CN109402257B - 一种用于人类brca1和brca2基因全编码序列突变位点检测的引物、方法和试剂盒 - Google Patents
一种用于人类brca1和brca2基因全编码序列突变位点检测的引物、方法和试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于人类BRCA1和BRCA2基因全编码序列突变位点检测的引物、方法和试剂盒。所述引物包括扩增覆盖BRCA1基因全部24个编码区的正、反向引物,其碱基序列如SEQ ID NO:3~52所示;扩增覆盖BRCA2基因全部27个外显子编码区的正、反向引物,其碱基序列如SEQ ID NO:53~134所示。所述基于NGS技术的检测方法包括:特异性引物与目标模板DNA序列结合、通用引物扩增待测样本目标区域,磁珠纯化文库,对得到的文库进行高通量测序并分析BRCA1和BRCA2基因的突变。本发明公开的引物、方法和试剂盒可覆盖待检测的所有突变位点,均一性高,同时能够简化实验步骤,提高检测灵敏度,为包括家族性乳腺癌和卵巢癌患者的选择用药,以及为遗传易感性提供指导,有效减少发病风险。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术的基因突变检测领域,更具体涉及一种用于人类BRCA1和BRCA2基因全编码序列突变位点检测的引物、方法和试剂盒。
背景技术
乳腺癌的高发病率已经严重威胁女性健康,是女性最常见的癌症之一。乳腺癌可分为散发性和遗传性两大类,目前认为大多数遗传性乳腺癌是由于基因突变引起的,其中BRCA1和BRCA2是迄今为止已发现的最直接的乳腺癌易感基因。研究表明,携带BRCA1和BRCA2基因突变的人群,乳腺癌患病风险和复发风险均高于普通人群,其中携带BRCA1和BRCA2基因致病性突变的女性一生中发生乳腺癌的风险最高可达87%。不仅如此,BRCA1/2基因还是卵巢癌易感基因,据统计BRCA1基因突变携带者一生患卵巢癌的风险是15%~45%,BRCA2基因突变携带者患卵巢癌的风险是10%~20%。BRCA1编码区已经发现的突变有几百种,而BRCA2编码区的突变多达上千种。鉴于BRCA1/2基因突变带来的危害,欧洲肿瘤协会(EMSO)指南(2011)、美国国立综合癌症网络(NCCN)指南(2014)以及《中国抗癌协会乳腺癌诊治指南与规范(2013版)》,已将BRCA1和BRCA2基因检测列入其中。
BRCA1基因定位于人类17号染色体长臂12-21区,长约80kb,包含24个外显子,其基因产物是1863个氨基酸所构成的磷酸化蛋白质。BRCA2基因位于13号染色体长臂12-13区,长约70kb,包含27个外显子,所编码的蛋白含有3418个氨基酸。BRCA1/2基因都是肿瘤抑制基因,参与细胞周期的调控、基因转录的调控、DNA损伤的修复及凋亡等重要的细胞活动,在维持基因组稳定性中起很重要的作用。一旦BRCA1/2基因发生突变,致使其无法正常编码合成蛋白产物或合成的蛋白产物功能缺失,其抑癌作用将会受到影响,极大的增加癌症发生的风险。
此外,BRCA基因的突变还与胰腺癌、恶性黑色素瘤和男性前列腺癌有关;筛选BRCA基因的突变越来越受到研究者的关注。目前医院对于乳腺癌的诊断主要靠检查双侧乳腺、乳腺X线摄影(乳腺钼靶照相)、乳腺磁共振检查(MRI)等,这样诊断发现的乳腺癌一般已到晚期,很难治愈。通过对BRCA1/2基因的检测,寻找其致病突变位点,筛检出乳腺癌、卵巢癌及其他相关恶性肿瘤的高危人群,利于该类疾病的早期诊断治疗和风险评估。而此前美国国家癌症研究所发布的《BRCA1and BRCA2:Cancer Risk and Genetic Testing》指南也指出:先对家族中罹患乳腺癌或卵巢癌的患者进行基因检测,如果发现该患者带有有害的BRCA1或BRCA2基因突变,那么家族中的其它成员可再进行基因检测,观察是否也有存在有害突变,此种做法有很高的临床价值。
目前,普遍应用的BRCA1/2基因突变检测方法主要有以下几种:荧光定量PCR技术,该技术灵敏度高、特异性强、自动化程度高,但是会存在样品污染、假阳性高的情况,并且每次只能检测一种类型的突变,无法完全覆盖BRCA1/2基因全编码区,而BRCA1/2基因检测难度较大,没有热点变异,变异遍布于2个基因的全长。限制小片段长度多态性分析法(RFLP法)用于检测酶切位点改变的基因,可直接判断基因型,但是不能用于没有产生新酶切位点的基因检测;此外,RFLP实验操作繁琐,检测周期长,成本高,存在第一轮酶切不完全导致的假阳性,非闭管操作,同样容易污染,难以满足临床检测要求。Sanger测序法,从检测灵敏度上讲,Sanger测序法一般只能检测20%以上突变率的变异,对BRCA1/2基因全部编码序列检测来说,周期较长,成本昂贵,操作复杂,检测通量比较低,很难通过一次测序获得精确的数据,需要多次重复测序才可能避免假阳性等,很难满足实际应用的需要。
因此,临床上迫切需要开发一种相对快捷、操作简便、检测周期短、针对性强、检测结果准确可靠的BRCA1/2基因突变检测方法。而新一代高通量测序(NGS)技术具有很高的敏感性和特异性,随着该技术的成熟及测序成本的持续降低,使用NGS技术进行BRCA1/2基因突变检测是未来市场的趋势。
发明内容
本发明目的在于提供了一种基于多重PCR和高通量测序技术的用于检测与人类遗传易感性相关的BRCA1和BRCA2基因全编码序列突变位点的引物、方法和试剂盒,旨在解决现有技术中成本高、步骤多,灵敏度低、周期长和易污染等问题。
在本发明的一方面,提供一种检测BRCA1和BRCA2基因突变的引物,其中通用引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示;
用于扩增BRCA1基因全编码序列突变位点的特异性引物序列如SEQ ID NO.3~52所示;
用于扩增BRCA2基因全编码序列突变位点的特异性引物序列如SEQ ID NO.53~134所示。
本发明的另一方面提供一种BRCA1和BRCA2基因突变位点检测试剂盒,主要成分如下:
本发明的另一方面提供一种BRCA1和BRCA2基因突变位点检测的多重PCR体系:
本发明再一方面,提供一种BRCA1和BRCA2基因突变位点检测方法,包括以下步骤:
A.抽提血液、口腔拭子等受试样品DNA。
B.多重PCR法扩增待测样本基因组的目标区域:
1)准备无菌、无核酸酶的200μL PCR管,置于冰上。
2)配制多重PCR体系,轻轻吹打混匀,离心后将管子置于冰上。
3)将管子置于PCR仪中,按以下程序运行:
C.使用磁珠纯化文库。
D.对得到的文库进行高通量测序并分析BRCA1和BRCA2基因突变信息。
本发明的有益效果在于:本发明基于高通量测序平台,采用了特异性引物和多重PCR技术,可以快速、准确的实现BRCA1和BRCA2基因突变的检测。本发明:(1)提供一种新的引物设计,按100%扩增覆盖BRCA1和BRCA2基因编码区设计,在大幅降低引物二聚体形成的同时,扩增子中容纳更长的真实序列,从根本上提高了引物特异性,提高扩增效率;(2)使用新型多重PCR技术,控制特异性引物只在最初靶标捕获的两个循环中发挥作用,之后会自动切换到由通用引物引导的以相同效率进行的文库扩增,获得均一性非常高的文库;(3)操作简单,5分钟人工操作,即可一步完成BRCA1和BRCA2基因的靶向文库制备工作,节约成本,临床应用范围广;(4)全程无额外开管处理过程,避免由人工带入的污染风险。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚,本发明提供如下附图:
图1.3%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物示意图。箭头标注处是目标条带区域。50M:50bp DNA Ladder(Thermo);T1:Tube 1文库构建PCR产物;T2:Tube 2文库构建PCR产物。
图2.Agilent 2100Bioanalyzer对文库进行质检示意图。方框处标注为目标文库区域。
图3.Sample 7中chr17:41243776CCT>C sanger突变验证标示图。
图4.Sample 10中chr17:41223094T>C sanger突变验证标示图。
图5.Sample 11中chr17:41223094T>C sanger突变验证标示图。
图6.Sample 12中chr17:41223094T>C sanger突变验证标示图。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明发明内容,但不应理解为对该发明的限制。若未特别指明,实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
通过检测已知突变类型及频率的标准品进行本试剂盒的性能验证。
A.标准品DNA定量
B.多重PCR法扩增样本基因组的目标区域。
1).准备无菌、无核酸酶的200μL PCR管,置于冰上;按下表配制PCR反应体系,小心避免交叉污染。
组分 | 体积 |
2×PCR混合液 | 6.25μL |
特异性引物 | 2.0μL |
通用引物R5 | 0.5μL |
通用引物R7 | 0.5μL |
DNA模板,50ng | xμL |
无核酸酶水 | 3.25-xμL |
总体积 | 12.5μL |
2).轻轻吹打混匀,离心,将管子置于冰上。
3).将管子置于PCR仪中,按以下反应程序运行:
C.使用磁珠纯化文库
1).向PCR产物中补加Nuclease-free水至50μL后转移至一个新的无核酸酶的离心管,加入50μL经过充分混匀的beads(室温),吹打混匀;
2).室温孵育5min后,将离心管置于磁力架上5min,小心吸弃上清;
3).保持离心管在磁力架上,加入200μL新鲜配制的80%乙醇,放置30s,吸弃上清,重复乙醇清洗步骤1次;
4).两次乙醇清洗后,室温放置5min,确保乙醇完全去除(注:为防止吸弃beads,在第一次弃乙醇时,可调整移液枪到95μL,富余5μL,第二次正常加入乙醇以及弃去乙醇,最后用小枪头,吸弃残余的5μL乙醇;)
5).将离心管从磁力架取下并加入50μL 10mMTris-HCL(pH 8.0),轻轻吹打重悬磁珠。室温放置5min后将离心管置于磁力架上室温5min直到溶液澄清。转移上清至一个新的无核酸酶管,勿扰动磁珠。
6).转移上清至一个新的无核酸酶管并加入50μL经过充分混匀的beads(室温),吹打混匀;
7).重复第2-4步。用15μL 10mMTris-HCl(pH 8.0),轻轻吹打重悬磁珠。室温放置5min后将离心管置于磁力架上室温5min直到溶液澄清。转移上清到新的200μL PCR管中。
D.结果分析
1).数据分析
将测序下机后的数据进行数据质量分析,并去除无效数据,比对人类基因组(hg19),使reads对应到相应的基因组位置,通过软件比对,得到突变类型及频率信息。
2).Sanger验证结果
选择三个位点进行sanger验证。结果如表1所示。
表1.突变类型及频率信息
结果显示,采用本试剂盒构建文库并NGS测序的检测结果与传统金标准Sanger测序结果一致。说明本试剂盒的特异性和准确性很高。
实施例2
检测20例乳腺肿瘤患者BRCA1/2基因突变。
A.患者全血基因组DNA提取
使用血液基因组DNA提取试剂盒(天根,货号DP318-02)对患者外周血样本进行基因组DNA提取,操作如提取试剂盒说明书所述。使用荧光定量仪及相应/>定量试剂(Invitrogen)进行定量。定量结果如表2所示。
表2.样本定量结果
B.多重PCR法扩增样本基因组的目标区域。
1).准备无菌、无核酸酶的200μL PCR管,置于冰上;按下表配制PCR反应体系,小心避免交叉污染。
组分 | 体积 |
2×PCR混合液 | 6.25μL |
特异性引物 | 2.0μL |
通用引物R5 | 0.5μL |
通用引物R7 | 0.5μL |
DNA模板,50ng | xμL |
无核酸酶水 | 3.25-xμL |
总体积 | 12.5μL |
2).轻轻吹打混匀,离心,将管子置于冰上。
3).将管子置于PCR仪中,按以下反应程序运行:
C.使用磁珠纯化文库
1).向PCR产物中补加Nuclease-free水至50μL后转移至一个新的无核酸酶的离心管,加入50μL经过充分混匀的beads(室温),吹打混匀;
2).室温孵育5min后,将离心管置于磁力架上5min,小心吸弃上清;
3).保持离心管在磁力架上,加入200μL新鲜配制的80%乙醇,放置30s,吸弃上清,重复乙醇清洗步骤1次;
4).两次乙醇清洗后,室温放置5min,确保乙醇完全去除(注:为防止吸弃beads,在第一次弃乙醇时,可调整移液枪到95μL,富余5μL,第二次正常加入乙醇以及弃去乙醇,最后用小枪头,吸弃残余的5μL乙醇;)
5).将离心管从磁力架取下并加入50μL 10mM Tris-HCL(pH 8.0),轻轻吹打重悬磁珠。室温放置5min后将离心管置于磁力架上室温5min直到溶液澄清。转移上清至一个新的无核酸酶管,勿扰动磁珠。
6).转移上清至一个新的无核酸酶管并加入50μL经过充分混匀的beads(室温),吹打混匀;
7).重复第2-4步。用15μL 10mM Tris-HCl(pH 8.0),轻轻吹打重悬磁珠。室温放置5min后将离心管置于磁力架上室温5min直到溶液澄清。转移上清到新的200μL PCR管中。
D.结果分析
1).数据分析
将测序下机后的数据进行数据质量分析,并去除无效数据,比对人类基因组(hg19),使reads对应到相应的基因组位置,通过软件比对得到变异类型及频率信息。
表6.患者文库扩增子覆盖深度信息
Uniformity(0.2×mean coverage)*:指高于所有扩增子平均值20%的阈值的扩增子占总扩增子的比例。比例越高,说明多重PCR体系越均一,试剂盒性能越好。Percentreads on target(mapped/mappable)*:指所得数据中可以比对到扩增子序列的数据占总测序数据的比例。比例越高,说明文库质量越高。如表6所示,该试剂盒的多重PCR体系均一性高,所扩增出来的文库质量同样很高。
2).Sanger验证结果
表7.患者外周血样本突变信息
表8.患者外周血样本突变信息
从表7、表8中选择Sample 7,Sample 10,Sample 11,Sample 12等4个样本的2个位点进行sanger验证。图3为Sample 7突变验证——chr17:41243776CCT>C,参考序列:GAGGAGAATTTATTATCATTGAAGAATAGCTTAAATGACTGC,测序序列一:GAGGAGAATTTATTATCATT,测序序列二:G GAGAATTTATTATCATT,与参考序列相比缺少AG,也就是少了CT;图4为Sample 10验证:chr17:41223094位置无T>C突变;图5为Sample 11验证:chr17:41223094位置T>C突变50%;图6为Sample 12验证:chr17:41223094位置T>C突变100%。NGS检测与Sanger验证对照结果如表9所示。
表9.NGS检测与Sanger验证对照结果
从表9可知,使用两个平台对同一病人样本进行检测所得的突变频率具有极高的符合性。该结果证明本试剂盒的性能的准确性及稳定性。
序列表
<110> 杭州链康医学检验实验室有限公司
<120> 一种用于人类BRCA1和BRCA2基因全编码序列突变位点检测的引物、方法和试剂盒
<130> 2018
<160> 131
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgggttttta gcaagcagtg taaccgggaa ctctcgtcta atagattgca ttttggtctt 60
ctgtt 65
<210> 2
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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attattggag tt 72
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<211> 65
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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<212> DNA
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<400> 21
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gtc 63
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<212> DNA
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<400> 22
tcctaaagca agattattcc tttgtgtaac cgggaactct cgtctaatag attagatgta 60
tgtgctttaa atg 73
<210> 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
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ttctgaagct acctccgtgt aaccgggaac tctcgtctaa tagattaccc aagtgtcaat 60
ta 62
<210> 25
<211> 68
<212> DNA
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aatcacag 68
<210> 26
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
ttggttttct aaactgagta aattgtgtaa ccgggaactc tcgtctaata gattgcaagc 60
ctcagtc 67
<210> 27
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
gctgtctacc tgaccagtgt aaccgggaac tctcgtctaa tagattacag aactttctac 60
tatattagaa gaa 73
<210> 28
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
gcccctaaac cccacgtgta accgggaact ctcgtctaat agatttgctg atcttcatgt 60
ca 62
<210> 29
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
acagaatcat gacatttact tgagtgtaac cgggaactct cgtctaatag attgcttctg 60
gttatttaac agat 74
<210> 30
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
tctactggca gcaggtgtaa ccgggaactc tcgtctaata gattacttct gcagaggt 58
<210> 31
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
acaaatcttc tttaatctga gtggtgtaac cgggaactct cgtctaatag attaatactg 60
aaaatgaaga taacaaa 77
<210> 32
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
tcccacttgc agtctgtgta accgggaact ctcgtctaat agattgccag tttatgaagg 60
agg 63
<210> 33
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
accaactggg acacttgtgt aaccgggaac tctcgtctaa tagattgcaa aatataaaag 60
attttgagac ttc 73
<210> 34
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
tctttttcat caaaaaggtt gtgtaaccgg gaactctcgt ctaatagatt acatagttaa 60
acacaaaata ctga 74
<210> 35
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
tggggcagct ggtgtaaccg ggaactctcg tctaatagat tagttaaaat tgcaaaggaa 60
<210> 36
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
agttgcagga ctttgtgtaa ccgggaactc tcgtctaata gattgacctt gaattagcat 60
g 61
<210> 37
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
ttccttctct aagccagtgt aaccgggaac tctcgtctaa tagatttcaa aaagtatctt 60
tttgaaagtt 70
<210> 38
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
atggtaggaa tagctgttag tgtaaccggg aactctcgtc taatagatta cttcattact 60
tgaagcaa 68
<210> 39
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
ttcatttaca gtttgtgggg tgtaaccggg aactctcgtc taatagatta cttatttaag 60
taacagtagc atg 73
<210> 40
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
ttgtttcatg tgaaacacaa gtgtaaccgg gaactctcgt ctaatagatt aaagatgcaa 60
atgca 65
<210> 41
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
tgaagaatat cctctgaatc agtgtaaccg ggaactctcg tctaatagat tggatagcca 60
gtggta 66
<210> 42
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
actaacatca caaggtggtg taaccgggaa ctctcgtcta atagattttg ttacgaggca 60
ttg 63
<210> 43
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
tggaaaagac ttgcttggta gtgtaaccgg gaactctcgt ctaatagatt tggattggag 60
aaagttt 67
<210> 44
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
tccagagaaa gcagatgtgt aaccgggaac tctcgtctaa tagattagac aagtgttttc 60
tga 63
<210> 45
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
gtttctctta tcaacacgag gtgtaaccgg gaactctcgt ctaatagatt ggcttttcat 60
ataatgtgg 69
<210> 46
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
accaactgtt gtttgtcttg gtgtaaccgg gaactctcgt ctaatagatt acctacgtct 60
agacaaaatg ta 72
<210> 47
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
tgtttcaaag tagttttctg agtgtaaccg ggaactctcg tctaatagat ttctattaaa 60
gtttctccat atct 74
<210> 48
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
ggctctcctc ttctttgtgt aaccgggaac tctcgtctaa tagattgaag tttgttctac 60
ttactc 66
<210> 49
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
tgaaaagaca tagtttataa cactcgtgta accgggaact ctcgtctaat agatttgagg 60
aaatggtttt gtc 73
<210> 50
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
actttagctt taaaaaaatg gtcgtgtaac cgggaactct cgtctaatag attgctaatt 60
ttaccatctg g 71
<210> 51
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
tgttcattta taaaaacgag acttgtgtaa ccgggaactc tcgtctaata gattttgtgt 60
atttacagta acatgg 76
<210> 52
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
tgaaactgct aaattgcttg gtgtaaccgg gaactctcgt ctaatagatt tgcaacaaag 60
gca 63
<210> 53
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
tgaacatctg actttggagt gtaaccggga actctcgtct aatagatttt ttgtctgttt 60
tcctcc 66
<210> 54
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
gcaaaaattc atcacacaag tgtaaccggg aactctcgtc taatagattt tgaacagtgt 60
gttagga 67
<210> 55
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
gctttttaaa tttcaatttt atttttgcta gtgtaaccgg gaactctcgt ctaatagatt 60
gcctcctact gctgc 75
<210> 56
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
gccaggcagt cgtgtaaccg ggaactctcg tctaatagat tgcactaatg tgttcattct 60
tt 62
<210> 57
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
gtatgagcca tccacgtgta accgggaact ctcgtctaat agattttttt cttttttgtg 60
tgtgtt 66
<210> 58
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
gaatacagtt ggctgagtgt aaccgggaac tctcgtctaa tagattgctt aaccataatg 60
cactt 65
<210> 59
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
agaagcaccc tttgtgtaac cgggaactct cgtctaatag attgtatcat cctatgtggt 60
t 61
<210> 60
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
gctaatagat gcctaagccg tgtaaccggg aactctcgtc taatagattg cagtgtggga 60
t 61
<210> 61
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
tgcatttttg ttttcacttg tgtaaccggg aactctcgtc taatagattt caataatggc 60
cacttt 66
<210> 62
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
gcccaccagt tgtgtaaccg ggaactctcg tctaatagat ttgaaacttc tagcaataaa 60
actagta 67
<210> 63
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
gtcagaagat tattcttcat ggagtgtaac cgggaactct cgtctaatag attgcttttt 60
atactaaaat tatcagtaca tct 83
<210> 64
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
tgataagggc agaggagtgt aaccgggaac tctcgtctaa tagattttct agaagaatga 60
aaactct 67
<210> 65
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
tcctgaccct agacctgtgt aaccgggaac tctcgtctaa tagattacag tggctcac 58
<210> 66
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
tgttatatat gtgacttttt tggtggtgta accgggaact ctcgtctaat agatttcctg 60
aattttagtg aataaggc 78
<210> 67
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
gcccaacaaa agagactagt gtaaccggga actctcgtct aatagattac accaaaaaag 60
aataccc 67
<210> 68
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
gcctcattat atgtcctctg tgtaaccggg aactctcgtc taatagattg cttttgaatt 60
tacagtttag tga 73
<210> 69
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
tgttcctttt gttcagcagt gtaaccggga actctcgtct aatagattgc catctagtta 60
caatagatgg a 71
<210> 70
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
tgataagaaa caagctcaga gtgtaaccgg gaactctcgt ctaatagatt tcattttgtt 60
agtaaggtca 70
<210> 71
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
gtagttgttg atactgagtt gtgtaaccgg gaactctcgt ctaatagatt ttgcatcttt 60
ctcatct 67
<210> 72
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
gtgaaggggc tcgtgtaacc gggaactctc gtctaataga ttacatacag ttagcagcga 60
<210> 73
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
gccaactggt agctccgtgt aaccgggaac tctcgtctaa tagatttttc agatttacca 60
gcca 64
<210> 74
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
gcaaataaag taagaaggcc gtgtaaccgg gaactctcgt ctaatagatt attcttttct 60
tttttttcca ttc 73
<210> 75
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
tgtgtggtga tgctggtgta accgggaact ctcgtctaat agattgcaac ctccagtg 58
<210> 76
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
gcagcttttc cacttgtgta accgggaact ctcgtctaat agattacttc ttataatatt 60
ccttgagtt 69
<210> 77
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 77
tctctttctc cccttgtgta accgggaact ctcgtctaat agatttgctt aaatattttc 60
aatgaaaagt t 71
<210> 78
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 78
tccttggtgg ctgagtgtaa ccgggaactc tcgtctaata gattacctgt ctcagccca 59
<210> 79
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 79
tcctgttgaa ccagacaaag tgtaaccggg aactctcgtc taatagattt ctccggctgc 60
<210> 80
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 80
tgcttatttt tctcacattc tgtgtaaccg ggaactctcg tctaatagat tgcattgata 60
aatacccaag c 71
<210> 81
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 81
ataagtacta atgtgtggtt gtgtaaccgg gaactctcgt ctaatagatt tctgatcaaa 60
gaacagga 68
<210> 82
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 82
tgtggctggc tggtgtaacc gggaactctc gtctaataga tttgacacta atctctgctt 60
<210> 83
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 83
tccagggtgt ccacgtgtaa ccgggaactc tcgtctaata gattacaata aaaacatcaa 60
aaagacat 68
<210> 84
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 84
tctgacaggg cacgtgtaac cgggaactct cgtctaatag attggagagt gtagggt 57
<210> 85
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 85
tccctctctc ttcctcgtgt aaccgggaac tctcgtctaa tagattaccc ccatcgtgg 59
<210> 86
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 86
gcttctcttt ctcttatcct ggtgtaaccg ggaactctcg tctaatagat tgtgagattt 60
ttgtcaactt 70
<210> 87
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 87
gtggtgcatt gatgggtgta accgggaact ctcgtctaat agatttctcc gtgaaaagag 60
ca 62
<210> 88
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 88
gggaggaggg gagtgtaacc gggaactctc gtctaataga tttgaggctc tttagctt 58
<210> 89
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 89
gaggtaactc atgataatgg gtgtaaccgg gaactctcgt ctaatagatt gcagatgcaa 60
ggt 63
<210> 90
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 90
acctacataa aactctttcc agagtgtaac cgggaactct cgtctaatag attgcaggga 60
gaagcca 67
<210> 91
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 91
accctttctg ttgaagctgg tgtaaccggg aactctcgtc taatagattg ccccagagtc 60
agct 64
<210> 92
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 92
gatggtatgt tgccagtgta accgggaact ctcgtctaat agatttttgt aattcaacat 60
tcatcg 66
<210> 93
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 93
tttgttccaa tacagcaggt gtaaccggga actctcgtct aatagattgg tacatgcaca 60
gtt 63
<210> 94
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 94
tcatttatgc tttggctggt gtaaccggga actctcgtct aatagattgt ttctattctg 60
aagactcc 68
<210> 95
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 95
gatttgtttt ctcattccat gtgtaaccgg gaactctcgt ctaatagatt tgtcagatac 60
cacagc 66
<210> 96
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 96
acttgtgggg catgtgtaac cgggaactct cgtctaatag attgccaaaa tgacgaacac 60
aa 62
<210> 97
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 97
gctgtgttag aacagcagtg taaccgggaa ctctcgtcta atagatttcc ttactcttca 60
gaaggag 67
<210> 98
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 98
gctgttagaa ggctggtgta accgggaact ctcgtctaat agatttttca attcctgtgc 60
ta 62
<210> 99
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 99
accacacaca cgcagtgtaa ccgggaactc tcgtctaata gattgcgttt atagtctgct 60
t 61
<210> 100
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 100
tccaaacaaa tgaggcatgt gtaaccggga actctcgtct aatagatttg gggcaaacac 60
aa 62
<210> 101
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 101
actccctggc ttgtgtaacc gggaactctc gtctaataga tttgcagtaa ccaggta 57
<210> 102
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 102
tgcttccaac acttgttagt gtaaccggga actctcgtct aatagatttc actaaggtga 60
tgttc 65
<210> 103
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 103
gaaggtatat tgtttacttt accagtgtaa ccgggaactc tcgtctaata gattgttttt 60
agcaaaagcg t 71
<210> 104
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 104
acagcctatg ggagtgtaac cgggaactct cgtctaatag atttgaaagg gctaggac 58
<210> 105
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 105
acaaacctga gatgcatgag tgtaaccggg aactctcgtc taatagattg ccaaaattga 60
atgctatgct ta 72
<210> 106
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 106
gtacagtgag cacaattagt gtaaccggga actctcgtct aatagattgt tgcaaaaccc 60
ct 62
<210> 107
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 107
tggcttcttt aaaaacattt tctgtgtaac cgggaactct cgtctaatag attacgaaac 60
tggactca 68
<210> 108
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 108
tgagtctaat atcaagcctg tgtaaccggg aactctcgtc taatagatta agtccatgtt 60
tatttgga 68
<210> 109
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 109
accacaggaa agccgtgtaa ccgggaactc tcgtctaata gatttgctca gtatttgcag 60
a 61
<210> 110
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 110
tcagtgtgca gcagtgtaac cgggaactct cgtctaatag attgcgcttt gaaacctt 58
<210> 111
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 111
gccttctgtg tcatttctat tagtgtaacc gggaactctc gtctaataga ttactgaaag 60
atctgtagag ag 72
<210> 112
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 112
gtgttcaaat accagtgagt gtaaccggga actctcgtct aatagattgt accaatgaaa 60
tactgc 66
<210> 113
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 113
ttcttctctt ggaaggctag tgtaaccggg aactctcgtc taatagattt gcaactggag 60
cc 62
<210> 114
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 114
gtcttctacc aggcagtgta accgggaact ctcgtctaat agatttttgg cttgttactc 60
ttc 63
<210> 115
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 115
gcttagattt ctactgacta ctaggtgtaa ccgggaactc tcgtctaata gatttgagaa 60
aaatcctaac cca 73
<210> 116
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 116
acctacatca ggccgtgtaa ccgggaactc tcgtctaata gattgcagat tctttttcga 60
g 61
<210> 117
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 117
tgccaaatct gctttcgtgt aaccgggaac tctcgtctaa tagattgaag gcaagcc 57
<210> 118
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 118
acgttctaaa tgaggtagat gagtgtaacc gggaactctc gtctaataga tttcctataa 60
ttagattttc agttacatgg 80
<210> 119
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 119
tttctctgaa gaaccagaag tgtaaccggg aactctcgtc taatagatta ctgccatgct 60
ca 62
<210> 120
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 120
tggcttagca aggaggtgta accgggaact ctcgtctaat agatttgctg ctatttagtg 60
tta 63
<210> 121
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 121
tgtttcctta cttccagcgt gtaaccggga actctcgtct aatagattgc agctgagagg 60
c 61
<210> 122
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 122
tccaaggtgt atgaagtagt gtaaccggga actctcgtct aatagattac cctgatactt 60
ttctgga 67
<210> 123
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 123
gtcccaaatg gtctgtgtaa ccgggaactc tcgtctaata gattactctg tcttttccct 60
a 61
<210> 124
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 124
aaggttctct ttgactcgtg taaccgggaa ctctcgtcta atagattgca ttgtacctgc 60
ca 62
<210> 125
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 125
accaagattt ttggcaagtg taaccgggaa ctctcgtcta atagatttgt tctttaccat 60
actgtt 66
<210> 126
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 126
tggttttacc ggccgtgtaa ccgggaactc tcgtctaata gattagtttc tatcatccaa 60
agta 64
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 127
gggtttctct tggttgtgta accgggaact ctcgtctaat agattggttt ctgtagccc 59
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 128
tgagttttca tggacagcag tgtaaccggg aactctcgtc taatagattg ctgagtgtgt 60
ttctca 66
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<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gctcttaagg gcagttgtgt aaccgggaac tctcgtctaa tagattacct agcatcatta 60
ccaa 64
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<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gccacataac acattcgtgt aaccgggaac tctcgtctaa tagattgctc aaagttgaac 60
tt 62
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 131
tggtttgtat tattctaaaa ccttcgtgta accgggaact ctcgtctaat agatttacac 60
tcttgtgctg 70
Claims (4)
1.一组检测BRCA1和BRCA2基因全编码序列突变位点的引物,其特征在于,包含通用引物和特异性引物,所述的通用引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示,所述的特异性引物包括:
用于扩增BRCA1基因编码区域的特异性引物序列如SEQ IDNO.3~52所示;
用于扩增BRCA2基因编码区域的特异性引物序列如SEQ IDNO.53~131所示,
所述的特异性引物被硫代修饰、2-氟代核糖核酸修饰、2'-O-甲基核糖核酸修饰、5-甲基脱氧胞嘧啶修饰、脱氧次黄嘌呤修饰、2-氨基嘌呤修饰、5-溴-脱氧尿嘧啶修饰、反向dT修饰、双脱氧胞苷修饰、间臂修饰、氨基修饰、巯基修饰、磷酸化修饰、生物素修饰、锁核苷酸修饰中的任意一种方式修饰,或是多种方式同时修饰。
2.一种检测BRCA1和BRCA2基因全编码序列突变位点的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括权利要求1所述的引物,还包括PCR混合反应液、纯化磁珠和阳性对照。
3.根据权利要求2所述的试剂盒,其特征在于,所述的PCR混合反应液包括DNA聚合酶、dNTPs和2×PCR缓冲液。
4.一种利用权利要求1所述的引物进行非诊断目的的检测BRCA1和BRCA2基因全编码序列突变位点的方法,其特征在于,包括以下步骤:特异性引物与模板基因组DNA序列结合、通用引物扩增待测样本目标区域,磁珠纯化文库,对得到的文库进行高通量测序并分析BRCA1和BRCA2基因的突变。
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