CN112094916B - 一种血浆游离dna肺癌基因联合检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分子生物学技术领域，具体公开了一种血浆游离DNA肺癌融合基因联合检测引物组和试剂盒。本发明试剂盒包含：1）DNA文库构建的专用接头；2）检测融合基因和点突变的特异性复合引物；3）文库扩增复合引物。本发明通过提取送检样品的DNA，对其进行片段化、末端修复和接头连接，产物进行PCR扩增，富集文库后进行高通量测序。本发明提供的融合基因检测试剂盒及检测方法，能一次性检测肺癌相关的多种融合基因或突变，提高了检测效率，操作方便，用时短，且灵敏度较高，可达到0.0625%。

Description

一种血浆游离DNA肺癌基因联合检测试剂盒
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种血浆游离DNA中肺癌相关基因融合和/或突变联合检测引物组和试剂盒。
背景技术
目前，肺癌的发病率和死亡率已居所有恶性肿瘤之首，被广泛的分为小细胞肺癌（SCLC）和非小细胞肺癌（NSCLC），其中，小细胞肺癌（SCLC）占比15%左右，非小细胞肺癌（NSCLC）占比85%左右。据世界卫生组织估计，截至到2025年，我国每年肺癌死亡病例将达到100万。以手术、放疗、化疗和分子靶向治疗为基础的综合治疗是肺癌最主要的治疗手段。有研究表明，在肺癌早期阶段，NSCLC经手术切除后具有良好的预后，小的局部肿瘤的5年存活期为70-90%（I期），然而，大多数患者（约75%）在诊断时即为晚期（III/IV期），生存率明显下降。2014年，据UK Office for National Statistics报道，IV期肺癌患者的一年生存率仅为15-19%，而I期为81-85%。SCLC比NSCLC更具有攻击性，预后更差，研究发现，I期患者5年单切的生存率为40%，同时进行放疗/化疗的生存率为52%，然而，超过90%的患者在诊断时即为晚期（III/IV期），整体5年生存率仅为5%。因此，对早期肺癌的筛查与检测是改善肺癌生存率的关键。
针对肺癌的早期检测及筛查，传统的检测方法有影像学检测（如CT扫描、核磁共振）、电子支气管镜等方法，其检测所需设备较为专业且昂贵，需要专业技术人员进行操作，且检测效率往往较低。随着技术的发展及人们对肺癌的不断了解，对血清肿瘤标志物的检测逐渐成为研究热点之一。目前，临床中常用的肿瘤标志物包括：癌胚抗原（CEA）、神经特异性烯化酶（NES）、细胞角蛋白19片段（CYERA-21-1）、表皮生长因子受体（EGFR）等，通过检测体内肿瘤标志物的含量或变化，进而诊断及评估肺癌的临床分期。
然而，肺癌肿瘤标志物在不同的个体中的差异很大，这主要是由于肺癌的病理类型对肿瘤标志物的变化具有很大的影响，同时受技术条件的限制，在肺癌患者中检测的敏感性和特异性尚有一定的局限性。如何寻找和应用有效的筛选方法，将分子生物学技术用于肺癌早期诊断，提高早期肺癌的检出率是当前研究的热点之一。
目前融合基因的检测，是肺癌早期诊断的研究热点之一。对于融合基因的检测，主要依赖于实时荧光定量PCR（Real Time PCR，RT-PCR）、荧光原位杂交技术（Fluorescencein situ hybridization，FISH）和免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）等。FISH和IHC均采用探针杂交原理对已知的基因融合进行检测，一般一次仅检测一种类型的基因融合，操作流程复杂，成本较高；RT-PCR具有相对较高的检测通量，但需要的样品量较多，实验操作步骤多，检测费用较高。专利CN111172281A提供了一种非小细胞肺癌多重基因突变检测试剂盒及方法，虽然能够同时检测62种突变类型，但其样品需求量较大，不适合血浆样品的检测。专利CN104818318B公开了一次性检测肺癌多重基因的引物、探针、检测体系及试剂盒，可一次性检测肺癌EGFR/KRAS/BRAF/ALK/ROS1基因，但其样品需求量较大，且检测费用较高。专利CN111235272A公开了一种一次性检测肺癌多重基因突变的组合物，但其检测中需采用两个PCR 8联管，一个检测融合基因，另一个检测突变，所需样品量较多，且操作较为复杂。
综上，上述检测方法只能对已知的基因融合检测或对点突变进行检测，且受限于检测通量的限制，无法对致癌融合基因和点突变实现一次性全检测，因此，开发一种能同时检测融合基因和点突变的试剂盒，对于肺癌的临床研究和早期诊断具有重要的意义。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明要解决的技术问题是为了能同时检测与肺癌相关的多基因、已知及未知基因的融合和突变情况，提供了一种能联合检测血浆游离DNA肺癌相关基因融合或突变的引物组和试剂盒，通过对送检样品的DNA进行提取，并进行高通量测序文库构建，能一次性检测包括NRAS、KRAS、EGFR、ERBB2、PIK3CA、MET、BRAF、RET、ROS1、ALK等多种突变或与其他基因的融合情况，可以为肺癌患者提供精准诊断和治疗，并为肺癌患者进行癌症风险评估。
为解决上述技术问题，本发明提供以下技术方案：
一方面，本发明提供了一组用于检测融合基因和点突变的特异性复合引物，所述的特异性复合引物的序列如下表1。
表1特异性复合引物序列
检测位点 引物名称 引物序列 SEQ ID NO
与i5端 引物配对 通用引物1 AATGATACGGCGACCACCGAGAT SEQ ID NO：10
NRAS-G12 NRAS-1 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCG GATTAGCTGGATTGTCAGTGCGCTT SEQ ID NO：11
NRAS-Q61 NRAS-2 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCC CTCATGTATTGGTCTCTCATGGCACTGT SEQ ID NO：12
KRAS-G12 KRAS-1 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC CTGAATTAGCTGTATCGTCAAGGCACTCTTG SEQ ID NO：13
KRAS-Q61 KRAS-2 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC AAAGCCCTCCCCAGTCCTCATGT SEQ ID NO：14
EGFR-G719 EGFR-1 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC CCTTATACACCGTGCCGAACGCA SEQ ID NO：15
EGFR-L858 EGFR-2 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC GGTGAAAACACCGCAGCATGTCA SEQ ID NO：16
EGFR-T790 EGFR-3 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC GTGTTCCCGGACATAGTCCAGGAGG SEQ ID NO：17
EGFR-19del EGFR-4 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC GAAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTA SEQ ID NO：18
ERBB2-20ins ERBB2-4 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC ACCCTTGTCCCCAGGAAGCATACG SEQ ID NO：19
PIK3CA-E545 PIK3CA-1 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC GAGAATCTCCATTTTAGCACTTACCTGTGACTC SEQ ID NO：20
PIK3CA-H1047 PIK3CA-2 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC ACTGAGCAAGAGGCTTTGGAGTATTTCATG SEQ ID NO：21
表1续
MET-exon14 MET-1 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC GCTGGTGTTGTCTCAATATCAACAGCACTG SEQ ID NO：22
MET-exon14 MET-2 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC GTCGTCGATTCTTGTGTGCTGTCTTATATG SEQ ID NO：23
MET-exon14 MET-3 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CGCCGTCTTTAACAAGCTCTTTCTTTCTCTCT SEQ ID NO：24
MET-exon14 MET-4 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CGATAGGCTTGTAAGTGCCCGAAGTGT SEQ ID NO：25
BRAF-V600 BRAF-1 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CTTCTAGTAACTCAGCAGCATCTCAGGGCC SEQ ID NO：26
ALK-intron19 ALK-1 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CTGCTCAGCTTGTACTCAGGGCTCTG SEQ ID NO：27
ALK-intron19 ALK-2 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC CTCCCCTGAGCTCTGAACCTTTCCATCATAC SEQ ID NO：28
ALK-intron19 ALK-3 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CGGGCAGAGTCATGTTAGTCTGGTTCCTC SEQ ID NO：29
ALK-intron19 ALK-4 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CGCTGGGTGAACCAGCAGACTGTGTT SEQ ID NO：30
ALK-intron19 ALK-5 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CCCATGGAGCCTAAGGAAGTTTCAGCAAG SEQ ID NO：31
ALK-intron19 ALK-6 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CCCCAGGAATTGGCCTGCCTTAGTA SEQ ID NO：32
ALK-intron19 ALK-7 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CATTTGAGGGTGCAGCTGGGATCTTG SEQ ID NO：33
ALK-intron19 ALK-8 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CGAAAAGATCTCTGAATTGGTGTCTGGGGAT SEQ ID NO：34
ALK-intron19 ALK-9 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CGGTCACAGGACCTCTTTGGACTGC SEQ ID NO：35
ALK-intron19 ALK-10 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CGCTCTACCAATGTGAGTGACCATTATCACTCC SEQ ID NO：36
ALK-intron19 ALK-11 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CGCCAGAACAAAATTGTGATTCAGTGGGTAG SEQ ID NO：37
ALK-intron19 ALK-12 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CACCCGCTATGTGCTCAGTTCCCT SEQ ID NO：38
ALK-intron19 ALK-13 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CGCCGAGCACGTAGTAACCATGCAA SEQ ID NO：39
ALK-intron19 ALK-14 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CCTCCCTTCTACCGGCAGATCCCTT SEQ ID NO：40
ALK-intron19 ALK-15 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CCCCATCTGTCCTGGGCATGTCTCT SEQ ID NO：41
ALK-intron19 ALK-16 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCG GCTGAACAGAAATATACTCAGAAACCGATTTTCC SEQ ID NO：42
表1续
ALK-intron19 ALK-17 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC GTGGAAGCATGTGGGAGCTAGAAGTG SEQ ID NO：43
ALK-intron19 ALK-18 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CCCCTGATCAGCCAGGAGGATACACA SEQ ID NO：44
ALK-intron19 ALK-19 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CGTTGGGAGCTTCCGTTTTGGCTTG SEQ ID NO：45
ALK-intron19 ALK-20 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC AGAGAGGATCAGCGAGAGTGGCA SEQ ID NO：46
RET-intron11 RET-1 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CCATCCTGTGAGGGGCTGCCAA SEQ ID NO：47
RET-intron11 RET-2 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CGGGGTGGGACTGTGATGAGGT SEQ ID NO：48
RET-intron11 RET-3 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC ATGGAGGGGCACTGAAGTCAGAAGG SEQ ID NO：49
RET-intron11 RET-4 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CGGCCTCTGCCCTCTCCTGGT SEQ ID NO：50
RET-intron11 RET-5 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CAGGCTCAGAGCCAAGGGTGTGA SEQ ID NO：51
RET-intron11 RET-6 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CCCTGGAGCCTCCGTTCAGGC SEQ ID NO：52
RET-intron11 RET-7 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CGTTTGTGTGAGGCTGCCCAGGAA SEQ ID NO：53
RET-intron11 RET-8 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CATCAGCACCAGGTCTTGGACCCAT SEQ ID NO：54
RET-intron11 RET-9 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CGGTAAACAGGTTTCCAGTGCCAGCT SEQ ID NO：55
RET -intron11 RET-10 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CGCTTTGGCCTCCCTGGTCAGAG SEQ ID NO：56
RET-intron11 RET-11 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CAACATGGTGGCGCCTTTCTTTGC SEQ ID NO：57
RET-intron11 RET-12 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CGGGCCTGGTGCTCATTTAGTCCT SEQ ID NO：58
RET-intron11 RET-13 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CCTGCACATTGGAACTTGTCCATGGG SEQ ID NO：59
ROS1-intron33 ROS1-1 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCA TAGTAAGTATGAAACTTGTTTCTGGTATCCAAA SEQ ID NO：60
ROS1-intron33 ROS1-2 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CGCCAGTTGTTAGACCGTTGGTAGCTTGAA SEQ ID NO：61
ROS1-intron33 ROS1-3 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCA AAGAAGAACATGCTACAGAGATCACATGTAGCC SEQ ID NO：62
ROS1-intron33 ROS1-4 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCG ACTAAGGAGCATCAGGTAAGCATTATGATGAGT SEQ ID NO：63
表1续
ROS1-intron33 ROS1-5 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC GGCAAACACAGGGCCAAAGACTAAGTGA SEQ ID NO：64
ROS1-intron33 ROS1-6 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC GAGAGCCATTGTGGGTATTTCAGAGAGGGAT SEQ ID NO：65
ROS1-intron33 ROS1-7 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCA CAGGACCTGATTACTGAGTAGAGGGAAAAATCAC SEQ ID NO：66
ROS1-intron33 ROS1-8 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCA TGTAGGAGTGGTCATAAGGCTGGTATAATGTGA SEQ ID NO：67
ROS1-intron33 ROS1-9 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC GCCAGAGTCTGGCAAACTATGGCATGA SEQ ID NO：68
ROS1-intron33 ROS1-10 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCG GACCAAGAAATCTCAGTCTTTGGATACTAAATAG SEQ ID NO：69
ROS1-intron33 ROS1-11 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCG ACTAAGGAGCATCAGGTAAGCATTATG SEQ ID NO：70
另一方面，本发明提供了一种血浆游离DNA肺癌融合基因和/或突变联合检测试剂盒。
具体地，所述的血浆游离DNA肺癌融合基因和/或突变联合检测试剂盒包括本发明上述的检测融合基因和点突变的特异性复合引物。
具体地，所述的试剂盒还包含一种DNA文库构建的专用接头，所述的专用接头为接头引物1分别和8条不同的i5端引物构成的8个二聚体。所述的接头引物1和8条不同的i5端引物的序列如下表2。
表2 专用接头序列
引物 名称 引物序列 5_index 序列 SEQ ID NO
接头 引物1 GATCGGAAGAGCCACATACTGA - SEQ ID NO：1
i5端1 号引物 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCTCTCT ATACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT CTCT CTAT SEQ ID NO：2
i5端2 号引物 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTATCCT CTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT TATC CTCT SEQ ID NO：3
i5端3 号引物 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTAAGG AGACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT GTAA GGAG SEQ ID NO：4
i5端4 号引物 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACACTGCA TAACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT ACTG CATA SEQ ID NO：5
i5端5 号引物 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAAGGAG TAACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT AAGG AGTA SEQ ID NO：6
i5端6 号引物 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCTAAGC CTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT CTAA GCCT SEQ ID NO：7
表2续
i5端7 号引物 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCGTCTA ATACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT CGTC TAAT SEQ ID NO：8
i5端8 号引物 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTCTC CGACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT TCTC TCCG SEQ ID NO：9
进一步具体地，所述的专用接头具有附图1所示的结构。其中，所述的5_index的序列为：CTCTCTAT、TATCCTCT、GTAAGGAG、ACTGCATA、AAGGAGTA、CTAAGCCT、CGTCTAAT或TCTCTCCG。
进一步具体地，所述的专用接头包括附图2所示的8个接头结构。
具体地，所述的试剂盒还包含一组文库扩增复合引物，所述的文库扩增复合引物的序列如下表3。
表3 文库扩增复合引物序列
引物名称 引物序列 7_index序列 SEQ ID NO
通用引物2 AATGATACGGCGACCACCG - SEQ ID NO：71
i7端1号引物 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCA CAAGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGT TCACAAGC SEQ ID NO：72
i7端2号引物 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACTACACGGTGACTGGAGTTCAGACGTGT ACTACACG SEQ ID NO：73
i7端3号引物 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATCGTACGGTGACTGGAGTTCAGACGTGT ATCGTACG SEQ ID NO：74
i7端4号引物 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGACACAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGT AGACACAG SEQ ID NO：75
i7端5号引物 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTGTCCTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGT TTGTCCTG SEQ ID NO：76
i7端6号引物 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGTGAGAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGT TGTGAGAG SEQ ID NO：77
i7端7号引物 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGGTTGGGTGACTGGAGTTCAGACGTGT AAGGTTGG SEQ ID NO：78
i7端8号引物 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTAGCCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGT ATTAGCCA SEQ ID NO：79
本发明提供的试剂盒中，上述（1）检测融合基因和点突变的特异性复合引物、（2）DNA文库构建的专用接头、（3）文库扩增复合引物试剂独立包装。
需要特别说明的是，本发明提供的检测融合基因和点突变的特异性复合引物是本发明的第二个目的。所述的检测融合基因和点突变的特异性复合引物被用于与非本发明提供的其他接头配合来进行NRAS、KRAS、EGFR、ERBB2、PIK3CA、MET、BRAF、RET、ROS1、ALK检测的产品或相关方法也应当属于本发明这一目的所包含的范围。
作为优选的实施方案，本发明的提供的试剂盒还包括以下任意一个或多个试剂组：DNA片段化/末端修复/dA添加试剂组；DNA连接试剂组；PCR扩增试剂组；高保真热启动PCR扩增试剂组。
具体地，所述的DNA片段化/末端修复/dA添加试剂组包括末端修复混合液。
具体地，所述的DNA连接试剂组包括5×连接酶缓冲液、TIANSeq DNA连接酶、专用接头和超纯水。
具体地，所述的PCR扩增试剂组包括5×多重PCR反应酶混合液、PCR引物。
具体地，所述的高保真热启动PCR扩增试剂组包括高保真热启动酶反应液、PCR引物和超纯水。
又一方面，本发明提供了上述试剂盒的使用方法，即血浆游离DNA肺癌融合基因和/或突变联合检测方法。
所述的检测方法包括以下步骤：
（1）使用DNA文库构建的专用接头连接检测样本DNA；
（2）使用检测融合基因和点突变的特异性复合引物对步骤（1）的连接产物进行复合PCR扩增；
（3）使用文库扩增复合引物对步骤（2）获得的扩增产物进行PCR扩增，获得测序文库；
（4）对步骤（3）获得的测序文库进行测序。
作为一些优选的实施方案，所述的检测方法包括以下步骤：
S1.提取样本中的DNA；
S2.将步骤S1所得的DNA进行核酸片段化、末端修复及加A；
S3.将步骤S2处理所得的DNA进行接头连接并纯化，得纯化后的接头连接产物；
S4.将步骤S3所得的纯化后的接头连接产物进行第一步特异性PCR并纯化，得第一步PCR纯化产物；
S5.将步骤S4所得的第一步PCR纯化产物进行第二步通用PCR并纯化，得测序文库；
S6.上机测序；
S7.生物信息学分析软件对进行数据结果分析。
又一方面，本发明还提供了所述DNA文库构建的专用接头，所述检测融合基因和点突变的特异性复合引物，所述文库扩增复合引物在制备血浆游离DNA肺癌融合基因和/或突变联合检测试剂盒中的应用。
与现有技术相比，本发明的积极和有益效果在于：
1、就本发明的整体构思而言，本发明实现了融合基因和点突变的同时检测，且提高了检测的灵敏度。
2、就本发明针对文库构建的设计构思而言：
传统扩增子文库构建检测基因位点突变时，使用双引物扩增（参见附图3的示意图），生成的文库双端位置固定，导致某个位置的测序序列无法有效去除扩增导致的序列重复，从而无法识别降低扩增过程中引入的随机突变，导致灵敏度降低。
而本发明对DNA进行随机打断后，在DNA两端连接通用引物，一端采用特异性引物扩增，一端采用通用引物，保留其中一端的随机性，从而可以有效识别重复测序序列。参见附图4的示意图。
3、就本发明检测融合基因和点突变的特异性复合引物的设计而言：
（1）血浆样品中，mRNA含量较低且不稳定，难提取，传统扩增子文库建库方案以mRNA为检测对象，导致检测容易失败。本发明以血浆中游离的DNA为检测对象，捕获融合DNA断点所在的内含子区域，适用的样品范围更广。参见附图5的示意图。
（2）融合基因是指将两个或多个基因的编码区首尾相连，置于同一套调控序列（包括启动子、增强子、核糖体结合序列、终止子等）控制之下，构成的嵌合基因。融合基因通常有多个伴侣基因，并且融合断点往往不一样。
因此传统扩增子文库构建检测融合基因时，需要同时知晓伴侣基因和核心基因两个基因，并且断点位置也已知的情况下，进行引物设计检测，容易遗漏断点未知，或者伴侣基因未知的融合类型。本发明通知将单引物设置在核心基因上，不必事先知道断点或伴侣基因，在引物扩增过程中，都能够将序列包含在文库中，通过测序识别伴侣基因及断点位置。参见附图6的示意图。
4、就整个检测流程而言：
传统液相杂交捕获文库流程偏长，涉及约24个步骤，耗时20-24h，操作过程复杂，本试剂盒发明精简操作流程至11个步骤和耗时缩短至6-8h，参见附图7的示意图。
5、与其他检测技术的比较：
（1）与利用arms_PCR法检测比较
利用arms_PCR法突变操作复杂，每管反应只能检测一个至三个位点；而本发明试剂盒通过加入多个位点的检测引物，并进行高通量测序可同时检测上述所有位点。另外，arms_PCR法无法利用mRNA检测融合基因，本发明试剂盒可以检测。
（2）与利用RT-PCR法检测融合基因比较
RT-PCR的检测方法检测效率较低，一次只能检测一种类型融合，本发明试剂盒通过同时加入多组引物，可实现多种融合同时检测。且RT-PCR只能检测已知种类，限定特定断点的融合基因类型，本发明则克服了这一缺陷。
（3）与利用Sanger测序法检测比较
Sanger测序法检测突变位点敏感性及灵敏度较低，只能达到10%，本发明试剂盒利用高通量测序法，每次测序每个突变并行测序10000次以上，灵敏度可达到0.0625%。另外，Sanger测序法操作复杂，每管反应只能检测一个位点，本发明试剂盒通过加入多个位点的检测引物，并进行高通量测序，可同时检测上述所有位点。
6、本发明整体技术方案利用高通量测序法，每次测序每个突变并行测序10000次以上，结合整体构思、文库构建的设计构思，以及“（1）DNA文库构建的专用接头；（2）检测融合基因和点突变的特异性复合引物；（3）文库扩增复合引物”的设计构思，一方面实现了同时检测上述所有位点（融合基因和多个突变位点）；另一方面从多方面多角度提升检测灵敏度，灵敏度可达到0.0625%。而常规检测方法（例如利用Sanger测序）敏感性较低，灵敏度较低，只能达到10%。
综上，相对于现有技术，本发明提供了一种灵敏度更高的能够实现融合基因和突变位点同时检测的肺癌多基因联合检测试剂盒。
附图说明
图1为专用接头结构。
图2为专用接头的8个接头结构。
图3为构建传统扩增子文库检测基因位点突变。
图4为构建本发明单引物文库检测基因位点突变。
图5为本发明内含子断点文库方案与传统外显子断点文库方案的比较。
图6为构建传统扩增子文库与本发明单引物文库检测融合基因的比较。
图7为构建液相杂交捕获文库与本发明单引物文库的比较。
图8为本发明试剂盒使用方法的实验流程图。
图9为本发明单引物扩增文库构建流程图。
图10为采用本发明检测RET-intron11捕获结果图。
图11为采用本发明检测KRAS-G12D突变阳性的结果图。
图12为采用本发明检测KRAS-G12D突变阴性的结果图。
图13为采用本发明检测NRAS Q61R突变阳性的结果图。
图14为采用本发明检测NRAS Q61R突变阴性的结果图。
图15为采用本发明检测EGFR G719A突变阳性的结果图。
图16为采用本发明检测EGFR G719A突变阴性的结果图。
图17为采用本发明检测EGFR L858R突变阳性的结果图。
图18为采用本发明检测EGFR L858R突变阴性的结果图。
图19为采用本发明检测ERBB2 A775_G776insYVMA突变阳性的结果图。
图20为采用本发明检测ERBB2 A775_G776insYVMA突变阴性的结果图。
图21为采用本发明检测PIK3CA H1047R突变阳性的结果图。
图22为采用本发明检测PIK3CA H1047R突变阴性的结果图。
图23为采用本发明检测MET c.3028+1G>T突变阳性的结果图。
图24为采用本发明检测MET c.3028+1G>T突变阴性的结果图。
图25为采用本发明检测BRAF V600E突变阳性的结果图。
图26为采用本发明检测BRAF V600E突变阴性的结果图。
图27为采用本发明检测EML4-ALK融合阳性的结果图。
图28为采用本发明检测EML4-ALK融合阴性的结果图。
图29为采用本发明检测CD74-ROS1融合阳性的结果图。
图30为采用本发明检测CD74-ROS1融合阴性的结果图。
图31为采用本发明检测KIF5B-RET融合阳性的结果图。
图32为采用本发明检测KIF5B-RET融合阴性的结果图。
图33为采用本发明检测KRAS G12A突变阳性的结果图。
图34为采用本发明检测KRAS G12A突变阴性的结果图。
图35为采用sanger测序检测EML4-ALK融合的结果图。
图36为采用本发明检测EML4-ALK融合的结果图。
图37为采用sanger测序检测CCDC6-RET融合的结果图。
图38为采用本发明检测CCDC6-RET融合的结果图。
图39为采用sanger测序检测EGFR p.S768I c.2303G>T突变的结果图。
图40为采用本发明检测EGFR p.S768I c.2303G>T突变的结果图。
图41为采用sanger测序检测KRAS G12D c.35G>A突变的结果图。
图42为采用本发明检测KRAS G12D c.35G>A突变的结果图。
图43为采用sanger测序检测EGFR p.E746_A750delELREA c.2235_2249del15GGAATTAAGAGAAGC>-突变的结果图。
图44为采用本发明检测EGFR p.E746_A750delELREA c.2235_2249del15GGAATTAAGAGAAGC>-突变的结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1 DNA文库构建专用接头、检测融合基因和点突变的特异性复合引物及扩增复合引物的设计
1. DNA文库构建的专用接头
一种DNA文库构建的专用接头，为接头引物1分别和8条不同的i5端引物构成的8个二聚体。接头引物1和8条不同的i5端引物的序列如下表4。
表4 专用接头引物序列表
引物 名称 引物序列 5_index 序列 SEQ ID NO
接头 引物1 GATCGGAAGAGCCACATACTGA - SEQ ID NO：1
i5端1 号引物 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCTCTCT ATACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT CTCT CTAT SEQ ID NO：2
i5端2 号引物 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTATCCT CTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT TATC CTCT SEQ ID NO：3
i5端3 号引物 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTAAGG AGACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT GTAA GGAG SEQ ID NO：4
i5端4 号引物 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACACTGCA TAACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT ACTG CATA SEQ ID NO：5
i5端5 号引物 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAAGGAG TAACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT AAGG AGTA SEQ ID NO：6
i5端6 号引物 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCTAAGC CTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT CTAA GCCT SEQ ID NO：7
i5端7 号引物 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCGTCTA ATACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT CGTC TAAT SEQ ID NO：8
i5端8 号引物 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTCTC CGACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT TCTC TCCG SEQ ID NO：9
专用接头具有如图1所示的结构。其中，所述的5_index的序列为：CTCTCTAT、TATCCTCT、GTAAGGAG、ACTGCATA、AAGGAGTA、CTAAGCCT、CGTCTAAT或TCTCTCCG。
因此，专用接头包括如图2所示的8个接头结构。
2.检测融合基因和点突变的特异性复合引物
一组用于检测融合基因和点突变的特异性复合引物，特异性复合引物的序列如下表5。
表5 特异性引物序列表
检测位点 引物名称 引物序列 SEQ ID NO
与i5端 引物配对 通用引物1 AATGATACGGCGACCACCGAGAT SEQ ID NO：10
NRAS-G12 NRAS-1 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCG GATTAGCTGGATTGTCAGTGCGCTT SEQ ID NO：11
NRAS-Q61 NRAS-2 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCC CTCATGTATTGGTCTCTCATGGCACTGT SEQ ID NO：12
KRAS-G12 KRAS-1 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC CTGAATTAGCTGTATCGTCAAGGCACTCTTG SEQ ID NO：13
KRAS-Q61 KRAS-2 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC AAAGCCCTCCCCAGTCCTCATGT SEQ ID NO：14
EGFR-G719 EGFR-1 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC CCTTATACACCGTGCCGAACGCA SEQ ID NO：15
EGFR-L858 EGFR-2 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC GGTGAAAACACCGCAGCATGTCA SEQ ID NO：16
EGFR-T790 EGFR-3 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC GTGTTCCCGGACATAGTCCAGGAGG SEQ ID NO：17
EGFR-19del EGFR-4 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC GAAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTA SEQ ID NO：18
ERBB2-20ins ERBB2-4 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC ACCCTTGTCCCCAGGAAGCATACG SEQ ID NO：19
PIK3CA-E545 PIK3CA-1 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC GAGAATCTCCATTTTAGCACTTACCTGTGACTC SEQ ID NO：20
PIK3CA-H1047 PIK3CA-2 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC ACTGAGCAAGAGGCTTTGGAGTATTTCATG SEQ ID NO：21
MET-exon14 MET-1 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC GCTGGTGTTGTCTCAATATCAACAGCACTG SEQ ID NO：22
MET-exon14 MET-2 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC GTCGTCGATTCTTGTGTGCTGTCTTATATG SEQ ID NO：23
MET-exon14 MET-3 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CGCCGTCTTTAACAAGCTCTTTCTTTCTCTCT SEQ ID NO：24
MET-exon14 MET-4 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CGATAGGCTTGTAAGTGCCCGAAGTGT SEQ ID NO：25
表5续
BRAF-V600 BRAF-1 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CTTCTAGTAACTCAGCAGCATCTCAGGGCC SEQ ID NO：26
ALK-intron19 ALK-1 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CTGCTCAGCTTGTACTCAGGGCTCTG SEQ ID NO：27
ALK-intron19 ALK-2 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC CTCCCCTGAGCTCTGAACCTTTCCATCATAC SEQ ID NO：28
ALK-intron19 ALK-3 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CGGGCAGAGTCATGTTAGTCTGGTTCCTC SEQ ID NO：29
ALK-intron19 ALK-4 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CGCTGGGTGAACCAGCAGACTGTGTT SEQ ID NO：30
ALK-intron19 ALK-5 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CCCATGGAGCCTAAGGAAGTTTCAGCAAG SEQ ID NO：31
ALK-intron19 ALK-6 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CCCCAGGAATTGGCCTGCCTTAGTA SEQ ID NO：32
ALK-intron19 ALK-7 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CATTTGAGGGTGCAGCTGGGATCTTG SEQ ID NO：33
ALK-intron19 ALK-8 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CGAAAAGATCTCTGAATTGGTGTCTGGGGAT SEQ ID NO：34
ALK-intron19 ALK-9 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CGGTCACAGGACCTCTTTGGACTGC SEQ ID NO：35
ALK-intron19 ALK-10 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CGCTCTACCAATGTGAGTGACCATTATCACTCC SEQ ID NO：36
ALK-intron19 ALK-11 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CGCCAGAACAAAATTGTGATTCAGTGGGTAG SEQ ID NO：37
ALK-intron19 ALK-12 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CACCCGCTATGTGCTCAGTTCCCT SEQ ID NO：38
ALK-intron19 ALK-13 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CGCCGAGCACGTAGTAACCATGCAA SEQ ID NO：39
ALK-intron19 ALK-14 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CCTCCCTTCTACCGGCAGATCCCTT SEQ ID NO：40
ALK-intron19 ALK-15 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CCCCATCTGTCCTGGGCATGTCTCT SEQ ID NO：41
ALK-intron19 ALK-16 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCG GCTGAACAGAAATATACTCAGAAACCGATTTTCC SEQ ID NO：42
ALK-intron19 ALK-17 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC GTGGAAGCATGTGGGAGCTAGAAGTG SEQ ID NO：43
ALK-intron19 ALK-18 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CCCCTGATCAGCCAGGAGGATACACA SEQ ID NO：44
ALK-intron19 ALK-19 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CGTTGGGAGCTTCCGTTTTGGCTTG SEQ ID NO：45
ALK-intron19 ALK-20 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC AGAGAGGATCAGCGAGAGTGGCA SEQ ID NO：46
表5续
RET-intron11 RET-1 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CCATCCTGTGAGGGGCTGCCAA SEQ ID NO：47
RET-intron11 RET-2 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CGGGGTGGGACTGTGATGAGGT SEQ ID NO：48
RET-intron11 RET-3 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC ATGGAGGGGCACTGAAGTCAGAAGG SEQ ID NO：49
RET-intron11 RET-4 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CGGCCTCTGCCCTCTCCTGGT SEQ ID NO：50
RET-intron11 RET-5 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CAGGCTCAGAGCCAAGGGTGTGA SEQ ID NO：51
RET-intron11 RET-6 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CCCTGGAGCCTCCGTTCAGGC SEQ ID NO：52
RET-intron11 RET-7 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CGTTTGTGTGAGGCTGCCCAGGAA SEQ ID NO：53
RET-intron11 RET-8 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CATCAGCACCAGGTCTTGGACCCAT SEQ ID NO：54
RET-intron11 RET-9 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CGGTAAACAGGTTTCCAGTGCCAGCT SEQ ID NO：55
RET -intron11 RET-10 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CGCTTTGGCCTCCCTGGTCAGAG SEQ ID NO：56
RET-intron11 RET-11 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CAACATGGTGGCGCCTTTCTTTGC SEQ ID NO：57
RET-intron11 RET-12 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CGGGCCTGGTGCTCATTTAGTCCT SEQ ID NO：58
RET-intron11 RET-13 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CCTGCACATTGGAACTTGTCCATGGG SEQ ID NO：59
ROS1-intron33 ROS1-1 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCA TAGTAAGTATGAAACTTGTTTCTGGTATCCAAA SEQ ID NO：60
ROS1-intron33 ROS1-2 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CGCCAGTTGTTAGACCGTTGGTAGCTTGAA SEQ ID NO：61
ROS1-intron33 ROS1-3 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCA AAGAAGAACATGCTACAGAGATCACATGTAGCC SEQ ID NO：62
ROS1-intron33 ROS1-4 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCG ACTAAGGAGCATCAGGTAAGCATTATGATGAGT SEQ ID NO：63
ROS1-intron33 ROS1-5 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC GGCAAACACAGGGCCAAAGACTAAGTGA SEQ ID NO：64
ROS1-intron33 ROS1-6 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC GAGAGCCATTGTGGGTATTTCAGAGAGGGAT SEQ ID NO：65
ROS1-intron33 ROS1-7 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCA CAGGACCTGATTACTGAGTAGAGGGAAAAATCAC SEQ ID NO：66
ROS1-intron33 ROS1-8 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCA TGTAGGAGTGGTCATAAGGCTGGTATAATGTGA SEQ ID NO：67
表5续
ROS1-intron33 ROS1-9 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC GCCAGAGTCTGGCAAACTATGGCATGA SEQ ID NO：68
ROS1-intron33 ROS1-10 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCG GACCAAGAAATCTCAGTCTTTGGATACTAAATAG SEQ ID NO：69
ROS1-intron33 ROS1-11 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCG ACTAAGGAGCATCAGGTAAGCATTATG SEQ ID NO：70
3.一组文库扩增复合引物，文库扩增复合引物的序列如下表6。
表6 文库扩增复合引物序列表
引物名称 引物序列 7_index序列 SEQ ID NO
通用引物2 AATGATACGGCGACCACCG - SEQ ID NO：71
i7端1号引物 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCA CAAGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGT TCACAAGC SEQ ID NO：72
i7端2号引物 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACT ACACGGTGACTGGAGTTCAGACGTGT ACTACACG SEQ ID NO：73
i7端3号引物 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATC GTACGGTGACTGGAGTTCAGACGTGT ATCGTACG SEQ ID NO：74
i7端4号引物 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGA CACAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGT AGACACAG SEQ ID NO：75
i7端5号引物 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTG TCCTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGT TTGTCCTG SEQ ID NO：76
i7端6号引物 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGT GAGAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGT TGTGAGAG SEQ ID NO：77
i7端7号引物 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAG GTTGGGTGACTGGAGTTCAGACGTGT AAGGTTGG SEQ ID NO：78
i7端8号引物 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATT AGCCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGT ATTAGCCA SEQ ID NO：79
实施例2 联合检测血浆游离DNA肺癌相关融合基因或突变的试剂盒及检测方法
一种联合检测血浆游离DNA肺癌相关融合基因或突变的试剂盒，包括实施例1的：（1）DNA文库构建的专用接头；（2）检测融合基因和点突变的特异性复合引物；（3）文库扩增复合引物。
上述试剂盒还包括：DNA片段化/末端修复/dA添加试剂组；DNA连接试剂组；PCR扩增试剂组；高保真热启动PCR扩增试剂组。
其中，DNA片段化/末端修复/dA添加试剂组包括末端修复混合液。DNA连接试剂组包括5×连接酶缓冲液、TIANSeq DNA连接酶、专用接头和超纯水。PCR扩增试剂组包括5×多重PCR反应酶混合液、PCR引物。高保真热启动PCR扩增试剂组包括高保真热启动酶反应液、PCR引物和超纯水。
本发明提供的试剂盒中，上述（1）-（3）项试剂独立包装。
上述试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
（1）使用DNA文库构建的专用接头连接检测样本DNA；
（2）使用检测融合基因和点突变的特异性复合引物对步骤（1）的连接产物进行复合PCR扩增；
（3）使用文库扩增复合引物对步骤（2）获得的扩增产物进行PCR扩增，获得测序文库；
（4）对步骤（3）获得的测序文库进行测序。
试剂盒的检测方法包括如下具体步骤（如图8-9所示，图8为本发明试剂盒使用方法的实验流程图，图9为本发明单引物扩增文库构建流程图）：
1、文库构建：核酸片段化、末端修复及加A
1.1取15-30ng从血浆提取的游离DNA，及末端修复混合液（TIANSeq Fragment/Repair/Tailing Module NG301）配制如下反应体系：
提取获得的游离DNA 50µl；
末端修复混合液 15µl；
总体积 65µl。
1.2在PCR仪中进行如下反应程序：20℃ 15min；65℃ 15min；4℃ hold。PCR仪热盖温度设置为105℃。
1.3反应结束后，立即进入接头连接步骤。
2、文库构建：接头连接
2.1取DNA连接酶反应液及DNA连接酶（TIANSeq快速连接模块 NG303）在步骤1反应结束管中配制如下反应体系：
步骤1反应产物 65μL；
DNA连接酶反应液 25μL；
DNA连接酶 5μL；
专用接头（15μM） 1.5μL；
超纯水 3.5μL；
总体积 100μL。
其中，专用接头包括以下8个接头结构：
接头1：
Figure 590293DEST_PATH_IMAGE001
接头2：
Figure 943914DEST_PATH_IMAGE002
接头3：
Figure 351893DEST_PATH_IMAGE003
接头4：
Figure 816372DEST_PATH_IMAGE004
接头5：
Figure 750830DEST_PATH_IMAGE005
接头6：
Figure 649254DEST_PATH_IMAGE006
接头7：
Figure 138004DEST_PATH_IMAGE007
接头8：
Figure 15961DEST_PATH_IMAGE008
2.2移液器吸打混匀，放入PCR仪，进行如下反应程序：20℃ 15min；4℃ hold。PCR仪热盖温度设置为105℃。
2.3 1.6×磁珠（TIANSeq DNA片段分选磁珠NG306）纯化接头连接产物，16μL超纯水洗脱，取15μL上清液到新的PCR管中，进行第一步PCR扩增反应。
3、第一步多重PCR扩增
3.1取5×多重PCR反应酶混合液（Multiplex PCR Assay Kit Ver.2，RR062A，Takara）配制如下多重PCR反应体系：
5×多重PCR反应酶混合液 4μL；
特异性引物混合物 1.2μL；
通用引物1 4.7μL；
步骤4获得的纯化后接头连接产物 10.1μL；
总体积 20μL。
其中，特异性引物混合物配制方法：先将各引物稀释至100μM，然后按照下表7所示配制混合物体系。
表7 特异性引物混合物体系
引物名称 SEQ ID NO 各引物100μM混入量（μL） 20μL反应体系引物终浓度（μM）
NRAS-1 SEQ ID NO:11 1 0.1
NRAS-2 SEQ ID NO:12 1 0.1
KRAS-1 SEQ ID NO:13 1 0.1
KRAS-2 SEQ ID NO:14 1 0.1
EGFR-1 SEQ ID NO:15 1 0.1
EGFR-2 SEQ ID NO:16 1 0.1
EGFR-3 SEQ ID NO:17 1 0.1
EGFR-4 SEQ ID NO:18 1 0.1
ERBB2-4 SEQ ID NO:19 1 0.1
PIK3CA-1 SEQ ID NO:20 1 0.1
PIK3CA-2 SEQ ID NO:21 1 0.1
MET-1 SEQ ID NO:22 1 0.1
MET-2 SEQ ID NO:23 1 0.1
MET-3 SEQ ID NO:24 1 0.1
MET-4 SEQ ID NO:25 1 0.1
BRAF-1 SEQ ID NO:26 1 0.1
ALK-1 SEQ ID NO:27 1 0.1
ALK-2 SEQ ID NO:28 1 0.1
ALK-3 SEQ ID NO:29 1 0.1
表7续
ALK-4 SEQ ID NO:30 1 0.1
ALK-5 SEQ ID NO:31 1 0.1
ALK-6 SEQ ID NO:32 1 0.1
ALK-7 SEQ ID NO:33 1 0.1
ALK-8 SEQ ID NO:34 1 0.1
ALK-9 SEQ ID NO:35 1 0.1
ALK-10 SEQ ID NO:36 1 0.1
ALK-11 SEQ ID NO:37 1 0.1
ALK-12 SEQ ID NO:38 1 0.1
ALK-13 SEQ ID NO:39 1 0.1
ALK-14 SEQ ID NO:40 1 0.1
ALK-15 SEQ ID NO:41 1 0.1
ALK-16 SEQ ID NO:42 1 0.1
ALK-17 SEQ ID NO:43 1 0.1
ALK-18 SEQ ID NO:44 1 0.1
ALK-19 SEQ ID NO:45 1 0.1
ALK-20 SEQ ID NO:46 1 0.1
RET-1 SEQ ID NO:47 1 0.1
RET-2 SEQ ID NO:48 1 0.1
RET-3 SEQ ID NO:49 1 0.1
RET-4 SEQ ID NO:50 1 0.1
RET-5 SEQ ID NO:51 1 0.1
RET-6 SEQ ID NO:52 1 0.1
RET-7 SEQ ID NO:53 1 0.1
RET-8 SEQ ID NO:54 1 0.1
RET-9 SEQ ID NO:55 1 0.1
RET-10 SEQ ID NO:56 1 0.1
RET-11 SEQ ID NO:57 1 0.1
RET-12 SEQ ID NO:58 1 0.1
表7续
RET-13 SEQ ID NO:59 1 0.1
ROS1-1 SEQ ID NO:60 1 0.1
ROS1-2 SEQ ID NO:61 1 0.1
ROS1-3 SEQ ID NO:62 1 0.1
ROS1-4 SEQ ID NO:63 1 0.1
ROS1-5 SEQ ID NO:64 1 0.1
ROS1-6 SEQ ID NO:65 1 0.1
ROS1-7 SEQ ID NO:66 1 0.1
ROS1-8 SEQ ID NO:67 1 0.1
ROS1-9 SEQ ID NO:68 1 0.1
ROS1-10 SEQ ID NO:69 1 0.1
ROS1-11 SEQ ID NO:70 1 0.1
10μM特异性引物混合物总量 - 60 -
3.2反应体系配好后，移液器吹打10次混匀，放入PCR仪，运行以下反应程序：99℃2min；99℃ 15s，69℃ 4min，18个循环；72℃ 10min；4℃ hold。PCR仪热盖温度设置为105℃。
3.3 PCR结束后，电泳。1.6×磁珠（TIANSeq DNA片段分选磁珠 NG306）纯化，得到第一步PCR扩增产物，Qubit定量。
4、第二步PCR扩增
4.1取高保真热启动酶反应液（TIANSeq高保真PCR反应预混液NG219-12），及第一步PCR纯化产物进行第二步PCR扩增，扩增体系如下：
高保真热启动酶反应液 25μL；
i7-primer（10μM） 1.5μL；
通用引物2（10μM） 1.5μL；
第一步PCR纯化产物 10μL；
超纯水 12μL；
总体积 50μL。
4.2第二步PCR扩增反应体系配好后，移液器吹打10次混匀，放入PCR仪，运行以下反应程序95℃ 3min；98℃ 20s，58℃ 15s，72℃ 15s，8个循环；72℃ 1min；4℃ hold。PCR仪热盖温度设置为105℃。
4.3 PCR反应结束后，Qubit定量，电泳。
4.4 1.3X磁珠（TIANSeq DNA片段分选磁珠NG306）纯化，10μL超纯水洗脱，Qubit定量。
5、文库稀释到2-3ng/μL，采用Agilent 4150 TapeStation系统进行检测。
6、测序上机。
7、生物信息学分析软件对进行数据结果分析。
实验例1
采用本发明实施例2所述的步骤对肺癌血液样本进行检测。以下实验均征得患者本人知情及同意。
1.样本1：来源为云南省肿瘤医院病人编号为25617_KTD011临床样品。
检测结果如图10所示，该样本为RET-intron11捕获结果。
2.样本2：来源为云南省肿瘤医院病人编号为25826_KTD031临床样品。
检测结果如图11所示，该样本为KRAS-G12D突变阳性。
3.样本3：来源为云南省肿瘤医院病人编号为24212_KTD044临床样品。
检测结果如图12所示，该样本为KRAS-G12D突变阴性。
4.样本4：来源为云南省肿瘤医院病人编号为27687_KTD060临床样品。
检测结果如图13所示，该样本为NRAS Q61R突变阳性。
5.样本5：来源为云南省肿瘤医院病人编号为24212_KTD044临床样品。
检测结果如图14所示，该样本为NRAS Q61R突变阴性。
6.样本6：来源为云南省肿瘤医院病人编号为27672_KTD058临床样品。
检测结果如图15所示，该样本为EGFR G719A突变阳性。
7.样本7：来源为云南省肿瘤医院病人编号为24212_KTD044临床样品。
检测结果如图16所示，该样本为EGFR G719A突变阴性。
8.样本8：来源为云南省肿瘤医院病人编号为27751_KTD034临床样品。
检测结果如图17所示，该样本为EGFR L858R突变阳性。
9.样本9：来源为云南省肿瘤医院医院病人编号为24212_KTD044临床样品。
检测结果如图18所示，该样本为EGFR L858R突变阴性。
10.样本10：来源为云南省肿瘤医院病人编号为27770_KTD052临床样品。
检测结果如图19所示，该样本为ERBB2 A775_G776insYVMA突变阳性。
11.样本11：来源为云南省肿瘤医院病人编号为26432_KTD015临床样品。
检测结果如图20所示，该样本为ERBB2 A775_G776insYVMA突变阴性。
12.样本12：来源为云南省肿瘤医院病人编号为27520_KTD071临床样品。
检测结果如图21所示，该样本为PIK3CA H1047R突变阳性。
13.样本13：来源为云南省肿瘤医院病人编号为26432_KTD015临床样品。
检测结果如图22所示，该样本为PIK3CA H1047R突变阴性。
14.样本14：来源为云南省肿瘤医院病人编号为25049_KTD056临床样品。
检测结果如图23所示，该样本为MET c.3028+1G>T突变阳性。
15.样本15：来源为云南省肿瘤医院病人编号为26432_KTD015临床样品。
检测结果如图24所示，该样本为MET c.3028+1G>T突变阴性。
16.样本16：来源为云南省肿瘤医院病人编号为27714_KTD105临床样品。
检测结果如图25所示，该样本为BRAF V600E突变阳性。
17.样本17：来源为云南省肿瘤医院病人编号为26432_KTD015临床样品。
检测结果如图26所示，该样本为BRAF V600E突变阴性。
18.样本18：来源为云南省肿瘤医院病人编号为27709_KTD085临床样品。
检测结果如图27所示，该样本为EML4-ALK融合阳性。
19.样本19：来源为云南省肿瘤医院病人编号为26432_KTD015临床样品。
检测结果如图28所示，该样本为EML4-ALK融合阴性。
20.样本20：来源为云南省肿瘤医院病人编号为27639_KTD093临床样品。
检测结果如图29所示，该样本为CD74-ROS1融合阳性。
21.样本21：来源为云南省肿瘤医院病人编号为26432_KTD015临床样品。
检测结果如图30所示，该样本为CD74-ROS1融合阴性。
22.样本22：来源为云南省肿瘤医院病人编号为27729_KTD041临床样品。
检测结果如图31所示，该样本为KIF5B-RET融合阳性。
23.样本23：来源为云南省肿瘤医院病人编号为26432_KTD015临床样品。
检测结果如图32所示，该样本为KIF5B-RET融合阴性。
24.样本24：来源为云南省肿瘤医院病人编号为27734_KTD021临床样品。
检测结果如图33所示，该样本为KRAS G12A突变阳性。
25.样本25：来源为云南省肿瘤医院病人编号为26432_KTD015临床样品。
检测结果如图34所示，该样本为KRAS G12A突变阴性。
实验例2 准确性
1.来源为云南省肿瘤医院病人编号为27709_KTD085临床样品，分别采用sanger测序及本发明所述的检测方法进行检测EML4-ALK融合，由sanger测序结果如图35所示，及本发明所述的检测结果如图36所示，其检测结果具有一致性。
2.来源为云南省肿瘤医院病人编号为27819_KTD035临床样品，分别采用sanger测序及本发明所述的检测方法进行检测CCDC6-RET融合，由sanger测序结果如图37所示，及本发明所述的检测结果如图38所示，其检测结果具有一致性（本发明检测结果序列反向互补与sanger测序法一致）。
3.来源为云南省肿瘤医院病人编号为29542临床样品，分别采用sanger测序及本发明所述的检测方法进行检测EGFR p.S768I c.2303G>T突变，由sanger测序结果如图39所示，及本发明所述的检测结果如图40所示，其检测结果具有一致性。
4.来源为云南省肿瘤医院病人编号为29441临床样品，分别采用sanger测序及本发明所述的检测方法进行检测KRAS G12D c.35G>A突变，由sanger测序结果如图41所示，及本发明所述的检测结果如图42所示，其检测结果具有一致性（本发明所述的检测结果反义链C>T，与sanger测序一致）。
5.来源为云南省肿瘤医院病人编号为25427临床样品，分别采用sanger测序及本发明所述的检测方法进行检测EGFR p.E746_A750delELREA c.2235_2249del15GGAATTAAGAGAAGC>-突变，由sanger测序结果如图43所示，及本发明所述的检测结果如图44所示，其检测结果具有一致性。
实验例3灵敏性
采用梯度稀释法确定本发明所述试剂盒及检测方法的灵敏性：选取EGFR-S768I（南京科佰生物科技有限公司，货号CBP10405）、EGFR p.E746_A750delELREA（南京科佰生物科技有限公司，货号CBP10334）、KRAS-G12D（南京科佰生物科技有限公司，货号CBPCBP10292）、CCDC6-RET（南京科佰生物科技有限公司，货号CBP20014R）、EML4-ALK（南京科佰生物科技有限公司，货号CBP20020R）标准品样本，将融合基因的比例定义为100%，将其与另一融合基因检测为阴性的样本按比例进行混合，分别获得融合基因比例为0.5%、0.25%、0.125%、0.0625%的样本，将混合后的样本采用本发明所述的试剂盒及检测方法和Sanger测序法分别进行检测，数据显示，采用本发明的试剂盒及检测方法，检测比例为0.25%时仍可检测到阳性融合基因，比例为0.0625%仍能检测到点突变类型阳性，而Sanger测序法仅能检测到10%。检测结果具体如下表8。
表8 灵敏性检测
样品编号 样品 数字PCR 频率 数字PCR 判读 阳性Reads 数量 测序深度 检出频率% 结果判读
CBP10405 0.5% EGFR-S768I 0.49% 阳性 87 22493 0.39% 阳性
CBP10405 0.25% EGFR-S768I 0.31% 阳性 59 29498 0.20% 阳性
CBP10405 0.125% EGFR-S768I 0.12% 阳性 25 26997 0.09% 阳性
CBP10405 0.0625% EGFR-S768I 0.05% 阳性 14 27009 0.05% 阳性
CBP10334 0.5% EGFR p.E746_A750delELREA 0.59% 阳性 385 66025 0.58% 阳性
CBP10334 0.25% EGFR p.E746_A750delELREA 0.26% 阳性 80 35371 0.23% 阳性
CBP10334 0.125% EGFR p.E746_A750delELREA 0.17% 阳性 11 10543 0.10% 阳性
CBP10334 0.0625% EGFR p.E746_A750delELREA 0.08% 阳性 5 12542 0.04% 阳性
CBP10292 0.5% KRAS-G12D 0.55% 阳性 133 36790 0.36% 阳性
CBP10292 0.25% KRAS-G12D 0.28% 阳性 68 28442 0.23% 阳性
CBP10292 0.125% KRAS-G12D 0.17% 阳性 6 6941 0.09% 阳性
CBP10292 0.0625% KRAS-G12D 0.10% 阳性 3 8374 0.04% 阳性
CBP20014R 0.5% CCDC6-RET 0.55% 阳性 263 50533 0.52% 阳性
CBP20014R 0.25% CCDC6-RET 0.25% 阳性 117 41315 0.28% 阳性
CBP20020R 0.5% EML4-ALK 0.54% 阳性 126 37855 0.33% 阳性
CBP20020R 0.25% EML4-ALK 0.30% 阳性 67 40549 0.17% 阳性
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 苏州科贝生物技术有限公司
<120> 一种血浆游离DNA肺癌基因联合检测试剂盒
<130> 20200910
<160> 79
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
gatcggaaga gccacatact ga 22
<210> 2
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 2
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacc tctctataca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatct 70
<210> 3
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 3
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact atcctctaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatct 70
<210> 4
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 4
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacg taaggagaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatct 70
<210> 5
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 5
aatgatacgg cgaccaccga gatctacaca ctgcataaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatct 70
<210> 6
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 6
aatgatacgg cgaccaccga gatctacaca aggagtaaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatct 70
<210> 7
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 7
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacc taagcctaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatct 70
<210> 8
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 8
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacc gtctaataca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatct 70
<210> 9
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 9
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctctccgaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatct 70
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 10
aatgatacgg cgaccaccga gat 23
<210> 11
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 11
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcggattag ctggattgtc agtgcgctt 59
<210> 12
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 12
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atccctcatg tattggtctc tcatggcact 60
gt 62
<210> 13
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 13
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcctgaatt agctgtatcg tcaaggcact 60
cttg 64
<210> 14
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 14
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcaaagccc tccccagtcc tcatgt 56
<210> 15
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 15
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcccttata caccgtgccg aacgca 56
<210> 16
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 16
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcggtgaaa acaccgcagc atgtca 56
<210> 17
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 17
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcgtgttcc cggacatagt ccaggagg 58
<210> 18
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 18
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcgaaggtg agaaagttaa aattcccgtc 60
gcta 64
<210> 19
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 19
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcacccttg tccccaggaa gcatacg 57
<210> 20
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 20
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcgagaatc tccattttag cacttacctg 60
tgactc 66
<210> 21
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 21
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcactgagc aagaggcttt ggagtatttc 60
atg 63
<210> 22
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 22
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcgctggtg ttgtctcaat atcaacagca 60
ctg 63
<210> 23
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 23
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcgtcgtcg attcttgtgt gctgtcttat 60
atg 63
<210> 24
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 24
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcgccgtct ttaacaagct ctttctttct 60
ctct 64
<210> 25
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 25
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcgataggc ttgtaagtgc ccgaagtgt 59
<210> 26
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 26
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttctagt aactcagcag catctcaggg 60
cc 62
<210> 27
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 27
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgctcag cttgtactca gggctctg 58
<210> 28
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 28
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcctcccct gagctctgaa cctttccatc 60
atac 64
<210> 29
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 29
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcgggcaga gtcatgttag tctggttcct 60
c 61
<210> 30
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 30
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcgctgggt gaaccagcag actgtgtt 58
<210> 31
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 31
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcccatgga gcctaaggaa gtttcagcaa 60
g 61
<210> 32
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 32
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atccccagga attggcctgc cttagta 57
<210> 33
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 33
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcatttgag ggtgcagctg ggatcttg 58
<210> 34
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 34
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcgaaaaga tctctgaatt ggtgtctggg 60
gat 63
<210> 35
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 35
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcggtcaca ggacctcttt ggactgc 57
<210> 36
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 36
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcgctctac caatgtgagt gaccattatc 60
actcc 65
<210> 37
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 37
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcgccagaa caaaattgtg attcagtggg 60
tag 63
<210> 38
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 38
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcacccgct atgtgctcag ttccct 56
<210> 39
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 39
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcgccgagc acgtagtaac catgcaa 57
<210> 40
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 40
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcctccctt ctaccggcag atccctt 57
<210> 41
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 41
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atccccatct gtcctgggca tgtctct 57
<210> 42
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 42
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcggctgaa cagaaatata ctcagaaacc 60
gattttcc 68
<210> 43
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 43
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcgtggaag catgtgggag ctagaagtg 59
<210> 44
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 44
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcccctgat cagccaggag gatacaca 58
<210> 45
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 45
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcgttggga gcttccgttt tggcttg 57
<210> 46
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 46
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcagagagg atcagcgaga gtggca 56
<210> 47
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 47
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atccatcctg tgaggggctg ccaa 54
<210> 48
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 48
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcggggtgg gactgtgatg aggt 54
<210> 49
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 49
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcatggagg ggcactgaag tcagaagg 58
<210> 50
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 50
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcggcctct gccctctcct ggt 53
<210> 51
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 51
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcaggctca gagccaaggg tgtga 55
<210> 52
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 52
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atccctggag cctccgttca ggc 53
<210> 53
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 53
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcgtttgtg tgaggctgcc caggaa 56
<210> 54
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 54
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcatcagca ccaggtcttg gacccat 57
<210> 55
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 55
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcggtaaac aggtttccag tgccagct 58
<210> 56
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 56
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcgctttgg cctccctggt cagag 55
<210> 57
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 57
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcaacatgg tggcgccttt ctttgc 56
<210> 58
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 58
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcgggcctg gtgctcattt agtcct 56
<210> 59
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 59
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcctgcaca ttggaacttg tccatggg 58
<210> 60
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 60
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcatagtaa gtatgaaact tgtttctggt 60
atccaaa 67
<210> 61
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 61
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcgccagtt gttagaccgt tggtagcttg 60
aa 62
<210> 62
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 62
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcaaagaag aacatgctac agagatcaca 60
tgtagcc 67
<210> 63
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 63
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcgactaag gagcatcagg taagcattat 60
gatgagt 67
<210> 64
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 64
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcggcaaac acagggccaa agactaagtg 60
a 61
<210> 65
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 65
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcgagagcc attgtgggta tttcagagag 60
ggat 64
<210> 66
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 66
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcacaggac ctgattactg agtagaggga 60
aaaatcac 68
<210> 67
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 67
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcatgtagg agtggtcata aggctggtat 60
aatgtga 67
<210> 68
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 68
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcgccagag tctggcaaac tatggcatga 60
<210> 69
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 69
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcggaccaa gaaatctcag tctttggata 60
ctaaatag 68
<210> 70
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 70
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcgactaag gagcatcagg taagcattat 60
g 61
<210> 71
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 71
aatgatacgg cgaccaccg 19
<210> 72
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 72
caagcagaag acggcatacg agattcacaa gcgtgactgg agttcagacg tgt 53
<210> 73
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 73
caagcagaag acggcatacg agatactaca cggtgactgg agttcagacg tgt 53
<210> 74
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 74
caagcagaag acggcatacg agatatcgta cggtgactgg agttcagacg tgt 53
<210> 75
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 75
caagcagaag acggcatacg agatagacac aggtgactgg agttcagacg tgt 53
<210> 76
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 76
caagcagaag acggcatacg agatttgtcc tggtgactgg agttcagacg tgt 53
<210> 77
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 77
caagcagaag acggcatacg agattgtgag aggtgactgg agttcagacg tgt 53
<210> 78
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 78
caagcagaag acggcatacg agataaggtt gggtgactgg agttcagacg tgt 53
<210> 79
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 79
caagcagaag acggcatacg agatattagc cagtgactgg agttcagacg tgt 53

Claims (3)

1.一种血浆游离DNA肺癌融合基因和/或突变联合检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括：
（1）一组用于检测融合基因和点突变的特异性复合引物，所述特异性复合引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:10-SEQ ID NO:70所示；
（2）一种DNA文库构建的专用接头，所述的DNA文库构建的专用接头为接头引物1分别和8条不同的i5端引物构成的8个二聚体；
所述的接头引物1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
所述的8条不同的i5端引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2-SEQ ID NO:9所示；
（3）一组文库扩增复合引物，所述的文库扩增复合引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:71-SEQ ID NO:79所示。
2.根据权利要求1所述的血浆游离DNA肺癌融合基因和/或突变联合检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括以下任意一个或多个试剂组：DNA片段化/末端修复/dA添加试剂组；DNA连接试剂组；PCR扩增试剂组；高保真热启动PCR扩增试剂组。
3.根据权利要求2所述的血浆游离DNA肺癌融合基因和/或突变联合检测试剂盒，其特征在于，
所述的DNA片段化/末端修复/dA添加试剂组包括末端修复混合液；
所述的DNA连接试剂组包括5×连接酶缓冲液、TIANSeq DNA连接酶、专用接头和超纯水；
所述的PCR扩增试剂组包括5×多重PCR反应酶混合液、PCR引物；
所述的高保真热启动PCR扩增试剂组包括高保真热启动酶反应液、PCR引物和超纯水。
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