CN109439752B - 一种鉴别甲状腺髓样癌ret基因突变的特异性引物组合及其试剂盒及其用途 - Google Patents
一种鉴别甲状腺髓样癌ret基因突变的特异性引物组合及其试剂盒及其用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种快速鉴别甲状腺髓样癌RET基因突变的特异性引物组合，其特征在于，用于扩增甲状腺髓样癌RET基因突变中的如SEQ ID NO.1所示的序列，所述引物组合包括引物RET8、引物RET10、引物RET11、引物RET13、引物RET14、引物RET15、引物RET16的组合，本发明还公开了该引物组合的试剂盒及该引物组合的用途。本发明的引物组合，特异性强，准确覆盖目标区域片段，检测多种已知突变位点。本发明采用特异性引物和带有荧光边标记的混合溶液，对批量样本进行PCR扩增，再进行sanger测序分析，一次性可分析大量样本，同时对多个已知和未知突变进行检测，减少操作步骤，节省资源，提高效率。本发明试剂盒可广泛应用于临床甲状腺髓样瘤的辅助诊断检测，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种鉴别甲状腺髓样癌RET基因突变的特异性引物组合及其试剂盒及其用途。
背景技术
甲状腺髓样癌(MTC)是甲状腺恶性肿瘤之一，约占甲状腺癌的2％，MTC 包括遗传性MTC和散发性MTC，散发性MTC通常发生在四十到六十岁之间，临床表现不可预测，诊断时的年龄和疾病阶段与预后显著相关。遗传性MTC 主要为MEN2，MEN2有两种综合征MEN2A和MEN2B。MEN2A占MEN2 病例的95％，有四种变体：经典MEN2A(由统一存在的MTC和不太常见的嗜铬细胞癌(PHEO)或甲旁亢(HPTH)或两者出现)，MEN2A与皮肤苔藓淀粉样变(CLA)，MEN2A与先天性巨结肠病(HD)以及FMTC(具有MTC 但不是PHEO和HPTH的具有RET种系突变的家族或个体)。几乎所有 MEN2A，MEN2B，FMTC患者都携带RET胚系突变，约50％的散发性MTC 患者有RET突变，18％-80％缺乏体细胞RET突变的散发性MTC有HRAS， KRAS或极少NRAS的体细胞突变。散发性MTC中体细胞RET密码子M918T 突变似乎预示着进展的临床病程和不良预后。基于甲状腺髓样瘤RET，对于临床的应用指导有实际的意义，能够及时有效的筛查和区分高危人群，辅助疾病的诊断治疗以及预后。
目前针对甲状腺髓样瘤风险检测的同类服务项目较少，主要是针对甲状腺结节良恶性判断和分化型甲状腺癌的检测服务，我们依据临床指南中的明确要求，选择甲状腺髓样瘤相关的高风险的位点进行检测分析,弥补市场空白。甲状腺髓样瘤的基因检测包含PCR定量或NGS检测的方法。PCR定量每次可检测突变位点数量较少，同时进行多人多位点检测，工作量巨大；NGS检测价格高昂，检测周期长。
发明内容
为了克服现有技术的上述缺陷，本发明的目的之一在于提供一种鉴别甲状腺髓样癌RET基因突变的特异性引物组合。
本发明的目的之二在于提供一种包含鉴别甲状腺髓样癌RET基因突变的特异性引物组合的试剂盒。
本发明的目的之三在于提供一种鉴别甲状腺髓样癌RET基因突变的特异性引物组合的用途。
为了实现本发明的目的之一，所采用的技术方案是：一种快速鉴别甲状腺髓样癌RET基因突变的特异性引物组合，其特征在于，所述引物组合包括引物RET8、引物RET10、引物RET11、引物RET13、引物RET14、引物RET15、引物RET16：
引物RET8的序列为：
F:TCCCTGTCCTTGGGCACTAGC
R:CTTGGGCGTTTCCAGGGCTTA
引物RET10的序列为：
F:GGGACACTGCCCTGGAAATAT
R:TGCTGTTGAGACCTCTGTGGG
引物RET11的序列为：
F:AGCCATGAGGCAGAGCATACG
R:TGGGGAGGGCAGGGGATCTTC
引物RET13的序列为：
F:AAGCCTCAAGCAGCATCGTCT
R:GGAAACAGGGCAGGAGCAGTA
引物RET14的序列为：
F:ACACGAGCAGCAGGAGGCAGAG
R:TGGCTGGGTGCAGAGCCATAT
引物RET15的序列为：
F:GCCTGACGACTCGTGCTATTT
R:AAGATTTGGGGTGAGGGCTAT
引物RET16的序列为：
F:TCTGTGCCCAGGAGTGTCTACA
R:GCCATTTGCCTCACGAACA
在本发明的一个优选实施例中，所述的甲状腺髓样癌RET基因突变包括：
外显子8.10.11.13.14.15.16中的
G533C,C609F/G/R/S/Y,C611F/G/S/Y/W,C618F/R/S,C620F/R/S,C630 R/Y,D631Y,C634F/G/R/S/W/Y,K666E,E768D,L790F,V804L/M,A883F, S891A,R912P,M918T热点突变中的任意一种或多种。
为了实现本发明的目的之二，所采用的技术方案是：一种包含快速鉴别 XX的特异性引物组合的试剂盒，包括如下组成部分：
(1)PCR反应预混液，所述PCR反应预混液为qPCR SYBR Green Master Mix；
(2)快速鉴别甲状腺髓样癌RET基因突变的特异性引物组合
其中，所述引物组合包括引物RET8、引物RET10、引物RET11、引物RET13、引物RET14、引物RET15、引物RET16：
引物RET8的序列为：
F:TCCCTGTCCTTGGGCACTAGC
R:CTTGGGCGTTTCCAGGGCTTA
引物RET10的序列为：
F:GGGACACTGCCCTGGAAATAT
R:TGCTGTTGAGACCTCTGTGGG
引物RET11的序列为：
F:AGCCATGAGGCAGAGCATACG
R:TGGGGAGGGCAGGGGATCTTC
引物RET13的序列为：
F:AAGCCTCAAGCAGCATCGTCT
R:GGAAACAGGGCAGGAGCAGTA
引物RET14的序列为：
F:ACACGAGCAGCAGGAGGCAGAG
R:TGGCTGGGTGCAGAGCCATAT
引物RET15的序列为：
F:GCCTGACGACTCGTGCTATTT
R:AAGATTTGGGGTGAGGGCTAT
引物RET16的序列为：
F:TCTGTGCCCAGGAGTGTCTACA
R:GCCATTTGCCTCACGAACA
为了实现本发明的目的之三，所采用的技术方案是：一种鉴别甲状腺髓样癌RET基因突变的特异性引物组合的用途，所述的甲状腺髓样癌RET基因突变包括
外显子8.10.11.13.14.15.16中的
G533C,C609F/G/R/S/Y,C611F/G/S/Y/W,C618F/R/S,C620F/R/S,C630 R/Y,D631Y,C634F/G/R/S/W/Y,K666E,E768D,L790F,V804L/M,A883F, S891A,R912P,M918T热点突变中的任意一种或多种。
本发明的有益效果在于：
本发明的引物组合，特异性强，准确覆盖目标区域片段，检测多种已知突变位点。
本发明采用特异性引物和带有荧光边标记的混合溶液，对批量样本进行 PCR扩增，再进行sanger测序分析，一次性可分析大量样本，同时对多个已知和未知突变进行检测，减少操作步骤，节省资源，提高效率。
本发明试剂盒可广泛应用于临床甲状腺髓样瘤的辅助诊断检测，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1：引物组合RET11-1产物熔解曲线；
图2：引物组合RET16-1产物熔解曲线
图3：引物组合RET11-2产物熔解曲线；
图4：引物组合RET16-2产物熔解曲线。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的说明，但这些实施例不得用于解释对本发明的限制。
实施例1
使用本发明的引物检测甲状腺髓样瘤组织样本RET基因突变
1材料与方法
1.1样本来源
通过合作关系收集2017年1月1日到2018年6月30日复旦大学附属肿瘤医院头颈外科甲状腺髓样瘤组织标本25例，进行检测，抽取9例，分别记为样本一～样本九。
1.2标本提取
甲状腺髓样瘤组织标本液氮冷冻，-80℃冻存，4℃运送至实验室，-80℃保存备用。用天根血液/细胞/组织提取试剂盒(DP304-02)提取样本中的DNA， -20℃保存备用。
1.3合成PCR扩增引物
利用生物信息学知识和DNAstar等相关生物信息学软件，对Genbank数据库中所能检索到的RET基因核酸序列进行基因序列比对分析，选定目标区域的特异性序列，设计出针对各个区域的相应特异性基因片段的PCR引物(见表1)。
表1引物序列及扩增的目的片段长度
注：引物名称以基因对应的外显子编号命名；F代表上游引物，R代表下游引物。
1.4准备混合PCR引物工作液
(1)合成的每个PCR引物分别用双蒸水配制成100μmol/L的储存液；
(2)将引物配对并分为7组，每组1对引物，
第一组为引物组合I：分别取RET8-F,RET8-R对应的PCR引物储存液各 10μl加入到同一1.5ml Eppendorf管中，再加入80μl的双蒸水即为混合PCR 引物工作液I；
第二组为引物组合II：分别取RET10-F,RET10-R对应的PCR引物储存液各10μl加入到同一1.5ml Eppendorf管中，再加入80μl的双蒸水即为混合PCR 引物工作液II；
第三组为引物组合III：分别取RET11-F,RET11-R对应的PCR引物储存液各10μl加入到同一1.5ml Eppendorf管中，再加入80μl的双蒸水即为混合 PCR引物工作液III；
第四组为引物组合Ⅳ：分别取RET13-F,RET13-R对应的PCR引物储存液各10μl加入到同一1.5ml Eppendorf管中，再加入80μl的双蒸水即为混合PCR 引物工作液Ⅳ；
第五组为引物组合Ⅴ：分别取RET14-F,RET14-R对应的PCR引物储存液各10μl加入到同一1.5ml Eppendorf管中，再加入80μl的双蒸水即为混合PCR 引物工作液Ⅴ；
第六组为引物组合Ⅵ：分别取RET15-F,RET15-R对应的PCR引物储存液各10μl加入到同一1.5ml Eppendorf管中，再加入80μl的双蒸水即为混合PCR 引物工作液Ⅵ；
第七组为引物组合Ⅶ：分别取RET16-F,RET16-R对应的PCR引物储存液各10μl加入到同一1.5ml Eppendorf管中，再加入80μl的双蒸水即为混合PCR 引物工作液Ⅶ。
1.5PCR扩增反应：
(1)PCR反应体系：PCR扩增反应体系为20μl，其中包括2×qPCR SYBR GreenMaster Mix 10μl，混合PCR引物工作液I(或混合PCR引物工作液II 或混合PCR引物工作液III或混合PCR引物工作液Ⅳ或混合PCR引物工作液Ⅴ或混合PCR引物工作液Ⅵ或混合PCR引物工作液Ⅶ)1μl，样本(DNA) 100ng，补ddH2O至终体积为20μl；
(2)PCR反应程序：95℃5min→95℃0.5min、63℃0.5min、72℃0.5min (40个循环)→95℃1.5min、72℃1min(熔解曲线)→4℃保温。
1.6sanger测序
(1)取96孔反应板，使用记号笔标明板名、实验日期；
(2)制作电子版sanger测序表，并自动生成上机表；
(3)使用连续加样器，吸取990μl HIDI和10μl ROX500或LIZ500的混合物(ROX500和LIZ500为分子量内标)，加入到96孔反应板中，每孔10μl；
(4)将96孔板置于平板离心机中，离心500g即停；
(5)使用12排10μL排枪，对照sanger测序表，在96孔板对应的孔中加入50pg的样品，即步骤1.5扩增的PCR产物；
(6)将96孔板置于平板离心机中，离心500g即停；
(7)使用封板膜密封96孔板，振荡，将96孔板置于平板离心机中，离心500g即停；
(8)置于PCR仪，变性程序为98℃，5min，不加热热盖，程序结束后立即将96孔板置于冰水混合物上急速冷却；
(9)将96孔板置于平板离心机中，离心2000g即停；
(10)使用测序仪ABI3730xl进行样本测序。
2结果
2.1样本一的突变信息
样本一突变信息见表2；
表2
表2为样本一的突变信息，其中C634F位点出现双峰，发生致病突变， C634C位点出现双峰，发生良性突变。对比NGS突变频率结果，二者一致， C634F,C634C突变为胚系突变。病理信息表示该样本为甲状腺髓样癌病人癌旁组织样本。
2.2样本二的突变信息
样本二的突变信息见表3
表3样本二突变信息；
表3
表3为样本二的突变信息，其中C634F位点出现双峰，发生致病突变， C634C位点出现双峰，发生良性突变。对比NGS突变频率结果，二者一致， C634F,C634C突变为胚系突变。病理信息表示该样本为甲状腺髓样癌病人癌组织样本。
2.3样本三的突变信息
样本三突变信息见表4；
表4
表4为样本三的突变信息，其中C634R位点出现双峰，发生致病突变， C629S,L769L,S904S位点出现双峰，发生良性突变。对比NGS突变频率结果，二者一致，C634R,L769L,S904S突变为胚系突变，G691S为体细胞突变。病理信息表示该样本为甲状腺髓样癌病人癌组织样本。
2.4样本四的突变信息
样本四突变信息见表5；
表5
表5为样本四的突变信息，其中C634R位点出现双峰，发生致病突变， C629S,L769L,S904S位点出现双峰，发生良性突变。对比NGS突变频率结果，二者一致，C634R,L769L,S904S突变为胚系突变，G691S为体细胞突变。病理信息表示该样本为甲状腺髓样癌病人癌旁组织样本。
2.5样本五的突变信息
样本五突变信息见表6；
表6
表6为样本五的突变信息，其中M918T位点出现双峰，发生致病突变。对比NGS突变频率结果，二者一致，突变为体细胞突变。病理信息表示该样本为甲状腺髓样癌病人癌组织样本。
2.6样本六的突变信息
样本六突变信息见表7；
表7
表7为样本六的突变信息，其中M918T位点出现双峰，发生致病突变， L769L位点出现双峰，发生良性突变。对比NGS突变频率结果，二者一致， M918T突变为体细胞突变，L769L突变为胚系突变。病理信息表示该样本为甲状腺髓样癌病人癌组织样本。
2.7样本七的突变信息
样本七突变信息见表8；
表8
表8为样本七的突变信息，其中C634G位点出现双峰，发生致病突变，G691S,L769L,S904S位点出现双峰，发生良性突变。对比NGS突变频率结果，二者一致，C634G,L769L,S904S突变为胚系突变，G691S突变为体细胞突变。病理信息表示该样本为甲状腺髓样癌病人癌旁组织样本。
2.8样本八的突变信息
样本八突变信息见表9；
表9
表9为样本八的突变信息，其中C634G位点出现双峰，发生致病突变， G691S,L769L,S904S位点出现双峰，发生良性突变。对比NGS突变频率结果，二者一致，C634G,L769L,S904S突变为胚系突变，G691S突变为体细胞突变。病理信息表示该样本为甲状腺髓样癌病人癌组织样本。
2.9样本九的突变信息
样本九突变信息见表10；
表10
表10为样本九的突变信息，其中M918T位点出现双峰，发生致病突变。对比NGS突变频率结果，二者一致，M918T突变为胚系突变。病理信息表示该样本为甲状腺髓样癌病人癌组织样本。
实施例2
本发明的试剂盒中含有下列试剂和材料：
1.引物溶液(100μmol/L)：组成为引物对SEQ ID NO.1-2、SEQ ID NO.3-4、 SEQ IDNO.5-6、SEQ ID NO.7-8、SEQ ID NO.9-10、SEQ ID NO.11-12、 SEQ ID NO.13-14
2. 2×qPCR SYBR Green Master Mix
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
对比实施例1
改变引物组合序列信息检测甲状腺髓样瘤组织样本RET基因突变
1材料与方法
1.1样本来源
通过合作关系收集2017年1月1日到2018年6月30日复旦大学附属肿瘤医院头颈外科甲状腺髓样瘤组织标本25例，进行检测，抽取5例，分别记为样本一～样本五。
1.2标本提取
甲状腺髓样瘤组织标本液氮冷冻，-80℃冻存，4℃运送至实验室，-80℃保存备用。用天根血液/细胞/组织提取试剂盒(DP304-02)提取样本中的DNA， -20℃保存备用。
1.3合成PCR扩增引物
利用生物信息学知识和DNAstar等相关生物信息学软件，对Genbank数据库中所能检索到的RET基因核酸序列进行基因序列比对分析，选定目标区域的特异性序列，设计出针对各个区域的相应特异性基因片段的PCR引物(见表11)。
表11引物序列及扩增的目的片段长度
注：引物名称以基因对应的外显子编号命名；F代表上游引物，R代表下游引物。
1.4准备混合PCR引物工作液
(1)合成的每个PCR引物分别用双蒸水配制成100μmol/L的储存液；
(2)将引物配对并分为4组，每组1对引物，第一组为引物组合RET11-1：分别取RET11-F,RET11-R的PCR引物储存液各10μl加入到同一 1.5ml Eppendorf管中，再加入80μl的双蒸水即为混合引物工作液RET11-1；
第二组为引物组合RET16-1：分别取RET16-F,RET16-R的PCR引物储存液各10μl加入到同一1.5ml Eppendorf管中，再加入80μl的双蒸水即为混合引物工作液RET16-1；
第三组为引物组合RET11-2：分别取RRET11-F2,RET11-R2的PCR引物储存液各10μl加入到同一1.5ml Eppendorf管中，再加入80μl的双蒸水即为混合引物工作液RET11-2；
第四组为引物组合RET16-2：分别取RET16-F2,RET16-R2的PCR引物储存液各10μl加入到同一1.5ml Eppendorf管中，再加入80μl的双蒸水即为混合引物工作液RET16-2。
1.5PCR扩增反应：
(1)PCR反应体系：PCR扩增反应体系为20μl，其中包括2×qPCR SYBR GreenMaster Mix 10μl，混合引物工作液RET11-1(或混合引物工作液RET16-1 或混合引物工作液RET11-2或混合引物工作液RET16-2)1μl，样本(DNA) 100ng，补ddH2O至终体积为20μl；
(2)PCR反应程序：95℃5min→95℃0.5min、63℃0.5min、72℃0.5min (40个循环)→95℃1.5min、72℃1min(熔解曲线)→4℃保温。
2结果
2.1引物组合RET11-1产物熔解曲线见图1,图1为引物组合RET11-1产物熔解曲线，产物熔解曲线峰型单一，特异性好
2.2引物组合RET16-1产物熔解曲线见图2，图2为引物组合RET16-1产物熔解曲线，产物熔解曲线峰型单一，特异性好
2.3引物组合RET11-2产物熔解曲线见图3，图3为引物组合RET11-2产物熔解曲线，产物熔解曲线峰型杂乱，对比RET11-1峰型较差，引物组合特异性低，不适合进行后续sanger测序。
2.4引物组合RET16-2产物熔解曲线见图4，图4为引物组合RET16-2产物熔解曲线，产物熔解曲线峰型杂乱，对比RET16-2峰型较差，引物组合特异性低，不适合进行后续sanger测序。
本发明的原理在于：该方法通过设计针对RET热点外显子区域，检测主要致病突变，通过设计引物组合进行目标序列扩增，产物直接送出测序，时间上和检测成本上都有效降低，同时在检测位点上，通过7个体系，覆盖目标区域，完成35个已知致病突变或和更多未知突变位点检测。
序列表
<110> 上海派森诺医学检验所有限公司
<120> 一种鉴别甲状腺髓样癌RET基因突变的特异性引物组合及其试剂盒及其用途
<130> 20181031
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
tccctgtcct tgggcactag c 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
cttgggcgtt tccagggctt a 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
gggacactgc cctggaaata t 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 4
tgctgttgag acctctgtgg g 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 5
agccatgagg cagagcatac g 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 6
tggggagggc aggggatctt c 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 7
aagcctcaag cagcatcgtc t 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 8
ggaaacaggg caggagcagt a 21
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 9
acacgagcag caggaggcag ag 22
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 10
tggctgggtg cagagccata t 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 11
gcctgacgac tcgtgctatt t 21
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 12
aagatttggg gtgagggcta t 21
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 13
tctgtgccca ggagtgtcta ca 22
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 14
gccatttgcc tcacgaaca 19
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 15
agagcatacg cagcctgtac c 21
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 16
tcacaggatg gcctctgtct c 21
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 17
ttcaatgtct ttattccatc ttc 23
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 18
gggtgtttct gtaacctcca c 21
Claims (1)
1.一种包含快速鉴别甲状腺髓样癌RET基因突变的特异性引物组合的试剂盒，其特征在于，包括如下组成部分：
(1)PCR反应预混液，所述PCR反应预液为qPCR SYBR Green Master Mix；
(2)快速鉴别甲状腺髓样癌RET基因突变的特异性引物组合
其中，所述引物组合包括引物RET8、引物RET10、引物RET11、引物RET13、
引物RET14、引物RET15、引物RET16：
引物RET8的序列为：
F:TCCCTGTCCTTGGGCACTAGC
R:CTTGGGCGTTTCCAGGGCTTA
引物RET10的序列为：
F:GGGACACTGCCCTGGAAATAT
R:TGCTGTTGAGACCTCTGTGGG
引物RET11的序列为：
F:AGCCATGAGGCAGAGCATACG
R:TGGGGAGGGCAGGGGATCTTC
引物RET13的序列为：
F:AAGCCTCAAGCAGCATCGTCT
R:GGAAACAGGGCAGGAGCAGTA
引物RET14的序列为：
F:ACACGAGCAGCAGGAGGCAGAG
R:TGGCTGGGTGCAGAGCCATAT
引物RET15的序列为：
F:GCCTGACGACTCGTGCTATTT
R:AAGATTTGGGGTGAGGGCTAT
引物RET16的序列为：
F:TCTGTGCCCAGGAGTGTCTACA
R:GCCATTTGCCTCACGAACA；
所述的甲状腺髓样癌RET基因突变包括：
外显子8.10.11.13.14.15.16中的G533C,C609F/G/R/S/Y,C611F/G/S/Y/W,C618F/R/S,C620F/R/S,C630R/Y,D631Y,C634F/G/R/S/W/Y,K666E,E768D,L790F,V804L/M,A883F,S891A,R912P,M918T热点突变中的任意一种或多种。
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