上述的引物组在制备用于检测RET基因突变的产品中的应用。
进一步地，所述产品为试剂。
本发明还提供了一种用于检测RET基因突变的试剂，包括上述的引物组。
本发明还提供了一种用于检测RET基因突变的试剂盒，包括上述的引物组或试剂。
本发明还提供了一种检测RET基因突变的方法，应用上述的引物组或试剂或试剂盒。
进一步地，所述方法包括：以所述引物组为引物，以待测样本的DNA为模板，进行PCR扩增反应，得到PCR扩增产物并对所述扩增产物进行测序，得到测序结果，对所述测序结果进行分析并注明突变位点。
进一步地，所述测序使用的引物为：所述SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述SEQID NO.4所示的核苷酸序列，所述SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，所述SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列，所述SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列，所述SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列，所述SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列，所述SEQ ID NO.13所示的核苷酸序列。
本发明提供的检测RET基因突变的引物组，包括用于检测RET基因第5外显子、第8外显子、第10外显子、第11外显子、第13外显子、第14外显子和/或第15外显子、第16外显子的引物对中的一种或两种以上，可同时检测RET基因的多种突变，检测全面，应用广泛。本发明提供的用于检测RET基因突变的试剂，包括本发明提供的引物组，检测快速，准确。本发明提供的用于检测RET基因突变的试剂盒，包括本发明提供的引物组或试剂，能够快速、准确地检测RET基因的突变，灵敏度高、特异性强，能对MEN 2患者的诊断、治疗及遗传咨询方面提供指导，达到早发现、早治疗，以期患者得到更多获益。本发明提供的检测RET基因突变的方法，操作简单，成本低廉，耗时短，临床应用范围广。
附图说明
图1为本发明实施例2提供的样本PCR产物电泳鉴定图；
图2为本发明实施例2提供的样本DNA测序结果峰图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种检测RET基因突变的引物组，包括如下7个引物对中的至少一个引物对，所述7个引物对为：
本发明提供的检测RET基因突变的引物组，可同时检测RET基因的多种突变，检测全面，应用广泛。
在本发明中，引物组由上述7个所述引物对组成。
本发明还提供了上述的引物组在检测RET基因突变中的应用。
本发明还提供了上述的引物组在制备用于检测RET基因突变的产品中的应用。
在本发明中，用于检测RET基因突变的产品为试剂。
本发明还提供了一种用于检测RET基因突变的试剂，包括上述的引物组。
本发明提供的用于检测RET基因突变的试剂，包括本发明提供的引物组，检测快速，准确。
本发明还提供了一种用于检测RET基因突变的试剂盒，包括上述的引物组或试剂。
在本发明中，用于检测RET基因突变的试剂盒还包括PCR缓冲液、dNTPs、MgCl2、TaqDNA聚合酶和模板DNA。
本发明提供的用于检测RET基因突变的试剂盒，包括本发明提供的引物组或试剂，能够快速、准确地检测RET基因的突变，灵敏度高、特异性强，能对MEN 2患者的治疗提供遗传学方面的指导，达到提早发现，早期治疗，以使患者得到更多的获益的目的。
本发明还提供了一种检测RET基因突变的方法，应用上述的引物组或试剂或试剂盒。
其中，检测RET基因突变不以疾病的诊断与治疗为目的。
在本发明中，该方法包括：以引物组为引物，以待测样本的DNA为模板，进行PCR扩增反应，得到PCR扩增产物并对扩增产物进行测序，得到测序结果，对测序结果进行分析并注明突变位点。
其中，PCR扩增体系为：
试剂 体积
10×PCR缓冲液 5μL
dNTPs(2.5mM) 3μL
上游引物 10μM
下游引物 10μM
TaqDNA聚合酶 1μL(2U)
Template 20-50ng
H2O Up to 50μL
PCR扩增条件为：
95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸5min。
在本发明中，测序使用的引物为：用于检测RET基因第5外显子的SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，用于检测RET基因第8外显子的SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，用于检测RET基因第10外显子的SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，用于检测RET基因第11外显子的SEQID NO.7所示的核苷酸序列，用于检测RET基因第13外显子的SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列，用于检测RET基因第14外显子的SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列，用于检测RET基因第15外显子的SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列，用于检测RET基因第16外显子的SEQ IDNO.13所示的核苷酸序列。
本发明提供的检测RET基因突变的方法，操作简单，成本低廉，耗时短，临床应用范围广。
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1样本的处理
取外周血2mL于EDTA抗凝管中，轻柔地颠倒混匀，4℃保存。
取200μL抗凝血，用试剂盒提取DNA，采用电泳凝胶成像对DNA纯度和浓度作检测。具体操作步骤如下：
加500μL Buffer AP1到1.5mL离心管中；
加200-250μL抗凝全血到Buffer AP1中，用移液器来回吸注几次，以彻底溶解残留在吸头上的血液；
盖紧离心管盖子，旋涡振荡10s；
加100μL Buffer AP2，旋涡振荡10s，2,000×g离心10min，得滤液；
将制备管置于2mL离心管中，将上述滤液加入到制备管中，12,000×g离心1min；
弃滤液，将制备管置回到原2mL离心管中，加入700μL Buffer W1A，室温放置2min12,000×g离心30s；
弃滤液，将制备管置回到原2mL离心管中，加入800μL已加无水乙醇的Buffer W2，12,000×g离心1min；
将弃滤液，将制备管置回原2mL离心管，12,000×g离心1min；
将制备管置于另一洁净的1.5mL离心管中，在silica膜中央加入80-200μL BufferTE，室温静置1min，12,000×g离心1min洗脱DNA。
实施例2样本的检测
(1)PCR反应体系的配置
在每一个反应孔中加入试剂盒中的PCR缓冲液、dNTPs、MgCl2、TaqDNA聚合酶、模板DNA的PCR反应体系如下：
试剂 体积
10×PCR缓冲液 5μL
dNTPs(2.5mM) 3μL
上游引物 10μM
下游引物 10μM
TaqDNA聚合酶 1μL(2U)
Template 20-50ng
H2O Up to 50μL
使用对应引物扩增目标外显子：
(2)PCR扩增条件为：
95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸5min。结果如图1所示。其中，泳道1-8分别为DL2000marker，以SEQ3/SEQ4、SEQ13/SEQ14、SEQ11/SEQ12、SEQ9/SEQ10、SEQ1/SEQ2、SEQ7/SEQ8、SEQ5/SEQ6为引物的PCR产物。
(3)PCR产物纯化：
为了提高回收效率，使用磁珠纯化的方式，对PCR产物进行快速纯化。
(4)使用ABI 3730XL测序仪器测序：
测序PCR反应条件：1μL BigDye(2.5×)+1.5μL BigDye Seq Buffer(5×)+1μL测序引物+2μL PCR纯化产物+3.5μL ddH20。95℃预变性1min；95℃变性30s，50℃退火10s，60℃延伸3min，25个循环；72℃延伸5min。
使用酒精/NaAC/EDTA方法纯化后，按照ABI说明进行上机测序。
测序使用的引物为：用于检测RET基因第5外显子的SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，用于检测RET基因第8外显子的SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，用于检测RET基因第10外显子的SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，用于检测RET基因第11外显子的SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列，用于检测RET基因第13外显子的SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列，用于检测RET基因第14外显子的SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列，用于检测RET基因第15外显子的SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列，用于检测RET基因第16外显子的SEQ ID NO.13所示的核苷酸序列。
(5)使用软件对测序结果进行分析
测序完成后，对测序的结果使用Seqscap软件进行分析，并注明突变位点。结果如图2所示。
(6)结论
通过对这几个外显子的比对分析，发现了突变，结果如下：
突变位点 突变方式 密码子改变 RS号
5号外显子 无突变 - - -
8号外显子 无突变 - - -
10号外显子 无突变 - - -
11号外显子 c.1901 G>A TGC>TAC rs75996173
13号外显子 无突变 - - -
14号外显子 无突变 - - -
15号外显子 无突变 - - -
16号外显子 无突变 - - -
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国人民解放军第一一七医院
上海祥音生物科技有限公司
<120> 检测RET基因突变的引物组及其应用和应用其的产品以及检测RET基因突变的
方法
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atctggtcca cctatgggct 20
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<211> 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
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<211> 20
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<400> 7
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<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
cacctcatca cagtcccacc 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tgcggggaat ttctgtggac 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
tgacaatgtt cctgccatgc 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gctgtgtcca cccccttact 20
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gcggagttct aattgggtcc t 21
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gctccagccc cttcaaagat 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
ctttgagcag tttggggcac 20

Claims (10)

1.一种检测RET基因突变的引物组，其特征在于，所述引物组包括如下7个引物对中的至少一个引物对，所述7个引物对为：
用于检测RET基因第5外显子的引物对，用于检测RET基因第8外显子的引物对，用于检测RET基因第10外显子的引物对，用于检测RET基因第11外显子的引物对，用于检测RET基因第13外显子的引物对，用于检测RET基因第14外显子和/或第15外显子的引物对以及用于检测RET基因第16外显子的引物对；
所述用于检测RET基因第5外显子的引物对包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
所述用于检测RET基因第8外显子的引物对包括SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；
所述用于检测RET基因第10外显子的引物对包括SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列；
所述用于检测RET基因第11外显子的引物对包括SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列；
所述用于检测RET基因第13外显子的引物对包括SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列；
所述用于检测RET基因第14外显子和/或第15外显子的引物对包括SEQ ID NO.11和SEQID NO.12所示的核苷酸序列；
所述用于检测RET基因第16外显子的引物对包括SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述引物组由7个所述引物对组成。
3.如权利要求1或2所述的引物组在检测RET基因突变中的应用。
4.如权利要求1或2所述的引物组在制备用于检测RET基因突变的产品中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述产品为试剂。
6.一种用于检测RET基因突变的试剂，其特征在于，包括权利要求1或2所述的引物组。
7.一种用于检测RET基因突变的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的引物组或权利要求6所述的试剂。
8.一种检测RET基因突变的方法，其特征在于，应用权利要求1或2所述的引物组或权利要求6所述的试剂或权利要求7所述的试剂盒。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法包括：以所述引物组为引物，以待测样本的DNA为模板，进行PCR扩增反应，得到PCR扩增产物并对所述扩增产物进行测序，得到测序结果，对所述测序结果进行分析并注明突变位点。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述测序使用的引物为：所述SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列，所述SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，所述SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，所述SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列，所述SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列，所述SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列，所述SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列，所述SEQ IDNO.13所示的核苷酸序列。
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