CN107988356A - 一种检测高血压相关基因多态性的引物组和检测试剂盒 - Google Patents

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朱月艳
孙子奎
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Abstract

本发明公开的检测高血压相关基因多态性的引物组，其特征在于，所述引物的核苷酸序列为：CYP2D6*10F：AGGTGTGTCCAGAGGAGCCCAT；CYP2D6*10R：CCACCATCCATGTTTGCTTCTGG；ADRBF：CAACCCCATCATCTACTGCCG；ADRBR：GGCCCTACACCTTGGATTCCG；CYP2C9*3F：CCAGGAAGAGATTGAACGTGTGA；CYP2C9*3R：CACCCGGTGATGGTAGAGGTT；AGTR1F：CTCAGATAATGTAAGCTCATCCACC；AGTR1R：AGCAGCCGTCATCTGTCTAATGC；ACE‑F：GACTCTGTAAGCCACTGCTGGAG；ACE‑R：GACGTGGCCATCACATTCGTCA；CYP3A5*3F：TGGAGAGTGGCATAGGAGATACC；CYP3A5*3R：TAATCCATACCCCTAGTTGTACGAC；NPPA‑F：CCAAGAAGAAAGAAAGCACACCA；NPPA‑R：CCACTAGCACTGGGAAATTAAAATA。

Description

一种检测高血压相关基因多态性的引物组和检测试剂盒
技术领域
本发明属于生物检测领域，具体涉及一种检测高血压相关基因多态性的引物组和检测试剂盒。
背景技术：
原发性高血压(essential hypertension，EH)是一种常见的慢性复杂性疾病，有研究预计，到2025年全球高血压患病率将达到29.2％。2015年公布的慢性病状况报告显示我国每年约330万人死于高血压,成年人高血压的患病率为25.2％，并且发病的年龄出现年轻化趋势。高血压是最常见的重大疾病之一，其发病机制受到环境与遗传的影响，需要长期的药物控制，因此，对高血压药物个体化应用的研究具有深远的社会效益，是临床医疗人员长期关注的课题。目前对高血压的治疗主要依据医生的临床经验及用药指南，但由于个体间的差异，治疗的效果差别很大。
研究发现，高血压的发生与多种基因表型相关，基因表型不同，降压药物的治疗效果就存在显著差异，如血管紧张素原基因多态性与阿替洛尔的降压疗效相关。因此为取得最佳降压疗效，医生应依据患者的基因型选取合适的降压药物，实现“基因导向型”个体化药物治疗，才能做到因人而异，“量体用药”，也可以前瞻性避免治疗失败和严重不良反应。
临床上主要采取测序法和基因芯片法检测高血压用药相关基因的多样性，但是，检测的相关基因数目较少，很难全面反映高血压患者的基因多样性，因而很难给予患者一个精确的用药方案，并且基因芯片法灵敏度比较低，只有浓度到达104copies/ml时，才能被检测到，且容易产生假阳性。
本发明中采用了测序法(金标准)，同时检测七个高血压相关基因的多态性，更全面地评估个体的遗传特性，从而做到精准给药，避免个体的不良反应。
本发明中包含的高血压相关基因CYP2D6、ADRB1、CYP2C9、AGTR1、ACE、CYP3A5*3和NPPA涉及目前常用的β受体阻断药、血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)、血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂(ARB)利尿剂、钙拮抗剂(CCB)这五类降压药。
发明内容：
本发明的目的之一提供一种检测高血压相关基因多态性的引物组。
本发明的目的之二提供一种利用上述检测高血压相关基因多态性的引物组制备的检测试剂盒。
作为本发明第一方面的检测高血压相关基因多态性的引物组，所述引物的核苷酸序列为：
CYP2D6*10F：AGGTGTGTCCAGAGGAGCCCAT；
CYP2D6*10R：CCACCATCCATGTTTGCTTCTGG；
ADRBF：CAACCCCATCATCTACTGCCG；
ADRBR：GGCCCTACACCTTGGATTCCG；
CYP2C9*3F：CCAGGAAGAGATTGAACGTGTGA；
CYP2C9*3R：CACCCGGTGATGGTAGAGGTT；
AGTR1F：CTCAGATAATGTAAGCTCATCCACC；
AGTR1R：AGCAGCCGTCATCTGTCTAATGC；
ACE-F：GACTCTGTAAGCCACTGCTGGAG；
ACE-R：GACGTGGCCATCACATTCGTCA；
CYP3A5*3F：TGGAGAGTGGCATAGGAGATACC；
CYP3A5*3R：TAATCCATACCCCTAGTTGTACGAC；
NPPA-F：CCAAGAAGAAAGAAAGCACACCA；
NPPA-R：CCACTAGCACTGGGAAATTAAAATA。
作为优选，应用PCR检测引物组进行扩增的条件为：
采用20μL的反应体系，包括：PCR-Mix 10μL；ddH2O 7Μl；浓度10pmol/μL的上、下游引物各1μL；cDNA 1μL；
设置如下条件进行反应：预变性95℃，4min；再经95℃变性45s，53℃退火35s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸10min。
本发明的第二个目的在于提供上述引物组的试剂盒，该试剂盒灵敏度高，特异性好，成本低，能够简便快速对高血压相关基因CYP2D6、ADRB1、CYP2C9、AGTR1、ACE、CYP3A5*3和NPPA进行分型检测，大大降低了检测高血压病因的时间和成本。
实现本发明的目的可以通过采取如下技术方案达到：一种检测试剂盒，包括：如上所述的引物组。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1、本发明检测高血压相关基因多态性的引物组，能够快速，准确检测高血压相关基因CYP2D6、ADRB1、CYP2C9、AGTR1、ACE、CYP3A5*3和NPPA。
2、试剂盒灵敏度高，特异性好，成本低，能够简便快速对高血压相关基因CYP2D6、ADRB1、CYP2C9、AGTR1、ACE、CYP3A5*3和NPPA进行分型检测，大大降低了检测高血压病因的时间和成本。
附图说明
图1为对高血压相关基因CYP2D6的Sanger测序序列示意图。
图2为对高血压相关基因ADRB1的Sanger测序序列示意图。
图3为对高血压相关基因CYP2C9的Sanger测序序列示意图。
图4为对高血压相关基因AGTR1的Sanger测序序列示意图。
图5为对高血压相关基因NPPA的Sanger测序序列示意图。
图6为对高血压相关基因CYP3A5*3的Sanger测序序列示意图。
图7为对高血压相关基因ACE的灵敏性检测电泳图和插入片段序列示意图。
具体实施方式
实施例1:PCR引物的设计
利用引物设计软件Primer5在对应的SNP位点上下400bp左右的碱基序列上设计F/R引物，在上海派森诺生物科技有限公司合成，再采用PAGE的纯化法进行制备。聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳，是对利用DNA片段大小的不同，对DNA片段进行电泳分离，然后从凝胶中回收目的目标片段的方法。
实施例2：高血压相关基因CYP2D6、ADRB1、CYP2C9、AGTR1、ACE、CYP3A5*3和NPPA的提取
一、基因组提取：提取人基因组DNA(唾液样本为例)
1.该SOP适用于用·L2P试剂提取由Oragene及ORAcollect系列产品收集的唾液样本基因组DNA。
1)将Oragene·DNA(OG-500)唾液收集管中的样本轻轻颠倒混匀10s。
2)将唾液收集管于50℃水浴至少1h(空气浴至少2h)。
3)取500μl混合后的唾液样本于1.5ml离心管中，剩余样本于常温保存。
4)在500μl唾液中加入20μlPT-L2P，漩涡振荡10秒，短暂离心。
5)冰上孵育10min。
6)室温15,000×g离心5min。
7)小心地将干净的上清液转移到新的1.5ml离心管中，丢弃含有杂质沉淀的离心管。
注：转移上清的过程中枪头一定不要碰到杂质沉淀。若不小心碰到沉淀，则必须将微量离心管重新离心再转移上清。
8)加入600μl室温的无水乙醇到500μl上清中，轻轻颠倒混匀10次。
9)室温孵育10min，使DNA充分沉淀。
10)室温15,000×g，离心2min。
11)去除上清液并将其丢弃。
注：吸除上清的时候首先将移液器调至500μl，去除上清液一次。再将移液器调至200μl，尽可能彻底除去剩余的上清。这个过程中不要碰到DNA沉淀。
12)加入250μl 70％的乙醇，室温放置1min。在不碰到DNA沉淀的情况下彻底去除乙醇。
注：残留乙醇会影响DNA质量，一定要彻底去除乙醇。如果沉淀分离，可以将样本于室温下15,000×g离心5min。
13)加入50-100μl TE溶解DNA沉淀，漩涡振荡至少5s。溶解后的DNA在50℃放置1h以完全溶解DNA，期间振荡几次。
2.DNA质量检测
1)DNA质量检测：取3μl DNA样品加入1μl 6x loading buffer，吸打混匀。吸取全部样品加入1％琼脂糖凝胶孔中，点3μl DL15000Marker，140V电泳15分钟。电泳结束后，将胶块放入凝胶成像系统中拍照，图片存入相应的文件夹。
2)取1μL DNA样品(可稀释10倍)，用TE稀释30倍，加入30μL PicoGreen荧光染料(TE稀释200倍)，短暂震荡离心后转移50μL混合溶液至Minicell中。若Minicell中的液体有气泡或没有全部加到底部，可以甩几下来赶走气泡并将液体甩入Minicell底部。将Minicell放入TBS380，按下Read键，记下读数。利用标准曲线，计算样品浓度，并记录。
实施例3：PCR扩增方法的建立
配制PCR反应液(50μL)：
其中，2×PCR master(1mL)为：
PCR程序(touchdown)
实施例4：PCR检测体系的灵敏度评价
通过跟人类全基因组进行对比，选取的特异性最高的引物进行PCR扩增，通过跑胶和Sanger测序的结果来看(如图1至图7)，这七对引物的特异性和灵敏度非常高，在每一个样本中都扩增出了目标片段，因此，这七个引物地PCR检测体系的灵敏度非常高，符合常规的基因检测。

Claims (3)

1.检测高血压相关基因多态性的引物组，其特征在于，所述引物的核苷酸序列为：
CYP2D6*10F：AGGTGTGTCCAGAGGAGCCCAT；
CYP2D6*10R：CCACCATCCATGTTTGCTTCTGG；
ADRBF：CAACCCCATCATCTACTGCCG；
ADRBR：GGCCCTACACCTTGGATTCCG；
CYP2C9*3F：CCAGGAAGAGATTGAACGTGTGA；
CYP2C9*3R：CACCCGGTGATGGTAGAGGTT；
AGTR1F：CTCAGATAATGTAAGCTCATCCACC；
AGTR1R：AGCAGCCGTCATCTGTCTAATGC；
ACE-F：GACTCTGTAAGCCACTGCTGGAG；
ACE-R：GACGTGGCCATCACATTCGTCA；
CYP3A5*3F：TGGAGAGTGGCATAGGAGATACC；
CYP3A5*3R：TAATCCATACCCCTAGTTGTACGAC；
NPPA-F：CCAAGAAGAAAGAAAGCACACCA；
NPPA-R：CCACTAGCACTGGGAAATTAAAATA。
2.如权利要求1所述的检测高血压相关基因多态性的引物组，其特征在于，应用PCR检测引物组进行扩增的条件为：
采用20μL的反应体系，包括：PCR-Mix 10μL；ddH2O 7Μl；浓度10pmol/μL的上、下游引物各1μL；cDNA 1μL；
设置如下条件进行反应：预变性95℃，4min；再经95℃变性45s，53℃退火35s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸10min。
3.一种检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的所述的引物组。
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