CN112094915B - 一种肉瘤融合基因和/或突变联合检测引物组及试剂盒 - Google Patents

一种肉瘤融合基因和/或突变联合检测引物组及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及分子生物学技术领域，具体公开了一种肉瘤融合基因联合检测引物组和试剂盒及其检测方法。本发明试剂盒包含：1）DNA文库构建的专用接头；2）检测融合基因和点突变的特异性复合引物；3）文库扩增复合引物。本发明分别提取送检样品的DNA和RNA，将RNA逆转录合成cDNA后，与DNA混合，对其进行片段化、末端修复和接头连接，产物进行PCR扩增，富集文库后进行高通量测序。本发明提供的融合基因检测试剂盒及检测方法，能一次性检测肉瘤相关的多种融合基因或突变，提高了检测效率，操作方便，用时短，且灵敏度较高，可达到0.1%。

Description

一种肉瘤融合基因和/或突变联合检测引物组及试剂盒
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种肉瘤融合基因和/或突变联合检测引物组和试剂盒及其检测方法。
背景技术
肉瘤来源于间叶组织（包括结缔组织和肌肉）的恶性肿瘤，多发生于皮肤、皮下、骨膜及长骨两端。据统计，在美国每年约有11000位新发肉瘤患者，其中约3800人死于这种疾病，而全世界每年新发病例约为200000名。软组织肉瘤可以发生于任何年龄，好发年龄在30-50岁，男性略多于女性，约60%发生在肢体部位，19%发生在躯干部位，其他部位还有腹膜后、颈部等。目前，已有100多种不同的亚型，表现出其组织学的多样性，成人最常见的软组织肉瘤是多形性未分化肉瘤（Pleomorphic undifferentiated sarcoma,UPS）和脂肪肉瘤（Liposarcoma,LPS），约占全部肉瘤的35-45%。儿童略有不同，最常见的是横纹肌肉瘤（Rhabdomyosarcoma,RMS）、神经母细胞瘤（Neuroblastoma,NB）和骨外尤文肉瘤（ES/PNET）。同样他们的生物学行为也是多变的，从惰性、高度侵袭到远处转移。易复发是软组织肉瘤的特征之一，并对预后有着深远的影响，复发性肉瘤的组织学形态可随着时间的进展发生相应的改变，如核分裂数的增加、组织学的异形性，例如分化良好型脂肪肉瘤，就是一类典型的随着时间进展其恶性程度增加的一类疾病。
目前，软组织肉瘤的诊断是临床、影响、病理三者相结合，所有疑似软组织肉瘤的标准诊断步骤包括：体检、原发病灶的影像学检查（X线平片、局部MRI和或增强CT扫描）、胸部影像学检查（胸部CT）、淋巴结B超、活检等。其中，病理诊断和分类依据是肿瘤的分化特征，而不是肿瘤来源，病理形态学评估仍然是软组织肉瘤诊断的金标准。完整地病理报告应该包括肿瘤的诊断、部位、深度、大小、组织学分级、坏死情况、切缘情况、病理核分裂情况、脉管癌栓、淋巴结状态等。免疫组化、细胞病理及分子病理可用于辅助诊断和鉴别诊断。然而，不同类型的软组织肉瘤愈后治疗有所不同，但不同来源的肉瘤往往在临床上有相似的表现，仅靠传统的病理学检测无法进行有效的区分。因而融合基因对于某些肉瘤的诊断和预后判断有一定的价值。
目前基因融合的检测，主要依赖于实时荧光定量PCR（Real Time PCR， RT-PCR）、荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ hybridization，FISH）和免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）等。FISH和IHC均采用探针杂交原理对已知的基因融合进行检测，一般一次仅检测一种类型的基因融合，操作流程复杂，成本较高；RT-PCR具有相对较高的检测通量，但需要的样品量较多，实验操作步骤多，检测费用较高。在《原发与复发性软组织肉癌基因突变及其临床意义》（黎成芳，石河子大学）一文中，以基质辅助激光解析电离时间飞行质谱技术（MALDI-TOF-MS）为平台，采用OncoCarta panel v1.0 检测19个常见癌基因的238个突变位点在原发及复发性软组织肉瘤样本的基因突变情况，但其步骤较为复杂，且使用的设备较为昂贵。专利CN109811055A公开了一种肉瘤融合基因检测试剂盒及系统，可对与肉瘤相关的22对融合基因（137个融合转录产物）进行检测，但其采用NGS检测过程中所需的DNA的量较多，且对扩增引物的要求极高，以避免引物同聚引发的检测失控。专利CN107746882A公开了一种骨肉瘤基因筛查的荧光定量PCR检测系统及其应用，在同一体系同时完成两个基因上的2个多态性位点的检测，需要的样品量也较多。
综上，上述方法只能对已知的基因融合检测或对点突变进行检测，且受限于检测通量的限制，无法对致癌融合基因和点突变实现一次性全检测，因此，开发一种能同时检测融合基因和点突变的试剂盒，对于软组织肉瘤的临床研究和诊断具有重要的意义。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明要解决的技术问题是为了能同时检测与软组织肉瘤相关的多基因的、已知及未知基因的融合和突变情况，提供了一种能联合检测软组织肉瘤相关基因融合或突变的引物组和试剂盒，通过对送检样品的DNA和RNA共同提取，对RNA进行逆转录成cDNA后，与DNA一起进行高通量测序文库构建，能一次性检测包括ALK、CAMTA1、CCNB3、CDX1、CIC、EWSR1、FOSB、FOXO1、FUS、HMGA2、NCOA2、NR4A3、PAX3、PAX7、PDGFB、SS18、JAZF1、TFE3、USP6、KIT、PDGFRA等多种突变或与其他基因的融合情况，可以为软组织肉瘤患者提供精准诊断和治疗，并为软组织肉瘤患者进行癌症风险评估。
为解决上述技术问题，本发明提供以下技术方案：
一方面，本发明提供了一组用于检测融合基因和点突变的特异性复合引物，所述的特异性复合引物的序列如下表1。
表1 特异性复合引物序列
检测位点 引物名称 引物序列 SEQ ID NO
与i5端引物配对 通用引物1 AATGATACGGCGACCACCGAGAT SEQ ID NO：10
ALK融合基因 ALK-1 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CATCTGCATGGCTTGCAGCTCCTG SEQ ID NO：11
CAMTA1融合基因 CAMTA1-1 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CGGGCCTGTGATGAGGACCTTCACTCCTC SEQ ID NO：12
CAMTA1融合基因 CAMTA1-2 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CCATTGCTGCAGGTCCACTTGATGCCATG SEQ ID NO：13
CAMTA1融合基因 CAMTA1-3 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CGGCGCTGTTACACTTGTGATGCACGCT SEQ ID NO：14
CCNB3融合基因 CCNB3-1 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CAGAGGCTACTACTGGTGTGACTTCCAGCT SEQ ID NO：15
CDX1融合基因 CDX1-1 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CACGCGGTACTTGTCCTTGGTCCGAGT SEQ ID NO：16
CIC融合基因 CIC-1 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CGTGCCGAGAAGCCGCAATGAGCGAGA SEQ ID NO：17
CIC融合基因 CIC-2 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CGTCCCTCCACAGCTGCCACAGGCAGG SEQ ID NO：18
EWSR1融合基因 EWSR1-1 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CGCCCAGCCTAGGATATGGACAGAGTAACTA SEQ ID NO：19
EWSR1融合基因 EWSR1-2 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CACTGGATCCTACAGCCAAGCTCCAAGTC SEQ ID NO：20
EWSR1融合基因 EWSR1-3 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CACCGGAGCATGAGTGGCCCTGATAACC SEQ ID NO：21
EWSR1融合基因 EWSR1-4 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CCAGCGCTGGAGAGCGAGGTGGCTTC SEQ ID NO：22
EWSR1融合基因 EWSR1-5 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CTGTCCTATGAAGACCCACCCACTGCCAAG SEQ ID NO：23
EWSR1融合基因 EWSR1-6 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CAGGCATGCCACCACCACTCCGTGGA SEQ ID NO：24
FOSB融合基因 FOSB-1 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CGTCCACCGAAGACAGATATTGAGACTCGGC SEQ ID NO：25
表1续
FOSB融合基因 FOSB-2 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CTGGCTGGTTGTGATCGCGGTGACCGT SEQ ID NO：26
FOXO1融合基因 FOXO1-3 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CCACACGAATGAACTTGCTGTGTAGGGACAG SEQ ID NO：27
FUS融合基因 FUS-1 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CGCAGAACCAGTACAACAGCAGCAGTGGT SEQ ID NO：28
FUS融合基因 FUS-2 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CCAGTGGTGGCTATGAACCCAGAGGTCGT SEQ ID NO：29
FUS融合基因 FUS-3 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CGCCCTCGGGACCAAGGATCACGTCATG SEQ ID NO：30
FUS融合基因 FUS-4 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CGCAAGCTGAAGGGAGAGGCAACGGTCT SEQ ID NO：31
HMGA2融合基因 HMGA2-1 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CGAGACCCAGGGGAAGACCCAAAGGCAGC SEQ ID NO：32
HMGA2融合基因 HMGA2-2 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CCGGCCAAGAGGCAGACCTAGGAAATGG SEQ ID NO：33
HMGA2融合基因 HMGA2-3 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CCAACAAGTTGTTCAGAAGAAGCCTGCTCAG SEQ ID NO：34
NCOA2融合基因 NCOA2-1 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CCTGGTTTGGCAATAACCTGCCCAGTTGC SEQ ID NO：35
NR4A3融合基因 NR4A3-1 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CGTATGTCTGCGCCGCATAACTGGAACCT SEQ ID NO：36
PAX3融合基因 PAX3-1 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CCACCATTGGCAATGGCCTCTCACCTCAG SEQ ID NO：37
PAX7融合基因 PAX7-1 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CCGGTCAGCAACGGCCTGTCTCCTCAG SEQ ID NO：38
PDGFB融合基因 PDGFB-1 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CAGCGGATCGAGTGGTCACTCAGCATCTC SEQ ID NO：39
SS18融合基因 SS18-1 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CGACCAACACAGCCTGGACCACCACAG SEQ ID NO：40
JAZF1融合基因 JAZF1-1 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CTCTTCATTCCGCAGCAGCACTCCGACA SEQ ID NO：41
TFE3融合基因 TFE3-1 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CAGGTGGTAGCGCGTTGGGTTCTCCAGA SEQ ID NO：42
TFE3融合基因 TFE3-2 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CCATTGTAACTGGACTCCAGGCTGATGATCTC SEQ ID NO：43
TFE3融合基因 TFE3-3 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CGTACACATCAAGCAGATTCCCTGACACAGG SEQ ID NO：44
USP6融合基因 USP6-1 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CAGTATGTCCTTCCGCTCCTGTGCCTGCA SEQ ID NO：45
KIT KIT-1 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CGGTGACATGGAAAGCCCCTGTTTCATACT SEQ ID NO：46
表1续
KIT KIT-2 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CACCCCATGAACTGCCTGTCAACAGCTAA SEQ ID NO：47
KIT KIT-3 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CGGACTGTCAAGCAGAGAATGGGTACTCAC SEQ ID NO：48
KIT KIT-4 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CGCCCACATCGTTGTAAGCCTTACATTCAAC SEQ ID NO：49
KIT KIT-5 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CGACAATAAAAGGCAGCTTGGACACGGCTTT SEQ ID NO：50
KIT KIT-6 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC GACCCATGAGTGCCCTTCTACATGTCCCACTTG SEQ ID NO：51
KIT KIT-7 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC GACTGATATGGTAGACAGAGCCTAAACATCCC CTT SEQ ID NO：52
PDGFRA PDGFRA-1 GGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGA TCGCTGAGCCTAATCCTCTGCCAGCTTTC SEQ ID NO：53
PDGFRA PDGFRA-2 GGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGA TCACCCAGATGTAGCCTTTGTACCTCTAGG SEQ ID NO：54
PDGFRA PDGFRA-3 GGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGA TCCAACATCAGAGCTGGATCTAGAAATGGAA SEQ ID NO：55
PDGFRA PDGFRA-4 GGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGA TCGGCAAAGGCATCACAATGCTGGAAGA SEQ ID NO：56
PDGFRA PDGFRA-5 GGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGA TCGTATCGAAGCAAATTAAAGCTGATCCG SEQ ID NO：57
PDGFRA PDGFRA-6 GGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGA TCAACTTCCTGGACTATTTTGGCCAACA SEQ ID NO：58
PDGFRA PDGFRA-7 GGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGA TCCATTTACATCATCACAGAGTATTGCTTCT SEQ ID NO：59
PDGFRA PDGFRA-8 GGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGA TCACAATGGTGACTACATGGACATGAAGC SEQ ID NO：60
具体地，所述的ALK融合基因包括TPM3-ALK，TPM4-ALK，RANBP2-ALK；所述的CAMTA1融合基因包括WWTR1-CAMTA1；所述的CCNB3融合基因包括BCOR-CCNB3；所述的CDX1融合基因包括IRF2BP2-CDX1；所述的CIC融合基因包括CIC-DUX4；所述的EWSR1融合基因包括EWSR1-ATF1，EWSR1-CREB1，EWSR1-DDIT3，EWSR1-ERG，EWSR1-ETV1，EWSR1-ETV4，EWSR1-FEV，EWSR1-FLI1，EWSR1-NFATc2，EWSR1-NR4A3，EWSR1-PATZ，EWSR1-PBX1，EWSR1-POU5F1，EWSR1-SMARCA5，EWSR1-TAF15，EWSR1-WT1，EWSR1-ZNF444；所述的FOSB融合基因包括SERPINE1-FOSB，ZFP36-FOSB；所述的FOXO1融合基因包括PAX7-FOXO1；所述的FUS融合基因包括FUS-ATF1，FUS-CREB3L1，FUS-CREB3L2，FUS-DDIT3，FUS-ERG，FUS-FEV；所述的HMGA2融合基因包括HMGA2-CXCR7，HMGA2-EBF1，HMGA2-LHFP，HMGA2-LPP，HMGA2-NFIB；所述的NCOA2融合基因包括HEY1- NCOA2；所述的NR4A3融合基因包括TAF1168-NR4A3，TCF12-NR4A3；所述的PAX3融合基因包括PAX3-FOXO1；所述的PAX7融合基因包括PAX7-FOXO1，PAX7-NCOA1；所述的PDGFB融合基因包括COL1A1-PDGFB；所述的SS18融合基因包括SS18-SSX1，SS18-SSX2，SS18-SSX4；所述的JAZF1融合基因包括JAZF1-JJAZ1；所述的TFE3融合基因包括ASPSCR1-TFE3，YAP1-TFE3，TFE3-CAMTA1；所述的USP6融合基因包括MYH9-USP6。
具体地，所述的EWSR1-FLI1、EWSR1-ERG、EWSR1-ETV1、EWSR1-ETV4、EWSR1-FEV、EWSR1-NFATc2、EWSR1-POU5F1、EWSR1-SMARCA5、EWSR1-PATZ、FUS-ERG、FUS-FEV、CIC-DUX4、BCOR-CCNB3融合基因可用于检测尤文肉瘤；所述的EWSR1-ATF1、EWSR1-CREB1融合基因可用于检测软组织透明细胞肉瘤；所述的EWSR1-CREB1、FUS-ATF1、EWSR1-ATF1融合基因可用于检测血管瘤样纤维组织细胞瘤；所述的EWSR1-NR4A3、EWSR1-TAF15融合基因可用于检测骨外黏液样软骨肉瘤；所述的EWSR1-WT1融合基因可用于检测促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤；所述的EWSR1-POU5F1、EWSR1-PBX1、EWSR1-ZNF444融合基因可用于检测软组织肌上皮瘤/肌上皮癌/混合瘤；所述的FUS-DDIT3、EWSR1-DDIT3融合基因可用于检测黏液样脂肪肉瘤；所述的EWSR1-ATF1、EWSR1-CREB1融合基因可用于检测胃肠道恶性神经外胚层肿瘤；所述的PAX3-FOXO1、PAX7-FOXO1、PAX7-NCOA1融合基因可用于检测腺泡状横纹肌肉瘤；所述的SS18-SSX1、SS18-SSX2、SS18-SSX4融合基因可用于检测滑膜肉瘤；所述的ASPSCR1-TFE3融合基因可用于检测腺泡状软组织肉瘤；所述的TPM3-ALK、TPM4-ALK、CLTC-ALK融合基因可用于检测炎性肌纤维母细胞肿瘤；所述的RANBP2-ALK融合基因可用于检测上皮样炎性肌纤维母细胞肉瘤；所述的FUS-CREB3L2、FUS-CREB3L1融合基因可用于检测低度恶性纤维黏液样肉瘤；所述的FUS-CREB3L2融合基因可用于检测硬化性上皮样纤维肉瘤；所述的FUS-ATF1融合基因可用于检测血管瘤样纤维组织细胞瘤；所述的FUS-DDIT3融合基因可用于检测黏液样脂肪肉瘤；所述的MYH9-USP6融合基因可用于检测结节性筋膜炎；所述的c-Kit、PDGFRA突变可用于检测GIST；所述的HMGA2-LPP、HMGA2-CXCR7、HMGA2-EBF1、HMGA2-NFIB、HMGA2-LHFP融合基因可用于检测脂肪瘤；所述的FUS-DDIT3、EWSR1-DDIT3融合基因可用于检测黏液样脂肪肉瘤/圆形细胞脂肪肉瘤；所述的WWTR1-CAMTA1、TFE3 -CAMTA1融合基因可用于检测上皮样血管内皮瘤；所述的YAP1-TFE3融合基因可用于检测实性型上皮样血管内皮瘤；所述的ZFP36-FOSB融合基因可用于检测上皮样血管瘤；所述的HEY1- NCOA2、IRF2BP2-CDX1融合基因可用于检测间叶性软骨肉瘤；所述的ZFP36-FOSB、SERPINE1-FOSB融合基因可用于检测上皮样血管瘤和假肌源性血管内皮瘤；所述的COL1A1-PDGFB融合基因可用于检测隆突性皮肤纤维肉瘤（巨细胞成纤维细胞瘤）；所述的JAZF1-JJAZ1融合基因可用于检测子宫内膜间质肉瘤；所述的EWSR1-NR4A3、TAF1168-NR4A3、TCF12-NR4A3融合基因可用于检测骨外粘液样软骨肉瘤。
另一方面，本发明提供了一种肉瘤融合基因和/或突变联合检测试剂盒。
所述的肉瘤融合基因和/或突变联合检测试剂盒包含本发明上述的检测融合基因和点突变的特异性复合引物。
所述的试剂盒还包含一种DNA文库构建的专用接头，所述的专用接头为接头引物1分别和8条不同的i5端引物构成的8个二聚体。
所述的接头引物1和8条不同的i5端引物的序列如下表2。
表2 专用接头序列
引物 名称 引物序列 5_index 序列 SEQ ID NO
接头 引物1 GATCGGAAGAGCCACATACTGA - SEQ ID NO：1
i5端1 号引物 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCTCTCT ATACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT CTCT CTAT SEQ ID NO：2
i5端2 号引物 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTATCCT CTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT TATC CTCT SEQ ID NO：3
i5端3 号引物 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTAAGG AGACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT GTAA GGAG SEQ ID NO：4
i5端4 号引物 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACACTGCA TAACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT ACTG CATA SEQ ID NO：5
表2续
i5端5 号引物 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAAGGAG TAACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT AAGG AGTA SEQ ID NO：6
i5端6 号引物 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCTAAGC CTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT CTAA GCCT SEQ ID NO：7
i5端7 号引物 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCGTCTA ATACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT CGTC TAAT SEQ ID NO：8
i5端8 号引物 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTCTC CGACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT TCTC TCCG SEQ ID NO：9
所述的专用接头具有附图1所示的结构。其中，所述的5_index的序列为：CTCTCTAT、TATCCTCT、GTAAGGAG、ACTGCATA、AAGGAGTA、CTAAGCCT、CGTCTAAT或TCTCTCCG。
所述的专用接头包括附图2所示的8个接头结构。
所述的试剂盒还包含一组文库扩增复合引物，所述的文库扩增复合引物的序列如下表3。
表3 文库扩增复合引物序列
引物名称 引物序列 7_index序列 SEQ ID NO
通用引物2 AATGATACGGCGACCACCG - SEQ ID NO：61
i7端1号引物 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCA CAAGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGT TCACAAGC SEQ ID NO：62
i7端2号引物 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACTA CACGGTGACTGGAGTTCAGACGTGT ACTACACG SEQ ID NO：63
i7端3号引物 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATCG TACGGTGACTGGAGTTCAGACGTGT ATCGTACG SEQ ID NO：64
i7端4号引物 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGA CACAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGT AGACACAG SEQ ID NO：65
i7端5号引物 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTGT CCTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGT TTGTCCTG SEQ ID NO：66
i7端6号引物 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGT GAGAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGT TGTGAGAG SEQ ID NO：67
i7端7号引物 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAG GTTGGGTGACTGGAGTTCAGACGTGT AAGGTTGG SEQ ID NO：68
i7端8号引物 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTA GCCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGT ATTAGCCA SEQ ID NO：69
本发明提供的试剂盒中，上述（1）检测融合基因和点突变的特异性复合引物、（2）DNA文库构建的专用接头、（3）文库扩增复合引物试剂独立包装。
需要特别说明的是，本发明提供的检测融合基因和点突变的特异性复合引物是本发明的第二个目的。所述的检测融合基因和点突变的特异性复合引物被用于与非本发明提供的其他接头配合来进行ALK、CAMTA1、CCNB3、CDX1、CIC、EWSR1、FOSB、FOXO1、FUS、HMGA2、NCOA2、NR4A3、PAX3、PAX7、PDGFB、SS18、JAZF1、TFE3、USP6、KIT、PDGFRA等基因检测的产品或相关方法也应当属于本发明这一目的所包含的范围。
作为优选的实施方案，本发明的提供的试剂盒还包括以下任意一个或多个试剂组：反转录反应试剂组；DNA片段化/末端修复/dA添加试剂组；DNA连接试剂组；PCR扩增试剂组；高保真热启动PCR扩增试剂组。
具体地，所述的反转录反应试剂组包括随机引物、第一链合成缓冲液、第一链合成酶混合液、第二链合成缓冲液、第二链合成酶混合液和超纯水。
具体地，所述的DNA片段化/末端修复/dA添加试剂组包括10×DNA片段化缓冲液、5×片段化酶混合液和超纯水。
具体地，所述的DNA连接试剂组包括5×连接酶缓冲液、TIANSeq DNA连接酶、专用接头和超纯水。
具体地，所述的PCR扩增试剂组包括5×多重PCR反应酶混合液、PCR引物。
具体地，所述的高保真热启动PCR扩增试剂组包括高保真热启动酶反应液、PCR引物和超纯水。
又一方面，本发明提供了上述试剂盒的使用方法，即肉瘤融合基因和/或突变联合检测方法。
所述的检测方法包括以下步骤：
（1）使用DNA文库构建的专用接头连接检测样本DNA；
（2）使用检测融合基因和点突变的特异性复合引物对步骤（1）的连接产物进行复合PCR扩增；
（3）使用文库扩增复合引物对步骤（2）获得的扩增产物进行PCR扩增，获得测序文库；
（4）对步骤（3）获得的测序文库进行测序。
作为一些优选的实施方案，所述的检测方法包括以下步骤：
S1.提取样本中的DNA和RNA；
S2.将步骤S1所得的RNA逆转录制备cDNA；
S3.将步骤S2所得的cDNA与步骤S1所得的DNA混合后，进行核酸片段化、末端修复及加A，得cDNA与DNA混合液；
S4.将步骤S3所得的cDNA与DNA混合液进行接头连接并纯化，得纯化后的接头连接产物；
S5.将步骤S4所得的纯化后的接头连接产物进行第一步特异性PCR并纯化，得第一步PCR纯化产物；
S6.将步骤S5所得的第一步PCR纯化产物进行第二步通用PCR并纯化，得测序文库；
S7.上机测序；
S8.生物信息学分析软件对进行数据结果分析。
又一方面，本发明还提供了所述DNA文库构建的专用接头，所述检测融合基因和点突变的特异性复合引物，所述文库扩增复合引物在制备肉瘤融合基因和/或突变联合检测试剂盒中的应用。
与现有技术相比，本发明的积极和有益效果在于：
1、就本发明的整体构思而言，本发明实现了融合基因和点突变的同时检测，且提高了检测的灵敏度。
2、就本发明针对文库构建的设计构思而言：
传统扩增子文库构建检测基因位点突变时，使用双引物扩增（参见附图3的示意图），生成的文库双端位置固定，导致某个位置的测序序列无法有效去除扩增导致的序列重复，从而无法识别降低扩增过程中引入的随机突变，导致灵敏度降低。
而本发明对cDNA和DNA进行随机打断后，在DNA两端连接通用引物，一端采用特异性引物扩增，一端采用通用引物，保留其中一端的随机性，从而可以有效识别重复测序序列。参见附图4的示意图。
3、就本发明检测融合基因和点突变的特异性复合引物的设计而言：
融合基因是指将两个或多个基因的编码区首尾相连，置于同一套调控序列（包括启动子、增强子、核糖体结合序列、终止子等）控制之下，构成的嵌合基因。例如EWSR1-ATF1融合，其中EWSR1为核心基因，ATF1为伴侣基因，融合基因通常有多个伴侣基因，并且融合断点往往不一样。
因此传统扩增子文库构建检测融合基因时，需要同时知晓伴侣基因和核心基因两个基因，并且断点位置也已知的情况下，进行引物设计检测，容易遗漏断点未知，或者伴侣基因未知的融合类型。本发明通知将单引物设置在核心基因上，不必事先知道断点或伴侣基因，在引物扩增过程中，都能够将序列包含在文库中，通过测序识别伴侣基因及断点位置。参见附图5的示意图。
4、就整个检测流程而言：
传统液相杂交捕获文库流程片长，涉及约24个步骤，耗时20-24h，操作过程复杂，本试剂盒发明精简操作流程至11个步骤和耗时缩短至6-8h，参见附图6的示意图。
5、与其他检测技术的比较：
（1）与利用arms_PCR法检测比较
利用arms_PCR法突变操作复杂，每管反应只能检测一个至三个位点；而本发明试剂盒通过加入多个位点的检测引物，并进行高通量测序可同时检测上述所有位点。另外，arms_PCR法无法利用mRNA检测融合基因，本发明试剂盒可以检测。
（2）与利用RT-PCR法检测融合基因比较
RT-PCR的检测方法检测效率较低，一次只能检测一种类型融合，本发明试剂盒通过同时加入多组引物，可实现多种融合同时检测。且RT-PCR只能检测已知种类，限定特定断点的融合基因类型，本发明则克服了这一缺陷。
（3）与利用Sanger测序法检测比较
Sanger测序法检测突变位点敏感性及灵敏度较低，只能达到10%，本发明试剂盒利用高通量测序法，每次测序每个突变并行测序10000次以上，灵敏度可达到0.1%。另外，Sanger测序法操作复杂，每管反应只能检测一个位点，本发明试剂盒通过加入多个位点的检测引物，并进行高通量测序，可同时检测上述所有位点。
6、本发明整体技术方案利用高通量测序法，每次测序每个突变并行测序10000次以上，结合整体构思、文库构建的设计构思，以及“（1）DNA文库构建的专用接头；（2）检测融合基因和点突变的特异性复合引物；（3）文库扩增复合引物”的设计构思，一方面实现了同时检测上述所有位点（融合基因和多个突变位点）；另一方面从多方面多角度提升检测灵敏度，灵敏度可达到0.1%。而常规检测方法（例如利用Sanger测序）敏感性较低，灵敏度较低，只能达到10%。
综上，相对于现有技术，本发明提供了一种灵敏度更高的能够实现融合基因和突变位点同时检测的肉瘤多基因联合检测试剂盒。
附图说明
图1为专用接头结构。
图2为专用接头的8个接头结构。
图3为构建传统扩增子文库检测基因位点突变。
图4为构建本发明单引物文库检测基因位点突变。
图5为构建传统扩增子文库与本发明单引物文库检测融合基因的比较。
图6为构建液相杂交捕获文库与本发明单引物文库的比较。
图7为本发明试剂盒使用方法的实验流程图。
图8为本发明单引物扩增文库构建流程图。
图9为胃肠间质瘤KIT突变阳性检测图。
图10为胃肠间质瘤KIT突变阴性检测图。
图11为胃肠间质瘤PDGFRA突变阳性检测图。
图12为胃肠间质瘤PDGFRA突变阴性检测图。
图13为透明细胞瘤EWSR1-ATF1融合阳性检测图。
图14为透明细胞瘤EWSR1-ATF1融合阴性检测图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1 DNA文库构建专用接头、检测融合基因和点突变的特异性复合引物及扩增复合引物的设计
1. DNA文库构建的专用接头
一种DNA文库构建的专用接头，为接头引物1分别和8条不同的i5端引物构成的8个二聚体。接头引物1和8条不同的i5端引物的序列如下表4。
表4 专用接头引物序列表
引物 名称 引物序列 5_index 序列 SEQ ID NO
接头 引物1 GATCGGAAGAGCCACATACTGA - SEQ ID NO：1
i5端1 号引物 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCTCTCT ATACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT CTCT CTAT SEQ ID NO：2
i5端2 号引物 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTATCCT CTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT TATC CTCT SEQ ID NO：3
i5端3 号引物 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTAAGG AGACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT GTAA GGAG SEQ ID NO：4
i5端4 号引物 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACACTGCA TAACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT ACTG CATA SEQ ID NO：5
i5端5 号引物 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAAGGAG TAACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT AAGG AGTA SEQ ID NO：6
i5端6 号引物 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCTAAGC CTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT CTAA GCCT SEQ ID NO：7
i5端7 号引物 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCGTCTA ATACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT CGTC TAAT SEQ ID NO：8
i5端8 号引物 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTCTC CGACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT TCTC TCCG SEQ ID NO：9
专用接头具有如图1所示的结构。其中，所述的5_index的序列为：CTCTCTAT、TATCCTCT、GTAAGGAG、ACTGCATA、AAGGAGTA、CTAAGCCT、CGTCTAAT或TCTCTCCG。因此，专用接头包括如图2所示的8个接头结构。
2.一组用于检测融合基因和点突变的特异性复合引物，特异性复合引物的序列如下表5。
表5 特异性引物序列表
检测位点 引物名称 引物序列 SEQ ID NO
与i5端引物配对 通用引物1 AATGATACGGCGACCACCGAGAT SEQ ID NO：10
ALK融合基因 ALK-1 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CATCTGCATGGCTTGCAGCTCCTG SEQ ID NO：11
CAMTA1融合基因 CAMTA1-1 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CGGGCCTGTGATGAGGACCTTCACTCCTC SEQ ID NO：12
表5续
CAMTA1融合基因 CAMTA1-2 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CCATTGCTGCAGGTCCACTTGATGCCATG SEQ ID NO：13
CAMTA1融合基因 CAMTA1-3 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CGGCGCTGTTACACTTGTGATGCACGCT SEQ ID NO：14
CCNB3融合基因 CCNB3-1 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CAGAGGCTACTACTGGTGTGACTTCCAGCT SEQ ID NO：15
CDX1融合基因 CDX1-1 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CACGCGGTACTTGTCCTTGGTCCGAGT SEQ ID NO：16
CIC融合基因 CIC-1 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CGTGCCGAGAAGCCGCAATGAGCGAGA SEQ ID NO：17
CIC融合基因 CIC-2 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CGTCCCTCCACAGCTGCCACAGGCAGG SEQ ID NO：18
EWSR1融合基因 EWSR1-1 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CGCCCAGCCTAGGATATGGACAGAGTAACTA SEQ ID NO：19
EWSR1融合基因 EWSR1-2 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CACTGGATCCTACAGCCAAGCTCCAAGTC SEQ ID NO：20
EWSR1融合基因 EWSR1-3 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CACCGGAGCATGAGTGGCCCTGATAACC SEQ ID NO：21
EWSR1融合基因 EWSR1-4 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CCAGCGCTGGAGAGCGAGGTGGCTTC SEQ ID NO：22
EWSR1融合基因 EWSR1-5 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CTGTCCTATGAAGACCCACCCACTGCCAAG SEQ ID NO：23
EWSR1融合基因 EWSR1-6 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CAGGCATGCCACCACCACTCCGTGGA SEQ ID NO：24
FOSB融合基因 FOSB-1 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CGTCCACCGAAGACAGATATTGAGACTCGGC SEQ ID NO：25
FOSB融合基因 FOSB-2 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CTGGCTGGTTGTGATCGCGGTGACCGT SEQ ID NO：26
FOXO1融合基因 FOXO1-3 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CCACACGAATGAACTTGCTGTGTAGGGACAG SEQ ID NO：27
FUS融合基因 FUS-1 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CGCAGAACCAGTACAACAGCAGCAGTGGT SEQ ID NO：28
FUS融合基因 FUS-2 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CCAGTGGTGGCTATGAACCCAGAGGTCGT SEQ ID NO：29
FUS融合基因 FUS-3 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CGCCCTCGGGACCAAGGATCACGTCATG SEQ ID NO：30
FUS融合基因 FUS-4 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CGCAAGCTGAAGGGAGAGGCAACGGTCT SEQ ID NO：31
HMGA2融合基因 HMGA2-1 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CGAGACCCAGGGGAAGACCCAAAGGCAGC SEQ ID NO：32
HMGA2融合基因 HMGA2-2 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CCGGCCAAGAGGCAGACCTAGGAAATGG SEQ ID NO：33
表5续
HMGA2融合基因 HMGA2-3 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CCAACAAGTTGTTCAGAAGAAGCCTGCTCAG SEQ ID NO：34
NCOA2融合基因 NCOA2-1 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CCTGGTTTGGCAATAACCTGCCCAGTTGC SEQ ID NO：35
NR4A3融合基因 NR4A3-1 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CGTATGTCTGCGCCGCATAACTGGAACCT SEQ ID NO：36
PAX3融合基因 PAX3-1 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CCACCATTGGCAATGGCCTCTCACCTCAG SEQ ID NO：37
PAX7融合基因 PAX7-1 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CCGGTCAGCAACGGCCTGTCTCCTCAG SEQ ID NO：38
PDGFB融合基因 PDGFB-1 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CAGCGGATCGAGTGGTCACTCAGCATCTC SEQ ID NO：39
SS18融合基因 SS18-1 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CGACCAACACAGCCTGGACCACCACAG SEQ ID NO：40
JAZF1融合基因 JAZF1-1 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CTCTTCATTCCGCAGCAGCACTCCGACA SEQ ID NO：41
TFE3融合基因 TFE3-1 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CAGGTGGTAGCGCGTTGGGTTCTCCAGA SEQ ID NO：42
TFE3融合基因 TFE3-2 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CCATTGTAACTGGACTCCAGGCTGATGATCTC SEQ ID NO：43
TFE3融合基因 TFE3-3 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CGTACACATCAAGCAGATTCCCTGACACAGG SEQ ID NO：44
USP6融合基因 USP6-1 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CAGTATGTCCTTCCGCTCCTGTGCCTGCA SEQ ID NO：45
KIT KIT-1 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CGGTGACATGGAAAGCCCCTGTTTCATACT SEQ ID NO：46
KIT KIT-2 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CACCCCATGAACTGCCTGTCAACAGCTAA SEQ ID NO：47
KIT KIT-3 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CGGACTGTCAAGCAGAGAATGGGTACTCAC SEQ ID NO：48
KIT KIT-4 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CGCCCACATCGTTGTAAGCCTTACATTCAAC SEQ ID NO：49
KIT KIT-5 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CGACAATAAAAGGCAGCTTGGACACGGCTTT SEQ ID NO：50
KIT KIT-6 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC GACCCATGAGTGCCCTTCTACATGTCCCACTTG SEQ ID NO：51
KIT KIT-7 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC GACTGATATGGTAGACAGAGCCTAAACATCCC CTT SEQ ID NO：52
PDGFRA PDGFRA-1 GGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGA TCGCTGAGCCTAATCCTCTGCCAGCTTTC SEQ ID NO：53
表5续
PDGFRA PDGFRA-2 GGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGA TCACCCAGATGTAGCCTTTGTACCTCTAGG SEQ ID NO：54
PDGFRA PDGFRA-3 GGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGA TCCAACATCAGAGCTGGATCTAGAAATGGAA SEQ ID NO：55
PDGFRA PDGFRA-4 GGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGA TCGGCAAAGGCATCACAATGCTGGAAGA SEQ ID NO：56
PDGFRA PDGFRA-5 GGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGA TCGTATCGAAGCAAATTAAAGCTGATCCG SEQ ID NO：57
PDGFRA PDGFRA-6 GGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGA TCAACTTCCTGGACTATTTTGGCCAACA SEQ ID NO：58
PDGFRA PDGFRA-7 GGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGA TCCATTTACATCATCACAGAGTATTGCTTCT SEQ ID NO：59
PDGFRA PDGFRA-8 GGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGA TCACAATGGTGACTACATGGACATGAAGC SEQ ID NO：60
3.一组文库扩增复合引物，文库扩增复合引物的序列如下表6。
表6 文库扩增复合引物序列表
引物名称 引物序列 7_index序列 SEQ ID NO
通用引物2 AATGATACGGCGACCACCG - SEQ ID NO：61
i7端1号引物 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCA CAAGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGT TCACAAGC SEQ ID NO：62
i7端2号引物 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACTA CACGGTGACTGGAGTTCAGACGTGT ACTACACG SEQ ID NO：63
i7端3号引物 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATCG TACGGTGACTGGAGTTCAGACGTGT ATCGTACG SEQ ID NO：64
i7端4号引物 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGA CACAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGT AGACACAG SEQ ID NO：65
i7端5号引物 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTGT CCTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGT TTGTCCTG SEQ ID NO：66
i7端6号引物 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGT GAGAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGT TGTGAGAG SEQ ID NO：67
i7端7号引物 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAG GTTGGGTGACTGGAGTTCAGACGTGT AAGGTTGG SEQ ID NO：68
i7端8号引物 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTA GCCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGT ATTAGCCA SEQ ID NO：69
实施例2 联合检测肉瘤相关融合基因或突变的试剂盒及检测方法
一种联合检测肉瘤相关融合基因或突变的试剂盒，包括实施例1的：（1）DNA文库构建的专用接头；（2）检测融合基因和点突变的特异性复合引物；（3）文库扩增复合引物。
上述试剂盒还包括：反转录反应试剂组；DNA片段化/末端修复/dA添加试剂组；DNA连接试剂组；PCR扩增试剂组；高保真热启动PCR扩增试剂组。
其中，反转录反应试剂组包括随机引物、第一链合成缓冲液、第一链合成酶混合液、第二链合成缓冲液、第二链合成酶混合液和超纯水。DNA片段化/末端修复/dA添加试剂组包括10×DNA片段化缓冲液、5×片段化酶混合液和超纯水。DNA连接试剂组包括5×连接酶缓冲液、TIANSeq DNA连接酶、专用接头和超纯水。PCR扩增试剂组包括5×多重PCR反应酶混合液、PCR引物。高保真热启动PCR扩增试剂组包括高保真热启动酶反应液、PCR引物和超纯水。
本发明提供的试剂盒中，上述（1）-（3）项试剂独立包装。
上述试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
（1）使用DNA文库构建的专用接头连接检测样本DNA；
（2）使用检测融合基因和点突变的特异性复合引物对步骤S1的连接产物进行复合PCR扩增；
（3）使用文库扩增复合引物对步骤S2获得的扩增产物进行PCR扩增，获得测序文库；
（4）对步骤S3获得的测序文库进行测序。
试剂盒的检测方法包括如下具体步骤（如图7-8所示，图7为本发明试剂盒使用方法的实验流程图，图8为本发明单引物扩增文库构建流程图）：
1、cDNA逆转录
1.1 第一链cDNA合成
1.1.1试剂准备：将样本中提取的RNA置于冰上缓慢解冻后移液器混匀，随机引物、第一链合成缓冲液、第一链合成酶混合液（TIANSeq RNA片段化及cDNA合成模块NG308）从-20℃取出，解冻后轻弹混匀。
1.1.2在PCR管中配制如下反应体系，并用移液器轻轻吹打充分混匀：
RNA XμL（1000ng）；
随机引物 1μL；
超纯水 （10-X）μL；
总体积 11μL。
1.1.3 将上述反应体系置于65℃孵育5分钟，然后置于冰上2分钟。
1.1.4步骤1.1.3结束后，在原管中继续加入反转录组分，配制如下反应体系：
步骤1.1.3结束反应液 11μL；
第一链合成缓冲液 7μL；
第一链合成酶混合液 2μL；
总体积 20μL。
1.1.5用移液器轻轻吹打充分混匀，进行第一链cDNA合成反应，反应程序如下：25℃10min；42℃15min；70℃15min；4℃hold。PCR仪热盖温度设置为105℃。（注意：反应结束后立即进行cDNA第二链的合成反应。）
1.2 第二链cDNA合成
1.2.1将第二链合成酶缓冲液和第二链合成酶混合液（TIANSeq RNA片段化及cDNA合成模块NG308）从-20℃取出，轻弹混匀，在PCR管中配制如下反应体系，并用移液器轻轻吹打充分混匀：
合成的第一链cDNA 20μL；
第二链合成酶缓冲液 8.5μL；
第二链合成酶混合液 3.5μL；
超纯水 48μL；
总体积 80μL。
1.2.2在PCR仪中进行第二链cDNA合成反应，反应程序如下：16℃60min；4℃hold。PCR仪热盖温度设定为≤40℃。（注意：反应结束后，cDNA第二链的合成产物可在4℃暂存1小时，但是建议反应结束后立即进行下步纯化步骤。）
1.3 纯化
1.3.1 1.8X纯化磁珠（TIANSeq DNA片段分选磁珠NG306）纯化cDNA第二链的合成产物，37μL纯水洗脱，进行cDNA定量，得到cDNA样品。
2、cDNA与样品提取的DNA混合
取50ngcDNA样品和同一份样本中提取的50ngDNA样品等量混合，得到cDNA和DNA混合液100ng。
3、文库构建：核酸片段化、末端修复及加A
3.1 取10×DNA片段化缓冲液、5×片段化酶混合液（TIANSeq快速DNA片段化/末端修复/dA添加模块NG301-02）配制如下反应体系（DNA上样量>10ng），冰上操作，各组分加入后，请轻柔吸打混匀，注意不要涡旋：
10×DNA片段化缓冲液 5μL；
5×片段化酶混合液 10μL；
cDNA和DNA混合液 XμL（100ng）；
超纯水 （35-X）μL；
总体积 50μL。
3.2在PCR仪中进行如下反应程序：4℃ 1min；32℃7min；65℃30min；4℃ hold。PCR仪热盖温度设置为70℃。
其中，32℃片段化时间选择参考如下：
DNA主峰为250bp时，10ng DNA上样量32℃片段化时间为24min，100ng DNA上样量32℃片段化时间为16min，1000ng DNA上样量32℃片段化时间为14min。
DNA主峰为350bp时，10ng DNA上样量32℃片段化时间为16min，100ng DNA上样量32℃片段化时间为10min，1000ng DNA上样量32℃片段化时间为8min。
DNA主峰为450bp时，10ng DNA上样量32℃片段化时间为14min，100ng DNA上样量32℃片段化时间为8min，1000ng DNA上样量32℃片段化时间为6min。
DNA主峰为550bp时，10ng DNA上样量32℃片段化时间为10min，100ng DNA上样量32℃片段化时间为6min，1000ng DNA上样量32℃片段化时间为4min。
3.3反应结束后，立即进入接头连接步骤。
4、文库构建：接头连接
4.1取5×Ligase Buffer、TIANSeq DNA Ligase（TIANSeq快速连接模块NG303-02）在步骤3反应结束管中配制如下反应体系：
步骤3反应产物 50μL；
5×Ligase Buffer 20μL；
TIAN Seq DNA Ligase 10μL；
专用接头（15μM） 2.5μL；
超纯水 17.5μL；
总体积 100μL。
其中，专用接头包括以下8个接头结构：
接头1：
Figure 562736DEST_PATH_IMAGE001
接头2：
Figure 791723DEST_PATH_IMAGE002
接头3：
Figure 996440DEST_PATH_IMAGE003
接头4：
Figure 929760DEST_PATH_IMAGE004
接头5：
Figure 67481DEST_PATH_IMAGE005
接头6：
Figure 795265DEST_PATH_IMAGE006
接头7：
Figure 516971DEST_PATH_IMAGE007
接头8：
Figure 988404DEST_PATH_IMAGE008
4.2移液器吸打混匀，放入PCR仪，进行如下反应程序：20℃ 15min；4℃ hold。无热盖。
4.3 1.6×磁珠（TIANSeq DNA片段分选磁珠NG306）纯化接头连接产物，16μL超纯水洗脱，取15μL上清液到新的PCR管中，进行第一步PCR扩增反应。
5、第一步多重PCR扩增
5.1取5×多重PCR反应酶混合液（Multiplex PCR Assay Kit Ver.2，RR062A，Takara）配制如下多重PCR反应体系：
5×多重PCR反应酶混合液 4μL；
10μM特异性引物混合物 1μL；
通用引物1 4.7μL；
步骤4获得的纯化后接头连接产物 10.3μL；
总体积 20μL。
其中，特异性引物混合物配制方法：先将各引物稀释至100μM，然后按照下表7所示配制混合物体系。
表7 特异性引物混合物体系
引物名称 SEQ ID NO 各引物100μM混入量（μL） 20μL反应体系引物终浓度（μM）
ALK-1 SEQ ID NO:11 1 0.1
CAMTA1-1 SEQ ID NO:12 1 0.1
CAMTA1-2 SEQ ID NO:13 1 0.1
CAMTA1-3 SEQ ID NO:14 1 0.1
CCNB3-1 SEQ ID NO:15 1 0.1
CDX1-1 SEQ ID NO:16 1 0.1
CIC-1 SEQ ID NO:17 1 0.1
CIC-2 SEQ ID NO:18 1 0.1
EWSR1-1 SEQ ID NO:19 1 0.1
EWSR1-2 SEQ ID NO:20 1 0.1
EWSR1-3 SEQ ID NO:21 1 0.1
EWSR1-4 SEQ ID NO:22 1 0.1
EWSR1-5 SEQ ID NO:23 1 0.1
EWSR1-6 SEQ ID NO:24 1 0.1
表7续
FOSB-1 SEQ ID NO:25 1 0.1
FOSB-2 SEQ ID NO:26 1 0.1
FOXO1-3 SEQ ID NO:27 1 0.1
FUS-1 SEQ ID NO:28 1 0.1
FUS-2 SEQ ID NO:29 1 0.1
FUS-3 SEQ ID NO:30 1 0.1
FUS-4 SEQ ID NO:31 1 0.1
HMGA2-1 SEQ ID NO:32 1 0.1
HMGA2-2 SEQ ID NO:33 1 0.1
HMGA2-3 SEQ ID NO:34 1 0.1
NCOA2-1 SEQ ID NO:35 1 0.1
NR4A3-1 SEQ ID NO:36 1 0.1
PAX3-1 SEQ ID NO:37 1 0.1
PAX7-1 SEQ ID NO:38 1 0.1
PDGFB-1 SEQ ID NO:39 1 0.1
SS18-1 SEQ ID NO:40 1 0.1
JAZF1-1 SEQ ID NO:41 1 0.1
TFE3-1 SEQ ID NO:42 1 0.1
TFE3-2 SEQ ID NO:43 1 0.1
TFE3-3 SEQ ID NO:44 1 0.1
USP6-1 SEQ ID NO:45 1 0.1
KIT-1 SEQ ID NO:46 1 0.1
KIT-2 SEQ ID NO:47 1 0.1
KIT-3 SEQ ID NO:48 1 0.1
KIT-4 SEQ ID NO:49 1 0.1
KIT-5 SEQ ID NO:50 1 0.1
KIT-6 SEQ ID NO:51 1 0.1
KIT-7 SEQ ID NO:52 1 0.1
PDGFRA-1 SEQ ID NO:53 1 0.1
表7续
PDGFRA-2 SEQ ID NO:54 1 0.1
PDGFRA-3 SEQ ID NO:55 1 0.1
PDGFRA-4 SEQ ID NO:56 1 0.1
PDGFRA-5 SEQ ID NO:57 1 0.1
PDGFRA-6 SEQ ID NO:58 1 0.1
PDGFRA-7 SEQ ID NO:59 1 0.1
PDGFRA-8 SEQ ID NO:60 1 0.1
10μM特异性引物混合物总量 - 50 -
5.2反应体系配好后，移液器吹打10次混匀，放入PCR仪，运行以下反应程序：99℃2min；99℃ 15s，69℃ 4min，18个循环；72℃ 10min；4℃ hold。PCR仪热盖温度设置为105℃。
5.3 PCR结束后，电泳。1.6×磁珠（TIANSeq DNA片段分选磁珠NG306）纯化，使用15μL纯水洗脱，得到第一步PCR扩增产物，Qubit定量。
6、第二步PCR扩增
6.1取高保真热启动酶反应液（TIANSeq高保真PCR反应预混液NG219-12），及第一步PCR纯化产物进行第二步PCR扩增，扩增体系如下：
高保真热启动酶反应液 25μL；
i7-primer（10μM） 1.5μL；
通用引物2（10μM） 1.5μL；
第一步PCR纯化产物 10μL；
超纯水 12μL；
总体积 50μL。
6.2第二步PCR扩增反应体系配好后，移液器吹打10次混匀，放入PCR仪，运行以下反应程序95℃ 3min；98℃ 20s，58℃ 15s，72℃ 15s，8个循环；72℃ 1min；4℃ hold。PCR仪热盖温度设置为105℃。
6.3 PCR反应结束后，Qubit定量，电泳。
6.4 1.3×磁珠（TIANSeq DNA片段分选磁珠NG306）纯化，10μL超纯水洗脱，Qubit定量。
7、文库稀释到2-3ng/μL，采用Agilent 4150 TapeStation系统进行检测。
8、测序上机。
9、生物信息学分析软件对进行数据结果分析。
实验例1
采用本发明实施例2所述的步骤对KIT样本进行检测。以下实验均征得患者本人知情及同意。
1.样本1：来源为云南省肿瘤医院普外科病人的胃肠间质瘤样本（编号为27698）。
检测结果如图9所示，该样本为KIT:NM_000222:exon11:c.T1727C:p.L576P突变阳性，突变率为32.08%。
2.样本2：来源为苏州科诺医学检验所体检健康人的样本（编号为190021）。
检测结果如图10所示，该样本为KIT:NM_000222:exon11:c.T1727C:p.L576P突变阴性。
实验例2
采用本发明实施例2所述的步骤对PDGFRA样本进行检测。以下实验均征得患者本人知情及同意。
1.样本3：来源为湖南省肿瘤医院病人的胃肠间质瘤样本（编号为27782）。
检测结果如图11所示，该样本为PDGFRA:NM_006206:exon12:c.C1658T:p.P553L突变阳性，突变率为35.29%。
2.样本4：来源为苏州科诺医学检验所体检健康人的样本（编号190021）。
检测结果如图12所示，该样本为PDGFRA:NM_006206:exon12:c.C1658T:p.P553L突变阴性。
实验例3
采用本发明实施例2所述的步骤对EWSR1-ATF1融合样本进行检测。以下实验均征得患者本人知情及同意。
1.样本5：来源为云南省肿瘤医院病人的透明细胞瘤样本（编号为27042）。
检测结果如图13所示，该样本为EWSR1-ATF1融合阳性。
2.样本6：来源为苏州科诺医学检验所体检健康人的样本（编号为190021）。
检测结果如图14所示，该样本为EWSR1-ATF1融合阴性。
实验例4 准确度
对实验例1样本1、实验例2样本3、实施例3样本5分别采用Sanger测序法进行验证，与本发明提供的方法检测结果一致，表明本发明提供的试剂盒具有较好的准确度。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 苏州科贝生物技术有限公司
<120> 一种肉瘤融合基因和/或突变联合检测引物组及试剂盒
<130> 20200924
<160> 69
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
gatcggaaga gccacatact ga 22
<210> 2
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 2
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacc tctctataca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatct 70
<210> 3
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 3
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact atcctctaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatct 70
<210> 4
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 4
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacg taaggagaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatct 70
<210> 5
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 5
aatgatacgg cgaccaccga gatctacaca ctgcataaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatct 70
<210> 6
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 6
aatgatacgg cgaccaccga gatctacaca aggagtaaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatct 70
<210> 7
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 7
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacc taagcctaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatct 70
<210> 8
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 8
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacc gtctaataca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatct 70
<210> 9
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 9
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctctccgaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatct 70
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 10
aatgatacgg cgaccaccga gat 23
<210> 11
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 11
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcatctgca tggcttgcag ctcctg 56
<210> 12
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 12
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcgggcctg tgatgaggac cttcactcct 60
c 61
<210> 13
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 13
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atccattgct gcaggtccac ttgatgccat 60
g 61
<210> 14
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 14
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcggcgctg ttacacttgt gatgcacgct 60
<210> 15
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 15
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcagaggct actactggtg tgacttccag 60
ct 62
<210> 16
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 16
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcacgcggt acttgtcctt ggtccgagt 59
<210> 17
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 17
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcgtgccga gaagccgcaa tgagcgaga 59
<210> 18
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 18
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcgtccctc cacagctgcc acaggcagg 59
<210> 19
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 19
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcgcccagc ctaggatatg gacagagtaa 60
cta 63
<210> 20
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 20
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcactggat cctacagcca agctccaagt 60
c 61
<210> 21
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 21
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcaccggag catgagtggc cctgataacc 60
<210> 22
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 22
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atccagcgct ggagagcgag gtggcttc 58
<210> 23
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 23
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgtccta tgaagaccca cccactgcca 60
ag 62
<210> 24
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 24
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcaggcatg ccaccaccac tccgtgga 58
<210> 25
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 25
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcgtccacc gaagacagat attgagactc 60
ggc 63
<210> 26
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 26
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctggctgg ttgtgatcgc ggtgaccgt 59
<210> 27
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 27
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atccacacga atgaacttgc tgtgtaggga 60
cag 63
<210> 28
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 28
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcgcagaac cagtacaaca gcagcagtgg 60
t 61
<210> 29
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 29
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atccagtggt ggctatgaac ccagaggtcg 60
t 61
<210> 30
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 30
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcgccctcg ggaccaagga tcacgtcatg 60
<210> 31
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 31
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcgcaagct gaagggagag gcaacggtct 60
<210> 32
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 32
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcgagaccc aggggaagac ccaaaggcag 60
c 61
<210> 33
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 33
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atccggccaa gaggcagacc taggaaatgg 60
<210> 34
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 34
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atccaacaag ttgttcagaa gaagcctgct 60
cag 63
<210> 35
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 35
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcctggttt ggcaataacc tgcccagttg 60
c 61
<210> 36
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 36
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcgtatgtc tgcgccgcat aactggaacc 60
t 61
<210> 37
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 37
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atccaccatt ggcaatggcc tctcacctca 60
g 61
<210> 38
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 38
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atccggtcag caacggcctg tctcctcag 59
<210> 39
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 39
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcagcggat cgagtggtca ctcagcatct 60
c 61
<210> 40
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 40
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcgaccaac acagcctgga ccaccacag 59
<210> 41
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 41
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcttcat tccgcagcag cactccgaca 60
<210> 42
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 42
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcaggtggt agcgcgttgg gttctccaga 60
<210> 43
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 43
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atccattgta actggactcc aggctgatga 60
tctc 64
<210> 44
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 44
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcgtacaca tcaagcagat tccctgacac 60
agg 63
<210> 45
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 45
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcagtatgt ccttccgctc ctgtgcctgc 60
a 61
<210> 46
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 46
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcggtgaca tggaaagccc ctgtttcata 60
ct 62
<210> 47
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 47
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcaccccat gaactgcctg tcaacagcta 60
a 61
<210> 48
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 48
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcggactgt caagcagaga atgggtactc 60
ac 62
<210> 49
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 49
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcgcccaca tcgttgtaag ccttacattc 60
aac 63
<210> 50
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 50
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcgacaata aaaggcagct tggacacggc 60
ttt 63
<210> 51
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 51
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcgacccat gagtgccctt ctacatgtcc 60
cacttg 66
<210> 52
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 52
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcgactgat atggtagaca gagcctaaac 60
atcccctt 68
<210> 53
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 53
ggtgactgga gttcagacgt gtgctcttcc gatcgctgag cctaatcctc tgccagcttt 60
c 61
<210> 54
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 54
ggtgactgga gttcagacgt gtgctcttcc gatcacccag atgtagcctt tgtacctcta 60
gg 62
<210> 55
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 55
ggtgactgga gttcagacgt gtgctcttcc gatccaacat cagagctgga tctagaaatg 60
gaa 63
<210> 56
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 56
ggtgactgga gttcagacgt gtgctcttcc gatcggcaaa ggcatcacaa tgctggaaga 60
<210> 57
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 57
ggtgactgga gttcagacgt gtgctcttcc gatcgtatcg aagcaaatta aagctgatcc 60
g 61
<210> 58
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 58
ggtgactgga gttcagacgt gtgctcttcc gatcaacttc ctggactatt ttggccaaca 60
<210> 59
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 59
ggtgactgga gttcagacgt gtgctcttcc gatccattta catcatcaca gagtattgct 60
tct 63
<210> 60
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 60
ggtgactgga gttcagacgt gtgctcttcc gatcacaatg gtgactacat ggacatgaag 60
c 61
<210> 61
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 61
aatgatacgg cgaccaccg 19
<210> 62
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 62
caagcagaag acggcatacg agattcacaa gcgtgactgg agttcagacg tgt 53
<210> 63
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 63
caagcagaag acggcatacg agatactaca cggtgactgg agttcagacg tgt 53
<210> 64
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 64
caagcagaag acggcatacg agatatcgta cggtgactgg agttcagacg tgt 53
<210> 65
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 65
caagcagaag acggcatacg agatagacac aggtgactgg agttcagacg tgt 53
<210> 66
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 66
caagcagaag acggcatacg agatttgtcc tggtgactgg agttcagacg tgt 53
<210> 67
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 67
caagcagaag acggcatacg agattgtgag aggtgactgg agttcagacg tgt 53
<210> 68
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 68
caagcagaag acggcatacg agataaggtt gggtgactgg agttcagacg tgt 53
<210> 69
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 69
caagcagaag acggcatacg agatattagc cagtgactgg agttcagacg tgt 53

Claims (3)

1.一种肉瘤融合基因和/或突变联合检测试剂盒，其特征在于，所述的肉瘤融合基因和/或突变联合检测试剂盒包括：
（1）一组用于检测融合基因和点突变的特异性复合引物，所述特异性复合引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:10-SEQ ID NO:60所示；
（2）一种DNA文库构建的专用接头，所述的DNA文库构建的专用接头为接头引物1分别和8条不同的i5端引物构成的8个二聚体；
所述的接头引物1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
所述的8条不同的i5端引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2-SEQ ID NO:9所示；
（3）一组文库扩增复合引物，其特征在于，所述的文库扩增复合引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:61-SEQ ID NO:69所示。
2.根据权利要求1所述的一种肉瘤融合基因和/或突变联合检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括以下任意一个或多个试剂组：反转录反应试剂组；DNA片段化/末端修复/dA添加试剂组；DNA连接试剂组；PCR扩增试剂组；高保真热启动PCR扩增试剂组。
3.根据权利要求2所述的一种肉瘤融合基因和/或突变联合检测试剂盒，其特征在于，
所述的反转录反应试剂组包括随机引物、第一链合成缓冲液、第一链合成酶混合液、第二链合成缓冲液、第二链合成酶混合液和超纯水；
所述的DNA片段化/末端修复/dA添加试剂组包括10×DNA片段化缓冲液、5×片段化酶混合液和超纯水；
所述的DNA连接试剂组包括5×连接酶缓冲液、TIANSeq DNA连接酶、专用接头和超纯水；
所述的PCR扩增试剂组包括5×多重PCR反应酶混合液、PCR引物；
所述的高保真热启动PCR扩增试剂组包括高保真热启动酶反应液、PCR引物和超纯水。
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